CN101925612A - 针对癌相关的nfkbib变体的表位的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了癌症特异性抗体的重链和轻链的互补决定区的氨基酸序列和核酸序列。另外，本申请提供了癌症特异性的抗体和包含附着到毒素或标记的癌症特异性抗体的免疫偶联物，及其方法和用途。本申请也涉及使用本申请的癌症特异性抗体的诊断方法和试剂盒。另外，本申请提供了新的癌症相关抗原及其用途。

Description

针对癌相关的NFKBIB变体的表位的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及新的抗体和抗原以及治疗和检测癌症的方法和组合物。
背景技术
在2000年，估计全世界有2200万人患癌症并且有620万死于这类疾病。每年有超过1000万新的病例出现并且预期在未来15年该估计值以50％的的速率增长(WHO，World Cancer Report.Bernard W.Stewart和Paul Kleihues，eds.IARCPress，Lyon，2003)。目前的癌症治疗措施局限于创伤性的手术、放射治疗和化学治疗，所有这些治疗导致潜在的严重副作用、非特定的毒害和/或损伤人们的体像和/或生活质量。癌症能够耐化学治疗，这减少了进一步的治疗的选择性和成功的可能性。一些癌症的预后比其它的症状更加严重，一些几乎总是致命性的。另外，一些具有相对高治愈成功率的癌症仍然是主要的杀手，因为它们的发病率高。
目前癌症治疗缺陷的一个原因是它们缺乏对患病组织和细胞的选择性。手术切除总是涉及作为“安全边缘”(safety margin)的明显正常的组织的去除，这会增加发病率和并发症的危险。也总是除去散布有肿瘤细胞并可能潜在维持或恢复患病器官或功能的一些健康组织。放射治疗和化学治疗会由于其非特异性的作用方式而杀死或伤害许多正常细胞。这会产生严重的副作用如严重恶心、体重减少和体力较小、头发减少等，以及增加在生命晚期发展继发癌症(secondary cancer)的危险。对癌细胞具有更大选择性的疗法会使正常细胞不受伤害由此改善治疗结果、副作用概况和生命质量。
癌症治疗的选择性可以通过对癌细胞特异但是没有发现对正常细胞特异的靶向分子改善。这些分子接着被用作基于抗体的诊断剂或治疗剂的靶或用作能够改变它们功能的药物。
IkB蛋白是一族结构相关的胞内蛋白，其结合NF-kB并通过位点和酶特异性的磷酸化、反馈基因调节和细胞质与核区室(nuclear compartments)之间的转运来调节其活性。该家族的几个成员已经被鉴定，其包括IkBα、β、ε、γ和BCL-3(见Hayden & Ghosh，Genes Dev 18：2195-2224，2004，NF-kB途径的综述)。IkB蛋白之间的序列差异导致功能的重大不同。
IkBβ最初被鉴定为TRIP-9，也称为NF-k-B抑制剂β、NF-k-BIB、I-k-B-β、IkBβ、IkB-β、IkB-B、甲状腺受体相互作用蛋白9和TR相互作用蛋白9。已经报道了两个主要的剪接变体，即IkBβ1和IkBβ2。这些同种型它们的C端不同，导致对它们的降解产生了显著的影响以及对NF-kB产生了影响。结果，β2同种型似乎局限于细胞质中并且比β1同种型降解的慢(Hirano等人，MolCell Biol 18(5)：2596-2607，1998)。据报道在来自HT-29人结肠癌细胞系的胞质提取物中β2同种型是主要的IkBβ形式(Inan等人，Mol Carcinogenesis 29：25-36，2000)。已经提出用人IkBβ1蛋白治疗炎症和自身免疫疾病(US 5,952,483)并且，与人IkBβ1类似的兔IkBβ蛋白用于治序与NF-kB诱导的基因活化相关的失调的治疗(US 5,597,898)。
NF-kB-IkBβ复合物通常保留在静息细胞的细胞质中，由此阻止了NF-kB的转录活性。在IkBβ的位点特异性和信号诱导的磷酸化后，所述复合体解离并且标记IkBβ以观察其通过泛素-蛋白酶体途径的分解。游离的NF-kB转运到核中，在核中其结合到DNA并调节各种基因的表达(Malek等人，JBC276(48)：45225-235，2001)。在细胞质中，IkBβ维持NF-kB的能力似乎部分与C端PEST结构域的磷酸化和另外的分子与所述复合体的结合相关(Chen，Wu和Ghosh，JBC 278(25)：23101-106，2003；Chu等人，Mol Cell Biol 16(11)：5974-84，1996)，因此在β1与β2同种型之间存在差异。新合成的或处于磷酸化的IkBβ可能转移到核中并保留结合NF-kB的能力，但是不能阻止或中断其基因转录活性(Tran等人，Mol Cell Biol 17(9)：5386-99，1998)。相反，当与IkBα结合时，NF-kB不是绝对地保留在细胞质中，而是通过复合体进出机制在核和细胞质之间来回运动，平衡时有利于其定位在静息细胞的细胞质中。IkBα与IkBβ在控制NF-kB的定位和活性的能力上的差异被认为部分是因为IkBβ分子上存在***蛋白而α形式上没有(Chen，Wu和Ghosh，JBC 278(25)：23101-106，2003)。IkB蛋白的作用和具体调控远远未被完全理解，但是被普遍认可的是，这些蛋白是细胞质蛋白，其中的一些能够在核与胞质之间转移，并且所有的蛋白在对细胞生长、凋亡、炎症反应和可能的癌症的调节中具有重要的作用。
已经报道了在癌细胞中IkBα基因的突变(Cabannes等人，Oncogene 18：3063-70，1999)，但是到目前为止，没有报道IkBβ同种型突变。IkBα和IkBβ的欠表达和过表达也已经牵涉癌细胞中NF-kB途径的去调节(JBC274(26)：18827-835，1999).
发明内容
本发明人已经鉴定了新的抗体和抗原。具体地说，本发明人已经鉴定了新的癌特异的抗体，其结合几种类型的癌细胞，包括但不限于结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、卵巢癌、头颈癌、***癌和肺癌细胞。重要的是，抗体不显著结合到正常的组织上，使得其为癌症治疗和诊断的合适候选物。本发明人也已经鉴定了新抗体特异性合的抗原。
另外，本发明人鉴定了新的癌症相关的抗原。具体地说，本发明人已经鉴定了在癌细胞表面表达的IkBβ变体。在具体的实施方案中，新癌症相关的抗原是在癌细胞表面上表达的IkBβ同种型2(IkBβ2)变体。
本发明人已经克隆并测序了所述抗体并确定了抗体轻链和重链可变区和互补决定区1、2和3的序列。
因此，本发明公开了包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO：8)的分离的轻链互补决定区1(CDR1)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO：9)的轻链互补决定区2(CDR2)；和包含氨基酸序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO：10)的分离的轻链互补决定区3(CDR3)；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：5)的分离的重链CDR1；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的分离的重链CDR2；和包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ IDNO：7)的分离的重链CDR3。
本发明也提供了编码包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1的分离的核酸序列；编码包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2的分离的核酸序列；和编码包含氨基酸序列QAWDS STVV(SEQID NO：10)的轻链CDR3的分离的核酸序列；编码包含氨基酸序列SYAMH(SEQID NO：5)的重链CDR1的分离的核酸序列；编码包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2的核酸序列；和编码包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ ID NO：7)的重链CDR3的分离的核酸序列。
本发明公开的另外的方面是包含本发明的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NOS：8-10)的分离的轻链可变区与包含本发明的重链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NOS：5-7)的分离的重链可变区。在一个实施方案中，轻链可变区包含图1B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。在另一个实施方案中，重链可变区包含图1A中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
本发明也包括编码本文公开的轻链可变区的分离的核酸序列和编码本文公开的重链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包括图1B中所示的核酸序列(SEQ ID NO：3)。在另一个实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包括图1A中所示的核酸序列(SEQ ID NO：1)。
本发明的另一个方面是结合蛋白，优选地抗体或抗体片段，其包含本发明公开的至少一个轻链互补决定区(即，SEQ ID NOS：8-10中的一个或以上)和/或本发明的至少一个重链互补决定区(即SEQ ID NOS：5-7中的一个或以上)。本发明也提供了结合蛋白，优选地抗体和抗体片段，其包含本文公开的轻链可变区和/或本文公开的重链可变区。
如上所述，本发明也鉴定了本发明的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明提供了结合到IkBβ蛋白的结合蛋白，所述IkBβ包括IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和癌相关的IkBβ变体。在一个实施方案中，癌相关的变体是IkBβ2变体。
另外，本发明提供了包含本发明的结合蛋白如抗体和抗体片段和药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂的组合物。
另外，本发明提供了编码本发明的结合蛋白的分离的核酸序列。
本发明的另外方面是免疫偶联物，其包含(1)本发明的结合蛋白，优选地结合癌细胞上抗原或分子的抗体或抗体片段，所述结合蛋白附着到(2)效应分子上。本发明的另外方面是免疫偶联物，其包含(1)本发明的结合蛋白，优选地结合被癌细胞内化的抗原或分子的抗体或抗体片段，所述结合蛋白附着到(2)效应分子上。在一个优选的实施方案中，所述效应分子是(i)可直接或间接产生可检测信号的标记，或(ii)癌症治疗剂，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式妨碍或降低癌细胞***和/或转移的能力。优选地，癌症治疗剂是毒素或细胞毒素。在一个实施方案中，免疫偶联物包含SEQ ID NO：67所定义的氨基酸序列。
本申请还提供编码本文的免疫偶联物的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸序列编码包含SEQ ID NO：67所定义的氨基酸序列的蛋白。在另一实施方案中，分离的核酸序列包含SEQ ID NO：66。
本申请还提供包含本申请的免疫偶联物的组合物和免疫偶联物在制造用于治疗或预防癌症的药物中的用途和用于诊断目的用途。此外，本申请提供使用本申请的免疫偶联物治疗或预防癌症的方法和相关的试剂盒。
本申请的进一步方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤：
(1)将从所述受试者取得的测试样品与本申请的且特异性结合癌细胞上抗原的结合蛋白或免疫偶联物接触，以产生结合蛋白-抗原复合物；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；和
(3)比较测试样品中与对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
本申请的另一方面是包含本申请的免疫偶联物的诊断试剂，其中效应分子是可以直接或间接产生可检测信号的标记。
本申请还包括可以特异性结合本申请的结合蛋白之一的分离的蛋白质，及其核酸序列和用途。
如上所述，发明人已经鉴定了本申请的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明包含包括癌相关的IkBβ变体的分离的蛋白。本发明也包括编码癌相关的IkBβ变体的分离的核酸序列。
本发明也包含结合癌相关的IkBβ变体的结合蛋白。
本发明也包含本发明的抗原在治疗和诊断癌中的用途。
因此，本发明包括检测或监控受试者中癌症的方法，其包括检测样品的细胞中的本发明的抗原，其中如果在细胞上检测到所述抗原，则表明患有癌症。本发明也包括检测或监测受试者癌症的方法，所述方法包含检测样品中细胞的本发明的癌症相关的IkBβ变体的RNA表达，其中如果检测到癌相关的IkBβ变体的RNA表达，那么表明患有癌症。
本发明也包括药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的抗原、编码本发明的抗原的分离的核酸序列或包含编码本发明的抗原的核酸序列的重组表达载体以及药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。
本申请的进一步方面是本申请所公开抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或者包含编码本申请所公开抗原的核酸序列的重组表达载体在引起受试者中免疫反应中的用途。
本申请的进一步的方面是本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或者包含编码本申请抗原的核酸序列的重细表达载体在治疗或预防癌症中的用途。
此外，本申请包括用于治疗或预防受试者中癌症的方法，包括向受试者或者来自受试者的细胞施用有效量的本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或者包含编码本申请的抗原的核酸序列的重组表达载体。
本申请还包括用于诱导受试者对本申请的抗原产生免疫反应的方法，包括向受试者或者来自受试者的细胞施用有效量的本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或者包含编码本申请的抗原的核酸序列的重组表达载体。
根据下面的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，本发明的详细描述和具体实施例尽管指出本发明的优选实施方案，但仅以例证的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
本发明现将参照附图加以描述，其中：
图1显示VB1-204的(A)μ、VH3(分别为SEQ ID NOS：1和2)和(B)λ、VL3(分别为SEQ ID NOS：3和4)的链的核苷酸和氨基酸序列。
图2显示VB1-204的肿瘤谱。将黑素瘤(A-375)、肺(A-549)、胰腺(CFPac-1和Panc-1)、肝(Hep-G2)、乳腺(MB-231、MB-435S和SK-BR-3)、***(DU-145)和卵巢(SK-OV-3)的肿瘤细胞系与100μg/mL的VB 1-204温育，并通过流式细胞术用偶联到FITC的羊抗人H&L抗体检测结合的材料。显示了两个独立实验的相对于对照抗体的中位荧光(MF)的平均值。
图3显示通过共焦显微镜评价VB1-204的内化A-375细胞与VB1-204(100μg/mL)于4℃孵育，洗涤并加温至37℃维持60分钟。细胞被固定、透化并用抗人的IgM生物素化的抗体标记，接着与偶联有FITC的链霉亲和素温育。A)，与VB1-204于4℃孵育60分钟之后的A-375细胞的荧光标记，显示标记的周缘表面分布，通过白色箭头指示，(60X x 3)放大率。B)，在抗体结合的细胞于37℃孵育60分钟之后，细胞显示细胞内被内化抗体染色，(60X x 3)放大率。
图4A显示VB1-204饱和曲线，其通过经流式细胞术测量增加浓度的VB1-204对A-375癌细胞的反应性来确定；B：Lineweaver-Burk法，结合常数通过Lineweaver-Burk法确定。
图5显示用VB1-204免疫沉淀和探针检测的从膜组分纯化的蛋白的Western印迹分析。
图6显示对在用VB1-204免疫共沉淀后的来自阳性细胞系CFPAC-1的膜提取物以及阴性细胞系PANC-1的MS分析对比。
图7显示来自肿瘤细胞系A：CFPAC-1、B：A-375和C：MB-231的MS分析的肽的鉴定。从每个细胞类型回收的定位到IkBβ2的肽用下划线和黑体表示。
图8显示了经从头测序收集并且其定位对应于IkBβ2的肽。收集的序列为黑体。收集的肽的变异氨基酸用下划线表示。
图9A显示使用8个最强峰的中性肽Mr(calc)的单一同位素质量：1986.9720，固定的修饰：脲甲基(C)离子得分：47期望值：1e+002匹配(粗体红色)：3/176碎片离子。图9B显示使用25个最强峰的中性肽Mr(calc)的单一同位素质量：1070.5542，固定的修饰：脲甲基(C)可变修饰：M1：氧化(M)离子得分：52期望值：7.7e+002匹配(粗体红色)：10/80碎片离子。图9C显示使用6个最强峰的中性肽Mr(calc)的单一同位素质量：1203.5811，离子得分：98期望值：7.2e-06匹配(粗体红色)：4/68碎片离子。
图10是VB1-204免疫沉淀的蛋白的Western 印迹，所述蛋白来自整个细胞的裂解物或来自纯化的CFPAC-1膜组分。将所述印迹用VB 1-204或商业获得的抗IkBβ抗体探针检测。
图11显示VB6-204核苷酸序列(SEQ ID NO：66)和氨基酸序列(SEQ IDNO：67)。
图12显示了CFPAC-1细胞中VB6-204的细胞毒性。
图13显示C33A细胞的流式细胞术结果，结果显示了存在抑制剂DEAB(图13A和图13C)或不存在抑制剂DEAB(图13B和图13D)时aldefluor的反应性分布以及VB1-204特异性地结合到这些细胞上(图13C和图13D)。
图14显示DU-145细胞的流式细胞术结果，结果显示了存在抑制剂DEAB(图A和图C)或不存在抑制剂DEAB(图B和图D)时aldefluor的反应性分布以及VB1-204特异性地结合到这些细胞上(图C和图D)。
具体实施方式
(A)定义
术语“细胞”包括单个细胞以及多个或者一群细胞。向细胞施用试剂包括体外和体内施用。
术语“全身施用”，如本文所使用，意思是指免疫偶联物和/或其它癌症治疗剂可以以方便的方式全身性施用，例如通过注射(皮下、静脉内、肌内等)、口服施用、吸入施用、经皮施用或局部应用(例如局部乳膏剂或软膏剂等)、栓剂应用或植入方法。植入物可以是多孔、非多孔或者凝胶材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。栓剂通常包含0.5重量％至10重量％范围的活性成分。
术语“氨基酸”包括所有天然存在氨基酸以及修饰氨基酸。
术语“抗体”，如本文所使用，旨在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可以是重组来源和/或在转基因动物中产生。术语“抗体片段”，如本文所使用，旨在包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体微型抗体双抗体、及其多聚体，多特异性抗体片段和域抗体。抗体可以使用常规技术片段化。例如，F(ab′)2片段可以通过以胃蛋白酶处理抗体产生。可以处理所得到的F(ab′)2片段以还原二硫键来产生Fab′片段。木瓜蛋白酶消化可以导致形成Fab片段。Fab、Fab′和F(ab′)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其它片段也可以通过重组技术合成。
本文所用术语“本申请的抗体或抗体片段”包含至少一个本申请的轻链互补决定区(即SEQ ID NO：8-10中的一个或一个以上)和/或至少一个本申请的重链互补决定区(即SEQ ID NO：5-7中的一个或一个以上)。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含轻链CDR序列(SEQ ID NO：8-10的全部)和/或重链CDR序列(SEQ ID NO：5-7中的全部)。在另一实施方案中，抗体或抗体片段包含SEQID NO：4的氨基酸(轻链可变区)和/或SEQ ID NO：2的氨基酸(重链可变区)。该术语还包括结合本申请的抗原的抗体或抗体片段。本申请的抗体或抗体片段还包括序列的功能变体，使得抗体或抗体片段可以结合癌细胞，而基本上不结合正常细胞。
本文所用术语“本申请的抗原”指本申请的结合蛋白能够结合的结合蛋白，并且包括IkBβ蛋白，IkBβ蛋白包括IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌症相关的IkBβ变体和其片段或部分(例如，癌症相关的IkBβ变体的胞外结构域)。本文所用术语“IkBβ同种型1或IkBβ1”指SEQ ID NO：28限定的蛋白。本文所用术语“IkBβ同种型2或IkBβ2”指SEQ ID NO：27限定的蛋白。本文所用术语“癌症相关的IkBβ变体”或“IkBβ变体”指在癌细胞表面表达且不显著在非癌细胞表面表达的新IkBβ变体。在本发明的一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体具有与IkBβ相同的功能，IkBβ作为NFk-B的抑制性调节因子，但是它们在细胞中的位置却不同(即位于细胞膜上)。在另一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体包括SEQ ID NO：32和/或36定义的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，癌相关的IkBβ变体包括SEQ ID NO：30定义的氨基酸序列。在附加的实施方案中，癌相关的IkB β变体由SEQ ID NO：30定义的氨基酸序列组成。在另外的实施方案中，癌相关的IkBβ变体包括SEQ ID NO：27的序列，其中选自26、27、31、34、39、106和111和112位的一个或多个氨基酸用另一个氨基酸取代或化学修饰。在另一个实施方案中，取代或化学修饰导致相对于未修饰的蛋白(即SEQ ID NO：27)而改变的区域的疏水性增加。在另外的实施方案中，所述取代为以下的一种或多种：P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、E106V、E111V和/或K112A。在本发明的另一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体包括含有通常不存在于IkBβ的一个或多个跨膜结构域的IkBβ。在一个实施方案中，跨膜结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO：53或54。在一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体是IkBβ2的变体。
