WO2004072649A1 - スーパーオキシドアニオン分析用試薬 - Google Patents

スーパーオキシドアニオン分析用試薬 Download PDF

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WO2004072649A1
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Katsunori Teranishi
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Mie Tlo Co.Ltd
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0012—Cyclodextrin [CD], e.g. cycle with 6 units (alpha), with 7 units (beta) and with 8 units (gamma), large-ring cyclodextrin or cycloamylose with 9 units or more; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to the analysis of superoxide aeon. More specifically, the present invention provides a compound in which a luminescent reagent (for example, a fluorescein molecule and an imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule) is covalently bonded to a cyclodextrin molecule as an active ingredient.
  • a luminescent reagent for example, a fluorescein molecule and an imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule
  • the present invention relates to a reagent for the analysis of superoxide-one, which is contained as a product, a method for producing the same, and a method for analyzing superoxide-one using the same. Background technology>
  • Superoxide anion is a type of active oxygen and has physiological activities such as detoxification in vivo.
  • excessive superoxide aion destroys normal parts, leading to cancer and aging.
  • the analysis of superoxide anion having such a function in a living body is important, and a colorimetric method, a fluorescent method, and an ESR method have been used so far. However, these methods are not preferable because they have low sensitivity and destroy and analyze the analyte.
  • the luminescence method that has been developed recently has good sensitivity and can analyze a subject nondestructively.
  • Luminescent reagents used for the luminescence method include 2-methyl-6-phenylimidazo [1,2-a] pyrazine-3 (7H) 'one (CLA: compound A below), 2-methyl-6- ( 4-Methoxyphenyl) imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one (MCLA: Compound B below), 3,7-dihydro-6- [4- [2- [N '(5- Fluoresceinyl) thioperido] -ethoxy] phenyl] -2-methylimidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one (FCLA: compound C in the figure below) is known (for example, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). Z Tokyo Chemical Sales Co., Ltd.). NH ⁇ NH
  • the maximum emission wavelength of CLA is about 380-410 nm, and the maximum emission wavelength of MCLA is about
  • FCLA sporadic anion analysis of a living body
  • FCLA that emits light in the long wavelength region
  • CLA CLA
  • MCLA MCLA
  • FCLA MCLA has the highest luminescence intensity, and higher luminescence intensity is desirable in living body superoxide ion analysis, so MCLA is better in terms of luminescence intensity. It is said. Therefore, with MCLA
  • a luminescence analysis reagent that combines the good properties of both FCLA compounds, that is, has a high luminescence intensity and a luminescence wavelength in a long wavelength region. More preferably, a luminescent reagent having a higher luminescence intensity than MCLA and FCLA and exhibiting luminescence in a further longer wavelength region (for example, orange or red luminescence) is desired.
  • the luminescence of CLA, MCLA, and FCLA is susceptible to components such as proteins, lipids, and sugar chains in the living body.
  • CLA, MCLA, and FCLA have low water solubility, making it difficult to inject them into the analyte system.In addition, they are easily adsorbed on the cell surface, etc. There's a problem.
  • the present invention has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to solve the problems of the conventional technology, to provide high detection sensitivity, to emit light in a long wavelength region, to express proteins, lipids, and sugar chains. And a method for producing superoxide ion for detecting superoxide ion having characteristics such as a reduction in the effect of light emission by components such as luminescence, an improvement in water solubility, and a high accuracy of analysis. Super oxide door using it It is to provide a two-on analysis method. Disclosure of the invention>
  • the first invention is directed to compounds (13) and (14) shown in FIG. 1 (where M is 5 to 14).
  • integer integer, n represents 0 to (M-1), 1 ⁇ ⁇ 11 3, and R 5 ⁇ 13 is, H or a C 2 0 of Aruki group, Arukeeru group, an alkynyl group, Hue - Le group , Hydroxy, alkylhydroxyl, benzyl, aryl, halogen, nitro, cyano, snolephoninole, lipinole, amino, naphthyl, indolinole, X and Y are integers from 0 to 20; R 4 is a phenyl ring with 0 to 4 degrees of substitution) as active ingredients. is there.
  • This compound contains both a molecule that reacts with superoxide and a molecule that receives the energy generated by it and emits light in one cyclodextrin
  • Cyclodextrin is a non-reducing cyclic oligosaccharide in which D-dalcoviranose is ⁇ 1-> 4 linked, and is composed of 6 molecules, 7 molecules, and 8 molecules of dalcoviranose. It is called ⁇ -, /-cyclodextrin.
  • cyclodextrin of the present invention in addition to these Q; to ⁇ -cyclodextrin, cyclic oligosaccharide having 9 to 15 molecules of dalcopyranose bonded thereto can be used. Is 6 to 8 molecules of ⁇ -, ⁇ -, ⁇ -cyclodextrin, and more preferably ⁇ -cyclodextrin.
  • the second invention comprises, as an active ingredient, at least a compound in which a fluorescein molecule and an imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bonded to a cyclodextrin molecule.
