WO2004013314A1 - ZELLEN, DIE R-α-LIPONSÄURE SEKRETIEREN UND VERFAHREN ZUR FERMENTATIVEN HERSTELLUNG DER R-α-LIPONSÄURE - Google Patents

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lipoic acid
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cell
culture medium
cells
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Tobias Dassler
Thomas Maier
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Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds

Definitions

  • the invention relates to cells that secrete R- ⁇ -lipoic acid and a method for the fermentative production of R- ⁇ -lipoic acid using these cells.
  • R- ⁇ -lipoic acid is an essential cofactor of certain multienzyme complexes in a large number of pro and eukaryotes.
  • the R- ⁇ -lipoic acid is in each case covalently bound to the ⁇ -amino group of a specific lysine residue of the corresponding enzyme.
  • the R- ⁇ -lipoic acid is part of the E2 subunit of pyruvate dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] and ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] and plays there as Redox partners and acyl group carriers play a crucial role in the oxidative decarboxylation of ⁇ -keto acids.
  • PDH pyruvate dehydrogenase
  • KGDH ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase
  • Lipoic acid also acts as an aminomethyl carrier in glycine cleavage enzyme systems.
  • ⁇ -Lipoic acid is an optically active molecule with a chiral center at the carbon atom C ⁇ .
  • the R configuration of ⁇ -lipoic acid is the naturally occurring enantiomer. Only this form shows physiological activity as a cofactor of the corresponding enzymes.
  • ⁇ -Lipoic acid can occur both in an oxidized (5- [1, 2] -dithiolan-3-yl-pentanoic acid) and in a reduced form (6, 8-dimercapto-octanoic acid).
  • ⁇ -lipoic acid both forms and the respective salts of ⁇ ⁇ lipoic acid, such as. B. the calcium, potassium, magnesium, sodium or ammonium salt to understand.
  • octanoic acid which is covalently bound to the acyl carrier protein (ACP) serves as a specific precursor in lipoic acid synthesis.
  • ACP acyl carrier protein
  • two sulfur atoms are transferred to the octanoic acid (octanoyl-ACP) activated in this way, producing R- ⁇ -lipoyl-ACP.
  • This reaction will catalyzed by the sulfur transferase lipoic acid synthase [EC 2.8.1.-], the lipA gene product.
  • the amino acid L-cysteine ultimately serves as the sulfur donor.
  • ⁇ -lipoic acid In addition to its relevance as an essential component of enzymes with a central role in metabolism, the importance of ⁇ -lipoic acid for pharmacotherapy and for food supplementation (nutraceutical) was recognized early on: Due to its two thiol groups, ⁇ -lipoic acid has a pronounced effectiveness as an antioxidant and can therefore protect the organism from harmful processes that are induced by oxidative stress. In addition, ⁇ -dihydro-lipoic acid, the reduced form of ⁇ -lipoic acid, is able, due to its property as a strong reducing agent, to regenerate other oxidized natural antioxidants in the body, such as ascorbic acid or ⁇ -tocopherol, directly or indirectly or, if they are deficient, to do so replace.
  • ⁇ -lipoic acid is of central importance in interaction with ascorbic acid, ⁇ -tocopherol and glutathione, the so-called "network of antioxidants".
  • ⁇ -Lipoic acid is also used for the prevention and control of type II diabetes mellitus and its consequential damage, such as. B. polyneuropathy, cataract or cardiovascular disease.
  • the different biological activity of the two enantiomers of ⁇ -lipoic acid is currently the subject of intensive investigations, although it is becoming increasingly clear that the application of the pure R enantiomer of ⁇ -lipoic acid has clear advantages over the S form. It was shown in the in vitro experiment that only the natural R- ⁇ -lipoic acid leads to the formation of functional ⁇ -keto acid dehydrogenases.
  • the S enantiomer even had an inhibitory effect on the stimulation of enzyme activity by R- ⁇ -lipoic acid.
  • the reduction of ⁇ -lipoic acid and thus the regeneration of the antioxidative ⁇ -dihydroliponic acid in the mitochondria is essential for the cell.
  • the mitochondrial NADH-dependent lipoamide reductase of mammals shows an almost 20-fold higher activity with the R enantiomer than with the S form.
