WO2004076658A1 - モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ、医薬組成物ならびに診断試薬 - Google Patents

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cancer
antibody
amino acid
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Saiko Hosokawa
Masahiko Aoki
Yoko Hirakawa
Seima Itami
Hiroe Umeki
Yoshiro Saikawa
Koichiro Kumai
Kazumasa Fukuda
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Mitsubishi Pharma Corporation
Keio University
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Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody which can be used for the treatment and diagnosis of cancer, a DNA encoding the antibody, a hybridoma producing the antibody, a pharmaceutical thread containing the antibody, and a diagnosis.
  • a novel monoclonal antibody which can be used for the treatment and diagnosis of cancer, a DNA encoding the antibody, a hybridoma producing the antibody, a pharmaceutical thread containing the antibody, and a diagnosis.
  • Vimentin is a filament protein of the cytoskeleton of mesenchymal cells or non-epithelial cells, and its genetic expression is known to increase by cell stimulation (Mol Cell Biol. 1987, vol. 7, No. 11, p3908-15). In addition, expression is not observed in normal epithelial cells, whereas its expression tendency is high in the cytoplasm of some poorly differentiated tumor cells such as lung gland, stomach cancer, endometrial cancer or fetal cancer. (Mol Cell Biol. 1987, vol. 7, No. 11, p3908-15). However, it was not known that Vimentin itself functions as an antigen protein. ''
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody which is useful for diagnosing and treating cancers, especially non-small cancers, S-derived cancers, and gastric cancers, and has few side effects.
  • the present inventors have conducted intensive studies to provide a monoclonal antibody for use in targeting therapy for cancer tissues, and as a result, have specifically identified cancer cells such as HLC-1, PANC-1 and ⁇ 45.
  • the present inventors have produced a hybridoma that produces a novel human monoclonal antibody that recognizes it, and have found that a therapeutic agent for cancer useful for targeting therapy can be obtained by using this antibody.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • Variable member region or contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 86, 88 and 90, and vehicle variable region i or contains the amino acid sequence of Torii sequence number 92, 94 and 96 Monoclonal antibodies that make this difficult.
  • the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of rooster No. 115, and it is difficult for the car 31 negative variable region to comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 117.
  • the region coding for the variable region of the heavy chain contains the base sequence of the rooster H ⁇ lJ Nos. 85, 87 and 89, and the region coding for the variable region of the light chain is SEQ ID NOs: 91, 93 and 95.
  • the region encoding the heavy chain variable region comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81, and the region encoding the light chain variable region comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 83, (11) Or the DNA of (12).
  • the region encoding the heavy chain variable region includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 114, and the region encoding the light chain variable region includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 116.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody according to any one of (1) to (10).
  • cancer therapeutic agent is a cancer therapeutic agent for one or more cancers selected from the group consisting of non-small cell lung cancer, spleen cancer, and gastric cancer.
  • the morphological change is a morphological change to one or more morphologies selected from the group consisting of an axon-like morphology, an occult blast-like morphology, and a morphology having protrusions of neuronal differences.
  • the polypeptide according to any one of (23) to (25).
  • Figure 1 is a photograph (photograph) showing the morphological change of each cell when HoAKs-1 antibody was allowed to act on cultured females.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the HoAKs-1 antibody on the stimulation of HLC-1, MKN45 and HUV ECs.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the HoAKs-1 antibody on the control of spleen cancer cells PANC-1.
  • FIG. 4 is a diagram (photograph) showing the reactivity of the HoAKs-1 antibody to various tissue sections.
  • FIG. 5 is a diagram (photograph) showing the results of the analysis of the antigen protein to which the HoAKs-1 antibody reacts.
  • FIG. 6 is a diagram (photograph) showing the morphological change of each cell when the Ho AKs-1 antibody is allowed to act on the culture medium for a certain period of time, and then the antibody is removed from the culture medium.
  • FIG. 7 is a diagram (photograph) showing the binding activity of the HoAKs-1 antibody to each live cancer cell surface.
  • FIG. 8 is a diagram (photograph) 'showing the binding activity of the anti-55 kDa mouse monoclonal antibody to the surface of each live cancer cell.
  • FIG. 9 is a diagram (photograph) showing the binding activity of the r-HoA. Antibody to each live cancer cell surface.
  • the monoclonal antibody of the present invention comprises an antigenic protein of about 55 kDa (human amino acid sequence of SEQ ID NO: 107) derived from human ⁇ cancer thin moon cake PAN C-1 (ATCC No. CRL 1469) shown in FIG. (Specifically, a protein).
  • it is a monoclonal antibody that does not cause morphological changes in normal cells and causes morphological changes in cancer cells.
  • a specific protein of about 55 kDa protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107) derived from human pancreatic carcinoma ePANC-1 shown in Fig. 5 is specific. It is a monoclonal antibody that recognizes morphologically, does not cause morphological changes in normal cells, and causes morphological changes in cancer cells.
  • Vimentin can be exemplified as the above-mentioned about 55 kDa viewing protein.
  • morphological changes include, for example, the axon-shaped morphology, the ⁇ ⁇ fine morphology, and the morphology having a shin-fiber as Wei as shown in Fig. 1 (B and!).
  • Form change dani
  • the monoclonal antibody of the present invention include a heavy chain variable region containing amino acid sequences of Nos. 86, 88 and 90, and a carbohydrate variable region containing amino acid sequences of SEQ ID Nos. 92, 94 and 96. Things.
  • the tenth amino acid may be Cys or Tyr. That is, there are two types of heavy chain variable regions, one with 1 OCys and one with 10 Tyr.
  • the clear antibody may have one or several amino acid substitutions or deletions in one or more of the above six types of sequences.
  • the above six types of arrangements are the regions called “hypervariable regions” in the variable regions of translatory and car fibers;
  • Antibodies consist of ⁇ and ⁇ , and each chain consists of a constant region and a variable region.
  • the variable region further has a hypervariable region, and this region has the specificity of immunoglobulin as an antibody and the binding property between the iJ3 ⁇ 4g3 ⁇ 43 ⁇ 4 group and the antibody. Therefore, the antibody of the present invention contains the above sequences in the hypervariable region, but the region other than the hypervariable region may be derived from another antibody.
  • other antibodies include antibodies derived from organisms other than humans, but human-derived antibodies are preferable from the viewpoint of side effects iffi.
  • Particularly preferred monoclonal antibodies in the present invention include: a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82; a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84; The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • Antibodies comprising the 17 amino acid sequences.
  • the combination of the 14th and 51st amino acids may be either (Cys, Tyr) or (Tyr, Cys). That is, there are two types of heavy chain variable region sequences, 14Cys and 51 Tyr and 14Tyr and 51 Cys.
  • the 13th amino acid may be Val or I1e. In other words, there are two types of vehicle variable region arrays, 13 Va 1 and 13 I 1 e.
  • the monoclonal antibody is a fragment of a monoclonal anti-monoclonal antibody, an F (ab,) dimerized anti-F (ab,) ⁇ ⁇ anti-short chain: ⁇ enhancer (scFv), a diabody (Diabodies). ) And minibodies.
  • the amino acid sequence of the SI member and the constant region of the fiber can be obtained from Nucleic Acids Research vol. 14, pl779, 1986, The Journal of Biologica 1 Chemistry vol. 257, pl516, 1982 and Cell vol. .22, pl97 5 1980.
  • Examples of the antibody of the present invention containing a constant region MS and a variable region include an antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 130 (heavy chain) or the rooster example number 132 (member of car II).
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained, for example, by culturing a hybridoma producing the antibody using a culture medium containing RPMI 1640 containing fetal bovine serum, or using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81 or 83.
  • a host such as a CHO cell (Chinese high-speed Yuichi ovary cell) or a bacterium by incorporating it into the ⁇ ii bek yuichi (pc DNA 3.1 (invitrogen) etc.) that enables the expression of the gene.
  • Antibodies can be produced by expression and purified from these cultures using a Protein A column or the like.
  • the monoclonal antibody of the present invention also comprises a protein of about 55 kDa derived from human knee cancer cell line PAN C-1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107, preferably vimentin (GenBauk Accession No. M14144).
  • a hybridoma is prepared from an animal immunized with the above, and the hybridoma is cultured, and a monoclonal antibody having a binding activity to a live cancer cell surface is selected from the obtained monoclonal antibodies.
  • Examples of such a monoclonal antibody include a monoclonal antibody produced from the hybridoma 2F6-1 strain and the 3F9-1 strain shown in the Wei example described below.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention.
  • the region encoding the variable region of the heavy chain has the amino acid sequence of rooster H ⁇ number 86, 88 and 90.
  • a region encoding a carcass variable region includes a sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, 94, or 96, respectively.
  • the region encoding the variable region of the employee contains bases ⁇ J of SEQ ID NOS: 85, 87 and 89, respectively
  • the region encoding the variable region of the human is SEQ ID NOS: 91, 93 and And DNAs containing the 95 and 95 base sequences, respectively.
  • the 29th base may be a or g.
  • the 18th base may be c or t. That is, there are two types of sequences coding for the light chain variable region: 18c and 18t. Since the hypervariable regions encoded by the DNAs of these sequences are regions that determine the specificity of the antibody, roosters encoding other regions may be roosters derived from other antibodies.
  • other antibodies also include antibodies derived from organisms other than humans, but human antibodies are preferred from the viewpoint of reducing side effects.
  • V Particularly preferred DN ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the present invention is that the region coding for the variable member of the dust contains the sequence coding for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82, and the region coding for the vehicle negative variable region.
  • the region encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 84, or the region encoding the variable region of the heavy chain includes the sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 115, and the light chain
  • the region encoding the variable region is DNA containing the sequence encoding the amino acid sequence of No. 117.
  • particularly preferred DNAs are those in which the sequence encoding the heavy chain variable region comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81 and the region encoding the variable region comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 83.
  • the sequence encoding the NA or heavy chain variable region contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 114, and the region encoding the variable region of the vehicle is DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 116.
  • the combination of the 41st and 152nd bases may be (a, g) or (g, a).
  • sequences encoding heavy chain variable regions 41a and 152g, and 41g and 152a.
  • sequence of SEQ ID NO: 83 or 116 No. 37
  • the combination of the bases at positions 183, and 258 may be any of (a, a, t), (a, a, c) and (g, g, t). That is, there are three types of rooster U that encodes the member variable region: 37a, 183a, 258t, 37a, 183a, 258c, and 37g, 183g, 258t. No.
  • the DNA of the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes a protein of about 55 kDa derived from human arm cancer-specific PANC-1 (a protein containing the amino acid of SB ⁇ J No. 107). That hybridizes under stringent conditions to the DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 81 and the salt of SEQ ID NO: 83, or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 114 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 116 It may be.
  • the stringent conditions include, for example, 60 ° C, lxSSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 XSSC, 0.1% SDS, which are the washing conditions for Sazanno and hybridization. Conditions for hybridizing with a corresponding salt may be mentioned.
  • the DNA of the present invention may encode all of the constant region and the variable region of the heavy chain and ⁇ , but may also encode only the si member and the variable region of the vehicle.
  • the nucleotide sequence of the constant region of translation and vehicle translation when all of the constant region and variable region are encoded is described in Nucleic Acid Research Vol. 14, pl779, 1986, The Journal of Biological Chemistry v. 1.257, pl516, 1982 and Cell vol.22, pl97, 1980 are preferred.
  • Examples of the DNA of the present invention encoding the constant region and the variable region include a DNA having a base sequence of Rooster sequence number 129 (heavy chain) and Rooster example number 131 mi).
  • the DNA of the present invention can be obtained, for example, by the following method.
  • total RNA is prepared from a cell such as the hybridoma of the present invention using a commercially available RNA extraction kit, and cDNA is synthesized by a reverse transcriptase using a random primer or the like.
  • the cDNA encoding the antibody is amplified by PCR using the oligonucleotides of the conserved sequences in the variable regions of the known human antibody heavy chain gene and the black fiber gene, respectively, as a primer.
  • the sequence encoding the constant region can be obtained by amplifying a known sequence by the PCR method.
  • the nucleotide sequence of DNA can be determined by a conventional method, for example, by incorporating it into a plasmid for sequencing.
  • the present invention also provides a transformant containing the DNA of the present invention, and a transformant comprising the ffli santan vector.
  • Eto Itoh is a vector like Echerichia coli.
  • a vector that can be expressed in a nuclear cell for example, pBR322, PUC119 or a derivative thereof
  • a vector that can be expressed in a fiber cell is preferable, and a vector that can be expressed in a cell derived from a mammal is more preferable.
  • Examples of vectors that can be expressed in mammalian cells include plasmid vectors such as pcDNA3.1 (Invitrogen II) and virus vectors such as DON-AI DNA (Treasure Bioshelf).
  • the transformant into which the recombinant vector of the invention is introduced may be a prokaryotic cell such as a fungus, but is preferably a difficult cell, more preferably a cell derived from a mammal.
  • Examples of the cells include Chinese hams evening ovary cells (CH0 cells) and the like.
  • the hybridoma of the present invention is a hybridoma that produces a monoclonal antibody as described above.
  • Examples of the hybridoma of the present invention include the hybridoma HoAKs-1 strain and the 2F6-1-3F9-1 strain shown in the actual S examples described below.
  • the hybridoma of the present invention can be obtained by the following method. First, according to the method of A. Imam et al. (Cancer Research vol. 45, 263 1985), cancer 'infiltrating lymphocytes were isolated from cancer tissue removed from a lung cancer patient, and the cells containing lymphocytes were polyethylene glycol. A hybridoma is obtained by fusing with a mouse.
  • the hybridoma of the present invention is prepared by using a protein of about 55 kDa derived from the human spleen cancer cell line PAN C-1 shown in FIG. It can also be obtained by immunizing a mouse and fusing the obtained lymphocytes with mouse myeoma cells.
  • the pharmaceutical thread of the present invention comprises the monoclonal antibody of the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include soluble carriers, such as known physiologically acceptable buffers (eg, phosphate buffers), Is a dog-like carrier such as latex beads.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is suitably used as a therapeutic agent for cancer, particularly for non-small cell cancer, knee cancer or gastric cancer.
  • the pharmaceutical fiber of the present invention may utilize the effect of the monoclonal antibody itself on the wound damage or growth inhibition, or may bind the monoclonal antibody of the present invention to an iJ3 ⁇ 4g agent such as adriamycin. May be used to target an anticancer drug to a cancer tissue.
  • a particularly advantageous pharmaceutical fiber is one obtained by binding the antibody of the present invention to a liposome containing a toxin or an iJ3 ⁇ 4S agent.
  • the ribosome carrying the antibody is composed of a double lipid layer, but any one having a multi-layered preparation layer or a single layer can be used.
  • Phosphatidylcholine, cholesterol, phosphatidylethanolamine, and phosphatidine as a charge-imparting substance are used as the components of the liposome.
  • cholesterol is 0.3 to 1 mol, preferably 0.4 to 0.6 mol
  • phosphatidylethanolamine is 0.1 to 0.1 mol per mol of phosphatidylcholine.
  • the composition ratio of 0.2 mo 1 is preferably 0.02-0. Lmo 1, and that of phosphatidic acid is 0 to 0.4 mo 1, preferably 0 to 0.15 mo 1.
  • a known method can be used for the production method of ribosome. For example, after removing the solvent, the mixture is emulsified with a homogenizer or the like, and after condensing and melting, multilamellar ribosomes are obtained. In order to further adjust the particle size, supersonic, high-speed homogenization, or uniform pores are used. It can be produced by using a pressure filtration method (Biochimica et Biophysica Acta vol. 81, p55, 1985) with a membrane having The size of the ribosome is preferably from 30 nm to 20 O nm.
  • Drugs to be encapsulated in the ribosome include anti-cancer drugs such as adriamycin, daunomycin, mitomycin, cisplatin, vincristine, epirubicin, methotrexet, 5Fu (5-fluorouracil), aclacynomycin, ricin A, diphtheria toxin, etc. Toxins, antisense RNA and the like can be used.
  • the drug can be encapsulated in the ribosome by hydrating the S substance with an aqueous drug solution. Adriamycin, daunomycin, and epirubicin can also be encapsulated using the H-gradient remote loading method (Cancer Res. Vol. 49, p5922, 1989).
  • Methods for binding the monoclonal antibody on the ribosome surface include a method in which a purified antibody is introduced into the liposome by attaching a 7k substance, and a method in which phosphatidylethanolamine and the antibody are cross-linked with glutar.
  • a liposome containing a maleimide group-introduced lipid is prepared, the S agent or toxin is encapsulated, and the two are reacted to bind the antibody to the liposome surface.
  • a water-soluble polymer derivative having a reaction site with an amino group and a thiol group or a potential thiol group can also be suitably used (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-152234).
  • a thiol group to an antibody can be performed by adding N-succinimidyl-1- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), which is commonly used for thiolation of proteins, to iminothiolane, mercaptoalkylimidate, etc.
  • SPDP N-succinimidyl-1- (2-pyridyldithio) propionate
  • a method of using a compound or a method of reducing an endogenous dithiol group of an antibody to a thiol group may be used, and a method of using an endogenous thiol group is more preferable from the viewpoint of activity.
