JP7057926B1 - 蛍光測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】光源の揺らぎ、信号処理のジッタの問題及び背景光の影響を抑制もしくは除去し、蛍光が散乱光と時間差又は波長差で分離することが困難な場合であっても、高感度でしかも高精度な定量を行う蛍光測定装置を提供する。【解決手段】連続光源２と、励起光照射部３と、励起光強度検出部４と、フォトンカウンティング方式の蛍光検出部５と、連続光源の矩形波変調回路６と、矩形波変調回路に供給する矩形波パルス及び信号処理用のゲートパルスを生成するタイミング回路７と、蛍光の光子パルス信号をゲートパルスの期間に計数するゲートカウンタ回路８と、物理パラメータ情報取得部９と、濃度演算器１０で構成する。この構成でデジタル信号処理し、現在時点のバックグラウンド光子計数換算値を正確にデジタル演算して差し引くことにより、バックグラウンドの影響を適正に除去した高感度で高精度な定量を行える。【選択図】図１

Description

本発明は、極微量な物質の発する蛍光を測定し、高精度な定量が可能な蛍光測定装置に関する。

物質が特定波長の光を吸収して電子励起され、一重項励起状態から基底状態に戻るときに発する蛍光を測定して当該物質の分子情報を得る蛍光分光法は、蛍光標識や蛍光色素を利用する生化学の分野を中心とした科学研究では常套的な分析手法として使用される。また研究用か産業用かを問わず、液体試料の分析法として重要な液体クロマトグラフ装置やキャピラリ電気泳動装置の選択的かつ高感度な検出器として蛍光検出装置が用いられる。しかしながら一般産業分野において、特に希薄なガス態の物質を対象とした分析では吸収分光法に比べて実施例が少なく、一般的となっているのは燃焼施設等の排ガス処理系統に設置される二酸化硫黄分析計くらいである。一つには蛍光分光法は吸収分光法に比べて微弱光の測定となるため、より強い蛍光を得るためには多くの分子を励起するため高輝度の光源を必要とし、光源としては特定波長のレーザ及びキセノンランプに限定されることが原因となっていた。また電子励起状態への遷移確率を高めるため、光のエネルギーを短時間に凝縮させたパルス光を用いるのが普通であるが、これはショット毎の強度のばらつきのみならず、ジッタと呼ばれるパルス光発振の時間位置のばらつきの問題があった。

先に述べた光源の揺らぎに由来するＳＮ比の低下の改善方法として、従来技術の典型的な例では、励起光がセルに入射する手前に半透鏡を配置し、反射した光をフォトダイオード等の検出器で検知する。反射光強度は光源の光強度と比例するため、蛍光の検出器からの出力値を反射光の検出器からの出力値で除して光源変動を補償している。この方法ではセルへの励起光の入射窓の曇りによる影響を受けるといった問題があり、特許文献１では、セルに入射した励起光を捕集して端部に導く光トラップを備え、端部に配置した検出器の出力により補償するようにしている。蛍光光度計に関する特許文献２では、キセノンランプ等の放電ランプによる励起光の一部を分けて受光した検出器の出力をさらに積分器で積分し、得られた出力を用いて蛍光強度の補正を行っている。光源としてパルスレーザを用いる特許文献３でも、類似の補正方法が開示されている。しかしながらこうした光源強度の補正を行っても、パルス発振の光源が元々有する強度揺らぎが大きいため、その影響は十分には解消できず、光源強度の揺らぎに起因する蛍光の信号強度のばらつきは５％程度であるのが通常であった。

エンジンの燃焼状態の可視化でよく用いられるパルスレーザを用いたレーザ誘起蛍光法もしくはレーザ蛍光法装置では、典型的には複数の遅延時間の異なるパルス列を発生するパルス発生器あるいはタイミング回路を用い、レーザの発振をトリガする。蛍光の検出系は、光電子増倍管に前置増幅器を接続し、パルス光発振に応じて物質の蛍光遷移で生成する繰返し光信号の直流電流成分をレーザ発振とはある遅延時間を持ったパルス列でトリガし、ボックスカー積分器あるいはゲート積分回路で積分してノイズに埋もれる微弱信号を抽出し、その電圧出力をＡ／Ｄ変換してＣＰＵもしくはマイクロプロセッサに取込み、物質濃度を計算する。また二酸化硫黄分析計の場合も信号処理はアナログ回路で行っている。このため高感度な測定装置を構築しようとしても、極微弱光に対しては著しく低い直流レベルを検出することとなるので、どうしても感度不足となる問題点があった。またパルスレーザとアナログのゲート積分方式の組合せでは、同一のパルス発生器を使用しても信号処理における時間軸の揺らぎ、すなわちジッタが大きな問題であった。

アナログ回路で構成される蛍光信号の信号処理方式に替え、光電子増倍管からの出力の直流電流成分を電圧に変換するとともに増幅し、アナログ回路で構成される蛍光信号の検出系に替え、光電子増倍管からのパルス信号を直接、計数する光子計数法、この場合特にフォトンカウンティング方式と呼称される光子数に変換する方法が極微弱光の測定に有効とされる。しかしながら強い光を受光する場合には、パルス信号が統計的に１個の光子の事象に対応せず、複数の光子の事象に対応する事象が出現するため、受光強度に従い計数値が飽和してくるというダイナミックレンジの狭さがあったため、直流成分測定方式より一般的ではなかった。

光子計数測光装置に関して、特許文献４に開示された装置では、フォトンカウンティング回路と直流成分測定回路の両方を備え、光電子増倍管のパルス信号を波高弁別をして、波高値により両回路を切り替えることによりダイナミックレンジを拡げているが、切り替えは手動によるものであった。特許文献５で開示された光検出用回路及び検出器では、光電子増倍管の光電陰極への入射光量が所定量より大きいと判定されると、フォトンカウンティング方式からアナログ出力方式に切り替え、光電陰極への入射光量に応じて、隣接する２段のダイノードを同電位にして、二次電子の増倍率を制御することによりダイナミックレンジを拡張している。

特許文献６では、パルス光により励起されて生じた蛍光信号の支配的な時間領域で、そうでない時間領域よりもアバランシェフォトダイオードが好適とされる検出器の増倍率を高くすることにより、散乱光の影響を抑制して極微量の物質を精度よく測定するようにしている。しかしながら蛍光寿命の短い物質では、散乱光の減衰の時間と近くなるため、この方法によって散乱光の影響を抑制するのは困難である。

非特許文献に記述されるように、光子計数方式の適用のため、高圧電源回路、電圧分割回路、光電子増倍管及びフォトンカウンティング回路を一つのモジュールにまとめたフォトンカウンティングヘッドが普及している。一部にゲート回路を内蔵するものもあるが、高速性及び高繰返し性に関しては制限がある。

特開昭５１－９４８８６号公報 特開平８－３０４２８３号公報 特開昭５８－２１１６３１号公報 特公平７－１８７５７号公報 特開２００５－２０７９５５号公報 特開平９－１５９５２７号公報

浜松ホトニクス株式会社著 「光電子増倍管ハンドブック（光電子増倍管 その基礎と応用 第4版）」

極微量の物質の高感度な検出に蛍光分光法を用いるには、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管の使用が有効であるとされ、ダイナミックレンジを拡げる技術が特許文献４及び特許文献５等により開示された。しかしながらダイナミックレンジの制限の問題が重要視されるのは、蛍光光度計等の一部の適用の場合であって、可能性ある産業用途では、多くの場合に必要なダイナミックレンジは４～５桁程度以内であり、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管で得られる光電陰極への入射光子数に比例したパルス信号出力、すなわち応答の直線性の範囲で十分である。蛍光分光法の産業利用を制限する問題はむしろ別な点にあり、蛍光励起に高出力のパルスレーザを始めとするパルス光源の使用を前提としていることが問題である。パルスレーザは短時間のパルスに非常に高いエネルギーを圧縮しているため、強度の揺らぎ、パルス幅の揺らぎ、並びにパルス発振のジッタが無視できず、高感度ではあっても高精度とするには多くの追加の技術を要する。パルスレーザは入手可能な波長帯域が限られており、また装置が大型化し、高コストでもある。さらに瞬間的に高い光量で発振するため、励起光の検出領域での散乱光を蛍光と分離するため、主体となる時間領域で分離するか、波長領域で分離するかの手段が必ず必要となるが、蛍光寿命の短い物質あるいは励起光と蛍光の波長差、すなわちストークスシフトが小さい物質では分離が困難となるといった問題がある。蛍光強度に与えるパルス光源の強度の揺らぎの影響を補正する方法としては、特許文献１、特許文献２及び特許文献３等が開示されており、パルス光源を用いる際の散乱光の影響を抑制する方法としては、特許文献３等が開示されている。しかしながらこうした補正を行っても、パルス発振の光源が元々有する強度揺らぎが大きいためにその影響は十分には解消できず、高感度な方法ではあっても、高精度な定量方法とはならなかった。また先行技術では、背景光の影響について、その影響を定量的に評価し、適正な補正を行うことができなかったが、その原因としては、そもそも背景光そのものを詳細に解析していない、並びに信号処理がアナログ方式のために背景光の影響を除去するための演算式を搭載しにくいということが挙げられる。

本発明は、光源の揺らぎ、信号処理のジッタの問題及び背景光の影響を抑制もしくは除去し、蛍光が散乱光と時間差又は波長差で分離することが困難な場合であっても、高感度でしかも高精度な定量を行う蛍光測定装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明は、 測定対象物質の励起光を発生する連続光源と、試料を導入し、前記連続光源からの励起光を照射する励起光照射部と、励起光強度と比例する光量を検出し、デジタル信号に変換する励起光強度検出部と、測定対象物質が発する蛍光をフォトンカウンティング方式で検出する蛍光検出部と、前記連続光源を点灯及び消灯状態に対応する矩形波で変調する矩形波変調回路と、同一のクロックにより、前記矩形波変調回路に供給する矩形波パルス及び信号処理用のゲートパルスを生成するタイミング回路と前記蛍光検出部からの1光子に対応するパルス信号を、所定時間内において前記ゲートパルスの期間に計数するゲートカウンタ回路と、前記測定対象物質の濃度を演算する際に必要とする、現在時点の物理パラメータ値を取得する物理パラメータ情報取得部と、前記ゲートカウンタ回路で得られた現在時点の光子計数値から、現在時点のバックグラウンド光子計数換算値を差し引きして、バックグラウンドの影響を除いた蛍光光子計数値を求め、得られた前記蛍光光子計数値を、前記励起光強度検出部で測定された現在時点の励起光強度計測値と、濃度校正時に測定された励起光強度基準値との、比として表される励起光強度補正係数で除することにより、励起光強度補正蛍光光子計数値を算出し、さらに前記励起光強度補正蛍光光子計数値を、前記濃度校正時に求めた濃度当りの蛍光光子計数値として表される前記測定対象物質の濃度係数で除することにより、前記測定対象物質の濃度をデジタル演算する濃度演算器とを備え、前記濃度演算器における前記バックグラウンド光子計数換算値は、前記励起光強度補正係数に依存しない定数項と前記励起光強度補正係数に比例する比例項との線形結合であるとして、予め保管した前記濃度校正時における前記測定対象物質を含まない試料で測定した基準バックグラウンド光子計数値並びに関連する基準物理パラメータ値、前記物理パラメータ情報取得部で取得した現在時点の前記物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算することを特徴とする。