“至少中等严格杂交条件”意思是指所选择的促进两个互补补核酸分子在溶液中选择性杂交的条件。杂交可发生在核酸序列分子的全部或部分。杂交部分长度有代表性地至少15个(例如20、25、30、40或50个)核苷酸。本领域技术人员将认识到，核酸双链体或杂合体的稳定性由Tm决定，其在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/1)，或相似方程)。因此，在洗涤条件中的决定杂交稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似、但不相同的分子，可以假定1％的错配会导致Tm降低大约1℃，例如，如果寻找具有＞95％同一性的核酸分子，则最后的洗涤温度降低大约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择适宜的杂交条件。在优选的实施方案中，选择严格杂交条件。通过实例的方式，可以采用下列条件以实现严格杂交：基于上述方程，在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt’s溶液/1.0％SDS中于Tm-5℃下杂交，然后以60℃的0.2xSSC/0.1％SDS洗涤。中等严格杂交条件包括在3x SSC中于42℃洗涤的步骤。然而，应当理解，等效的严格性可以使用替代的缓冲液，盐和温度实现。关于杂交条件的另外的指导可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，2002和Sambrook等，Molecular Cloning：aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001中找到。
术语“结合蛋白”，如本文所使用，指特异性结合另一物质，如本申请的癌相关抗原，的蛋白质。在一个实施方案中，结合蛋白是抗体或抗体片段。
“适宜体内施用的生物学相容形式”意思是指待施用物质的治疗效应胜过任何毒性效应的形式。
术语“癌症”，如本文所使用，包括可以被本申请的结合蛋白、优选本申请的抗体或抗体片段结合的任何癌症。
术语“癌细胞”包括癌症或肿瘤形成细胞、转化细胞或易于变成癌症或肿瘤形成细胞的细胞。
术语“互补”指核酸序列能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对，或者能够在严格条件下与特定核酸片段杂交。
“保守氨基酸取代”，如本文所使用，是一种其中一种氨基酸残基被另一种氨基酸残基置换，而没有破坏蛋白质的预期特性的取代。
术语“对照”，如本文所使用，指来自受试者或者一组受试者的样品，其已知患有癌症或未患有癌症。
术语“控释***”，如所使用，意思是指本申请的免疫偶联物和/或其它癌症治疗剂可以以受控的方式施用。例如，微泵可以向肿瘤区域直接递送受控剂量，由此精细调节药物组合物的施用时间和浓度(见，例如Goodson，1984，Medical Applications of Controlled Release，第2卷，第115-138页)。
术语“肽衍生物”指具有一个或更多个通过功能性侧基反应所化学衍生残基的肽。此类衍生分子包括例如，其中游离氨基已经被衍生以形成胺氢氯化物、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以被衍生形成盐、甲酯和乙酯或者其他类型酯或酰肼。游离羟基可以被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以被衍生形成N-im-苄基组氨酸。作为衍生物还包括那些包含一个或一个以上的二十种标准氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可以替代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸；和鸟氨酸可以替代赖氨酸。
短语“检测或监测癌症”指确定受试者是否具有或不具有癌症、癌症程度、癌症严重性和/或癌症分级的方法或过程。
术语“直接施用”，如本文所使用，意思是指癌症治疗剂可以施用，但不限于瘤内、血管内和肿瘤旁施用。例如，癌症治疗剂可以通过一次或一次以上直接向肿瘤内注射、通过连续或间断向肿瘤内灌注、通过引入肿瘤治疗剂储存器、通过向肿瘤内引入缓慢释放装置、通过向肿瘤内引入缓慢释放制剂和/或通过向肿瘤上直接应用来施用。“向肿瘤内”施用的模式包括向肿瘤区域或者向基本上直接流入肿瘤区域的血管或***中引入癌症治疗剂。
如本文所使用，短语“有效量”意思是指在此剂量时并且在达到预期结果所必需的时间阶段内有效的量。治疗有效量可以根据因素改变，例如动物的疾病状态、年龄、性别、体重。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，每天可以施用数个分剂量，或者剂量可以按比例减少，如通过治疗状态的紧急情况所指示。
术语“引起免疫反应”或者“诱导免疫反应”，如本文所使用，意思是指启动、触发、引起、增强、提高或者增进免疫***的任何反应，例如体液免疫或者细胞介导的免疫。免疫反应的启动或增强可以使用本领域技术人员已知的测定法评价，包括但不限于，抗体则定法(例如ELISA测定法)、抗原特异性细胞毒性测定法和细胞因子的产生(例如ELISPOT测定法)。优选地，本申请的分离的蛋白质、核酸序列或重组表达载体和本申请的方法触发或增强细胞免疫反应，更加优选T细胞反应。
术语“重链互补决定区”，如本文所用，指的是，抗体分子的重链可变区内的高变区。所述重链可变区具有三个互补决定区，从氨端到羧端分别称为重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3。
术语“重链可变区”，如本文所使用，指重链的可变区。
本文所用的术语“本申请的免疫偶联物”包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，其附着至(2)效应分子。效应分子可以是人们希望递送至癌细胞的任何分子，包括但不限于(i)可以直接或间接产生可检测信号的标记，或(ii)癌症治疗剂，例如毒素，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞***和/或转移的能力。术语“本申请的免疫毒素”指免疫偶联物，其中效应分子是癌症治疗剂，例如毒素，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞***和/或转移的能力。
术语“分离的核酸序列”，如本文所使用，指当通过重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养基或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品的核酸。分离的核酸还基本上没有天然位于核酸侧翼的序列(即位于核酸5′和3端的序列)，核酸是从这些序列获得。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，并且可以是双链的或者单链的，并且代表有义链或反义链。此外，术语“核酸”包括互补核酸序列。
术语“分离的蛋白”指当通过重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或者培养基，或者来自培养的细胞或组织样品，或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学物质的蛋白质。
术语“轻链互补决定区”，如本文所使用，指抗体分子的轻链可变区内的高变区。轻链可变区具有三个互补决定区，从氨基末端至羧基末端称作轻链互补决定区1、轻链互补补决定区2和轻链互补决定区3。
术语“轻链可变区”，如本文所使用，指轻链的可变区。
术语“修饰的bouganin”，如本文所使用，意思是指如在PCT/CA2005/000410和以US2005-0238642A1公布的美国专利申请号11/084,080中所描述的具有降低的激活免疫反应倾向的修饰的bouganin。在一个实例中，修饰的bouganin具有氨基酸序列(SEQ ID NO：11)：
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLV
DITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKL
FPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTIN
GQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENN
WGDISDAIHKS SPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKS
SK。
术语“核酸序列”，如本文所使用，指由天然存在碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷或核苷酸单体的序列。术语还包括包含其非天然存在单体或其部分的修饰的或取代的序列。本申请的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列还可以包含修饰的碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
术语“样品”，如本文所使用，指来自可以被测定是否有癌症的受试者的任何流体、细胞或组织样品。
术语“序列同一性”，如本文所使用，指两个多肽序列之间序列同一性的百分数。为了确定两个多肽序列之间的同一性百分数，将这两个序列的氨基酸序列比对，优选使用Clustal W算法(Thompson，JD，Higgins DG，Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-4680)连同BLOSUM 62打分矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)和空位开放罚分10以及空位扩展罚分0.1，以便获得两个序列之间的最高级配对，其中所述序列之一的总长度的至少50％参与比对。可以用于比对的其它方法是由Smith和Waterman改良(Adv.Appl.Math.，1981，2：482)的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.，1970，48：443)的比对方法，由此获得两个序列之间最高级配对并确定两个序列之间相同氨基酸的个数。其它计算两个氨基酸序列之间同一性同一性百分率的方法是本领域公知的，并且包括Carillo和Lipton(SIAM J.Applied Math.，1988，48：1073)所述以及在Computational Molecular Biology，Lesk，e.d.OxfordUniversity Press，New York，1988，Biocomputing：Informatics and GenomicsProjects所述的那些方法。通常，用于这方面的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux等人Nucleic Acids Res.，1984，12：387)BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，J.Molec.Biol.，1990：215：403)。
术语“受试者”，如本文所使用，指动物界的任何成员，优选哺乳动物，更优选人。在优选的实施方案中，受试者被怀疑具有或者具有癌症。
如本文所使用，短语“治疗或预防癌症”指抑制癌细胞复制、防止细胞向癌症形成细胞的转化、抑制癌症扩散(转移)、抑制肿瘤生长、降低癌细胞数量或者肿瘤生长、降低癌症的恶性等级(例如增强的分化)或者改善癌相关症状。
术语“变体”，如本文所使用，包括以与本申请的蛋白或核酸分子基本上相同的方式执行基本相同功能的、本申请的氨基酸和核酸序列的修饰物或化学等效物。例如，本申请的蛋白变体包括但不限于保守氨基酸取代。本申请的蛋白变体还包括对本申请的蛋白的添加和缺失。此外，变体肽和变体核苷酸序列包括其类似物和衍生物。本申请的癌相关抗原的变体意思是指在癌细胞上但不在正常细胞上表达的蛋白质序列。
(B)互补决定区和结合蛋白
(i)轻链和重链互补决定区和轻链和重链可变区
本申请公开提供了包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO：8)的分离的轻链互补决定区1(CDR1)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO：9)的分离的轻链互补决定区2(CDR2)；和包含氨基酸序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO：10)的分离的轻链互补决定区3(CDR3)；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：5)的分离的重链CDR1；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的分离的重链CDR2；和包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ IDNO：7)的分离的重链CDR3。
本申请还包括CDR序列变体，其可以结合至与由上面所公开CDR序列所识别的相同抗原。
本申请的另外方面是包含本申请的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ IDNO：8-10)的分离的轻链可变区，和包含本申请的重链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NO：5-7)的分离的重链可变区。在一个实施方案中，轻链可变区包含图1B中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。在另一实施方案中，重链可变区包含图1A中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
本申请还公开了分离的轻链可变区和重链可变区的变体，其可以结合至与由上面所公开分离的轻链可变区和分离的重链可变区所识别的相同抗原。
本领域技术人员将意识到，本申请包括SEQ ID NO：5-10、2和4的氨基酸序列的变体，包括本申请公开的序列的化学等效物。此类等效物包括以基本相同的方式执行与本申请的特定蛋白质基本上相同功能的蛋白质。例如，CDR序列的功能变体将能够结合至天然CDR 序列所识别的抗原。例如，等效物包含但不限于保守的氨基酸的取代。
在一个实施方案中，轻链CDR1、CDR2和CDR3和重链CDR1、CDR2和CDR3的变体氨基酸序列与SEQ ID NO：5-10分别具有至少50％、优选至少60％、更加优选至少70％、最优选至少80％、甚至更加优选至少90％、并且甚至最优选95％的序列同一性。
在另一实施方案中，轻链可变区和重链可变区的变体氨基酸序列与SEQ IDNO：2和4分别具有至少50％、优选至少60％、更加优选至少70％、最优选至少80％、甚至更加优选至少90％并且甚至最优选95％的序列同一性。
本申请还公开了编码本申请的轻链可变区的分离的核酸序列和编码本申请的重链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸序列编码包含图1B中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的轻链可变区。在另一实施方案中，分离的核酸序列编码包含图1A中所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的重链可变区。在进一步的实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包含图1B中所示的核酸序列(SEQ ID NO：3)。在又一个实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包含图1A中所示核酸序列(SEQ ID NO：1)。本申请还包括编码本申请的轻链可变区和重链可变区的核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的轻链可变区和重链可变区的核酸序列杂交的核苷酸序列。
本申请还公开了编码如下序列的分离的核酸：包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、包含氢基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2；包含氨基酸序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：5)的重链CDR1；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2；和包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ ID NO：7)的重链CDR3。
本申请还提供了编码上面所讨论的CDR序列和可变区序列的变体的分离的核酸序列。
变体核酸序列包括至少在中等严格杂交条件下与编码SEQ ID NO：5-10、2和4中所示氨基酸序列的核酸序列及其变体杂交的核酸序列。
(ii)结合蛋白
本申请的另一个方面是包含至少一个本申请的轻链互补决定区(即SEQ IDNO：8-10中的一个或一个以上)和/或至少一个本申请的重链互补决定区(即SEQID NO：5-7中的一个或一个以上)的结合蛋白，这样的结合蛋白一般在本文中被称为“本申请的结合蛋白”或优选地“本申请的抗体或抗片段”。
在一个实施方案中，结合蛋白包含分别含有氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO：8)、QDSKRPS(SEQ ID NO：9)和QAWDSSTVV(SEQ ID NO：10)的轻链互补决定区1、2和3；和分别含有氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO：5)；VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6)；和AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ ID NO：7)的重链互补决定区1、2和3。本申请还公开了包含图1B中所示轻链可变区(SEQ ID NO：4)和/或图1A中所示重链可变区(SEQ ID NO：2)的结合蛋白，优选抗体或抗体片段。
本领域技术人员会意识到，本申请包括以与上面所公开结合蛋白基本上相同的方式执行基本相同功能的上面所公开特定结合蛋白的变体，包括上面所公开序列的化学等效物。结合蛋白的功能变体将能够结合至与上面所公开结合蛋白相同的抗原。在一个实施方案中，结合蛋白结合到IkBβ蛋白上，包括IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌相关的IkBβ变体。
发明人已经鉴定了本发明的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明提供了结合到IkBβ蛋白包括IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌相关的IkBβ变体的结合蛋白。
如上所述，本申请的结合蛋白结合到癌细胞的表面上，但不显著地结合到非癌细胞的表面。因此，本申请包括结合到癌相关的IkBβ变体的胞外结构域的结合蛋白。癌相关的IkBβ变体的结构能够被本领域技术人员使用计算机建模来预测。例如，可以使用商业获得的软件或服务(见Martz，Eric在2000年11月30日提交的Protein Explorer，最后修订于2003年4月30日，http://molvis.sdsc.edu/visres/molvisfw/titles.jsp)。在一个实施方案中，对SEQ IDNO：30限定的蛋白进行计算机建模。
在一个实施方案中，所述胞外结构域包含在或包含SEQ ID NO：27或30的氨基酸52-97。
在另一个实施方案中，胞外结构域包含在或包含序列GYVTEDGDTALHLAVIHQHEPFLFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTA(SEQ IDNO：68)。
在另一个实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO：27或30的氨基酸38-98：
AELGPGLSWAPLVFGYVTEDGDTALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQ ID NO.69)或
AWLGPGLSWAPLVFGYVTEDGDTALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQIDNO.70)。
在另一个实施方案中，本申请的结合蛋白结合到包含SEQ ID NO：27或30的氨基酸38-102的肽：
AELGPGLSWAPLVFGYVTEDGDTALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA(SEQ ID NO：71)或
AWLGPGLSWAPLVFGYVTEDGDTALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA(SEQ ID NO：72)。
在某些实施方案中，抗体或抗体片段包含全部或者部分的得链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或者IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgM重链恒定区。另外抗体或抗体片段可以包含全部的或部分的κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，轻链恒定区是λ轻链恒定区。
为了产生人单克隆抗体，抗体产生细胞(淋巴细胞)可以从患有癌症的人中取得，并且通过标准体细胞融合过程与骨髓瘤细胞融合，因此使这些细胞永生并且得到杂交瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的(例如最初由Kohler和Milstein(Nature 256：495-497(1975))开发的杂交瘤技术以及其他技术例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4：72(1983))、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Roder等，Methods Enzymol，121：140-67(1986))和组合抗体文库的筛选(Huse等，Science 246：1275(1989))也是本领域众所周知的。可免疫化学筛选产生与癌细胞特异性反应的抗体的杂交瘤细胞，并且可以分离单克隆抗体。