  • Antibodies are converted into F (ab,) 2 by an enzyme such as pepsin, reduced with dithiothreitol (DTT) ', etc., and converted into F (ab,) 2 to form one to three new thiol groups. Can also be subjected to a binding reaction with liposomes. Maleimide group-containing ribosomes can be conjugated with thiolated antibodies by reacting them for 2 to 16 hours in a neutral buffer (pH 6.5-7.5).
  • the preparation of the cancer therapeutic agent of the present invention can be carried out by a known method, that is, a lunar method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-502348), a method of adding a stabilizer and using it as a liquid (Japanese Patent Application Laid-Open — No. 9331) and a freeze-drying method (JP-A-64-9331).
  • This onset Ming cancer therapeutic, and intravascular administration, intraperitoneal, etc. can be force s used topical administration, the projecting Azukaryou is by agents contained in the ribosome, respectively to the optimum amount of Can be.
  • the dose can be used as an adriamycin amount of 5 O mg / kg or less, preferably 1 O mg / kg or less, more preferably 5 mg / kg or less.
  • the diagnostic of the present invention includes a diagnostic reagent utilizing the cancer cell specificity of the antibody of the present invention. More specifically, a diagnostic reagent for cancer comprising the secondary antibody of the antibody of the present invention, a detection substrate, and the like. And the like.
  • the polypeptide of the present invention specifically binds to a protein of about 55 kDa (a protein containing the amino acid sequence of Rooster No. 107) derived from human spleen carcinoma cell line * PANC-1 shown in FIG.
  • the polypeptide to be recognized It is a polypeptide that does not cause morphological change in normal cells and causes morphological change in cancer cells.
  • the morphological change includes, for example, a morphological change of normal cells to an axon-shaped morphology as shown in FIGS. .
  • polypeptide of the present invention specifically, a polypeptide which can be adsorbed on process A shown in Examples described later can be mentioned. More preferably, the monoclonal antibody of the present invention is used.
  • the polypeptide of the present invention induces morphological changes specifically in cancer cells, so that it can be used as a therapeutic agent for pharmaceuticals, especially for the treatment of cancers such as non-small cell reversion cancer, B-extracted cancer, and gastric cancer. Can be used. ⁇ row
  • a cancer tissue removed from a lung cancer patient is made into a small mass with a scalpel, and a culture solution A (RPM I 164 0 + 50 After shaking well in zg / ml gentamicin sulfate, the culture night (I) was recovered. In addition, small pieces of cancer plaiting were finely loosened with a force razor blade, and pitting was performed in a new culture solution to disperse the cells. This cell suspension was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to recover the supernatant (II). I and II were combined and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to finally obtain about 4 ⁇ 10 7 cells containing cancer-infiltrating lymphocytes.
  • Cells containing cancer-infiltrating linnospheres were fused with mouse myeloma cells (approximately 4 ⁇ 10 7 ) using polyethylene glycol 1500 (Roche Diagnostics) according to a conventional method (Cancer Research vol. 45, 263, 1985). .
  • the fused cells were suspended in culture solution B ( ⁇ ⁇ nutrient solution A + 10% ⁇ month-old baby serum (FCS)) to a cell density of 5 ⁇ 10 5 / ml.
  • the seeds were seeded in 100 ⁇ 1 aliquots on a 96 ⁇ er plate, and the culture was started in 37 (( 2 incubates) overnight.
  • the above cancer broth is cultured in a 96-well plate for 3 to 4 days until further growth. Then, the supernatant was removed, and after one round of competition with 1 OmM phosphate buffer (pH 7.4, 0.15 M NaCl) (PBS), the cells were fixed with 2% paraformaldehyde (room temperature, 20 minutes). After 5 times with PBS, 5% BSA (pserum albumin) -containing PBS scythes were added at 150/1 / well to perform blocking. The plate was competed five times with PBS, and 50 ⁇ 1 hybridoma culture supernatant was added and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours.
  • 1 OmM phosphate buffer pH 7.4, 0.15 M NaCl
  • the cells were competed five times in P83, and a goat antibody (diluted in 1,000-fold, Capel) against a human antibody bound to 501 horseradish peryloxidase (HRP) was added. A time reaction was performed. Then, the plate with PBS containing 0.05% 0. The Tween20 (PBS-T) and 3 ⁇ 43 ⁇ 4 War, o- phenylene Renjiamin 3 ⁇ 4 Hokusatsu (5. 2%) and H 2 0 2 (0. 0 15 %) was added at a rate of 50 1 / well, and the mixture was allowed to react at room temperature until color development was confirmed. The absorbance at 490 nm was measured by a microphotometer (Nippon Intermed).
  • HoAKs-1 antibody the monoclonal antibody obtained from this strain.
  • the fetal serum was passed through a protein A-glass bead column (Procept A) (bio PROCESSING) and processed. Serum from which the substance adsorbed on A was removed was prepared, and the hybridoma HoAKs-11 was cultured using the culture solution A containing 7 to 10% of this serum.
  • the culture solution obtained by culturing the hybridoma HoAKs-1 was applied to Prosep A to adsorb the polypeptide A-adsorbed polypeptide, and then eluted to purify the polypeptide adsorbed to Prosep A. This polypeptide having the Procept AP attached thereto was subsequently used as the HoAKs-1 antibody.
  • the HoAKs-1 antibody purified by Procept A was labeled with biotin using Biotinylation Reagent (Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions, and the gel and the free biotin were separated by gel filtration. separated.
  • Lung cancer cell line HLC-1, gastric cancer cell line 45, ⁇ cancer cell line PANC-1 (NCTCC No. CRL 1469) were used as human cancer cells, and vascular endothelial cell HUVECs (Dainippon Pharmaceutical) were used as normal human cells. Tengchong these cancers information, maintenance, and grown at 37 ° C, of 5% C0 2 conditions in culture D. Human vascular endothelial cells, HUVECs, were grown using the culture medium CS-C culture medium (Cell systems).
  • the HoAKs-1 antibody is sterilized by filtration through a filter overnight, diluted with culture medium C or CS-C culture medium to a fiber of about 140 ⁇ g / m 1, and added to a 96-well plate. 1 / 'dispensed in aliquots.
  • each of the cultured cancer cells and vascular endothelial cell HUVECs was diluted to a density of 3 ⁇ 10 4 / ml with culture medium C containing 10% human serum (ICN Biomedicals) or CSC-culture medium, respectively.
  • the cell-containing solution was seeded at 100 1 / well, so that the number of cells in the well was 1.5 ⁇ 10 3 / well, and the concentration of the HoAKs-1 antibody was adjusted to about 70 g / ml.
  • the HizaganHoso Zhu PAN C-1 recognized morphologies Heni spoon, cell number LXL 0 3 / Ueru become as 96 Ueru first plate tides' weigh in Ueru, HoAKs - 1 concentration of the antibody 30 0 zg / ml N 100 ⁇ G / ml, the I ⁇ become conditions 30 ⁇ G / ml, and cultured at 37 ° C, 5% C0 2 environment, 3 times every other day, the culture supernatant Were replaced under the same conditions as above, and the number of live cancer cells was compared on the 6th day using a prodoxyduridine (BrdU) cell proliferation assay kit (manufactured by Oncogene). . According to the sixth statement, Brd U solution was added to each well according to the kit's instructions, cultured overnight, and the amount of BrdU incorporated into live cancer cells was measured on the 7th day . For comparison, similar experiments were performed using human antibody IgM.
  • various types of cancer such as lung cancer (Lung Cancer Shoe Ver .: HLC-1 (Keio University), A549 and PC-9 (Immune Biology Research Institute, Knee Cancer Subdivision: SUIT 2 (Kyushu Cancer Center), PANC-1) And PK8 (Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University), Gastric cancer: MKN45, MKN74, HSC-3 (all immunobiological research), Cancer: HT29 (ATCC No.
  • DLD -1 ATCC No. CCL221)
  • LoVo ATCC No. CCL229
  • CO L0205 ATCC No. CCL 222
  • Approximately 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 cells were implanted subcutaneously into nude mice (CLEA Japan) to form tumors, and the formed tumors were excised and treated as described above. ⁇ Tissue sections were prepared.
  • the prepared various pieces were deparaffinized according to a conventional method, subjected to a blocking operation, and reacted with the biotin-labeled Ho AKs-1 antibody described in Difficult Example (3) -2.
  • the detection was performed using DAKO Catalyzed Signal Amplifier (CSA) System (DAKO), and the reactivity was detected as reddish brown staining of diaminobenzidine. Further, in the tissue section subjected to the immunostaining, the nuclei of cells in the tissue were stained blue with hematoxylin in order to confirm the histological image.
  • CSA DAKO Catalyzed Signal Amplifier
  • FIG. 4 shows stained images of various cancer tissue sections and autologous lung non-cancerous tissue sections in which reactivity was observed.
  • HoAKs-1 antibody is used to identify the cancer in the autologous lung cancer tissue from which the hybridoma was derived and the lung cancer tumors formed in nude mice: HLC-1 and A549; 1 and PK-8, gastric cancer tumor: MKN45 tumor Tumor tumor cells showed clear reactivity. On the other hand, non-cancer group was not found.
  • a human antibody purified from human serum using a Prosep A column in the same manner as the HoAKs-1 antibody, or an antibody having the same subtype as the HoAKs-1 antibody obtained in the same manner as the HoAKs-1 antibody Staining using gM human monoclonal antibody A was also performed in the same procedure as described above. These antibodies did not have the potential for the insoluble fraction of PANC-1 cells, but did not show any specific reactivity with the above tissue sections.
  • ⁇ -buffer (1 OmM Tris-HCL (pH 7.6), 15 OrnM NaCl, ImM EDTA) + protease inhibitor (5/1 g / m 5 ll gm 1vpstatin A and 10 g (v / v) of the cells from which 5 gm 1 chymosintin (both from Peptide Laboratories) were collected, and using a glass homogenizer under ice-cooling. The cells were disrupted by centrifugation and centrifuged at 10,000 g for 20 minutes to obtain a soluble supernatant fraction and an insoluble supernatant.
  • RIPA-buffer (5 OmM Tris-HCL (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1%
  • FIG. 5 shows the electrokinetic pattern of the protein derived from P ANC-1 cells (Coomassie Briant Blue stain) and the results of Western blotting.
  • the HoAK s-1 antibody was found to exhibit a] 3 ⁇ 45 property to a single protein of about 55 kDa in the insoluble fraction (membrane fraction) of the homogenate of pan PAN C-1 cell homogenate.
  • the Si3 ⁇ 4 substance of Ho AKs-1 was detected on the two-dimensional electrophoresis pattern.
  • the same sample was subjected to two-dimensional electrophoresis 13 times, and the gel after electrophoresis was stained with C 00massie Brilliant Blue. Based on the results of the Western blot, the gel was compared with the HoAKs-1 antibody reactant. The corresponding spot was cut out from the gel for 13 pieces.
  • the HoAKs-1 antibody is thought to have exerted a morphological change (Fig. 1) and a growth inhibitory effect (Fig. 2 or 3) on cancer cells via a protein containing this amino acid sequence VELQELNDRFAN (Rooster S ⁇ J No. 107).
  • Fig. 1 a morphological change
  • Fig. 2 or 3 a growth inhibitory effect
  • this protein was found to be present on the cancer cell membrane surface. As expected.
  • RNA PGR KIT AMV
  • TaKaRa RNA PGR KIT
  • PCR primers VH1 (SEQ ID NO: 1), VH2 (SEQ ID NO: 3), and VH3 (SEQ ID NO: 1) corresponding to the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, and 12) conserved in step 1 No.
  • VH4 SEQ ID NO: 7
  • VH5 SEQ ID NO: 9
  • VH6 SEQ ID NO: 11
  • PCR primers corresponding to the C-terminal amino acid sequence SEQ ID NOs: 14, 16, 18, and 20
  • JH1 SEQ ID NO: 13
  • JH2 SEQ ID NO: 15
  • JH3 SEQ ID NO: 17
  • JH4 SEQ ID NO: The same mixture of 19 was used on the third side.
  • the primer for amplifying the chain variable region is stored in frame 1 of the human antibody chain variable region.
  • N-terminal amino acid sequences SEQ ID NOS: 22, 24, 26, 28, 30, and 32
  • VK1 Roomster J No. 21
  • VK2 Roomster Column No. 23
  • VK3 Legend number 25
  • VK4 SEQ ID NO: 27
  • VK5 SEQ ID NO: 29
  • VK6 SEQ ID NO: 31
  • PCR primers JK1 (SEQ ID NO: 33), JK2 (SEQ ID NO: 35), JK3 (SEQ ID NO: 37), and PCR primers corresponding to the C-terminal amino acid sequences (SEQ ID NOs: 34, 36, 38, 40, and 42), respectively.
  • the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NOs: 44, 46, 48, 50, 52, 54, and 56) conserved in frame 1 of the human antibody variable chain variable region was The corresponding PCR primers VL1 (SEQ ID NO: 43), VL2 (Rooster B ⁇ No. 45), VL3 (Rooster [J No. 47), VL4 (SEQ ID NO: 49), VL5 (SEQ ID NO: 51) ⁇ VL6 (SEQ ID NO: 53), an equal mixture of VL7 (SEQ ID NO: 55) at the 5 'end, a human antibody; and a C-terminal amino acid sequence (Rod example numbers 58, 60 and 62) conserved in frame 4 of the I chain variable region.
  • Equivalent mixtures of the corresponding PCR primers JL1 (SEQ ID NO: 57), JL2 (SEQ ID NO: 59), and JL3 (SEQ ID NO: 61) were used at the 3 ends.
  • the PCR reaction was performed using Perk in Elmer Gene Amp PCR System 2400 and RNA PCR KIT (AMV) (TaKaRa) according to the instruction manual.
  • AMV RNA PCR KIT
  • TaKaRa RNA PCR KIT
  • the amplified variable region DNA fragments of each of the heavy and light chains were purified using MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN). Next, TOPO
  • pCR2.1-TOP0 pCR2.1-TOP0 and the above purified PCR product were linked to each other to transform Escherichia coli. Pick up the resulting colonies, purify the plasmid using QIAGEN Plasmid mini kit (QIAGEN), digest with EcoRI at 37 ° C for 15 minutes, and incorporate the desired DNA fragment by 2% agarose electrophoresis. It was confirmed.
  • the nucleotide sequence was determined for multiple colonies in which the DNA fragment of interest was integrated. Using the imaz, the corn was ligated using the CEQ 2000 DNA Analysis System (Beckman). As a result, four types of sequences, H09 (SEQ ID NO: 63), H12 (Rooster B ⁇ No. 65), H27 (SEQ ID NO: 67), and H30 (Rooster ⁇ ) No. 69, were obtained from the heavy chain cage. . From the cage of the K chain, K30 (SEQ ID NO: 71), K31 (Rooster No.
  • K32 SEQ ID NO: 75
  • K35 Legend number 77
  • K39 SEQ ID NO: 79
  • KM05 SEQ ID NO: 97
  • KM06 Rooster H ⁇ No. 99
  • KM026 SEQ ID NO: 101
  • KM036 SEQ ID NO: 103
  • KMO 40 SEQ ID NO: 105
  • H09, HI2, H27, H30, K30, # 31, # 32, # 35, and # 39 were considered to encode human heavy chains or fractions.
  • the rooster H ⁇ in the region 3 'further from the sequence described above was determined.
  • the amplification of the 3 side region of the heavy fiber gene was carried out by using the PCR framer VH3 (SEQ ID NO: 5) corresponding to the N-terminal amino acid rooster conserved in frame 1 of the heavy chain variable region of the human antibody.
  • PCR was performed using PCR primer IgMFOR (SEQ ID NO: 108) corresponding to the amino acid rooster in the normal region of the human antibody, and using the three-sided primer.
  • the obtained PCR product was inserted into a plasmid in the same manner as described above, and the nucleotide sequence was determined.
  • a 57-base sequence (Rooster Example No. 110) following the third side of the base sequence of the heavy chain variable region (SEQ ID No. 81) could be newly obtained.
  • This nucleotide sequence was predicted to encode 19 amino acids (number 111).
  • the nucleotide sequence of the HoAKs-1 antibody heavy chain 1 gene to which the 57 bases were added and the predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 118 and SEQ ID NO: 119, respectively.
  • this 57 base since sequences are included to co one de constant region, portions encoding the variable region (24 bases) only H 0 eight 1 ⁇ -1 antibody MigakuSada variable territory ⁇ plus The nucleotide sequence of the advisor and the predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 115, respectively.
  • Amplification of HoAKs-1 antibody fiber gene was performed using the PCR primer VK4 (SEQ ID NO: 27) corresponding to the N-terminal amino acid sequence stored in frame 1 of the human antibody / c chain variable region.
  • PCR was performed using a PCR primer GKFOR (SEQ ID NO: 109) corresponding to the C-terminal amino acid sequence of the human antibody arm normal region as the 5′-side primer, using the PCR primers used for the three-side primer.
  • the obtained PCR product was inserted into a plasmid in the same manner as described above, and the nucleotide sequence was determined.
