明 細 書
スーパーォキシドア二オン分析用試薬
ぐ技術分野 >
本発明は、 スーパーォキシドアユオンの分析に関するものである。 さらに詳し くは、 本発明は、 シクロデキストリン分子に、 発光試薬 (例えば、 フルォレセィ ン分子およびィミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子) が共に共有結合した 化合物を有効成分として含有するスーパーォキシドア-オン分析用試薬とその製 造法およびそれを用いたスーパーォキシドア二オンの分析方法に関するものであ る。 ぐ背景技術 >
スーパーォキシドア二オンは活性酸素の一種であり、 生体での解毒活性をはじ めとする生理活性作用を有している。 —方、 過剰なスーパーォキシドアユオンは 正常な部位を破壊するため、 癌化や老化を招く。 このような機能を持つスーパー ォキシドア二オンの生体での分析は重要であり、これまでに比色法、蛍光法、 ESR 法が用いられてきた。 しかし、 これらの方法は、 感度が低いことに加え、 被検体 を破壊して分析するため好ましい分析法とはいえない。 これに対し、 近年になつ て開発されてきた発光法は、 感度がよく、 かつ被検体を非破壊的に分析すること ができる。
発光法に用いられる発光試薬としては、 2-メチル -6-フエ二ルイミダゾ [1,2-a]ピ ラジン- 3 (7H) 'オン (CLA:下図化合物 A)、 2-メチル -6- (4-メ トキシフエニル) イミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン (MCLA:下図化合物 B)、 3,7-ジヒ ドロ -6-[4-[2-[N'(5-フルォレセィニル)チォゥレイ ド] -ェトキシ]フエ-ル] -2-メチルイ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン(FCLA:下図化合物 C) が知られている (例 えば東京化成工業株式会社 Z東京化成販売株式会社)。
NH丫 NH
(A) (B) a (C)
CLA の最大発光波長は約 380-410 nm であり、 MCLA の最大発光波長は約
420-460 nmであり、 FCLAの最大発光波長は約 520-540 nmである。 生体のス 一パーォキシドア二オン分析では他の成分の影響が少ない方が望ましいことから、 より長波長域での発光が望まれる。 このため、 長波長域の発光を示す FCLAがよ レヽとされる。 また、 CLA、 MCLA, および: FCLAのうち、 発光強度は MCLAが もっとも強く、 生体のスーパーォキシドア二オン分析では発光強度が高い方が望 ましいことから、 発光強度の点では MCLAがよいとされる。 従って、 MCLAと
FCLAの両化合物の良い特性を兼ね備えた、 すなわち、 高い発光強度を有し、 か つ発光波長が長波長領域であるという特性を有した発光分析試薬の創製が望まれ る。 更に好ましくは、 MCLAおよび FCLAよりも発光強度が高く、 しかも、 さら なる長波長領域 (例えば、 オレンジ色や赤色の発光) での発光を示す発光試薬が 望まれる。 また、 CLA、 MCLA, FCLAの発光は、 生体中のタンパク質、 脂質や 糖鎖等の成分による影響を受けやすいため、 スーパーォキシドアユオンの分析精 度が低いと言う問題がある。 また、 CLA、 MCLA, FCLAは水溶性が低いために、 被検体系への注入が困難であり、 加えて細胞表面等への吸着が生じ易く有効に作 用できずに発光性能が低下するという問題がある。
本発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 従 来技術の問題点を解消し、 高い検出感度、 長波長領域での発光、 タンパク質 .脂 質や糖鎖等の成分による発光に対する影響の低減化、 水溶性の向上、 高い精度で の分析等の特性を有するスーパーォキシドア二オンを検出するためのスーパーォ キシドア二オン分析用試薬とその製造法およびそれを用いたスーパーォキシドア
二オンの分析方法を提供することである。 く発明の開示〉
本発明者は、 鋭意研究の結果、 上記の課題を解決するものとして、 第一の発明 は、 第 1図に示す化合物 ( 1 3 ) 及び (1 4 ) (伹し、 M は 5〜1 4の整数、 n は 0〜 (M—1) の整数、 1^〜113、 及び R5〜! 13は、 Hまたは 一 C 2 0のァルキ ル基、 ァルケエル基、 アルキニル基、 フエ-ル基、 ヒ ドロキシル基、 アルキルヒ ドロキシル基、 ベンジル基、 ァリール基、 ハロゲン基、 ニトロ基、 シァノ基、 ス ノレホニノレ基、 力ルポ二ノレ基、 アミノ基、 ナフチル基、 インドリノレ基のうちの一つ であり、 Xおよび Yは、 0— 20の整数、 R4は、 0— 4個の置換度によるフエニル 環である) を有効成分として含有することを特徴とするスーパーォキシドアェォ ン分析用試薬である。 この化合物は、 一つのシクロデキス トリン分子内に、 スー パーォキシドと反応する分子と、 そこで生じたエネルギーを受け取って発光する 分子との両分子を含むものであり、 スーパーォキシドア二オンを良好に分析する ことができる。