对特定抗原或分子(例如癌细胞上的抗原或分子)具有反应性的特异性抗体或抗体片段，也可以通过筛选与细胞表面成分一起表达于细菌中的编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库产生。例如，完整的Fab片段、VH区和FV区可以使用噬菌体表达文库在细菌中表达(见例如Ward等，Nature 341：544-546(1989)；Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；和McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。
本申请包括结合至与本申请的抗体或抗体片段相同的抗原的所有抗体和抗体片段。本领域技术人员会意识到，结合测定可以用于找出与本申请的抗体和抗体片段具有相同结合特异性的其它抗体和抗体片段。如下面所例证，竞争结合测定可以用于找出此类的其它抗体。
在使用流式细胞术开展竞争测定之前，确定对固定数量癌细胞给出最大结合的本申请的抗体(Ab1)的最低浓度。从指数生长培养物中收获总计106个细胞并且与多种抗体浓度于4℃孵育1小时。洗涤细胞并且与适宜检测抗体在4℃下再孵育1小时。在洗涤之后，通过流式细胞术分析细胞。对于每一测试抗体，通过中位荧光对抗体浓度作图从数据产生饱和曲线。
对于竞争测定，如上制备癌细胞并且用固定浓度的抗体(Ab1)一式两份处理。固定浓度是如上所确定的对固定数量的癌细胞产生最大结合的最低抗体浓度。在加入Ab1之后即刻向每一管中加入不同浓度的潜在抑制性抗体(Ab2)，并且将混合物在4℃下孵育1小时。通过从对于每一测试样品(Ab1+Ab2)读取到的中位荧光减去背景荧光(PBS-5％FCS)，计算出抑制百分数和相对于最大中位荧光的变化。然后将结果除以单独Ab1的中位荧光(最大结合)减去背景(见下)。通过乘以100得到抑制百分数结果。两次重复试验的平均值连同它们各自的标准误对抗体浓度作图。下列公式用于计算抑制百分数：
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]×100
其中PI＝抑制百分数；MF(Ab1+Ab2)＝对于Ab1+Ab2混合物测量的中位荧光；MFBgd＝具有PBS-5％FCS的背景中位荧光。
因此，本申请提供能够结合癌细胞上抗原的结合蛋白，其中结合蛋白可以通过包括下列步骤的方法鉴定：
(1)将固定数量的癌细胞与对于固定数量癌细胞产生最大结合的最低浓度的本文所公开结合蛋白、优选抗体或抗体片段(Ab1)孵育，并且测量Ab1的中位荧光(MFAb1)；
(2)通过向Ab1和癌细胞加入Ab2测试两种或两种以上浓度的测试结合蛋白(Ab2)，并且测定中位荧光(MF(Ab1+Ab2))；
(3)测定背景中位荧光(MFbgd)；
(4)计算PI，其中
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]×100；和
(5)比较PI与对照PI值；
其中，与对照PI具有统计学显著性差异的PI表明测试结合蛋白能够结合癌细胞上本申请的抗原。
本领域技术人员会意识到，亲和性成熟技术通过增加对抗原的亲和性，可用于改良本申请的结合蛋白或免疫偶联物。
通常使用两个策略增强抗体的结合亲和性。一个方法是利用对Ab-Ag复合物晶体结构的解析来鉴定参与抗原结合的关键残基(Davies D.R.，Cohen G.H.1996.Interactions of protein antigens with antibodies.Proc Natl.Acad.Sci.U.S A.93，7-12)。之后，这些残基可以被突变以增强相互作用。另外的方法模拟体内抗原刺激，该刺激驱动由B细胞产生的免疫球蛋白的亲和性成熟。在免疫反应的成熟过程中，免疫球蛋白可变区经受体细胞突变(Mc Heyzer-Williams M.2003.B-cell signaling mechanism and activation.Fundamental Immunology，第五版，195-225)。该方法对免疫***具有高特异性，其特征在于以极高的比率引入点突变。它仅存在于编码可变区的DNA片段中，并且排除保守结构域。然后，表达体细胞突变变体抗体的B细胞经受抗原介导的选择，导致选择出更高亲和性的免疫球蛋白。为了体外复制该现象，已经使用数种方法，或通过随机或通过定向过程来引入突变。随机突变可以使用错配PCR、链改组或增变株大肠杆菌引入(Clackson T.Hoogenboom N.R.，Griffiths A.D.和Winter G.1991Makingantibody fragments using phage display libraries.Nature 352，624-628，HawkinsR.E.，Russell S.J.和Winter G.1992.Selection of phage antibodies by bindingaffinity.Mimicking affinity maturation.J.Mol.Biol.226，889-896，Low N.，HolligerP.和Winter G.1996.Mimicking somatic hypermutation：affinity maturation ofantibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain.J Mol.Biol.260，359-368)。该策略导致产生大文库，其中反应性克隆使用展示技术，如核糖体、噬菌体或酵母加以选择(Min L.(2000).Applications of display technology inprotein analysis.Nat.Biotechnol.18，1251-1256)。
已经显示，CDR(特别是轻链和重链CDR3)的定向突变是用于增强抗体亲和性的有效技术。CDR3的3至4个氨基酸的区段或者称作“热点”的特异性区域被定向诱变。Yang等报道，通过突变四个CDR残基，抗HIV gp120Fab片段提高420倍(Yang W.P.，Green K.，Pinz-Sweeney S.，Briones A.T.，Burton D.R.和Barbas C.F.III.1995.CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of apotent human anti-HIV-1antibody into picomolar range.J.Mol.Biol.，254，392-403)。在C6.5scFv的VL CDR3中的一个突变与VH CDR3中三个突变的组合使亲和性提高1230倍(Schier R.，McCall A.，Adams G.P.，Marshall K.W.，Merrit H.，Yin M.，Crawford R.S.Weiner L.M.，Marks C.和Marks J.D.1996.Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2single-chain Fv by molecular evolutionof the complementary determining regions in the center of the antibody binding site.J.Mol.Biol.，263，551-567)。
“热点”是在体内发生体细胞高变的序列(Neuberger M.S和Milstein C.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。热点序列可以定义为某些密码子的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C或T并且W可以是A或T(Neuberger M.S和Milstein C.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。此外，相对于对应于潜在热点序列的TCN编码的那些，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基大部分存在于可变结构域的CDR区(Wagner S.D.，Milstein C.和Neuberger M.S.1995.Codon bias targets mutation.Nature，376，732)。结构分析显示CDR环对抗原结合贡献最大，特别是CDR3环(Giudicelli V.，Chaume D.和Lefranc M.P.2004.IMGT/V-QUEST，an integrated software program for immunoglobulin and T cellreceptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleic Acids Res.32，435-440)。因此，扫描每一抗体的重链和轻链CDR的核苷酸序列，确定是否存在热点序列和AGY密码子。使用International ImMunoGen Tics数据库(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)将所鉴定的轻链和重链CDR区的热点与种系的重链和轻链序列比较(Davies D.R.，Padlan E.A.和Sheriff S.1990.Antibody-antigencomplexes.Annu.Rev.Biochem.59，439-473)。序列与种系相同，表明没有发生体细胞突变；因此，模拟体内发生的体细胞事件的随机突变被引入。与之相反，不同的序列表明已经发生了一些体细胞突变。这将仍需确定体内体细胞突变是否是最佳的。编码埋入CDR内的氨基酸或者CDR中的保守氨基酸的热点没有被诱变。这些残基对于总体结构通常是至关重要的，并且由于她们被埋藏，所以不大可能与抗原相互作用。此外，序列可以与种系序列中、体细胞突变主要发生于此的预期位置比较(Tomlinson I.M.，Cox J.P.L.，Gherardi E.，LeskA.M.和Chotia C.1995.The structural repertoire of the human V.ldomain.EMBO J.14，4628-4638，Tomlinson I.M.，Walter G.，Jones P.T.，Dear P.H.，Sonnhammer E.L.L.和Winter G.1996.The imprint of somatic hypermutation on therepertoire of human germline V genes.J.Mol.Biol.256，813-817)。相似的策略应用于BL22scFv的亲和性成熟中。将点突变引入到重链CDR3中导致对多种CD22阳性细胞系的结合活性提高5至10倍(Salvatore G.，Beers R.，MarguliesI.，Kreitman R.J.和Pastan I.2002.Improved cytotoxic activity toward cell lines andfresh leukemia cells of a mutant anti-CD22immunotoxin obtained by antibody phagedisplay.Clinical Cancer research，8，995-1002)。同样，在CDR1和CDR2环中的多个氨基酸的突变也产生了亲和性增加3倍至7倍的突变体(Ho M.，KreitmanJ.，Onda M.和Pastan I.2005.In vitro antibody evolution targeting germline hotspots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin.J.Biol.Chem.，280，607-617)。
在通过随机过程或者定向过程引入突变之后，表达抗体并评估其功能。例如，可以基于结合进行功能筛选。一旦评估了功能，则使用已知方法对所选择抗休开展DNA测序。
在另一实施方案中，Harvey，B等(PNAS 2004 June 22；101(25)：9193-8)描述的锚定周质表达(APEx)方法用于本申请的结合蛋白或免疫偶联物的亲和性成熟。
因此，本申请包括已经被亲和性成熟的本申请的结合蛋白，以增加结合蛋白对IkBβ蛋白包括IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌相关的IkBβ变体的亲和性。
本申请还提供了包含本申请结合蛋白、优选抗体和抗体片段与可药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂的组合物。
此外，本申请提供了编码本申请的结合蛋白的分离的核酸序列。本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的结合蛋白的核酸序列杂交的核酸序列。
(C)癌相关抗原
发明人已经鉴定了本申请的结合蛋白结合的抗原(包括IkBβ蛋白，诸如IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌相关的IkBβ变体)。癌相关的抗原表达于癌细胞表面上并且在正常细胞表面上没有明显的表达。因此，本申请包括可特异性结合本申请的结合蛋白之一的分离的蛋白及其核酸序列和用途。
本申请包括新的癌相关抗原，即癌相关的IkBβ变体。在一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体表达于癌细胞表面上并且在正常细胞表面上没有明显的表达。在进一步的实施方案中，癌相关的IkBβ变体具有与IkBβ相同的功能(IkBβ是NFk-B的抑制性调节因子)，但在细胞中的位置不同(即位于细胞膜上)。在另一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体包含SEQ ID NO：32和/或36限定的氨基酸序列。在另一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体包含SEQ IDNO：30限定的氨基酸序列。在另一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体由SEQ IDNO：30限定的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，癌相关的IkBβ变体包含SEQ ID NO：27的序列，其中选自26、27、31、34、39、106、111和112位的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代或化学修饰。在进一步的实施方案中，取代或化学修饰导致相对于未修饰的蛋白(即SEQ ID：27)发生改变的区域疏水性增加。在另外的实施方案中，取代是以下的一个或多个：P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、E106V、E111V和/或K112A。在进一步的实施方案中，癌相关的IkBβ变体包含具有通常不存在于IkBβ中的一个或多个跨膜结构域的IkBβ。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含氨基酸序列SEQID NO：53或54。在一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体是IkBβ2的变体。
本领域技术人员会意识到，本申请包括上述的氨基酸序列的变体，包括本申请公开的序列的化学等效物。此类等效物包括与本申请的特异性蛋白质以基本相同的方式执行基本相同功能的蛋白质。例如等效物包括但不限于保守氨基酸取代物。
在一个实施方案中，本申请的变体氨基酸序列与SEQ ID NO：30、32、36、53或54具有至少50％、优选至少60％、更加优选至少70％、最优选至少80％、甚至更加优至少90％、并且甚至最优选至少95％的序列同一性。
本申请包括本申请的新的癌症相关抗原的用途。例如，本申请的新的癌症相关抗原用于产生可以用于治疗或预防癌症的结合蛋白和免疫偶联物的用途，或者可以用于检测或监测受试者中癌症的用途或者用于制造治疗或预防癌症的药物的用途。
此外，本申请提供了编码本申请的新癌症相关抗原的分离的核酸序列。本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的新癌症相关抗原的核酸序列杂交的核苷酸序列。
(D)免疫偶联物
本申请还包括免疫偶联物，包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，其已经附着至(2)效应分子。在一个实施方案中，结合蛋白结合至癌细胞上的抗原或分子。在一个实施方案中，所述抗原或分子包含IkBβ蛋白，IkBβ同种型1(IkBβ1)、IkBβ同种型2(IkBβ2)和/或癌相关的IkBβ变体。
在一个优选的实施方案中，效应分子是(i)可以直接或间接产生可检测信号的标记，或(ii)癌症治疗剂，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞***和/或转移的能力。这样的免疫偶联物在本文中一般可以被称为“本申请的免疫偶联物”。
在本申请的一个实施方案中，效应分子是癌症治序剂。癌症治疗剂优选地是毒素，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞***和/或转移能力。因此，本申请的一个方面是免疫偶联物，其包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，其附着至(2)癌症治疗剂，例如细胞毒素。
在另一实施方案中，免疫偶联物被内化，并且癌症治疗剂是阻断细胞的蛋白质合成、由此导致细胞死亡的细胞毒素。重要的是，由于大多数正常细胞没有广泛表达在癌细胞上存在的抗原，它们不能结合并内化免疫偶联物，并且被保护免予毒素或其他癌症治疗剂的杀伤作用。
多种效应分子可以用于本申请的免疫偶联物上，并且大量的此类效应分子是胞内活性分子。因此，在一个实施方案中，免疫偶联物被癌细胞内化。
在优选的实施方案中，效应分子是癌症治疗剂，更加优选包含具有核糖体失活活性的多肽的细胞毒素，包括但不限于白树毒蛋白、bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞属(Pseudomonas)外毒素A及其变体。当蛋白质是核糖体失活性蛋白质时，免疫偶联物结合至癌细胞后必须被内化，以便于蛋白质对于细胞是细胞毒性的。因此，在一个实施方案中，效应分子是细胞毒素并且免疫偶联物被癌细胞内化。
在一个实施方案中，毒素是bouganin或假单胞菌属外毒素A，及其变体。在另一实施方案中，毒素是修饰的bouganin或者缺乏细胞结合结构域的截短形式的假单胞菌属外毒素A。在进一步的实施方案中，毒素是基本上无T细胞表位的bouganin，或者由氨基酸252-608组成的截短形式的假单胞菌属外毒素A。
在其他非限定性实施方案中，癌症治疗剂包括起作用以断裂DNA的试剂。因此，癌症治疗剂可以选自，但不限于，烯二炔(例如加利车霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子试剂(例如博来霉素、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。根据本发明的有用的其他癌症治疗剂包括但不限于柔红霉素、多柔比星、偏端霉素A、顺铂、丝裂霉素C、海鞘素、倍癌霉素/CC-1065、和博来霉素/匹来霉素。
在其他非限定性实施方案中，癌症治疗剂包括起作用以打断微管蛋白的试剂。此类试剂可以包括，但不限于，根霉素/美登素、泰素、长春新碱和长春碱、秋水仙碱、auristatin、多拉司他汀10MMAE、和peloruside A。
在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含烷化剂，包括但不限于Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNUNSC 409962、白消安NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂NSC 271674、CBDCA NSC241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC 3088、氯脲霉素NSC 178248、顺铂NSC 119875、克罗米松NSC 338947、氰基吗啉代多柔比星NSC 357704、环戊二烯NSC 348948、二脱水半乳糖醇NSC 132313、氟多潘NSC 73754、hepsulfam NSC 329680、海恩酮NSC 142982、美法仑NSC8806、甲基CCNU NSC 95441、丝裂霉素C NSC 26980、米托唑酰胺NSC353451、氮芥NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪双酮NSC135758、哌泊溴烷NSC 25154、泊非霉素NSC 56410、螺妙斯定NSC 172112、替罗昔隆NSC 296934、四铂NSC 363812、噻替派NSC 6396、曲他胺NSC9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462和Yoshi-864 NSC 102627。
在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含抗有丝***剂，包括但不限于异秋水仙碱NSC 406042、大田软海绵素BNSC 609395、秋水仙碱NSC 757、秋水仙碱衍生物NSC 33410、多拉司他汀10NSC 376128(NG-auristatin衍生的)、美登素NSC 153858、根霉素NSC332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水仙碱NSC 361792、三苯甲基半胱氨酸NSC 83265、硫酸长春碱NSC 49842和硫酸长春新碱NSC 67574。
在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含拓扑异构酶I抑制剂，包括但不限于喜树素NSC 94600、喜树素钠盐NSC100880、氨基喜树素NSC 603071、喜树素衍生物NSC 95382、喜树素衍生物NSC 107124、喜树素衍生物NSC 643833、喜树素衍生物NSC 629971、喜树素衍生物NSC 295500、喜树素衍生物NSC 249910、喜树素衍生物NSC 606985、喜树素衍生物NSC 374028、喜树素衍生物NSC 176323、喜树素衍生物NSC295501、喜树素衍生物NSC 606172、喜树素衍生物NSC 606173、喜树素衍生物NSC 610458、喜树素衍生物NSC 618939、喜树素衍生物NSC 610457、喜树素衍生物NSC 610459、喜树素衍生物NSC 606499、喜树素衍生物NSC610456、喜树素衍生物NSC 364830、喜树素衍生物NSC 606497和吗啉代多柔比星NSC 354646。
