WO2004005901A1 - Detection of molecular identification by electrochemiluminescence on conductive polymer - Google Patents

Detection of molecular identification by electrochemiluminescence on conductive polymer Download PDF

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WO2004005901A1
WO2004005901A1 PCT/FR2003/002058 FR0302058W WO2004005901A1 WO 2004005901 A1 WO2004005901 A1 WO 2004005901A1 FR 0302058 W FR0302058 W FR 0302058W WO 2004005901 A1 WO2004005901 A1 WO 2004005901A1
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redox
electrochemiluminescence
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Gérard Bidan
Martial Billon
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Commissariat A L'energie Atomique
Universite Joseph Fourier
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Definitions

  • the present invention relates to a method of detecting molecular recognition by electrochemiluminescence on a conductive polymer with electronic conduction. It generally allows quantitative and qualitative detection of molecular recognition between a first molecule fixed on a support and a second molecule sought in a sample.
  • This invention relates to the field in the broad sense of sensors and biochips, in particular those or those comprising at least one electronic conductive polymer film such as polypyrrole and their derivatives.
  • This invention relates to detection by electrogenerated chemiluminescence or electrochemiluminescence (ECL) via a relay having redox properties, called in the present "redox relay”.
  • molecular recognition can be defined as a specific interaction between two more or less complex molecules, leading to a bond or assembly of the two molecules sufficiently stable so that the molecules can be detected when they are linked. It may, for example, be a hybridization of nucleic acids (DNA and / or RNA), a recognition reaction of antigen / antibody type, a protein / protein type interaction, sugar / protein type interaction, enzyme / substrate type interaction, double strand DNA / protein type interaction, etc.
  • the method of the present invention finds, for example, an application in the detection in the field of "Biochips" in the broad sense, that is to say nucleic acid chips and protein chips or any system including multiparametric for it. study of probe-target recognition of biological substrates. This is for example the detection of hybridization of nucleic acids on a solid support, in an aqueous medium or in air, for example in the context of a screening or a detection of hybridization on a biochip.
  • the method of the present invention can be applied for all marking purposes on surfaces of conductive polymers with electronic conduction by an electrochemiluminescent system.
  • the references in square brackets [] refer to the annexed reference list.
  • probe molecules generally biological molecules such as DNA fragments, or more generally fragments of oligonucleotides (or ODN), immobilized on very small surfaces.
  • target molecules like strands of DNA or complementary ODN
  • the sensitivity of these biosensors depends in part on the technique used to reveal the phenomenon of recognition of probe molecules / target molecules.
  • electrochemiluminescent markers such as luminol and its derivatives or organometallic compounds such as the Ru (2, 2 '-bipyridine) 3 2+ , Ru (bpy) 3 2+ complex [1] and [2] .
  • electrochemiluminescence leads to an irreversible destruction of the luminol molecule or its derivatives. The light emission then corresponds to a flash, its intensity rapidly decreasing over time.
  • This complex can be formed in a first way by the annihilation reaction, reaction (3) below, between Ru (bpy) 3 3+ and Ru (bpy) 3 2+ ; each of these two species being electrogenerated from the Ru (bpy) 3 2+ complex, respectively by oxidation, described by reaction (1) below, and reduction, described by reaction (2) below, of this last by applying alternately, at a frequency of the order of 0.2 Hz, a potential of +1.3 V and -1.3 V (vs Ag / AgCl).
  • This first route does not relate to the process of the present invention. It is also possible, in a second way, from the Ru (bpy) 3 2+ complex to observe a permanent emission at 610 nm by electrochemiluminescence by applying a constant potential of +1.3 V (vs Ag / AgCl). In this case, the presence of a co-substrate, also called sacrificial substrate, is then required.
  • This compound which may be an aliphatic amine such as tripropylamine (Pr 3 N), as described in document [1], generates a reducing agent Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 , as described in reaction (6 ) below, which can either react with the complex Ru (bpy) 3 3+ to form the excited state Ru (bpy) 3 + * , according to reaction (7) below, or reduce the species Ru ( bpy) 3 2+ in Ru (bpy) 3 + , according to reaction (8) below, to lead to Ru (bpy) 3 2 + * according to reaction (3) above.
  • the Ru (bpy) 3 2+ complex is not exhausted but regenerated during electrochemiluminescence, on the other hand, the co-substrate is irreversibly consumed.
  • the Ru (bpy) 3 2+ complex is immobilized by a covalent bond in a poly (4-vinylpyridine) matrix.
  • the principle of oxalate detection is based on the electrochemical generation of Ru (bpy) 3 3+ which then reacts with the analyte C 2 0 4 2 " to lead to the complex in the excited state Ru (bpy) 3 2 + * The latter then emits at 610 nm when it is deactivated according to reaction (4) above R.
  • Blanchard et al. [4] have also developed a sensor for detecting oxalate ions in electrostatically trapping a derivative of the Ru (bpy) 3 2+ complex in an electronically conductive polymer matrix.
  • the ruthenium complex in its sulfonic form RuBPS (tris (4, 7-diphenyl-l, 10-phenantrolinedisulfonic acid) ruthenium II) is inserted as a doping counterion in the polymer matrix (polyMPP) during its electrosynthesis via l electrochemical oxidation of 1-methyl-3- (pyrrol-1-ylmethyl) pyridinium chloride (MPP) monomers.
  • polyMPP polymer matrix
  • MPP pyrrol-1-ylmethyl
  • the object of the present invention is precisely to provide such an alternative method and to solve the aforementioned problems of the prior art by providing a method for detecting molecular recognition between a probe molecule fixed on a support and a target molecule sought in a test sample, said method further allowing precise and sensitive qualitative and quantitative detection of the target molecule when it is present in a sample.
  • Said method of the present invention comprises the following steps: a) bringing together a test support comprising a surface comprising an electronically conductive polymer film on which a probe molecule is fixed, b) marking before or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent marker, c) bringing the target molecule into contact with the test support under physical and chemical conditions allowing molecular recognition and specific assembly between the probe molecule and the target molecule, d) rinsing the test support so as to removing the excess of electrochemiluminescent marker while preserving the specific assembly between the probe molecule and the target molecule of step c), and e) subject the rinsed test support obtained in step d) to a reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an electronic transfer between the target marker and the support in the presence of a redox relay.
  • step e) The detection of a chemiluminescence in step e) reveals an assembly by molecular recognition in the abovementioned sense between the probe molecule fixed on the support and the desired target molecule, and therefore the presence of the target molecule in the test sample.
  • the detection of recognition between the probe molecule and the labeled target molecule is based on electrogenerated chemiluminescence, or electrochemiluminescence (ECL). It is an optical detection allowing to overcome the drawbacks of the methods of the prior art while retaining the sensitivity of the optical detectors. Indeed, the electrical initiation of chemiluminescence only concerns the chemiluminescent marker and not the test support or the biomolecules. In addition, this new detection method applied to biochips allows quantitative measurements of probe molecule / target molecule recognition to be carried out, unlike fluorescence detection.
  • ECL electrochemiluminescence
  • the excitation by an electric pulse according to the present invention allows a spatial control and a fast and easy implementation while being freed from an expensive apparatus of laser excitation used in the prior art.
  • the present invention therefore finds particular application in the field of biochips, where the support on which the conductive film is deposited in accordance with the present invention forms the biochip.
  • the support can be any of the supports used by a person skilled in the art for the manufacture of biochips.
  • a metal support such as Au, Pt, etc. can be used.
  • a support made of a semiconductor material a glass / ITO support; a glass or metallic quartz support; a plastic / ITO support; a metallic plastic support; a glassy carbon support; or a support formed by depositing a screen-printed conductive material on an insulating substrate or on one of the aforementioned supports.
  • the electronic conductive polymer film can be a conductive polymer film such as those used by a person skilled in the art for the manufacture of biochips on which probes are grafted.
  • the polymer can be a conductive polymer such as those described in the "Engineering Techniques" -A3140- under the name “intrinsic conductive polymers”: these are polymers formed from molecules carrying conjugated bonds (oligomers or crosslinked networks) and optionally doped with electron donating or accepting dopants such as poly (acetylene), poly (sulfur nitride), polyphenylene, polypyrrole, poly (phenylene sulfide), polythiophene, polyaniline etc.
  • it may be a film of polypyrrole; poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) or their derivatives.
  • the conductive polymer film can be deposited on the support using the conventional techniques known to those skilled in the art, for example electrodeposition or
  • spin coating or the inkjet.
  • the conductive polymer film can be produced from simple pyrrole type monomers or from pre-synthesized oligomers such as oligothiophenes, as well as from more complex molecular systems such as complexing units of transition metals such as as phenanthrolines, phenylpyridine, etc., carrying electropolymerizable units which leads during the preparation of the polymer to a conjugated network.