  • a reagent for the analysis of superoxide anion characterized by the formulas (15) and (16) in FIG. 2 (where M is 5 Is an integer from 0 to 7, and n is an integer from 0 to (M-1)).
  • M is 5 Is an integer from 0 to 7
  • n is an integer from 0 to (M-1)
  • a cyclodextrin molecule represented by a fluorescein molecule, a diazomidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule Preferably, the compounds are covalently bonded together.
  • M 7 that is, a compound in which a fluorescein molecule and an imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bonded to a y-cyclodextrin molecule is preferably used as an active ingredient.
  • This is a reagent for analysis of superoxide aeon.
  • the third invention relates to compounds (15) and (16) in which a fluorescein molecule and a midazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bonded to a cyclodextrin molecule. ) Is provided.
  • a fourth invention provides a method for analyzing superoxide eon, which comprises measuring the luminescence intensity after bringing the reagent for analyzing superoxide eon into contact with a sample solution.
  • the reagent for a superoxide ion analysis for easily and accurately analyzing superoxide ion, the manufacturing method thereof, and the analysis method are provided.
  • the reagent for analyzing superoxide anion of the present invention is water-soluble and exhibits high luminescence intensity upon reacting with superoxide union.
  • the maximum emission wavelength is about 530 nm, the effect of other components is small, and efficient analysis of superoxide ion is possible.
  • FIG. 1 is a chemical structural formula showing compounds (13) and (14) according to the present invention.
  • FIG. 2 is a chemical structural formula showing compounds (15) and (16) according to the present invention.
  • cyclodextrin molecules react with superoxide adione (for example, imidazo [1,2-a] virazine-3 (7 H) -one molecule or a derivative thereof) and a compound that covalently binds to a molecule that emits light by receiving energy from the substance (for example, a fluorescein molecule or a derivative thereof) can be used as a luminescent agent to provide superoxygen in a sample.
  • superoxide adione for example, imidazo [1,2-a] virazine-3 (7 H) -one molecule or a derivative thereof
  • a compound that covalently binds to a molecule that emits light by receiving energy from the substance for example, a fluorescein molecule or a derivative thereof
  • the present inventors have found that door-on can be detected, and have arrived at the present invention.
  • the reagent for analysis of superoxide aion of the present invention contains at least a compound in which an imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule and a fluorescein molecule are covalently bound to a cyclodextrin molecule. It is characterized by the following.
  • an imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule and a fluorescein molecule are covalently bonded to the cyclodextrin molecule used in the reagent for analyzing superoxide ionone of the present invention.
  • Preferred examples of the compound include those of the formulas (1) and (2) in FIG.
  • the reagent for analysis of superoxide ion of the present invention is water-soluble, reacts with superoxide ion, emits green light having a maximum emission wavelength of about 530 mn, and shows higher emission intensity than MCLA and FCLA. (Approximately 100 times the emission intensity of FCLA), and is less susceptible to biological components such as proteins and lipids, and is therefore preferred as an active ingredient.
  • a fluorescein molecule and an imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bonded to a cyclodextrin molecule used as an active ingredient of a reagent for analyzing superoxide-one.
  • the compounds are as described above and provide a method for their preparation. For example, there is the following method shown in FIG. Known methods (for example, JP-A-10-77303, Biosci. Biotech.Biochem., 1998 62, 1249-1252) Monomannoepoxy- ⁇ -cyclodextrin ull. Chem. Soc.
  • 6-O-nitrobenzenesulfoninole- ⁇ -cyclodextrin (3 and 4 ) Is reacted with sodium azide in DMF to introduce the azide group at the 6-position to synthesize new compounds (5) and (6), and then reduce the azide group by catalytic hydrogenation to obtain the new compound (7) And a mixture of compound (8) Next, the mixture of compound (7) and compound (8) is reacted with fluorescein isothiocyanate to obtain a mixture of novel compound (9) and compound (10).
  • the reagent for analyzing superoxide eon of the present invention is characterized in that the fluorescein molecule and the imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bonded to the cyclodextrin molecule as described above.
  • Other substances for example, a solvent, a buffer, a stabilizer, a surfactant, and the like may be contained as long as the compound as an active ingredient is used.
  • the present invention also provides a method for detecting superoxide ion using the above-mentioned reagent for analyzing superoxide adion. That is, the reagent for analysis of superoxide aeon of the present invention is added to a sample solution, mixed and the like, and contacted. Then, the intensity of light emitted by the compound in which imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule and fluorescein molecule are covalently bonded to the cyclodextrin molecule is measured, thereby obtaining a superoxido. This makes it possible to analyze dione easily.
  • the analysis conditions such as the amount of the superoxide union analysis reagent to be added are not particularly limited. More specifically, the concentration of the Superoxide-On analysis reagent may be such that it does not affect the analysis system.
  • the superoxide ion analysis may be performed in a temperature range that does not affect the subject. For example, when a living body is generally used as a subject and analysis is performed in an aqueous solution, a temperature range of about 10 to 40 ° C. is preferably exemplified.
