WO2004023117A1

WO2004023117A1 - 生化学的検査用画像処理方法

Info

Publication number: WO2004023117A1
Application number: PCT/JP2003/011019
Authority: WO
Inventors: Kaneyasu Okawa; Takatomo Sato
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2004-03-18
Also published as: AU2003261818A1; JP2004101354A; EP1548423A1; JP3908135B2

Abstract

本発明の生化学的検査用画像処理方法は、生化学検査用アレイに励起照明を与えて光画像をサンプル画像として撮り込み、各プローブアレイ要素から発生した蛍光を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正する。

Description

明細書

生化学的検査用画像処理方法

技術分野

本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査用の画像処理方法に関する。

背景技術

最近、「ハイプリダイゼーシヨンによる配列決定」（ S B H ) のために、アレイドハィプリダイゼーション ( a r r a y e d h y b r i d i z a t i o n ) 反応の幾つ力 ^¾の方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブと D N A試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いた S B H 力 Sある。

また、従来「ジエノセンサー（ g e n o s e n s o r ) J なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジエノセンサーの概念には、ハイプリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。

このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージエノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及ぴ多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージエノセンサ一は、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。

( 1 ) 表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。

( 2 ) ハイブリダィゼーシヨン反応に要する時間が短縮し (平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイプリダィゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。

( 3 ) 多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。

( 4 ) 大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。

以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平 9 — 5 0 4 8 6 4 号公報を引用し、図 1 2 を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。

図 1 2 は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ゥエルァレィを示す図である。図 1 2 において、多孔性のガラスウェハ一 1 0 1 には、複数のテーパ孔 1 0 2 が配設されており、これら各孔 1 0 2 にテーパ付きゥエル 1 0 3 が埋設されている。テーパ付きゥヱル 1 0 3 は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する 0. 1 — 1 Ο μ ΐη直径のチャンネル 1 0 4 を底部に含む。各チャンネル 1 0 4 は図示のように多くの微小の貫通孔 1 0 5 を有している。このゥエルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。

( 1 ) 3 — グリシドキシプロピル一トリメトキシシラン 4 m 1 、キシレン 1 2 m 1 、 N , N— ジィソプロピルェチルァミン（フーエツヒ（ H u n i g ) 塩基） 0 . 5 m l の溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを 8 0 °Cの該溶液に 5 時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、 8 0 °Cにて乾燥することにより、ウェハーをェポキシシラン一誘導体化ガラスとする。

( 2 ) 5 ' 一または 3 ' —アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に 1 0 M— 5 0 /z Mにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー 1 0 1 (シリカウェハー〉に微量分注する。 6 5 °Cにてー晚反応させた後、その表面を 6 5 °Cの水、次いで 1 0 mM トリェチルァミンで簡単に流し、表面上の未反応ェポキシ基を取り除く。次いで、 6 5 °Cの水で再度流し、風乾することにより、ァミン一誘導化オリゴヌクレオチドをェポキシシラン一誘導体化ガラスに結合させる。

( 3 ) 増幅の間に産物に [ ³² P ] ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ一 ³² P [A T P ] +ポリヌクレオチド · キナーゼを用いて増幅産物を 5 ' —標識することによって、標的 D N A (分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（ C e n t r i c o n ) 濾過によって除去する。好ましくは、 1 の P C R断片を 5 ' — ピオチン標識すれば、ストレプトァビジン · ァフィ二ティークロマトグラフィ一による一本鎖の調製ができる。少なくとも 5 n M ( 5 f m o 1 / μ 1 ) の濃度であって、少なくとも 5， 0 0 0 c p m / f m o 1 の特異活性のハイブリダィゼーシヨン緩衝液（ 5 0 m M トリス _ H C 1 、 p H 8 2 mM E D T A、 3 . 3 M塩化テトラメチルアンモ二ゥム）中に標的 D N Aを溶解する。数百塩基長の P C R断片が、少なくともォクタマ一長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイプリダイゼーションに適している。