在其他非限定性实施方案中，免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含拓扑异构酶II抑制剂，包括但不限于多柔比星NSC 123127、氨萘非特NSC308847、m-AMSA NSC 249992、蒽吡唑衍生物NSC 355644、吡唑啉吖啶NSC366140、比桑郡HCL NSC 337766、柔红霉素NSC 82151、脱氧多柔比星NSC267469、米托蒽醌NSC 301739、美诺立尔NSC 269148、N，N-二苄基道诺霉素NSC 268242、比散特隆NSC 349174、佐柔比星NSC 164011、VM-26NSC122819和VP-16NSC 141540。
在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含RNA或DNA抗代谢物，包括但不限于L-丙氨菌素NSC 153353、5-氮胞苷NSC 102816、5-氟尿嘧啶NSC 19893、阿西维辛NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC 132483、氨基蝶呤衍生物NSC 184692、氨基蝶呤衍生物NSC 134033、抗叶酸剂NSC 633713、抗叶酸剂NSC 623017、Baker′s可溶性抗叶酸剂NSC139105、二氯烯内基指甲花醌NSC 126771、布喹那NSC 368390、替加氟(前药)NSC 148958、5，6-二氢-5-氮胞苷NSC 264880、甲氨蝶呤NSC 740、甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)NSC 224131、吡唑霉素NSC 143095、三甲曲沙NSC 352122、3-HP NSC 95678、2′-脱氧-5-氟尿苷NSC 27640、5-HP NSC 107392、α-TGDR NSC 71851、艾菲地可宁甘氨酸酯NSC 303812、阿糖胞苷NSC 63878、5-氮杂-2′-脱氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC 71261、环胞苷NSC 145668、胍唑NSC 1895、羟基脲NSC32065、肌苷乙醇二醛NSC 118994、麦克菌素II NSC 330500、吡唑咪唑NSC51143、硫鸟嘌呤NSC 752和硫嘌呤NSC 755。
在另一非限定性实施方案中，免疫偶联物的治疗部分可以是核酸。可以使用的核酸包括但不限于反义RNA、基因或其他多核苷酸、核酸类似物，例如硫鸟嘌呤和硫嘌呤。
本申请进一步提供了免疫偶联物，包含(i)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，其附着至(2)效应分子，其中效应分子是可以间接或直接产生可检测信号的标记。这些免疫偶联物可以用于研究应用或者诊断应用，如癌症的体内检测。标记优选地能够直接或间接产生可检测信号。例如，标记可以是不透射线的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光(荧光团)或化学发光(生色团)化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；显像剂；或金属离子。
在另一实施方案中，免疫偶联物是间接可检测性的。例如，对免疫偶联物具有特异性并且包含可检测标记的二级抗体可以用于检测免疫偶联物。
本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，可以通过结合蛋白可以结合或连接至效应分子的任何方式“附着至”效应分子。例如，结合蛋白可以通过化学或重组方式附着至效应分子。用于制备融合物或者连接物的化学方法在本领域是众所周知的，并且可以用于制备免疫偶联物。用于将结合蛋白和效应分子连接的方法必须能够将结合蛋白与效应分子接合，而不干扰结合蛋白结合至癌细胞上抗原的能力。
本申请的结合蛋白可以间接连接至效应分子。例如，结合蛋白可以直接连接至包含几种类型之一的效应分子的脂质体。一种或多种效应分子和/或结合蛋白还可以结合至固体表面。
在一个实施方案中，结合蛋白(优选抗体或抗体片段)和效应分子均是蛋白质，并且可以使用本领域众所周知的技术连接。有数百种能将两种蛋白质连接的交联剂可利用(见例如“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”.1991，Shans Wong，CRC Press，Ann Arbor)。交联剂通常基于结合蛋白(优选抗体或抗体片段)和/或效应分子上可利用的或者***的活性官能基进行选择。此外，如果不存在反应基，可以使用光活化交联剂。在某些情况下，希望在结合蛋白(优选抗体或抗体片段)与效应分子之间包含间隔子。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺和双(重氮联苯胺)和异双功能试剂：(m maleimidobenzoyl)顺丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺和硫代顺丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺。
在某些情况下，本申请的结合蛋白可以用用于效应分子化学附着的特定残基进行工程改造。本领域已知的用于分子化学附着的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。交联剂基于结合蛋白上***的活性官能基和效应分子上可利用的活性官能基来选择。
结合蛋白-效应分子蛋白质融合也可以使用重组DNA技术制备。在此种情况下，编码结合蛋白的DNA序列融合至编码效应分子的DNA序列，产生嵌合DNA分子。嵌合DNA序列被转染进入宿主细胞，宿主细胞表达融合蛋白。可以从细胞培养物中回收融合蛋白并且使用本领域已知的技术纯化。
将作为标记的效应分子附着至结合蛋白的实例包括描述于Hunter，等，Nature 144：945(1962)；David，等，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain，等，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30：407(1982)；Wensel和Meares，Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)；和Colcher等，″Use OfMonoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Athymic Mice″，Meth.Enzymol.，121：802-16(1986)中的方法。
在一个实施方案中，免疫偶联物包含由SEQ ID NO：67定义的氨基酸序列。本申请还包括该序列的变体。
本申请还提供了编码本申请的免疫偶联物的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸序列编码包含SEQ ID NO：67限定的氨基酸序列的蛋白。在另一实施方案中，分离的核酸序列包含SEQ ID NO：66。
本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的免疫偶联物的核酸序列杂交的核酸序列。
(E)蛋白质的制备
本领域技术人员会意识到，本申请的蛋白质，例如本申请的轻链和重链互补决定区、轻链和重链可变区、抗体和抗体片段、免疫偶联物、新癌相关抗原可以以数种方法任一种制备，但是最优选使用重组方法制备。
因此，本申请的核酸分子可以以已知方式整合入保证本申请的蛋白蛋白质良好表达的适宜表达载体中。可能的表达载体包括，但不限于，粘粒、质粒、或改造的病毒(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，只要载体与所使用的宿主细胞相容即可。表达载体“对于转化宿主细胞是适宜的”，这意味着表达载体包含本申请的核酸分子和在待用于表达的宿主细胞基础上选择的、有效连接至核酸分子的调节序列。有效连接旨在指以允许核酸表达的方式将核酸连接至调节序列。
因此，本申请包括包含本申请的核酸分子或其片段和对于所***蛋白质序列转录和翻译所必需的调节序列的重组表达载体。
适宜调节序列可以来源于多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物、或昆虫基因(例如，见Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述的调节序列)。适宜调节序列的选择如下面所讨论依赖于所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地实现。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或者RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，取决于所选择的宿主细胞和所采用的载体，其它序列，例如复制起点、额外的DNA限制位点、增强子、和赋予转录可诱导性的序列可以整合入表达载体中。
本申请的重组表达载体还可以包含选择标记基因，其利于选择转化或转染有本申请的重组分子的宿主细胞。选择标记基因的实例是编码下列蛋白质的基因，例如赋予对某些药物抗性的G418和潮霉素、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶或者免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白、优选IgG的Fc部分。选择标记基因的转录通过选择标记蛋白例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶浓度的变化来监测。如果选择标记基因编码赋予抗生素抗性如新酶素抗性的蛋白质，则转化体细胞可以用G418筛选。已经整合有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡。这使得可以显现和测定本申请的重组表达载体的表达，并且具体而言可以确定突变对表达和表型的效应。应当意识到，选择标记可以引入到与目的核酸分开的载体上。
重组表达载体还可以包含编码融合部分的基因，所述融合部分提供了增强的重组蛋白表达；增强的重组蛋白溶解度；和通过充当亲和纯化中的配体来帮助靶重组蛋白的纯化。例如，蛋白酶水解位点可以加入至靶重组蛋白中以允许在融合蛋白纯化之后将重组蛋白与融合部分分离。代表性的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，澳大利亚)、pMal(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与重组蛋白融合。
重组表达载体可以引入至宿主细胞中，以产生转化的宿主细胞。术语“转化有”、“转染有”、“转化”和“转染”旨在包括通过本领域已知的多种可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞内。术语“转化的宿主细胞”，如本文所使用，旨在还包括已经以本申请的重组表达载体转化了的、能够糖基化的细胞。原核细胞可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化以核酸转化。例如，核酸可以通过常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectin(脂转染试剂)、电穿孔或微注射引入至哺乳动物细胞中。用于转化和转染宿主细胞的适宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)和其它实验室教科书中找到。
适宜的宿主细胞包括广泛多种的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本申请的蛋白质可以在酵母细胞或者哺乳动物细胞中表达。其它适宜宿主细胞可以在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1991)中找到。此外，本申请的蛋白质可以在原核细胞，例如大肠酐菌中表达(Zhang等，Science 303(5656)：371-3(2004))。此外，可以使用基于假单胞菌属的表达***，例如荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)(美国专利申请公布号US 2005/0186666，Schneider，Jane C等)。
适宜开展本申请酵母和真菌宿主细胞包括，但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和曲霉属(Aspergillus)的多个种。用于在酿酒酵母中表达的载体实例包括pYepSec1(Baldari.等，Embo J.6：229-234(1987))、pMFa(Kurjan和Herskowitz，Cell 30：933-943(1982))、pJRY88(Schultz等，Gene 54：113-123(1987))和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。用于酵母和真菌转化的方法是本领域普通技术人员众所周知的(见Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929(1978)；Ito等，J.Bacteriology 153：163(1983)，和Cullen等.(Nat BiolTech 5：369(1987))。
除了其它，适宜实施本发明的哺乳动物细胞包括：COS(例如ATCC号CRL1650或1651)、BHK(例如ATCC号CRL 6281)、CHO(ATCC号CCL 61)、HeLa(例如ATCC号CCL 2)、293(ATCC号1573)和NS-1细胞。用于指引在哺乳动物细胞中表达的适宜表达载体通常包括启动子(例如衍生自病毒物质，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.，Nature 329：840(1987))和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J.6：187-195(1987))。
按照本文提供的教导，启动子、终止子和用于将适宜类型表达载体引入植物、禽类和昆虫细胞内的方法也可以容易实现。例如，在一个实施方案中，本申请的蛋白质可以从植物细胞表达(见Sinkar等，J.Biosci(Bangalore)11：47-58(1987)，其综述了毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)载体的应用；还见Zambryski等，Genetic Engineering，Principles and Methods，Hollaender和Setlow(编者)，第VI卷，第253-278页，Plenum Press，New York(1984)，其描述了表达载体用于植物细胞的用途，包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034等)。
适宜实施本发明的昆虫细胞包括来自蚕(Bombyx)、粉纹夜蛾(Trichoplusia)或斜纹夜蛾(Spodotera)物种的细胞和细胞系。可利用的用于在培养的昆虫细胞(SF 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，Mol.CellBiol.3：2156-2165(1983))和pVL系列(Luckow，VA.，和Summers，M.D.，Virology 170：31-39(1989)。
可选地，本申请的蛋白质还可以在非人转基因动物中表达，例如大鼠、兔、绵羊和猪(Hammer等.Nature 315：680-683(1985)；Palmiter等.Science222：809-814(1983)；Brinster等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442(1985)；Palmiter和Brinster Cell 41：343-345(1985)和美国专利号4,736,866)。
本申请的蛋白质还可以通过使用蛋白质化学领域众所周知的技术，例如固相合成(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.85：2149-2154(1964)；Frische等，J.Pept.Sci.2(4)：212-22(1996))或同质溶液内合成(Houbenweyl，Methods ofOrganic Chemistry，编者E.Wansch，第15I和II卷，Thieme，Stuttgart(1987))的化学合成来制备。
包含与其它分子例如蛋白质连接的本申请的蛋白质的N末端或C末端融合蛋白质，可以通过重组技术经融合加以制备。所得到的融合蛋白质包含融合至如本文所述的所选择蛋白质或标记蛋白质的本申请的蛋白质。本申请的重组蛋白质还可以通过已知技术连接至其它蛋白质。例如，可以使用如WO 90/10457中所述的异双功能含巯基连接体N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基5硫代乙酸酯将蛋白质偶联。可以用于制备融合蛋白质或连接物的蛋白质的实例包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白、激素、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽类、转铁蛋白、铃蟾肽、脱唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。
因此，本申请提供了包含编码本申请的蛋白质的核酸序列的重组表达载体，本申请的蛋白质为例如本申请的轻链和重链互补决定区、轻链和重链可变区、结合蛋白例如抗体和抗体片段、免疫偶联物以及新的本申请的分离蛋白质。此外，本申请提供了包含本申请的核酸序列或重组表达载体的宿主细胞。
(F)治疗方法和结合蛋白与免疫毒素的药物组合物
发明人已经证明了本申请的结合蛋白显示对IkBβ蛋白-包括IkBβ1、IkBβ2和癌相关的IkBβ变体具有特异性。IkBβ通常是胞内的。然而，发明人已经证实癌细胞可在癌细胞表面表达可检测的IkBβ变体。因此，本发明人已经证实本申请的结合蛋白显示对癌细胞的特异性。此外，发明人还证明了本申请的结合蛋白被癌细胞内化。因此，本申请的结合蛋白可以用于靶向递送生物活性或者医学相关试剂，例如成像剂、放射活性剂或细胞毒性剂。
一个实施方案是治疗或预防癌症的方法，包括向患有或者怀疑患有癌症的受试者施用有效量的本申请的免疫偶联物。另一实施方案是有效量的本申请的免疫偶联物在制造用于治疗或预防癌症的药物中的用途。此外，本申请提供了有效量的本申请的免疫偶联物的用途，还包括附加的癌症治疗剂在制造用于同时、单独或者依次治疗或预防癌症的药物中的用途。本申请还提供了有效量的本申请的免疫偶联物用于治疗或预防癌症的用途。此外，本申请提供了有效量的本申请的免疫偶联物的用途，还包括额外的癌症治疗剂用于同时、单独或依次治疗或预防癌症的用途。
在一个实施方案中，癌症包括，但不限于，胃癌、结肠癌、***癌，以及***、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌(例如导管癌、小叶癌和***癌)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、和慢性髓性白血病)、脑癌、神经母细胞瘤、肉瘤、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在另一实施方案中，癌症是结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、头颈癌、***癌或肺癌。在又一个实施方案中，癌症是结肠癌、胰腺癌或肾癌。
本申请的免疫偶联物选择性抑制或破坏癌性细胞的能力可以使用癌细胞系在体外容易地试验。本申请的免疫偶联物的选择性抑制作用可以通过例如证明癌细胞的细胞增殖被选择性地抑制来确定。
毒性也可以基于细胞生存力测量，例如可以比较暴露于免疫偶联物的癌细胞和正常细胞培养物的生存力。细胞生存力可以通过已知技术，例如台盼兰排斥试验评价。
在另一实例中，可以使用许多模型以测试本申请的免疫偶联物的有效性。Thompson，E.W.等(Breast Cancer Res.Treatment 31：357-370(1994))已经描述了用于通过测量肿瘤细胞介导的对细胞外基质的蛋白酶解和肿瘤细胞对重建基膜(胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、Matrigel或明胶)的侵袭来确定人乳腺癌细胞体外侵袭的模型。其它可应用的癌细胞模型包括培养的卵。巢腺瘤细胞(Young，T.N.等.Gynecol.Oncol.62：89-99(1996)；Moore，D.H.等.Gynecol.Oncol.65：78-82(1997))、人滤泡性甲状腺癌细胞(Demeure，M.J.等，World J.Surg.16：770-776(1992))、人黑素瘤(A-2058)和纤维肉瘤(HT-1080)细胞系(Mackay，A.R.等.Lab.Invest.70：781 783(1994))和肺鳞状(HS-24)和腺癌(SB-3)细胞系(Spiess，E.等.J.Histochem.Cytochem.42：917-929(1994))。也已经描述了涉及在无胸腺裸鼠中肿瘤植入和测定肿瘤生长和转移的体内试验***(Thompson，E.W.等，Breast Cancer Res.Treatment 31：357-370(1994)；Shi，Y.E.等，Cancer Res.53：1409-1415(1993))。
本申请的免疫偶联物可以配制成用于向受试者施用的、适宜体内施用的生物相容形式的药物组合物。物质可以施用至活有机体，包括人和动物。本发明的治疗有效量的药物组合物的施用定义为，在此剂量下和达到预期结果所必需的时间阶段内有效的量。例如，物质的治疗有效量可以根据多种因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本申请的重组蛋白在个体内引起所希望的反应的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每日施用数个分次剂量，或者如治疗状况的急迫性所指示，剂量可以按比例减少。
因此，本申请提供用于治疗或预防癌症的药物组合物，包含本申请的免疫偶联物和可药用载体、稀释剂或赋形剂。在优选的实施方案中，药物组合物中免疫偶联物的效应分子是癌症治疗剂，更加优选毒素。
包含免疫偶联物的药物制剂可以全身施用。药物制剂可以直接向癌症部位施用。取决于施用途径，免疫偶联物可以包裹在材料中以保护化合物不受酶、酸和可能使化合物失活的其它天然条件作用。
根据本申请的一个方面，免疫偶联物通过直接施用递送至患者。本申请考虑了药物组合物以至少足以达到终点的量施用，并且必要时包含可药用载体。
本申请还提供用于降低术后并发症危险的方法，包括在手术治疗癌症之前、之中或之后施用有效量的免疫偶联物。