上記のように構成された本発明の蛍光測定装置によれば、極微量の物質を検出可能な高い感度で、頻繁な校正を要せずに、測定対象物質を精密かつ正確に定量することができる。

しかも本発明では、必ずしも光源の高いコヒーレント性を要せず、比較的安価な連続光源を用い、デジタル信号処理を主体に構成することから、低コストでコンパクトな蛍光測定装置を提供することができる。

実施形態に係る蛍光測定装置の一例を示す概念的な構成図 実施形態に係る蛍光測定装置を構成する濃度演算器における演算方法の一例を示す流れ図 実施形態に係る濃度演算器におけるバックグラウンド光子計数換算値を計算する手順１の一例を示す流れ図 実施形態に係る濃度演算器におけるバックグラウンド光子計数換算値を計算する手順２の一例を示す流れ図 実施形態に係る濃度演算器におけるバックグラウンド光子計数換算値を計算する手順３の一例を示す流れ図 実施形態に係る濃度演算器におけるバックグラウンド光子計数換算値を計算する手順４の一例を示す流れ図 実施形態に係る濃度演算器における、試料中に測定対象物質の消光物質が存在する場合の濃度計算方法の一例を示す流れ図

本発明の連続光源は、安定な連続光を発光することが可能な光源を指し、一般にＣＷ光源とも称するが、本発明の場合は当該連続光源を一般的なパルスレーザの発振周波数より高い周波数で矩形波変調して使用する。典型的にはＹＡＧレーザ励起色素レーザのような元来のパルス発振の光源とは区別するため、元の発光形態から連続光源と呼称するものとする。複数の励起波長帯を時間的に切換えて使用する場合、連続光源の個数は複数であってもよい。

本発明の測定対象物質は、光源からの励起光により蛍光を発生する物質であって、媒質が気体又は液体の試料中に存在する物質を指す。典型的には媒質が気体の場合には気体の状態で存在している物質、媒質が液体の場合には液体の状態で存在している物質であるが、媒質が気体又は液体であって、微粒子もしくは微小な集合体として存在する場合であってもよい。測定対象物質そのものは蛍光を発しないもしくは蛍光が微弱な物質であっても、蛍光プローブ、蛍光標識剤もしくは蛍光染色剤との反応により、生成物もしくは修飾物が蛍光を発し、生成物もしくは修飾物の蛍光を測定する場合であってもよい。また連続光源の複数の励起波長帯を切換えて使用する場合、測定対象物質は同数の複数であってよく、測定を行いたい物質ではないが蛍光を発する干渉物質も、測定対象物質に含めるものとする。

本発明のフォトンカウンティング方式は、光子計数方式と同義であって、光子計数法を実現できる方式を指し、ここではフォトンカウンティング方式、光子計数方式及び光子計数法は特段の区別はなく、同義として扱う。

本発明の矩形波パルスは、ゲートパルスとの区別のため、連続光源を矩形波変調するための、タイミング回路で生成する矩形波のパルスのみを指すものとする。連続光源の複数の励起波長帯を時間的に切換えて使用する場合、各励起波長帯に対応する同数の異なる矩形波パルスを生成する。

本発明のゲートパルスは、ゲートカウンタ回路の信号処理においてゲートを掛けるための、タイミング回路で生成する矩形波のパルスを指し、区別のためゲートパルスと呼称するものとする。連続光源の複数の励起波長帯を切換えて使用する場合、各矩形波パルスに対応する、すなわち各励起波長帯に対応する同数の異なるゲートパルスを生成する。

本発明のゲートカウンタは、ボックスカー積分器に代表されるアナログ信号のゲート積分方式と対比させる目的で定義され、フォトンカウンティング方式の蛍光検出部から入力する１光子に対応するパルス信号を、タイミング回路で生成したゲートパルスを掛けた期間だけカウンタで計数し、所定時間内の積算を行う方式を指すものとする。デジタル回路で演算するのでデジタルゲート積分方式とも言える。

本発明のバックグラウンドは、総じて背景光とも呼称される信号から蛍光を除いたバイアス成分を指し、一般的に迷光と呼ばれる不必要な光、蛍光検出部の熱的に発生したノイズである暗計数率（ダークカウント）、試料の媒質中に含まれる測定対象物質以外の主要成分物質によるレーリー散乱光、試料中に強いラマン活性を有する成分が多量に含まれる場合の当該成分による自然ラマン散乱光が含まれる。測定対象物質そのものは蛍光を発しないもしくは蛍光が微弱な物質であって、蛍光プローブ、蛍光標識剤もしくは蛍光染色剤との反応により、生成物もしくは修飾物が蛍光を発し、生成物もしくは修飾物の蛍光を測定する場合、すなわち測定対象物質を蛍光標識化し、蛍光標識化生成物の蛍光を測定する場合は、測定対象物質もしくは測定対象物質含有物による自家蛍光も含まれる。また一般には媒質中の粒子態成分は事前に除去されているか、影響を受けないような処理を経ているため、ミー散乱は含まないものとして扱ってよい。迷光は室内光、励起光照射部外部の反射並びに屈折による励起光の散乱光、及び励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光を含むが、励起光照射部の構造を室内光、励起光照射部外部の反射並びに屈折による励起光の散乱光が侵入しないようにしているため、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光が中心となるが、これらが蛍光検出部に到達しないような内部構造を案出することにより低減できる。励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光及びレーリー散乱光は、蛍光寿命が長く、連続光源を点灯から消灯に転じた後に、遅延ゲートを掛けて蛍光信号を取得すれば、先ず時間的に分離することが可能であるが、現実には蛍光寿命は短く、時間的に分離できないか、あるいは分離できても負荷周期が非常に小さいために感度が得られない場合の方が多い。また蛍光スペクトルの波長が励起光の波長より十分に長波長側に延びている場合でも、分光器のような分光素子を利用して、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光及びレーリー散乱光と蛍光を波長で分離する場合、実際の蛍光の収集効率は非常に小さくなる。分光器に換えてバンドパスフィルタ等を使用した場合でも、バンドパスフィルタの中心波長及び半値全幅の使用上では分離できることになっていても、透過スペクトルの裾野は％以下のオーダーで観ると広く、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光及びレーリー散乱光を完全に遮断することはできず、微量濃度の測定では無視できない。単色性のレーザに換えＬＥＤを連続光源として使用する場合、結果として励起波長自体に幅があることになり、励起波長帯の長波長側の裾が蛍光波長と重複することになるので、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光及びレーリー散乱光の影響は大きくなる。自然ラマン散乱光は微弱であって気体の場合には無視しうるが、液体試料の場合であって、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光及びレーリー散乱光の影響がよく分離されている場合には、自然ラマン光の影響を考慮すべき場合がある。

本発明のタイミング回路の矩形波パルス及びゲートパルスの１周期は、複数の励起波長帯を順次切換えて使用する場合も想定し、共通のクロックに基づく同一の周期であり、各励起波長帯に対応する矩形波パルスの点灯開始時点から起算して、当該励起波長帯に対応する矩形波パルスの次回の点灯開始時点までの期間を指す。同様に対応する各ゲートパルスの関しても、ゲート開始時点から起算して、当該励起波長帯に対応するゲートパルスの次回のゲート開始時点までの期間を指すものとする。

本発明の励起波長帯は、連続光源の発光スペクトルの範囲内で、実際に測定対象物質の電子励起に使用する波長範囲もしくは波長帯域を指す。

本発明の矩形波パルスの点灯状態は、対応する励起波長帯の連続光源の点灯状態に対応するデジタル値が保持されている状態を指し、通常は論理１状態が設定されるが、論理０状態を設定してもよく、この場合は消灯状態が論理１状態となる。矩形波パルスの点灯状態開始時点は連続光源の点灯開始時点と等しく、矩形波パルスの点灯状態終了時点は連続光源の点灯終了時点と等しい。

本発明のゲートパルスのゲート状態は、ゲートカウンタ回路における対応する励起波長帯における光子数のためのゲートが掛かっている状態に対応するデジタル値が保持されている状態を指し、通常は論理１状態が設定される。ゲートパルスのゲート状態開始時点はゲートの開始時点と等しく、ゲートパルスのゲート状態終了時点はゲートの終了時点と等しい。

本発明の物理パラメータは、濃度演算器での測定対象物質の濃度の演算に用いる試料の特定の物理パラメータを指し、バックグラウンドの寄与項を計算するのに用いる励起光強度以外の物理パラメータ、例えば気体試料であれば圧力、温度、湿度、あるいは測定対象物質以外の特定の成分の濃度を含み、用いる詳細な演算式により異なる。用いる物理パラメータ値は、本発明の蛍光測定装置自体で計測したものであっても、別の装置により取得したデータを取り込んだものであっても、あるいは別途の方法により推算したものであってもよい。

本発明の濃度係数は、濃度校正において得られる濃度当りの蛍光光子計数値、すなわち光子計数法で測定する蛍光強度を指す。濃度校正においては、測定対象物質を含まない濃度ゼロを含む濃度の異なる数点以上の標準試料を測定し、調製濃度に対して蛍光光子計数値をグラフ上にプロットし、直線近似で求めた傾きが濃度当りの蛍光光子計数値、つまり濃度係数となる。直線近似は濃度ゼロの実測値を固定し、つまりその点を通過する直線として近似する。

本発明の基準バックグラウンド光子計数値は、濃度校正における測定対象物質を含まない濃度ゼロの場合の蛍光光子計数値を指す。これは濃度校正の直線近似の切片となるが、切片の値に自由度を与えるのでなく、実測値で固定する。

本発明の基準物理パラメータ値は、濃度校正時に測定された、もしくは他の装置等で測定された、あるいは適切な手段により推算された物理パラメータの値を指す。

本発明の励起光強度基準値は、濃度校正時に励起光強度検出部で測定された励起光強度の値を指す。

本発明の励起光強度補正係数は、励起光強度検出部で測定された現在時点の励起光強度計測値と励起光強度基準値の比を指す。すなわち励起光の相対強度を表す。

本発明のバックグラウンド光子計数換算値は、便宜的な定義であって、励起光強度補正係数に依存しない定数項と励起光強度補正係数に比例する比例項との線形結合であるとして、予め保管した濃度校正時における測定対象物質を含まない濃度ゼロの試料で測定した基準バックグラウンド光子計数値並びに関連する基準物理パラメータ値、現在時点の物理パラメータ値、及び励起光強度補正係数を用いて計算する現在時点のバックグラウンド光子の推算値である。現在時点において、バックグラウンド光子そのものを直接に計数するわけではないため、換算値と呼称している。