なお、 シクロデキス トリンとは、 D—ダルコビラノースが α 1— > 4結合した非 還元性の環状オリゴ糖であり、 ダルコビラノース 6分子、 7分子、 8分子からな るものをそれぞれ α—、 β—、 /—シクロデキス トリンと称する。 本発明のシク ロデキストリンとしては、 これら Q;〜 γ—シクロデキストリンの他に、 ダルコピ ラノースが 9分子〜 1 5分子結合した環状性のォリゴ糖を用いることができるが、 好ましくは、 ダルコビラノースが 6分子〜 8分子の α—、 β—、 γ—シクロデキ ストリンであり、 更に好ましくは γ—シクロデキストリンである。
また、 第二の発明は、 少なく とも、 シクロデキストリン分子にフルォレセイン 分子およびイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合 物を有効成分として含有することを特徴とするスーパーォキシドア二オン分析用 試薬であり、 その化合物は、 第 2図の式 (1 5 ) 及び (1 6 ) (ただし、 M は 5
〜7の整数、 nは 0〜(M— 1)の整数である) で表されるシクロデキストリン分子 にフルォレセィン分子おょぴィミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に 共有結合した化合物であることが好ましい。 このうち、 好ましくは、 M=7である とき、 すなわち y—シクロデキストリン分子にフルォレセイン分子およびィミダ ゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を有効成分とし て含有するスーパーォキシドアェオン分析用試薬である。
また、 第三の発明は、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子おょぴィ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 (1 5) 及 び (1 6) の製造方法を提供する。
第四の発明は、 前記のスーパーォキシドアユオン分析用試薬を検体溶液と接触 させた後、 発光強度を測定することを特徴とするスーパーォキシドアェオンの分 析方法を提供する。
本発明によれば、 スーパーォキシドア二オンの分析を簡便かつ精度高く行なう ためのスーパーォキシドアェオン分析用試薬、 及ぴその製造法さらには分析方法 が提供される。 この発明のスーパ一ォキシドア二オン分析用試薬は、 水溶性であ り、 スーパーォキシドアユオンと反応して高い発光強度を示す。 また、 最大発光 波長約 530nmであることから、 他成分の影響が少なく、 効率的なスーパーォキ シドア二オンの分析が可能となる。
<図面の簡単な説明 >
第 1図は、本発明に係る化合物 (1 3)及び(14) を示す化学構造式である。 第 2図は、本発明に係る化合物 (1 5)及び(16) を示す化学構造式である。 また、 第 3図は、 化合物 (1 5) 及び (16) において、 M=7のときの化合物 (1) 及び (2) を製造する手順を説明したものである。
<発明を実施するための最良の形態 >
発明者は、 これまで、シクロデキストリンに MCLAを共有結合させた化合物の 合成やその発光反応について報告している (例えば、 Carbohydr. Rese" 306, 177- 187 (1998). Luminescence, 14, 303-314 (1999). 特開平 10-77286)。
発明者は、 これらの知見をもとに鋭意研究を進めた結果、 シクロデキスト リン 分子にスーパーォキシドア二オンと反応する分子 (例えば、 イミダゾ [1,2-a]ビラ ジン- 3 ( 7 H) -オン分子、 又はその誘導体)、 およびその物質からのエネルギー を受け取って発光する分子 (例えば、 フルォレセイン分子、 又はその誘導体) が 共有結合した化合物を発光剤として用いることにより、 検体中のスーパーォキシ ドア二オンを検出できることを見い出し、 本発明に至ったものである。
本発明のスーパーォキシドアユオン分析用試薬は、 少なくともシクロデキスト リン分子にイミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子およびフルォレセィン分 子が共有結合した化合物を含有することを特徴とするものである。