( 4 ) 標的 D N A試料をチップの多孔性領域に流し込み、 6 °Cにて 5〜 1 5分間インキュベートし、ハイプリダイゼーションを行なう。次いで、 1 8 °Cにて同様の時間、多孔性チップを通してハイプリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニゥムの代わりに、 1 M K C L もしくは N a C l または 5 . 2 Mベタインを含有する緩衝液でハイプリダイゼーションを行なうこともできる。

( 5 ) C C Dジエノセンサー装置を用いてハイプリダイゼーシヨン強度の検出及び定量を行なう。 C C Dジエノセンサ一装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。

従来では、図 1 2 に示した三次元アレイを用いて生化学検查を行なう場合、まず生化学検査用アレイを製作する。そして、顕微鏡観察下に配置された標準反射板に励起照明を与えて、レファレンス画像を C C Dカメラで撮り込む。次に前記反射板を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイを配置し、蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせる。続いて生化学検査用アレイに励起照明を与えて、蛍光画像を C C Dカメラで撮り込みサンプル画像とする。このサンプル画像をレファレンス画像で補正することにより、多数のプローブァレイ要素 3すなわち微細パターンから発生した蛍光を検出している。

しかし従来では、標準反射板を配置してレファレンス画像を得るため、専用の手段が必要となり装置が大型化するとともに、サンプル画像を補正するまでの処理時間が長くなる。また、レファレンス画像を取得する際に、標準反射板上のゴミ等によりノイズが混入することもあり、蛍光輝度を示すシグナルの検出精度に影響を及ぼす。また、標準反射板の保守等も煩雑であるという問題がある。

本発明の目的は、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる生化学的検査用画像処理方法を提供することにある発明の開示

( 1 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は、生化学的物質の溶液を、表面に該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記生化学的物質と該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査用の画像処理方法であり、前記生化学検査用アレイの画像をサンプル画像として撮り込み、前記各プローブアレイ要素から発生した光の強度を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を捕正する。

( 2 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 1 ) に記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像に対して収縮処理を施した後に膨張処理を施すことにより前記レファレンス画像を抽出する。

( 3 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 2 ) に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及ぴ前記膨張処理は、所定形状のカーネルを用い、前記微細パターンを消滅させるのに必要な回数分実行する。

( 4 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 3 ) に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、 3 X 3 画素の十字形カーネルを用い、前記微細パターンの外接円の最大半径以上に相当する画素数を処理回数とする。

( 5 〉本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 3 ) に記載の方法であり、かつ前記収縮処理及び前記膨張処理は、「前記微細パターンの外接円の最大直径以上に相当する画素数」 X 「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネルを用い、処理回数を 1 とする。

( 6 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 1 ) 乃至（ 5 ) のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、前記サンプル画像を補正する。

( 7 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 1 ) 乃至（ 5 ) のいずれかに記載の方法であり、かつ前記サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、前記サンプル画像を補正する。

( 8 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 1 ) 乃至（ 5 ) のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像の各画素について、（レファレンス画像の最大輝度値 Z該画素の輝度値）を算出し、その値を対応する前記サンプル画像の各画素の輝度値に乗じて、前記サンプル画像を補正する。

( 9 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記（ 1 ) 乃至（ 8 〉のいずれかに記載の方法であり、かつ前記レファレンス画像に平滑化処理を施し、前記サンプル画像を補正する。

( 1 0 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法は上記 ( 1 ) 乃至（ 9 ) のいずれかに記載の方法であり、かつ前記微細パターンの画像は、蛍光標識された多数の微小スポットを有する前記生化学検査用アレイを励起光で照明して得られる蛍光画像であり、前記サンプル画像を補正することにより前記各微小スポットの蛍光輝度を示す信号を検出する。