本発明の蛍光光子計数値は、便宜的な定義であって、ゲートカウンタ回路で得られた現在時点の所定時間内の光子計数値から現在時点の所定時間内のバックグラウンド光子計数換算値を差し引きして得られる値であって、バックグラウンドの影響を除いた蛍光のみの寄与に相当する計数値を指す。

本発明の励起光強度補正蛍光光子計数値は、便宜的な定義であって、蛍光光子計数値を励起光強度補正係数で除して得られる値を指す。

本発明の無消光励起光強度補正蛍光光子計数値は、便宜的な定義であって、消光物質が存在して蛍光強度が減少している場合に、Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒの関係式により外挿して得られる消光物質濃度ゼロ、すなわち無消光の励起光強度補正蛍光光子計数値を指す。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。図１に示すように、本発明の蛍光測定装置１は、連続光源２、励起光照射部３、励起光強度検出部４、蛍光検出部５、矩形波変調回路６、タイミング回路７、ゲートカウンタ回路８、物理パラメータ情報取得部９及び濃度演算器１０を備える。この構成により、適正に光子計数法を適用してジッタの少ないデジタル信号処理とし、背景光の寄与を適正な演算式で演算して差し引くことにより、測定対象物質の高感度かつ高精度な定量を行うことができる。

連続光源２は、測定対象物質を電子励起することが可能な波長の連続光源である。測定対象物質の励起波長に応じて、例えば深紫外ＬＥＤ、紫外ＬＥＤ、可視ＬＥＤ、近赤外ＬＥＤ、紫外半導体レーザ、可視半導体レーザ、及び近赤外半導体レーザ等が挙げられる。これらは点灯の立ち上がり時間及び立ち下がり時間がほぼ５０ｎｓ以下であり、実用的に変調が可能である。安定性については仕様上の統一された規定がないことが多いため、特に定めるものではないが、一般的なＬＥＤ及び半導体レーザは、前者は電圧、後者は電流による発振の制御が可能であって、放電現象に基づくキセノンアークランプや重水素ランプと異なり、十分な発光強度の安定性を有する。また単色性すなわち発振のスペクトル線幅については、測定対象物質により異なるが、必ずしも狭いことを要しない。半導体レーザでは、狭いスペクトル線幅で単一発振波長の分布帰還型半導体レーザのみならず、比較的狭い帯域で複数の波長の発振線を有するファブリー・ペロー型半導体レーザを使用することもできる。むしろ発振波長の安定性については、狭いスペクトル線幅で単一発振波長の分布帰還型半導体レーザの方が光源素子のより精密な温度制御を要する。なおＬＥＤの場合も発光強度及びその安定性には素子の温度が影響するため、半導体レーザを適用する場合と同様、素子に接する放熱フィンブロックを配置し、さらにペルチェ素子を配して、少なくとも０．１℃以内の精密度の温度制御を行うことができる。また発光スペクトルの特定の波長帯域を切り出すバンドパスフィルタや、光束を効率的に利用して励起光照射部の特定の観測領域に集光するためのレンズ光学系については、連続光源２の放射特性に合せて最適化するものとする。連続光源２は、実際には矩形波変調がなされて矩形波パルスの励起光を発生するが、矩形波変調の詳細は矩形波変調回路６において説明する。

連続光源２において、測定対象物質の励起のために半導体レーザ程度の狭い発振スペクトル線幅を要しない場合は、半導体レーザよりも強度安定性の優れるＬＥＤが好ましい。高精度なデジタル信号処理では、レーザのコヒーレント性よりも、その一方での微視的な波長安定性の問題があり、比較的広い波長帯域のＬＥＤの方が、総合的に励起光強度の安定性の点で有利になるからである。

励起光照射部３は、媒質が気体又は液体である試料を連続的又は間欠的に導入し、連続光源からの励起光を照射する。合成石英製の窓板もしくは入射窓、あるいはその他の入射光を透過する材質の窓を通して、励起光照射部の試料通過箇所に集光された励起光を吸収した試料中の測定対象物質分子は、基底状態から電子励起状態に励起される。電子励起状態の測定対象物質分子のある一定の割合は、基底状態に戻るときに特定の波長領域の蛍光を発する。なお励起光の励起光照射部への導入は、窓板を通さずに気密状態を保つフランジを通じて挿入する光ファイバを用いることができる。また蛍光の収集効率を増大するため、励起光の入射光軸を挟んで蛍光検出部に対向する壁面を電解研磨もしくは電解研磨と機械研磨の複合研磨を施したアルミ合金とすることにより、入射光軸の背後の方向に発生された蛍光を反射させて蛍光検出部に導くことができる。媒質が気体である試料の場合には、常套的に励起光照射部の圧力は０．１５ｋＰａ以上かつ１３ｋＰａ以下程度の範囲内の、測定対象物質に依存する最適な圧力に設定して圧力制御を行うことができる。最適圧力は分子数による励起分子数の増大と媒質分子による蛍光消光効果との得失により決まる。励起光照射部内部は、励起光の屈折及び反射による散乱光が蛍光検出部に直接到達するのを防ぐため、励起光の光束の周縁部を除去し、観測領域での集光がなされるよう、段階的に開口径を絞ったスキマーもしくはオリフィスを励起光の光路に沿って配置することができる。励起光照射部内壁は測定対象物質が吸着するのを防止するため、適切な不活性材料で構成されるか、不活性な塗膜もしくは表面処理を施し、さらに励起光の壁面での散乱を抑制するような塗膜もしくは表面処理を施すことができる。吸着防止効果と散乱抑制効果を両立する処理は得ることが難しいため、全ての壁面を同一の材料、塗膜もしくは表面処理で覆うのではなく、どちらを重視すべき場所であるかに応じて使い分ける。不活性な材料もしくは不活性な表面処理を施した材料としては、例えばポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、電解研磨と機械研磨との複合での研磨を施したステンレス鋼、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂コーティングを施した電解研磨ステンレス鋼、及び水素化アモルファスシリコンを化学蒸着し、さらにアルキル基を結合させる不活性化処理を施した電解研磨ステンレス鋼などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、またこれらの表面処理は表面の平滑化を伴うため、励起光を散乱しやすい場合もある。励起光の散乱抑制効果の高い表面処理としてはアルミ合金の梨地処理の上に施す黒塗りアルマイト処理などが代表的である。特に測定対象物質が吸着しやすい物質である場合には、励起光照射部筐体を１０５℃以上に温度制御して、吸着の影響を最小とすることができる。

励起光強度検出部４は、励起光照射部３の内部又は連続光源から励起光照射部３までの間の外部の光路における反射もしくは屈折による励起光の散乱光の光量か、励起光照射部３の透過光の一部の光量の少なくともいずれか一方を測定する。励起光の散乱光の場合及び透過光の測定の場合において、一部の光量としているのは、元の励起光の強度と完全に比例関係があることが事前に確認されていれば、必ずしも全光量の測定でなくてもよいためである。励起光強度検出部４で用いる光量の検出器は、特に限定するものではないが、一般的には直線性の優れたシリコンフォトダイオードが使用される。検出器への入射光量と比例して光電流が生成するので、これを電流－電圧変換してＡ／Ｄ変換回路に取込み、デジタル信号に変換して所定時間の平均を採り励起光強度計測値とする。これにより元の励起光の短時間での揺らぎ及び長期的な強度変化を監視することができる。なお励起光強度検出部４のＡ／Ｄ変換回路には、バックグラウンド計数換算値の計算に用いる物理パラメータ、代表的には励起光照射部での試料の圧力及び温度等を当該蛍光測定装置１の内部で計測している場合には、それらの計測値を入力してデジタル値に変換することも含む。Ａ／Ｄ変換回路は独立の専用基板、Ａ／Ｄ変換ボード、Ａ／Ｄ変換カードで実現できる他、ＦＰＧＡボードに機能ブロックとして回路が搭載されている場合がある。

蛍光検出部５は、励起光照射部３の内部空間においての測定対象物質の分子の電子励起状態から発する蛍光を、フォトンカウンティング方式で検出する。フォトンカウンティング方式を実現する検出器としては、電流出力型光電子増倍管とアンプ/ディスクリミネータの組合せ、フォトンカウンティングヘッドと呼称される光電子増倍管、フォトンカウンティング回路及び高圧電源が一体のモジュール、ＭＰＰＣ（マルチピクセルフォトンカウンタ）と呼称される複数のガイガーモードＡＰＤ（アバランシェ・フォトダイオード）が平面上に配置された固体素子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛍光検出部では励起光照射部の窓板もしくは励起光照射部窓より蛍光を通過させ、検出器の前に集光レンズ群、アパーチャあるいは光学ガイド、励起光波長と区別するために検出する蛍光波長領域を選択するための光学素子等を、測定対象物質、励起波長帯域、及び検出する蛍光波長領域に従って、適切に個数並びに順番を組合せて配置する。検出する蛍光波長領域を選択するための光学素子としては、ロングパスフィルタ、バンドパスフィルタ、分光器、音響光学波長可変フィルタ、及びこれらの組合せ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

矩形波変調回路６は、タイミング回路７で生成した論理０状態及び論理１状態の繰り返しで生成する矩形波パルスのパルス列に基づき、点灯が維持される高状態及び消灯に対応する低状態に対応する直流電圧又は直流電流を矩形波で連続光源２に供給する。論理０状態に低状態、論理１状態に高状態が対応する組合せであっても、その逆の論理１状態に低状態、論理０状態に高状態が対応する組合せであってもよい。高状態は連続光源が安定して点灯し、十分な励起光強度が得られ、かつ連続光源の寿命を著しく短縮、あるいは熱発生による影響が生じない程度の電圧もしくは電流を設定する。一方、低状態はＬＥＤの場合には完全に電圧０Ｖに落としてよいが、半導体レーザの場合には立ち上がり時間の問題並びにチャープと呼称される素子の熱歪みによる周波数変化の問題を軽減するため、発振の閾値を多少下回る程度の０ｍＡでない低電流を設定するのが一般的である。矩形波変調はＬＥＤの場合には直流電圧、半導体レーザ等の場合には直流電流で行う。