  • R- ⁇ -lipoic acid has a significantly stronger effect on insulin-mediated glucose uptake and the glucose metabolism of skeletal muscle cells in insulin-resistant rats.
  • the R form also had an anti-inflammatory effect, while the S form had an analgesic effect. In order to avoid undesirable side effects, it is therefore extremely desirable to apply ⁇ -lipoic acid only in the enantiomerically pure form.
  • ⁇ -lipoic acid takes place exclusively by means of chemical processes, the racemate always being formed from the R and S forms as the end product (Yadav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res. 49: 400-409 ).
  • Various processes have been developed to obtain enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid.
  • the racemate of ⁇ -lipoic acid or one of the synthetic intermediates can either be chemically by means of chiral auxiliary substances (Walton et. Al. 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) or enzymatically (Adger et al., 1995, J. Chem.
  • An object of the present invention was to use cells for
  • This object is released by cells which are characterized thereby are that they overexpress a lipoic acid synthase gene (Iip ⁇ gene).
  • Overexpression in the sense of the present invention is preferably to be understood to mean that the lipoic acid synthase gene is at least a factor of 2, preferably at least a factor, in comparison to the respective wild-type cell from which the lipoic acid synthase gene was obtained 5, is increasingly expressed.
  • the lipoic acid synthase gene is preferably a gene with the sequence SEQ ID NO: 1 or a functional variant of this gene.
  • a functional variant is to be understood as a DNA sequence which is derived from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 by deletion, insertion or substitution of nucleotides, the enzymatic activity of those encoded by the gene Lipoic acid synthase is retained.
  • the copy number of the lipA gene in a cell can be increased and / or the expression of the lip ⁇ gene can be increased, preferably by suitable promoters.
  • Overexpression of a lip ⁇ gene increases the cell's lipoic acid synthase activity by at least the same factor.
  • a cell according to the invention preferably overexpresses a lipoic acid synthase gene which codes for a protein comprising the sequence ID NO: 2 or functional variants with a sequence homology to SEQ ID NO: 2 greater than 40%.
  • sequence homology to SEQ ID NO: 2 is preferably greater than 60%, particularly preferably the sequence homology to SEQ ID NO: 2 is greater than 80%.
  • a lipA gene can be cloned into a plasmid vector with a multiple copy number per cell (eg pUC19, pBR322, pACYC184 for Escherichia coli) and introduced into the cell.
  • a lip ⁇ gene can be integrated several times into the chromosome of a cell.
  • the known systems with temperate bacteriophages, in- tegrative plasmids or integration via homologous recombination can be used (eg Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622).
  • the invention thus also relates to a plasmid characterized in that it contains a Üp ⁇ gene under the functional control of a promoter.
  • the natural promoter and operator region of the lipA gene can serve as the control region for the expression of a plasmid-encoded lip ⁇ gene, but the enhanced expression of a lipA gene can also be effected in particular by means of other promoters.
  • Corresponding promoter systems which either allow a permanent or a controlled, inducible expression of the lipoic acid synthase gene, as for example in
  • Escherichia coli the constitutive GAPDH promoter of the gap ⁇ gene or the inducible lac, tac, trc, lambda, ara or tet promoters are known to the person skilled in the art (Makrides S. C, 1996, Microbiol. Rev. 60 : 512-538). Such constructs can be used in a manner known per se on plasmids or chromosomally.
  • a plasmid which already contains a promoter for enhanced expression, such as, for example, the inducible tet promoter / repressor system from Escherichia coli.
  • translation start signals such as. B. the ribosome binding site or the start codon of the gene are present in an optimized sequence on the respective construct, or that according to the "codon usage", rare codons are exchanged for more common codons.
  • Cells according to the invention preferably contain a plasmid with a JipA gene and the aforementioned modifications of the regulation signals.
  • the cloning of a lipA gene in a plasmid vector is effected for example by specific 'amplification of a lipA gene by the polymerase chain reaction using specific primers which detect the complete 2ipA gene and subsequent ligation with vector DNA fragments.
  • Cells according to the invention which have an increased expression of a lipA gene in relation to a starting cell and, in connection therewith, an increased lipoic acid synthase activity, can be generated from a starting cell using standard techniques of molecular biology.
  • Lipoic acid synthase genes were identified in a large number of cells.