  • the probe molecule can be for example single or double-stranded DNA, an oligonucleotide, an antibody, a protein, a sugar or an enzyme, as well as any molecule or biomolecule allowing specific recognition and assembly such as defined above.
  • the fixing of the probe molecule to the conductive polymer film can be done by conventional methods of chemistry used to fix probes on a biochip.
  • the bond between the film and the probe can be adsorption, electrostatic, chemical obtained by self-assembly, silanization, or by any chemical, electrochemical, photochemical, etc. method. known to those skilled in the art for the deposition of the probe molecule, for example functionalized by a group providing the property of self-assembly, anchoring, coupling, or polymerizable chemically, electrochemically, photochemically or electrophotochemically by photosensitization.
  • connection between the electronic conductive polymer film deposited on the support and the probe can be obtained in one step for example by the MICAM process (registered trademark).
  • the documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 and US 5 810 989 describe, for example, techniques for film deposition and fixing of probe molecules which can be used in the present invention. These are, for example, electro-copolymerization on a support, for example on a silica substrate, of precursor monomers of the conductive polymer, such as pyrrole, with monomers, for example of pyrrole, functionalized by a probe molecule according to the present invention, for example oligonucleotides. In these techniques, the adhesion of the conductive polypyrrole film to the substrate is exploited so as to achieve the fixing of the recognition probe molecules therein.
  • the probe can also be fixed to the film after it has been deposited on the support, for example by post-functionalization of the film, for example of polypyrrole (Ppy), deposited for example by electrografting on the support, by a system of affinity recognition, for example an avidin / biotin system or equivalent systems, or derivatives of these systems.
  • Ppy polypyrrole
  • affinity recognition for example an avidin / biotin system or equivalent systems, or derivatives of these systems.
  • These structures can for example be used on a support (S) of gold (Au) or silica, or on any aforementioned support allowing the grafting of the
  • This fixing can be done for example with addressing of the probes. It is, for example, a photochemical addressing, a mechanical addressing, for example by micropipetting using a dispersing robot, or an electrochemical addressing. These techniques for attaching probes to a polymer film are known to those skilled in the art. Addressing has the advantage that it then allows multi-parameter analyzes.
  • the probe molecule can be anchored by simple coupling between two reactive chemical functions, for example activated ester type and an amine, one of these functions being carried by the probe molecule and the other anchored on the film.
  • the chemical probe / film coupling can be prevented by blocking the reactivity of the chemical function carried by the film.
  • the impediment can be lifted, "unlocked", by making the function reactive again, this thanks for example to an electrochemical or photochemical activation.
  • the coupling of the probe molecule on the film is again possible.
  • the labeling of the target with the electrochemiluminescent marker can be prior or after step c) of bringing the target molecule into contact with the test support.
  • the labeling of the target molecule can be carried out either on the sample to be tested before it is brought into contact with the test support, that is to say before the assembly probe molecule / target molecule is done, either on the test support after step c) of bringing the target molecule into contact with the test support, that is to say, when the probe molecule / target molecule is assembled.
  • the method of the present invention for example according to the type of probe / target molecules involved.
  • the marker can be one of the electrochemiluminescent markers known to those skilled in the art.
  • it may be a marker having electrochemiluminescence properties, the potential for triggering the ECL in the presence of the co-substrate, lies in a potential domain where the conductive polymer film has an effect of over oxidation. This over-oxidation is manifested by a notable degradation of the properties of electronic conductivities of the conductive polymer film.
  • the electrochemiluminescent marker can be an organometallic complex. It can be chosen, for example, from the group comprising the osmium and ruthenium complexes with identical or different ligands of bi or terpyridine and / or phenanthroline and their derivatives; a europium cryptate or acridinium esters.
  • the labeling of the target can be done by bonding between the target and the metal complex.
  • the aim of the redox relay is, in step e), to be able to trigger the electrochemiluminescence of the marker at a potential lower than that applied in the absence of redox relay by transfer of the electrons from the marker towards the polymer film deposited on the support. It acts as a redox relay between the marker and the film, and lowers the reading potential of electrochemiluminescence.
  • the reading potential of electrochemiluminescence being lower than that which should be used to mark it alone, the conductive polymer film is preserved from overoxidation and therefore from the notable degradation of its electronic conductivity properties.
  • This redox relay can be in solution, or immobilized, for example by grafting, on the support with the film or with the assembly resulting from the molecular recognition between the probe and the target, for example in the form of an intercalant having properties redox or comprising redox groups.
  • an intercalant having properties redox or comprising redox groups.
  • a metallocene group for example a ferrocene or a diferrocene
  • transition metal complexes such as a cobalt complex, or other transition metals
  • a group of the family of phenothiazine, methylviologene and their respective derivatives or DNA intercalants having redox properties or comprising redox groups; aromatic amines or heterocycles, etc.
  • the reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an indirect electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay may have to be carried out in the presence of a sacrificial substrate.
  • This compound may for example be one of those described in document [1], for example an aliphatic amine such as tripropylamine (Pr 3 N) which generates a reducing agent Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 , according to reaction (6) above, which can either react with the Ru (bpy) 3 3+ complex to form the excited state Ru (bpy) 3 2 + * , according to reaction (7) above, or reduce the species Ru (bpy) 3 + to Ru (bpy) 3 + , according to reaction (8) above, to lead to Ru (bpy) 3 + * according to reaction (3) above.
  • an aliphatic amine such as tripropylamine (Pr 3 N) which generates a reducing agent Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 , according to reaction (6) above, which can either react with the Ru (bpy) 3 3+ complex to form the excited state Ru (bpy) 3 2 + * , according to reaction (7) above, or reduce the
  • FIG. 1 is a schematic representation of an electronic transfer between the labeled target molecule and the support via the redox relay and the electronic conductive film during an electrochemiluminescence reading according to the method of the present invention.
  • “su” represents the support
  • “f” the electronic conductive film “li” the link between the electronic conductive film and the probe molecule
  • “S” the probe molecule “C” the target molecule
  • “m” the marker the marker.
  • the final step of reading electrochemiluminescence can be carried out using a luminometer which measures the intensity of luminescence emitted, for example at 610 nm for ruthenium complexes.
  • the intensity of luminescence emitted is proportional to the concentration of target molecules assembled to the probe molecules.
  • the triggering potential of the ECL without redox relay is incompatible with the electronic conduction properties of the polymer film such as pyrrole because it is located in a potential domain where the pyrrole is in a state of advanced overoxidation and therefore plays the role of a quasi-passivating layer making the direct electronic transfer support / probe insufficient to allow detection of the ECL.
  • the ECL reading potential in the process of the present invention is lowered, which preserves the polymer film from over-oxidation, and allows the ECL to be read.
  • the electronic transfer of the support to the electrochemiluminescent marker in the presence of the redox relay can therefore be carried out through an electronically conductive polymer film which is not the case in the systems developed by Xu et al. [6-7].
  • the anchoring of the electrochemiluminescent group on the support is carried out by means of respectively alkane aluminum bisphosphonate and aminohexane, layers which are non-conductive.
  • the immobilization of the electrochemiluminescent marker is carried out specifically on the target analyte unlike the processes where the complex is immobilized in a polymer matrix on the electrode [3,4].
  • the use of a redox relay according to the present invention promotes and makes possible the electronic transfer of support / electronic conductive film / marker and therefore the performance of this mode of detection by electrochemiluminescence.
  • the support can have a double active function allowing (i) the electro-controlled immobilization of the biological object within the electronic conductive film and (ii) the activation as a "trigger" of the electrochemiluminescence process of the electrochemiluminescent marker in the presence of the relay which allows its application to a multi-parameter system (parallel analysis, or "multi-array") of biochip type based on technology developed over several years using a network of MICAM type electrodes (registered trademark).
  • Each stud making up a MICAM biochip specifically recognizing a particular molecule, for example a DNA sequence, the different molecules, for example different DNA sequences, present in a given sample can be detected simultaneously during analysis .
  • the support has a double active function allowing (i) the electro-controlled immobilization of the probe biological object, in this example DNA, and (ii) activation as a trigger for electrochemiluminescence.
  • the present invention therefore allows for the first time the implementation of an electrochemiluminescence process on a parallel analysis system ("multi-array") in which the immobilization support is also that which allows the initiation of chemiluminescence.
  • the application of the present invention to a multi-parameter system further allows multi-parameter and / or parallel reading that does not offer the successive positioning devices of the prior art.
  • the method of the present invention makes it possible to carry out direct quantitative analyzes while eliminating the problems of background noise inherent in fluorescence measurements.
  • the immobilization of the marker is carried out specifically on the target molecule unlike the methods of the prior art involving electrochemiluminescent intercalants in the case of DNA biosensors.
