JP2012157293A - 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の増幅構造を制御し、高発現させる方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、哺乳動物細胞において目的遺伝子を発現させる方法であって、プロモーターに制御可能に連結された目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、且つ両末端が非パリンドローム突出末端となっている直鎖状のポリヌクレオチドを複数個連結することによって直列反復配列を作製する連結工程;当該連結工程によって得られた直列反復配列を哺乳動物細胞へ導入する遺伝子導入工程;当該遺伝子導入工程によって得られた形質転換細胞において目的遺伝子を発現させる発現工程を含む。
【選択図】図1
Description
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子(以下、適宜「目的遺伝子」という)の細胞内コピー数を1万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はIR/MARベクターに対して同一の遺伝子構築物(シス)として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物(トランス)として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した。
哺乳動物細胞において目的遺伝子を発現させる方法であって、
プロモーターに制御可能に連結された目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、且つ両末端が非パリンドローム突出末端となっている直鎖状のポリヌクレオチドを複数個連結することによって直列反復配列を作製する連結工程;
当該連結工程によって得られた直列反復配列を哺乳動物細胞へ導入する遺伝子導入工程;
当該遺伝子導入工程によって得られた形質転換細胞において目的遺伝子を発現させる発現工程を含むことを特徴としている。
本発明の遺伝子発現方法は、
哺乳動物細胞において目的遺伝子を発現させる方法であって、
プロモーターに制御可能に連結された目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、且つ両末端が非パリンドローム突出末端となっている直鎖状のポリヌクレオチドを複数個連結することによって直列反復配列を作製する連結工程;
当該連結工程によって得られた直列反復配列を哺乳動物細胞へ導入する遺伝子導入工程;
当該遺伝子導入工程によって得られた形質転換細胞において目的遺伝子を発現させる発現工程を含むことを特徴としている。
本発明の遺伝子発現方法に含まれる連結工程は、プロモーターに制御可能に連結された目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、且つ両末端が非パリンドローム突出末端となっている直鎖状のポリヌクレオチドを複数個連結することによって直列反復配列を作製する連結工程である。
本発明の遺伝子発現方法における遺伝子導入工程は、上述の連結工程によって得られた直列反復配列を哺乳動物細胞へ導入する工程である。
本発明の遺伝子発現方法には、上記遺伝子導入工程において直列反復配列が導入された形質転換細胞を選択する選択工程が含まれていてもよい。
本発明の遺伝子発現方法における「発現工程」は、遺伝子導入工程によって得られた形質転換細胞において目的遺伝子を発現させる工程である。かかる発現工程は、例えば、上記選択工程によって既に選択された哺乳動物細胞(すなわち「形質転換細胞」)を培養することによって実施され得る。形質転換細胞を培養する(必要に応じて所定の操作(転写誘導操作等)を行う)ことによって、目的遺伝子を発現させることができる。本発明の遺伝子発現方法によれば、形質転換細胞は直列反復配列が導入されているため、逆位反復配列に起因する目的遺伝子の発現抑制が起こりにくくなる。それゆえ目的タンパク質を大量に生産することができる。
本発明の遺伝子発現方法には、上記発現工程によって生産された目的タンパク質を精製する「精製工程」が含まれていてもよい。
c-Myc抗体タンパク質のL鎖とH鎖の遺伝子発現カセットを挿入したIR/MAR-MycLH ベクター(pΔBM AR1 MCS MycLH (D1):pΔBM AR1 MCSのSwaI部位にMycLH (抗体遺伝子L鎖H鎖発現カセット)をライゲーションで導入後、DHFR IR部分を制限酵素MfeI、KpnI消化で取り出した後、D1 IR部分を In-fusion(クロンテック社製)で導入後、当該ベクターを制限酵素BsmIで切断することによって、当該ベクターに非パリンドローム型制限酵素Rsr IIの認識配列(CG/GWCCG)を含むリンカーDNAを挿入し、pΔBM AR1 MCS MycLH (D1) Rsr IIプラスミドを構築した(図2を参照のこと)。
11、22 遺伝子増幅構造
21 直列反復配列
Claims (7)
- 哺乳動物細胞において目的遺伝子を発現させる方法であって、
プロモーターに制御可能に連結された目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含み、且つ両末端が非パリンドローム突出末端となっている直鎖状のポリヌクレオチドを複数個連結することによって直列反復配列を作製する連結工程;
当該連結工程によって得られた直列反復配列を哺乳動物細胞へ導入する遺伝子導入工程;
当該遺伝子導入工程によって得られた形質転換細胞において目的遺伝子を発現させる発現工程を含むことを特徴とする遺伝子発現方法。 - 上記直鎖状のポリヌクレオチドは、遺伝子発現カセット、および当該遺伝子発現カセットの領域外に非パリンドローム型制限酵素認識配列を含む環状ポリヌクレオチドを、当該非パリンドローム型制限酵素認識配列を認識して切断する非パリンドローム型制限酵素で消化して得られたものである、請求項1に記載の遺伝子発現方法。
- 上記環状ポリヌクレオチドは、遺伝子発現カセットを含む環状ポリヌクレオチドに対して、遺伝子発現カセットの領域外に非パリンドローム型制限酵素認識配列が1つ含まれるように非パリンドローム型制限酵素認識配列が導入されてなる、請求項2に記載の遺伝子発現方法。
- 上記直鎖状のポリヌクレオチドは、さらに選択マーカー遺伝子を含み、
上記遺伝子導入工程の後に形質転換細胞を選択する選択工程を含む、請求項1ないし3にいずれか1項に記載の遺伝子発現方法。 - 上記直鎖状のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域とをさらに含む、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の遺伝子発現方法。
- 上記哺乳動物複製開始領域は、c−myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座のいずれか1つに由来する、請求項5に記載の遺伝子発現方法。
- 上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座のいずれか1つに由来する、請求項5または6に記載の遺伝子発現方法。
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