具体的には、 本発明のスーパーォキシドア二オン分析用試薬に用いられるシク ロデキストリン分子にイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子およびフルォ レセィン分子が共有結合した化合物は、図 1の式(1 )および(2 )のものが好ましく 例示される。
本発明のスーパ一ォキシドア二オン分析用試薬は、 水溶性であり、 スーパーォ キシドアェオンと反応して最大発光波長が約 530mnの緑色の発光を示し、かつ、 MCLAおよび FCLAよりも高い発光強度を示し(FCLAの約 100倍の発光強度)、 さらには、 タンパク質や脂質などの生体成分の影響を受けにくいため、 有効成分 として好ましい。
本発明においてスーパーォキシドア-オン分析用試薬の有効成分として使用さ れるシクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [1,2-a]ピラジ ン -3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合物は、以上のとおりのものであり、 その製造法を提供する。 例えば、 第 3図に示した以下の方法がある。 既知の方法 (例えば、 特開平 10-77303、 Biosci. Biotech. Biochem., 1998 62, 1249- 1252)
より合成されるモノ- 2-ひトシル -γ -CD のアル力リ処理により得られた既知物質 モノマンノエポキシ- γ-シクロデキス トリン ull. Chem. Soc. Jpn" 1990, 63, 1409-1414) をピリジン中で ニトロベンゼンスルホユルクロリ ドと反応させ、 6位水酸基に二トロベンゼンスルホ二ル基を結合させた新規化合物 3および 4を 得る。 本化合物には 8個の異性体が存在するがこれら 8個の異性体の分離を行な わず 8個の異性体の混合物すなわち化合物 3および 4の混合物として以後の反応 を進める。 6-O-ニトロベンゼンスルホ二ノレ- γ -シクロデキストリン (3及び 4) を DMF中、 アジ化ナトリゥムと反応させ、 6位にアジド基を導入し新規化合物 (5) および化合物 (6) を合成する。 次に接触水素添加によりアジド基を還元 し新規化合物 (7) および化合物 (8) の混合体を得る。 次に化合物 (7) およ ぴ化合物 (8) の混合体をフルォレセィンィソチオシアナ一トと反応させ、 新規 化合物 (9) および化合物 (1 0) の混合体を得る。 続いて化合物 (9) および 化合物 (1 0) の混合体をアンモニア水と反応させることによりエポキシを開環 し、 3位にアミノ基を導入した新規化合物 (1 1 ) および化合物 (1 2) の混合 体を得る。 続いて化合物 (1 1) および化合物 (1 2) の混合体を MCLA-COOH とアミ ド結合させ、 目的とする新規化合物 (1 ) および化合物 (2) の混合体を 得る。 もちろんこれ以外の方法によって合成されるものであってもよく、 上記例 によって、 限定されるものではない。
さらに、 本発明のスーパーォキシドアェオン分析用試薬は、 以上のとおりのシ' クロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物を有効成分とするものであれば、 そ の他の物質、 例えば、 溶剤、 緩衝剤、 安定剤、 界面活性剤などを含有していても よい。
そして、 本発明は、 以上の通りのスーパーォキシドアユオン分析用試薬を用い てスーパーォキシドア二オンを検出する方法をも提供する。 すなわち、 本発明の スーパーォキシドアユオン分析用試薬を検体溶液に添加、 混合するなどして接触
させ、 シクロデキストリン分子にイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子お よびフルォレセィン分子が共有結合した化合物によって発せられる光の強さを測 定することによりスーパーォキシドア二オンを簡便に分析することが可能となる のである。
この時、 添加するスーパーォキシドアユオン分析試薬の量等の分析条件は特に 限定されない。 具体的には、 スーパーォキシドア-オン分析試薬の濃度は、 分析 系に影響を与えない程度であればよい。また、スーパーォキシドア二オン分析は、 被検体に影響を与えない温度範囲で行なえばよい。 例えば、 一般に生体を被検体 とし、 水溶液中で分析を行なう場合には、 約 10-40°Cの温度範囲が好ましく例示 される。