タイミング回路７は、論理０状態及び論理１状態の繰り返しとなる矩形波変調回路６に供給する矩形波パルスを生成すると共に、同一のクロックにより、信号処理用のゲートパルスを生成する。クロックの周波数は、例えばＦＰＧＡボードの内部クロックを分周して得られる商用電源周波数の頓倍でない周波数として、商用電源ノイズの影響を除去することができる。ＦＰＧＡの多くはフェーズロックループ（ＰＬＬ）か、ディレイロックループ（ＤＬＬ）と呼称される専用のクロック分散遅延を削減する回路が搭載されており、ＰＬＬ及びＤＬＬは周波数合成の機能も標準で備え、奇数分周も容易にできるため、商用電源周波数の頓倍でない周波数を設定することができる。またクロックの周波数は、ゲートパルスで設定するゲートカウンタ回路８での１周期のゲートの間の背景光を除いた蛍光のみに由来する光子の計数値が、０．０００５～２００個／ゲートの範囲となるようにし、かつ測定の負荷周期を可能な限り大きくするように設定することができる。単一又は複数の連続光源により複数の励起波長帯を時間的に順次切換えて用い、典型的には励起波長帯の数と同数の測定対象物質を測定する場合においては、クロックの周波数は、各励起波長帯に対応する各ゲートパルスで設定するゲートカウンタ回路８での各励起波長帯に対応する１周期のゲートの間の背景光を除いた蛍光のみに由来する光子の計数値が、０．０００５～２００個／ゲートの範囲となり、しかも測定の負荷周期を可能な限り大きくするように設定することができる。

タイミング回路７における矩形波パルスは、当該矩形波パルスの点灯状態開始時点が、直前の周期のゲートパルスのゲート状態終了時点か又は直前の矩形波パルスの点灯状態終了時点に測定対象物質の蛍光寿命を加算した時点かの、いずれか遅い時点より遅いか又は等しいように、しかも点灯状態時間幅が、ゲートカウンタ回路８でのゲートの間の蛍光由来の光子の計数値に関する０．０００５～２００個／ゲートの範囲内で、蛍光が検出可能となるのに十分な測定対象物質の電子励起状態の分子を得るに足るように設定することができる。単一又は複数の連続光源２により複数の励起波長帯を時間的に順次切換えて用い、典型的には励起波長帯の数と同数の測定対象物質を測定する場合においては、各励起波長帯での連続光源２の点灯に関わる各矩形波パルスは、当該矩形波パルスの点灯状態開始時点が、直前の励起波長帯に対応するゲートパルスのゲート状態終了時点か、又は直前の励起波長帯に対応する矩形波パルスの点灯状態終了時点に直前の励起波長帯における蛍光に寄与する全ての測定対象物質の蛍光寿命のうち最長の蛍光寿命を加算した時点かの、いずれか遅い時点より遅いか又は等しいように、しかも当該矩形波パルスの点灯状態時間幅が、ゲートカウンタ回路８での当該励起波長帯に対応するゲートの間の蛍光由来の光子の計数値に関する０．０００５～２００個／ゲートの範囲内で、蛍光が検出可能となるのに十分な測定対象物質の電子励起状態の分子を得るに足るように設定することができる。

タイミング回路７におけるゲートパルスは、ゲート状態開始時点が当該励起波長帯の連続光源２が点灯して出力が安定化する時点よりも遅く、しかもゲート状態終了時点が当該矩形波パルスの点灯状態終了時点より遅いか又は等しく設定することができる。単一又は複数の連続光源２により複数の励起波長帯を時間的に順次切換えて用い、典型的には励起波長帯の数と同数の測定対象物質を測定する場合においては、各励起波長帯に対応するゲートパルスは、ゲート状態開始時点が当該励起波長帯の連続光源が点灯して出力が安定化する時点よりも遅く、しかもゲート状態終了時点が当該矩形波パルスの点灯状態終了時点より遅いか又は等しく設定することができる。

ゲートカウンタ回路８は、蛍光の光子１個に対応する蛍光検出部からのパルス信号を、蛍光が主体となる時間領域において、タイミング回路７で発生したゲートパルスを入力してゲートを掛け、ゲート期間におけるパルス信号の発生回数を計数することで、所定時間内の光子数を積算して計数する。

タイミング回路７及びゲートカウンタ回路８は、ＦＰＧＡを搭載するFPGAボードで構成することができ、市販されるＦＰＧＡボードはさらに、以下に説明する濃度演算器１０を構成するメモリとしてのＳＳＤ（半導体ドライブ）及びマイクロコンピュータを搭載している場合がある。また機能ブロックとしてＡ／Ｄ変換回路が搭載されている場合もあり、励起光強度検出部４のＡ／Ｄ変換回路を構成することができる。なおFPGAは、フィールドプログラマブルゲートアレイとも呼称される、使用者が論理回路の接続構成を変更して自由にプログラミング可能な集積回路もしくは集積回路のチップを指す。従来、高感度なフォトンカウンティング方式で蛍光測定を行うためには、タイミング回路７と同等の機能として、独立のパルス発生器もしくは遅延パルス発生器を用いて、ボックスカー積分器を用いるか、タイミング回路７及びゲートカウンタ回路８を兼ねるタイマ／カウンタボード等を用いるのが一般的であったが、これらの駆動にはマイクロコンピュータ及び適用毎にソフトウエアが必要で、ハードウエアが冗長で装置の小型化に適さず、ハードウエア間を配線しなければならなかった。またハードウエアが分散しているため、負荷周期歪みによるジッタが問題であったが、ハードウエア言語で駆動し、並列処理に優れる集積化されたＦＰＧＡボードの使用によりジッタを容易に制御できる。タイミング回路７及びゲートカウンタ回路８を構成するための、ＦＰＧＡと対抗する半導体集積回路としては、特定用途向け大規模集積回路（ＡＳＳＰ）及びカスタム化大規模集積回路（ＡＳＩＣ）があるが、蛍光測定用に汎用品があるわけではなく、開発に膨大な経費が掛かる。

物理パラメータ情報取得部９は、測定対象物質の濃度の演算において必要とされる現在時点の試料の特定の物理パラメータ値を取得する。特定の物理パラメータは、バックグラウンドの寄与項を計算するのに用いる励起光強度以外の物理パラメータ、例えば気体試料であれば圧力、温度、湿度等であって、測定対象物質以外の特定の成分の濃度も含み、用いる詳細な演算式により異なる。用いる物理パラメータ値は、本発明の蛍光測定装置自体で測定したものであっても、別の装置により取得したデータを取り込んだものであっても、あるいは別途の方法により推算したものであってもよい。従って物理パラメータ情報取得部９の様態は、その取得方法により異なる。

濃度演算器１０は、図２のステップＳ０１～Ｓ０８に示すように、予め濃度校正を行い、濃度当りの蛍光光子計数値として表される測定対象物質の濃度係数を求め、同時に濃度校正時における測定対象物質を含まない試料で測定した基準バックグラウンド光子計数値、並びに関連する基準物理パラメータ値、さらに濃度校正時に励起光強度検出部４で得られた励起光強度基準値をメモリに保管しておく。ここでの標準ガスによる濃度校正は年１回、あるいは半年に１回程度の保守点検時に行うことを前提としている。現在の測定については、ゲートカウンタ回路８で得られた現在時点の所定時間内の光子計数値から現在時点の所定時間内のバックグラウンド光子計数換算値を差し引きし、得られた蛍光のみの寄与である蛍光光子計数値を、励起光強度検出部４で得られた現在時点の励起光強度計測値と、保管された励起光強度基準値との比として表される励起光強度補正係数で除して、励起光強度補正蛍光光子計数値とする。得られた励起光強度補正蛍光光子計数値を、さらに保管された測定対象物質の濃度係数で除することにより、測定対象物質の濃度をデジタル演算する。すなわち測定対象物質の濃度Ｃの演算式は、ゲートカウンタ回路８で得られた現在時点の所定時間内の光子計数値Ｉｐ、現在時点の所定時間内のバックグラウンド光子計数換算値Ｂ、現在時点の励起光強度Ｉ、濃度校正時の励起光強度基準値Ｉ０、励起光強度補正係数ｆｅ、蛍光光子計数値Ｉｆ、励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ、濃度の基準校正時の濃度係数ａとすると、以下の式（１）で表される。ここに励起光強度補正係数ｆｅは式（２）で定義される。

ここで濃度演算器１０における測定対象物質の濃度Cの演算で使用するバックグラウンド光子計数換算値は、以下の手順１により計算する。すなわち励起光強度補正係数に依存しない定数項と励起光強度補正係数に比例する比例項との線形結合であるとして、予め保管した濃度校正時における測定対象物質を含まない試料で測定した基準バックグラウンド光子計数値並びに関連する基準物理パラメータ値、物理パラメータ情報取得部９で取得した現在時点の物理パラメータ値、及び励起光強度補正係数を用いて計算する。手順1では、定数項及び比例項が何に起因するものかは問わず、予め濃度校正におけるゼロ校正の際に能動的に連続光源２の励起光強度を変えてバックグラウンド光子計数値を求め、直線近似で得られる切片及び傾きから便宜的に定数項と比例項を定義する。物理パラメータは比例項に影響を与えるものとして、温度あるいは圧力のような単純な物理パラメータを採れば、励起光強度を固定して、物理パラメータの値を変えることにより、近似的に物理パラメータ関数としての演算式が求まる。多くの場合、こうした物理パラメータは制御されているか、そもそも変動の微小な系としており、感度解析を行った場合のバックグラウンド光子計数換算値に与える影響は、励起光強度の変動による影響に比べて無視しうるので単純な演算となる。従来、背景光もしくはバックグラウンドは、十分に抑制されたものとして無視するか、アナログ計測値としてアナログ回路で差し引きするという方法が主流であった。しかしながら差し引きするバックグラウンドの定義が不明確であり、種々の特性のバックグラウンドがあるにも関わらず、一括してバックグラウンドとして扱ってきた。しかしながら、例えば媒質が空気である試料であり、ｐｐｂ及びそれ以下の濃度の物質を測定する場合であって、蛍光の波長領域が励起光の波長に非常に近い場合、窒素及び酸素によるレーリー散乱の寄与は無視できない程度大きい。レーリー散乱の散乱断面積は物質により固有の数値を持ち、分子数すなわち濃度と比例するため、励起光照射部内の試料気体の圧力及び温度と相関し、また励起光強度もしくは励起光強度補正係数と比例する。バックグラウンドの原因となるものには、励起光強度に比例する成分と固定値となる成分があるが、アナログ回路では一括して固定値として扱わざるを得ない。本発明ではデジタルの信号処理を採用し、基準バックグラウンド光子計数値、基準物理パラメータ値、現在時点の温度、圧力等の物理パラメータ値及び励起光強度補正係数より、正確に現在時点のバックグラウンドの寄与を計算することにより、高感度かつ高精度な濃度測定を行える。現在時点のバックグラウンドの寄与の計算値は、ここでは区別のためバックグラウンド光子計数換算値と称するものとする。上記で説明した手順１は図２のステップＳ０２及びＳ０３の第一の詳細の手順であって、図３のステップＳ１００～Ｓ１０7に該当する。