  • the base sequence of the above-mentioned chain variable region (SEQ ID NO: 83), the sequence of 99 bases following the 3 ′ side (Rooster [
  • This nucleotide sequence was predicted to encode 33 amino acids (SEQ ID NO: 113).
  • the nucleotide sequence of the ⁇ Ks-1 antibody chain gene to which the 99 bases were added and the predicted amino acid H ⁇ J are shown in No. 120 and No. 121, respectively.
  • these 99 bases include the motif of the constant region, the HoAKs-1 antibody has only the variable region-encoding portion (24 bases).
  • ⁇ base sequence of the chain variable region gene
  • the predicted amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 116 and Rooster!], Respectively.
  • CDR hypervariable region
  • the framework was determined by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991).
  • CDRs of the heavy chain were HCDR 1 (base sequence: SEQ ID NO: 85, amino acid sequence: ⁇ number 86), HCDR2 (base II:.: Rooster 1) number 87, and amino acid sequence: rooster H ⁇ y number 88 )
  • H CDR3 base sequence: SEQ ID NO: 89, amino acid sequence: 0
  • car 11 Sada CDRs are LCDR1 (base sequence: SEQ ID NO: 91, amino acid sequence: SEQ ID NO: 92), LCDR2 (base sequence: SEQ ID NO: 93, amino acid sequence: SEQ ID NO: 94) and LCDR 3 (base sequence: It can be identified as Rooster sequence number 95, amino acid sequence: SEQ ID NO: 96).
  • FIG. 7 shows the binding activity of the Ho AKs-1 antibody to the surface of each living cell.
  • HoAKs-1 antibody showed binding activity to the live cell surface of PANC-1 cells and HLC-1 cells (Fig. 7—A, C), but did not show binding activity to HUVECs cells (Fig. 7).
  • -E The human gM antibody used as a control did not show any binding activity to any of the cells (FIG. 7—B, D, F).
  • Tsuru Example (6) Prepare an insoluble fraction protein solubilized with RIPA buffer from a homogenate of PANC-1 cells in the same manner as in (1) -1, and use a 10% acrylamide gel for about 180 ⁇ g. Electrophoresis was performed. The gel and the gel were stained with Coomassie Brilliant Blue, and a band corresponding to about 55 kDa protein, to which the HoAKs-1 antibody was reactive, was cut out.
  • the excised gel was crushed, mixed with 0.2 ml complete Freund's adjuvant (manufactured by DI FCO LABORATORIES), and injected into the abdominal cavity of a mouse (Balb / c AJc1, 6-week-old, CLEA Japan), A first immunization was performed. Two weeks later, the incomplete adjuvant and the gel were mixed, prepared in the same manner as described above, and the mice were immunized again. Four days later, the spleen of the mouse was removed and lymphocytes were prepared (2.4 10 8 Then, the cells were fused with mouse myeloma cells P3U1 according to a standard method (Monoclonal Antibody Experiment Manual, published by Kodansha Scientific Ltd.).
  • the fused cells were suspended in culture medium D (eRDF + 50 g / m1 genmycin «+ 10% FCS) plus normal HAT, and seeded on a 96-well plate. ° culture was started in C0 2 incubator beta scratch. Approximately 2 weeks after fusion, the appearance of hybridomas was confirmed, and using the culture supernatant, the reactivity to the approximately 55 kDa protein was detected by Western blotting, and the desired hybridoma was selected. .
  • culture medium D eRDF + 50 g / m1 genmycin «+ 10% FCS
  • FCS normal HAT
  • Insoluble fraction protein solubilized in a RIP A buffer from a homogenate of PANC-1 cells Approximately 4 mg of the protein was electrophoresed on a 10% acrylamide gel, and the protein was transferred from the gel to a PVDF membrane. And blocked. (10) The culture supernatant of each 96-well plate was collected and reacted with the transferred PVDF membrane at 37 ° C for 1 hour. The VDF membrane was washed with PBS-II, a goat antibody (1000-fold dilution, Capel) against the mouse antibody bound to HRP was added, and the reaction was further performed at 37 ° C for 1 hour.
  • the PVDF membrane was washed with PBS-T, and the activity of the culture supernatant to about 55 kDa evening protein was detected using Konikai Munostin HRP-1000 (manufactured by Konikaki Co., Ltd.). Cloning was performed by limiting dilution from the wells in which iS property was detected, and hybridoma strains 2F6-1 and 3F9-1 were established.
  • the hybridoma strains 2F6-1 and 3F9-1 established in (10) -2 were cultured, and the respective culture supernatants were collected and applied to Prosep A to purify the antibody. SDS-PAGE confirmed that each of the monoclonal antibodies was IgM. After purifying each antibody using Biotin Reagent according to the instruction manual, the labeled antibody and free biotin were separated by gel filtration.
  • 'PANC-1 Insoluble fraction protein solubilized with R-PA buffer from the homogenate of Itoda Tsukiha, about 10 g per lane of 10% acrylamide gel, electrophoresed, and the protein was transferred from gel to PVDF membrane. Transfer was performed for blocking.
  • Anti-vimentin mouse monoclonal antibody (sc-6260, Santa Cruz Biotechno 1 og-i) and goat anti-desmin antibody (sc-7559 ⁇ Santa Cruz Biotechno 1 ogy shelf with PVDF membrane and 37.C, 1 hour After the reaction, the PVDF membrane was washed with PBS-T, and a goat antibody (1000-fold dilution, Capel) against the mouse antibody bound to HRP or a mouse antibody (1000-fold dilution) against the goat antibody was added. The reaction was performed for 1 hour at 0 ° C.
  • the PVDF membrane was washed, and the reactant of the antibody was detected with a well-tanning luminol reagent.
  • the anti-vimentin antibody was approximately 55 kDa. Showed anti-desmin antibody S ⁇ property but not detected
  • HoAKs-1 antibody recognizes approximately 55 kDa
  • the protein was determined to be vimentin, and it was proved that some antibodies reactive with the protein had binding activity to the surface of live cancer cells.
  • variable regions of the fil and / or ⁇ chains For amplification of the variable regions of the fil and / or ⁇ chains, a primer into which a restriction enzyme site for ligation with an expression plasmid was introduced was used.
  • P2 SEQ ID NO: 123) containing a Hind III site and a signal sequence on the 5 'end side, and P3 containing a NheI: site on the end shelf (Torumi column number 124)
  • P4 SEQ ID NO: 125
  • P5 SEQ ID NO: 126) containing a Bs iWI site at the 3' end were used. .
  • the amplified variable region DNA fragments of the heavy chain and K chain were purified using QI Quick PCR Purification Kit (QIAGEN).
  • the DNA fragment was digested with a restriction enzyme to ligate it to the expression vector.
  • the heavy chain DNA fragment was digested with Hindi II and Nhe I at 37 ° C for 2 hours.
  • the strand DNA fragment was first digested with BsiWI at 37 ° C for 2 hours, purified with QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN), and further digested with HindIII at 37 ° C for 2 hours.
  • the resulting DNA fragment was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis, and the desired DNA fragment was purified using QI Ack gel Extraction Kit (Q I AGEN).
  • pKS— £ — Hind— 5 was digested with Asp718 at 37 ° C for 2 hours, purified with QIAquick PC Purification Kit (QI AGEN), and further digested with Hind111 at 37 ° C for 2 hours. . The digested fragment was subjected to 0.8% agarose electrophoresis, and the target fragment was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the DNA fragment containing the Constitutive variable region of HoAKs-1 obtained by the above method and the digested expression plasmid pEX-G1-WLpHy were obtained using the Ligation Kit Ver. 2.1 (TAKARA).
  • the cells were ligated according to the manufacturer's instructions, and transformed with Escherichia coli DH5-hiT1 (Invitroen) according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting colony was picked up and the plasmid was purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
  • the plasmid containing the nucleotide sequence was digested with Ndel at 37 ° C for 1 hour, and subjected to 1.5% agarose electrophoresis to obtain a desired plasmid pEX-HoAKs-H.
  • SEQ ID NO: 1228 was used to confirm the nucleotide sequence.
  • SEQ ID NO: 129 shows the nucleotide sequence of the heavy chain structural gene of the HoAKs-1 recombinant antibody.
  • the expression plasmid pKS- / C'-Hind-5 digested with the DNA fragment containing the chain variable region of HoAKs-1 was prepared using the Liation Kit Ver. 2.1 (TAKA A), And transformed into ⁇ ISDH5a-Tl (Invitrogen). The resulting colonies were picked up and the plasmid was purified using QI Aprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). The plasmid containing the chain base sequence was digested with BsiWI at 37 ° C for 1 hour, and subjected to 1.5% agarose electrophoresis to obtain a desired plasmid pKS-HoAKs-K.
  • the plasmid obtained above was digested with restriction enzymes to ligate the heavy chain and the chain of HoAKs-1 into one plasmid.
  • pEX-11013-11 was digested at 37 ° C for 2 hours at 1161 and 1: 3-110-813-1-1 was digested at 37 ° C for 37 hours at 37 ° C for 2 hours.
  • the fragments were purified using the QIAquick PC Purification Kit (QIAGEN), and each fragment was ligated using the Ligation Kit Ver. 2.1 (TAKARA) according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting colonies were picked up, and the plasmid was purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) The resulting plasmid was digested with NheI at 37 ° for 30 minutes. Then, 0.8% agarose electrophoresis was performed to obtain a desired plasmid pEX-HoAKs-HK.
  • Plasmid p: SV: 2dhf r "containing the pEX-110 1 ⁇ -111: and (] 1: 0 ⁇ > genes obtained above was linked to r-HoA.
  • pEX-HoAKs-HK was digested with BamHI and NheI at 37.C for 2 hours, then electrophoresed with 0.8% agarose, and the target DNA fragment was subjected to QIAquick Gel.
  • Each fragment was ligated using Ligation Kit Ver. 2.1 (TAKARA) according to the instructions, and Escherichia coli DH5HiTl (Invitrogen) was transformed. The resulting colonies were picked up and the plasmid was purified using QI Aprep S in Miniprep Kit (QI AGEN). The resulting plasmid is After digestion at 37 ° C for 1 hour at 61 ° C, the desired plasmid pEX—HoAKs—HK / pSV2dhfr ′ for expressing 1.5 ⁇ g Agarose-based antibody and expressing the Antan ⁇ antibody
  • CH ⁇ (DG325) cell J3 which can be cultured in a serum-free medium, was used.
  • CHO (DG325) was adjusted to 1 ⁇ 10 6 ce 11 s / ml with CHO—S—SFMI I (GIBC0).
  • 2 g of pEX—HoAKs_HK / pSV2dhfr ', DNA and 6 / L of FuGENE 6 (Roche) were mixed and transfected to CHO (DG325) according to the instructions.
  • EX-CELL325-PF (Nichirei) was added.
  • Culture for 2 days G418 Sulfate (Promega) 40 O ⁇ zg / ml and methotrexate (Sigma) 0, 25, or 50 nM were added to the medium, and cultured. Cells were produced.
  • the amount of AA-HoA. Produced by the cells was measured by the sandwich ELISA method. First, dilute a heron anti-human immunoglobulin antibody (CAPPEL) to 50 / g / ml with solution 1 (PBS). Each 50 L we 11 was added to a flexible plate (FALCON) and treated at 37 ° C for 2 hours. Thereafter, the solution of we11 was discarded, and 200 L of solution 2 was added to each well, followed by treatment at 4 ° C for 16 hours or more. Discard each we11 solution, add 5 Oju L / well of culture supernatant diluted with solution 2 (0.1% Gelat in / PBS / 0.05% Tween20), and react at 4 ° C for 16 hours or more.
  • CAPPEL heron anti-human immunoglobulin antibody
  • the A-Ho A. production details obtained above were cultured in EX-CELL 325-PF (Nichirei) supplemented with G418 Sulfate (Promega) and methotrexate (Sigma), and r-HoA. Was obtained.
  • r-HoA. was adsorbed by applying the culture solution to Procept A, and then eluted to purify e-HoA.
  • r-HoA. was confirmed to be pure IG by SDS-PAGE.
  • the insoluble fraction protein solubilized in the RI PA buffer from the homogenate of PANC-1 cells was subjected to electrophoresis for 10 g of each protein using a 10% acrylamide gel, and the protein was transferred from the gel to a PV-DF membrane. Blocked.
  • the transferred PVDF membrane was incubated with the purified HoA. Described in (13-7) for 1 hour at 37 ° C.
  • the PVDF membrane was washed with PBS-T, a goat antibody (1000-fold dilution, Capel) against a human antibody bound to HRP was added, and the reaction was further performed at 37 ° C for 1 hour. Next, the PVDF membrane was washed with PBS-T, and the reactivity of ⁇ -HoA.
  • HizaganHoso Zhu P ANC-Ted Stevens 1 seeded with lung cancer cell lines HL C-1 and vascular endothelial cells HUVE C s 96- ⁇ El plates (3603, co one Ningune Qian), the cultured at 37 5% C0 2 environment After one day, the refiner described in (13-7) (containing 0.05% sodium azide) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 60 minutes. After removing the solution, react with a goat antibody (20-fold sickle, Capel) (containing 0.05% sodium azide) against FITC-conjugated human antibody for 30 minutes at room temperature.
  • FIG. 9 shows the binding activity of the antibody to the surface of each living cell.
  • HoA. Like HoAKs-1 described in (9), showed binding activity to PANC-1 Itoda vesicle and HLC-11 cells on the live cell surface (Fig. 9A, C). ) Did not show binding activity to HUVEC s cells (Fig. 9-E).
  • a cancer therapeutic agent that remotely attacks cancer tissue particularly non-small cell lung cancer, knee cancer or gastric cancer
  • cancer tissue particularly non-small cell lung cancer, knee cancer or gastric cancer
  • the human monoclonal antibody of the present invention it is possible to provide a therapeutic agent for cancer that can be continuously administered with few side effects.