本発明のスーパーォキシドア-オンの分析方法において用いられるスーパーォ キシドア二オン分析試薬の有効成分であるシクロデキストリン分子にフルォレセ ィン分子およびィミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した 化合物は、 水溶性であるため血液や血清、 あるいは細胞培養液等にも溶解できる 上、 タンパク質や脂質、 糖の存在においてもその発光反応に影響を与えない。 ま た、発光波長は、最大波長約 530nmであるため他成分の影響が小さい。 さらに、 発光強度が CLA, MCLA, FCLAに比べて非常に高い。従って、 このようなシク口 デキストリン分子にフルォレセイン分子およびィミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 ( 7 H) -オン分子が共に共有結合した化合物は、 従来の CLA, MCLA, FCLAなどのスー パーォキシドア二オン分析用試薬に比べ、 高い精度でのスーパーォキシドアニォ ンの分析を可能とする。
以下、 実施例を示し、 この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。 もちろん、 本発明は以下の例に限定されるものではなく、 その要旨を変更しない 範囲内で様々な態様で実施することが可能である。 加えて、 本発明の技術的範囲 は、 いわゆる均等の範囲にまで及ぶものである。
<実施例 >
実施例 1
KC1 (ナカライテスタ株式会社製) (0.2M)、 EDTA (SIGMA社製) (0·1ηιΜ)、
3-モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS、ナカライテスタ株式会社製) (20mM) を含む緩衝水溶液 (pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cでヒポキサンチン (和光純薬工業株式 会社製) 水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、 化合物 (1 ) および化合物 (2 ) の混合水溶 液 (2·5χ10·5Μ、 40 /zl) およびキサンチンォキシダーゼ (SIGMA社製) 水溶液 (0.37unit/mlN 40 μ 1) を加え、 ァロカルミネッセンスリーダー BL201 (ァロカ 社製) を用いて発光強度を測定した。 発光はキサンチンォキシダーゼ水溶液の添 加後、 すぐに最高強度を示した。 比較のため化合物 ( 1 ) および (2 ) の混合物 の代わりに MCLA (東京化成工業株式会社製) および FCLA (東京化成工業株式 会社製) を用いて同様にして実験を行なった。 得られた相対発光強度の結果を表 1に示した。 実施例 2
KC1 (0.2M)、 EDTA (0.1ηιΜ)、 3-モルホリ ノプロパンスルホン酸 (MOPS) (20mM) を含む緩衝水溶液 (pH 7.2, 0.5ml)に 25°Cでへキサデシルトリメチル アンモニゥムプロミ ド(CTAB:ナカライテスク株式会社製)水溶液 (0.5%、 50 μ 1)、 ヒポキサンチン水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、 化合物 (1 ) および化合物 ( 2 ) の混合水溶液 (2.5xlO'5M、 40 μ 1) およぴキサンチンォキシダーゼ水溶液 (0.37unit/ml、 40 μΐ) を加え、 ァロカルミネッセンスリーダー BL201 を用い て発光強度を測定した。 発光はキサンチンォキシダーゼ水溶液の添加後、 すぐに 最高強度を示した。 比較のため化合物 ( 1 ) および (2 ) の混合物の代わりに MCLAおよび: FCLAも同様にして実験を行なった。得られた相対発光強度の結果 を表 1に示した。
実施例 3
KC1 (0.2M)、 EDTA (0.1mM)、 アルブミンタンパク質 (BSA:和光純薬工業 株式会社製) (0.1%)、 3-モルホリ ノプロパンスルホン酸 (MOPS) (20mM) を 含む緩衝水溶液 (pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cで、 ヒポキサンチン水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、 化合物 (1) および化合物 (2) の混合水溶液 (2.5χ10·
5Μ、 40 μ\) お よびキサンチンォキシダーゼ水溶液 (0.37unit/ml、 40^1) を加え、 ァロカルミ ネッセンスリーダー BL201を用いて発光強度を測定した。発光はキサンチンォキ シダーゼ水溶液の添加後、 すぐに最高強度を示した。 比較のため化合物 (1) お よび (2) の混合物の代わりに MCLAおよび FCLAも同様にして実験を行なつ た。 得られた相対発光強度の結果を表 1に示した。 表 1. 相対発光強度