  • Figure 1 is a schematic representation of the reaction mechanism of the present invention. Examples
  • Example 1 ELECTROCHIMILUMINESCENCE of the Ru (bpy) 3 + complex in solution on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
  • the inventors undertook the study of electrochemiluminescence from the trisbipyridine complex of ruthenium (Ru (bpy) 3 2+ ) in solution. This experiment was carried out using a 1 mM Ru (bpy) 3 2+ solution + 50 mM tripropylamine (TPA) + 0.1 M LiCl0 4 in a mixed medium CH 3 CH / H 2 0 (50:50 by volume) or pure CH 3 CN on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
  • Ru (bpy) 3 2+ ruthenium
  • TPA tripropylamine
  • the orange light emission starts from a threshold voltage of 0.8 V whose intensity increases to 1.0 V to stabilize in the area of potential explored until at 1.2 V.
  • Example 2 ELECTROCHIMILUMINESCENCE of Pu (bpy) 3 2+ in solution in the presence of sodium N-methylphenothiazine or sodium N-butylphenothiazine sulfonate on a platinum electrode covered with a polypyrrole film.
  • Pu (bpy) 3 2+ sodium N-methylphenothiazine or sodium N-butylphenothiazine sulfonate on a platinum electrode covered with a polypyrrole film.
  • Electrochemiluminescence is studied from Ru (bpy) 3 2+ complex in solution and a platinum electrode covered by a polypyrrole film (20 mC / cm 2 ). If to the preceding solution (1 mM in Ru (bpy) 3 2+ + 50 mM of tripropylamine (TPA) + LiCl0 4 0.1 M in CH 3 CN / H 2 0), 2 mM of N-methylphenothiazine are added, it is then possible to observe an orange luminescence emission centered at 610 nm typical of electrochemiluminescence of Ru (bpy) 3 2+ on this electrode covered with the polypyrrole film by applying only a potential of 0.65 V. This emission is constant as long as this potential value is imposed. On the other hand, if the potential is brought to 1 V, that is to say to the potential where the over-oxidation of the polypyrrole occurs, this emission disappears almost instantaneously and irreversibly.
  • a redox relay in accordance with the present invention, for example N-methylphenothiazine in this example, makes it possible to lower the potential for triggering the electrochemiluminescence of the Ru (bpy) 3 2+ complex in a potential domain where the matrix forming the polypyrrole polymer film is not over-oxidized, that is to say in a field where it retains its properties of electronic conductivity.

Abstract

The invention concerns a method for detecting molecular identification by electrochemiluminescence mediated on electronic conductive polymer. Said method comprises steps which consist in: a) providing a test support including one surface comprising a conductive polymer film, said film containing a probe molecule; b) marking prior to or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent marker; c) contacting the target molecule with the test support in physical and chemical conditions enabling molecular identification and specific linkage between the probe molecule and the target molecule; d) rinsing the test support so as to eliminate excess electrochemiluminescent marker while preserving the specific linkage between the probe molecule and the target molecule of step c); and e) subjecting the rinsed test support obtained at step d) to a reading of the signal of electrochemiluminescence enabled by electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay.

Description

DETECTION D'UNE RECONNAISSANCE MOLECULAIRE PAR ELECTROCHIMILUMINESCENCE SUR POLYMERE CONDUCTEUR DETECTION OF MOLECULAR RECOGNITION BY ELECTROCHEMILUMINESCENCE ON CONDUCTIVE POLYMER
DESCRIPTION Domaine techniqueDESCRIPTION Technical area
La présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence sur un polymère conducteur à conduction électronique. Elle permet de manière générale la détection quantitative et qualitative d'une reconnaissance moléculaire entre une première molécule fixée sur un support et une deuxième molécule recherchée dans un échantillon.The present invention relates to a method of detecting molecular recognition by electrochemiluminescence on a conductive polymer with electronic conduction. It generally allows quantitative and qualitative detection of molecular recognition between a first molecule fixed on a support and a second molecule sought in a sample.
Elle concerne le domaine au sens large des capteurs et biopuces, en particulier ceux ou celles comprenant au moins un film polymère conducteur électronique tel que le polypyrrole et leurs dérivés . Cette invention est relative à la détection par chimiluminescence électrogénérée ou électrochimiluminescence (ECL) via un relais présentant des propriétés d'oxydo-réduction, appelé dans la présente « relais rédox ».It relates to the field in the broad sense of sensors and biochips, in particular those or those comprising at least one electronic conductive polymer film such as polypyrrole and their derivatives. This invention relates to detection by electrogenerated chemiluminescence or electrochemiluminescence (ECL) via a relay having redox properties, called in the present "redox relay".
Selon l'invention, la reconnaissance moléculaire peut être définie comme une interaction spécifique entre deux molécules plus ou moins complexes, conduisant à une liaison ou assemblage des deux molécules suffisamment stable pour que les molécules puissent être détectées lorsqu'elles sont liées. Il peut s'agir par exemple d'une hybridation d'acides nucléiques (ADN et/ou ARN) , d'une réaction de reconnaissance de type antigène/anticorps, d'une interaction de type protéine/protéine, d'une interaction sucre/protéine, d'une interaction de type enzyme/substrat, d'une interaction de type ADN double brin/protéine, etc. Le procédé de la présente invention trouve par exemple une application dans la détection dans le domaine des "Biopuces" au sens large c'est-à-dire des puces à acides nucléiques et des puces à protéines ou tous systèmes y compris multiparamétriques pour l'étude de la reconnaissance sonde-cible de substrats biologiques. Il s'agit par exemple de la détection d'hybridation d'acides nucléiques sur support solide, en milieu aqueux ou à l'air, par exemple dans le cadre d'un criblage ("screening" ) ou d'une détection d'hybridation sur une biopuce.According to the invention, molecular recognition can be defined as a specific interaction between two more or less complex molecules, leading to a bond or assembly of the two molecules sufficiently stable so that the molecules can be detected when they are linked. It may, for example, be a hybridization of nucleic acids (DNA and / or RNA), a recognition reaction of antigen / antibody type, a protein / protein type interaction, sugar / protein type interaction, enzyme / substrate type interaction, double strand DNA / protein type interaction, etc. The method of the present invention finds, for example, an application in the detection in the field of "Biochips" in the broad sense, that is to say nucleic acid chips and protein chips or any system including multiparametric for it. study of probe-target recognition of biological substrates. This is for example the detection of hybridization of nucleic acids on a solid support, in an aqueous medium or in air, for example in the context of a screening or a detection of hybridization on a biochip.
Le procédé de la présente invention peut être appliqué à toutes finalités de marquage sur des surfaces de polymères conducteurs à conduction électronique par un système électrochimiluminescent. Dans la présente description, les références entre crochets [ ] renvoient à la liste de référence annexée.The method of the present invention can be applied for all marking purposes on surfaces of conductive polymers with electronic conduction by an electrochemiluminescent system. In the present description, the references in square brackets [] refer to the annexed reference list.
Etat de la techniqueState of the art
Les biocapteurs miniaturisés ou biopuces sont actuellement l'objet d'enjeux économiques majeurs. Cet attrait s'explique par leur capacité de pouvoir réaliser des milliers d'analyses en parallèle ainsi que par leur vaste champ d'application touchant à la fois le domaine du diagnostic médical, du contrôle environnemental et agro-alimentaire, ainsi que celui de la pharmacologie. Ces systèmes sont constitués de molécules sondes, généralement de molécules biologiques telles que des fragments d'ADN, ou plus généralement des fragments d'oligonucléotides (ou ODN) , immobilisées sur de très petites surfaces. Ces sondes, de par leur capacité de reconnaître spécifiquement des entités biologiques données, appelées molécules cibles, comme des brins d'ADN ou d'ODN complémentaires, confèrent au biocapteur une sélectivité de reconnaissance. La sensibilité de ces biocapteurs dépend en partie de la technique mise en oeuvre pour révéler le phénomène de reconnaissance molécules sondes/molécules cibles.Miniaturized biosensors or biochips are currently the subject of major economic issues. This attraction is explained by their capacity to be able to carry out thousands of analyzes in parallel as well as by their vast field of application touching at the same time the field of medical diagnosis, environmental and agro-food control, as well as that of pharmacology. These systems consist of probe molecules, generally biological molecules such as DNA fragments, or more generally fragments of oligonucleotides (or ODN), immobilized on very small surfaces. These probes, by their ability to specifically recognize given biological entities, called target molecules, like strands of DNA or complementary ODN, give the biosensor a selectivity of recognition. The sensitivity of these biosensors depends in part on the technique used to reveal the phenomenon of recognition of probe molecules / target molecules.
De nombreux outils ont été développés pour détecter ces reconnaissances moléculaires. Certaines techniques utilisent des marqueurs fluorescents qui offrent une grande sensibilité de détection. Cependant, ces techniques nécessitent une excitation laser des fluorophores greffés sur les biomolécules cibles qui peut s'accompagner également par une fluorescence résiduelle parasite provenant de l'illumination du support et des biomolécules .Many tools have been developed to detect these molecular recognitions. Some techniques use fluorescent markers that offer high detection sensitivity. However, these techniques require laser excitation of the fluorophores grafted onto the target biomolecules, which can also be accompanied by a parasitic residual fluorescence originating from the illumination of the support and of the biomolecules.