上記手順１で計算する現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの演算式の一例を以下に示す。ただし以下は一例であって、これに限るものではない。基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、式（３）のように励起光強度基準値に依存しない定数項ｂ、及び励起光強度補正係数ｆｅに比例する比例項の基準値ｍ０の総和で構成されるとして、濃度校正時に求めた各項の値を保管する。次に現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂは、保管された基準バックグラウンド光子計数値の定数項ｂ、励起光強度補正係数ｆｅに比例する比例項Mで構成される。比例項Mは、比例項の基準値ｍ０と、保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、及び現在時点の物理パラメータ値Ｐｊを用いた物理パラメータ規格化関数Ｎｍ（Ｐｊ，Ｐｊ０）と、励起光強度補正係数ｆｅの積として計算される。現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの演算をまとめると式（４）のようになる。物理パラメータ規格化関数Ｎｍ（Ｐｊ，Ｐｊ０）は、物理パラメータとして何を使用するかにより関数形は異なるが、励起光照射部３の温度及び圧力が精密に制御され、試料中の測定対象物質以外の組成が変化しないと見做される場合には、式（５）のように１に等しいとして扱うことができる。なお添字の０は基準状態すなわち濃度校正時の説明変数であることを表し、以降の段落においても同義である。また物理パラメータ規格化関数とは、基準状態と現在状態で物理パラメータの値が異なることにより比例項の計算に際して補正を行う必要があるため、その補正を補正係数の形式で表すための便宜的な概念であり、以降の段落においても同義で扱う。

濃度演算器１０における濃度係数値、基準バックグラウンド光子計数値並びに関連する基準物理パラメータ値、及び励起光強度基準値を保管するメモリは、ＦＰＧＡボードを用いる場合、ＦＰＧＡチップ自体にもメモリブロックが存在するが、ＳＳＤが搭載されることが多い。大容量の外部記憶装置が必要となる場合には、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、ＵＳＢメモリ、ＳＤカード、ＳＳＤ等がある。ただし処理速度が速いため、ＳＳＤが一般的である。

一般に物理パラメータ情報取得部９において取得する物理パラメータ値が比較的大きく変動する、あるいは長期的にみると変動する場合には、濃度演算器１０における演算で用いる基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０及び現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂは、次のような手順２で演算するのが好ましい。先ず基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、励起光強度基準値に依存しない定数項ｂ、励起光照射部３での反射並びに屈折による基準励起光散乱寄与項Ｓ０、及び試料媒質中の主要成分で、かつレーリー散乱断面積が大きくレーリー散乱の寄与が無視できない成分ｉによる基準レーリー散乱寄与項Ｒｉ０の各項の総和で構成されるとして、濃度校正時に求めた各項の値を保管する。次に現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂは、保管された基準バックグラウンド光子計数値の定数項ｂ、励起光強度補正係数ｆｅに比例する比例項として、現在時点の励起光散乱寄与項Ｓ、及び同じく励起光強度補正係数ｆｅに比例する比例項として、現在時点のレーリー散乱寄与項Ｒｉの総和で構成されるとする。励起光散乱寄与項Ｓは、保管された基準励起光散乱寄与項Ｓ０並びに基準物理パラメータ値、物理パラメータ情報取得部９で取得した現在時点の物理パラメータ値、及び励起光強度補正係数を用いて計算される。レーリー散乱寄与項Ｒｉは、保管された基準レーリー散乱寄与項Ｒｉ０並びに基準物理パラメータ値、現在時点の物理パラメータ値、及び励起光強度補正係数を用いて計算される。なおＲｉは試料中の散乱断面積が大きく、かつ高濃度に存在することによりレーリー散乱の寄与が無視できない成分に対応し、1つに限定されない説明変数であるため添字を付与している。多くの場合、レーリー散乱の寄与が無視できない成分とは媒質成分であり、例えば試料が気体試料の場合、酸素及び窒素の成分比率が変わらないものとして、空気及び水蒸気が該当する。手順２により、バックグラウンドにおけるレーリー散乱の寄与を明確に切り分けて扱えば、励起波長と蛍光波長の波長差が少ない物質や、蛍光寿命が短く時間的にレーリー散乱と蛍光を分離することが難しい物質の定量に対しても蛍光測定法が適用可能となり、非コヒーレントなLED等を連続光源として使用でき、しかも典型的にはｐｐｂもしくはそれ以下の低濃度な測定対象物質を高精度で測定することが可能となる。上記で説明した手順２は図２のステップＳ０２及びＳ０３の第二の詳細の手順であって、図４のステップＳ２００～Ｓ２１０に該当する。

上記手順２で計算する現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの演算式の一例を以下に示す。ただし以下は一例であって、これに限るものではない。基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、励起光強度基準値に依存しない定数項ｂ、励起光照射部３での反射並びに屈折による基準励起光散乱寄与項Ｓ０、及び試料媒質の主要成分ｉによる基準レーリー散乱寄与項Ｒｉ０の総和として式（６）で表され、各項を保管しておく。励起光散乱寄与項Ｓは、保管された基準励起光散乱寄与項Ｓ０を、保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、及び現在時点の物理パラメータ値Ｐｊを用いた物理パラメータ規格化関数ＮＳ（Ｐｊ，Ｐｊ０）により補正し、さらに励起光強度計測値Ｉと、励起光強度基準値Ｉ０との、比として表される励起光強度補正係数ｆｅを乗じて計算し、レーリー散乱寄与項Ｒｉは、保管された基準レーリー散乱寄与項Ｒｉ０を、保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、及び現在時点の物理パラメータ値Ｐｊを用いた物理パラメータ規格化関数ＮＲｉ（Ｐｊ，Ｐｊ０）により補正し、さらに励起光強度補正係数ｆｅを乗じて計算し、総合してバックグラウンド光子計数換算値Ｂを式（７）により求める。ここで物理パラメータ規格化関数は、物理パラメータとして何を使用するかにより関数形は異なる。定数項ｂは、例えばフォトンカウンティングヘッドの暗計数率、及び殆ど変化しない室内光の漏れ込み、励起光照射部外部の反射並びに屈折による励起光の散乱光、あるいは装置内の励起光照射部外部の部品から発する光の漏れ込みであるが、暗計数率以外は励起光照射部３の遮光対策を適切に講じることによりほぼゼロとすることができる。また暗計数率は冷却により低減できるが、例えばペルチェ素子により冷却する場合、精密に温度制御するため定数とみなすことができる。励起光散乱寄与項Ｓとは、励起光照射部内部の反射並びに屈折による励起光の散乱光の寄与を表す項であり、適正に光学系を配置して連続光源２からの励起光照射部３への入射光を導入すれば、励起光強度もしくは励起光強度補正係数ｆｅと比例し、他の物理パラメータの影響はほぼ受けないので、物理パラメータ規格化関数ＮＳ（Ｐｊ／Ｐｊ０）は式（８）のように１に等しいとしてよい。レーリー散乱寄与項Ｒｉは試料中のレーリー散乱に寄与する成分によるレーリー散乱の寄与を表す項であって、レーリー散乱に寄与する成分の濃度もしくはモル分率ｍｎi及び励起光強度補正係数ｆｅと比例し、レーリー散乱に寄与する成分ｉ毎に計算する必要がある。例えば主要成分組成の変わらない空気試料であって、湿度も少なく水蒸気によるレーリー散乱の寄与は無視しうる場合には、レーリー散乱に寄与する成分は１個（ｉ＝１）で空気のみと考え、物理パラメータは２個（ｊ＝２）で、励起光照射部内の圧力Ｐｅ及び温度Ｔｅとする。レーリー散乱は分子数に比例するため、物理パラメータ規格化関数ＮＲｉ（Ｐｊ／Ｐｊ０）はＮＲ１（Ｐｊ／Ｐｊ０）のみであって、式（９）で表される。

また例えば主要成分組成の変わらない液体試料であって、アセトニトリルのような単一溶媒である場合には、主要成分はアセトニトリルのみ（ｉ＝１）と考え、レーリー散乱は分子数すなわち密度に比例するため、温度を測定して密度の推算式により密度を求めるものとし、関係する物理パラメータとしては励起光照射部内の温度Ｔｅのみ（ｊ＝１）となる。物理パラメータ規格化関数ＮＲｉ（Ｐｊ／Ｐｊ０）はＮＲ１（Ｐｊ／Ｐｊ０）のみであって、最も簡単には有機化合物の体膨張率ｂが温度によらず一定として扱い、式（１０）で表される。以上は使用する物理パラメータ及び物理パラメータ規格化関数の関数形の一例であって、これに限るものではない。

試料中に高濃度のラマン活性物質が共存し、自然ラマン散乱の寄与が無視できない場合には、濃度演算器１０における演算で用いる基準バックグラウンド光子計数値及び現在時点のバックグラウンド光子計数換算値は、次のような手順３で演算するのが好ましい。すなわち基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、手順２で示した項に、さらに試料中のラマン活性を有する成分ｋによる基準自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋ０を加えた各項の総和で構成されるとして、濃度校正時に求めた各項の値を保管する。次に現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂは、手順1で示した比例項に、さらに現在時点の自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋが加わった総和で構成されるとする。自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋは、保管された基準自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋ０並びに保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、現在時点の物理パラメータ値Ｐｊ、及び励起光強度補正係数ｆｅを用いて計算される。なおｋは試料中のラマン活性があり、かつ高濃度に存在することにより自然ラマン散乱の寄与が無視できない成分に対応し、1つに限定されないので添字としている。手順３によれば、主として液体試料において、特に溶媒が対称性の強い分子で水素結合性があることによりラマン散乱断面積の大きい物質、代表的には水の場合において、レーリー散乱はバンドパスフィルタ、ロングパスフィルタ、あるいは分光器により除去できるものの、超微量分析であるために溶媒の自然ラマン散乱が干渉となる場合についても、蛍光測定法を適用することができる。上記で説明した手順３は図２のステップＳ０２及びＳ０３の第三の詳細の手順であって、図５のステップＳ３００～Ｓ３１２に該当する。

上記手順３で計算する現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの演算式の一例を以下に示す。ただし以下は一例であって、これに限るものではない。基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、手順２の式（６）の右辺にさらに基準自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋ０を加えた式（１１）で表され、各項を保管しておく。自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋは、保管された基準自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋ０を、保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、及び現在時点の物理パラメータ値Ｐｊを用いた物理パラメータ規格化関数ＮＲＭｋ（Ｐｊ／Ｐｊ０）により補正し、さらに励起光強度補正係数ｆｅを乗じて計算し、手順２の式（７）の右辺に追加し、総合してバックグラウンド光子計数換算値Ｂを式（１２）により求める。例えばラマン活性のある物質が１種（ｋ＝１）の場合、関係する物理パラメータはｊ＝1として、Ｐｊはラマン活性のある物質の濃度Ｃｒのみとなる。物理パラメータ規格化関数ＮＲＭｋ（Ｐｊ／Ｐｊ０）はＮＲＭ１（Ｐｊ／Ｐｊ０）のみであって、式（１３）で表される。