  • the cyclodextrin molecule which is the active ingredient of the reagent for analysis of superoxide-one used in the method for analyzing superoxide-one of the present invention, includes a fluorescein molecule and imidazo [1,2-a] pyrazine-3 (7H).
  • the compound in which the -one molecule is covalently bonded is soluble in water, so that it can be dissolved in blood, serum, or cell culture, and does not affect the luminescence reaction even in the presence of proteins, lipids, and sugars.
  • the emission wavelength is about 530 nm at the maximum, so that the influence of other components is small. Furthermore, the emission intensity is much higher than CLA, MCLA, FCLA.
  • KC1 (manufactured by Nakarai Tester Co., Ltd.) (0.2M), EDTA (manufactured by SIGMA) (0.1 ⁇ ),
  • hypoxanthine manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a buffered aqueous solution pH 7.2, 0.5 ml
  • MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
  • hypoxanthine aqueous solution 0.3 mM, 0.5 ml
  • mixed aqueous solution of compound (1) and compound (2) (2.5xlO ' 5 M, 40 ⁇ 1) and an aqueous solution of xanthine oxidase (0.37 unit / ml, 40 ⁇ ) were added, and the luminescence intensity was measured using an AR-carloluminescence reader BL201.
  • MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
  • the luminescence showed the highest intensity immediately after the addition of the aqueous xanthine oxidase solution.
  • Table 1 shows the results of the obtained relative luminescence intensities.
  • Table 1 Relative luminescence intensity From the above Examples 13 to 13, the mixture of the compounds (1) and (2) in which the fluorescein molecule and the imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are covalently bound to the cyclodextrin molecule is It was found that the luminescence intensity was higher than that of MCLA and FCLA.
  • CTAB has the effect of enhancing the emission intensity of MCLA and FCLA, but a compound in which a cyclodextrin molecule and a fluorescein molecule and an imidazo [l, 2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule are both covalently bonded. It was confirmed that the mixture of (1) and (2) was not significantly affected by CTAB.
  • BSA also has the effect of increasing or decreasing the emission intensity of MCLA and FCLA, but a compound in which a cyclodextrin molecule is covalently bound to a fluorescein molecule, an imidazo [1,2-a] pyrazin-3 (7H) -one molecule. It was confirmed that the effect of BSA was small for the mixture of the products (1) and (2).
  • Monomannoepoxy-y-cyclodextrin (0.500 g, 0.00039 lmol) is dried in pyridin (10.0 ml), and 723-nitrobenzene snorehoninolechloride (0.130 g, 0.000586 mol) is added. The mixture was stirred at -20 ° C for 30 minutes.

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Abstract