D'autres techniques utilisent des marqueurs électrochimiluminescents tels que le luminol et ses dérivés ou les composés organometalliques tel que le complexe Ru (2 , 2 ' -bipyridine) 3 2+, Ru(bpy)3 2+ [1] et [2]. Malheureusement dans le cas du luminol et de ses dérivés, l' électrochimiluminescence (ECL) conduit à une destruction irréversible de la molécule de luminol ou de ses dérivés. L'émission de lumière correspond alors à un flash, son intensité diminuant rapidement dans le temps .Other techniques use electrochemiluminescent markers such as luminol and its derivatives or organometallic compounds such as the Ru (2, 2 '-bipyridine) 3 2+ , Ru (bpy) 3 2+ complex [1] and [2] . Unfortunately in the case of luminol and its derivatives, electrochemiluminescence (ECL) leads to an irreversible destruction of the luminol molecule or its derivatives. The light emission then corresponds to a flash, its intensity rapidly decreasing over time.
Pour les marqueurs type Ru(bpy)3 +, l'émission de luminescence ne s ' accompagne pas de la destruction du luminophore, le complexe Ru (bpy) 3 2+ étant régénéré, mais sont utilisation ne peut malheureusement pas se faire sur tout type de support .For markers of the Ru (bpy) 3 + type , the luminescence emission is not accompanied by the destruction of the phosphor, the Ru (bpy) 3 2+ complex being regenerated, but their use can unfortunately not be done on everything type of support .
L' électrochimiluminescence du Ru(bpy)3 2+ est induite par la désactivation du complexe à l'état excité Ru(bpy)3 2+*.The electrochemiluminescence of Ru (bpy) 3 2+ is induced by the deactivation of the complex in the excited state Ru (bpy) 3 2 + * .
Ce complexe peut-être formé suivant une première voie par la réaction d'annihilation, réaction (3) ci- dessous, entre le Ru(bpy)3 3+ et le Ru(bpy)3 2+ ; chacune de ces deux espèces étant électrogénérée à partir du complexe Ru(bpy)3 2+, respectivement par oxydation, décrite par la réaction (1) ci-dessous, et réduction, décrite par la réaction (2) ci-dessous, de ce dernier en appliquant alternativement, à une fréquence de l'ordre de 0,2 Hz, un potentiel de +1,3 V et -1,3 V (vs Ag/AgCl) .This complex can be formed in a first way by the annihilation reaction, reaction (3) below, between Ru (bpy) 3 3+ and Ru (bpy) 3 2+ ; each of these two species being electrogenerated from the Ru (bpy) 3 2+ complex, respectively by oxidation, described by reaction (1) below, and reduction, described by reaction (2) below, of this last by applying alternately, at a frequency of the order of 0.2 Hz, a potential of +1.3 V and -1.3 V (vs Ag / AgCl).
Ru(bρy)3 2+ -> Ru(bpy)3 3+ + e" (1)Ru (bρy) 3 2+ -> Ru (bpy) 3 3+ + e " (1)
Ru(bpy)3 2+ + e" -> Ru(bpy)3 + (2)Ru (bpy) 3 2+ + e " -> Ru (bpy) 3 + (2)
Ru(bpy)3 3+ + Ru(bρy)3 + -> Ru(bpy)3 2+* (3)Ru (bpy) 3 3+ + Ru (bρy) 3 + -> Ru (bpy) 3 2 + * (3)
Cette réaction d'annihilation (3) conduit à la formation du complexe à l'état excité Ru(bpy)3 2+* qui lors de sa désactivation, réaction (4) , émet sous forme de flash une lumière centrée à 610 nm en redonnant le complexe initial Ru(bpy)3 2+. Ru (bpy) 2 2+* -> Ru (bpy) 3 2+ + hλ (4 )This annihilation reaction (3) leads to the formation of the complex in the excited state Ru (bpy) 3 2 + * which, when deactivated, reaction (4), emits light in the form of a flash centered at 610 nm in restoring the initial complex Ru (bpy) 3 2+ . Ru (bpy) 2 2 + * -> Ru (bpy) 3 2+ + hλ (4)
Cette première voie ne concerne pas le procédé de la présente invention. II est également possible, suivant une deuxième voie, à partir du complexe Ru(bpy)3 2+ d'observer une émission permanente à 610 nm par électrochimiluminescence en appliquant un potentiel constant de +1,3 V (vs Ag/AgCl) . Dans ce cas, la présence d'un co-substrat, appelé aussi substrat sacrificiel, est alors requise. Ce composé qui peut- être une aminé aliphatique type tripropylamine (Pr3N) , comme le décrit le document [1] , génère un agent réducteur Pr2N-CH°-CH2-CH3, comme le décrit la réaction (6) ci-dessous, qui peut soit réagir avec le complexe Ru(bpy)3 3+ pour former l'état excité Ru(bpy)3 +*, selon la réaction (7) ci-dessous, ou réduire l'espèce Ru(bpy)3 2+ en Ru(bpy)3 +, selon la réaction (8) ci- dessous, pour conduire au Ru(bpy)3 2+* selon la réaction (3) ci-dessus. Comme précédemment, le complexe Ru(bpy)3 2+ n'est pas épuisé mais régénéré lors de l' électrochimiluminescence par contre le co-substrat est irréversiblement consommé.This first route does not relate to the process of the present invention. It is also possible, in a second way, from the Ru (bpy) 3 2+ complex to observe a permanent emission at 610 nm by electrochemiluminescence by applying a constant potential of +1.3 V (vs Ag / AgCl). In this case, the presence of a co-substrate, also called sacrificial substrate, is then required. This compound, which may be an aliphatic amine such as tripropylamine (Pr 3 N), as described in document [1], generates a reducing agent Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 , as described in reaction (6 ) below, which can either react with the complex Ru (bpy) 3 3+ to form the excited state Ru (bpy) 3 + * , according to reaction (7) below, or reduce the species Ru ( bpy) 3 2+ in Ru (bpy) 3 + , according to reaction (8) below, to lead to Ru (bpy) 3 2 + * according to reaction (3) above. As before, the Ru (bpy) 3 2+ complex is not exhausted but regenerated during electrochemiluminescence, on the other hand, the co-substrate is irreversibly consumed.
Ru(bpy)3 2+ -> Ru(bpy)3 3+ + e" (5)Ru (bpy) 3 2+ -> Ru (bpy) 3 3+ + e " (5)
Ru(bpy)3 3+ + Pr3N -> Ru(bpy)3 2+ + Pr2N-CH°-CH2-CH3 + H+ (6)Ru (bpy) 3 3+ + Pr 3 N -> Ru (bpy) 3 2+ + Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 + H + (6)
Pr2N-CH°-CH2-CH3 + Ru(bpy)3 3+ + H20 ->Ru (bpy) 3 2+* + Pr2NHPr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 + Ru (bpy) 3 3+ + H 2 0 -> Ru (bpy) 3 2 + * + Pr 2 NH
+ Et-CHO + H+ (7) Pr2N-CH°-CH2-CH3 + Ru(bpy)3 2+ + H20 -> Ru(bpy)3 + + Pr2NH+ Et-CHO + H + (7) Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 + Ru (bpy) 3 2+ + H 2 0 -> Ru (bpy) 3 + + Pr 2 NH
+ Et-CHO + H+ (8) Ru(bpy)3 3+ + Ru(bpy)3 + -> Ru(bpy)3 2+* (3)+ Et-CHO + H + (8) Ru (bpy) 3 3+ + Ru (bpy) 3 + -> Ru (bpy) 3 2 + * (3)
Ru(bpy)3 2+* -> Ru(bpy)3 + + hλ (4)Ru (bpy) 3 2 + * -> Ru (bpy) 3 + + hλ (4)
C'est pourquoi par rapport au luminol ou ses dérivés les composés Ru(bpy)3 2+ sont des candidats plus attractifs en tant que marqueurs pour une détection par électrochimuluminescence .This is why, compared to luminol or its derivatives, the compounds Ru (bpy) 3 2+ are more attractive candidates as markers for detection by electrochimuluminescence.