図面の簡単な説明

図 1 は、本発明の実施の形態に係る生化学的検查用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。

図 2 Aは、本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。

図 2 B は、本発明の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。

図 3 は、本発明の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。

図 4 は、本発明の実施の形態に係るサンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図。

図 5 は、本発明の実施の形態に係るサンプル画像の輝度分布を示す図。

図 6 Aは、本発明の実施の形態に係る十字形カーネルを示す図。

図 6 B は、本発明の実施の形態に係る円形カーネルを示す図。

図 6 Cは、本発明の実施の形態に係る円形カーネルを示す図。

図 7 は、本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の等輝度線図。

図 8 は、本発明の実施の形態に係るレファレンス画像の輝度分布を示す図。

図 9 は、本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像を示す図。

図 1 0 は、本発明の実施の形態に係る補正サンプル画像の輝度分布を示す図。

図 1 1 は、本発明の実施の形態に係る平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図。

図 1 2 は、従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ゥエルアレイを示す図。

発明を実施するための最良の形態

図 1 は、本発明の実施の形態に係る生化学的検査用画像処理方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図 1 において、励起光源 1 1 には、水銀光源等が用いられる。この光源 1 1 から出射される励起光の光路上には、シャッター 1 2 、レンズ 1 3 、励起フィ 7レタ 1 4、およびダイクロイツクミラー 1 5 が配置され、このダイクロイツクミラー 1 5 の反射光路上には、対物レンズ 1 6 および後述する生化学検査用アレイ 1 が配置されている。また、ダイクロイツクミラー 1 5 の透過光路上には、蛍光フィルタ 1 7、結像レンズ 1 8、および C C Dカメラ 1 9 が配置されている。 C C Dカメラ 1 9 には画像処理部 2 0 が接続され、画像処理部 2 0 には表示部 2 1 が接続されている。

図 2 A , 図 2 Bは、本実施の形態で使用する生化学検査用アレイの概略構成を示す図であり、図 2 Aは上面のフォーマットを示す図、図 2 B は一部側面図である。生化学検査用ァレイ 1 は、図 1 2 に示した三次元アレイ力らなる。図 2 Aに示すように、生化学検査用アレイ 1 にはプローブアレイ要素 3 (微小スポット）が二次元に配列されている。これらプローブアレイ要素 3 は、図 1 2 に示したようにテーパ付きゥェル 1 0 3 力らなり、底部に 0 . 1 — 1 Ο μ πι直径のチャンネル 1 0 4 を有し、さらに各チャンネル 1 0 4 は図 2 B に示すように多くの微小な貫通孔 1 0 5 を有している。各貫通孔 1 0 5 の壁面には、プローブ 3 1 が結合している。

すなわち生化学検査用アレイ 1 では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー 1 0 1 の表面の異なるテーパ付きゥエル 1 0 3 にそれぞれプロ一プの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー 1 0 1 の内部に設けられた各チャンネル 1 0 4 の各貫通孔 1 0 5 で保持するのが良いが、多孔性ガラスゥェハー 1 0 1 を設けずに、直接各貫通孔 1 0 5 にプロープの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔 1 0 5 を含む部材が、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。

以下、本実施の形態における生化学検査の概略を説明する。まず検査者は、顕微鏡観察下に生化学検査用アレイ 1 を配置する。この生化学検查用アレイ 1 には、あらかじめプロ一プアレイ要素ごとに異なるプローブをプローブアレイ要素 3 に固相化してある。

次に検査者は、該生化学検査用アレイ 1 に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素 3 から除去する。

次に、該生化学検査用アレイ 1 (基板）に励起照明を与えて、サンプル画像を C C Dカメラ 1 9 で撮り込む。このサンプル画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。このサンプル画像は、励起強度に比例するパックグラゥンド（背景）を示す画像上に、同じく励起強度に比例する多数のプローブアレイ要素 3から発生した蛍光の微細パターンが散在し、さらに励起強度と無関係なノイズが加わった画像となる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャツタ、、一 1 2 などで励起照明を遮断するのが好ましい。

次に、画像処理部 2 0 は、サンプル画像から微細パターンを除いたバックグラウンド画像を抽出し、それぞれレファレンス画像とする。そして画像処理部 2 0 は、各レファレンス画像で対応する各サンプル画像を補正する。これにより、サンプル画像に含まれる微細パターンのシグナルが正確に検出される。