　従来技術の問題点を解消し、高い検出感度、長波長領域での発光、タンパク質・脂質や糖鎖等の成分による発光に対する影響の低減化、水溶性の向上、高い精度での分析等の特性を有するスーパーオキシドアニオンを検出するためのスーパーオキシドアニオン分析用試薬とその製造法およびそれを用いたスーパーオキシドアニオンの分析方法を提供することを目的とする。シクロデキストリン分子にフルオレセイン分子およびイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3（７H）-オン分子が共に共有結合した化合物によって、上記目的を達成することができる。

Description

明 細 書
スーパーォキシドア二オン分析用試薬
ぐ技術分野 >
本発明は、 スーパーォキシドアユオンの分析に関するものである。 さらに詳し くは、 本発明は、 シクロデキストリン分子に、 発光試薬 （例えば、 フルォレセィ ン分子およびィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子) が共に共有結合した 化合物を有効成分として含有するスーパーォキシドア-オン分析用試薬とその製 造法およびそれを用いたスーパーォキシドア二オンの分析方法に関するものであ る。 ぐ背景技術 >
スーパーォキシドア二オンは活性酸素の一種であり、 生体での解毒活性をはじ めとする生理活性作用を有している。 —方、 過剰なスーパーォキシドアユオンは 正常な部位を破壊するため、 癌化や老化を招く。 このような機能を持つスーパー ォキシドア二オンの生体での分析は重要であり、これまでに比色法、蛍光法、 ESR 法が用いられてきた。 しかし、 これらの方法は、 感度が低いことに加え、 被検体 を破壊して分析するため好ましい分析法とはいえない。 これに対し、 近年になつ て開発されてきた発光法は、 感度がよく、 かつ被検体を非破壊的に分析すること ができる。
発光法に用いられる発光試薬としては、 2-メチル -6-フエ二ルイミダゾ [1,2-a]ピ ラジン- 3 (7H) 'オン (CLA：下図化合物 A)、 2-メチル -6- (4-メ トキシフエニル) イミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン （MCLA：下図化合物 B)、 3,7-ジヒ ドロ -6-[4-[2-[N'(5-フルォレセィニル）チォゥレイ ド] -ェトキシ]フエ-ル] -2-メチルイ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン（FCLA：下図化合物 C) が知られている （例 えば東京化成工業株式会社 Z東京化成販売株式会社)。
Figure imgf000004_0001
NH丫 NH
(A) (B) a (C)
CLA の最大発光波長は約 380-410 nm であり、 MCLA の最大発光波長は約
420-460 nmであり、 FCLAの最大発光波長は約 520-540 nmである。 生体のス 一パーォキシドア二オン分析では他の成分の影響が少ない方が望ましいことから、 より長波長域での発光が望まれる。 このため、 長波長域の発光を示す FCLAがよ レヽとされる。 また、 CLA、 MCLA, および: FCLAのうち、 発光強度は MCLAが もっとも強く、 生体のスーパーォキシドア二オン分析では発光強度が高い方が望 ましいことから、 発光強度の点では MCLAがよいとされる。 従って、 MCLAと
FCLAの両化合物の良い特性を兼ね備えた、 すなわち、 高い発光強度を有し、 か つ発光波長が長波長領域であるという特性を有した発光分析試薬の創製が望まれ る。 更に好ましくは、 MCLAおよび FCLAよりも発光強度が高く、 しかも、 さら なる長波長領域 （例えば、 オレンジ色や赤色の発光） での発光を示す発光試薬が 望まれる。 また、 CLA、 MCLA, FCLAの発光は、 生体中のタンパク質、 脂質や 糖鎖等の成分による影響を受けやすいため、 スーパーォキシドアユオンの分析精 度が低いと言う問題がある。 また、 CLA、 MCLA, FCLAは水溶性が低いために、 被検体系への注入が困難であり、 加えて細胞表面等への吸着が生じ易く有効に作 用できずに発光性能が低下するという問題がある。
本発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 従 来技術の問題点を解消し、 高い検出感度、 長波長領域での発光、 タンパク質 .脂 質や糖鎖等の成分による発光に対する影響の低減化、 水溶性の向上、 高い精度で の分析等の特性を有するスーパーォキシドア二オンを検出するためのスーパーォ キシドア二オン分析用試薬とその製造法およびそれを用いたスーパーォキシドア 二オンの分析方法を提供することである。 く発明の開示〉
本発明者は、 鋭意研究の結果、 上記の課題を解決するものとして、 第一の発明 は、 第 1図に示す化合物 （ 1 3 ) 及び （1 4 ) (伹し、 M は 5〜1 4の整数、 n は 0〜 （M—1) の整数、 1^〜113、 及び R5〜！ 13は、 Hまたは 一 C 2 0のァルキ ル基、 ァルケエル基、 アルキニル基、 フエ-ル基、 ヒ ドロキシル基、 アルキルヒ ドロキシル基、 ベンジル基、 ァリール基、 ハロゲン基、 ニトロ基、 シァノ基、 ス ノレホニノレ基、 力ルポ二ノレ基、 アミノ基、 ナフチル基、 インドリノレ基のうちの一つ であり、 Xおよび Yは、 0— 20の整数、 R4は、 0— 4個の置換度によるフエニル 環である） を有効成分として含有することを特徴とするスーパーォキシドアェォ ン分析用試薬である。 この化合物は、 一つのシクロデキス トリン分子内に、 スー パーォキシドと反応する分子と、 そこで生じたエネルギーを受け取って発光する 分子との両分子を含むものであり、 スーパーォキシドア二オンを良好に分析する ことができる。
なお、 シクロデキス トリンとは、 D—ダルコビラノースが α 1— > 4結合した非 還元性の環状オリゴ糖であり、 ダルコビラノース 6分子、 7分子、 8分子からな るものをそれぞれ α—、 β—、 /—シクロデキス トリンと称する。 本発明のシク ロデキストリンとしては、 これら Q；〜 γ—シクロデキストリンの他に、 ダルコピ ラノースが 9分子〜 1 5分子結合した環状性のォリゴ糖を用いることができるが、 好ましくは、 ダルコビラノースが 6分子〜 8分子の α—、 β—、 γ—シクロデキ ストリンであり、 更に好ましくは γ—シクロデキストリンである。