媒質が液体の試料で、かつ測定対象物質を蛍光標識化し、蛍光標識化生成物の蛍光を測定する場合において、試料中の測定対象物質もしくは測定対象物質含有物による自家蛍光の寄与が無視できない場合には、濃度演算器１０における演算で用いる基準バックグラウンド光子計数値及び現在時点のバックグラウンド光子計数換算値は、次のような手順４で演算するのが好ましい。すなわち基準バックグラウンド計数値Ｂ０は、手順２及び手順３で示した項に、さらに試料による基準自家蛍光寄与項ＡＦ０を加えた各項の総和で構成されるとして、濃度校正時に求めた各項の値を保管する。現在時点のバックグラウンド計数換算値Ｂは、手順２及び手順３で示した比例項に、さらに現在時点の自家蛍光寄与項ＡＦが加わった総和で構成されるとする。自家蛍光寄与項ＡＦは、保管された基準自家蛍光寄与項ＡＦ０並びに保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、現在時点の物理パラメータ値Ｐｊ、及び励起光強度補正係数ｆｅを用いて計算される。手順４によれば、生体由来の溶液試料で例えば１－アニリノナフタレン－８－スルフォン酸等の蛍光プローブを用いて血清アルブミン等の特定のタンパク質を分析する場合、一般的に蛍光標識を行うフローサイトメトリーの場合、及び蛍光プローブを用いたフローインジェクション分析法、例えば２、３－ジアミノナフタレンを添加してセレンを分析する場合に、夾雑物、アミノ酸残基、クロロフィル等の生物由来色素、あるいは細胞、細菌といった物質もしくは物体による自家蛍光の影響を分離し、高感度な測定が行えるようになる。上記で説明した手順４は図２のステップＳ０２及びＳ０３の第四の詳細の手順であって、図６のステップＳ４００～Ｓ４１２に該当する。

上記手順４で計算する現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの演算式の一例を以下に示す。ただし以下は一例であって、これに限るものではない。基準バックグラウンド光子計数値Ｂ０は、手順３の式（１１）の右辺にさらに基準自家蛍光寄与項ＡＦ０を加えた式（１４）で表され、各項を保管しておく。自家蛍光寄与項ＡＦは、保管された基準自家蛍光寄与項ＡＦ０を、保管された基準物理パラメータ値Ｐｊ０、及び現在時点の物理パラメータ値Ｐｊを用いた物理パラメータ規格化関数ＮＡＦ（Ｐｊ，Ｐｊ０）により補正し、さらに励起光強度補正係数ｆｅを乗じて計算し、手順３の式（１２）の右辺に追加し、総合してバックグラウンド光子計数換算値Ｂを式（１５）により求める。

試料中に測定対象物質の蛍光を消光する消光物質が存在し、消光の影響が無視できない場合においては、消光の影響を補正する必要がある。この場合の濃度演算器１０における濃度演算は、、図７のステップＳ５００～Ｓ５０５に示すように、励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄを、消光物質Ｘの非存在下における無消光励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ０、消光物質の濃度［Ｘ］、及び消光速度定数と消光物質非存在下の蛍光寿命の積であるＳｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ定数Ｋｓｖとの間の、Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒの関係式より求まる無消光励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ０に置換えて演算するのが好ましい。これにより、例えば気体試料における水蒸気や窒素のような消光物質の影響が大きい場合にも、実際の蛍光測定結果から正確に測定対象物質の濃度を求めることができる。Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒの関係式は、例えば式（１６）のように表される。Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ定数Ｋｓｖは、予め一定濃度の測定対象物質が含まれ、消光物質の濃度［Ｘ］を変化させた標準試料を数点以上用意し、対応する励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄを求め、その逆数と消光物質濃度をプロットし、線形近似により最小二乗法で傾きを計算して得られる。Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒの関係式を用いる上記の手順により、蛍光寿命が長く、水蒸気等の消光物質の影響を受けやすい測定対象物質の場合、例えば湿潤な大気試料の二酸化窒素濃度を可視領域の蛍光測定により高感度測定を行いたい場合に、水蒸気濃度を別途同時に測定すれば、水蒸気濃度の変動によらず精度よい測定が可能となる。

測定対象物質が複数であって、同数の励起波長又は蛍光波長における蛍光を測定し、測定対象物質の濃度Ｃｍを求める場合において、濃度演算器１０における濃度演算は、複数の励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄｎ、もしくは複数の無消光励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ0ｎが、同数の測定対象物質の濃度Ｃｍと同数の濃度係数ａｍｎとの線形結合であるものとして、連立方程式の求解により各測定対象物質の濃度を決定するのが好ましい。ここでｍは複数の測定対象物質に対応し、ｎは同数の励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄｎ又は無消光励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ0ｎに対応する添字である。例えば関心のある測定対象物質が１つであっても、干渉物質が１つ存在し、異なる２つの励起波長又は蛍光波長において蛍光を測定する場合、干渉物質は別の測定対象物質、すなわち測定対象物質は２つとして扱う。これにより、干渉物質が存在する場合でも、蛍光測定により測定対象物質の濃度を正確に求めることができる。また結果としてLEDのように比較的広い帯域で発振する非コヒーレントな連続光源を使用することが可能となるため、蛍光測定の適用範囲が拡がる。２つの測定対象物質が存在する場合の連立方程式は、例えば式（１７）のように表される。

以下に実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これら実施例によってなんら限定されるものではない。

図１に示した本発明の実施の形態を具現化した例として、腸内細菌叢の健全性、いわゆる悪玉菌とされる一部の腸内細菌の存在指標となる呼気中のフェノール濃度をリアルタイムに測定するモニタにつき説明する。悪玉菌は、芳香族アミノ酸であるチロシンからフェノールを産生する酵素、チロシンフェノールリアーゼ等を特異的に所有してフェノールを産生し、腸内で生成したフェノールは速やかに吸収され、血中に移行することにより、肺胞を介して呼気中にガス態として存在する。呼気中のフェノール濃度は血中濃度を反映するため、呼気中濃度を測定して腸内細菌叢の状態を知ることができる。悪玉菌にはｐ－クレゾールを産生する者、及び両者を産生するものも存在するが、フェノールを産生するものが優勢である。８時間以内にコーヒー、ワイン及びブドウ等の食物を喫食していない、かつ薬物を投与されていない状態では、呼気中に存在して２６５ｎｍ付近の波長の光を吸収し、蛍光を発する物質は大部分のフェノール及び少量のｐ－クレゾールであると見做すことができる。フェノールはストークスシフトと称する最大励起波長と最大蛍光波長の差が小さく、また分光器を使用しない場合の励起波長の半値全幅は１０ｎｍと広いため、検出波長により励起光の壁面等での反射等による散乱光、及び呼気中の二酸化炭素、酸素、窒素及び水蒸気によるレーリー散乱光の影響を取り除くことが難しい。また２６５ｎｍの励起波長における蛍光寿命は２ｎｓ程度であり、励起光の照射とほぼ同時と見做しうるこれら散乱光に対して、励起光を消灯して励起光の散乱光の影響が減少してから、遅延時間を以って蛍光を検出する方式とすると、測定の負荷周期は極めて低くなる。迷光とも呼称される励起光の励起光照射部付近の蛍光セル壁面等での散乱光の影響は、蛍光セル等の構造における意匠により削減可能であるが、蛍光セル内の測定対象物質以外の物質で、比較的多量に存在し、散乱断面積の大きい物質による励起光のレーリー散乱は必然的に発生する。レーリー散乱と蛍光を検出波長で分離することが困難であって、微弱な蛍光を測定する場合は特に問題となる。

そこでフェノールの蛍光特性に合わせたフェノールモニタは、連続光源２を中心波長２６５ｎｍ、光出力４５ｍＷの深紫外ＬＥＤとし、バンドパスフィルタによりの波長帯域を狭帯化して、矩形波変調回路６により１７ｋＨｚの矩形波で、１周期の９０％すなわち５２．９μｓの間は点灯、残り１０％すなわち５．９μｓの間は消灯を繰り返して励起光に用いる。励起光照射部３は、本例では呼気ガスを流通させる蛍光セルとし、その内部は、励起光の屈折及び反射による散乱光が蛍光検出部に直接到達するのを防ぐため、励起光の光束の周縁部を除去し、観測領域での集光がなされるよう、段階的に開口径を絞ったスキマーを励起光の光路に沿って配置している。励起光照射部３の内壁は測定対象物質が吸着するのを防止するため、水素化アモルファスシリコンを化学蒸着し、さらにアルキル基を結合させる不活性化処理を施した電解研磨ステンレス鋼で構成し、さらに励起光の壁面での散乱を抑制すべき部品もしくは部位については、アルミ合金の梨地処理の上に施す黒塗りアルマイト処理を施したものとしている。励起光照射部３、励起光強度検出部４及び蛍光検出部５は室内光の侵入を防止する構造となっており、室内光の影響は無視しうる。励起光強度検出部４はシリコンフォトダイオードを検出器として、連続光源２から励起光照射部３に入射した励起光の内部反射光の一部の光強度を電流信号として検出し、Ａ／Ｄ変換回路で励起光強度に比例したデジタル値に変換する。蛍光検出部５はフォトンカウンティングヘッドを検出器として、蛍光をフォトンカウンティング方式で検出する。生成したパルス信号は、タイミング回路７で設定したゲートパルスの期間にゲートカウンタ回路８で計数する。ゲートパルスは連続光源２の点灯後２．９μｓ経過してから消灯までとしている。物理パラメータ情報取得部９は、蛍光セル内の試料ガスの温度及び圧力をそれぞれ測温抵抗体及び半導体ピエゾ抵抗拡散式圧力センサにより計測し、蛍光セルと並列に設置された二酸化炭素測定セルに試料の一部を分岐して、二酸化炭素濃度及び絶対湿度を計測する。デジタルのタイミング回路７は、矩形波変調回路６に供給する矩形波パルスを生成すると共に、同一のクロックにより、ゲートカウンタ回路８における信号処理用のゲートパルスを生成する。励起光強度検出部４のＡ／Ｄ変換回路、タイミング回路７、ゲートカウンタ回路８、物理パラメータ情報取得部９のＡ／Ｄ変換回路、及び濃度演算器１０は、Ａ／Ｄ変換回路、ＳＳＤ及びマイクロコンピュータ搭載のＦＰＧＡボードにより構成している。濃度演算器１０における測定対象物質の濃度の演算については、ゲートカウンタ回路８で得られた現在時点の所定時間内の光子計数値Ｉｐ、現在時点の所定時間内のバックグラウンド光子計数換算値Ｂ、現在時点の励起光強度Ｉ、濃度校正時の励起光強度基準値Ｉ０、励起光強度補正係数ｆｅ、蛍光光子計数値Ｉｆ、励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ、濃度の基準校正時の濃度係数ａとすると、測定対象物質の濃度Ｃは式（１）で表される。また励起光強度補正係数ｆｅは式（２）で表される。バックグラウンド光子計数換算値Ｂを手順１により演算する場合には、呼気の二酸化炭素濃度及び絶対湿度が一定で、蛍光セル内の試料ガスの温度及び圧力は制御されているため一定として扱い、式（３）、（４）及び（５）により現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂを求めてフェノール濃度を計算した。次に手順２によりバックグラウンド光子計数換算値Ｂを計算する方式を採用して手順１の場合と比較した。手順２の場合、呼気中の窒素、酸素、二酸化炭素及び水蒸気の各濃度もしくはモル分率ｍｎｉ、並びに蛍光セル内の温度Ｔｅ及び圧力Ｐｅの各計測値は変動するものとして扱い、６個（ｊ＝６）の物理パラメータが与えられ、一方、レーリー散乱に寄与する成分は窒素、酸素、二酸化炭素及び水蒸気の４種である。窒素のモル分率は乾きガスとしては一定であるとして扱う。酸素のモル分率は、例えば磁気式酸素濃度センサにより測定できる。式（９）の代わりに次の式（１８）により物理パラメータ規格化関数ＮＲｉ（Ｐｊ／Ｐｊ０）を定め、式（６）、（７）、及び（８）により現在時点のバックグラウンド光子計数換算値Ｂを求めてフェノール濃度を計算した。