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Abstract

癌患者の癌組織由来のリンパ球とマウスミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌などの癌細胞を特異的に認識する新規なヒトモノクローナル抗体を産生させる。該抗体を単独、または、毒素や抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持して用いることにより、癌治療薬を得る。より具体的には、重鎖可変領域が配列番号１１５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１１７のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体を単独、または、毒素や抗癌剤を内包するリポソームの表面に担持して用いることにより、癌治療薬を得る。

Description

明細書 ' モノクローナル抗#¾よびそれをコードする遺伝子、 ハイブリドーマ、 医薬糸誠物なら びに診断 技術分野
本発明は、 癌の治療、 診断に使用し得る新規なモノクローナル抗 その抗体をコ一 ドする DNA、 およびその抗体を産生するハイプリドーマ、 並びに、 その抗体を含む医 薬糸 物、 診断 に関する。 - 背景技術
癌の治療分野においては、 充分な効果を示す治療薬のない固形癌に対して、 特定の癌 細胞を標的としたターゲティング療法の研究が縣ょりなされてきた。 かかるターゲテ ィングには癌細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が有効であるが、 マウスモノ ク口一ナル抗体を用いると、 免疫応答に起因するァナフィラキシ一などの副作用から、 連続投与が難しい等の問題点があった （Pro NatL Acad. Sci .'U. S.A. vol .86, p4220， 1 989)。
そして、 かかる問題点を解決するために、 副作用の少ないモノクローナル抗体の取得 が試みられてきた。遺伝 且み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキ メラ抗体作成技術や、 超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などがある が、 副作用低減の亂 からは完全ヒトモノクローナル抗体がより望ましいとされてきた かかる完全ヒトモノクローナル抗体を得る方法としてヒト由来のリンパ球を用いたノ、 イブリドーマ法 (Cancer Res. vol .45, p263， 1985) があるが、 完全ヒトモノクロ一ナ ル抗体の作製はマウスモノク口一ナル抗体の作製法と比較し、 目的とする抗体を産生す るヒト B細胞を効率的に得るための能動的免疫法が困難であること、 抗体産生細胞を無 P艮增殖化させる効率的方法が確立されていないことなどから、 充分に腫瘍細胞に反応す るヒトモノクロ一ナル抗体の取得はごくわずかしか報告されておらず （特許第 3 2 3 6 6 6 7号公報） 、 依然として困難な状況にあった。
かかる状況下においても、 徐々にではあるが、 ヒト化抗体技術等を利用して、 特定の 癌細胞に対し、 単独、 又は抗癌剤との併用によって、 殺 効果や、 増殖抑制効果を有す るモノクローナル抗体の開発がなされてきており、 最近では、 抗 H e 2ヒト化抗体 ( ハ一セプチン） の乳癌への適用 (Oncology vol. 63 Suppl 1 , pp25— 32， 2002) 、 抗 E G Fレセプ夕一抗体（Semin Oncol, vol. 9, No.5 Suppl 14, ppl8-303 2002)ゃ抗 V E G F (血管内皮増殖因子）抗体 (Semin Oncol , vol .29， No.6 Suppl 16, ppl0-14， 200 2)等を用いた治験が進められている。 しかしながら、 罹患者数の多い非小細胞肺癌や、 特に難治性の癌種である膝癌等に対して特異的なターゲティング療法に用いることので きる抗体はいまだ存在せず、 かかる癌種に対応するために、 副作用が少なく、 癌組織へ の特異 '注の高いモノクローナル抗体の取得が望まれていた。
ビメンチン （vimentin) は、 間葉系細胞ないし非上皮細胞の細胞骨格のフィラメント タンパク質であり、細胞刺激によってその遺伝^ §現が上昇することが知られている（M ol Cell Biol. 1987， vol. 7， No. 11, p3908-15) 。 また、 通常の上皮細胞では発現が 認められないのに対して、 肺腺 、 胃癌、 子宮内膜癌又は胎児性癌などの一部の低分化 な腫瘍細胞の細胞質内にその発現傾向が高いことが知られている （Mol Cell Biol. 198 7， vol . 7, No. 11， p3908-15)。 しかし、 ビメンチン自身が抗原タンパク質として機能 するなどの ί藤は知られていなかづた。 ''
発明の開示
本発明の調は癌、 特に非小細蹦市癌、 S萃癌、 胃癌の診断、 治療に有用であり、 かつ 、 副作用の少ないモノク口一ナル抗体を提供することである。
本発明者らは、 癌組織に対するターゲティング療法に用いるためのモノクロ一ナル抗 体を提供すべく鋭意検討した結果、 H L C— 1、 P AN C- 1および ΜΚΝ 4 5等の癌 細胞を特異的に認識する新規なヒトモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを作 製し、 本抗体を用いることによりタ一ゲティング療法に有用な癌治療薬が得られること を見いだして、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) 重鎖可変領域に配列番号 8 6、 8 8および 9 0のアミノ酸配列を含むことを特 徴とするモノクローナル抗体。 (2) 重鎖可変領域に配列番号 8, 2のアミノ酸配列を含むことを纖とする、 (1) のモノクローナル抗体、。
( 3 ) 重鎖可変領域に配列番号 115のァミン酸配列を含むことを とする、 （ 1 ) のモノクローナル抗体、。
(4) 6§員可変領域に配列番号 92、 94および 96のアミノ酸配列を含むことを特 徴とするモノクローナル抗体。
(5) 車 ϋ負可変領域に配列番号 84のアミノ酸配列を含むことを とする、 （4) のモノクローナル 体。
(6) 車翌貞可変領域に配列番号 117のアミノ酸酉咧を含むことを難とする、 （4 ) のモノクローナル ί体。
( 7 ) 重 §員可変領 ί或が、 配列番号 86、 88および 90のァミノ酸配列を含み、 かつ 、 車翻可変領 i或が、 酉己列番号 92、 94および 96のアミノ酸配列を含むことを難と するモノクローナル抗体。
( 8 ) 重鎖可変領域が醇 U番号 82のアミノ酸配列を含み、 かつ、 車 員可変領域が配 列番号 84のアミノ酸配列を含むことを髓とする、 (7) のモノクローナル抗体。
(9) '重鎖可変領域が酉^]番号 115のアミノ酸酉洌を含み、 かつ、 車 31負可変領域が 配列番号 117のアミノ酸配列を含むことを難とする、 ( 7 ) のモノク口一ナル抗体
(10) ヒト抗体である、 (1)〜 （9)のいずれかのモノク口一ナル抗体。
( 11) (1) ~ ( 10) のいずれかのモノクローナル抗体をコードする DNA。
(12) 重鎖可変領域をコ一ドする領域が、 酉 H^lJ番号 85、 87および 89の塩基配 列を含み、 かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 91、 93および 95の塩 基配列を含むことを赚とする、 (11) の DNA。
(13) 重鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 81の塩基配列を含み、 かつ軽 鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 83の塩基配列を含むことを髓とする、 ( 11) または （12) の DNA。
(14) 重鎖可変領域をコ一ドする領域が、 配列番号 114の塩基配列を含み、 かつ 軽鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 116の塩基配列を含むことを とする 、 （11) または （12) の DNA。 (15) (11) - (14)のいずれかの DN Aを含む糸搬ぇベクター。
(16) (15)の糸 奐えべクターを含む形質転 ί奐体ゝ。
(17) (1) 〜 （10)のいずれかのモノクローナル抗体を産生するハイプリドー マ。
(18) (1) 〜 （10)のいずれかのモノクロ一ナル抗体を含む医薬組成物。
(19) 癌治療薬である （18)の医薬糸誠物。
(20) 癌治療薬が、 非小細胞肺癌、 脾癌、 および胃癌からなる群より選ばれる、一 または二以上の癌に対する癌治療薬である、 (19)の医薬糸誠物。
(21) モノクローナル抗体を、 毒素またはお i癌剤を内包するリポソ一ムの表面に担 持させたことを特徴とする、 (18)〜 （20)のいずれかの医薬 «物。
(22) (1)〜 （10)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む診断謹。
(23) 下記 （a)および/または （b)の性質を有するポリペプチド：
(a)細胞骨格のフィラメントに反応性を有する、
(b)正常綱包に対しては形態変化を引き起こさず、 癌細胞に対しては形態変化を引 さ起しす
(24) 下記 (a)および/または （b)'の性質を有するポリペプチド：
(a)配列番号 107のアミノ酸配列を含むヒト臈癌細 S繊 PAN C— 1由来の約 5 5kD aの夕ンパク質を特異的に認識する、
(b)正常細胞に対しては形態変化を引き起こさず、 癌細胞に対しては形態変化を引 き起こす。
(25) 約 55 kD aのタンパク質がビメンチンである (24)のボリペプチド
(26) 形態変化が、 軸索状の形態、 隱芽細胞様の形態、 および、 神経細 差の突 起を有する形態からなる群より選ばれる、一または二以上の形態への形態変化である、 (23)〜 （25)のいずれかのポリペプチド。
(27) (1)〜 （10)のいずれかのモノクローナル抗体であることを特徴とする 、 （ 23 )〜 （ 26 ) のいずれかのポリぺプチド
(28) (23)〜 （26)の 、ずれかのポリぺプチドを含む医薬糸誠物。 図面の簡単な説明
図 1は、 HoAKs— 1抗体を培 細雌に作用させたときの各細胞の形態変化 を示す図 （写真） である。
図 2は、 HoAKs— 1抗体の培觀細騒朱 HLC— 1、 MKN45および HUV ECsに対する増衝卬制効果を示すグラフ図である。
図 3は、 HoAKs-1抗体の脾癌細 «P ANC-1に対する増魁卬制効果を示 すグラフ図である。
図 4は、 HoAKs— 1抗体の各種組織切片に対する反応性を示す図 （写真） であ る。
図 5は、 HoAKs-1抗体が反応する抗原夕ンパク質についての麟斤結果を示す 図 (写真) である。
図 6は、 培麵細赚に Ho AKs-1抗体を一定期間作用させ、 その後、 抗体を P余去したときの各細胞の形態変ィ匕を示す図 (写真) である。
図 7は、 HoAKs-1抗体の各生癌細胞表面に対する結合活性を示す図 （写真） である。
V 図 8は、 抗 55 k D aマウスモノクローナル抗体の各生癌細胞表面への結合活性を •示す図 （写真）'である。
図 9は、 r-HoA.抗体の各生癌細胞表面に対する結合活性を示す図 （写真） で ある。 . 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1 >本発明のモノク口一ナル抗体
本発明のモノク口一ナル抗体は、 図 5に示すヒト脬癌細月餅朱 PAN C— 1 (ATCC No. CRL 1469) 由来の約 55 kD aの抗原タンパク質 （配列番号 107のァ ミノ酸配列を含むタンパク質） を特異的に認識するモノクローナル抗体である。 また、 正常細胞に対しては形態変ィ匕を弓 Iき起こさず、 癌細胞に対しては形態変化を引き起こす 、 モノクローナル抗体である。 さらに、 図 5に示すヒト脾癌細 ePANC— 1由来の 約 55kDaのタンパク質 （配列番号 107のアミノ酸配列を含むタンパク質） を特異 的に認識し、 かつ、 正常細胞に対しては形態変化を弓 Iき起こさず、 癌細胞に対しては形 態変化を引き起こすモノクローナル抗体である。前記約 55 kD aの観タンパク質と しては、 ビメンチンを例示することができる。 また、 形態変化とは、 例えば、 図 1の B および!)に示すような軸索状の形態、 Ιϋ^細歸羡の形態、 および、 神緻腿繊の魏 を有する形態への正常細胞の形態変ィ匕が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体として具体的には、 重鎖可変領域に酉咧番号 86、 88 および 90のアミノ酸配列を含み、 車羅可変領域に配列番号 92、 94および 96のァ ミノ酸酉例を含むものが挙げられる。 ここで、 酉 2 ^番号 88のアミノ酸配列において、 10番目のアミノ酸は Cysであっても Tyrであってもよい。 すなわち、 重鎖可変領 域としては 1 OCysのものと 10 T yrのものの 2種類が挙げられる。 なお、 ヒト膝 癌細 朱 PANC— 1由来の約 55kDaの ίί タンパク質 （酉 H^!J番号 107のァミノ 酸配列を含むタンパク質） を特異的に認識するという上記の特異性を有する限り、 本発 明の抗体は、 上記 6種類の配列のうちの一、 または、 複数において、 一または数個のァ ミノ酸の置 欠失、 または付加があってもよい。 ここで、 数個とは好ましくは、 2〜 5個、 より好ましくは、 2個または 3個、 特に好ましくは、 2個を意味する。
· 上記 6種類の配列は、 翻および車纖の可変領域の中で『超可変領域』 と呼ばれる領 ；域の配列である。 抗体は麵と車纖からなり、 さらに、 それぞれの鎖は定常領域と可変' 領域からなる。 可変領域にはさらに超可変領域が存在し、 かかる領域が免疫グロプリン の抗体としての特異性、 iJ¾g¾¾基と抗体の結合籍ロ性を している。 したがって、 本発明の抗体は、 超可変領域に上記それそれの配列を含むものであるが、 かかる超可変 領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。 ここで、 他の抗体とはヒト以外の 生物由来の抗体も含むが、 副作用 iffi威の観 からはヒト由来のものが好ましい。
本発明において特に好適なモノクローナル抗体としては、 重鎖可変領域に配列番号 8 2のアミノ酸配列を含み、 軽鎖可変領域に配列番号 84のアミノ酸酉例を含む抗 ま たは重鎖可変領域に配列番号 115のアミノ酸配列を含み、 皐 可変領域に配列番号 1
17のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。 ここで、 配列番号 82または 1 15の配 列において、 14番目と 51番目のアミノ酸の組み合わせは （Cys、 Tyr) または (Tyr、 Cys) のいずれであってもよい。 すなわち、 重鎖可変領域の配列として、 14Cys、 51 Tyrのものと 14Tyr、 51 Cysのものの 2種類が挙げられる 。 また、 配列番号 84または 117の配列において、 13番目のアミノ酸は Valであ つても I 1 eであってもよい。 すなわち、 車 ϋ員可変領域の配列として、 13 Va 1のも のと 13 I 1 eのものの 2種類が挙げられる。
本発明において、 モノクローナル抗体とは、 モノクローナル抗 モノクロ一ナル抗 体のフラグメント、 F (ab， ) 2化抗 F (ab， )ィ匕抗 短鎖: ί亢体 (scFv) 、 ダイァボディ （Di abodi es)およびミニボディ （Minibodies)を 含むものとする。 定常領 i或を含む場合においては、 SI員および纖の定常領域のァミノ 酸配列は、 Nucleic Acids Research vol.14, pl779, 1986、 The Journal of Biologica 1 Chemistry vol.257, pl516， 1982および Cell vol.22, pl975 1980に記載のものが 好ましい。 定常領 MSび可変領域を含む本発明の抗体としては、 例えば、 配列番号 13 0 (重鎖） 、 又は酉例番号 132 (車 II員） のアミノ酸配列を有する抗体を挙げることが できる。
本発明のモノクローナル抗体は、 例えば、 本抗体を産生するハイブリド一マをゥシ胎 児血清含有 RPMI 1640培養液等を用いて培養するか、 または、 配列番号 81およ び 83の塩基酉 」を有する可変領域をコードする DN Aに、 廳貞および幸纖の定常領域 コードする DNAをそれぞれ連結した遺伝子 （例えば、 配列番号 129 (重鎖） 又は
131 m)の 子） を PGR法、 または、 化学^ ^により合成し、 法により
、 その遺伝子の発現を可能とする 口の ¾iiベク夕一 （ p c D N A 3. 1 (inv i t ro gen)等） に組み込んで C HO細胞 (チャイニーズハイス夕一卵巣細胞） や 菌等の宿主中で発現させることによって抗体を産生し、 これらの培養液から、 Prot e in Aカラム等を用いて抗体を精製することによって得ることができる。
本発明のモノク口一ナル抗体はまた、 配列番号 107のアミノ酸配列を含むヒト膝癌 細腳朱 PAN C— 1由来の約 55 kD aのタンパク質、 好ましくは、 ビメンチン (GenB auk Accession No. M14144)で免疫した動物からハイブリドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養し、 得られたモノクローナル抗体の中から生癌細胞表面への結合活性を有 するものを選択することによって得ることができる。 このようなモノクローナル抗体と しては、 後述の魏例にて示されるハイプリドーマ 2 F 6— 1株、 および 3 F 9— 1株 より産生されるモノク口一ナル抗体を挙げることができる。 く 2 >本発明の D NA