また、 第二の発明は、 少なく とも、 シクロデキストリン分子にフルォレセイン 分子およびイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合 物を有効成分として含有することを特徴とするスーパーォキシドア二オン分析用 試薬であり、 その化合物は、 第 2図の式 （1 5 ) 及び （1 6 ) (ただし、 M は 5 〜7の整数、 nは 0〜(M— 1)の整数である） で表されるシクロデキストリン分子 にフルォレセィン分子おょぴィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に 共有結合した化合物であることが好ましい。 このうち、 好ましくは、 M=7である とき、 すなわち y—シクロデキストリン分子にフルォレセイン分子およびィミダ ゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を有効成分とし て含有するスーパーォキシドアェオン分析用試薬である。
また、 第三の発明は、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子おょぴィ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 (1 5) 及 び （1 6) の製造方法を提供する。
第四の発明は、 前記のスーパーォキシドアユオン分析用試薬を検体溶液と接触 させた後、 発光強度を測定することを特徴とするスーパーォキシドアェオンの分 析方法を提供する。
本発明によれば、 スーパーォキシドア二オンの分析を簡便かつ精度高く行なう ためのスーパーォキシドアェオン分析用試薬、 及ぴその製造法さらには分析方法 が提供される。 この発明のスーパ一ォキシドア二オン分析用試薬は、 水溶性であ り、 スーパーォキシドアユオンと反応して高い発光強度を示す。 また、 最大発光 波長約 530nmであることから、 他成分の影響が少なく、 効率的なスーパーォキ シドア二オンの分析が可能となる。
<図面の簡単な説明 >
第 1図は、本発明に係る化合物 (1 3)及び（14) を示す化学構造式である。 第 2図は、本発明に係る化合物 （1 5)及び（16) を示す化学構造式である。 また、 第 3図は、 化合物 （1 5) 及び （16) において、 M=7のときの化合物 (1) 及び （2) を製造する手順を説明したものである。
<発明を実施するための最良の形態 > 発明者は、 これまで、シクロデキストリンに MCLAを共有結合させた化合物の 合成やその発光反応について報告している （例えば、 Carbohydr. Rese" 306, 177- 187 (1998). Luminescence, 14, 303-314 (1999). 特開平 10-77286)。
発明者は、 これらの知見をもとに鋭意研究を進めた結果、 シクロデキスト リン 分子にスーパーォキシドア二オンと反応する分子 (例えば、 イミダゾ [1,2-a]ビラ ジン- 3 ( 7 H) -オン分子、 又はその誘導体）、 およびその物質からのエネルギー を受け取って発光する分子 (例えば、 フルォレセイン分子、 又はその誘導体) が 共有結合した化合物を発光剤として用いることにより、 検体中のスーパーォキシ ドア二オンを検出できることを見い出し、 本発明に至ったものである。
本発明のスーパーォキシドアユオン分析用試薬は、 少なくともシクロデキスト リン分子にイミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子およびフルォレセィン分 子が共有結合した化合物を含有することを特徴とするものである。
具体的には、 本発明のスーパーォキシドア二オン分析用試薬に用いられるシク ロデキストリン分子にイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子およびフルォ レセィン分子が共有結合した化合物は、図 1の式（1 )および（2 )のものが好ましく 例示される。
本発明のスーパ一ォキシドア二オン分析用試薬は、 水溶性であり、 スーパーォ キシドアェオンと反応して最大発光波長が約 530mnの緑色の発光を示し、かつ、 MCLAおよび FCLAよりも高い発光強度を示し（FCLAの約 100倍の発光強度）、 さらには、 タンパク質や脂質などの生体成分の影響を受けにくいため、 有効成分 として好ましい。
本発明においてスーパーォキシドア-オン分析用試薬の有効成分として使用さ れるシクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [1,2-a]ピラジ ン -3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合物は、以上のとおりのものであり、 その製造法を提供する。 例えば、 第 3図に示した以下の方法がある。 既知の方法 (例えば、 特開平 10-77303、 Biosci. Biotech. Biochem., 1998 62, 1249- 1252) より合成されるモノ- 2-ひトシル -γ -CD のアル力リ処理により得られた既知物質 モノマンノエポキシ- γ-シクロデキス トリン ull. Chem. Soc. Jpn" 1990, 63, 1409-1414) をピリジン中で ニトロベンゼンスルホユルクロリ ドと反応させ、 6位水酸基に二トロベンゼンスルホ二ル基を結合させた新規化合物 3および 4を 得る。 本化合物には 8個の異性体が存在するがこれら 8個の異性体の分離を行な わず 8個の異性体の混合物すなわち化合物 3および 4の混合物として以後の反応 を進める。 6-O-ニトロベンゼンスルホ二ノレ- γ -シクロデキストリン （3及び 4) を DMF中、 アジ化ナトリゥムと反応させ、 6位にアジド基を導入し新規化合物 (5) および化合物 (6) を合成する。 次に接触水素添加によりアジド基を還元 し新規化合物 （7) および化合物 （8) の混合体を得る。 次に化合物 （7) およ ぴ化合物 (8) の混合体をフルォレセィンィソチオシアナ一トと反応させ、 新規 化合物 (9) および化合物 (1 0) の混合体を得る。 続いて化合物 (9) および 化合物 (1 0) の混合体をアンモニア水と反応させることによりエポキシを開環 し、 3位にアミノ基を導入した新規化合物 (1 1 ) および化合物 (1 2) の混合 体を得る。 続いて化合物 （1 1) および化合物 （1 2) の混合体を MCLA-COOH とアミ ド結合させ、 目的とする新規化合物 (1 ) および化合物 (2) の混合体を 得る。 もちろんこれ以外の方法によって合成されるものであってもよく、 上記例 によって、 限定されるものではない。