Malheureusement, les potentiels de lecture du signal émis pour les marqueurs électrochimiluminescents tels que les complexes de ruthénium sont trop élevés pour pouvoir être utilisés sur des films de polymères conducteurs tels que ceux utilisés pour la fabrication de la pluspart des capteurs et biopuces, par exemple tels que le polypyrrole dans les systèmes MICAM (marque déposée) . En effet, ces potentiels conduisent à une suroxydation du film de polymère conducteur qui perd alors ses propriétés de conductivité électronique rendant le transfert électronique support/sonde insuffisant pour permettre une détection par ECL. Poster et coll. [3] ont élaboré un capteur à base de Ru(bpy)3 2+ pour la détection d'ions oxalate. Dans ce cas, le complexe Ru(bpy)3 2+ est immobilisé par un lien covalent dans une matrice poly (4-vinylpyridine) . Le principe de la détection des oxalates repose sur la génération électrochimique de Ru(bpy)3 3+ qui réagit ensuite avec l'analyte C204 2" pour conduire au complexe à l'état excité Ru(bpy)3 2+*. Ce dernier émet ensuite à 610 nm lors de sa désactivation suivant la réaction (4) ci-dessus . R. Blanchard et coll. [4] ont également développé un capteur pour la détection d'ions oxalates en piégeant électrostatiquement un dérivé du complexe Ru(bpy)3 2+ dans une matrice polymère conducteur électronique. Le complexe de ruthénium sous sa forme sulfonique RuBPS (acide tris (4 , 7-diphenyl-l , 10- phenantrolinedisulfonique) ruthénium II) est inséré en tant que contre-ion dopant dans la matrice polymère (polyMPP) lors de son électrosynthèse via l'oxydation électrochimique de monomères l-méthyl-3- (pyrrol-1- ylmethyl)pyridinium chlorure (MPP) . En imposant à ce film RuBPS/polyMPP en présence d'ions oxalate, un potentiel de 1,250 V vs Ag/AgCl, une réponse lumineuse par électrochimiluminescence est alors détectée.Unfortunately, the signal reading potentials emitted for electrochemiluminescent markers such as ruthenium complexes are too high to be able to be used on films of conductive polymers such as those used for the manufacture of most sensors and biochips, for example such than polypyrrole in MICAM systems (registered trademark). Indeed, these potentials lead to an over-oxidation of the conductive polymer film which then loses its properties of electronic conductivity making the electronic transfer support / probe insufficient to allow detection by ECL. Poster et al. [3] developed a Ru (bpy) 3 2+ -based sensor for the detection of oxalate ions. In this case, the Ru (bpy) 3 2+ complex is immobilized by a covalent bond in a poly (4-vinylpyridine) matrix. The principle of oxalate detection is based on the electrochemical generation of Ru (bpy) 3 3+ which then reacts with the analyte C 2 0 4 2 " to lead to the complex in the excited state Ru (bpy) 3 2 + * The latter then emits at 610 nm when it is deactivated according to reaction (4) above R. Blanchard et al. [4] have also developed a sensor for detecting oxalate ions in electrostatically trapping a derivative of the Ru (bpy) 3 2+ complex in an electronically conductive polymer matrix. The ruthenium complex in its sulfonic form RuBPS (tris (4, 7-diphenyl-l, 10-phenantrolinedisulfonic acid) ruthenium II) is inserted as a doping counterion in the polymer matrix (polyMPP) during its electrosynthesis via l electrochemical oxidation of 1-methyl-3- (pyrrol-1-ylmethyl) pyridinium chloride (MPP) monomers. By imposing on this RuBPS / polyMPP film in the presence of oxalate ions, a potential of 1.250 V vs Ag / AgCl, a light response by electrochemiluminescence is then detected.
Cependant ces auteurs notent une faible stabilité dans le temps du film RuBPS/PMPP résultant d'une solubilisation de ce polymère. En outre ils soulignent également la possibilité d'émission d' électrochimiluminescence du RuBPS à l'interface de l'électrode conséquence de son exclusion par diffusion de la matrice PMPP. Dans cet exemple, la sonde d' électrochimiluminescence est piégée électrostatiquement à la surface de l'électrode. Cette méthode d'immobilisation pose donc un problème en terme de stabilité puisque les complexes de ruthénium peuvent être exclus de la matrice polymère par simple diffusion. De plus, comme le montrent des études réalisées à partir de polypyrroles solubles fonctionnalisés par des complexes polypyridyle de ruthénium II [5] , on peut envisager dans le cas de l'insertion des complexes Ru(bpy)3 2+ dans une matrice polymère type polypyrrole, un effet de quenching de l'état excité Ru (bpy) 3 2+* induit par son confinement dans la matrice polymère. On peut donc penser que l'immobilisation du complexe Ru(bpy)3 + par un lien électrostatique ou covalent dans un polymère est peu favorable à son emploi comme marqueur en vue d'une détection par électrochimiluminescence.However, these authors note a low stability over time of the RuBPS / PMPP film resulting from the solubilization of this polymer. In addition, they also underline the possibility of emission of electrochemiluminescence from RuBPS at the interface of the electrode as a consequence of its exclusion by diffusion of the PMPP matrix. In this example, the electrochemiluminescence probe is electrostatically trapped on the surface of the electrode. This immobilization method therefore poses a problem in terms of stability since the ruthenium complexes can be excluded from the polymer matrix by simple diffusion. In addition, as shown by studies carried out from soluble polypyrroles functionalized by ruthenium II polypyridyl complexes [5], one can consider in the case of the insertion of the Ru (bpy) 3 2+ complexes in a typical polymer matrix polypyrrole, a quenching effect of the excited state Ru (bpy) 3 2 + * induced by its confinement in the polymer matrix. We can therefore think that the immobilization of the Ru (bpy) 3 + complex by an electrostatic or covalent bond in a polymer is not very favorable for its use as a marker for detection by electrochemiluminescence.
Xu et coll. [6-7] ont adopté une autre démarche où cette fois-ci la molécule cible est marquée par la sonde d' électrochimiluminescence. Cette dernière n'est donc plus insérée à l'électrode via une matrice polymère comme précédemment. Ces auteurs, pour contourner le problème précité de suroxydation du film de polymère conducteur, ont appliqué cette détection par électrochimiluminescence à un biocapteur à ADN constitué de simples brins d'ADN immobilisés sur une électrode recouverte par un film d' alcanebisphosphonate d'aluminium. Le phénomène d'hybridation entre ces fragments d'ADN immobilisés et des brins complémentaires en solution a été mis en évidence via électrochimiluminescence de complexes Ru (bpy) 3 2+ soit insérés comme intercalant ou greffés préalablement sur les brins complémentaires.Xu et al. [6-7] adopted another approach where this time the target molecule is marked by the electrochemiluminescence probe. The latter is therefore no longer inserted at the electrode via a polymer matrix as previously. These authors, to circumvent the aforementioned problem of overoxidation of the conductive polymer film, applied this detection by electrochemiluminescence to a DNA biosensor consisting of single strands of DNA immobilized on an electrode covered by a film of aluminum alkane bisphosphonate. The phenomenon of hybridization between these immobilized DNA fragments and complementary strands in solution has been demonstrated via electrochemiluminescence of Ru (bpy) 3 2+ complexes either inserted as intercalator or grafted beforehand on the complementary strands.
Il existe donc un réel besoin d'une méthode alternative de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence, qui puisse facilement être mise en œuvre, même sur des capteurs et biopuces telles que les systèmes MICAM (marque déposée) , et qui ne présente pas les inconvénients des techniques de l'art antérieur, et notamment, qui ne s'accompagne pas d'une destruction irréversible du marqueur électrochimiluminescent et surtout du film de polymère conducteur.There is therefore a real need for an alternative method of detecting molecular recognition by electrochemiluminescence, which can easily be implemented, even on sensors and biochips such as MICAM systems (registered trademark), and which does not have the disadvantages of the techniques of the prior art, and in particular, which is not accompanied by an irreversible destruction of the electrochemiluminescent marker and especially of the conductive polymer film.
EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention a précisément pour but de fournir une telle méthode alternative et de résoudre les problèmes précités de l'art antérieur en fournissant un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire entre une molécule sonde fixée sur un support et une molécule cible recherchée dans un échantillon à tester, ledit procédé permettant en outre une détection qualitative et quantitative précise et sensible de la molécule cible lorsqu'elle est présente dans un échantillon. Ledit procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur électronique sur lequel est fixée une molécule sonde, b) marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent, c) mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible, d) rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c) , et e) soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d' électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support en présence d'un relais rédox.PRESENTATION OF THE INVENTION The object of the present invention is precisely to provide such an alternative method and to solve the aforementioned problems of the prior art by providing a method for detecting molecular recognition between a probe molecule fixed on a support and a target molecule sought in a test sample, said method further allowing precise and sensitive qualitative and quantitative detection of the target molecule when it is present in a sample. Said method of the present invention comprises the following steps: a) bringing together a test support comprising a surface comprising an electronically conductive polymer film on which a probe molecule is fixed, b) marking before or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent marker, c) bringing the target molecule into contact with the test support under physical and chemical conditions allowing molecular recognition and specific assembly between the probe molecule and the target molecule, d) rinsing the test support so as to removing the excess of electrochemiluminescent marker while preserving the specific assembly between the probe molecule and the target molecule of step c), and e) subject the rinsed test support obtained in step d) to a reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an electronic transfer between the target marker and the support in the presence of a redox relay.