本文所述的组合物可以通过用于制备可向受试者施用的可药用组合物的实质上已知的方法来制备，以致于有效量的活性物质与可药用赋形剂组合在混合物中。适宜赋形剂描述于，例如Remington′s PharmaceuticalSciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA，2000)。在此基础上，组合物包括，然而非排他性地包括，物质与一种或一种以上可药用赋形剂或稀释剂结合的溶液，并且包含在具有适宜pH和与生理流体等渗的缓冲溶液中。
药物组合物包括但不限于，冻干粉末或者水性或非水性无菌注射溶液或混悬液，其还可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得组合物基本上与预期接收者的组织或血液相容的溶质。可以存在于此类组合物中的其它成分包括例如水、表面活性剂(例如Tween)、醇类、多元醇类、甘油和植物油类。临时配制的注射溶液和混悬液可以从无菌粉末、颗粒、片剂、或浓溶液或混悬液制备。免疫偶联物可以作为在向患者施用之前用无菌水或盐水重构的冻干粉末加以提供，但不限于此方式。
药物组合物可以包含可药用载体。适宜可药用载体包括基本上化学惰性的和无毒的不干扰药物组合物生物活性有效性的组分。适宜药物载体的实例包括但不限于水、盐溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2，3-二油酰基(oleyloxy))丙基)N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二油酰基磷脂酰(phosphotidyl)乙醇胺(DOPE)和脂质体。此类组合物应包含治疗有效量的化合物以及适宜量的载体以便提供用于向患者直接施用的形式。
组合物可以是可药用盐的形式，其包括但不限于与游离氨基形成的那些，例如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的那些，和与游离羧基形成的那些，例如从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胺、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的那些。
在多个实施方案中，药物组合物直接全身施用，或者直接向一个或多个肿瘤区施用。
药物组合物可以用于治疗患有癌症的动物(包括哺乳动物，优选人)的方法中。待施用的免疫偶联物的剂量和类型将取决于多种因素，其可以在人受试者中容易地监测。此类因素包括癌症的病原学和严重性(级别和阶段)。
使用本申请的免疫偶联物治疗癌症的临床结果可由相关领域的技术人员，如医生容易地辨别。例如，测量癌症的临床标志的标准医学试验可以是治疗有效性的强指示剂。此类试验可包括，但不限于，身体检查、性能尺度、疾病标志物、12导联心电图、肿瘤测量、组织活检、细胞检查、细胞学、肿瘤的最长直径计算、放射摄影术、肿瘤的数字成像、生命体征、体重、不良事件记录、感染发作的评估、伴行用药的评估、疼痛评估、血液或血清化学、尿液分析、CT扫描、和药物代谢动力学分析。此外，包括免疫偶联物和另一癌症治疗剂的联合治疗的协同效应可通过与经受单一疗法的患者进行比较研究来确定。
在大多数许可的癌症治疗法中，癌症治疗法用于与其它癌症治疗法联合。因此，本申请提供使用本申请的免疫偶联物与至少一种另外癌症治疗法联合预防或治疗癌症的方法。其它癌症治疗法可以在免疫偶联物施用之前施用、交叉重叠施用、并行施用和/或之后施用。当并行施用时，免疫偶联物和其它癌症治疗剂可以在单一制剂中施用或者在分开的制剂中施用，并且，如果分开施用，则任选通过不同施用模式施用。一种或一种以上免疫偶联物和一种或一种以上其它癌症治疗法的组合将协同作用以对抗肿瘤或癌症。其它癌症治疗法包括但不限于其它癌症治疗剂，包括但不限于2，2，2三氯三乙胺盐酸盐4，4′-(1，2-乙二基(Ethanediyl))双(1-异丁氧基羰基氧基甲基-2，6-哌嗪二酮、5，6-二氢-5-氮胞苷、5-羟基-2-甲酰基吡啶硫代缩氨基脲、6-氮杂尿苷、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、相思豆毒蛋白、阿西维辛、阿柔比星、阿地流津、阿仑单抗、异秋水仙碱、甲胎蛋白、α-硫脱氧鸟苷、六甲蜜胺、氨基喜树素、氨基格鲁米特、氨基蝶呤衍生物、氨萘非特二盐酸盐、氨萘非特L-苹果酸盐、安吖啶、阿那曲唑、盐酸安西他滨、血管生成素、反义寡核苷酸、血管抑制素、蒽霉素、蒽吡唑、艾菲地可宁甘氨酸酯、门冬酰胺酶auristatin E、自体细胞或组织、阿扎胞苷、偶氮丝氨酸、氮丙啶、卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)、卡介苗活疫苗、苯替派(benzotepa)、β倍他米松、β硫鸟嘌呤脱氧核糖核苷、贝伐单抗、金霉素、比卡鲁胺、比桑郡、博来霉素、勃地酮、布喹那、布舍瑞林、白消安、放线菌素c、加利车霉素、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、碳铂、羧基邻苯二甲酸铂、癌胚抗原肽1、癌胚抗原肽1-6D、卡氮芥、卡柔比星、嗜癌菌素A、CC-1065、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、醋酸氯地孕酮、氯脲霉素、色霉素、顺铂、克拉屈滨、克罗米松、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、皮质醇、可的松、氰基吗啉代多柔比星、环戊二烯、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、达卡巴嗪更生霉素、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨(decitabine)、秋水仙胺、地尼白介素(denileukin diftitox)、脱氧多柔比星、***、二脱水半乳糖醇、地吖醌、二氯烯丙基指甲花醌、白喉毒素、偏端霉素A、多西他塞、多拉司他汀10、去氧氟尿苷、多柔比星、屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、柔红霉素醇(duborimycin)、倍癌霉素A、倍癌霉素SA、依达曲沙、依洛尼塞、依利醋铵、依米丁、乙嘧替氟、内皮抑制素、依诺他滨、表柔比星、环硫雄醇、盐酸埃罗替尼、埃斯波霉素、雌莫司汀磷酸钠、溴化乙锭、依托格鲁、依托泊苷、法倔唑、芬维A胺(fenretinide)、氟脲苷、氟达拉滨、氟多潘、氟他胺、福美坦、磷雌酚、福莫司汀、硝酸镓、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、糖皮质激素、戈舍瑞林、短杆菌肽D、胍唑、大田软海绵素B、hepsulfam、己烷雌酚、人绒毛膜***、海蒽酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、英丙舒凡、肌苷乙醇二醛(inosineglycodialdehyde)、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-Y、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介素-18、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素类、伊立替康、异丙铂、L-门冬酰胺酶、拉帕替尼二苯甲磺酸酯、盐酸伊立替康、香菇多糖、来曲唑、甲酰四氢叶酸钙、醋酸亮丙瑞林(抑那通)、左旋咪唑、利多卡因、罗莫司丁、氯尼达明(lonidamine)、lucorteum、淋巴因子、淋巴毒素、麦克菌素II、巨噬细胞炎性蛋白、甘露醇氮芥、美登素、盐酸氮芥、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、美雄烷、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物、美乌替派、单甲基auristatin E、miltefosine、二溴甘露醇、丙米腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇、丝裂霉素C、曼托坦、米托蒽醌、米托唑酰胺、蒙匹胺醇、吗啉代多柔比星、突变的肿瘤特异性抗原、霉酚酸、N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸、N、N-二苄基柔红霉素、神经生长因子、尼罗替尼、尼鲁米特、尼莫司汀、二胺硝吖啶(nitracine)、诺加拉霉素、非自体细胞或组织、奥利默森(oblimersen)、***、OGX-011、橄榄霉素类、骨黏连蛋白ONYX-015、草酸铂、泰素、泰素衍生物、1-(2-氯乙基)-3-(2，6-二氧-3-哌啶基)-1-亚硝基脲、培门冬酶、喷司他丁(pentostatin)、派来霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、苯芥胆甾醇、普卡霉素、哌嗪衍生物、哌嗪双酮、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、吡曲克辛、piroxantrone、血小板衍生生长因子、纤维蛋白溶酶原kringle 5、普卡霉素、鬼臼毒素、聚磷酸***、聚谷氨酸毒树碱卟吩姆钠、紫菜霉素、松龙苯芥、***、丙卡巴肼、普鲁卡因、丙帕锗(propagermanium)、***、假单胞菌属外毒素、多糖-K，蝶罗呤(pteropterin)、嘌呤霉素、吡唑霉素、吡唑啉吖啶、吡唑咪唑、雷替曲塞(raltitrexed)、雷诺氮芥(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、重组人细胞单细胞集落刺激因子、类视黄醇、根霉素、蓖麻毒蛋白A、利妥昔单抗罗喹美克、丝氢酸蛋白酶抑制剂、甲苯磺酸索拉非尼、锗螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑菌素、链脲霉素、苹果酸舒尼替尼、柠檬酸他莫昔芬、替加氟脲、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、细交链孢菌酮酸(enuazonicacid)、台罗西隆(teroxirone)、睾内脂、丁卡因、四氯己铂胺(tetraplatin)、沙立度胺、硫代秋水仙碱、硫鸟嘌呤、硫嘌呤、噻替派、trabectedin、血小板反应蛋白I 衍生的肽、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、拓扑替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、维甲酸、三嗪苯酰胺、三亚胺醌、三亚乙基三聚氰胺、曲洛司坦、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、trofosfamide、杀结核菌素、肿瘤坏死因子样细胞因子、重组肿瘤坏死因子家族蛋白、乌苯美司、尿嘧啶芥子、尿嘧啶、乌瑞替哌、聚氨酯、凡德他尼、VEGF反义寡核苷酸、长春碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、吉雄-864(yoshi-864)、净司他丁、佐柔比星。
在另一实施方案中，一种或一种以上的本申请的免疫偶联物可以与一种或一种以上的下列癌症治疗法或者下列类别治疗剂组合施用，包括但不限于放射治疗、手术治疗、基因治疗、控制副作用的试剂(例如抗组胺剂、抗恶心剂)、癌症疫苗、血管发生抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、免疫抑制剂、提高抗原表达的试剂、与癌症治疗相关的其它试剂、化学治疗剂、免疫治疗剂、光敏剂、tk抑制剂、抗生素、抗代谢物剂、用于断裂DNA的试剂、用于断裂微管蛋白的试剂、烷化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、细胞因子、生长因子、激素治疗、长春花生物碱、植物生物碱和/或抗有丝***剂。
的确，向需要此类治疗的患者施用有效量的免疫偶联物将导致具有显著临床功效的另一癌症治疗剂的剂量减少。降低其它癌症治疗剂剂量的此种功效在不施用免疫偶联物时观察不到。因此，本申请提供了***或癌症的方法，包括施用减少剂量的一种或一种以上其它癌症治疗剂。
此外，向需要此种治疗的患者进行包含免疫偶联物的联合治疗与标准治疗方案的持续期间和周期数相比治疗时间相对缩短。因此，本申请提供***或癌症的方法，包括在相对短的持续时间内和/或在较少的治疗周期中施用一种或一种以上其它癌症治疗剂。
因此，根据本申请，包含免疫偶联物和另一癌症治疗剂的联合治疗可以降低总体癌症治疗的毒性(即副作用)。例如，与单一治疗或者另种联合治疗相比，当递送减少剂量的免疫偶联物和/或其它癌症治疗剂和/或当减少周期的持续时间(即单一施用的周期或一系列此类施用的周期)和/或当减少周期数时，可以观察到毒性降低。
因此，本申请提供药物组合物，其包含免疫偶联物和一种或一种以上另外的抗癌治疗剂，任选地在可药用载体中。
本申请还提供试剂盒，包含有效量的免疫偶联物，任选地与一种或一种以上其它癌症治疗剂组合，以及其用于治疗癌症的使用说明书。试剂盒还可以包括辅助试剂。例如，试剂盒可以包括用于将免疫偶联物注射入受试者的器械，如注射器；储藏或运输免疫偶联物的容器；和/或可药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。
如上所述，使用免疫偶联物的联合治疗可以使癌症或肿瘤对另一癌症治疗剂的施用敏感。因此，本申请考虑了用于预防、治疗癌症和/或防止癌症复发的联合治疗，包括在施用减少剂量的癌症治疗剂之前、之后或者同时施用有效量的免疫偶联物。例如，使用免疫偶联物的最初治疗将增加癌症或肿瘤对随后的癌治疗剂剂量治疗的敏感性。该剂量接近或低于当癌症治疗剂单独施用时或者在缺乏免疫偶联物的情况下施用时标准剂量的低值。当并行施用时，免疫偶联物可以与癌症治疗剂分开施用，并且任选地通过不同的施用模式施用。
在可选实施方案中，另一癌症治疗剂的施用将使癌症或肿瘤对免疫偶联物或结合蛋白敏感。在此种实施方案中，另一癌症治疗剂可以在免疫偶联物或结合蛋白施用之前给与。
在一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括顺铂，例如PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)，剂量为约5-10、11-20、21-40或41-75mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括卡铂，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，剂量为约2-3、4-8、9-16、17-35/或36-75mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括环磷酰胺，例如CYTOXAN(Bristol Myers Squibb)，剂量为约0.25-0.5、0.6-0.9、1-2、3-5、6-10、11-20或21-40mg/kg/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷，例如CYTOSAR-U(Pharmacia & Upjohn)，剂量为约0.5-1、2-4、5-10、11-25、26-50或51-100mg/m2/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷脂质体，例如DEPOCYT(Chiron Corp.)，剂量为约5-50mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括达卡巴嗪，例如DTIC或DTICDOME(Bayer Corp.)，剂量为约15-250mg/m2/周期、约0.2-2mg/kg/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括拓扑替康，例如，HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，剂量为约0.1到0.2、0.3到0.4、0.5到0.8或0.9到1.5mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括拓扑替康，例如，CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn)，剂量为约5到9、10到25或26到50mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括氟达拉宾，例如，FLUDARA(Berlex Laboratories)，剂量为约2.5到5、6到10、11到15或16到25mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷(Ara-C)，剂量为约200到2000mg/m2/周期、300到1000mg/m2/周期、400到800mg/m2/周期或500到700mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括多西他赛，例如，TAXOTERE(Rhone Poulenc Rorer)，剂量为约6到10、11到30或31到60mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括泰素，例如，TAXOL(BristolMyers Squibb)，剂量为约10到20、21到40、41到70或71到135mg/kg/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括5-氟尿嘧啶，剂量为约0.5到5mg/kg/周期、1到4mg/kg/周期或2-3mg/kg/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括多柔比星，例如，ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(Bristol MyersSquibb)，剂量为约2到4、5到8、9到15、16到30或31到60mg/kg/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括依托泊苷，例如，VEPESID(Pharmacia & Upjohn)，剂量为约3.5到7、8到15、16到25或26到50mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括长春碱，例如，VELBAN(EliLilly)，剂量为约0.3到0.5、0.6到0.9、1到2或3到3.6mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括长春新碱，例如，ONCOVIN(Eli Lilly)，剂量为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mg/m2/周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括甲氨喋呤，剂量为约0.2到0.9、1到5、6到10或11到20mg/m2/周期。
因此，联合治疗可以增加癌症或肿瘤对所施用免疫偶联物和/或另一癌症治疗剂的敏感性。以该种方式，更短的治疗周期是可能的，由此减少了毒性事件。周期持续时间可以根据使用的特定癌症治疗剂而变化。本申请还考虑了连续或者间断施用，或者日剂量分成数个部分施用。对于特定癌症治疗剂的适宜周期持续时间将由本领域技术人员确定，并且本申请考虑了对于每一癌症治疗剂的最佳治疗方案的连续评估。对于技术人员的具体指导在本领域是已知的。见例如Therasse等，2000，“New guidelines to evaluate the response to treatmentin solid tumors。European Organization for Research and Treatment of Cancer，National Cancer Institute of the United States，National Cancer Institute ofCanada，”J N atl Cancer Inst.Feb 2；92(3)：205-16。
考虑了免疫偶联物可以通过任可适宜方法施用，例如注射、口服施用、吸入经皮或者瘤内施用，而任何其它癌症治疗剂可以通过相同施用模式或者另一施用模式递送至患者。此外，当打算将多重癌症治疗剂递送至患者时，免疫偶联物和一种或一种以上其它癌症治疗剂可以通过一种方法递送，而其它癌症治疗剂可以通过另一种施用方式递送。
(G)使用结合蛋白和免疫毒素的诊断方法和试剂
所公开的结合蛋白选择性地结合至癌细胞上或癌细胞内，但是没有明显地结合至正常细胞。因此，结合蛋白可以用于癌症诊断。
因此，本申请包括诊断方法、试剂和试剂盒，其本身可以使用，或者在治疗方法之前、之中或者之后使用以确定是否存在癌细胞
在一个实施方案中，本申请提供检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤：
(1)将来自所述受试者的测试样品与本申请的特异性结合至癌细上抗原的结合蛋白或免疫偶联物接触，以产生结合蛋白-抗原复合物；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；和
(3)比较测试样品和对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
在一个实施方案中，抗原是IkBβ蛋白，如IkBβ1、IkBβ2和/或癌相关的IkBβ变体。
本申请还包括用于诊断癌症的试剂盒，包含任何一种本申请的结合蛋白或免疫偶联物和用于诊断癌症的使用说明书。试剂盒还可包括辅助试剂。例如，试剂盒可以包括额外的试剂，例如直接或间接检测本申请的结合蛋白或免疫偶联物的试剂；用于储存或运输结合蛋白或免疫偶联物的容器；阳性和/或阴性对照或参照标准；和/或其他缓冲液或稳定剂。
对于在诊断应用中的使用，结合蛋白、优选抗体或抗体片段可以以可检测标记来标记，例如不透射线的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；荧光化合物(荧光团)或化学发光化合物(生色团)，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；显像剂；或金属离子。如上所述，将标记附着至结合蛋白(例如抗体或抗体片段)的方法是本领域已知的。
本申请的另一个方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤：
(1)测量从所述受试者取得的测试样品中本申请的抗体的量；和
(2)比较测试样品和对照中本申请的抗体的量。
在一个实施方案中，通过例如ELISA测量测试样品中抗体的量来测量抗体的量。在另一个实施方案中，通过例如RT-PCR测量测试样品中编码本申请的抗体的核酸的表达水平来测量抗体的量。
(H)药物组合物、方法和抗原的用途
本申请已经鉴定了在癌细胞表面上递呈，但是在正常细胞上表面没有明显表达的抗原。因此，该抗原可以用于治疗和预防癌症的治疗中。如上所述，IkBβ蛋白，诸如IkBβ1和IkBβ2通常不含饿跨膜结构域，并且不在细胞表面上表达。因此，本发明的抗原抗可以用做治疗靶来治疗和预防癌症。例如，癌相关的IkBβ变体或其部分(诸如胞外结构域)可以用于引发体内免疫反应。此外，本申请包括使用抗原以检测或监测癌症。