図 3 は、本実施の形態による検査手順を示すフローチヤ一トである。以下、図 3 に従って検査方法およびその作用を説明する。

( 1 )ステップ S 1 ：まず検査者は、 F I T Cなどの蛍光分子で標識された生化学的物質の溶液を作成する。

( 2 )ステップ S 2 ：検査者は、生化学検査用アレイ 1 に生化学的物質の溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させ 03 011019

12 る。この場合検査者は、図 1 に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図 2 Aに示す生化学検査用アレイ 1 を配置し、その表面に一様に生化学的物質の溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ 1 上のプローブアレイ要素 3 內のプロ一ブと溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素 3 内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子が間接的にプローブに結合することになる。

( 3 )ステップ S 3 ：検查者は、生化学検査用アレイ 1 から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ 1 の各プローブァレィ要素 3 から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。

( 4)ステップ S 4 ：検査者は、生化学検査用アレイ 1 の画像をサンプル画像として C C Dカメラ 1 9 で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ 1 を励起光源 1 1 で励起照明して、蛍光画像を撮り込む。

励起光源 1 1 からの励起光は、レンズ 1 3 、励起フィルタ 1 4 を介してダイクロイツクミラー 1 5 で反射され、対物レンズ 1 6 を介して生化学検査用アレイ 1 の上面全体に照射される。生化学検査用アレイ 1 のプローブアレイ要素 3 内のサンプル物質に結合している蛍光分子から発生した蛍光と共に、バックグラゥンドを形成する生化学検査用アレイ 1 における反射光、生化学検查用アレイ 1 の自家蛍光、外部から混入する迷光などが、対物レンズ 1 6 、ダイクロイツクミラー 1 5 、バンドパスフィルタ 1 7およぴ結像レンズ 1 8 を介して、 C C Dカメラ 1 9 に入射し、サンプル画像が撮り込まれる。 C C Dカメラ 1 9 で撮り込んだサンプル画像は、画像処理部 2 0 へ送られる。

なお、本実施の形態では受光素子として C C Dを用いているが、 C C Dに特定するものではなく、他のエリアセンサを用いても良い。従って、以下に記述される「 C C D」は「ェリアセンサ」でも通用するものである。

図 4は、サンプル画像の例を等輝度線を用いて示した図である。図 4 において 4 1 は二次元的に配列された微細パターンの等輝度線、 4 2 はバックグラウンドの等輝度線であり、該バックグラウンドの等輝度線 4 2付近の数字は該バックグラウンドの等輝度線の輝度を示す。

図 5 は、サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示し、図 4 に示すサンプル画像上の所定の画素行 Lの輝度分布を表わしている。今、ノックグラウンドが一様な輝度値 5 0 0 を有し、微細パターンを示すシグナルの輝度が全て 5 0 0 である時に、形成されるサンプル画像は、一様なバックダラゥンドの輝度値 5 0 0 からのシグナルの突出量は全て 5 0 0 となる。し力、し、中央画素付近で最大輝度値 5 0 0 であるような、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合のサンプル画像は、図 5 に示すように、励起照明むらを含むパックグラウンドを示すシグナル（信号） 5 2 上に該パックグラウンドの輝度分布に比例するシグナル 5 1 が突出した分布となる

( 5 )ステップ S 5 ：画像処理部 2 0 は、各サンプル画像に対して収縮処理を行なう。このとき、例えば図 6 Aに示す 3 X 3画素からなる十字形カーネルを適用する。画像処理部 2 0 は、サンプル画像の各画素に、図 6 Aに示す十字形カーネルの中心画素 6 1 を当てはめ、この中心画素 6 1 の輝度を斜線部で示す 5画素（中心画素 6 1 自身とその上下左右の 4画素）の最小輝度に置き換える処理、すなわち収縮処理を行なラ