La détection d'une chimiluminescence à l'étape e) révèle un assemblage par reconnaissance moléculaire au sens précité entre la molécule sonde fixée sur le support et la molécule cible recherchée, et donc la présence de la molécule cible dans l'échantillon testé.The detection of a chemiluminescence in step e) reveals an assembly by molecular recognition in the abovementioned sense between the probe molecule fixed on the support and the desired target molecule, and therefore the presence of the target molecule in the test sample.
Dans le procédé de la présente invention, la détection de la reconnaissance entre la molécule sonde et la molécule cible marquée est basée sur la chimiluminescence électrogénérée, ou électrochimiluminescence (ECL) . Il s'agit d'une détection optique permettant de s'affranchir des inconvénients des procédés de l'art antérieur tout en conservant la sensibilité des détecteurs optiques. En effet, le déclenchement électrique de la chimiluminescence ne concerne que le marqueur chimiluminescent et non pas le support test ou les biomolécules. En outre, ce nouveau mode de détection appliqué aux biopuces permet d'effectuer des mesures quantitatives de la reconnaissance molécules sondes/molécules cibles contrairement à la détection par fluorescence. De plus, l'excitation par une impulsion électrique conforme à la présente invention permet un contrôle spatial et une mise en œuvre rapide et aisée tout en s' affranchissant d'un appareillage coûteux d'excitation laser utilisé dans l'art antérieur. La présente invention trouve donc notamment une application dans le domaine des biopuces, où le support sur lequel est déposé le film conducteur conformément à la présente invention forme la biopuce. Selon 1 ' invention, le support peut être un quelconque des supports utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces. A titre d'exemples non limitatifs, peuvent être utilisés un support en métal tel que Au, Pt, etc. ; un support constitué d'un matériau semi-conducteur ; un support verre/ITO ; un support en verre ou quartz métallisé ; un support plastique/ITO ; un support en plastique métallisé ; un support en carbone vitreux ; ou un support formé par dépôt d'un matériau conducteur sérigraphié sur un substrat isolant ou sur un des supports précités.In the method of the present invention, the detection of recognition between the probe molecule and the labeled target molecule is based on electrogenerated chemiluminescence, or electrochemiluminescence (ECL). It is an optical detection allowing to overcome the drawbacks of the methods of the prior art while retaining the sensitivity of the optical detectors. Indeed, the electrical initiation of chemiluminescence only concerns the chemiluminescent marker and not the test support or the biomolecules. In addition, this new detection method applied to biochips allows quantitative measurements of probe molecule / target molecule recognition to be carried out, unlike fluorescence detection. In addition, the excitation by an electric pulse according to the present invention allows a spatial control and a fast and easy implementation while being freed from an expensive apparatus of laser excitation used in the prior art. The present invention therefore finds particular application in the field of biochips, where the support on which the conductive film is deposited in accordance with the present invention forms the biochip. According to the invention, the support can be any of the supports used by a person skilled in the art for the manufacture of biochips. By way of nonlimiting examples, a metal support such as Au, Pt, etc. can be used. ; a support made of a semiconductor material; a glass / ITO support; a glass or metallic quartz support; a plastic / ITO support; a metallic plastic support; a glassy carbon support; or a support formed by depositing a screen-printed conductive material on an insulating substrate or on one of the aforementioned supports.
Selon la présente invention, le film polymère conducteur électronique peut être un film de polymère conducteur tel que ceux utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces sur lesquelles sont greffées des sondes. Par exemple le polymère peut être un polymère conducteur tel que ceux décrits dans les « Techniques de l'Ingénieur » -A3140- sous la dénomination « polymères conducteurs intrinsèques » : il s'agit de polymères formés de molécules porteuses de liaisons conjuguées (oligomères ou réseaux réticulés) et éventuellement dopés par des dopants donneurs ou accepteurs d'électrons tels que les poly(acétylène) , le poly(nitrure de soufre), le polyphénylène, le polypyrrole, le poly(sulfure de phénylêne) , le polythiophene, le polyaniline etc. A titre d'exemple non limitatif, il peut s'agir d'un film de polypyrrole ; de poly (3 , 4-éthylènedioxythiophène) (PEDOT) ou de leur dérivés.According to the present invention, the electronic conductive polymer film can be a conductive polymer film such as those used by a person skilled in the art for the manufacture of biochips on which probes are grafted. For example, the polymer can be a conductive polymer such as those described in the "Engineering Techniques" -A3140- under the name "intrinsic conductive polymers": these are polymers formed from molecules carrying conjugated bonds (oligomers or crosslinked networks) and optionally doped with electron donating or accepting dopants such as poly (acetylene), poly (sulfur nitride), polyphenylene, polypyrrole, poly (phenylene sulfide), polythiophene, polyaniline etc. By way of nonlimiting example, it may be a film of polypyrrole; poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) or their derivatives.
Selon la présente invention, le film polymère conducteur peut être déposé sur le support en utilisant les techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple l' électrodéposition ouAccording to the present invention, the conductive polymer film can be deposited on the support using the conventional techniques known to those skilled in the art, for example electrodeposition or
1 ' électropolymérisation ou le dépôt par centrifugation1 electropolymerization or deposition by centrifugation
("spin coating") ou encore le jet d'encre.("spin coating") or the inkjet.
Selon l'invention, le film polymère conducteur peut être élaboré à partir de simples monomères de type pyrrole ou d' oligomères pré-synthétisés comme des oligothiophènes, ainsi qu'à partir de systèmes moléculaires plus complexes comme des unités complexantes de métaux de transition tels que les phénantrolines, la phénylpyridine, etc., portant des unités électropolymérisables ce qui conduit lors de l'élaboration du polymère à un réseau conjugué.According to the invention, the conductive polymer film can be produced from simple pyrrole type monomers or from pre-synthesized oligomers such as oligothiophenes, as well as from more complex molecular systems such as complexing units of transition metals such as as phenanthrolines, phenylpyridine, etc., carrying electropolymerizable units which leads during the preparation of the polymer to a conjugated network.
Selon l'invention, la molécule sonde peut être par exemple de l'ADN simple ou double brin, un oligonucléotide, un anticorps, une protéine, un sucre ou un enzyme, ainsi que toute molécule ou biomolécule permettant une reconnaissance spécifique et un assemblage tels que définis ci-dessus.According to the invention, the probe molecule can be for example single or double-stranded DNA, an oligonucleotide, an antibody, a protein, a sugar or an enzyme, as well as any molecule or biomolecule allowing specific recognition and assembly such as defined above.
Selon l'invention, la fixation de la molécule sonde sur le film polymère conducteur peut se faire par les méthodes classiques de chimie utilisées pour fixer des sondes sur une biopuce. La liaison entre le film et la sonde peut être d' adsorption, électrostatique, chimique obtenue par auto-assemblage, silanisation, ou par toute méthode chimique, électrochimique, photochimique, etc. connue de l'homme du métier pour le dépôt de la molécule sonde par exemple fonctionnalisée par un groupement apportant la propriété d'auto- assemblage, d'ancrage, de couplage, ou polymérisable chimiquement, électrochimiquement, photochimiquement ou électrophotochimiquement par photosensibilisation.According to the invention, the fixing of the probe molecule to the conductive polymer film can be done by conventional methods of chemistry used to fix probes on a biochip. The bond between the film and the probe can be adsorption, electrostatic, chemical obtained by self-assembly, silanization, or by any chemical, electrochemical, photochemical, etc. method. known to those skilled in the art for the deposition of the probe molecule, for example functionalized by a group providing the property of self-assembly, anchoring, coupling, or polymerizable chemically, electrochemically, photochemically or electrophotochemically by photosensitization.
Selon l'invention, liaison entre le film polymère conducteur électronique déposé sur le support et la sonde peut être obtenue en une étape par exemple par le procédé MICAM (marque déposée) . Les documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 et US 5 810 989 décrivent par exemple des techniques de dépôt de film et de fixation de molécules sondes utilisables dans la présente invention. Il s'agit par exemple d' électro-copolymérisation sur un support, par exemple sur un substrat de silice, de monomères précurseurs du polymère conducteur, tel que le pyrrole, avec des monomères, par exemple de pyrrole, fonctionnalisés par une molécule sonde selon la présente invention, par exemple des oligonucléotides . Dans ces techniques, on exploite l'adhésion du film conducteur de polypyrrole sur le substrat de façon à y réaliser la fixation des molécules sondes de reconnaissance .According to the invention, connection between the electronic conductive polymer film deposited on the support and the probe can be obtained in one step for example by the MICAM process (registered trademark). The documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 and US 5 810 989 describe, for example, techniques for film deposition and fixing of probe molecules which can be used in the present invention. These are, for example, electro-copolymerization on a support, for example on a silica substrate, of precursor monomers of the conductive polymer, such as pyrrole, with monomers, for example of pyrrole, functionalized by a probe molecule according to the present invention, for example oligonucleotides. In these techniques, the adhesion of the conductive polypyrrole film to the substrate is exploited so as to achieve the fixing of the recognition probe molecules therein.