  • Cells according to the invention can thus preferably be produced from cells of pro- or eukaryotic organisms which are able to synthesize R- ⁇ -lipoic acid themselves (starting cell), which are accessible to recombinant methods and which can be cultured by fermentation. Plant or animal cells that can be grown in cell culture are thus also suitable for producing cells according to the invention.
  • the cells according to the invention are preferably microorganisms, such as, for example, yeast or bacterial strains.
  • microorganisms such as, for example, yeast or bacterial strains.
  • the strains of the Enterobacteriaceae family are particularly preferred, and strains of the type Escherichia coli are very particularly preferred.
  • the lipA-containing plasmids are transformed into a starting cell by a common transformation method (eg electroporation) introduced and selected for example by means of antibiotic resistance on plasmid-bearing clones.
  • a common transformation method eg electroporation
  • the invention thus also relates to methods for producing a cell according to the invention, characterized in that a plasmid according to the invention is introduced into an output cell.
  • Another object of the invention was to provide a fermentation process which enables the production of enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid.
  • This object is achieved by a method which is characterized in that a cell according to the invention is cultivated in a culture medium, the cell excreting enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid in the culture medium in free form and the enantiomerically pure R- ⁇ -lipoic acid from the culture medium is separated.
  • R- ⁇ -lipoic acid can be obtained from the culture medium by methods known to those skilled in the art, such as centrifugation of the medium to separate the cells and subsequent extraction or precipitation of the product.
  • the method according to the invention is the first method in which the entire synthesis of R- ⁇ -lipoic acid takes place exclusively in a fermentation process with living cells.
  • the advantage of the method according to the invention over the conventional chemical processes lies in the enantiomer-specific biosynthesis of R- ⁇ -lipoic acid, which is why there is no need for complex racemate separation during or at the end of the synthesis chain. Furthermore, the environmental impact in the production process according to the invention for R- ⁇ -lipoic acid is considerably lower in comparison to chemical synthesis.
  • the cells according to the invention for the production of R- ⁇ -lipoic acid are preferably cultivated in a minimal salt medium known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • all usable sugars, sugar alcohols or organic acids or their salts can be used as the carbon source.
  • Aspartic acid, malic acid, succinic acid, pyruvic acid, fumaric acid, glutamic acid, glucose, glycerol or oxaloacetic acid are preferably used.
  • Succinic acid and oxaloacetic acid are particularly preferred.
  • Combined feeding of several different carbon sources is also possible.
  • short-chain fatty acids with a chain length of C2-C8, preferably with a chain length of C6-C8 (hexanoic or octanoic acid) can be added to the medium as specific precursors for the ⁇ -lipoic acid synthesis.
  • the concentration of the carbon source added is preferably 1-30 g / l.
  • the cells according to the invention are preferably incubated under aerobic cultivation conditions over a period of 16-150 h and in the range of the optimal growth temperature for the respective cells. 15 - 55 ° C is preferred as the optimal temperature range. A temperature between 30 and 37 ° C. is particularly preferred.
  • the detection and quantification of the R- ⁇ -lipoic acid produced in the method according to the invention is carried out, for example, by means of a bioassay using a lipoic auxotrophic indicator strain (lipA mutant).
  • lipoic auxotrophic indicator strain lipA mutant
  • This type of turbidimetric quantification of R- ⁇ -lipoic acid is known from the literature (Herbert and Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
  • the indicator strain W14851ip2 (ATCC 25645) used in the context of the present invention would also grow without supplemented R- ⁇ -lipoic acid if the medium also contained acetate and succinate in addition to glucose.
  • the R- ⁇ -lipoic acid producers prefer with succinate as the only carbon source.
  • This strain is supplemented with the culture supernatant of a cell culture according to the invention; The lipoic acid content in the culture medium can then be determined on the basis of the growth of the indicator strain.
  • the following examples serve to further explain the invention.
  • the bacterial strain Escherichia coli W3110 / pASK-IBA3-lipA which was used for the execution of the examples, was deposited with the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38142 Braunschweig) under the number DSM 15104 in accordance with the Budapest Treaty.
  • the lipA gene from E. coli was determined by means of the polymerase chain reaction (PCR) using the Pwo DNA polymerase common practice known to those skilled in the art.
  • the chromosomal DNA of the E. coli wild-type strain W3110 (ATCC 27325) served as the template.