(i)药物组合物
一个实施方案是药物组合物，包含与适宜稀释剂或载体混合的、有效量的本申请的抗原。另一个实施方案是药物组合物，包含与适宜稀释剂或载体混合的、有效量的分离的核酸，所述分离的核酸编码本申请的抗原。本申请的进一步的方面是药物组合物，包含与适宜稀释剂或载体混合的、有效量的重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的核酸序列。在一个实施方案中，本申请的抗原是癌相关的IkBβ变体。
例如，本申请的药物组合物可以用于治疗或预防癌症。此外，药物组合物可以用于引发受试者针对在细胞表面表达本申请的抗原的癌细胞的免疫反应。
药物组合物可以如上制备和施用。药物组合物可以用于与如上所述的其它抗癌症治疗剂联使用。
如果免疫试剂(即本申请的抗原或其变体、和/或其编码核酸序列、和/或重组表达载体的试剂)和/或组合物与佐剂共同免疫，而不管施用形式如何，可以显著改善免疫原性。通常，佐剂作为0.05％至1.0％的磷酸缓冲盐水溶液使用。佐剂增强免疫原的免疫原性，但是本身不必然是免疫原性的。佐剂可通过将免疫原保留在施用部位的局部附近而发挥作用，以产生储存效应，利于免疫原向免疫***的细胞缓慢持续释放。佐剂也可以将免疫***的细胞吸引至免疫原库，并且刺激此类细胞以引起免疫反应。由此，实施方案包括还包含佐剂的药物组合物。
多年来已经使用佐剂改善宿主对例如疫苗的免疫反应。内部佐剂(例如脂多糖类)正常情况下是用作疫苗的灭活或减毒细菌的成分。外部佐剂是免疫调节剂，其有代表性地非共价连接至抗原并且被配制为增强宿主免疫反应。因此，已经鉴定了增强对胃肠外递送的抗原的免疫反应的佐剂。然而，这些佐剂中的一些是毒性的，并且会产生不良副作用，使得它们不适宜在人和多种动物中使用。实际上，只有氢氧化铝和磷酸铝(通称明矾)是常规用作人疫苗和兽疫苗中的佐剂。已经良好确立了明矾在增强对白喉毒素和破伤风毒素的抗体反应中的有效性。尽管如此，它确实具有局限性。例如，明矾对于流感疫苗接种是无效的，并且与其它免疫原引起的细胞介导的免疫反应不一致。由使用明矾作为佐剂的抗原在小鼠中引出的抗体主要是IgG1同种型，其对于由一些疫苗试剂提供的保护而言不是最佳的。
广泛的外部佐剂可刺激针对免疫原的有效免疫反应。这些佐剂包括与膜蛋白抗原复合的皂苷类(免疫刺激复合物)、带有矿物油的普卢兰尼克聚合物、灭活的分枝杆菌和矿物油、弗氏完全佐剂、细菌产物如胞壁酰基二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、以及脂质A、和脂质体。
在本申请的一个方面中，在任何本文所述实施方案中可用的佐剂如下。对于肠胃外免疫的佐剂包括铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝(aluminum hydroxy phosphate))。根据标准方法，抗原可以与铝化合物沉淀或者被吸附至铝化合物上。其他佐剂例如RIBI(ImmunoChem，Hamilton，MT)也可以在肠胃外施用中使用。
对于黏膜免疫的佐剂包括细菌毒素(例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、艰难梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)、或其组合、亚基、类毒素或突变体)。例如，天然霍乱毒素亚基B(CTB)的纯化制剂是可以使用的。这些毒素中任何毒素的片段、同系物、衍生物和融合物也是适宜的，只要它们保留了佐剂活性即可。优选地，使用具有降低毒性的突变体。适宜突变体已经描述(例如在WO 95/17211(Arg-7-Lys CT突变体)、WO9606627(Arg-192-Gly LT突变体)、和WO 95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-Gly PT突变体)中)。可以在本申请的方法和组合物中使用的另外的LT突变体包括例如Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突变体。其它佐剂(例如多种来源(如大肠杆菌、明尼苏达沙氏杆菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或福氏志贺菌(Shigella flexneri))的细菌单磷酰脂A(MPLA)、皂苷类、或聚交酯乙交酯共聚物PLGA)微球)也可以用于粘膜施用中。
对于黏膜免疫和肠胃外免疫两者有用的佐剂包括聚磷腈(例如WO9502415)、DC-chol(3b-(N-(N′，N′-二甲氨基甲烷)-氨甲酰基)胆固醇)(例如美国专利号5,283,185和WO 96/14831)和QS-21(例如，WO8809336)。
可以通过本领域技术人员已知的任何常规途径用药物组合物免疫受试者，所述药物组合物包含本申请的抗原、编码其的分离的核酸序列和/或重组表达载体。这可以包括，例如经过黏膜(例如眼睛的、鼻内的、口腔的、胃的、肺的、肠的、直肠的、***的或泌尿道的)表面的免疫、经过肠胃外(例如皮下、真皮内、肌内、静脉内或腹膜内)途径的免疫或者结节内免疫。优选的途径依赖于所选择的免疫原，并且这对于本领域技述人员是显而易见的。施用可以以单一剂量或者定期重复来实施。合适的剂量依赖于技术人员能理解的多种参数，例如免疫原本身(即是肽还是核酸(并且更加具体而言是其类型))、施用途径和待免疫的动物的状况(体重、年龄等等)。
本申请还提供试剂盒，包含有效量的本申请的抗原，任选地一种或一种以上其它癌症治疗剂组合，以及其使用说明书。试剂盒还可以包含辅助试剂。例如，试剂盒可以包括用于向受试者注射本申请的抗原的器械，例如注射器；用于储存或运输本申请的抗原的容器；佐剂；和/或可药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。在一个实施方案中，本申请的抗原是癌相关的IkBβ变体。
(ii)治疗方法
如上面所提到，本申请的抗原存在于癌细胞上，但是不明显存在于正常细胞上。因此，本申请的抗原或其部分(诸如胞外结构域)可以用于预防或治疗癌症的治疗方法中。此外，本申请的抗原或其部分(诸如胞外结构域)可以用于引起受试者例如疫苗免疫反应。
一个实施方案是本申请的抗原在制造治疗或预防癌症的药物中的用途。另一个实施方案是抗原在制造引起受试者中免疫反应的药物中的用途。
本申请还包括编码本申请的抗原的分离的核酸序列在制造治疗或预防癌症的药物中的用途。此外，本申请包括编码抗原的分离的核酸序列在制造引起受试者中免疫反应的药物中的用途。
进一步的实施方案是重组表达载体在制造治疗或预防癌症的药物中的用途，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。同样，本申请包括重组表达载体在制造引起受试者中免疫反应的药物中的用途，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。
另外的实施方案是治疗或预防患有或者怀疑患有癌症的受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的本申请的抗原。此外，本申请包括治疗或预防患有或怀疑患有癌症的受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码本申请的抗原。此外，本申请包括治疗或预防患有或者怀疑患有癌症的受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。
另一个实施方案是诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法，包括向所述受试者施用有效量的本申请的抗原。此外，本申请包括诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法，包括向所述受试者施用有效量的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码本申请的抗原。此外，本申请包括诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法，包括向受试者施用有效量的重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。
在一个实施方案中，本申请的抗原是癌相关的IkBβ变体。
(iii)诊断方法
本申请的抗原表达癌细胞上，并且没有明显地表达于正常细胞上，因此对本申请的细胞表面上抗原的检测可以用作癌症的诊断方法。另外，对癌相关的IkBβ变体的RNA的检测可以用作癌症的诊断方法。
一个实施方案是检测或监测受试者中癌症的方法，包括检测样品中细胞上的本申请的抗原，其中如果在细胞上检测到本申请的抗原，则表明具有癌症。
多种技术可以用于检测细胞上的本申请的抗原。例如，本申请的结合蛋白可以用于免疫测定中以检测本申请的抗原的细胞表面表达。本领域技术人员会意识到，多种技术可以用于检测和/或定量抗原的细胞表面表达，包括Western印迹、免疫沉淀接着进行SDS-PAGE、免疫细胞化学、FACS、蛋白质阵列等。
本申请一个方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括检测样品中细胞的本申请的癌相关的IkBβ变体的表达，其中如果在细胞内检测到癌相关的IkBβ变体的表达，则表明具有癌症。在一个实例中，编码本申请的癌相关的IkBβ变体的RNA表达产物用于检测细胞内癌相关的IkBβ变体的表达。本领域技术人员会意识到，可以通过检测编码癌相关的IkBβ变体的mRNA、或者特异性和/或选择性杂交至编码癌相关的IkBβ变体的mRNA的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或者天然存在的或修饰的核苷酸的其它组合来检测或定量RNA表达产物。
多种方法可以用于检测和/或定量细胞内癌相关的IkBβ变体的RNA表达，包括RT-PCR、核酸酶保护试验如核糖核酸酶保护试验和S1核酸酶试验、和Northern 印迹等。
在分离编码本申请的抗原的mRNA和/或癌相关的IkBβ变体的mRNA后也可以使用本领域已知的方法检测基因组突变。
在一个实施方案中，癌相关的IkBβ变体是IkBβ2变体。
(I)其它方法
IkBβ是NFk-B的抑制调节剂。由此，IkBβ在调节细胞生长、凋亡和炎性反应中发挥重要的作用。通常在细胞表面不存在IkBβ。通常非磷酸化的IkBβ结合到细胞质中的NFk-B中，并阻止NFk-B进入细胞核中。相反，癌相关的IkBβ变体具有至少一个跨膜结构域并且存在于癌细胞的表面上。因此，不限于理论，所述癌症相关的IkBβ变体能够破坏癌细胞中IkBβ中的正常作用。由此，本申请包括通过调节癌细胞中癌相关的IkBβ变体的活性或恢复或取代癌细胞中IkBβ活性来治疗和预防受试者癌症的方法。
在本申请的一个实施方案中，治疗或预防受试者中癌症的方法包括预防或降低癌相关的IkBβ变体的表达或功能或修复或代替癌细胞中IkBβ的正常功能。
可以使用标准技术来预防或降低细胞中癌相关的IkBβ变体的表达，包括使用对癌相关的IkBβ基因变体的转录物反应的反义分子、三螺旋分子或核酶分子。
例如，标准技术可以用于产生反义核酸分子，即，与编码目的多肽的有义核酸互补的分子，例如与双链cDNA 分子的编码链互补的分子，或与mRNA序列互补的分子。因此，反义核酸分子能够氢键合到有义核酸。反义核酸能够互补于整个编码链或其部分，例如，全部或部分的蛋白编码区(或开放阅读框)。反义核酸分子能够反义于编码目的多肽的核苷酸序列的编码链的全部或部分非编码区。非编码区(“5’和3’非翻译区”)是编码区两侧的5’和3’序列，并且不翻译为氨基酸。
反义寡核苷酸可以是例如长约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸或以上。本申请的反文核酸可以使用化学合成和酶连接反应通过本领域已知的过程构建军。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学合成，所述修饰的核苷酸设计为增加分子的生物稳定性或增加反义核酸分子与有义核酸分子之间形成的双链的物理稳定性，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸可以使用。能够用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶、5氯尿嘧啶、5碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4乙酰基胞嘧啶、5(羧羟甲基)嘧啶、5羧甲基氨甲基2硫尿苷、5羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、βD乳糖基核苷、N6异戊烯基腺嘌呤、1甲基鸟嘌呤、1甲基肌苷、2，2二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2甲基鸟嘌呤、3甲基胞嘧啶、5甲基胞嘧啶、N6腺嘌呤、7甲基鸟嘌呤、5甲基氨甲基尿嘧啶、5甲氧基氨甲基2硫尿嘧啶、βD甘露糖基核苷、5’甲氧羧甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲基硫N6异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶5氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、核苷、2硫胞嘧啶、5甲基2硫尿嘧啶、2硫尿嘧啶、4硫尿嘧啶、5甲基尿嘧啶、尿嘧啶5氧乙酸甲酯、尿嘧啶5氧乙酸(v)、5甲基2硫尿嘧啶、3(3氨基3N 2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6二氨基嘌呤。可替代的，反义核酸可以用表达载体生物学产生，其中核酸已经以反义方向被亚克隆到表达载体中(即，从***的核酸转录的RNA与目的靶核酸反义取向)。
施用至受试者的或原位产生的反义核酸分子以便它们杂交至或结合至编码目的多肽的细胞mRNA，由此抑制例如通过抑制转录和/或翻译来抑制表达。杂交可以通过常规的核苷酸互补形成稳定的双链体，或为例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下经双链体大沟中的特异的相互作用。本申请的反义核酸分子的施用途径包括直接注射在组织部位。替代地，反义核酸分子可以被修饰成靶向作用选择的细胞并接着全身施用。例如，对于全身施用，反义核酸分子可以被修饰，以便它们例如通过将反义核酸分子连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体，特异性地结合到在选择的细胞上例如T细胞或脑细胞上表达的受体或抗原。如下所述，用载体例如基因治疗载体反义核酸分子也可以被递送到细胞中。为了达到足够胞内浓度的反义分子，其中反义核酸分子位于强polII或polIII启动子控制下的载体构建物是优选的。
目的反义核酸分子可以是α端基异构核酸分子。α端基异构核酸分子与互补RNA形成双链杂合体，其中与通常的单元不同，所述双链走向互相平行(Gaultier等，1987，Nucleic Acids Res.15：66256641)。所述反义核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucleic Acids Res.15：61316148)或嵌合的RNADNA类似物(Inoue等1987，FEBS Lett.215：327330)。
核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够裂解单链核酸，如mRNA，在mRNA上他们具有互补区，并且也可以用标准技术生。由此，核酶(例如锤头核酶(描述于Haselhoff和Gerlach，1988，Nature 334：585591))也可以用于催化性裂解mRNA转录物由此抑制mRNA编码的蛋白的翻译。对编码目的多肽的核酸分子特异性的核酶可以基于编码癌相关的IkBβ变体的cDNA核苷酸序列设计。例如，在Cech等人的U.S.Patent No.4,987,071和Cech等人U.S.Patent No.5,116,742中，可以构建四膜虫L 19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与被降解的核苷酸序列互补。可替代地，编码目的多肽的mRNA可以用于从RNA分子库中选择具有特异性的核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如见Bartel和Szostak，1993，Science 261：1411 1418。
三螺旋结构也可以用公知的技术产生。例如，目的多肽的表达可以通过靶向作用与编码多肽的基因调节区(例如，启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成阻止靶细胞中基因转录的三螺旋结构加以抑制。一般见Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)：56984；Helene，1992，Ann.N.Y Acad.Sci.660：27 36和Maher，1992，Bioassays 14(12)：807 15。
在许多实施方案中，核酸组分可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰以改进例如分子的稳定性、杂交或分子的溶解性、例如，核酸的脱氧核糖磷酸骨架可以被修饰以产生肽核酸(见Hyrup等，1996，Bioorganic & MedicinalChemistry 4(1)：523)。如本文所用，术语“肽核酸’或“PNAs”指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架取代并且只保留四种天然的核碱基。已经显示中性PNAs骨架在低离子强度下实现与DNA和RNA的特异性杂交。可以用标准的固相肽合成方案，如如上述的Hyrup等1996、PerryO’Keefe等1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670675所述开展PNA寡聚体的合成。
PNAs可以例如被修饰，通过将亲脂基团或其他辅助基团结合到PNA、通过形成PNA DNA嵌合体或通过使用脂质体或其他的本领域已知的药物递送技术例如增强它们的稳定性或细胞摄取。例如，可以产生可结合PNA和DNA优良特性的PNA DNA嵌合体。这样的嵌合体使得DNA识别酶例如RNAse H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高的结合亲合力和特异性。用基于碱基堆积、核碱基之间的键的个数和取向选择的适当长度的接合体可以连接PNA DNA嵌合体(Hyrup，1996，见上)。PNA DNA嵌合体的合成可以在如Hyrup，1996，如上和Finn等1996，Nucleic Acids Res.24(17)：335763所述开展。例如，可以在支持物上用标准的亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物合成DNA链。化合物如5’(4甲氧基三苯甲基)氨基5’脱氧胸苷亚磷酰胺可以用作PNA和DNA 5’端之间的接头(Mag等，1989，Nucleic Acids Res.17：5973 88)。接着以分步的方式偶联PNA单体以产生含有5’PNA片段和3’DNA片段的嵌合分子(Finn等1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357 63)。可替代地，嵌合分子可以用5’DNA片段和3’PNA片段合成(Peterser等1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119 11124)。
在其他的实施方案中，寡核苷酸可以包括其他附加的基团例如肽(例如用于体内靶向作用宿主细胞受体)或促进通过细胞膜运输的试剂(见，例如Letsinger等1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553 6556；Lemaitre等1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648 652；International Publication No.W088/09810)或促进通过血脑屏障运输的试剂(见，例如International Publication No.W089/10134)。另外，寡核苷酸可以用杂交引起的裂解剂修饰(见，例如Krol等人1988，Bio/Techniques 6：958976)或***剂修饰(见，例如Zon，1988，Pharm.Res.5：539549)。为了达到该目的，寡核苷酸可以缀合到另一个分子上，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂等。
本申请的另一个方面是治疗或预防受试者中癌症的方法，其包括修复或代替IkBβ的表达或功能。在一个实施方案中，这与治疗或预防受试者中癌症的方法联合进行，其包括阻止或减少癌相关的变体IkBβ的表达或功能。
本发明的另一个方面是鉴定能够调节癌相关的IkBβ变体的表达或活性的化合物的方法，其可以用于预防或治疗癌症。在本发明的一个实施方案中，用于鉴定化合物预防或治癌症的能力的方法包括步骤：
(a)将表达癌相关的IkBβ变体的细胞与测试化合物接触；和
(b)测定癌相关的IkBβ变体的表达或功能；和
(c)比较癌相关的IkBβ变体与对照的表达或功能，其中癌相关的IkBβ变体与对照相比表达或功能的减少指示了化合物可以用于预防或治疗癌症。
本发明的另一个方面是重组表达形式的本申请的抗原和/或相似修饰的其它IkB蛋白或其片段或相应的核酸序列的制备，用于检测跨膜形式的IkB蛋白和/或本申请的抗原的存在。所述检测可以包括检测蛋白、编码本申请的修饰的IkB蛋白或基本申请的抗原的基因和/或mRNA。所述重组形式可以用于制备抗体或检测患者或受试者循环中的存在的抗体。
上面的公开一般性地描述了本发明。通过参照下面的具体实施例可以得到更加完全的理解。这些实施例仅以例证的目的描述并且不旨在限制本发明的范围。当环境暗示或出现应急情况时考虑了形式改变和等效替代物。虽然在本文中已经采用了特定术语，但是此类术语旨在是描述意义的，而不是限制的目的。
下列非限定性实施例用于说明本发明。
实施例
实施例1：VB1-204单克隆抗体的产生和测序
VB1-204是一种IgM MAb，其从乳腺癌患者的***产生。
信使RNA从杂交瘤细胞分离并且使用逆转录酶合成第一链互补DNA(cDNA)。然后cDNA用于通过PCR分离重链和轻链抗体片段。VH和λ的共有序列框架区的PCR引物分别用于扩增重链和轻链。
5’VH引物：
1 5’CCA GCC ATG GCG CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT G(SEQID NO：12)
2 5’CCAGCC ATG GCG SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG(SEQID NO：13)