Selon l'invention, la sonde peut aussi être fixée sur le film après son dépôt sur le support par exemple par post-fonctionnalisation du film, par exemple de polypyrrole (Ppy) , déposé par exemple par électrogreffage sur le support, par un système de reconnaissance par affinité, par exemple un système avidine/biotine ou des systèmes équivalents, ou des dérivés de ces systèmes. Ceci conduit par exemple aux structures support (S) -film conducteur-molécule sonde suivantes : S-PPy-ADN ; S-PPy-biotine/avidine/biotine- ADN ; S-PPy-biotine/avidine-protéine ; S-PPy- biotine/avidine/biotine-anticorps, utilisables selon la présente invention. Ces structures sont par exemple utilisables sur un support (S) d'or (Au) ou de silice, ou sur tout support précité permettant le greffage du polymère conducteur.According to the invention, the probe can also be fixed to the film after it has been deposited on the support, for example by post-functionalization of the film, for example of polypyrrole (Ppy), deposited for example by electrografting on the support, by a system of affinity recognition, for example an avidin / biotin system or equivalent systems, or derivatives of these systems. This leads for example to support (S) - conductor-molecule probe molecule structures: S-PPy-DNA; S-PPy-biotin / avidin / biotin-DNA; S-PPy-biotin / avidin-protein; S-PPy-biotin / avidin / biotin-antibody, usable according to the present invention. These structures can for example be used on a support (S) of gold (Au) or silica, or on any aforementioned support allowing the grafting of the conductive polymer.
Cette fixation peut se faire par exemple avec adressage des sondes. Il s'agit par exemple d'un adressage photochimique, d'un adressage mécanique, par exemple par micropipetage à l'aide d'un robot disperseur, ou d'un adressage électrochimique. Ces techniques de fixation de sondes sur un film polymère sont connues de l'homme du métier. L'adressage présente l'avantage qu'il permet ensuite des analyses multiparamétriques .This fixing can be done for example with addressing of the probes. It is, for example, a photochemical addressing, a mechanical addressing, for example by micropipetting using a dispersing robot, or an electrochemical addressing. These techniques for attaching probes to a polymer film are known to those skilled in the art. Addressing has the advantage that it then allows multi-parameter analyzes.
L'ancrage de la molécule sonde peut se faire par simple couplage entre deux fonctions chimiques réactives, par exemple type ester activé et une aminé, l'une de ces fonctions étant portée par la molécule sonde et l'autre ancrée sur le film. Le couplage chimique sonde/film peut être empêché en bloquant la réactivité de la fonction chimique portée par le film. L'empêchement peut être levé, « débloqué », en rendant à nouveau la fonction réactive, ceci grâce par exemple a une activation électrochimique ou photochimique. A l'issue, le couplage de la molécule sonde sur le film est a nouveau possible. , Selon l'invention, le marquage de la cible par le marqueur électrochimiluminescent peut être antérieur ou postérieur à l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test. En d'autres termes, le marquage de la molécule cible peut être effectué soit sur l'échantillon à tester avant sa mise en contact avec le support test, c'est à dire avant que l'assemblage molécule sonde/molécule cible se fasse, soit sur le support test après l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test, c'est à dire, lorsque l'assemblage molécule sonde/molécule cible s'est fait. L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention par exemple suivant le type de molécules sonde/cible mises en jeu.The probe molecule can be anchored by simple coupling between two reactive chemical functions, for example activated ester type and an amine, one of these functions being carried by the probe molecule and the other anchored on the film. The chemical probe / film coupling can be prevented by blocking the reactivity of the chemical function carried by the film. The impediment can be lifted, "unlocked", by making the function reactive again, this thanks for example to an electrochemical or photochemical activation. At the end, the coupling of the probe molecule on the film is again possible. According to the invention, the labeling of the target with the electrochemiluminescent marker can be prior or after step c) of bringing the target molecule into contact with the test support. In other words, the labeling of the target molecule can be carried out either on the sample to be tested before it is brought into contact with the test support, that is to say before the assembly probe molecule / target molecule is done, either on the test support after step c) of bringing the target molecule into contact with the test support, that is to say, when the probe molecule / target molecule is assembled. Those skilled in the art will know how to adapt the method of the present invention, for example according to the type of probe / target molecules involved.
Selon l'invention, le marqueur peut être un des marqueurs électrochimiluminescents connus de l'homme du métier. Il peut s'agir au sens large d'un marqueur ayant des propriétés d' électrochimiluminescence dont le potentiel de déclenchement de l'ECL en présence du co- substrat, se situe dans un domaine de potentiel où le film polymère conducteur présente un effet de suroxydation. Cette suroxydation se manifeste par une dégradation notable des propriétés de conductivités électroniques du film polymère conducteur.According to the invention, the marker can be one of the electrochemiluminescent markers known to those skilled in the art. In the broad sense, it may be a marker having electrochemiluminescence properties, the potential for triggering the ECL in the presence of the co-substrate, lies in a potential domain where the conductive polymer film has an effect of over oxidation. This over-oxidation is manifested by a notable degradation of the properties of electronic conductivities of the conductive polymer film.
Avantageusement, le marqueur électrochimiluminescent peut être un complexe organométallique. Il peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les complexes d'osmium et de ruthénium avec des ligands identiques ou différents de bi ou terpyridine et/ou de phénantroline et leurs dérivés ; un cryptate d'europium ou des esters d'acridinium. Dans ce cas, le marquage de la cible peut se faire par liaison entre la cible et le complexe métallique. Elle peut être directe par couplage chimique, comme par exemple entre le complexe métallique portant une fonction ester activé et la molécule cible possédant une fonction terminale aminé NH2 , ou par le biais d'un couplage par affinité de type biotine/avidine, par exemple ADNCibie-biotine/avidine- métal. Des protocoles de marquage de la cible utilisables dans la présente invention sont décrits par exemple dans les documents [1] et [2].Advantageously, the electrochemiluminescent marker can be an organometallic complex. It can be chosen, for example, from the group comprising the osmium and ruthenium complexes with identical or different ligands of bi or terpyridine and / or phenanthroline and their derivatives; a europium cryptate or acridinium esters. In this case, the labeling of the target can be done by bonding between the target and the metal complex. It can be direct by chemical coupling, such as between the metal complex carrying an activated ester function and the target molecule having an amino terminal NH 2 function , or by means of affinity coupling of biotin / avidin type, for example DNA C i b i e -biotin / avidin- metal. Target labeling protocols which can be used in the present invention are described for example in documents [1] and [2].
Dans le procédé de la présente invention, le relais rédox a pour but, dans l'étape e) , de pouvoir déclencher l' électrochimiluminescence du marqueur à un potentiel inférieur à celui appliqué en l'absence de relais rédox par transfert des électrons du marqueur vers le film polymère déposé sur le support. Il agit comme un relais rédox entre le marqueur et le film, et abaisse le potentiel de lecture de l' électrochimiluminescence. Ainsi, le potentiel de lecture de l' électrochimiluminescence étant inférieur à celui qui devrait être utilisé pour le marquer seul, le film polymère conduceur est préservé de la suroxydation et donc de la dégradation notable de ses propriétés de conductivités électroniques.In the method of the present invention, the aim of the redox relay is, in step e), to be able to trigger the electrochemiluminescence of the marker at a potential lower than that applied in the absence of redox relay by transfer of the electrons from the marker towards the polymer film deposited on the support. It acts as a redox relay between the marker and the film, and lowers the reading potential of electrochemiluminescence. Thus, the reading potential of electrochemiluminescence being lower than that which should be used to mark it alone, the conductive polymer film is preserved from overoxidation and therefore from the notable degradation of its electronic conductivity properties.
Ce relais rédox peut être en solution, ou immobilisé, par exemple par greffage, sur le support avec le film ou avec l'assemblage résultant de la reconnaissance moléculaire entre la sonde et la cible, par exemple sous la forme d'intercalant possédant des propriétés redox ou comportant des groupements redox. L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention en fonction des molécules cibles et sondes en jeu. A titre d'exemples non limitatifs, il peut être choisi parmi : un groupement métallocène, par exemple un ferrocène ou un diferrocène ; des complexes de métaux de transition tel qu'un complexe de cobalt, ou d'autres métaux de transition ; un groupement de la famille de la phénothiazine, du méthylviologène et de leurs dérivés respectifs ; ou des intercalants de l'ADN possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox ; des aminés aromatiques ou hétérocycles, etc.This redox relay can be in solution, or immobilized, for example by grafting, on the support with the film or with the assembly resulting from the molecular recognition between the probe and the target, for example in the form of an intercalant having properties redox or comprising redox groups. A person skilled in the art will know how to adapt the process of the present invention according to the target molecules and probes involved. By way of nonlimiting examples, it can be chosen from: a metallocene group, for example a ferrocene or a diferrocene; transition metal complexes such as a cobalt complex, or other transition metals; a group of the family of phenothiazine, methylviologene and their respective derivatives; or DNA intercalants having redox properties or comprising redox groups; aromatic amines or heterocycles, etc.