さらに、 本発明のスーパーォキシドアェオン分析用試薬は、 以上のとおりのシ' クロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を有効成分とするものであれば、 そ の他の物質、 例えば、 溶剤、 緩衝剤、 安定剤、 界面活性剤などを含有していても よい。
そして、 本発明は、 以上の通りのスーパーォキシドアユオン分析用試薬を用い てスーパーォキシドア二オンを検出する方法をも提供する。 すなわち、 本発明の スーパーォキシドアユオン分析用試薬を検体溶液に添加、 混合するなどして接触 させ、 シクロデキストリン分子にイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子お よびフルォレセィン分子が共有結合した化合物によって発せられる光の強さを測 定することによりスーパーォキシドア二オンを簡便に分析することが可能となる のである。
この時、 添加するスーパーォキシドアユオン分析試薬の量等の分析条件は特に 限定されない。 具体的には、 スーパーォキシドア-オン分析試薬の濃度は、 分析 系に影響を与えない程度であればよい。また、スーパーォキシドア二オン分析は、 被検体に影響を与えない温度範囲で行なえばよい。 例えば、 一般に生体を被検体 とし、 水溶液中で分析を行なう場合には、 約 10-40°Cの温度範囲が好ましく例示 される。
本発明のスーパーォキシドア-オンの分析方法において用いられるスーパーォ キシドア二オン分析試薬の有効成分であるシクロデキストリン分子にフルォレセ ィン分子およびィミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した 化合物は、 水溶性であるため血液や血清、 あるいは細胞培養液等にも溶解できる 上、 タンパク質や脂質、 糖の存在においてもその発光反応に影響を与えない。 ま た、発光波長は、最大波長約 530nmであるため他成分の影響が小さい。 さらに、 発光強度が CLA, MCLA, FCLAに比べて非常に高い。従って、 このようなシク口 デキストリン分子にフルォレセイン分子およびィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合物は、 従来の CLA, MCLA, FCLAなどのスー パーォキシドア二オン分析用試薬に比べ、 高い精度でのスーパーォキシドアニォ ンの分析を可能とする。
以下、 実施例を示し、 この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 もちろん、 本発明は以下の例に限定されるものではなく、 その要旨を変更しない 範囲内で様々な態様で実施することが可能である。 加えて、 本発明の技術的範囲 は、 いわゆる均等の範囲にまで及ぶものである。 <実施例 >
実施例 1
KC1 (ナカライテスタ株式会社製） （0.2M)、 EDTA (SIGMA社製） （0·1ηιΜ)、
3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS、ナカライテスタ株式会社製） （20mM) を含む緩衝水溶液 （pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cでヒポキサンチン （和光純薬工業株式 会社製） 水溶液 （0.3mM、 0.5ml)、 化合物 （1 ) および化合物 （2 ) の混合水溶 液 （2·5χ10·5Μ、 40 /zl) およびキサンチンォキシダーゼ (SIGMA社製) 水溶液 (0.37unit/mlN 40 μ 1) を加え、 ァロカルミネッセンスリーダー BL201 (ァロカ 社製） を用いて発光強度を測定した。 発光はキサンチンォキシダーゼ水溶液の添 加後、 すぐに最高強度を示した。 比較のため化合物 ( 1 ) および （2 ) の混合物 の代わりに MCLA (東京化成工業株式会社製) および FCLA (東京化成工業株式 会社製） を用いて同様にして実験を行なった。 得られた相対発光強度の結果を表 1に示した。 実施例 2
KC1 (0.2M)、 EDTA (0.1ηιΜ)、 3-モルホリ ノプロパンスルホン酸 （MOPS) (20mM) を含む緩衝水溶液 (pH 7.2, 0.5ml)に 25°Cでへキサデシルトリメチル アンモニゥムプロミ ド（CTAB：ナカライテスク株式会社製）水溶液 (0.5%、 50 μ 1)、 ヒポキサンチン水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、 化合物 （1 ) および化合物 ( 2 ) の混合水溶液 （2.5xlO'5M、 40 μ 1) およぴキサンチンォキシダーゼ水溶液 (0.37unit/ml、 40 μΐ) を加え、 ァロカルミネッセンスリーダー BL201 を用い て発光強度を測定した。 発光はキサンチンォキシダーゼ水溶液の添加後、 すぐに 最高強度を示した。 比較のため化合物 （ 1 ) および （2 ) の混合物の代わりに MCLAおよび: FCLAも同様にして実験を行なった。得られた相対発光強度の結果 を表 1に示した。 実施例 3
KC1 (0.2M)、 EDTA (0.1mM)、 アルブミンタンパク質 （BSA：和光純薬工業 株式会社製） （0.1%)、 3-モルホリ ノプロパンスルホン酸 （MOPS) (20mM) を 含む緩衝水溶液 （pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cで、 ヒポキサンチン水溶液 （0.3mM、 0.5ml)、 化合物 （1) および化合物 （2) の混合水溶液 （2.5χ10·5Μ、 40 μ\) お よびキサンチンォキシダーゼ水溶液 （0.37unit/ml、 40^1) を加え、 ァロカルミ ネッセンスリーダー BL201を用いて発光強度を測定した。発光はキサンチンォキ シダーゼ水溶液の添加後、 すぐに最高強度を示した。 比較のため化合物 （1) お よび (2) の混合物の代わりに MCLAおよび FCLAも同様にして実験を行なつ た。 得られた相対発光強度の結果を表 1に示した。 表 1. 相対発光強度