本発明の D N Aは本発明のモノクロ一ナル抗体をコードする D NAであるが、 例とし て、 重鎖可変領域をコードする領域が、 酉 H ^番号 8 6、 8 8および 9 0のアミノ酸配列 をコードする配列をそれぞれ含み、 かつ、 車纖可変領域をコードする領域が配列番号 9 2、 9 4および 9 6のアミノ酸配列をコードする配列をそれぞれ含む D N Aが挙げられ る。 その中でも、 謹員可変領域をコードする領域が配列番号 8 5、 8 7および 8 9の塩 基酉^ Jをそれぞれ含み、 かつ 肖可変領域をコードする領域が、 配列番号 9 1、 9 3お よび 9 5の塩基配列をそれぞれ含む D N Aが好ましい。 ここで、 配列番号 8 7の配列は 、 2 9番目の塩基が aであっても gであってもよい。すなわち、塵負可変領域をコードす る酉己列として、 2 9 aのものと 2 9 g'のものの 2種類が挙げられる。 また、 配列番号 9 5の配列は、 1 8番目の塩基が cであっても tであってもよい。 すなわち、 軽鎖可変領 域をコ一ドする配列として、 1 8 cのものと 1 8 tのものの 2種類が挙げられる。 これらの配列の D N Aによってコードされる超可変領域が、 抗体の特異性を する 領 i或であるため、 他の領域をコードする酉 は他の抗体由来の酉 ϋであってもよい。 こ こで、 他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、 副作用低減の からはヒト 由来のものが好ましい。
•V本発明において特に好適な DN Αは、 麈員可変領域をコ一ドする領域が配列番号 8 2 のアミノ酸酉^]をコ一ドする配列を含み、 かつ、 車達負可変領域をコ一ドする領域が配列 番号 8 4のアミノ酸配列をコードする配列を含む D NA、 または重鎖可変領域をコード する領域が配列番号 1 1 5のアミノ酸配列をコードする配列を含み、 かつ、 軽鎖可変領 域をコードする領域が 番号 1 1 7のアミノ酸配列をコードする配列を含む DN Aで ある。 その中でも特に好ましい D N Aは、 重鎖可変領域をコードする配列が配列番号 8 1の塩基配列を含み、 かつ、 率 ¾貞可変領域をコードする領域が、 配列番号 8 3の塩基配 列を含む D NA、 または重鎖可変領域をコードする配列が配列番号 1 1 4の塩基配列を 含み、 かつ、 車 貞可変領域をコードする領域が、 配列番号 1 1 6の塩基配列を含む DN Aである。 ここで、 配列番号 8 1または 1 1 4の配列において、 4 1番目と 1 5 2番目 の塩基の組み合わせが、 （a、 g) であっても （g、 a) であってもよい。 すなわち、 重鎖可変領域をコードする配列として、 4 1 a、 1 5 2 gのものと 4 1 g、 1 5 2 aの ものの 2種類が挙げられる。 また、 配列番号 8 3または 1 1 6の配列において、 3 7番 目、 183番目、 および 258番目の塩基の組み合わせが、 （a、 a、 t)、 （a、 a 、 c) および （g、 g、 t) のいずれであってもよい。 すなわち、 聿 員可変領域をコ一 ドする酉 Uとして、 37a、 183a, 258 tのもの、 37 a、 183 a、 258 c のもの、 および、 37 g、 183 g、 258 tのものの 3種類が挙げられる。
なお、 本発明の DNAは、 ヒト膊癌細謹 PANC— 1由来の約 55kDaの碰タ ンパク質（SB^J番号 107のアミノ酸酉例を含むタンパク質） を特異的に認識するモノ クロ一ナル抗体をコードする限り、 上記配列番号 81の塩基配列及ひ配列番号 83の塩 ,または配列番号 114の塩基酉例及び配列番号 116の塩基配列を含む DNA とストリンジェントな条件-下でハイブリダイズするものであってもよい。 ここで、 スト リンジェントな条件としては、 例えば、 サザンノ、ィブリダイゼ一ションの洗いの条件で ある 60°C、 lxSSC, 0. 1%SDS、 好ましくは、 0. 1 X S S C、 0. 1%S D Sに相当する塩 «でハイプリダイズする条件が挙げられる。
本発明の DNAは重鎖と麵の定常領域と可変領域の全てをコードするものであって もよいが、 si員と車 負の可変領域のみをコードするものであってもよレ、。定常領域と可 変領域の全てをコードする場合における翻および車翻の定常領域の塩基配列は、 Nucl e,ic Acids Research vol.14, pl779, 1986、 The Journal of Biological Chemistry v 。1.257， pl516, 1982および Cell vol.22, pl97, 1980に記載のものが好ましレ、。定常 領¾¾び可変領域をコードする本発明の DNAとしては、 例えば、 酉己列番号 129 (重鎖) 、 酉例番号 131 mi)の塩基配列を有する DNAを挙げることができる。
本発明の DN Aは例えば、 以下の方法によって得ることができる。 まず、 本発明のハ イブリドーマ等の細胞から、 市販の： RNA抽出キットを用いて全 RNAを調製し、 ラン ダムプライマー等を用い、 逆転写酵素により cDN Aを合成する。 次いで、 既知のヒト 抗体重鎖 伝子、 聿纖遺伝子の可変領域において、 それぞれ保存されている配列のオリ ゴヌクレオチドをブラィマーに用いた P CR法によって、 抗体をコードする cDNAを 増幅させる。定常領域をコードする配列については、 既知の配列を PC R法で増幅する ことによって得ることができる。 DNAの塩基配列は、 配列決定用プラスミドに組み込 むなどして、 常法により することができる。
本発明はまた、 本発明の D N Aを含む糸厳えべク夕一及び該 ffli奐えべクターを含む形 質転換体を提供する。糸藤えベクタ一としては、大腸菌 (Echerichia coli)のような原 核細胞において発現可能なベクター （例えば、 pBR322、 PUC119又はこれらの派生物） で あってもよいが、 繊細胞において発現可能なベクターが好ましく、 哺乳動物由来の細 胞において発現可能なベクターがより好ましい。 哺乳動物由来の細胞において発現可能 なベクターとしては、 例えば、 pcDNA3.1 (Invitrogen¾ ) のようなプラスミドベクタ ―、 DON-AI DNA (宝バイオ棚などのウイルスべク夕一を挙げることができる。本発 明の組換えべク夕一を導入する形質転換体は、 ：«菌のような原核細胞であってもよい が、 難細胞が好ましく、 哺乳動物由来の細胞がより好ましい。 哺乳動物由来の細胞と しては、例えば、チャイニーズハムス夕一卵巣細胞 (CH0細胞)などを挙げることができ る。
< 3 >本発明のハイプリドーマ
本発明のハイプリドーマは、 上述したようなモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマである。本発明のハイプリドーマとしては、 後述の実 S例に示すハイプリドーマ H o AK s— 1株、 2 F 6 - 1¾ 3 F 9— 1株などを挙げることができる。 本発明の ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。 まず、 A. I mamらの方法 ¾ (Cancer Research vol.45 ,263 1985)に準じて、肺癌患者から摘出された癌組織から癌 '浸潤リンパ球を単離し、 リンパ球を含む細胞をポリエチレングリコールを用いてマウス. ミエ口一マ細胞と融合してハイプリド一マを得る。次に、 得られたハイプリドーマの上 清を用いてェンザィムィムノアヅセィを行い、 パラホルムアルデヒド固定した各種癌細 胞株に対して陽性を示す抗体を産生するハイプリドーマを選択し、 さらに該ハイプリド 一マを限界希釈によりクローニングする。 また、 本発明のハイプリドーマは、 図 5のヒ ト脾癌細胞株 PAN C—1由来の約 5 5 kD aのタンパク質 （配列番号 1 0 7のァミノ 酸酉 |Jを含むタンパク質) を用いてマウスを免疫し、 得られたリンパ球とマウスミエ口 一マ細胞とを融合させることによつても得ることができる。 く 4 >本発明の医薬«；物
本発明の医薬糸誠物は、 本発明のモノクロ一ナル抗体を医薬上許容されうる担体とと もに含んでなるものである。 医薬上許容されうる担体の例としては、 既知の生理学的に 許容され得るバッファ一 （例えばリン酸バッファ一） のような可溶性キャリア一、 また はラテヅクスビーズのような固 犬態のキヤリァ一が挙げられる。
本発明の医薬糸誠物は癌、 特に非小細翻巿癌、 膝癌または胃癌の治療薬として好適に 用いられる。 また、 本発明の医薬繊物はモノクローナル抗体自身の細麟殳傷効果や増 殖抑制効果を利用するものであってもよいし、 ァドリアマイシンなどの iJ¾g剤に本発明 のモノクローナル抗体を結合させて抗癌剤を癌組織に夕ーゲティングさせるものであつ てもよい。
本発明において特に ¾1な医薬繊物は、 毒素や iJ¾S剤等を含んだリポソ一ムに本発 明の抗体を結合させたものである。抗体を担持するリボソームは、 二重の脂質層からな るものであるが、 調旨質層が多重層になったもの、 あるいは一層のものいずれも使用す ることができる。 リポソームの構戯分としては、 フォスファチジルコリン、 コレステ ロール、 フォスファチジルエタノ一ルァミン、 さらに電荷を与える物質としてのフォス ファチジン が用いられる。構成成分の使用割合として、 たとえば、 フォスファチジ ルコリン l mo 1に対しコレステロールは 0 . 3〜l m o 1、 好ましくは 0. 4〜0 . 6 mo 1, フォスファチジルエタノールァミンは 0 · 0 1〜0 . 2 m o 1好ましくは 0 . 0 2 - 0 . l m o 1、 フォスファチジン酸は 0〜0 . 4 m o 1好ましくは 0〜0 . 1 5 mo 1の組成比を用いることができる。
¾リボソームの製造方法には公知の方法を用いることができる。 たとえば、 溶媒を除去 した旨質 合 I勿をホモジナイザー等で乳化し、 結融解後、 マルチラメラリボソームを 得て、 さらに適当な粒径に調整するために超音 理、 高速ホモジナイズ、 あるいは均 一ポアを持つメンブランで加圧ろ過する方法 (Biochimica et Biophysica Acta vol . 8 12, p55， 1985)を用いることによって製造できる。 リボソームのサイズは 3 0 nmから 2 0 O nmが好ましい。
リボソームに内封させる薬剤としては、 アドリアマイシン、 ダウノマイシン、 マイト マイシン、 シスプラチン、 ビンクリスチン、 ェピルビシン、 メトトレキセ一ト、 5 F u ( 5—フルォロウラシル） 、 アクラシノマイシン等の抗癌剤、 リシン A、 ジフテリアト キシン等の毒素、 アンチセンス RNA等を用いることができる。薬剤の封入は、 S旨質を 薬剤水溶液で水和することでリボソームに封入することができる。 またァドリアマイシ ン、 ダウノマイシン、 ェピルビシンについては、 H勾配を利用したリモートローディ ング法 (Cancer Res. vol.49, p5922, 1989) を用いて封入することもできる。 リボソーム表面上にモノクローナル抗体を結合させる方法としては、 精製抗体に ¾7k 性の物質をつけることでリポソ一ムに揷入させる方法、 ホスファチジルェ夕ノールァミ ンと抗体をグルタールで架橋させる方法等もあるが、 好適には、 抗体をチオール化した 後、 マレイミド基を導入した脂質を含むリボソームを作製して ¾¾S剤または毒素を封入 し、 両者を反応させることによってリポソ一ムの表面に抗体を結合させる方法を用いる ことができる。 また、 ァミノ基との反応部位、 および、 チオール基または潜在的チォー ル基部分を有する水溶性高分子誘導体も好適に用いることができる （特開平 1 1— 1 5 2 2 3 4号） 。一方、 残存マレイミド基にチオールィ匕したポリアルキレングリコール部 分を含む化^ l等を反応させることによって、 リボソームの表面修飾を行うことも可倉 である。
抗体へのチオール基の付与は、 抗体のァミノ基に対し、 タンパク質のチオール化に通 常用いられる N—スクシンィミジル一 3— ( 2—ピリジルジチォ) プロピオネート (S P D P ) や、 イミノチオラン、 メルカプトアルキルイミデート等の化合物を用いて行う 方法、 または抗体の内在性ジチオール基を還元してチオール基とする方法が用いられる せ、 内在性チォ一ル基を用いる方法が活 f雄持の点からより好ましい。 また、 抗体は、■ プシン等の酵素で F (a b，） 2化し、 さらにジチオスレィトール（D TT)'等で還元 、 F ( a b， ） 化して新たに生ずる 1〜 3個のチオール基をリポソ一ムとの結合反応 に供することもできる。 マレイミド基含有リボソームとチオール化抗体の結合は中性の' 緩種難 （p H 6 . 5 - 7. 5 ) 中、 2〜1 6時間反応させることで できる。
本発明の癌治療薬の製剤化には、 公知の方法つまり、 月 法 （特表平 2— 5 0 2 3 4 8号公報） 、 安定化剤を加え液剤として用いる方法 （特開昭 6 4— 9 3 3 1号公報） 、 凍結乾燥法 （特開昭 6 4 - 9 9 3 1号公報） 等の製剤化法を用いることができる。 本発 明の癌治療薬は、 血管内投与法や、 腹腔内等、 局所投与法で用いること力 sでき、 その投 与量は、 リボソームに含有された薬剤によって、 それぞれ最適な量とすることができる 。 アドリアマイシン封入体を例に取れば投与量はアドリアマイシン量として 5 O mg/ k g以下、 好ましくは 1 O mg/k g以下、 より好ましくは 5 mg/k g以下で用いる ことができる。
< 5 >本発明の診断試薬 本発明の診断 としては、 本発明の抗体の癌細胞特異性を利用する診断試薬が挙げ られる力 s、 具体的には、 本発明の抗体 二次抗 よび検出基質等からなる癌の診断試 薬などが挙げられる。
< 6 >本発明のポリペプチド
本発明のポリぺプチドは、 図 5に示すヒト脾癌細^ *P AN C- 1由来の約 5 5 kD aのタンパク質 （酉咧番号 1 0 7のアミノ酸配列を含むタンパク質） を特異的に認識す るポリペプチドである。 また、 正常細胞に対しては形態変化を弓 Iき起こさず、 癌細胞に 対しては形態変ィ匕を弓 Iき起こすポリペプチドである。 さらに、 図 5に示すヒト脬癌細胞 株 PAN C— 1由来の約 5 5 kD aのタンパク質 (配列番号 1 0 7のアミノ酸酉^]を含 むタンパク質） を特異的に認識し、 かつ、 正常細胞に対しては形態変化を弓 Iき起こさず 、 癌細胞に対しては形態変化を弓 Iき起こすポリペプチドである。前記約 5 5 kD aの抗 原タンパク質としては、 ヒ'メンチンを例示することができる。 ここで、 形態変化とは、 例えば、 図 1の Bおよび Dに示すような軸索状の形態、 wm ^ および、 神 ,鶴削離の魏を有する形態への正常細胞の形態変化が挙げられる。
,本発明のポリぺプチドとして、 具体的には、 後述の実施例に示すプロセヅプ Aに吸着 きれるポリぺプチドが挙げられる。 より好ましくは、 本発明のモノクロ一ナル抗体が挙 げられる。 本発明のボリペプチドは、 癌細胞特異的に形態変化を弓 Iき起こすため、 医薬 糸誠物、 特に、 非小細翻巿癌、 B萃癌、 胃癌などの癌の治療薬を するために用いるこ とがでぎる。 麵列
以下、 雄例により本発明についてより詳細に説明するが、 その要旨を越えない限り 以下に限定されるものではない。
( 1 )癌患者癌浸潤リンパ球とマウスミエローマとの細胞融合によるハイプリドーマの 作製
( 1 ) 一 1 . リンパ球の調製
肺癌患者から摘出した癌組織をメスで小塊にし、 培養液 A (RPM I 1 6 4 0 + 5 0 zg/mlゲンタマイシン硫 ϋ¾)中でよく振った後、 その培截夜 (I)を回収した。 さらに癌編裁の小塊を力ミソリ刃によって細かくほぐし、 新たな培養液 Α中でピぺヅテ ィングを行い、 細胞を分散させた。 この細胞懸濁液を 1000 r pmで 5分間遠心分離 して上清 （I I)を回収した。 Iと I Iを合わせ、 3000 r pmで 5分間遠心分離を 行い、 最終的に癌浸潤リンパ球を含む約 4 X 107個の細胞を得た。
(1) -2.細胞融合
癌浸潤リンノ球を含む細胞は、 ポリエチレングリコール 1500 (ロシュダイァグノ スティヅクス） を用いて、 マウスミエローマ細胞 (約 4 X 107個） と常法 (Cancer Re search vol.45, 263， 1985)に従い融合させた。融合させた細胞は、 培養液 B (±咅養液 Aに 10%ゥシ月台児血清 (FCS)を加えたもの） に細胞数が 5 X 105/mlの密度 になるよう懸濁し、 100〃1ずつ 96ゥエループレートに播種し、 37 の( 〇2ィ ンキュベー夕一中で培養を開始した。 二日目に 10〃Mヒポキサンチン、 0. 04 ,"M アミノプテリン、 1. 6〃Mチミジンを添加した培養液 B (HAT添加培養液） を各ゥ エルに 100 1ずつ添加し、 ハイプリドーマのコロニーが出現するまで培養を行った 。 ,その結果、 ハイプリド一マのコロニーが、 10ゥエル中に石鶴忍された。
(2) ヒトモノクローナル抗体の癌細 S敏朱への 性の検討
(2) 一 1.癌細膽と緩寺
出現したハイプリドーマの培養上清を用いて、 固定癌細 朱、 即ち、 肺癌株 HLC— 1 (癌 vol.67, No.4， pp483-4923 1976、 慶應義塾大学医学部、 鈴木氏より入手） 、 胃 癌株 MKN45 (癌と化 法， vol.5, p89, 1978、 免疫生物研鄉から入手）および 勝癌株 SUIT2 (国立病院九州ガンセンター、 井口氏より入手) に対する反応性を測 定し、 目的のハイプリドーマを選択した。 これらの癌細赚は、 培養液 C (D-MEM /F 12 + 50〃 g/m 1ゲン夕マイシン硫酉 に 5 %F C Sを添加した培養液' Dで 、 37°C、 5 %C02の条件で維持、 増殖させた。
(2) 一 2.癌細 J3嫌に対する反応性の測定