またｐ－クレゾールを分別して定量する目的の場合には、中心波長２６５ｎｍの連続光源２と併せて、中心波長２７５ｎｍの連続光源２を設置した。この場合、両連続光源２の変調は共に１７ｋＨｚの矩形波であり、１周期当りの中心波長２６５ｎｍの連続光源２の点灯を２６．４μｓの間とし、消灯に転じたと同時に中心波長２７５ｎｍの連続光源２を２６．４μｓの間点灯する。蛍光検出部５は両励起光に対して同一の検出器を利用し、各連続光源２の点灯に対応した別個のゲートパルスにより、各連続光源のゲートカウンタ回路８で対応するパルス信号を計数する。ゲートパルスの掛け方は、１個の連続光源２の場合と同様、点灯後２．９μｓ経過してから消灯までとしている。濃度演算器１０におけるフェノール及びｐ－クレゾールの各バックグラウンド光子計数換算値の計算は、手順２によるものとし、各励起光強度補正蛍光光子計数値Ｉｆｄ１及びＩｆｄ２を計算した後、式（１７）の連立方程式を解いて、フェノール及びｐ－クレゾールの濃度を求めた。

以上の連続光源２が１個、すなわち一波長励起であって手順１によりバックグラウンド光子計数換算値Ｂを計算する場合（便宜的に本発明の実施形態１と称するものとする）、一波長励起で手順２によりバックグラウンド光子計数換算値Ｂを計算する場合（便宜的に本発明の実施形態２と称するものとする）、及び二波長励起で手順２によりバックグラウンド光子計数換算値Ｂを計算する場合（便宜的に本発明の実施形態３と称するものとする）について、従来技術と比較を行った。従来技術は、波長２６６ｎｍ、繰返し周波数１ｋＨｚ、パルス幅１０ｎｓ、パルスエネルギー０．２ｍＪの半導体レーザ励起Ｎｄ：ＹＡＧレーザの第四高調波をパルス光源とし、発生した蛍光を中心波長２７０ｎｍ、帯域の半値幅１０ｎｍのバンドパスフィルタを通して電流検出型光電子増倍管で検出し、電流信号を前置増幅器を通して電圧に変換し、ゲートを掛けてボックスカー積分器で積分し、Ａ／Ｄ変換してパーソナルコンピュータに取込む。半導体レーザ励起Ｎｄ：ＹＡＧレーザはデジタル遅延パルス発生器による外部トリガで発進させ、それより一定の遅延時間を有するパルスをボックスカー積分器に送り、積分ゲートを掛けた。また励起光の一部をシリコンフォトダイオードで検出し、励起光強度に比例した電流信号として同様に増幅後、ボックスカー積分器で積分し、Ａ／Ｄ変換してパーソナルコンピュータに取込み、蛍光信号の強度補正を行う。事前にゼロガスを含む所定濃度のフェノール標準ガスにより検量線を作成しておき、フェノール濃度を計算する。積分ゲートは実際のパルス光発振の開始から遅延時間２ｎｓ後から終了の２ｎｓ後までの場合（便宜的に既存技術１と称するものとする）、及びパルス光発振終了０．５ｎｓ後から２ｎｓ後までの場合（便宜的に既存技術２と称するものとする）につき検討した。比較結果を表１に示す。既存技術１、既存技術２、本発明の実施形態１、及び本発明の実施形態２は、呼気中に存在するフェノール及びフェノールの１割ないし２割程度存在するｐ－クレゾールの、フェノール換算の総量濃度を測定する装置であり、本発明の実施形態３は、フェノール及びｐ－クレゾールを分別して各濃度を測定する装置である。表中で１秒積算のゼロノイズは、酸素２１．３ｋＰａ、窒素８０．０ｋＰａの組成のゼロガスの１秒積算の測定値のＲＭＳノイズもしくは標準偏差を示す。１分積算の最小検出限界は、１秒積算の測定値の標準偏差の３倍を以って定義する。繰返し再現性は、人の呼気と同様な酸素１４．４ｋＰａ、窒素７１．１ｋＰａ、二酸化炭素５．１ｋＰａ、水蒸気６．３ｋＰａの組成のマトリクスで、フェノール濃度１９．８ｐｐｂ、ｐ－クレゾール１９．６ｐｐｂとなるよう調製した標準ガスを流通し、１分積算の測定を１０分程度の間隔を置いて１０回繰返し、その相対標準偏差で評価する。マトリクス変更時のゼロドリフトとは、吸気時と同様な酸素２１．３ｋＰａ、窒素８０．０ｋＰａの組成のゼロガスから、人の呼気と同様な酸素１４．４ｋＰａ、窒素７１．１ｋＰａ、二酸化炭素５．１ｋＰａ、水蒸気６．３ｋＰａの組成のゼロガスに切換った時の、１分積算の測定値の変化量を指す。

上記表１に示した通り、いずれの本発明の実施形態も既存技術に比べて精度が高く、再現性が優れた。またバックグラウンド光子計数換算値を手順２により計算する場合には、最初に値付けの濃度校正を行えば、６か月間以上校正なしに上記と同等の精度が保たれた。本発明の実施形態ではデジタル処理を駆使することにより、安価なＬＥＤを用いて蛍光測定装置を構成でき、低コストな蛍光測定装置を構成可能であった。

図１に示した本発明の実施の形態の他の例として、クロモトロープ酸（１，８－ジヒドロキシナフタレン－３，６－ジスルフォン酸）とホウ酸の形成する錯体の蛍光測定を利用したフローインジェクション分析法又は連続流れ分析法により、液体試料中のホウ素を間欠又は連続分析する蛍光測定装置につき説明する。従来からクロモトロープ酸を蛍光試薬として用いる蛍光測定装置は存在し、表層水中のホウ素の分析では、環境基準の１ｍｇ／Ｌを十分に下回る濃度まで測定できることが周知されている。しかしながら蛍光測定のバックグラウンドが高いため、例えば半導体プロセスの超純水管理で要望される１０ｎｇ／Ｌ以下の極低濃度までの測定ができず、適用の拡大が図れなかった。この場合のバックグラウンドの高さは、主としてクロモトロープ酸自体の自家蛍光に起因する。系のｐＨに依存してクロモトロープ酸は２個のスルフォン基、次いで２個の水酸基が解離し、４価までの陰イオンを生じる。未解離型から２価の陰イオンまでの吸収スペクトルはほぼ相似な広帯域なスペクトルであるが、３価及び４価の陰イオンへと解離に従い、吸収極大は長波長シフトする。例えば３１６ｎｍの波長で励起した蛍光スペクトルは、酸性領域での３５２ｎｍ及び３６９ｎｍの蛍光極大はｐＨの上昇と共に消長し、４３０ｎｍの蛍光極大が成長する。また蛍光測定の対象となるクロモトロープ酸とホウ酸の錯体は、モル比で１対１錯体と１対２錯体が存在し、系のｐＨに従い二段階反応により２対１錯体まで生成が進む。一段目の１対１錯体の生成は速い正反応であるが、二段目の１対１錯体から１対２錯体を生じる反応は比較的遅く、クロモトロープ酸配位子の酸解離定数が錯生成平衡のｐＨ依存性を支配する。１対１錯体及び１対２錯体の吸収スペクトル並びに蛍光スペクトルは、モル吸光係数も蛍光量子収率も比較的大きいものの、元のクロモトロープ酸に類似した広帯域なスペクトルである。