Figure imgf000011_0001
以上の実施例 1一 3より、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子および ィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 ( 1) お よび（ 2 ) の混合物は、 MCLAおよび FCLAよりも高い発光強度を示すことが明 かとなつた。 また、 CTABは、 MCLAや FCLAの発光強度を増強する効果がある が、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [l，2-a]ピラジ ン -3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 (1) および（2) の混合物は、 CTABの影響をあまり受けないことが確認された。また、 BSAは MCLAや FCLA の発光強度を増減する効果があるが、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン 分子おょぴイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合 物 （1) および（2) の混合物は、 BSAの影響が小さいことが確認された。 CTAB 添加実験あるいは BSA添加実験の結果は、 シクロデキストリン分子にフルォレ セイン分子およびイミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 ( 7H) -オン分子が共に共有結合し た化合物 （1 ) および （2) の混合物は、 タンパク質や脂質の影響を受けにくい 発光をする発光試薬であることを示している。 実施例 4
KC1 (0.2M)、 EDTA (O.lmM), 3-モルホリノプロパンスルホン酸 (MOPS) (20mM) を含む緩衝水溶液 （pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cで CTAB水溶液 （0.5%、 50 1)、 ヒポキサンチン水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、化合物（1 )および化合物 ( 2 ) の混合水溶液 （2.5χ10·5Μ、 40 μ ΐ) およびキサンチンォキシダーゼ水溶液 (0.37unit/mls 40 μΐ) を加え、 蛍光分光光度計 FP750DS (日本分光株式会社 製） を用いて発光スぺク トルを測定した (ただし、 励起光は使用しない）。 発光ス ぺクトルは最大発光波長約 530nmを示した。 実施例 5
モノ- 6-ひ二 ト口ベンゼンス /レホニル -2, 3-モノマンノエポキシ γ CD (3 ) お よび （4) の混合物の合成
次に、 化合物 ( 1 ) 及び ( 2 ) の製造方法について説明する。 なお、 下記の説 明において、 化合物番号は、 第 3図中の符号による。
モノマンノエポキシ- y -シクロデキス トリン (0.500g、 0.00039 lmol) をピリジ ン （10.0ml) に溶角旱し、 723-ニ ト ロベンゼンスノレホニノレク ロ リ ド （0.130g、 0.000586mol) を加え- 20°Cで 30分間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODS力 ラムクロマトグラフィー （20xl30mm、 0% MeOH/H2O→20% MeOH/H20) を 行ない、 化合物 （3 ) および （4 ) の混合物 (0.204g) を 35%の収率で得た。 混 合物を 1 H NMR (DMSOD6， 40°C)にて測定したところ、 δ 3.2-3.9 (majority, H of γ-cyclodextrin unit), 4.4-4.5 (2H, m, H-6*), 4.7-5.0 (8H, m, H-l), 8.00 (1H, m, Ar-H), 8.39 (lH, m, Ar-H) and 8.61 (2H, m, Ar-H)の結果を得た。 実施例 6
モノ- 6-アジド -2,3-モノマンノエポキシ γ-CD (5) および （6) の混合物の 合成
化合物 （3) および （4) の混合物 （0.190g、 0.000129mol) を DMF (3.80ml) に溶解し、 アジ化ナトリウム （0.0250g、 0.000384mol) を加え室温で 20時間攪 拌した。 DMFを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー (20xl30mm、 0% MeOH/H20→ 15% MeOH/H20) を行ない、 化合物 (5) および (6) の混合物 (0.165g) を 97%の収率で得た。 混合物を Ή NMR (DMSOD6， 50°C) にて測定し たとこ ό、 δ 3.3-3.8 (majority, H of γ-cycloaextrm unit) and 4.9-5.0 (8H, m, H-l)の結果を得た。 実施例 7
モノ -6-Λ 5-フルォレセィニル）チォゥレイ ド -2, 3-モノマンノエポキシ γ-CD (9) および （10) の混合物の合成