上記癌細騒朱は、 96ゥエル一プレートで 3日から 4日間、 一層になるまで培養を行 い、 上清を除 麦、 1 OmMリン酸緩衝液 （pH7. 4、 0. 15M NaCl) (P BS)で 1回流争した後、 2%パラホルムアルデヒド固定 （室温、 20分） を行った。 PBSで 5回 した後、 5%BSA (ゥシ血清アルブミン）含有 PB S鎌を 150 〃1/ゥエルずつ入れ、 ブロッキングを行った。 このプレートを PBSで 5回 争し、 50〃1のハイプリドーマ培養上清を加えて 37°C、 1時間半、 反応させた。 次に、 P 83で5回¾^争し、 50 1のホースラディッシュペリレオキシダーゼ （HRP) を結合 させたヒト抗体に対するャギ抗体 (1000培希釈、 カペル社） を加え、 37°C、 1時 間の反応を行った。 次に、 Tween20を 0. 05%を含んだ PBS (PBS-T) でプレートを¾¾争し、 o—フエ二レンジァミン ¾薩（5. 2%) と H202 (0. 0 15%) を含有したりん酸クェン酸緩衝液を 50 1/ゥエルずつ加え、 室温で発色が 確認できるまで反応させた後、 490 nmにおける吸光度をマイクロフオトメーター ( 日本インターメッド) によって測定した。反応性が石額忍できたゥエルから限界 尺によ つてクローニングを行い、 ハイプリドーマ株 H oAKs— 1を得た。 以下、 この株から 得られるモノクローナル抗体を HoAKs- 1抗体と呼ぶ。
'： ( 3 )モノク口一ナル抗体 H oAKs-1の精製と標識化
Ή 3) 一 1. ハイブリドーマ H oAKs-1の ί咅養とモノクローナル抗体 H oAKs- 1の精製
まず、 ゥシ胎児血清をプロテイン A—ガラスビーズカラム （プロセヅプ A) (bio PROCESSING)に素通りさせてプロセヅフ。 Aに吸着する物質を除去した血清 を作製し、 この血清を 7〜10%添加した培養液 Aを用いてハイプリドーマ HoAKs 一 1を培養した。 次に、 ハイプリドーマ HoAKs— 1を培養した培養液をプロセップ Aにかけることにより、 プロセヅプ A吸着ポリペプチドを吸着させ、 その後溶出させる ことによって、 プロセヅプ A吸着ポリペプチドを精製した。 このプロセヅプ AP及着ポリ ペプチドを以後、 HoAKs— 1抗体として用いた。 上記の血清を培養に用いることに よって、 血清由来の抗体等、 プロセヅプ Aに吸着する物質の¾λがない精製 HoAKs 一 1抗体が得られたと考えられた。 なお、 図には示していないが、 HoAKs— 1抗体 は、 ドデシル赚ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で純粋な I gMであることが 5鶴忍された。 (3) —2. HoAKs— 1抗体のピオチン標識
プロセヅプ Aで精製した HoAKs— 1抗体をビォチ二レーシヨンリージェント （ァ マシャムフアルマシアバイオテック) を用いて説明書に従いピオチン標識させた後、 ゲ ルろ過法によって標 !¾ϊ体と遊離のピオチンを分離した。
(4)生癌細騒朱および血管内皮細胞への作用の検討
(4) -1.癌細膽および血管内皮細胞と繊
ヒト癌細 «として肺癌株 HLC— 1、 胃癌株 ΜΚΝ45、 脖癌株 PANC— 1 (Α TCC No. CRL 1469)、 正常ヒト細胞として血管内皮細胞 HUVECs (大 日本製薬） を用いた。 これらの癌細騰は、 培養液 Dで 37°C、 5%C02の条件で維 持、 増殖させた。 ヒト血管内皮細胞 HUVECsは、 培養液 CS— C培養液 (Cell systems)を用い、 維寺、 ±曾殖させた。
(4) -2.癌細腿および血管内皮細胞の形態に与える影響の検討
も- HoAKs-1抗体をフィル夕一濾過して無菌化し、 約 140〃 g/m 1の纖とな るよう培養液 Cまたほ C S— C培養液で希釈し、 96—ゥエルプレートに 100 1 /' ゥエルずつ分注した。 次に、 各培養癌細胞および血管内皮細胞 HUVECsを、 それぞ れ 10%ヒト血清 (I CN Biomedicals)を含有した培養液 C、 または C S C—培養液で 3x104/m 1の密度に希釈し、 その細胞含有溶液を 100 1/ゥ エルずつ播種し、 ゥエル中の細胞数が 1. 5x103/ゥエル、 HoAKs- 1抗体の 濃度が約 70 g/m 1となるよう調製した。 このプレートを 37° (、 5%C02の条 件で培養した。 1日置きに 3回、 培養上清を上記と同様の条件となるよう交換し、 6日 目に細胞の形態変化を光学顕纖下で纏した。
I ^結果を図 1に示した。 正常細胞である血管内皮細胞 HUVE C sでは抗体の添加 によって細胞の形態変ィ匕が認められなかった （図 l—G, H)のに対し、 肺癌細月 朱 H LC-1 (図 1— A, B)、 S萃癌細 朱 PANC—1 (図 1— C, D)では抗体の添加 によって顕著な形態変化が認められた。 これらの細胞は、 軸索状の形態、 m m の形態、 若しくは神経細月繊の突起を有する形態に変化した。特に脬癌株 PANC— 1 は、 删犬態に陥った場合の形態に類似した変化を呈した。 また、 胃癌細騒朱 MKN4 5に対しても若干の形態変化が認められた （図 1— E, F) 以上より、 HoAKs— 1抗体は癌細腿に対して、 何らかの作用を与える可能性が示唆された。
(4) -3. 癌細腿朱に対する増慰 i卩制効果の検討
上記で形態変化の認められた肺癌細騒朱 HLC— 1、 胃癌細 «ΜΚΝ45および形 態変化の認められなかった正常細胞の血管内皮細胞 HUVE C sに対し、 同様の条件下 で 96ゥエル一プレートに癌細胞を播種し、 HoAKs— 1抗体の が約 7 Ojug/ mlとなる条件下、 37 5%C02の環境で培養し、 1日置きに 3回、 培養上清を 上記と同様の条件となるよう交換し、 6日目に MTTァヅセィ (J. Immunol. Methods v ol.70, p257, 1984) によって生癌細胞数の比較を行った。 比較として、 ヒト抗体 Ig M (ケミコン社製） を用い、 同様の実験を行った。
結果を図 2に示した。抗体を添加しなかったコントロール条件での細胞数を 100% とした場合、 HoAKs— 1抗体を添加することによって、 肺癌細胞株 HLC— 1では 約 60%、 胃癌細 «ΜΚΝ 45では約 50%の増藤 P制効果が認められた。 一方、 血 管内皮細胞 HUVECsにおいては差が認められなかった。 また、 比較として用いたヒ l gMでは、 その添カ卩による癌細 の増歹敏 P制効果は認められなかった。
形態変ィ匕の認められた膝癌細 朱 PAN C— 1を、 ゥエル中の細胞数が lxl 03/ ゥエルとなるように 96ゥエル一プレートに潮'重し、 HoAKs - 1抗体の濃度が 30 0 zg/mlN 100〃g/ml、 30〃g/mlの各ΐ^となる条件下、 37°C、 5 %C02の環境で培養し、 1日置きに 3回、 培養上清を上記と同様の条件となるよう交 換し、 6日目にプロモデォキシゥリジン (BrdU) セルプロライフレーシヨンァヅセ ィキット (Oncogene社製） によって生癌細胞数の比較を行った。 6曰目にキヅ トの説明に従って B r d U溶液を各ゥエルに添カロし、 オーバ一ナイ卜で培養を行い、 そ の間に生癌細胞に取り込まれた BrdU量を 7日目に測定した。 比較として、 ヒト抗体 I gMを用い、 同様の実,験を行った。
結果を図 3に示した。抗体を添加しなかったコントロール条件での B r dU取り込み 量を 100%として表示した。 HoAKs— 1ί亢体を添加することによって、 勝癌細胞 株 PANC— 1の増殖が 依存的に抑制されていることが ί鶴忍された。 比較として用 いたヒト I gMでは、 その添加による癌細 «の増 ¾卬制効果は認められなかった。
(5)各種組 片に対する^ 生の検討
(5) -1.各種糸且織切片の調製
HoAKs-1産生ハイプリドーマの作製に用いたリンパ球が由来した肺癌組 お よび同癌組 辺の非癌部肺組織片を、 常法に従ってホルマリン溶液で固定し、 パラフ インに包埋させて切片を作製した。 また、 各種癌細騰 （肺癌細腿朱： HLC— 1 (慶 應義塾大学）、 A 549および P C— 9 (免疫生物研麵 、 膝癌細離： S U I T 2 (九州ガンセンター） ， PANC— 1および PK8 (東北大学加齢医学研究所医用細胞 資源センター） 、 胃癌細騰： MKN45、 MKN74、 HSC-3 (いずれも免疫生 物研細）、 癌讓朱： HT29 (ATCC No. HTB38)、 DLD-1 ( ATCC No. CCL221)、 LoVo (ATCC No. CCL229)、 CO L0205 (ATCC No. CCL 222) )については、 それそれ培養液 Dで 37 。C、 5%C 02の条件で増殖させ、 それぞれ約 1 X 106〜 1 X 107個の細胞をヌード マウス (日本クレア) の皮下に移植し、 腫瘍を形成させた。形成した腫瘍を摘出し、 上 記と同様に を行って腫癟組織切片をそれぞれ作製した。
(5) -2.各種組織切片に対する反応性の検出
作製した各種組»片を常法に従い脱パラフィン麵し、 プロヅキング操作を行った 後に、 難例 (3) -2. に記載のピオチン標識した Ho AKs—1抗体を反応させた 。検出には、 DAKO Catalyzed Signal Amp lif icaio n (CSA) Sy s t em(DAKO)を用い、 その反応性は、 ジァミノベンチジンの 赤褐色の染色として検出された。 さらに上記免疫染色を行った組織切片は、 組織像を確 認するためにへマトキシリンによって組織中の細胞の核を青染させた。
反応性が認められた各種癌組織切片および自家肺非癌部組«片の染色像を図 4に示 した。 HoAKs— 1抗体は、 そのハイブリド一マが由来した自家肺癌組«片中の癌 細 および、 ヌードマウスで形成された肺癌株腫瘍： HLC—1および A549、 臈 癌株腫瘍： SUIT 2, PANC— 1および PK— 8、 胃癌株腫瘍： MKN 45の腫瘍 組«片中の癌細胞に明確な反応性が認められた。 一方、 非癌部組 »片に対する i¾ は認められなかった。
また、 図 4には示していないが、 コントロールとして、 ヒト血清から HoAKs— 1 抗体と同様にプロセップ Aカラムを用いて精製したヒト抗 または、 同様に取得した HoAKs-1抗体と同じサブタィプを有する I gM型ヒトモノク口一ナル抗体 Aを用 いた染色も、 上記と同様の手順で行った。 これらの抗体は、 難の、 PANC— 1細胞 の不溶性画分に対する威、性を有しないが、 上記各組織切片に対しても特異的な反応性 を示さなかった。
(6) HoAKs— 1抗体が認識する の麟斤
(6) -1.癌細腿からの ij ^サンプルの調製
細胞形態の著しい変ィ匕が引き起こさ ヌードマウス移植腫瘍での抗体 性が石鶴忍 された膝癌細 «P AN C— 1由来タンパク質を材料として、 ゥヱスタンプ口ット法に よって HoAKs— 1抗体が反応する物質の同定を試みた。 舰細腿 P AN C— 1を フラスコ中、 培養液 Dで 37。C、 5%CO 2の条件で増殖させた。 フラスコ中の培養上 清を除去し、 PBSで一回洗浄した後、 少量の PBSをフラスコに添加し、 セルスクレ τパーで細胞を剥がし、 遠心管に移して 1000 r pm、 5分間の遠心によって細胞を 回収した。さらに P B Sで二回 ¾K争した後、 ΤΝΕ -バッファ一 (1 OmM Tris— HCL (pH7. 6) ， 15 OrnM NaCl, ImM EDTA) +プロテアーゼイン ヒビ夕一 ( 5 /1 g/m 1ロイぺフ °チン、 5 ILL g m 1ぺプスタチン A、 5 g m 1キ モス夕チン (いずれもペプチド研究所) ) を回収した細胞の 10倍量 (v/v)加え、 氷冷中でガラス製ホモジナイザーを用いて細胞を破壊し、 10000g、 20分間遠心 を行い、 可溶性の上清画分と不溶性の«¾を得た。 ¾W¾については、 RIPA—バ ッファー（5 OmM Tr i s-HCL (pH8. 0)、 150 mM NaCl、 1% Nonidet P-40, 0. 5% デォキシコール酸、 0. 1%
SDS) +プロテア一ゼィンヒビ夕一 （ 5 /m 1ロイぺプチン， 5〃g/mlぺ ブス夕チン A, 5〃g/mlキモス夕チン) を、 先に加えた TNE—バヅファーと同量 添カロして懸濁させ、 超音波破碎機に約 3分間かけて沈殿を分散させた。
(6) —2. ウエスタンプロットによる角晰 上記の P ANC— 1由来可溶性画分タンパク質および R I PAバッファーで可溶化さ せた不溶性画分タンパク質をそれぞれ約 20 gずつ用いて、 2〜15%ァクリルアミ ドグラジェントゲルで電 永動を行った。電 永動後、 ゲルから PVDF膜にタンパク 質を転写し、 PVDF膜をブロッキングした後に、 HoAKs— 1抗体を 4°C、 0/N 、 さらに 37°Cで 1時間、 反応させた。 PVDF膜を PBS— Tで洗浄し、 ホースラデ ィヅシュペルォキシダ一ゼ （HRP)を結合したヒト抗体に対するャギ抗体 (1000 培鎌、 カペル） を加え、 さらに 37°C、 1時間の威、を行った。 次に、 PBS— Tで PVDF膜を辦し、 HoAKs— 1の Sii:、物質をウェスタンブロヅティングルミノ一 ルリージェント （San t a Cruz B i o t e c hn o 1 o gy)で検出した。
P ANC— 1細胞由来タンパク質の電 永動パターン （Coomassie Br i 11 i ant B lue染色) とウェスタンブロヅトの結果を図 5に示した。 HoAK s— 1抗体は、 膝癌細賺 PAN C— 1細胞ホモジネートの不溶性画分 （膜画分） 中、 約 55kD aの単一夕ンパク質に対して ]¾5性を示すことがわかった。
(6)一 3. アミノ酸配列分析
ί上記の R I Ρ Αノ1?ヅファ一で可溶化させた P A N C— 1由来の不溶性画分約 560〃 を、アマシャムネ土製 P 1 u s 0 n e 2-D Clean— Up kitを用いて処理し た後、 約 40 gずつ二次元電 永動にかけた。 一次元目の電気泳動では、 ZOOM STRIP (pH3- 10NL) (Invi t roge n社製) にサンフ°ルを膨潤させ て等電点電 永動を行い、 二次元目は 10%アクリルアミドゲルを用いて SDS—電気 泳動を行った。 上記ウエスタンブロット法と同様の方法を用い、 二次元電気泳動パター ン上で Ho AKs— 1の Si¾物質を検出した。 同じサンプルについて 13回の二次元電 気泳動を行い、 電気泳動後のゲルを C 00 m a ssie Brilliant B lu eで染色し、 ウェス夕ンブロットの結果を参照して、 HoAKs— 1抗体反応物質に相 当するスポットを 13個分ゲルから切り出した。
切り出したゲル片を 争し、 リジルエンドぺプチダーゼを含むトリスバヅファー (p H8. 5) を加えて 35°C、 オーバーナイトの麵を行った。 その後、 溶液を逆相 HP LC (TSKgel ODS-8 OTs)に供して断片ペプチドを分離した。分離された ぺフ。チドのうち、 フラクション No. 58についてアミノ酸配列分析装置 （Proci s e 494 HT Protein Sequencing S y s t em)を行い、主に 検出されたアミノ酸から、 N末端が Valで始まるペプチドの配列を 12¾¾目まで確 定した。 その配列は、 VELQELNDRFAN (配列番号 107)であり、 ホモロジ 一リサーチの結果、 各種ビメンチン （Mol. Cell. Biol. Vol. 6， p3614- 3620， 1986, G eiiBank Accession No. M14144)およびデスミン（Gene vol. 78, p243- 254， 1989)の内 部酉^ Jに一致してレ寸こ。 ビメンチンおよびデスミンは細胞骨格のフイラメントであるこ とから、 HoAKs-1抗体は細胞骨格のフィラメントに反応性を有する抗体であることが考え られた。
HoAKs— 1抗体は、 このアミノ酸配列 VELQELNDRFAN (酉 S^J番号 10 7) を含むタンパク質を介して癌細胞に形態変ィ匕 (図 1)や増殖抑制効果 (図 2または 3) を及ぼしたと考えられたが、 HoAKs— 1抗体を培養液中に添加することによつ て癌細胞が形態変化等を起こしたことから、 この K ^夕ンパク質は癌細胞の膜表面に存 在することが予想された。
(7) ヒトモノクローナル抗体 H oAKs-1遗伝子の取得と塩基配列の^
':'HoAKs_ 1抗体産生ノヽイブリドーマから RNeasy Protect Min ί kit (QIAGEN)を用いて全 RNAを調製した。逆転写 SiSは、 ランダム 9m erをプライマ一として、 RNA PGR KIT (AMV) (TaKaRa) を用い て行い、 cDNAを合成した。
P C R増幅用プライマ一としては、 職口の抗体配列 (J Mol Biol. Vol.222, pp581-5 97， 1991) に基づいて、 誦可変領域の増幅用には、 ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム 1で保存されている N末側アミノ酸配列 （配列番号 2、 4、 6、 8、 10および 12) にそれそれ対応する PCRプライマー VH1 (配列番号 1 )、 VH2 (配列番号 3 )、 VH3 (配列番号 5)、 VH4 (配列番号 7)、 VH5 (配列番号 9)、 VH6 (配列 番号 11) の等量混合物を 5， 側に、 ヒト抗体重鎖可変領域のフレーム 4で保存されて レ、る C末側ァミノ酸配列 （配列番号 14、 16、 18および 20 ) にそれぞれ対応する PCRプライマ一 JH1 (配列番号 13) 、 JH2 (配列番号 15) 、 JH3 (配列番 号 17)、 JH4 (配列番号 19)の等量混合物を 3， 側に用いた。