この収縮処理をサンプル画像の全画素に対して 1 回行なうと、周囲の 1 画素分だけ収縮する。この収縮処理を、微細パターン 4 1 の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば 1 3画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、全微細パターンが消滅しバックグラウンドのみに変調された画像となる。

なお、この収縮処理は、 3 X 3画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図 6 B に示す 5 X 5画素からなる円形カーネルを用いることもできる。

( 6 )ステップ S 6 ：画像処理部 2 0 は、ステップ S 5 で収縮処理された各サンプル画像に対して膨張処理を行なう。このときも、例えば図 6 Aに示す 3 X 3 画素からなる十字形力一ネルを適用する。画像処理部 2 0 は、収縮処理されたサンプル画像の各画素に、図 6 Aに示す十字形カーネルの中心画 P T/JP2003/011019

15 素 6 1 を当てはめ、この中心画素 6 1 の輝度を斜線部で示す 5画素の最大輝度に置き換える処理、すなわち膨張処理を行なう。

この膨張処理を収縮処理されたサンプル画像の全画素に対して 1 回行なうと、周囲の 1 画素分だけ膨張する。この膨張処理を、微細パターン 4 1 の外接円の最大半径に相当する画素数（例えば 1 3画素）以上の回数分実行すると、サンプル画像は、変調されたバックグラウンド画像が、シグナルの全微細パターンが消滅した状態で、復調した画像となる。この画像をレファレンス画像とする。また、この膨張処理は、 3 X 3 画素からなる十字形カーネル以外に円形カーネルも適用できる。例えば、図 6 B に示す 5 X 5 画素からなる円形カーネルを用いることもできる。

図 7 は、ステップ S 5 およびステップ S 6 により得られたレファレンス画像の等輝度線図であり、等輝度線付近の数字は各等輝度線の輝度を示す。図 7 では、図 4 に示したサンプル画像から微細パターン 4 1 が消滅し、ノックグラウンド 4 2 1 のみが表わされている。

図 8 は、レファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素 ( ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図 8 は、サンプル画像に対して収縮処理と膨張処理を実行した後の輝度分布を表わしている。図 8 では、図 5 にてバックダラゥンドを示すシグナル 5 2上に突出していた微細パターンを示す七つのシグナル 5 1 が消滅し、ノックグラウンドを示すシグナル 5 2 1 のみが表われている。 ( 7 )ステップ S 7 ：画像処理部 2 0 は、図 8 に示したレフアレンス画像の輝度分布から最大輝度を検出する。そして画像処理部 2 0 は、レファレンス画像の各画素に対して（レフアレンス画像の最大輝度/画素の輝度）を算出し、サンプル画像に乗じて補正サンプル画像を得る。

言い換えれば、画像処理部 2 0 により、サンプル画像をレファレンス画像で除算し、これに一定値であるレファレンス画像の最大輝度を乗じて補正サンプル画像を得る。ここで、一定値であるレファレンス画像の最大輝度は輝度レベルを補正前のサンプル画像に合わせるためのものであり、レファレンス画像の最大輝度に限定しなくても、後述の効果を損なうものではない。すなわち、レファレンス画像の最大輝度の代わりに 1 を採用しても良く、この場合、画像処理部 2 0 は、サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、補正サンプル画像を得る。

図 9 は、サンプル画像に「レファレンス画像の最大輝度/ 画素の輝度」を乗じることにより得られた補正サンプル画像を示す図である。図 9 では、微細パターン 4 1 1 が表わされているとともに、バックグラウンド 4 2 2 が一定強度 5 0 0 の輝度分布で表わされている。

図 1 0 は、補正サンプル画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度（階調）を示している。図 1 0 は、サンプル画像に対して補正を実施した後の輝度分布を表わしている。図 1 0 では、バックグラウンドを PC霞睡 11019