以上の実施例 1一 3より、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子および ィミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 ( 1) お よび( 2 ) の混合物は、 MCLAおよび FCLAよりも高い発光強度を示すことが明 かとなつた。 また、 CTABは、 MCLAや FCLAの発光強度を増強する効果がある が、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン分子およびィミダゾ [l,2-a]ピラジ ン -3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合物 (1) および(2) の混合物は、 CTABの影響をあまり受けないことが確認された。また、 BSAは MCLAや FCLA の発光強度を増減する効果があるが、 シクロデキストリン分子にフルォレセィン 分子おょぴイミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3 (7H) -オン分子が共に共有結合した化合 物 (1) および(2) の混合物は、 BSAの影響が小さいことが確認された。 CTAB
添加実験あるいは BSA添加実験の結果は、 シクロデキストリン分子にフルォレ セイン分子およびイミダゾ [l,2-a]ピラジン- 3 ( 7H) -オン分子が共に共有結合し た化合物 (1 ) および (2) の混合物は、 タンパク質や脂質の影響を受けにくい 発光をする発光試薬であることを示している。 実施例 4
KC1 (0.2M)、 EDTA (O.lmM), 3-モルホリノプロパンスルホン酸 (MOPS) (20mM) を含む緩衝水溶液 (pH 7.2、 0.5ml)に 25°Cで CTAB水溶液 (0.5%、 50 1)、 ヒポキサンチン水溶液 (0.3mM、 0.5ml)、化合物(1 )および化合物 ( 2 ) の混合水溶液 (2.5χ10·5Μ、 40 μ ΐ) およびキサンチンォキシダーゼ水溶液 (0.37unit/mls 40 μΐ) を加え、 蛍光分光光度計 FP750DS (日本分光株式会社 製) を用いて発光スぺク トルを測定した (ただし、 励起光は使用しない)。 発光ス ぺクトルは最大発光波長約 530nmを示した。 実施例 5
モノ- 6-ひ二 ト口ベンゼンス /レホニル -2, 3-モノマンノエポキシ γ CD (3 ) お よび (4) の混合物の合成
次に、 化合物 ( 1 ) 及び ( 2 ) の製造方法について説明する。 なお、 下記の説 明において、 化合物番号は、 第 3図中の符号による。
モノマンノエポキシ- y -シクロデキス トリン (0.500g、 0.00039 lmol) をピリジ ン (10.0ml) に溶角旱し、 723-ニ ト ロベンゼンスノレホニノレク ロ リ ド (0.130g、 0.000586mol) を加え- 20°Cで 30分間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODS力 ラムクロマトグラフィー (20xl30mm、 0% MeOH/H2O→20% MeOH/H20) を 行ない、 化合物 (3 ) および (4 ) の混合物 (0.204g) を 35%の収率で得た。 混 合物を 1 H NMR (DMSOD6, 40°C)にて測定したところ、 δ 3.2-3.9 (majority, H of γ-cyclodextrin unit), 4.4-4.5 (2H, m, H-6*), 4.7-5.0 (8H, m, H-l), 8.00 (1H, m,
Ar-H), 8.39 (lH, m, Ar-H) and 8.61 (2H, m, Ar-H)の結果を得た。 実施例 6
モノ- 6-アジド -2,3-モノマンノエポキシ γ-CD (5) および (6) の混合物の 合成
化合物 (3) および (4) の混合物 (0.190g、 0.000129mol) を DMF (3.80ml) に溶解し、 アジ化ナトリウム (0.0250g、 0.000384mol) を加え室温で 20時間攪 拌した。 DMFを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー (20xl30mm、 0% MeOH/H20→ 15% MeOH/H20) を行ない、 化合物 (5) および (6) の混合物 (0.165g) を 97%の収率で得た。 混合物を Ή NMR (DMSOD6, 50°C) にて測定し たとこ ό、 δ 3.3-3.8 (majority, H of γ-cycloaextrm unit) and 4.9-5.0 (8H, m, H-l)の結果を得た。 実施例 7