鎖可変領域の増幅用プライマーには、 ヒト抗体 鎖可変領域のフレーム 1で保存さ れている N末側アミノ酸配列 （配列番号 22、 24、 26、 28、 30および 32) に それそれ対応する PC Rプライマー VK1 (酉^ J番号 21) 、 VK2 (酉己列番号 23) 、 VK3 (嗣番号 25) 、 VK4 (配列番号 27) 、 VK5 (配列番号 29)、 VK 6 (配列番号 31) の等量混^ を 5， 側に、 ヒト抗体 鎖可変領域のフレーム 4で保 存されている C末側アミノ酸配列 （配列番号 34、 36、 38、 40および 42) にそ れぞれ対応する PCRプライマー JK1 (配列番号 33) 、 JK2 (配列番号 35) 、 JK3 (配列番号 37) 、 JK4 (配列番号 39) 、 JK5 (配列番号 41) の等量混 合物を 3' 側に用いた。
入鎖可変領域の増幅用プライマーには、 ヒト抗体え鎖可変領域のフレーム 1で保存さ れている N末側アミノ酸配列 （配列番号 44、 46、 48、 50、 52, 54および 5 6 ) にそれぞれ対応する P C Rプライマ一 V L 1 (配列番号 43) 、 VL2 (酉 B ^番号 45) 、 VL3 (酉 [J番号 47) 、 VL4 (配列番号 49) 、 VL5 (配列番号 51) ヽ VL6 (配列番号 53)、 VL7 (配列番号 55) の等量混合物を 5， 末端に、 ヒト 抗体； I鎖可変領域のフレーム 4で保存されている C末側アミノ酸配列 （酉例番号 58、 60および 62) にそれぞれ対応する PCRプライマ一 JL 1 (配列番号 57)、 JL 2 (配列番号 59) 、 JL3 (配列番号 61) の等量混^ %を 3， 末端に用いた。
P CR反応は、 Perk in Elmer Gene Amp PCR S y s t e m 2400を用い、 RNA PCR KIT (AMV) (TaKaRa) を用いて説 明書に従って行った。 その結果、 車達員については、 鎖用プライマ一による PC Rで増 幅され、 人腕プライマーでは増幅されなかったため、 ハイプリドーマより産生される 抗体の車 貞は 鎖:であることがわかった。
増幅された重鎖、 軽鎖各々の可変領域 D NA断片は、 MinElut e PCR P ur if i cat ion kit (Q IAGEN) を用いて精製した。 次に、 TOPO
TA cloning k i t (インビトロジェン）を用いて、 pCR2. 1— TOP 0と上記の精製 P CR産物とを連糸吉させ、 大腸菌のトランスフォーメーションを行った 。 生じたコロニーをピックアップし、 QI AGEN Plasmid mini ki t(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製し、 EcoRIで 37°C15分間消化して 、 2%ァガロース電気泳動で目的 DN A断片が組み込まれていることを確認した。
塩基配列は、 目的の DN A断片が組み込まれた複数のコロニーについて、 Ml 3ブラ イマ一を用いて、 CEQ 2000 DNA Analysis System (Be ckman)により角蜥した。その結果、重鎖の籠からは H09 (配列番号 63)、 H 12 (酉 B ^番号 65)、 H27 (配列番号 67)、 H30 (酉 ι」番号 69)の 4種類の 配列が得られた。 K鎖の籠からは、 K30 (配列番号 71)、 K31 (酉咧番号 73 )、 K32 (配列番号 75)、 K35 (嗣番号 77)、 K39 (配列番号 79)、 K M05 (配列番号 97)、 KM06 (酉 H ^番号 99)、 KM026 (配列番号 101) 、 KM036 (配列番号 103) 、 KMO 40 (配列番号 105 ) の 10禾靡貝の配列が 得られた。 これらのうち、 H09、 HI 2、 H27、 H30、 K30、 Κ31、 Κ32 、 Κ35、 Κ 39がヒトの重鎖または画をコードしていると考えられた。 これらの塩 M,および対応するアミノ酸配列 （廳員：配列番号 64、 66、 68、 K鎖：配列 番号 70、 72、 74、 76、 78、 80) を比較することによって、 翻および麵 それぞれについて、 可変領域の塩基配列 （重鎖：配列番号 81、 軽鎖：配列番号 83) およびアミノ酸配列 (mm：酉例番号 82、 車，員：配列番号 84)を決定した。
HoAKs- 1抗体遺伝子について、 上記で した配列よりもさらに 3'側の領域 の酉 H ^を決定した。重纖伝子の 3， 側領域の増幅は、 ヒト抗体重鎖可変領域のフレー ム 1で保存されている N末側アミノ酸酉例に対応する PCRフライマー VH3 (配列番 号 5) を 5， 側プライマ一に、 ヒト抗体 常領域中のアミノ酸酉綱に対応する PC Rプライマー IgMFOR (配列番号 108)を 3， 側プライマーに用いた P CRによ り行った。得られた PC R産物を、 上記と同様にしてプラスミドに組み込んで塩基配列 を決定した。 その結果、 上記重鎖可変領域の塩基配列 （配列番号 81)の 3， 側に続く 57塩基の配列 （酉例番号 110)を新たに することができた。 この塩基配列は 1 9アミノ酸 麵番号 111) をコードしていると予想された。 この 57塩基を加えた HoAKs— 1抗体重鎖1伝子の塩基配列と、 予想されるァミノ酸配列を、 それそれ配 列番号 118、 配列番号 119に示した。 一方、 この 57塩基には、 定常領域をコ一ド する配列も含まれるので、 可変領域をコードしている部分 （24塩基） のみを加えた H 0八1^ー1抗体磨貞可変領±顧伝子の塩基配列と、 予想されるアミノ酸配列を、 それ それ配列番号 114、 配列番号 115に示した。
HoAKs-1抗体 纖伝子の増幅は、 ヒト抗体/ c鎖可変領域のフレーム 1で保存 されている N末側アミノ酸配列に対応する PCRプライマー VK4 (配列番号 27)を 5'側プライマーに、 ヒト抗体 ま腕常領域の C末側アミノ酸配列に対応する PCRプ ライマー GKFOR (配列番号 109)を 3， 側プライマ一に用いた P CRにより行つ た。得られた PCR産物を、 上記と同様にしてプラスミドに組み込んで塩基配列を した。 その結果、 上記 鎖可変領域の塩基配列 （配列番号 83) ©3'側に続く 99塩 基の配列 （酉 [|番号 112) を新たに決定することができた。 この塩基配列は 33アミ ノ酸 （配列番号 113)をコードしていると予想された。 この 99塩基を加えた ΗοΑ Ks—l抗体 鎖遺伝子の塩基配列と、 予想されるアミノ酸酉 H^Jを、 それぞれ酉洌番号 120、 配列番号 121に示した。一方、 この 99塩基には定常領域をコードする酉洌 も含まれるので、 可変領域をコ一ドしている部分 (24塩基） のみを加えた HoAKs —1抗体 Λ:鎖可変領域遺伝子の塩基配列と、 予想されるアミノ酸酉己列を、 それぞれ配列 番号 116、 酉 !]番号 117に示した。
超可変領域 (CDR)とフレームワークの境目は Kab a tらの文献 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition National Institutes of Healt h, Bethesda, MD 1991年）を にして決定した。その結果、重鎖の CDRは HCDR 1 (塩基配列：配列番号 85、 ァミノ酸配列：麵番号 86)、 HCDR2 (塩基删 ：.:酉 1]番号 87、 ァミノ酸配列：酉 H^y番号 88 )および H CDR3 (塩基配列：配列番 号 89、 アミノ酸配列：
Figure imgf000026_0001
0)、 車 11貞の CDRは LCDR1 (塩基配列：配列 番号 91、 アミノ酸配列：配列番号 92)、 LCDR2 (塩基配列：配列番号 93、 ミノ酸配列：配列番号 94)および LCDR 3 (塩基配列：酉己列番号 95、 アミノ酸配 列：配列番号 96 ) と^することができた。
(8)形態変化の持続性
HoAKs-1抗体の添カロによって形態変ィ匕が認められた膝癌細腿朱 PAN C— 1を 用い、 その形態変化の持続性を検討した。 HoAKs- 1抗体の ¾が約 100 g/ mlとなる条件下、 37°C、 5%C02の環境で滕癌細胞株 PANC— 1を 5日間培養 した後、 HoAKs— 1抗体を含有しない培養液に交換し、 さらに 7日間培養を 镜し た。 HoAKs— 1抗体を除去してから 3日後、 6日後、 7日後の細胞の形態を顕纖 で観察した結果を図 6に示した。 H 0 A K s— 1抗体によって引き起こされた P A N C 一 1細胞の形態変化は、 抗体を除去した後も長期間 镜して認められた。 (9) HoAKs-1抗体の生癌細胞表面への結合活性
脾癌細 »、PANC— I 肺癌細腐朱 HLC— 1および血管内皮細胞 HUVE C sを 96—ゥエルプレート （3603、 コーニンク握） に播種し、 37°C、 5%C02の 環境で培養を一日行った後、 難例 (3)一 2に記載のピオチン標識した Ho AKs— 1ί亢体を 50 g/mlの (0. 05%アジ化ナトリウム含有） で添加し、 室显、 60分間反応させた。 亢体溶液を除去した後、 20nM—QdotTM565ストレブ トァビジン標識（Quantm Dot Corporatio n¾S¾) ¾ ( 0. 0 5%アジ化ナトリウム含有） を加えて室温、 30分間反応を行い、 本溶液を除去して P BS (0. 05%アジ化ナトリウム含有) を添加し、 共焦点蛍光顕微竟 (CSU10、 横河 «W朱式会社製） での観察を fi1つた。各生細胞表面に対する Ho AKs— 1抗体の 結合活性を図 7に示した。 HoAKs— 1抗体は、 PANC— 1細胞および HLC— 1 細胞の生細胞表面に結合活性を示した （図 7— A, C)が、 HUVECs細胞に対して は結合活性を示さなかった (図 7 - E)。 コントロールとして用いたヒトェ gM抗体は 、 いずれの細胞に対しても結合活性を示さなかった (図 7—B, D， F) o
¾10)滕癌細 »P AN C— 1由来の約 55 kD aタンパク質に対するマウスモノク 口—ナル抗体の作製
(10) -1. マウスへの免疫および細胞融合
鶴例 (6)— 1と同様の方法で PANC— 1細胞のホモジネートから RIPAバッ ファーで可溶化させた不溶性画分タンパク質を調製し、 約 180〃g分について 10% ァクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。 電 永斷麦、 ゲルを C 0 oma s s i e Brilliant Blueで染色し、 H o AK s— 1抗体が反応性を示す約 5 5 kD a夕ンパク質に相当するバンドを切り出した。
切り出したゲルを破砕し、 0. 2 m 1のコンプリートフロイントアジュバント (D I FCO LABORATORIES社製） と混合してマウス （Balb/c A J c 1 、 6週令、 、 日本クレア） の腹腔に注入し、 初回免疫を行った。 さらに 2週間後、 ィ ンコンプリートアジュバントとゲルを混合し、 上記同様に調製をして同マウスに再度免 疫を施した。 その 4日後、 同マウスの脾蔵を摘出してリンパ球を調製 （2. 4 108 個） し、 定法 （単クローン抗体実験マニュアル、 講談社サイェンティヅフイク出版） に 従いマウスミエローマ細胞 P3U1と融合させた。 融合させた細胞は、 培養液 D (eR DF + 50 g/m 1ゲン夕マイシン«+ 10%FCS)に通常使用 の HAT を添加した培養液に懸濁し、 96ゥエル—プレートに播種し、 37° C02インキュ ベータ一で培養を開始した。 融合から約 2週間後、 ハイプリドーマの出現を確認し、 そ の培養上清を用いて約 55 kD aタンパク質に対する反応性をウエスタンプロヅティン グ法によって検出し、 目的のハイプリド一マを選択した。
(10) -2.約 55 kD aタンパク質に対する 性の検出
PANC- 1細胞のホモジネ一卜から RIP Aバヅファ一で可溶化させた不溶'性 画分タンパク質、 約 4mg分について 10%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行 い、 ゲルから PVDF膜にタンパク質を転写してブロヅキングした。 (10) — 1の 9 6ゥエル一プレートの各ゥエルについてその培養上清を回収し、 転写した PVDF膜と 37° 1時間反応させた。 Ρ V D F膜を P B S— Τで 'し、 HRPを結合したマウ ス抗体に対するャギ抗体 (1000倍希釈、 カペル) を加え、 さらに 37°C、 1時間の 反応を行つた。 次に、 PBS— Tで PVD F膜を洗浄し、 培養上清の約 55 k D aの夕 ジパク質に対する 性をコニカイミュノスティン HRP— 1000 (コニ力株式会社 製） を用いて検出した。 iS性が検出されたゥエルから限界希釈法によってクローニン グを行い、 ハイブリドーマ株 2 F 6- 1および 3 F 9- 1を樹立した。
(11)抗 55 kD aマウスモノクローナル抗体の生癌細胞表面への結合活性
(11) -1.抗 55 kD aマウスモノクローナル抗'体の精製とネ票識化
(10) — 2で樹立したハイブリド一マ株 2 F 6— 1、 および 3 F 9— 1を培養し、 それぞれの培養上清を回収してプロセップ Aにかけ、 抗体を精製した。 SDS—PAG Eによってそれぞれのモノクローナル抗体は、 いずれも I gMであることが確認された 。精製した各抗体をビォチ二レーシヨンリージェントを用いて説明書に従いビォチン標 言哉させた後、 ゲルろ過法によって標識抗体と遊離のピオチンを分離した。
(11) -2.生癌細胞表面への結合活性 (9) と同様に脾癌細腿朱 PAN C— 1、 肺癌細 «HLC— 1および血管内皮細胞 HUVECsを 96—ゥエルプレート （3603、 コ一ニングネ選） に擦重し、 37°C 、 5%C02の環境で培養を一日行った後、 （11) —1に記載のピオチン標識した抗 55 kD aマウスモノクローナル抗体を 50 g/mlの濃度 (0. 05%アジィ匕ナト リウム含有） で添加し、 室温、 60分間反応させた。抗体溶液を除去した後、 20nM — Qdot TM565ストレプトアビジン標識 （Quantm Dot Corpor at io nネ: t ) ¾ (0. 05 %アジ化ナトリゥム含有） を加えて室显、 30分間反 応を行い、 本 夜を除去して PBS (0. 05%アジ化ナトリウム含有） を添加し、 共 焦点蛍光顕 « (CSU10、 横河 式会ネ: での を行った。 各生細胞表面 に対する抗体の結合活性を図 8に示した。 2F6- 1および 3F 9 - 1由来の抗体は、 (9) に記載の HoAK.s— lと同様、 PANC— 1細胞と HLC—1細胞に対してそ の生細胞表面に結合活性を示した （図 8— A、 B、 D、 E)が、 HUVECs細胞に対 する結合活性は示されなかった (図 8—Gヽ H)。
( 12) ゥエル夕ンプロヅティングによる抗ビメンチン抗体および抗デスミン抗体の約 55 kDa夕ンパク質に対する反応性
'PANC- 1糸田月包のホモジネートから Rェ P Aバッファーで可溶化させた不溶性画分 タンパク質を 10%アクリルアミドゲルの各レーンにつき、 約 10 gのせ、 電気泳動 を行い、 ゲルから PVDF膜にタンパク質を転写してブロッキングを行った。 抗ビメン チンマウスモノクローナル抗体（s c— 6260、 Santa Cruz Biote chno 1 og - i)およびャギ抗デスミン抗体 （ s c— 7559ヽ Santa C ruz B i o t echno 1 ogy棚 を PVDF膜と 37。C、 1時間反応させた 後、 PVD F膜を P B S— Tで洗浄し、 HRPを結合したマウス抗体に対するャギ抗体 ( 1000倍希釈、 カペル） またはャギ抗体に対するマウス抗体 (1000倍希釈) を 加え、 さらに 37°C、 1時間の反応を行った。 次に、 PBS— Tで： PVDF膜を洗浄し 、 抗体の反応物質をウェルタンブロヅティングルミノールリージェントで検出した。抗 ビメンチン抗体は、 約 55 kDaのタンパク質に対して 性を示したが、 抗デスミン 抗体の S ^性は検出されなかつた
これらの結果から、 HoAKs-1抗体が認識する P AN C - 1由来の約 55 k D a 夕ンパク質はビメンチンであると判断され 該タンパク質に反応性を有する抗体には生 癌細胞表面へ結合活性を有するものも存在するということが証明された。
(13) ァ—HoA. (繊ぇ HoAKs - 1抗体） の作製
(13-1) c DN Aの作製および HoAKs— 1可変領域 DN A断片の取得 全 RNA (難例 (7)に記載） からの cDNAの調整および PCR iSま、 Per kin Elmer Gene Amp PCR System 2400を用い、 T he r mo Scri t RT— P CR Systems plus p 1 a t i nu m Ta DNA polymerase Hi h Fidelity ( I n v i t rogen)を用いて説明書に従って行った。 重鎖の c D N Aを調製するためのプラ イマ一には、 キットに付属の random hexamer sを用いた。 鎖の cDN Aを調製するためのプライマーには、 P 1 (配列番号 122)を用いた。
filおよび/ ί鎖の可変領域の増幅には、 発現プラスミドと連結するための制限酵素サ ィトを導入したプライマ一を用いた。 重鎖可変領域の増幅には、 5'末端側に Hind I I Iサイトおよびシグナル配列を含む P 2 (配列番号 123)、 3， 末棚に N he I：サイトを含む P 3 (酉己列番号 124)を用いた。 鎖可変領域の増幅には、 5'末端 側に H indl I Iサイトおよびシグナル配列を含む P 4 (配列番号 125) 、 3， 末 端側に Bs iWIサイトを含む P5 (配列番号 126)を用いた。