  • the phosphorothioate-protected oligonucleotides lipAS1 and lipAS2 with the following sequences were used:
  • lipASl (SEQ ID NO: 3)
  • lipAS2 (SEQ ID NO: 4)
  • the DNA fragment with a length of approx. 1 kb obtained during the PCR was then purified using a DNA adsorption column from the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • the vector pASK-IBA3 was cut with the restriction enzyme Eco31I (isoschizomer from Bsal) under the conditions specified by the manufacturer, then dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase at the 5 'ends and then by means of the PCR fragment cleaned using the GENECLEAN method.
  • the ligation of the PCR fragment with the cut and dephosphorylated vector was carried out according to the manufacturer's instructions using the T4 DNA ligase.
  • the transformation of E. coli cells of the DH5 ⁇ strain with the ligation mixture was carried out by means of electroporation in a manner known to the person skilled in the art.
  • the transformation mixture was applied to LB-A picillin agar plates (10 g / 1 tryptone, 5 g / 1 yeast extract, 10 g / 1 NaCl, 15 g / 1 agar, 100 mg / 1 ampicillin) and incubated at 37 ° C. overnight ,
  • the desired transformants were identified by means of a restriction analysis after plasmid isolation using a QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden).
  • Example 2 Production of a producer of R- ⁇ -lipoic acid
  • the plasmid pASK-IBA3-lipA described in Example 1 was transformed into the E. coli strain W3110 by electroporation and after selection on LB agar plates with 100 mg / 1 ampicillin, this became Plasmid from one of the transformants reiso- lated, cleaved with restriction endonucleases and checked.
  • the control plasmid pASK-IBA3 was experienced in an analogous manner.
  • the strain W3110 / pASK-IBA3-lipA was used for the fermentative production of R- ⁇ -lipoic acid.
  • the strain W3110 was used as a comparison with the plasmid pASK-IBA3, which was cultivated under exactly the same conditions.
  • 5 ml of LB liquid medium containing 100 mg / 1 ampicillin were inoculated with the respective strain and incubated for 16 h at 37 ° C. and 160 rpm on a shaker. The cells were then harvested by centrifugation and washed twice with the appropriate volume of sterile saline (0.9% NaCl).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Zellen und ein Verfahren zur Herstellung von R-α-Liponsäure mittels Fermentation. Der erfindungsgemäße Wirtsorganismenstamm, der zur fermentativen Herstellung von R-α-Liponsäure geeignet ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß er ein Gen codierend für eine Liponsäure-Synthase überexprimiert und die gebildete R-α-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet.

Description

Zellen, die R-α-Liponsäure sekretieren und Verfahren zur fer- entativen Herstellung der R-α-Liponsäure
Die Erfindung betrifft Zellen, die R-α-Liponsäure sekretieren, und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung der R-α- Liponsäure unter Verwendung dieser Zellen.
R-α-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro- und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-α-Liponsäure jeweils kovalent an die ε-Aminogruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden Enzyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-α-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3.1.12] bzw. der α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3.1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgruppenüberträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen Decarboxylierung von α- Ketosäuren. Außerdem fungiert Liponsäure als Äminomethyl- Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen.
α-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom Cβ. Dabei stellt die R-Konfi- guration der α-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofaktor der entsprechenden Enzyme. α-Liponsäure kann sowohl in ei- ner oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form ( 6, 8-Dimercapto-Oktansäure) vorkommen. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung "α-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der α^Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium- oder das Am- moniumsalz, zu verstehen.
Die Biosynthese von R-α-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- terium Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 1). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova- lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwefelatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-ACP) übertragen, wobei R-α-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird von der Sulfurtransferase Liponsäure-Synthase [EC 2.8.1.-], dem lipA-Genprodukt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letztendlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-α-Liponsäure von R-α-Lipoyl-ACP auf die E2- Untereinheit der α-Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Li- poyl-Protein-Ligase B [EC 6.-.-.-], dem üpS-Genprodukt, katalysiert, ohne dass dabei jedoch R-α-Lipoyl-ACP oder R-α- Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178).
Über die Biosynthese von R-α-Liponsäure in Eukaryonten ist wenig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-α-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.
Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh die Bedeutung der α-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt: α-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist α-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der α-Liponsäure, aufgrund ihrer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, andere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder α-Tocopherol direkt oder indirekt zu regenerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Ent- sprechend kommt der α-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascorbinsäure, α-Tocopherol und Glutathion, dem sogenannten "Netzwerk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. α-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B. Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden, eingesetzt . Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der α-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersuchungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristallisiert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der α- Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist. So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-α-Liponsäure zur Bildung funktioneller α-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen inhibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-α-Liponsäure. Die Reduktion von α-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen α-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- α-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, α-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.
Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von α-Liponsäure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R- und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Yadav et al., 1990, J. Sei. Ind. Res . 49: 400-409). Zur Gewinnung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure wurden verschie- dene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der α-Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder chemisch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76: 4748; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc, Chem. Commun. : 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Entstehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syntheseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder chemisch (DE 3629116; DE 19533881; Bringmann et al . , 1999, Z. Na- turforsch. 54b: 655-661; DE 10036516) oder durch eine stereospezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen eingeführt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett. 30: 5705-5708; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc, Chem. Commun. : 729-730; DE 10056025) . Andere Prozesse wiederum starten die chemische Synthese von enantiomerenreiner α-Liponsäure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z. B. S- Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I: 9-12; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2183-2186) . Wegen z. T. aufwendiger Syntheseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomerenreiner R-α-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.
Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Naturstoffe, wie z.B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren, erfolgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Zellen zur
Verfügung zu stellen, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren.
Diese Aufgabe' wird gelöst durch Zellen, die dadurch gekenn- zeichnet sind, dass sie ein Liponsäure-Synthase-Gen (IipΛ-Gen) überexprimieren.
Unter einer Überexpression ist im Sinne der vprliegenden Erfindung vorzugsweise zu verstehen, dass das Liponsäure- Synthase-Gen im Vergleich zur jeweiligen Wildtyp-Zelle, aus der das Liponsäure-Synthase-Gen gewonnen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5, vermehrt exprimiert wird.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Liponsäure-Synthase-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder um eine funktio- nelle Variante dieses Gens. Unter einer funktionellen Variante ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die en- zymatische Aktivität der durch das Gen codierten Liponsäure- Synthase erhalten bleibt.
Um eine Überexpression des lipÄ-Gens in der Zelle zu erreichen, kann die Kopienzahl des lipA-Gens in einer Zelle erhöht sein und/oder es kann die Expression des lipÄ-Gens, vorzugsweise durch geeignete Promotoren, gesteigert sein.
Durch die Überexpression eines lipÄ-Gens ist die Liponsäure- Synthase-Aktivität der Zelle jeweils um mindestens den glei- chen Faktor gesteigert.
Vorzugsweise überexprimiert eine erfindungsgemäße Zelle ein Liponsäure-Synthase-Gen, das für ein Protein umfassend die Sequenz ID NO: 2 oder funktioneile Varianten mit einer Sequenz- homologie zu SEQ ID NO: 2 größer 40 % codiert.
Vorzugsweise ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 60 %, besonders bevorzugt ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 80 %.
In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus BESTFIT (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin) erhalten werden.
Die Erhöhung der Kopienzahl eines lipÄ-Gens in einer Zelle kann mit dem Fachmann bekannten Methoden erreicht werden. So kann zum Beispiel ein lipA-Gen in einen Plasmid-Vektor mit mehrfacher Kopienzahl pro Zelle (z.B. pUC19, pBR322, pACYC184 für Escherichia coli) kloniert und in die Zelle eingebracht werden. Alternativ kann ein lipÄ-Gen mehrfach ins Chromosom einer Zelle integriert werden. Als Integrationsverfahren können die bekannten Systeme mit temperenten Bakteriophagen, in- tegrative Plasmide oder die Integration über homologe Rekombination genutzt werden (z.B. Hamilton et al . , 1989, J. Bacteri- ol. 171: 4617-4622) .
Bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl durch Klonierung eines lipÄ-Gens in einen Plasmid-Vektor unter Kontrolle eines Promotors. Besonders bevorzugt ist die Erhöhung der Kopienzahl in Escherichia coli durch Klonierung eines lipA-Gens in ein pUC-Derivat wie z. B. pASK-IBA3 (IBA, Institut für Bioanaly- tik, Göttingen) . Die Erfindung betrifft somit auch ein Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass es ein ÜpÄ-Gen unter funktionel- ler Kontrolle eines Promotors enthält.