3 5’CCAGCC ATG GCG CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG(SEQID NO：14)
4 5’CCA GCC ATG GCG SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG(SEQ ID NO：15)
5 CCA GCC ATG GCG GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG(SEQID NO：16)
6 5’CCA GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG(SEQ ID NO：17)
7 5’CCA GCC ATG GCG CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG(SEQ ID NO：18)
8 5’CCA GCC ATG GCG CAG GAR GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG(SEQ ID 19)
9 5’CCA GCC ATG GCG CAG CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG(SEQ ID NO：20)
3’引物
15’CCA GGA GAA AGT GAT GGA GTC GGG AAG GAA GTC CTGTGC GAG(SEQ ID NO：21)
25’CGA CGG GGA ATT CTC ACA GGA GAC GAG GGG GAA AAGGGT TGG(SEQ ID NO：22)
λ引物
5’引物
15’ATG GCC TGS WCY CCT CTC YTC CTC AYC(SEQ ID NO：23)
25’ATG GCC TGG GCT CTS YTB YTS YTC ASC(SEQ ID NO：24)
35’ATG GCM TGG AYC SYT CTC YTC CTC GGC(SEQ ID NO：25)
3’引物
5’CAC TAG TGT GGC CTT GTT GGC TTG GAC CTC CTC AGA GGAGGG(SEQ ID NO：26)
注释：为了分离链，对于某些共有序列，5’引物混合物使用混合的碱基：R＝A+G，S＝C+G，W＝A+T，Y＝C+T，D＝A+T，H＝A+C，K＝T+G，B＝T+C+G，M＝A+C。
PCR反应包括50μL反应体积，其包含：
10×PCR缓冲液        5μL
2mM dNTP            5μL
引物5’             20pmol
引物3’             20pmol
Taq DNA聚合酶       2.5U
DNA模板             50ng
PCR循环条件是：94℃下1分钟，62℃下1分钟，72℃下1分钟，30个循环，并且最后在72℃延伸10分钟。采用两轮30个循环并且在第一轮30个循环采用以下引物：5’VH引物和3’引物-1.。接着用5’VH引物和3’引物-2将1μL的第一轮PCR反应产物再扩增。
扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离。切下目的条带并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化、克隆入TOPO pCR 2.1克隆载体中，然后使用373DNA 测序仪测序。序列分析表明，重链和轻链的亚类分别是VH3(图1A)和VL3(图1B)。轻链和重链可变区显示在图1(SEQ ID NO：1-4)中。VB1-204的CDR序列显示在表1中(SEQ ID NO：5-10)。
实施例2：通过测量肿瘤细胞反应性抗体表征
通过流式细胞术测试VB1-204对代表7种不同类型的上皮癌的反应性(图2)并将结果总结于表2中。MF值表示两个实验中相对于对照抗体的中位荧光的平均增加倍数。值零表明相对于对照抗体没有反应性。结合最强的是CF-Pac-1和MB-231细胞，其后紧跟着A-375。因此，VB1-204结合到局限于肿瘤细胞的膜的抗原上。
实施例3：通过比较肿瘤对正常组织微阵列来分析抗体性质
检测VB1-204并与在正常关键组织的低密度(LD)阵列上的同种型对照(IgM骨髓瘤)比较(表3A)。正常关键组织的膜染色被认为是最少的，在肺组织、结肠细织和肝组织的膜有一些染色。发现在所有检测的正常关键组织的细胞质中存在显著的染色，这表明与存在于正常细胞中的胞内蛋白发生了结合。
接着在高密度(HD)***固定的肿瘤组织微阵列中检测VB1-204的反应性(表3B)。与正常组织不同，在肝、结肠、肺、胰腺和肾膜上检测到VB1-204的反应性。在结肠上每组织样品的膜染色频率是最高的。在肝、结肠、肾、胰腺和肺上检测到膜染色，发生率、强度和阳性细胞的百分比不同。
实施例4通过共焦显微镜术评定VB1-204的内化
VB1-204和对照抗体95E9，已知为细胞内的内化抗体)被用于评定VB1-204的内化。为了确定细胞表面结合的VB1-204是否内化，使用了借助于激光扫描共焦显微镜术的荧光分布和胞内染色的直接显影。A-375细胞与VB1-204(100μg/mL)或对照抗体在4℃温育。在细胞冲洗后一半抗体在37℃温育1小时，另一半维持在4℃。用荧光素标记的第二抗体标记固定的(用甲醛溶液)和未固定的细胞。如5E9阳性对照抗体所示，与VB1-204在4℃温育60分钟的A-375细胞显示了荧光标记的周向分布(图3A)。将VB1-204处理的细胞加热到37℃在60分钟内显示胞内染色图案，如图3B所示，这表明了VB1-204/抗原复合物的内化。
实施例5：VB1-204的结合亲合力
使用流式细胞术来评定VB1-204的结合亲合力，针对固定数目的肿瘤细胞(A-375)对一系列的抗体浓度检测了2小时，获得饱和曲线。使用Sigma Plot(Jandel Scientific，San Rafael，CA)生成值和图像分析结果。将测定的中位荧光的倒数绘制为抗体浓度的倒数的函数曲线以通过Lineweaver-Burk方法确定KD。产生了直线并且从曲线斜率计算KD(图4A和4B)。通过以下公式确定解离常数和KD：1/F＝1/Fmax+(KD/Fmax)(1/IgM)，其中F＝背景减去中位荧光，Fmax从曲线计算。如图4A和4B所示，计算的VB1-204的解离常数为5x10-9M。
实施例6：抗原的分离和鉴定
肿瘤细胞系A375(黑素瘤)、HepG2(肝细胞癌)、MB 231(乳腺癌)CF-PAC-1和PANC-1(胰腺癌)和DU-145(***癌)被用于鉴定结合VB1-204的膜相关的抗原。这些细胞系通过流式细胞术基于肿瘤细胞特性进行选择。细胞系购自ATCC和按照ATCC的指南培养。
结合VB1-204的抗原的初步表征
VB1-204被用于免疫沉淀来自肿瘤细胞系的膜提取物的蛋白。接着在SDS-PAGE凝胶上分离纯化的蛋白，随后用VB1-204进行western印迹。在1D-PAGE上检测到一条65±2kDa的带以及一条～34kDa的带。在用2％SDS在65℃还原纯化的蛋白60分钟后，所有的带被破坏成在所有反应细胞系始终可见的单条强的～34KDa带。这些实验数据将VB1-204抗原归类为“可印迹的”含有N-聚糖掩蔽的表位的抗原。如在图5A和5B中所示，在所有的阳性细胞系中观察到强～34kDa。带的强度也反应了在该特定细胞系中抗原表达水平。
质谱分析和蛋白鉴定
来自阳性细胞系CFPAC-1膜组分以及阴性细胞系Panc-1膜的蛋白用VB1-204免疫沉淀并在ProteomeLabTM PF-2D***上分离。在阳性细胞系中观察到在10.85分钟洗脱的单峰而在阴性细胞系中不存在该峰，如图6所示。
MS分析的组合结果将在肿瘤细胞系CFPAC-1、A375和MB231上的VB1-204的抗原鉴定为IkBβ2的变体形式。最初从这些细胞系收集的、与数据库序列100％匹配的肽在图7A、7B和7C中显示以基于最高概率的得分定位到其蛋白的位置上，并包括在表4中(SEQ ID NO：31-52)。例如，针对IkBβ2(SEQ ID NO 27)、IkBβ1(SEQ ID NO 28)和IkBβ2β概念变体(conceptual variant)(SEQ ID NO 29)绘制图谱，显示具有最高的蛋白得分并显示了最相关的鉴定。所有从全部细胞系收集的、或在最初MS分析或随后的片段化中获得肽以及被鉴定为变体肽的肽(下述)被组合并在图8中将它们相应的定位到IkBβ2变体中(SEQ ID NO 30)，列在表4中(SEQ ID NO：31-52)。
肽1985.978172和1070.468308的MS片段化
从头序列鉴定导致鉴定了变体肽以及那些100％定位到序列的肽。安装在纳米源上的分离的纳米喷雾头用于此目的。碰撞能为48V，帘气和CAD气分别保持为25和6，并且将样品循环1.667分钟(100周期)来实现稳定的离子片段化。对所述肽中的两个进行MS/MS片段化(1985.978172和1070.468308)产生了图9A和9B中所示的片段离子。来自肽分子量1985.978172的肽LGVLAAAVGGVGLGAWL(SEQ ID NO：34)和来自肽分子量1070.468308的肽ILGVTSTVVAL(SEQ ID NO：37)显示与IkBβ2的两侧序列具有100％的同源性，但与中间序列没有这样的同源性，这表明了鉴定了新的序列。所述序列包括8个氨基酸的改变，导致形成了两个特有的疏水跨膜结构域的可变区。这些区大约为LGSLGVLAAAVGGVGLGAWLGPG(SEQ ID NO 53)和LAAILGVTSTVVALYAAGAGLCV(SEQ ID NO：54)。跨膜结构域的确切跨度随所用的蛋白质结构建模算法而少许不同。疏水可变结构域被IkBβ的野生型区隔开。一个肽(1205.378172来自(402.800000，3+)(SEQ ID NO：35))的MS/MS片段化产生了如图9C所示的另外的碎片离子，其显示与IkBβ2具有100％的同源性。
实施例7：来自癌细胞提取物的IkBβ2免疫沉淀
VB1-204被用于免疫沉淀来自肿瘤细胞系CFPAC-1的纯化膜的和全细胞的提取物的蛋白。接着在SDS-PAGE凝胶上分离纯化的蛋白质。分离的蛋白质通过Western印迹用VB1-204和用可商业途径获得的识别IkBβ1和IkBβ2同种型的抗体分析。商业抗体抗覆盖kBβ的氨基酸56-145(Abnova，HOOOO4793-M01)的重组肽序列。该区在癌相关的IkBβ2变体中含有3个氨基酸改变(位于106、111和112位)并也含有推定的所述变体的胞外部分(大约在氨基酸38与102之间)。图10显示VB1-204结合到存在于全细胞裂解物和膜部分中的蛋白质，而商业抗体只结合到全细胞裂解物蛋白。所有的条带都具有相同的MW。数据表明VB1-204也检测位于细胞内以及膜形式的野生型IkBβ，但是商业抗体只检测胞内野生型并且其与癌相关的变体的结合被免疫肽中的氨基酸改变阻止。
实施例8衍生自VB1-204的免疫毒素的细胞毒性
VB1-204的可变区被用于构建用于治疗癌症的免疫偶联物。改良形式的植物毒素bouganin融合到Fab形式的VB1-204上。
VB6-204构建
通过产生EcoRI-PelB-VH204-ApaI和AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI片段，将它们***EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/pING3302质粒构建VB6-204构建物。构建的片段被直接克隆到pING3302Xoma载体上处于***糖诱导的araBAD启动子控制下。在经L-(+)***糖诱导后，紧邻目的基因的PelB前导序列的存在使得蛋白分泌到培养基上清液中。置于VL-CL结构域的N端的组氨酸亲和标签使得能够利用Ni2+螯合俘获方法进行纯化。
通过剪接重叠延伸聚合酶链式反以PelB和VB1-204-VHDNA质粒为模板以及下列引物组装EcoRI-PelB-VH204-ApaI片段：
1)5’PelB：5’
Figure BPA00001186582800721
CCT GCA GGT CTA TGG AAC GAT AAA TGC(SEQ ID NO：56)
2)3’PelB-VH204：5’CGC CAT CGC TGG TTG GGC AGC GAG TAA TAACAA TCC(SEQ ID NO：57)
3)5’PelB-VH204：5’GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAG GTG CAGCTG GTG GAG TCT GGG(SEQ ID NO：58)
4)3’VH204-ApaI：5’GAC CGA
Figure BPA00001186582800722
CTT GGT GGA GGC TGA GGAGAC GGT GAC CAG GGT(SEQ ID NO：59)
用上述的全部4条引物进行两步剪接重叠延伸PCR方法来构建和扩增EcoRI-PelB-VH204-ApaI。加入EcoRI和ApaI限制位点(黑体)来帮助将PelB-VH204克隆到EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302载体上。PCR反应包括含有以下的50μL反应体积：
10X PCR缓冲液        5μL
2mM dNTPs            5μL
50mM MgCl2           2μL
引物5’              20pmol
引物3’              20pmol
Taq DNA聚合酶        2.5U
DNA模板              50ng
PCR循环条件为：94℃1min，62℃1min和72℃1.5min，总共20个循环，最后在72℃延伸10min。
步骤1
第一个PCR反应包含引物1和2，以及PelB模板。产生在5’端为含有EcoRI限制位点的PelB区以及在3’端为PelB前导信号的片段(131bp)。
在分开的另一个PCR反应中，用引物3和4与204VH模板产生VH204片段(438bp)，其5’端一侧为PelB前导信号和VH结构域的起点和3’端一侧为含有ApaI位点的CH结构域的21核苷酸。
步骤2
在接下来的PCR反应中，用引物1和4以及1μL的各PCR产物来产生EcoRI-PelB-VH204-ApaI片段(548bp)。
通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应方法使用VB1-204轻链DNA质粒作为模板和以下引物组装AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI片段：
1)5’De-boug-AflII：5’ATCTTT AAA AGC TCC AAA TAGTGA TCT AGA GTC GAC(SEQ ID NO：60)
2)3’PelB-6xHis：5’GTG ATG GTG ATG GTG ATG CGC CAT CGC TGG(SEQ ID NO：61)
3)5’6xHis-VL-204：5’ATG GCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TCC TATGAG CTG ACT CAG CCA CCC(SEQ ID NO：62)
4)3’VL-CL：5’GAC CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GACGGT CAG CTT GGT CCC(SEQ ID NO：63)
5)5’入恒定区：5’CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTGTTC(SEQ ID NO：64)
6)3’端-XhoI入恒定区5’
Figure BPA00001186582800732
TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGGGGC CAC TGT(SEQ ID NO：65)
用以上列出的全部6条引物进行两步剪接重叠延伸PCR方法来构建和扩增AflII-PelB-6xHis-VL204-CLXhoI。加入AflII和XhoI 限制位点(加黑)来帮助将AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI克隆到EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302载体上。
步骤1
在第一个PCR反应中，引物1和2为用于扩增PelB片段(195bp)，该片段在5’端一侧含有AflII限制位点，在3’端侧含有6xHis标签。
在第二个PCR反应中，引物3和4以及VB1-204轻链模板用于扩增6xHis-VL204片段(379bp)，该片段两侧，在5’端含有6xHis以及在3’端为CL结构域的前21个核苷酸。
用引物5和6以及CL模板进行第3个PCR反应，产生了含有3’端XhoI限制位点的入轻链恒定区(327bp)。
步骤2
在接下来的PCR循环中，用引物1和6和1μL的各PCR产物来产生AflII-PelB-6xHis-VL204-
Figure BPA00001186582800741
片段(833bp)。
一旦序列得到了证实，将PelB-VH204片段用EcoRI和ApaI限制酶消化并连接到用同样的酶预先消化的EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302载体中。用所述连接反应物转化10F感受态细胞并涂板到补充有四环素的LB琼脂板上。通过质粒PelB-VH204-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302的限制图谱证实了***片段的存在。接着用AflII和XhoI限制酶消化AflII-PelB-6xHis-VL204-
Figure BPA00001186582800742
片段并连接到预先用同样的酶消化的PelB-VH204-CHde-bouganin-AflII-XhoI/3302载体上来构建VB6-204。在证实了存在正确的***后，将构建物转化到大肠杆菌E104细胞中进行表达。纯化和检测从6L TB碎片化产生的VB6-204蛋白。VB6-204免疫偶联物的核苷酸SEQID NO：36)和氨基酸序列(SEQ ID NO：37)显示在图11中。
VB6-204蛋白的细胞毒性
通过MTS分析来测量VB6-011的细胞毒性。简单地说，接种抗原阳性和抗原阴性的细胞，每孔1000个细胞，并在37℃培养3小时。随后将不同浓度的VB6-204和de-bouganin加到细胞中，并在5天后检测存活率。经过5天培养后，由于大量的细胞死亡，确定抗原阳性细胞系的计算的VB6-204的IC50。相反，由于抗原阴性细胞保持活力，所有没有测定细胞系的IC50。
实施例9：癌干细胞分析
与aldefluor(ALDH1)染色相关的VB1-204结合用于评价癌干细胞反应性。一般，具有强ALDH染色的肿瘤细胞代表能够在异种移植物中自我更新并能够产生肿瘤的癌干细胞部分。高ALDH1活性被认为赋予对化学治疗剂抗性，导致新肿瘤过度生长和患者随后的复发(Wicha MS，Liu S和Dontu G.2006，CancerRes.66，1883-1890；Ginestier C，Hur MH，Charafe-Jauffret E et al.2007，CellStem Cell，1，555-567)。2色流式细胞术被用于测定结合宫颈细胞系C33A和***细胞系DU-145的ALDH1阳性细胞的VB1-204。结合ALDH1阳性的C33A和DU-145亚群的VB1-204突出了其对抗癌干细胞系的潜在用途。
实验设计：简单地说，将2x105个细胞与aldefluor试剂在37℃培养30分钟。接着冲洗细胞并在25μg/mL的VB1-204存在下在4℃培养2小进。结合到细胞上的VB1-204用生物素化山羊抗人H&L接着用链霉亲和素Cy5检测。IgM黑素瘤、人IgM anti-Id被用作阳性对照。另外，在作为反应的抑制剂DEAB的存在下证实了aldefluor染色的特异性。
结果：结果显示在图13和14中。数据分析显示2.98％和4.2％的C33A和DU-145细胞对癌干细胞标记aldefluor是阳性的(图13B和14B 的右下四分之一图)。VB1-204结合大部分的C33A(92.5％)&DU-145(96.8％)细胞，显示为细胞特征变换到图13C和14C的左上四分之一图。图13D和14D显示在存在VB1-204时ALDH1阳性的C33A细胞(2.3％)和DU-145(5.0％)也转换到右上四分之一图。这个数据表明VB1-204结合C33A & DU-145的癌干细胞部分以及表明VB1-204识别的抗原代表了癌干细胞部分。
尽管本申请已通过目前被认为优选的实施例进行了描述，但是应当理解，本发明不限于所公开的实施例。恰恰相反，本发明旨在涵盖处于所附权利要求书精神和范围内的多种修改和等同排列。
本文所有出版物、专利和专利申请以其全文通过引用并入本文，其程度为似乎各个出版物、专利、专利申请被明确且单个标明其全文通过引用并入本文
表1：VB1-204的CDR序列
Figure BPA00001186582800761
表2：通过流式细胞术表征肿瘤细胞反应性的抗体特征
Figure BPA00001186582800762
表3A：对于VB1-204的关键正常组织的LD阵列
  组织   膜染色   得分范围＊   细胞质染色   得分范围＊
  脑   无(0/4)   0   4/4   2-3+(60-80％)
  结肠   1/5   1+(10％)   5/5   1-3+(20-50％)
  心脏   无(0/5)   0   5/5   2+(60-80％)
  肾   无(0/5)   0   5/5   2-3+(50-70％)
  肝   3/5   1+(10％)   5/5   1-3+(10-70％)
  肺   5/5   1+(20％)   5/5   1-2+(10-40％)
组织 膜染色 得分范围＊ 细胞质染色 得分范围＊
  胰腺   无(0/5)   0   5/5   1-3+(10-70％)
  胃   无(0/4)   0   4/4   2-3+(20-80％)
评分是基于在0-3+尺度评价的，其中0＝无染色和微量的、小于1+但大于0的染色。级别1+到3+代表染色强度增加，其中3+为最强。
表3B：VB1-204的高密度肿瘤组织微阵列染色
  组织   膜染色   得分范围
  肝   1/9   1-2+(50％)
  结肠   4/8   1+(10％)
  肺   2/9   1+(10％)
  胰腺   1/6   1+(40％)
  肾   1/8   1+(10％)
  乳腺   0/9   0
  皮肤   0/9   0
  卵巢   0/9   0
  头颈**   0/8   0
  ***   0/9   0
得分在0-3+尺度上评价，0＝没有染色和微量的、少于1+但是大于0的染色。1+至3+级表示染色强度增加，3+为强的黑棕色染色。头和颈癌包括气管、喉、扁桃体、喉管、软腭、舌、口和唇的癌症。括号内的值指在所得分范围内染色细胞的最高百分数
表4：对应于IKKβ2(TRIP-9)和变体的肽以及各自的计算的质量
Figure BPA00001186582800771