17 示すシグナル 5 2 2 は、輝度値がほぼ一定値（約 5 0 0 ) となっている。ノックグラウンドを示すシグナル 5 2 2 上に突出している微細パターンを示す七つのシグナル 5 1 1 は、最大輝度値がほぼ一定値 1 0 0 0すなわち突出量が 5 0 0 となつている。このように微細パターンを示す各シグナル 5 1 1 の突出量は 7個共ほぼ一定値 5 0 0 となり、これはバックグラウンドに影響されず、正確な輝度値を示している。従って、前記突出量を求め、これを捕正後のシグナル輝度値とすれば、正確な輝度値が得られることになる。

なお、上記ステップ S 6 で得たレファレンス画像に対して、画像処理部 2 0 で平滑化処理（ローパスフィルタ処理）を行なうこともできる。このとき、例えば図 6 Cに示す 1 1 X 1 1 画素からなる円形カーネルを適用する。画像処理部 2 0 はレファレンス画像の各画素に、 1 1 X 1 1 画素カゝらなる円形カーネルの中心画素を当てはめ、この中心画素の輝度を円形カーネル中の 9 7画素の平均輝度で置き換える処理、すなわち平滑化処理を行なう。微細パターン 4 1 の外接円の最大半径が例えば 1 3画素である場合、この平滑化処理をレファレンス画像の全画素に対して例えば 1 0回実行する。

図 1 1 は、平滑化処理されたレファレンス画像の輝度分布を示す図であり、横軸は画素（ピクセル）番地、縦軸は輝度 (階調）を示している。図 1 1 では、図 8 におけるノッタグラウンドを示すシグナル 5 2 1 に表われていた輝度値の段差が消滅し、滑らかなシグナル 5 2 3 となっている。

以上のように平滑化処理されたレファレンス画像を基にして上記ステップ S 7 で補正サンプル画像を得る。その補正サンプル画像の輝度分布では、図 1 0 における微細パターンを示す七つのシグナル 5 1 1 の頂部が平坦になる。このようにレファレンス画像に平滑化処理を施すことにより、補正サンプル画像上の微細パターンを示す各シグナルは、より正確な輝度値を示すことになる。

また上記ステップ S 5 , S 6 で、画像処理部 2 0 は、 3 X 3 画素または 5 X 5 画素以外に限らず任意の形状のカーネルを用いて、収縮処理と膨張処理を実行することができる。例として、「微細パターン 4 1 の外接円の最大直径（例えば 2 6画素）以上に相当する画素数」 X 「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネル、例えば 2 7 X 2 7画素からなる円形カーネルを用い、収縮処理と膨張処理を 1 回実行してもよい。このように、所定形状のカーネルを用い、微細パターンを消滅させるのに必要な回数分、収縮処理と膨張処理を実行することにより、レファレンス画像を得ることができる。

以上のように、むらのある励起照明でバックグラウンドが形成される場合は、除算処理が有効である。一方、これに反して、喑電流ノイズや迷光ノイズなどの励起照明以外のノィズで形成される場合には減算処理が有効である。すなわち画像処理部 2 0 は、サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各面素の輝度値を減算することにより、補正サンプル画像を得る。これにより、ノックグラゥンド画像に含まれる不要な暗電流ノイズや迷光ノイズなど PC霞睡 11019

19 の直流ノイズを除去することができる。

本実施の形態によれば、バックグラウンド中に微細パターンが散在するサンプル画像からバックグラゥンド画像のみをレファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像でサンプル画像を補正することにより、サンプル画像に含まれる微細パターンの蛍光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。すなわち本実施の形態の画像処理を実行することにより、生化学検査用アレイ 1 上のプローブアレイ要素 3 内のプローブと溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各プローブアレイ要素 3 ごとに正確に検查することができる。

本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。例えば、説明上、微細ノヽ。ターンの数を 3 5 、このシグナノレの輝度値をすベて同一値 5 0 0 、ノックグラウンドの最大輝度値を 5 0 0 としたが、これらの数値は如何なる値でも良い。また、シグナルごとに輝度値が異なっても良い。

本発明によれば、以下のような作用を奏する。

( 1 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを正確に検出することができる。

( 2 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば.、微細パターンのシグナルが消滅し背景のシグナルのみが表われたレファレンス画像を正確に抽出することができる。