モノ -6-Λ 5-フルォレセィニル)チォゥレイ ド -2, 3-モノマンノエポキシ γ-CD (9) および (10) の混合物の合成
化合物(5)および( 6 )の混合物 (0.154g、 0.000 llSmol) をメタノール:水 =1:1 (5.00ml) に溶かし、 Pd-C (5wt.% on activated carbon) (O.lOOg) を加え水秦雰 囲気下、 室温で 15 時間攪拌した。 セライ ト及びメンブランフィルターを用いて Pd-Cを濾別し、 粗ァミノ体 (7) および (8) の混合体 (0.172g) を得た。 この 粗ァミノ体 (0.150g、 0.000117mol) をピリ ジン (3.00ml) に溶解し、 FITC (0.0460g, 0.000118mol) を加え室温で 1時間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー (15x70imn、 0% MeOH/H20 (0.1% ΊΤΑを含 む)→30°/。 MeOH/H20 (0.1% TFAを含む)) を行ない、化合物 (9) および (1 0 ) の混合物 (0.12 lg) を 70%の収率で得た。 混合物を Ή NMR (DMSODe, 50°C) にて測定したところ、 δ 3.3-3.9 (majority, H of γ-cyclodextrin unit), 4.9-5.1 (br.,
H- l), 6.63 (4H, m, Ar-H), 6.75 (2H, s, Ar-H), 7.18 (1H, m, Ar-H), 7.81 (br., Ar-H) and 8.34 (br., Ar-H)の結果を得た。 実施例 8
モノ - 6-Λ 5-フルォレセィニル)チォゥレイ ド-モノ- 3-デォキシ -3-[[6-(4-メ トキ シフエニル)ィ ミダゾ [1,2-a]ピラジン- 3(7 -オン- 2-ィル]プロ ピオニル]ァミ ノ -γ-CD ( 1 )および ( 2 ) の合成
化合物 ( 9 ) および ( 1 0 ) の混合物 (0.110g\ 0.0000659mol) を濃アンモェ ァ水 (2.20ml) に溶解し、 37。Cで 3日間反応させた。 反応液を濃縮し、 粗ァミノ 体 (1 1 ) および ( 1 2 ) の混合体 (0.142g) を得た。 この粗ァミノ体 (0.130g、 0.000077 Imol) ピリ ジン (2.60ml) に溶解し、 既知化合物 MCLA-COOH (Carbohydr. Rese., 1998, 306, 177-187 ) (0.0250g, 0.0000797mol)、 WSC (ナ 力ライテスタ株式会社製) (0.0440g、 0.000229mol) を加えアルゴン雰囲気下、 室温で 4時間攪拌した。 ピリジンを減圧除去し、 ODSカラムクロマトグラフィー (20x90mm 0% MeOH/H
20 (0.1% TFA を含む)→ 50 % MeOH/H
20 (0.1% TFA を含む)) を行なった。 さらに HPLC (COSMOSIL Code No.379-76 Sise 20x250醒 5C- 18-MS Type Waters 流速 6.0ml/min、 30% MeOH/H
20 (0.1% TFAを含む)→ 50 % MeOH/H
20 (0.1% TFAを含む)(60min》 によつて精製し た。 得られた化合物を少量のメタノールに溶解し、 大量の酢酸ェチルを加えパゥ ダー化させることにより化合物 ( 1 ) および ( 2 ) の混合物 (0.0300g) を 25% の収率で得た。混合物を iH NMR (CD
3OD, 20°C) にて測定したところ、 δ 2.7-3.2 (m,
3.3-4.1 (majority, H oi γ-cyclodextrin unit入 4.6-5.1 (m, H-l), 6.6-6.8 (m, Ar-H), 7.08 (m, Ar-H), 7.6-7.8 (m, Ar-H and H of pyrazine) and 7.9-8.2 (m, Ar-H and H of pyrazine) の結果を得た。また、 UV (0.03M phosphate buffer, pH 8.0) にて測定したところ、 Xmax nm (ε): 492 (48000)の結果を得た。