化合物（5)および（ 6 )の混合物 (0.154g、 0.000 llSmol) をメタノール:水 =1:1 (5.00ml) に溶かし、 Pd-C (5wt.% on activated carbon) (O.lOOg) を加え水秦雰 囲気下、 室温で 15 時間攪拌した。 セライ ト及びメンブランフィルターを用いて Pd-Cを濾別し、 粗ァミノ体 (7) および (8) の混合体 (0.172g) を得た。 この 粗ァミノ体 （0.150g、 0.000117mol) をピリ ジン （3.00ml) に溶解し、 FITC (0.0460g, 0.000118mol) を加え室温で 1時間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー （15x70imn、 0% MeOH/H20 (0.1% ΊΤΑを含 む）→30°/。 MeOH/H20 (0.1% TFAを含む)） を行ない、化合物 （9) および （1 0 ) の混合物 (0.12 lg) を 70%の収率で得た。 混合物を Ή NMR (DMSODe, 50°C) にて測定したところ、 δ 3.3-3.9 (majority, H of γ-cyclodextrin unit), 4.9-5.1 (br., H- l), 6.63 (4H, m, Ar-H), 6.75 (2H， s, Ar-H), 7.18 (1H, m, Ar-H), 7.81 (br.， Ar-H) and 8.34 (br., Ar-H)の結果を得た。 実施例 8
モノ - 6-Λ 5-フルォレセィニル）チォゥレイ ド-モノ- 3-デォキシ -3-[[6-(4-メ トキ シフエニル）ィ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3(7 -オン- 2-ィル]プロ ピオニル]ァミ ノ -γ-CD ( 1 )および ( 2 ) の合成
化合物 ( 9 ) および ( 1 0 ) の混合物 (0.110g\ 0.0000659mol) を濃アンモェ ァ水 (2.20ml) に溶解し、 37。Cで 3日間反応させた。 反応液を濃縮し、 粗ァミノ 体 （1 1 ) および ( 1 2 ) の混合体 (0.142g) を得た。 この粗ァミノ体 (0.130g、 0.000077 Imol) ピリ ジン （2.60ml) に溶解し、 既知化合物 MCLA-COOH (Carbohydr. Rese., 1998, 306, 177-187 ) (0.0250g, 0.0000797mol)、 WSC (ナ 力ライテスタ株式会社製） （0.0440g、 0.000229mol) を加えアルゴン雰囲気下、 室温で 4時間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー (20x90mm 0% MeOH/H20 (0.1% TFA を含む）→ 50 % MeOH/H20 (0.1% TFA を含む)） を行なった。 さらに HPLC (COSMOSIL Code No.379-76 Sise 20x250醒 5C- 18-MS Type Waters 流速 6.0ml/min、 30% MeOH/H20 (0.1% TFAを含む）→ 50 % MeOH/H20 (0.1% TFAを含む）（60min》 によつて精製し た。 得られた化合物を少量のメタノールに溶解し、 大量の酢酸ェチルを加えパゥ ダー化させることにより化合物 ( 1 ) および ( 2 ) の混合物 (0.0300g) を 25% の収率で得た。混合物を iH NMR (CD3OD, 20°C) にて測定したところ、 δ 2.7-3.2 (m,
Figure imgf000014_0001
3.3-4.1 (majority, H oi γ-cyclodextrin unit入 4.6-5.1 (m, H-l), 6.6-6.8 (m, Ar-H), 7.08 (m， Ar-H), 7.6-7.8 (m, Ar-H and H of pyrazine) and 7.9-8.2 (m, Ar-H and H of pyrazine) の結果を得た。また、 UV (0.03M phosphate buffer, pH 8.0) にて測定したところ、 Xmax nm (ε)： 492 (48000)の結果を得た。

Claims

0P青 の 囲
Figure imgf000015_0001
(但し、 M は 5 ~ 1 4の整数、 nは 0〜 （M—l ) の整数、 1^〜113、 及び ~Ri3は、 Hまたは 一 C2。のアルキル基、 ァルケ-ル基、 アルキ-ル基、 フエ エル基、 ヒ ドロキシル基、 アルキルヒ ドロキシル基、 ベンジル基、 ァリール基、 ハロゲン基、 ニトロ基、 シァノ基、 スルホュル基、 カルボニル基、 アミノ基、 ナ フチル基、 インドリル基のうちの一つであり、 Xおよび Yは、 0— 20の整数、 R 4は、 0— 4個の置換度によるフエニル環である） を有効成分として含有すること を特徴とするスーパーォキシドアユオン分析用試薬。
2. 少なくとも、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダ ゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を有効成分とし て含有することを特徴とするスーパーォキシドア-オン分析用試薬。
3. 下記の化合物 （1 5) 及び （16) :
Figure imgf000016_0001
(伹し、 M は 5〜 14の整数、 nは 0〜 （M— 1) の整数である） にて示される シクロデキス トリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [l，2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物。
4. シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [1,2-a]ビラ ジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を製造する方法であって、 ① モノマンノエポキシ-シクロデキス トリンの水酸基に-ト口ベンゼンスルホニル 基を結合させ、 ②その結果物である 6-ひエトロベンゼンスルホ-ル-シクロデキ ス トリ ンの 6位にアジド基を導入し、 ③このアジド基を還元し、 ④フルォレセィ ンイソチオシアナートと反応させた後、 ④エポキシを開環し、 3位にアミノ基を 導入し、 ⑤この結果物と MCLA-COOHとをアミ ド結合させ、 目的とする化合物 を得ることを特徴とする製造方法。
5 . 請求項 1〜請求項 3に記載の化合物を検体溶液と接触させた後、 発光強度 を測定することを特徴とするスーパーォキシドア二オンの分析方法。
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