( 3 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微 2003/011019

20 細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。

( 4 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。

( 5 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、短時間の処理で微細パターンのシグナルを確実に消滅させることができる。

( 6 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像に対して照明むらを補正することができる。

( 7 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理で背景画像からノイズを除去することができる。

( 8 ) 本発明の生化学的検查用画像処理方法によれば、レファレンス画像による簡易な処理でサンプル画像を補正することができる。

( 9 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、微細パターンのシグナルをより正確に検出できる。

( 1 0 ) 本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、生化学検査用アレイ上の微小スポット内のプローブとサンプル溶液に含まれる生化学的物質との間に生じる特異的な結合反応を、各微小スポットごとに正確に検査することができる。産業上の利用可能性

本発明の生化学的検査用画像処理方法によれば、サンプル画像に含まれる微細パターンの発光輝度を示すシグナルを、簡易な処理で正確かつ迅速に検出できる。

本発明によれば、レファレンス画像を、従来のように標準反射板を用いて専用の手段で取得する必要がなく、撮り込んだサンプル画像を処理することで取得できる。よって本発明では、サンプル画像を補正するまでの時間が短縮され、専用の手段を用いたときのようにレファレンス画像を取得する際にノイズが混入することもないため、シグナル検出の精度が向上する。

Claims

き求の範囲

1 . 生化学的物質の溶液を、表面に該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記生化学的物質と該生化学的物質に特異的に反応する生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査用の画像処理方法であり、

前記生化学検査用アレイの画像をサンプル画像として撮り込み、前記各プローブアレイ要素から発生した光の強度を示す微細パターンの画像を該サンプル画像から除いた背景画像を、レファレンス画像として抽出し、該レファレンス画像で前記サンプル画像を補正することを特徴とする生化学的検査用画像処理方法。

2 . 前記微細パターンの画像に対して収縮処理を施した後に膨張処理を施すことにより前記レファレンス画像を抽出することを特徴とする請求項 1 に記載の生化学的検査用画像処理方法。

3 . 前記収縮処理及び前記膨張処理は、所定形状のカーネルを用い、前記微細パターンを消滅させるのに必要な回数分実行することを特徴とする請求項 2 に記載の生化学的検査用画像処理方法。

4 . 前記収縮処理及ぴ前記膨張処理は、 3 X 3画素の十字形カーネルを用い、前記微細パターンの外接円の最大半径以上に相当する画素数を処理回数とすることを特徴とする請求項 3 に記載の生化学的検査用画像処理方法。

5 . 前記収縮処理及び前記膨張処理は、「前記微細パターンの外接円の最大直径以上に相当する画素数」 X 「前記外接円の最大直径以上に相当する画素数」画素の円形カーネルを用い、処理回数を 1 とすることを特徴とする請求項 3 に記載の生化学的検查用画像処理方法。

6 . 前記サンプル画像の各画素の輝度値を、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値で除算することにより、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項 1 乃至 5 のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。

7 . 前記サンプル画像の各画素の輝度値から、対応する前記レファレンス画像の各画素の輝度値を減算することにより、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項 1 乃至

5 のいずれかに記載の生化学的検查用画像処理方法。

8 . 前記レファレンス画像の各画素について、（レファレンス画像の最大輝度値/該画素の輝度値）を算出し、その値を対応する前記サンプル画像の各画素の輝度値に乗じて、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項 1 乃至 5 のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。

9 . 前記レファレンス画像に平滑化処理を施し、前記サンプル画像を補正することを特徴とする請求項請求項 1乃至 8 のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。

1 0 . 前記微細パターンの画像は、蛍光標識された多数の微小スポットを有する前記生化学検査用アレイを励起光で照明して得られる蛍光画像であり、前記サンプル画像を補正することにより前記各微小スポットの蛍光輝度を示す信号を検出することを特徴とする請求項 1 乃至 9 のいずれかに記載の生化学的検査用画像処理方法。