Als Kontrollregion für die Expression eines plasmid-codierten lipÄ-Gens kann die natürliche Promotor- und Operatorregion des lipA-Gens dienen, die verstärkte Expression eines lipA-Gens kann jedoch insbesondere auch mittels anderer Promotoren erfolgen. Entsprechende Promotorsysteme, die entweder eine andauernde oder eine kontrollierte, induzierbare Expression des Liponsäure-Synthase-Gens ermöglichen, wie beispielsweise in
Escherichia coli der konstitutive GAPDH-Promotor des gapÄ-Gens oder die induzierbaren lac-, tac-, trc-, lambda-, ara- oder tet-Promotoren, sind dem Fachmann bekannt (Makrides S. C, 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Solche Konstrukte können in an sich bekannter Weise auf Plasmiden oder chromosomal verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform für die Klonierung eines lipÄ-Gens wird ein Plasmid verwendet, das bereits einen Promotor zur verstärkten Expression enthält, wie beispielsweise das induzierbare tet-Promotor/Repressorsystem von Escherichia coli .
Des weiteren kann eine verstärkte Expression dadurch erreicht werden, daß Translationsstartsignale, wie z. B. die Ribosomen- bindestelle oder das Startcodon des Gens, in optimierter Sequenz auf dem jeweiligen Konstrukt vorhanden sind, oder dass gemäß der "codon usage" seltene Codons gegen häufiger vorkommende Codons ausgetauscht werden.
Bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Zellen ein Plasmid mit einem JipA-Gen sowie den genannten Modifikationen der Regulationssignale.
Die Klonierung eines lipA-Gens in einen Plasmid-Vektor erfolgt beispielsweise durch spezifische' Amplifikation eines lipA-Gens mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette 2ipA-Gen erfassen, und anschließende Ligation mit Vektor-DNS-Fragmenten.
Erfindungsgemäße Zellen, die eine gegenüber einer Ausgangszel- le erhöhte Expression eines lipA-Gens und verbunden damit eine gesteigerte Liponsäure-Synthase Aktivität aufweisen, können mit Standardtechniken der Molekularbiologie aus einer Ausgangszelle erzeugt werden.
In einer Vielzahl von Zellen konnten Liponsäure-Synthase-Gene identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro- oder eukaryontischen Organismen herstellen, die in der Lage sind, R-α-Liponsäure selbst zu synthetisieren (Ausgangszelle) , die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen geeignet.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe- oder Bakterienstämme. Besonders bevorzugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli .
Durch eine gängige Transformationsmethode (z.B. Elektroporati- on) werden die lipA-haltigen Plasmide in eine Ausgangszelle eingebracht und beispielsweise mittels Antibiotika-Resistenz auf plasmid-tragende Klone selektiert.
Die Erfindung betrifft somit auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Fermentations- verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Herstellung enantiomerenreiner R-α-Liponsäure ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine erfindungsgemäße Zelle in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenrei- ne R-α-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.
Die Gewinnung von R-α-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie Zentrifugation des Mediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Extraktion oder Präzipitation des Produkts, erfolgen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um das erste Verfahren, bei dem die gesamte Synthese von R-α- Liponsäure ausschließlich in einem Fermentationsprozess mit lebenden Zellen erfolgt. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den herkömmlichen chemischen Prozessen liegt in der enantiomerenspezifischen Biosynthese von R-α- Liponsäure, weshalb eine aufwendige Razemattrennung während oder am Ende der Synthesekette entfällt. Des weiteren ist bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren für R-α-Liponsäure die Umweltbelastung im Vergleich zur chemischen Synthese we- sentlich geringer.
Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebunde- ner Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-α-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106: 259-266; Miller et al., 2000, Biochemistry 39:15166-15178). Überraschenderweise wurde jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Überexpression eines Liponsäure-Synthase-Gens zur Anhäufung freier, enantiomerenreiner R-α-Liponsäure im Kulturmedium des Wirtsorganismus führt. Dies wiederum erlaubt eine einfache I- solierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor aufgebrochen werden müssen bzw. ohne dass die R-α-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2-Untereinheit der α-Ketosäure- Dehydrogenasen) abgespalten werden muss.
Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-α-Liponsäure erfolgt vorzugsweise in einem aus der Literatur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).
Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zucker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Äpfelsäure, Berηsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glu- taminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure. Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit ei- ner Kettenlänge von C6-C8 (Hexan- bzw. Oktansäure) als spezifische Vorstufen für die α-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zugesetzten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 1-30 g/1.
Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugsweise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 16 - 150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachtumstemperatur . Als optimaler Temperaturbereich werden 15 - 55 °C bevorzugt. Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.
Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-α-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipA-Mutante) . Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-α-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) . Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645) würde allerdings auch ohne supplementierte R-α-Liponsäure wachsen, wenn das Medium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthielte. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-α-Liponsäure zu vermeiden - beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Glucose und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-α-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat - erfolgt bereits die Anzucht des R-α-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Succinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110 / pASK- IBA3-lipA, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15104 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
Beispiel 1 : Konstruktion des Vektors pASK-IBA3-lipA
A. Amplifizierung des lipA-Gens
Das lipA-Gen aus E. coli wurde mittels der Polymeraseketten- reaktion (PCR) unter Verwendung der Pwo-DNA-Polymerase nach gängiger, dem Fachmann bekannter Praxis amplifiziert . Als Matrize diente die chromosomale DNA des E. coli-Wildtypstammes W3110 (ATCC 27325) . Als Primer wurden die phosphorothioat- geschützten Oligonukleotide lipASl und lipAS2 mit folgenden Sequenzen verwendet:
lipASl: (SEQ ID NO: 3)
5'- GAT CGA GGT CTC GAA TGA GTA AAC CCA TTG TGA TG -3' Bsal
lipAS2: (SEQ ID NO: 4)
5'- GAT CGA GGT CTC GGC GCT CTT AAC TTC CAT CCC TTT CG -3' Bsal
Das bei der PCR erhaltene DNA-Fragment mit einer Länge von ca. 1 kb wurde anschließend mittels eines DNA-Adsorptionssäulchens des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt.
B. Klonierung des lipA-Gens in den Vektor pASK-IBA3
In das PCR-Fragment wurden über die Primer-Sequenzen Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Bsal (Erkennungssequenz in den Oligonukleotiden unterstrichen) eingeführt. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuclease Bsal unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten, anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt und dann mittels des GENECLEAN Kits (BIO 101 Inc . , La Jolla, Kalifornien, USA) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel isoliert. Der Klonierungs- und Expressionsvektor pASK-IBA3 (IBA, Institut für Bioanalytik, Göttingen) enthält verschiedene genetische Elemente, die eine kontrollierte Expression eines beliebigen Gens erlauben. Es handelt sich dabei um einen high-copy Vektor mit einem von der pUC-Plasmidfamilie abgeleiteten Replikationsursprung. Die Expression des klonierten Gens wird durch den Tet-Repressor unterdrückt und kann durch (Anhydro- )Tetracyclin induziert werden. Des weiteren enthält der Vektor noch die sogenannte Strep-tag II-Sequenz, welche bei der Klo- nierung direkt an das letzte Codon des klonierten Gens anfusioniert wird. Die auf diese Weise entstandene Genfusion codiert nun für ein Protein, das C-terminal um die Aminosäuresequenz des Strep-tag II (SAWSHPQFEK: SEQ ID NO: 5) verlängert ist. Mit Hilfe dieses Anhängsels ist eine einfache Affinitätsreini- gung des Proteins möglich, da das StrepTagll-Peptid eine Bindung an Streptavidin-Säulen vermittelt.
Zur Klonierung des lipA-Gens wurde der Vektor pASK-IBA3 mit dem Restriktionsenzym Eco31I (Isoschizomer von Bsal) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten, anschließend durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase an den 5'- Enden dephosphoryliert und dann wie das PCR-Fragment mittels der GENECLEAN-Methode gereinigt. Die Ligation des PCR-Fragments mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Vektor erfolgte ach Herstellerangaben unter Verwendung der T4-DNA-Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5α mit dem Ligationsansatz wurde mittels Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise durchgeführt. Der Transformationsansatz wurde auf LB-A picillin-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 100 mg/1 Ampicillin) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plasmidiso- lierung mittels eines QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hil- den) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert.