増幅された重鎖、 K鎖各々の可変領域 D N A断片は、 QI Aqui ck PCR P urif icat ion Kit (Q I AG EN) を用いて精製した。 次に、 発現べク 夕一と連結するため、 D N A断片を制限酵素で消ィ匕した。 重鎖 DNA断片は Hindi I Iおよび Nhe Iで 37°C、 2時間消化した。 鎖 DNA断片ははじめに B s i WI で 37 °C、 2時間消化した後、 QIAqui ck PCR Pur if i cat ion Kit (QIAGEN)で精製し、 さらに H i nd I I Iで 37°C、 2時間消化した 。 消ィ匕した DNA断片は 1· 5%ァガ口一ス電気泳動し、 目的の DNA断片を QI Aq ui ck Gel Extraction K i t (Q I AGEN)を用いて精製した
(13— 2)発現プラスミドの切断およびプラスミド断片の取得 HoAKs— 1のヒト IgGl型疆奐ぇ抗体を発現させるため、 纖発綱プラスミ ドとして重鎖 常領域の配列を含む pEX— G1— WLpHy、 鎖発糊プラスミド として 鎖定常領域の配列を含む pKS— / c '—Hind— 5を用いた。 pEX— G1 — WLpHyは Hindi I Iおよび Spe Iで 37°C、 2時間消化した。 pKS— £— Hind— 5は Asp718で 37°C、 2時間消化した後、 QIAqui ck P C Purif icat ion K i t (Q I AGEN) で精製し、 さらに H i nd 111で37°〇、 2時間消化した。 消化した断片は 0. 8%ァガロース電気泳動し、 目 的の断片を QIAqui ck Gel Extract ion Kit (QIAGEN ) を用いて精製した。
(13-3) HoAKs- 1可変領域の発現プラスミドへの連結
上記の方法により得られた H oAKs-1の憲貞可変領域を含む D N A断片と切断し た発現プラスミド pEX— G 1— WLpHyは、 L i gat i on Kit Ver. 2. 1 (TAKARA) を用い、 説明書に従って連結させ、 昜菌 DH5ひ— T 1 (I nvi t ro en) を説明書に従レ、形質転換した。生じたコロニ一をピヅクァヅプし 、 QIAprep Spin Mi n i p r e p K i t (Q I AGEN) を用いてプ ラスミドを精製した。 重鎖:塩基配列を含むプラスミドは Ndelで 37°C、 1時間消化 し、 1. 5 %ァガロース電気泳動を行い所望のプラスミド p EX— H o AK s—Hを得 た。得られたプラスミドは、 55 末端側に P6 (配列番号 127)、 33 末端側に P7
(配列番号 128) を用いて塩基配列を確認した。 HoAKs— 1組換え抗体の重鎖構 造遺伝子の塩基配列を配列番号 129に示す。
一方、 HoAKs- 1の 鎖可変領域を含む DN A断片と切断した発現プラスミド p KS-/C '— Hind - 5は、 Li at i on Kit Ver. 2. 1 (TAKA A) を用い、 説明書に従って連結させ、 ^ISDH5a-Tl (Invit roge n)を形質転換した。生じたコロニーをピックアップし、 Q I Apr ep Spin M iniprep Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製した。 鎖塩基配 列を含むプラスミドは B s i W Iで 37 °C、 1時間消化し、 1. 5 %ァガロース電気泳 動を行い所望のプラスミド pKS— HoAKs— Kを得た。 得られたプラスミドは、 5 5 末端側に P6、 35 末端則に P 1を用いて塩基配列を石鶴忍した。 HoAKs— 1織奐 え抗体の 鎖構; it¾伝子の塩基配列を配列番号 131に示す。
(13-3) HoAKs— 1重鎖と HOAKS— IA:鎖を含むプラスミドの連結
HoAKs-1の重鎖と 鎖をひとつのプラスミドに連結するため、 上記で得られた プラスミドを制限酵素で消化した。 pEX— 110 1 3—11は 1161で37°〇、 2時 間消化し、 1：3—110八1 3— 1(は 1161ぉょび3 6ェで37° 2時間消化し た。得られた断片は QIAqui ck PC Purif ication Kit ( Q I AGEN)を用いて精製した。各々の断片を Li gat ion Kit Ver. 2. 1 (TAKARA)を用いて説明書に従い連結させ、 大腸菌 DH 5ひ一 Tl (In vi t r ogen)を形質転換した。 生じたコロニーをピックアップし、 QIApre p Spin Minipr ep Kit (QI AGEN) を用いてプラスミドを精製 した。 得られたプラスミドを Nhe Iで 37° 30分間消化し、 0. 8%ァガロース 電気泳動を行って所望のブラスミド pEX - HoAKs - HKを得た。
(13-4) r-HoA.発現プラスミドの作製
¾上記で得られた pEX— 110 1^ー111：と( ]1：0^>遺伝子を含むプラスミド p:SV: 2dhf r " を連 ϋ吉させ、 r-HoA.発糊のフ。ラスミドを作製した。方法として は、 まず pEX— HoAKs— HKを BamHIおよび Nhe Iで 37。C、 2時間消化 した後 0. 8%ァガロース電 永動し、 目的の DNA断片を QIAqui ck Gel
Ex traction Kit (Q I AGEN)を用いて精製した。 pSV2dhf r " は BamHIおよび Nhe Iで 37°C、 2時間消化した後 A lkal ine P hos hatase (TAKARA)を添加して 65°C、 15分間処理し、 QI Aq ui ck PCR Purif ication Kit (Q I AG EN) を用いて精製 した。その後 0.8%ァガロース電気泳動し、目的の DNA断片を Q I Aqui ck' G el Extract ion K i t (Q I AGEN)を用いて精製した。
各々の断片を Li gat i on Kit Ver. 2. 1 (TAKARA) を用い、 説明書に従って連結させ、 大腸菌 DH5ひ一 Tl (Invi t r ogen)を形質転換 した。 生じたコロニーをピックアップし、 Q I Aprep S in Minipre p Kit (Q I AGEN) を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドを N 61で37°〇、 1時間消化した後、 1. 5%ァガ口一ス電 永動を行って謝奐ぇ抗体 を発現させるための所望のプラスミド pEX— HoAKs— HK/pSV2dhf r '
' を得た。
(13-5) r-HoA. 生産細胞の作製
ァ一 HoA. 産生のための細胞株として、 無血清培地で培養可能な CH〇 (DG32 5)細 J3 を用いた。 CHO (DG325) を CHO— S— SFMI I (GIBC0) にて 1 X 106 c e 11 s /mlに調整した。 2〃 gの p EX— H o AK s _HK/p SV2dhf r '， DNA と 6 /Lの FuGENE 6 (Roche) を混合し、 説 明書に従って CHO (DG325) にトランスフエクシヨンした。 トランスフエクショ ンして 5時間後に E X— C ELL325-PF (ニチレイ) を添加した。 2日間培難 G418 Sulf at e (P r ome ga) 40 O^zg/mlおよびメトトレキセ一 ト （S igma) 0、 もしくは 25、 もしくは 50 nMを選 として培地に添加し て培養し、 ァー HoA. を生産する細胞を得た。
,-.(13-6) ELI SA Assayを用いた抗体生産量の測定
細胞が生産するァ一HoA. の生産量は、 サンドイッチ EL I S A法により測定した まず、 ゥサギ抗ヒトイムノグロブリン抗体（CAPPEL) を 50 /g/mlに溶液 1 (PBS)で希釈し、 96 we 11フレキシブルプレート (FALCON)に 50 L we 11ずつ添加し、 37 °Cで 2時間処理した。 その後、 we 11の溶液を捨て、 各 w e l lに溶液 2を 200 Lずつ添加し、 4°Cで 16時間以上処理した。各 w e 11の 溶液を捨て、 溶液 2 (0. l%Gelat in/PBS/0. 05%Tween20) で希釈した培養上清を 5 Oju L/w e l lずつ添加し、 4 °Cで 16時間以上反応させた o反応後、 各 we 11の溶液を捨て、 溶液 3 (PBS/0. 05%Tween20) で 5回洗浄した後、 溶液 2で 1000倍に希釈した HRP標識ゥサギ抗 bトイムノグロブ リン抗体（CAPPEL) を 50〃L/we 11ずつ添加し、 37°Cで 1時間反応させ た。各 w e 11の溶液を捨て、 PBS/0. 05%Tween20で 5回洗浄した後、 0—フエ二レンジアミン錠 （和光糸幢） を 5 OmMクェン酸緩衝液 (pH5. 0) で溶 解し過酸化水素水を添カロした基質液 （遮光 ·用時調整） を 50 ^L/wellで添カロし た。室温で 3分間ほど反応させて発色させた後、 IN H2S04を 50 /L/we 1 1を添加して反応を停止させ、 マルチプレートリーダ一 SPECTRA MAX 25 0 (Molecular D e v i c e s)で L 1 =495 nmおよび L 2 = 650 n mの吸光度 A 1および A 2を測定し、 (A1-A2)を算出した。 ヒト IgGlA: (C APPEL)を希釈して標準激夜として観線を作製し、 ±咅養上清中の抗体量を算出し た。算出した結果より、 抗体の生産量が最も高い細胞を邀尺し、 7-HoA. の生産に 用いた。
(13-7) 7-HoA. の精製
上記で得られたァ一 Ho A.生産細賺を G418 Sulf at e (Pr omega ) およびメトトレキセ一ト （Sigma)を添加した EX— CELL 325— PF (二 チレイ） で培養し、 r-HoA. を含む培養液を得た。 次に、 その培養液をプロセヅプ Aにかけることにより、 r-HoA. を吸着させ、 その後溶出させることによってァー HoA. を精製した。 なお、 図には示していないが、 r-HoA. は、 SDS-PAG Eで純粋な I Gであることが確認された。
K14 )膝癌細 «PAC— 1由来の約 55 k D άタンパク質に対するァ一 H o A · の反 応性の検出 .
PANC- 1細胞のホモジネートから RI PAバヅファ一で可溶化させた不溶性画分 タンパク質を各 10 g分について 10%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い 、 ゲルから PV—DF膜にタンパク質を転写してブロッキングした。 転写した PVDF膜 を （13— 7) に記載の精製ァー HoA. と 37°C、 1時間 させた。 PVDF膜を PBS— Tで洗浄し、 HRPを結合したヒト抗体に対するャギ抗体 (1000倍希釈、 カペル） を加え、 さらに 37°C、 1時間の反応を行った。 次に、 PBS— Tで PVDF 膜を洗浄し、 約 55kDaのタンパク質に対するァ一 HoA. の反応性をウエスタンブ ロッテイングルミノールリージェント （Santa Cruz B i o t echno 1 ogy)で検出した結果、 ァ一 HoA. は HoAKs— lと同様、 約 55 kD aのタン パク質に対して反応性を示すことがわかった。 (15) ァ— Ho A. の生癌細胞表面への結合活性
膝癌細 朱 P ANC— 1、 肺癌細胞株 HL C— 1および血管内皮細胞 HUVE C sを 96—ゥエルプレート （3603、 コ一ニングネ遷） に播種し、 37 5%C02の 環境で培養を一日行った後、 （13— 7) に記載の精製ァー ΗοΑ· (0. 05%アジ 化ナトリウム含有） を添加し、 室温で 60分間反応させた。 ァ一 ΗοΑ. 溶液を除去し た後、 FITCを結合したヒト抗体に対するャギ抗体（20倍鎌、 カペル） (0. 0 5%アジ化ナトリウム含有） を室温、 30分間反応させ、 本溶液を除去して PBS (0 . 05%アジ化ナトリウム含有） を添加し、 共焦点蛍光顕微竟（CSU10、 横河 株式会社製） での観察を行った。各生細胞表面に対する抗体の結合活性を図 9に示した 。 ァ一 HoA. は、 （9) に記載の HoAKs— 1と同様、 P AN C— 1糸田胞と H L C 一 1細胞に対してその生細胞表面に結合活性を示した (図 9一 A、 C) が、 HUVEC s細胞に対する結合活性は示さなかった (図 9— E) 産業上の利用の可能性
本発明で得られたモノクローナル抗体を用いることにより、 癌織 特に、 非小細胞 肺癌、 膝癌または胃癌を遠尺的に攻撃する癌治療薬を提供することができる。 さらに、 本発明のヒトモノクローナル抗体を用いた場合、 副作用が少なく連続投与可能な癌治療 薬を提供することができる。

Claims

請求の範囲
I . 誦可変領域に配列番号 8 6、 8 8および 9 0のァミノ酸配列を含むことを碰 とするモノクローナル抗体。
2 . 重鎖可変領域に配列番号 8 2のアミノ酸配列を含むことを赚とする、 請求項 1 に言己載のモノクローナル抗体。
3 . 謹貞可変領域に配列番号 1 1 5のアミノ酸配列を含むことを赚とする、 請求項 1に記載のモノクローナル抗体。
4. 聿纖可変領域に配列番号 9 2、 9 4および 9 6のアミノ酸配列を含むことを とするモノクローナル抗体。
5 . 聿纖可変領域に酉例番号 8 4のアミノ酸酉 !1を含むことを とする、 請求項 4 に言己載のモノクローナル抗体。
6 . 欄可変領域に配列番号 1 1 7のアミノ酸配列を含むことを とする、 請求項 4に記載のモノクローナル抗体。
7 . 磨員可変領域が、 配列番号 8 6、 8 8および 9 0のァミノ酸酉 H^Jを含み、 かつ、 軽鎖可変領域が、 酉例番号 9 2、 9 4および 9 6の配列を含むことを とするモノク 口一ナル抗体。
8 . . 翻可変領域が配列番号 8 2のアミノ酸配列を含み、 かつ、 車崖可変領域が配列 番号 8 4のァミノ酸配列を含むことを特徴とする、 請求項 7に記載のモノクローナル抗 体。
9 · 麵可変領域が配列番号 1 1 5のアミノ酸配列を含み、 かつ、 軽鎖可変領域が配 列番号 1 1 7のアミノ酸配列を含むことを (とする、 請求項 7に記載のモノクロ一ナ ル ϊ几体。
1 0 . ヒト抗体である、 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のモノクロ一ナル ί亢体。
I I . 請求項 1〜 1 0のいずれか一項に記載のモノク口一ナル抗体をコードする D Ν Α。
1 2 , 重鎖可変領域をコードする領域が、 酉 ij番号 8 5、 8 7および 8 9の塩基配列 を含み、 かつ軽鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 9 1、 9 3および 9 5の塩基 配列を含むことを赚とする、 請 « 1 1に記載の D NA。
1 3. 重鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 8 1の塩基配列を含み、 かつ軽鎖 可変領域をコードする領域が、 配列番号 8 3の塩基配列を含むことを霞とする、 請求 項 1 1または請求項 1 2に記載の DNA。
1 4. 重鎖可変領域をコ一ドする領域が、 配列番号 1 1 4の塩基酉例を含み、 かつ軽 鎖可変領域をコードする領域が、 配列番号 1 1 6の塩基配列を含むことを赚とする、 請求項 1 1または請求項 1 2に記載の DNA。
1 5. 請求項 1 1〜1 4のいずれか一項に記載の D NAを含む糸 Ιί奐えべクタ一。
1 6. 請求項 1 5に記載の組換えベクターを含む形質転換ィ *ο
1 7. 請求項 1〜； L 0のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマ。
1 8. 請求項 1〜： L 0のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬糸 物 1 9 · 癌治療薬である請求項 1 8に言 の医薬繊物。
2 0. 癌治療薬が、 非小細翻市癌、 S萃癌、 および胃癌からなる群より選ばれる、 一ま たは二以上の癌に対する癌治療薬である、 請求項 1 9に記載の医薬組成物。
2 1 . モノクロ一ナル抗;体を、 毒素またはお纏剤を内包するリポソームの表面に担持 させたことを とする、 請求項 1 8〜2 0のいずれか一項に記載の医薬糸誠物。
2 2 · 請求項 1〜； L 0のいずれか一項に記載のモノクロ一ナル抗体を含む診断試糜。 2 3. 下記（a)および/または (b) の性質を有するボリペプチド：
( a )細胞骨格のフイラメントに反応性を有する、
(b) 正常細胞に対しては形態変ィ匕を弓 Iき起こさず、 癌細胞に対しては形態変化を弓 I き起こす。 ·
2 4. 下記（a)および/または (b) の性質を有するポリペプチド：
( a ) 配列番号 1 0 7のァミノ酸配列を含むヒト膝癌細 SS¾P AN C- 1由来の約 5 5 kD aのタンパク質を特異的に認識する、
(b) 正常細胞に対しては形態変ィ匕を引き起こさず、 癌細胞に対しては形態変化を引 き起こす。
2 5. 前記約 5 5 kD aの夕ンパク質がビメンチンである請求項 2 4に記載のポリぺプ チド。
2 6 . 形態変ィ匕が、 軸索状の形態、 »| ^細謹の形態、 および、 神経細 S嫌の魏 を有する形態からなる群より選ばれる、 一または二以上の形態への形態変ィ匕である、 請 求項 2 3〜 2 5のいずれか一項に記載のポリぺプチド。
2 7 . 請求項 1〜1 0のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体であることを!^ とする、 請求項 2 3〜 2 6のレ、ずれか一項に記載のポリぺプチド
2 8 . 請求項 2 3 - 2 6のいずれか一項に記載のポリぺプチドを含む医薬組成物。
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