そこで極低濃度ホウ素のフローインジェクション分析用の蛍光測定装置としては、応答性を優先し、反応時間を長く取れないことから、１対２錯体への進行が抑制され、１対１錯体が支配する中性からアルカリ性領域に系のｐＨを設定し、検出の直線性を得るため、大過剰のクロモトロープ酸により、擬一次反応で１対１錯体を生成する条件とする。ｐＨ７ではクロモトロープ酸は３価の陰イオンが主体となり、３５２ｎｍ帯の蛍光強度は小さくなる。先ず１台目のポンプによりキャリア水として超純水を０．５ｍＬ／分で送液し、キャリア水の流路の途中に六方バルブで試料液を３００μＬを挿入する。２台目のポンプはクロモトロープ酸０．０００４ｍｏｌ／Ｌ、及び金属イオンの妨害を除去するためのエチレンジアミン四酢酸０．００２ｍｏｌ／Ｌを含むｐＨ７．０の０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液を０．５ｍＬ／分で送液し、混合部で合流させた後、３台目のポンプで０．１ｍｏｌ／Ｌアンモニア水を０．５ｍＬ／分で送液して下流の混合部で合流させ、反応コイルに流通して反応させ、クロモトロープ酸とホウ酸の１対１錯体を得る。流路は内径０．５ｍｍのＰＴＦＥチューブで構成した。反応コイル及び流路は３５℃に温度制御した。励起光照射部３は下流側に設置した合成石英製、容量０．１ｍＬの蛍光フローセルとした。本例の蛍光測定装置の連続光源２は中心波長３０８ｎｍ、光出力５０ｍＷの深紫外ＬＥＤとし、中心波長３１０ｎｍ、半値全幅１０ｎｍのバンドパスフィルタにより波長帯域をさらに狭帯化し、矩形波変調回路６により１７ｋＨｚの矩形波で、１周期の７５％すなわち４４．１μｓの間は点灯、残り２５％すなわち１４．７μｓの間は消灯を繰り返して励起光に用いる。励起光照射部３は、反応コイルの下流側に設置した合成石英製、容量０．１ｍＬの蛍光フローセルとした。蛍光フローセルは流路断面が方形で、流路に沿った３面が透明で、残り１面が不透明となっており、透明な１面から流路に垂直に励起光を入射し、対向する１面には励起光の透過光全量をシリコンフォトダイオードを検出器とした励起光強度検出部４で電流信号として検出し、Ａ／Ｄ変換回路で励起光強度に比例したデジタル値に変換する。蛍光検出部５は入射面と直交する1面に配置し、中心波長３５５ｎｍ、半値全幅１０ｎｍのバンドパスフィルタにより蛍光波長の一部を切り出し、フォトンカウンティングヘッドを検出器として、蛍光をフォトンカウンティング方式で検出する。生成したパルス信号は、タイミング回路７で設定したゲートパルスの期間にゲートカウンタ回路８で計数する。ゲートパルスは連続光源２の点灯後２．９μｓ経過してから消灯までとしている。励起光照射部３、励起光強度検出部４及び蛍光検出部５は室内光の侵入を防止する構造となっており、室内光の影響は無視しうる。蛍光検出部５で生成したパルス信号は、タイミング回路７で設定したゲートパルスの期間にゲートカウンタ回路８で計数する。ゲートパルスは連続光源２の点灯後２．９μｓ経過してから消灯後１１．８μｓまでとしている。物理パラメータ情報取得部９は、蛍光フローセル内の反応液の温度及びｐＨをそれぞれ測温抵抗体及びイオン応答電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）による半導体ｐＨセンサにより計測する。デジタルのタイミング回路７は、矩形波変調回路６に供給する矩形波パルスを生成すると共に、同一のクロックにより、ゲートカウンタ回路８における信号処理用のゲートパルスを生成する。励起光強度検出部４のＡ／Ｄ変換回路、タイミング回路７、ゲートカウンタ回路８、物理パラメータ情報取得部９のＡ／Ｄ変換回路、及び濃度演算器１０は、Ａ／Ｄ変換回路、ＳＳＤ及びマイクロコンピュータ搭載のＦＰＧＡボードにより構成している。濃度演算器１０におけるクロモトロープ酸とホウ酸の１対１錯体のバックグラウンド光子計数換算値Ｂの計算は、手順４により求めて、クロモトロープ酸とホウ酸の１対１錯体の濃度すなわちホウ素濃度を計算した。ここで励起光散乱寄与項Ｓは無視できないが、レーリー散乱寄与項Ｒｉは検出する蛍光波長が励起波長と大幅に異なるため、バンドパスフィルタの帯域を考慮しても無視しうる。一方、自然ラマン散乱寄与項ＲＭｋは殆ど水のラマン散乱３，３２８ｃｍ^－１の寄与であり、検出を行う蛍光波長の帯域の裾に掛かるが、水濃度が一定と見做しうるので、物理パラメータ規格化関数ＮＲＭｋ（Ｐｊ／Ｐｊ０）は１として扱える。自家蛍光寄与項ＡＦについては、クロモトロープ酸を定量供給し、ホウ酸に対して大過剰に供給しているため、反応の前後で濃度は変わらず、イオン総量としての濃度は一定と見做しうる。しかしながら各価数のイオンの分率は試料液のｐＨの摂動を受けて変動するため、結果として自家蛍光の寄与は僅かに変動する。このｐＨの影響を指数関数で表現して補正した。またクロモトロープ酸とホウ酸の１対１錯体の濃度は、錯生成反応速度が温度及びｐＨの影響を僅かに受けるため、指数関数によりこれらの補正も組み込んだ。濃度計算は０．１秒毎に０．１秒間の光子計数積算値を用いて行い、さらに試料液の注入時の六方バルブ切換えの接点信号を受けて無駄時間経過後、蛍光セルの平均滞留時間４秒の３倍すなわち１２秒間分積分して試料液のホウ素濃度を求めた。

本発明の実施形態により、クロモトロープ酸の自家蛍光のバックグラウンドの影響を受けずにホウ素濃度が測定でき、試料液１回の測定における最小検出限界は３．２ｐｐｔの極低濃度を達成し、1ｐｐｂのホウ素標準溶液での１０回繰返し測定の再現性は１．１％ＲＳＤと極めて良好であった。

１ 蛍光測定装置
２ 連続光源
３ 励起光照射部
４ 励起光強度検出部
５ 蛍光検出部
６ 矩形波変調回路
７ タイミング回路
８ ゲートカウンタ回路
９ 物理パラメータ情報取得部
１０ 濃度演算器

Claims (7)

1. 測定対象物質の励起光を発生する連続光源と、
   試料を導入し、前記連続光源からの励起光を照射する励起光照射部と、
   励起光強度と比例する光量を検出し、デジタル信号に変換する励起光強度検出部と、
   測定対象物質が発する蛍光をフォトンカウンティング方式で検出する蛍光検出部と、
   前記連続光源を点灯及び消灯状態に対応する矩形波で変調する矩形波変調回路と、
   同一のクロックにより、前記矩形波変調回路に供給する矩形波パルス及び信号処理用のゲートパルスを生成するタイミング回路と
   前記蛍光検出部からの1光子に対応するパルス信号を、所定時間内において前記ゲートパルスの期間に計数するゲートカウンタ回路と、
   前記測定対象物質の濃度の演算において必要とされる、現在時点の物理パラメータ値を取得する物理パラメータ情報取得部と、
   前記ゲートカウンタ回路で得られた現在時点の光子計数値から、現在時点のバックグラウンド光子計数換算値を差し引きして、バックグラウンドの影響を除いた蛍光光子計数値を求め、得られた前記蛍光光子計数値を、前記励起光強度検出部で測定された現在時点の励起光強度計測値と、濃度校正時に測定された励起光強度基準値との、比として表される励起光強度補正係数で除することにより、励起光強度補正蛍光光子計数値を算出し、さらに前記励起光強度補正蛍光光子計数値を、前記濃度校正時に求めた濃度当りの蛍光光子計数値として表される前記測定対象物質の濃度係数で除することにより、前記測定対象物質の濃度をデジタル演算する濃度演算器とを、備え、
   前記濃度演算器における演算は、
   前記濃度校正時における前記測定対象物質を含まない試料で測定した基準バックグラウンド光子計数値が、前記励起光強度基準値に依存しない定数項と、前記励起光強度補正係数に比例する比例項の基準値との、総和で構成されるとして各項の値を保管し、
   前記現在時点のバックグラウンド光子計数換算値が、保管された前記定数項と、前記励起光強度補正係数に比例する比例項との、総和で構成されるとして、
   前記現在時点のバックグラウンド光子計数換算値の比例項は、保管された前期比例項の基準値並びに前記基準物理パラメータ値、前記現在時点の物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算されることを特徴とする蛍光測定装置。
2. 前記連続光源はＬＥＤであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
3. 前記濃度演算器における演算は、
   前記基準バックグラウンド光子計数値の比例項の基準値が、
   前記励起光照射部での反射並びに屈折による基準励起光散乱寄与項と、試料媒質の主要成分による基準レーリー散乱寄与項との、総和で構成されるとして、各項の値を保管し、
   前記現在時点のバックグラウンド光子計数換算値の比例項が、
   現在時点の励起光散乱寄与項と、現在時点のレーリー散乱寄与項との、総和で構成されるとして、
   前記現在時点の励起光散乱寄与項は、保管された前記基準励起光散乱寄与項並びに前記基準物理パラメータ値、前記現在時点の物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算され、
   前記現在時点のレーリー散乱寄与項は、保管された前記基準レーリー散乱寄与項並びに前記基準物理パラメータ値、前記現在時点の物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算されることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光測定装置。
4. 前記濃度演算器における演算は、
   前記基準バックグラウンド光子計数値の比例項の基準値が、
   前記基準励起光散乱寄与項と、前記基準レーリー散乱寄与項に加え、試料中のラマン活性を有する成分による基準自然ラマン散乱寄与項との、総和で構成されるとして、各項の値を保管し、
   前記現在時点のバックグラウンド光子計数換算値の比例項が、
   前記現在時点の励起光散乱寄与項と、前記現在時点のレーリー散乱寄与項に加え、現在時点の自然ラマン散乱寄与項との、総和で構成されるとして、
   前記現在時点の自然ラマン散乱寄与項は、保管された前記基準自然ラマン散乱寄与項並びに前記基準物理パラメータ値、前記現在時点の物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算されることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光測定装置。
5. 前記濃度演算器における演算は、
   前記基準バックグラウンド光子計数値の比例項の基準値が、
   前記基準励起光散乱寄与項と、前記基準レーリー散乱寄与項と、前記基準自然ラマン散乱寄与項に加え、試料による基準自家蛍光寄与項との、総和で構成されるとして、各項の値を保管し、
   前記現在時点のバックグラウンド光子計数換算値の比例項が、
   前記現在時点の励起光散乱寄与項と、前記現在時点のレーリー散乱寄与項と、前記現在時点の自然ラマン散乱寄与項に加え、現在時点の自家蛍光寄与項との、総和で構成されるとして、
   前記現在時点の自家蛍光寄与項は、保管された前記基準自家蛍光寄与項並びに前記基準物理パラメータ値、前記現在時点の物理パラメータ値、及び前記励起光強度補正係数を用いて計算されることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光測定装置。
6. 前記濃度演算器における前記測定対象物質の濃度の計算は、
   前記励起光強度補正蛍光光子計数値を、
   さらに消光物質の非存在下における無消光励起光強度補正蛍光光子計数値と、前記消光物質の濃度と、消光速度定数及び前記消光物質の非存在下の蛍光寿命の積であるＳｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ定数との間の、Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒの関係式より求まる前記無消光励起光強度補正蛍光光子計数値に、
   置換えて演算することを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
7. 前記濃度演算器における前記測定対象物質の濃度の計算は、
   複数の前記励起光強度補正蛍光光子計数値、もしくは複数の前記励起光強度補正蛍光光子計数値が複数の前記無消光励起光強度補正蛍光光子計数値に置換えられた場合にあっては、前期複数の無消光励起光強度補正蛍光光子計数値が、同数の前記測定対象物質の濃度と同数の前記濃度係数とによる線形結合であるものとして、
   連立方程式の求解により各前記測定対象物質の濃度を、演算することを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
   

Images