Im dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid pASK-IBA3-lipA (Fig. 2) ist wie oben beschrieben an das letzte Codon des lipA-Gens die Strep-tag II-Sequenz anfusioniert. Diese C-terminale Verlängerung ist allerdings für die Erfindung nicht relevant, da sie auf die Aktivität des LipA-Proteins und damit auf die R-α- Liponsäure-Produktionsleistung des erfindungsgemäßen Wirtsorganismus keinen signifikanten Einfluss hat.
Beispiel 2 : Herstellung eines Produzenten von R-α-Liponsäure Das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pASK-IBA3-lipA wurde mittels Elektroporation in den E. coli-Stamm W3110 transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 100 mg/1 Ampicillin wurde das Plasmid aus einer der Transformanden reiso- liert, mit Restriktionsendonucleasen gespalten und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pASK-IBA3 wurde in analoger Weise erfahren.
Beispiel 3 : Fermentati e Produktion von R-α-Liponsäure
Für die fermentative Produktion von R-α-Liponsäure wurde der Stamm W3110 / pASK-IBA3-lipA verwendet. Als Vergleich diente der Stamm W3110 mit dem Plasmid pASK-IBA3, der unter exakt denselben Bedingungen kultiviert wurde. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das 100 mg/1 Ampicillin enthielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechen- den Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen. Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließlich 15 ml BS-Medium (7 g/1 K2HP04; 3 g/1 KH2P04; 1 g/1 (NH4)2S0 ; 0,1 g/1 MgS04 x 7 H20; 0,5 g/1 Na3Citrat x 3 H20; 0,2% säurehydroly- siertes Casein (vitaminfrei); 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20; pH 6,8 mit HC1 eingestellt), das außerdem 100 mg/1 Ampicillin enthielt, im Verhältnis 1:100 angeimpft. Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler für 48 h. Die Expression des Liponsäure-Synthase- Gens wurde durch Zugabe von 0,2 mg/1 Anhydrotetracyclin nach ca. 4 h Inkubation induziert. Nach 24 h und 48 h wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-α-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die erzielten Gehalte freier R-α-Liponsäure im jeweiligen Kulturüberstand: Tabelle 1
Figure imgf000016_0001

Claims

Patentansprüche
1. Zelle, die enantiomerenreine R-α-Liponsäure in ein Kulturmedium sekretiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Li- ponsäure-Synthase-Gen (ÜpA-Gen) überexprimiert .
2. Zelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Liponsäure-Synthase-Gen im Vergleich zu einer Wildtyp- Zelle, aus der das Liponsäure-Synthase-Gen gewonnen wurde, mindestens um den Faktor 2, bevorzugt mindestens um den Faktor 5, vermehrt exprimiert.
3. Zelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Liponsäure-Synthase-Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder eine funktioneile Variante dieses Gens handelt.
4. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopienzahl des lipA-Gens in der Zelle erhöht ist oder die Expression des lipA-Gens, vorzugsweise durch einen geeigneten Promotor, gesteigert ist.
5. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Liponsäure-Synthase-Gen für ein Protein umfassend die Sequenz ID NO: 2 oder funktioneile Varianten mit einer Sequenzhomologie zu SEQ ID NO: 2 größer 40 % codiert .
6. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn- zeichnet, dass es sich um einen Mikroorganismus, wie zum
Beispiel einen Hefe- oder Bakterienstamm, handelt.
7. Zelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Bakterienstamm aus der Familie der Enterobacteria- ceae, ganz besonders bevorzugt um einen Stamm der Art Escherichia coli handelt.
8. Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass es ein lipA-Gen unter funktioneller Kontrolle eines Promotors enthält.
9. Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass in eine Ausgangszelle ein erfindungsgemäßes Plasmid eingebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangszelle eine Zelle eines pro- oder eukaryonti- sehen Organismus eingesetzt wird, die in der Lage ist, R-α- Liponsäure zu synthetisieren, die einem rekombinanten Verfahren zugänglich ist und die durch Fermentation kultivierbar ist.
11. Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner R-α- Liponsäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem Kulturmedium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R- α-Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-α-Liponsäure von dem Kulturmedium abgetrennt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der enantiomerenreinen R-α-Liponsäure durch Zentrifugation des Kulturmediums und anschließende Extraktion oder Präzipitation der R-α-Liponsäure erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Inkubation der Zellen in einem Minimalsalz- medium als Kulturmedium unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeitraum von 16 - 150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachstumstemperatur erfolgt.
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