Figure BPA00001186582800781
Figure IPA00001186583000011
Figure IPA00001186583000021
Figure IPA00001186583000031
Figure IPA00001186583000041
Figure IPA00001186583000051
Figure IPA00001186583000061
Figure IPA00001186583000071
Figure IPA00001186583000081
Figure IPA00001186583000091
Figure IPA00001186583000101
Figure IPA00001186583000111
Figure IPA00001186583000121
Figure IPA00001186583000131
Figure IPA00001186583000141
Figure IPA00001186583000161
Figure IPA00001186583000171
Figure IPA00001186583000181
Figure IPA00001186583000191
Figure IPA00001186583000211
Figure IPA00001186583000221
Figure IPA00001186583000231
Figure IPA00001186583000241
Figure IPA00001186583000251
Figure IPA00001186583000261
Figure IPA00001186583000281
Figure IPA00001186583000291
Figure IPA00001186583000311
Figure IPA00001186583000321
Figure IPA00001186583000331
Figure IPA00001186583000341
Figure IPA00001186583000351
Figure IPA00001186583000361
Figure IPA00001186583000371
Figure IPA00001186583000391
Figure IPA00001186583000401
Figure IPA00001186583000411
Figure IPA00001186583000431
Figure IPA00001186583000441
Figure IPA00001186583000451

Claims (57)

1.分离的互补决定区(CDR)，其选自下组：
包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的分离的轻链CDR 1或其变体；
包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的分离的轻链CDR 2或其变体；
包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的分离的轻链CDR 3或其变体；
包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的分离的重链CDR 1或其变体；
包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的分离的重链CDR 2或其变体；和
包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的分离的重链CDR 3或其变体；
2.编码权利要求1的互补决定区的分离的核酸序列，或其变体。
3.分离的可变区，其选自下组：
包含SEQ ID NO：8，9和/或10限定的轻链互补决定区的分离的轻链可变区，或其变体；和
包含SEQ ID NO：5，6和/或7限定的重链互补决定区的分离的重链可变区，或其变体。
4.权利要求3的可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或其变体。
5.权利要求3的可变区，其中所述分离的重链可变区包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列，或其变体。
6.编码权利要求3-5任一项的可变区的分离的核酸序列，或其变体。
7.根据权利要求6的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO：3的序列。
8.根据权利要求6的分离的核酸序列，其包含SEQ ID NO：1的序列。
9.结合蛋白，其包含SEQ ID NO：8，9和/或10限定的轻链互补决定区，或其变体。
10.结合蛋白，其包含SEQ ID NO：5，6和/或7限定的重链互补决定区，或其变体。
11.结合蛋白，其包含包括由SEQ ID NO：8，9和/或10限定的氨基酸序列的轻链互补决定区和/或包括由SEQ ID NO：5，6和/或7限定的氨基酸序列的重链互补决定区，或其变体。
12.权利要求9-11任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白结合包含SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质。
13.根据权利要求12的结合蛋白，其中所述蛋白质是跨膜蛋白并且所述结合蛋白对所述蛋白质的胞外结构域是特异的。
14.能够结合癌细胞上抗原的结合蛋白，其中所述结合蛋白可以通过竞争结合分析被鉴定，其中所述竞争结合分析包括：
(1)将固定数目的癌细胞与最小浓度的对固定数目的癌细胞产生最大结合的根据权利要求23-33任一项的结合蛋白(Ab1)温育，并测定Ab1的中位荧光(MFAb1)；
(2)将测试结合蛋白(Ab2)加到Ab1和癌细胞中，检测两种或以上浓度的Ab2，并测定中位荧光(MF(Ab1+Ab2))；
(3)测定背景中位荧光(MFbgd)；
(4)计算PI，其中
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MFBgd)/(MFAb1-MFBgd)]x100；和
(5)比较所述PI和对照PI值；
其中，与对照PI值统计学显著不同的PI表明了所述测试结合蛋白能够结合癌细胞上包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质。
15.权利要求9-14任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体。
16.权利要求15的结合蛋白，其中所述抗体是抗体片段。
17.权利要求16的结合蛋白，其中所述抗体片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、二抗体，或其多聚体或双特异的抗体片段。
18.分离的核酸序列，其编码根据权利要求9-17任一项的结合蛋白。
19.组合物，其包含根据权利要求9-17任一项的结合蛋白和药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。
20.免疫偶联物，其包含(1)结合癌细胞上抗原的根据权利要求9-17任一项的结合蛋白，所述结合蛋白附着到(2)癌症治疗剂，所述癌症治序剂是细胞毒性的、细胞抑制性的或以另外的方式阻止或降低癌细胞***和/或转移的能力。
21.权利要求20的免疫偶联物，其中所述癌症治疗剂是细胞毒素。
22.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是核糖体失活多肽。
23.根据权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素选自下组：白树毒蛋白、bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A或其变体。
24.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是修饰的bouganin或其变体。
25.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是由氨基酸252-608组成的截短形式的假单胞菌外毒素A或其变体。
26.根据权利要求20-25任一项的免疫偶联物，其中所述免疫毒素被癌细胞内化。
27.根据权利要求20的免疫偶联物，其包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。
28.编码根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物的分离的核酸序列。
29.根据权利要求28的分离的核酸序列，其包括SEQ ID NO：66的核酸序列。
30.组合物，其包含根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物以及药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。
31.有效量的根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物在治疗或预防癌症中的用途。
32.根据权利要求31的用途，其还包含一种或多种另外的癌症治疗剂在同时、分开或依次治疗或预防癌症的用途。
33.治疗或预防癌症的试剂盒，其包含有效量的权利要求20-27任一项的免疫偶联物和其治疗或预防癌症的使用指南。
34.检测或监测受试者中癌症的方法，其包括步骤：
(1)将取自所述受试者的测试样品与特异性结合癌细胞上抗原的权利要求9-17的结合蛋白的任一个接触，产生结合蛋白-抗原复合物；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；和
(3)比较测试样品和对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
35.诊断癌症的试剂盒，其包含结合癌细胞上抗原的权利要求9-17的结合蛋白的任一个和其使用指示。
36.诊断试剂，其包含(1)结合癌细胞上抗原的根据权利要求9-17任一项的结合蛋白，所述结合蛋白附着到(2)直接或间接产生可检测信号的标记。
37.权利要求36的诊断试剂，其中所述标记是放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶、显像剂或金属离子。
38.试剂盒，其包含权利要求36或37的诊断试剂和其使用指示。
39.重组表载体，其包含权利要求2、6、7、8、18、28或29任一项的核酸分子。
40.宿主细胞，其包含权利要求39的重组表达载体。
41.分离的蛋白质，其包含SEQ ID NO：30、32、36、53或54的氨基酸序列，或其变体。
42.权利要求41的分离的蛋白质，由SEQ ID NO：30的氨基酸序列或其变体组成。
43.包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的分离的蛋白质，其中选自第26、27、31、34、39、106、111和112位的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代或化学修饰。
44.权利要求43的分离的蛋白质，其中所述取代是以下的一个或多个：P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、E106V、E111V和/或K112A。
45.分离的核酸序列，其编码权利要求41-44任一项的分离的蛋白质。
46.重组表达载体，其包含权利要求45的核酸序列。
47.检测或监测受试者中癌症的方法，其包括检测样品中细胞上的权利要求41-46任一项的分离的蛋白质，其中如果在细胞上检测到所述分离的蛋白质，表明患有癌症。
48.检测或监测受试者癌症的方法，其包括检测样品中细胞的权利要求41-46任一项分离的蛋白质的RNA表达，其中如果检测到分离的蛋白质，则表明患有癌症。
49.药物组合物，其包含有效量的权利要求41-46任一项分离的蛋白质或其片段和与其混合的合适的稀释剂或载体。
50.权利要求49的药物组合物，还包含佐剂。
51.药物组合物，其包含有效量的权利要求45的分离的核酸序列或权利要求46的表达载体和与其混合的合适的稀释剂或载体。
52.权利要求51的药物组合物，还包含佐剂。
53.权利要求41-44任一项的分离的蛋白质或其片段在治疗或预防癌症的用途。
54.权利要求41-44任一项的分离的蛋白质或其片段在制造引发受试者免疫反应的药物中的用途。
55.根据权利要求45的分离的核酸序列或根据权利要求46的重组表达载体在治疗或预防癌症的用途。
56.根据权利要求45的分离的核酸序列或根据权利要求46的重组表达载体在引发受试者免疫反应的用途。
57.鉴定化合物预防或治疗癌症的能力的方法，包含步骤：
(a)将在细胞表面上表达权利要求41-44任一项的分离的蛋白质的细胞与测试化合物接触；和
(b)检测所述分离的蛋白质的表达或功能；
(c)将所述分离的蛋白质的表达和功能与对照比较，其中所述分离的蛋白质的表达或能比对照减少，则表明化合物能够用于预防或治疗癌症。
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WO (1) WO2009067800A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108602873A (zh) * 2016-02-02 2018-09-28 洛桑联邦理工学院 工程化抗原呈递细胞及其用途

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8765817B1 (en) 2008-12-03 2014-07-01 Arrowhead Center, Inc. Selective inhibitors of EG5 motors and methods of use
US8349899B1 (en) 2008-12-03 2013-01-08 Arrowhead Center, Inc. Selective inhibitors of EG5 motors and methods of use
KR101834890B1 (ko) 2009-10-23 2018-04-20 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 항­ｇｃｃ 항체 분자와 관련 조성물 및 방법
WO2013109185A1 (en) * 2012-01-19 2013-07-25 Vilara Ab Novel antibodies
CN107266574A (zh) 2012-03-30 2017-10-20 拜尔健康护理有限责任公司 蛋白酶调节的抗体
CN114456272A (zh) 2015-04-03 2022-05-10 优瑞科生物技术公司 靶向afp肽/mhc复合体的构建体及其用途
WO2016187571A2 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Viventia Bio Inc. Her2 immunotoxins and methods of using the same
WO2017024070A1 (en) * 2015-08-03 2017-02-09 Field Water Testing, Llc Apparatus, system, and method for water contaminant testing
KR20190006495A (ko) 2016-04-15 2019-01-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
KR102536850B1 (ko) 2016-04-15 2023-05-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Icos 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
WO2018022946A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3493855A4 (en) * 2016-08-02 2020-04-01 ISI Life Sciences, Inc. METHOD FOR DETECTION OF CANCER CELLS.
TW201831517A (zh) 2017-01-12 2018-09-01 美商優瑞科生物技術公司 靶向組織蛋白h3肽/mhc複合體之構築體及其用途
KR20240039221A (ko) 2017-03-16 2024-03-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Pd-l1 리간드 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
WO2018170023A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3054068A1 (en) 2017-03-16 2018-09-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3615574A4 (en) 2017-04-26 2021-02-24 Eureka Therapeutics, Inc. CONSTRUCTIONS SPECIFICALLY RECOGNIZING GLYPICANE 3 AND USES OF SUCH LATEST
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
KR20230020022A (ko) 2017-10-10 2023-02-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
MA50404A (fr) 2017-10-18 2020-08-26 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de ligand de icos variant, compositions et méthodes associées
US20210363219A1 (en) 2018-06-15 2021-11-25 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN112469440A (zh) 2018-06-18 2021-03-09 优瑞科生物技术公司 靶向***特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途
US20210268070A1 (en) * 2018-07-10 2021-09-02 Rush University Medical Center Use of Immunomodulators to Control Infection and Stimulate Healing in Normal and Diabetic Wounds
US20210340273A1 (en) 2018-10-11 2021-11-04 Inhlbrx, inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CA3115285A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TW202028245A (zh) 2018-10-11 2020-08-01 美商英伊布里克斯公司 Dll3單域抗體及其治療性組合物
JP2022512684A (ja) 2018-10-11 2022-02-07 インヒブルクス インコーポレイテッド Ｂ７ｈ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
AU2021213177A1 (en) 2020-01-29 2022-08-18 Inhibrx Biosciences, Inc. CD28 single domain antibodies and multivalent and multispecific constructs thereof
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2023230488A1 (en) 2022-05-23 2023-11-30 Cereius, Inc. Her2-binding agents and uses thereof
WO2024151515A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-tnfr2 antigen-binding proteins and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012497A2 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the nfkbib gene
AU2003298261A1 (en) * 2002-09-26 2004-05-04 Cellzome Ag Protein complexes of the tumor-necrosis-factor-alpha (tnf-alpha) signalling pathway
KR20050106459A (ko) * 2003-02-28 2005-11-09 미쯔비시 웰 파마 가부시키가이샤 단일클론 항체, 이를 코딩하는 유전자, 하이브리도마, 의약조성물 및 진단 시약
US8945753B2 (en) * 2005-01-26 2015-02-03 Medtronic, Inc. Implantable battery having thermal shutdown separator
EP1851245B1 (en) * 2005-01-26 2012-10-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
WO2007101202A1 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Research Development Foundation Cell-targeted ikb and methods for the use thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108602873A (zh) * 2016-02-02 2018-09-28 洛桑联邦理工学院 工程化抗原呈递细胞及其用途
US11591407B2 (en) 2016-02-02 2023-02-28 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Eppfl) Engineered antigen presenting cells and uses thereof

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