JP5800816B2 - 金属錯体、蛍光プローブ - Google Patents
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Description
この発明に係る金属錯体を調製した。具体的には、図1の反応経路に沿って配位子を合成したのち、鉄錯体を調製した。なお、理解しやすくするため、以下の説明では、同じ化合物については図1と同じ記号を使用した。
N,N,N'-Tris(2-pyridyl-methyl)propane-1,3-diamine(以下、化合物dと省略する。)は既報(Hureau, C.; Groni, S.; Guillot, R.; Blondin, G.; Duboc, C.; Anxolabehere-Mallart, E. "Syntheses, X-ray Structures, Solid State High-Field Electron Paramagnetic Resonance, and Density-Functional Theory Investigations on Chloro and Aqua MnII MononucleaR3COmplexes with Amino-Pyridine Pentadentate Ligands", Inorg. Chem. 2008, 47, 9238-9247.)に従って合成したものを使用した。これ以外の試薬については市販のものを使用した。
窒素雰囲気下、Resazurinナトリウム塩(化合物a,1.50g,5.97mmol)の氷酢酸溶液(10ml)に亜鉛粉末(1.29g,29.6mmol)を加え、一時間攪拌した。反応液から溶媒を除去して、N,N-dimethyl-4-aminopyridine(DMAP,0.73g,5.97mmol)を加え、アセトン(40ml)に溶解した。反応溶液に無水酢酸(1.21g,11.9mmol)を加え、室温で攪拌した。反応終了はTLCにて確認した(Rf=0.28,SiO2,酢酸エチル:ヘキサン=1:2)。
窒素雰囲気下、化合物b(1.0g,3.34mmol)及び炭酸ナトリウム(0.425g,4.07mmol)の乾燥アセトニトリル溶液(40ml)にbromoacetylbromide(318μl,3.68mmol)を加え、3時間攪拌した。溶液の色が淡黄色から深緑色へ変化した。反応終了後、Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮・真空乾燥して深緑色固体を得た(1.3g,収率94%)。この化合物は精製せずに次の反応に使用した。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR及び13C NMR)、フーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR) の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
窒素雰囲気下、化合物c(67mg,0.16mmol)及び炭酸カリウム(19mg,0.18mmol)の乾燥アセトニトリル溶液(10ml)に化合物d(50mg,0.14mmol)を徐々に加え、室温で24時間攪拌した。Celiteにより反応溶液をろ過し、ろ液を濃縮・真空乾燥させ、赤褐色の油状物質を得た。油状物質をカラムクロマトグラフィー(Rf=0.10,SiO2,酢酸エチル:ヘキサン=1:1)を使用して精製し、赤褐色固体を得た(76mg,収率71%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
化合物e(22mg,0.032mmol)及び亜硫酸ナトリウム(8.2mg,0.065mmol)を1,4-dioxane/水混合溶液(2ml)に溶解し、24時間加熱還流した。反応溶液は赤色蛍光を発していた。溶媒を濃縮したのち、水を1ml加えて、再結晶し、赤色固体を得た(15mg,収率82%)。なお、この化合物は核磁気共鳴分光法(1H NMR及び13C NMR)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
化合物f(60mg,0.1mmol)のメタノール/アセトニトリル溶液(2ml, v/v = 1/1)にFeII(OTf)2・2CH3CN(46mg,0.1mmol)を加え、1時間撹拌した。溶液の色は褐色へと変化した。1時間後、ジエチルエーテル(2ml)を加え、析出した沈殿をろ過したのち、真空乾燥して茶褐色の固体を得た(38mg,収率35%)。なお、この化合物は、高分解能質量分析計(HRMS)の測定結果から同定した。その結果、HRMS(ESI,pos)m/z=329.1(M2+)であった。
この発明に係る蛍光プローブ(以下、MBFh1と省略する。)の反応速度を調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1(5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)を4面セルに調製した。これに、終濃度が2.5μM,5μM,50μM,500μMとなるように過酸化水素水を添加して、最大蛍光波長である590nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。その結果を図2に示す。
MBFh1の反応速度をより精密に調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1 (5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)を4面セルに調製した。これに、終濃度が1.25μM,3.75μM,5μM,12.5μM,25μMとなるように過酸化水素水を添加して、590nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。その結果を図3に示す。
酵素によって発生した過酸化水素が検出できるかどうか調べた。具体的には以下のようにして調べた。MBFh1(5μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO,125μM D-グルコース)を4面セルに調製した。これに、終濃度が0.008mg/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加したのち、590 nm(励起波長:570nm)における蛍光強度の時間変化を25℃で測定した。また、MBFh1のMOPS buffer溶液にグルコースオキシダーゼを添加してから、100秒後に終濃度が0.08mg/mlとなるようにカタラーゼを添加し、蛍光強度の時間変化を同様にして測定した。これらの測定結果を図4に示す。
MBFh1が、D−グルコースを検出できることは、実施例4で確認した。そこで、MBFh1のD−グルコースの検出感度について調べた。具体的には次のようにして調べた。MBFh1(50μM)の20mM MOPS buffer溶液(pH=7.2,2.5% DMSO)に、終濃度が2.5μM、5μM、19μM、25μMとなるようにグルコースを添加し、添加した溶液を4面セルに収納した。これに、終濃度が0.008mg/mlとなるようにグルコースオキシダーゼを添加して50秒撹拌したのち、590nmにおける蛍光強度(励起波長:570nm)を25℃で測定した。その結果を図5に示す。
MBFh1の反応性と、従来技術である非特許文献11に記載のAmplex Red(登録商標)酵素アッセイキットの反応性とを、他のペルオキシダーゼ基質の存在下で比較した。具体的には次のようにして比較した。
MBFh1と、非特許文献11に記載のAmplex Red(登録商標)酵素アッセイキットの活性酸素種に対する反応性を調べた。具体的には、次のようにして調べた。
発明者らは、MBFh1が蛍光プローブとして優れている理由について、MBFh1が鉄錯体と蛍光色素Amplex Redモチーフとが共有結合している化合物だからである、と考えた。そこで、MBFh1を使用した場合と、Amplex Red及びMBFh1の鉄錯体部分と構造的に類似する化合物[Fe(5)](OTf)3を使用した場合の蛍光強度の時間変化の違いを比較して調べた。具体的には、次のようにして調べた。
Claims (10)
- 請求項1に記載の金属錯体を含む蛍光プローブ。
- 過酸化水素の検出に使用する請求項2に記載の蛍光プローブ
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージング用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブを含む臨床分析用キット。
- 請求項2に記載の蛍光プローブで標識した標識抗体。
- 請求項7に記載の標識抗体を含むバイオアッセイ用キット。
- 請求項7に記載の標識抗体を含むバイオイメージング用キット。
- 請求項7に記載の標識抗体を含む臨床分析用キット。
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