Dans certains cas, par exemple pour les complexes du ruthénium, la lecture du signal d' électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique indirect entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox peut devoir être réalisée en présence d'un substrat sacrificiel. Ce composé peut-être par exemple un de ceux décrits dans le document [1] , par exemple une aminé aliphatique telle que la tripropylamine (Pr3N) qui génère un agent réducteur Pr2N-CH°-CH2-CH3, selon la réaction (6) ci- dessus, qui peut soit réagir avec le complexe Ru (bpy) 3 3+ pour former l'état excité Ru(bpy)3 2+*, selon la réaction (7) ci-dessus, ou réduire l'espèce Ru(bpy)3 + en Ru(bpy)3 +, selon la réaction (8) ci-dessus, pour conduire au Ru(bpy)3 +* selon la réaction (3) ci-dessus.In certain cases, for example for ruthenium complexes, the reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an indirect electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay may have to be carried out in the presence of a sacrificial substrate. This compound may for example be one of those described in document [1], for example an aliphatic amine such as tripropylamine (Pr 3 N) which generates a reducing agent Pr 2 N-CH ° -CH 2 -CH 3 , according to reaction (6) above, which can either react with the Ru (bpy) 3 3+ complex to form the excited state Ru (bpy) 3 2 + * , according to reaction (7) above, or reduce the species Ru (bpy) 3 + to Ru (bpy) 3 + , according to reaction (8) above, to lead to Ru (bpy) 3 + * according to reaction (3) above.
Ainsi, le complexe Ru(bpy)3 2+ n'est pas épuisé mais régénéré lors de l' électrochimiluminescence par contre le substrat sacrificiel est irréversiblement consommé . La figure 1 est une représentation schématique d'un transfert électronique entre la molécule cible marquée et le support via le relais rédox et le film conducteur électronique lors d'une lecture d' électrochimiluminescence conformément au procédé de la présente invention. Sur cette figure, « su » représente le support, « f » le film conducteur électronique, « li » la liaison film conducteur électronique/molécule sonde, « S » la molécule sonde, « C » la molécule cible, « m » le marqueur, « t » la liaison entre la molécule cible et le marqueur, « e" » le transfert d'électrons, « Mox/Mréd » le relais (M) rédox (ox = oxydant ; réd = réducteur) permettant le transfert électronique, et « hv » 1' électroluminescence. La présence d'une éventuelle molécule sacrificielle n'est pas représentée.Thus, the Ru (bpy) 3 2+ complex is not exhausted but regenerated during electrochemiluminescence, however the sacrificial substrate is irreversibly consumed. FIG. 1 is a schematic representation of an electronic transfer between the labeled target molecule and the support via the redox relay and the electronic conductive film during an electrochemiluminescence reading according to the method of the present invention. In this figure, “su” represents the support, “f” the electronic conductive film, “li” the link between the electronic conductive film and the probe molecule, “S” the probe molecule, “C” the target molecule, “m” the marker. , "T" the bond between the target molecule and the marker, "e " "the electron transfer," Mox / Mréd "the relay (M) redox (ox = oxidant; red = reducer) allowing electronic transfer, and "Hv" electroluminescence The presence of a possible sacrificial molecule is not shown.
L'étape finale de lecture d' électrochimiluminescence peut être réalisée au moyen d'un luminomètre qui mesure l'intensité de luminescence émise, par exemple à 610 nm pour les complexes du ruthénium. L'intensité de luminescence émise est proportionnelle à la concentration de molécules cibles assemblées aux molécules sondes.The final step of reading electrochemiluminescence can be carried out using a luminometer which measures the intensity of luminescence emitted, for example at 610 nm for ruthenium complexes. The intensity of luminescence emitted is proportional to the concentration of target molecules assembled to the probe molecules.
Dans le procédé de la présente invention, la détection directe, c'est à dire sans relais rédox, est impossible ou très difficile. En effet, comme illustré dans la partie art antérieur ci-dessus, le potentiel de déclenchement de l'ECL sans relais rédox est incompatible avec les propriétés de conduction électronique du film de polymère tel que le pyrrole car situé dans un domaine de potentiel où le pyrrole est dans un état de suroxydation avancée et donc joue le rôle d'une couche quasi-passivante rendant le transfert électronique direct support/sonde insuffisant pour permettre la détection de l'ECL. Le potentiel de lecture de l'ECL dans le procédé de la présente invention est abaissé, ce qui préserve le film de polymère de sa suroxydation, et permet la lecture de l'ECL.In the method of the present invention, direct detection, that is to say without redox relay, is impossible or very difficult. Indeed, as illustrated in the prior art part above, the triggering potential of the ECL without redox relay is incompatible with the electronic conduction properties of the polymer film such as pyrrole because it is located in a potential domain where the pyrrole is in a state of advanced overoxidation and therefore plays the role of a quasi-passivating layer making the direct electronic transfer support / probe insufficient to allow detection of the ECL. The ECL reading potential in the process of the present invention is lowered, which preserves the polymer film from over-oxidation, and allows the ECL to be read.
Dans le procédé de la présente invention, le transfert électronique du support vers le marqueur électrochimiluminescent en présence du relais rédox peut donc s'effectuer au travers d'un film polymère conducteur électronique ce qui n'est pas le cas dans les systèmes développés par Xu et coll. [6-7]. En effet pour ces systèmes de l'art antérieur, l'ancrage du groupement électrochimiluminescent sur le support est réalisé par l'intermédiaire respectivement d'alcane bisphosphonate d'aluminium et d' aminohexane, couches qui sont non-conductrices . Dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur électrochimiluminescent est réalisée spécifiquement sur l'analyte cible contrairement aux procédés où le complexe est immobilisé dans une matrice polymère sur l'électrode [3,4]. L'emploi d'un relais rédox selon la présente invention favorise et rend possible le transfert électronique support/ film conducteur électronique/marqueur et donc les performances de ce mode de détection par électrochimiluminescence. De plus, dans le procédé de la présente invention, le support peut présenter une double fonction active permettant (i) l'immobilisation électro-contrôlée de l'objet biologique au sein du film conducteur électronique et (ii) l' activation en tant que "déclencheur" du processus d' électrochimiluminescence du marqueur électrochimiluminescent en présence du relais ce qui permet son application à un système multiparametrique (analyse en parallèle, ou "multi-array" ) de type biopuce basée sur la technologie développée depuis plusieurs années utilisant un réseau d'électrodes de type MICAM (marque déposée) .In the process of the present invention, the electronic transfer of the support to the electrochemiluminescent marker in the presence of the redox relay can therefore be carried out through an electronically conductive polymer film which is not the case in the systems developed by Xu et al. [6-7]. Indeed for these systems of the prior art, the anchoring of the electrochemiluminescent group on the support is carried out by means of respectively alkane aluminum bisphosphonate and aminohexane, layers which are non-conductive. In the present invention, the immobilization of the electrochemiluminescent marker is carried out specifically on the target analyte unlike the processes where the complex is immobilized in a polymer matrix on the electrode [3,4]. The use of a redox relay according to the present invention promotes and makes possible the electronic transfer of support / electronic conductive film / marker and therefore the performance of this mode of detection by electrochemiluminescence. In addition, in the process of the present invention, the support can have a double active function allowing (i) the electro-controlled immobilization of the biological object within the electronic conductive film and (ii) the activation as a "trigger" of the electrochemiluminescence process of the electrochemiluminescent marker in the presence of the relay which allows its application to a multi-parameter system (parallel analysis, or "multi-array") of biochip type based on technology developed over several years using a network of MICAM type electrodes (registered trademark).
Chaque plot composant une biopuce de type MICAM reconnaissant de manière spécifique une molécule particulière, par exemple une séquence d'ADN, les différentes molécules, par exemple différentes séquences d'ADN, présentes dans un échantillon donné peuvent être détectées simultanément lors de l'analyse. Pour l'application de la présente invention, il suffit d'appliquer, soit de manière séquentielle, soit en parallèle, à chacun des plots d'une telle biopuce, le potentiel de déclenchement de l' électrochimiluminescence du marqueur en présence du relais rédox. Ainsi, par exemple pour de l'ADN, à partir des plots qui présentent une luminescence, il est possible d'identifier les séquences d'ADN présentes dans l'analyte. Le support présente une double fonction active permettant (i) l'immobilisation électro- contrôlée de l'objet biologique sonde, dans cet exemple l'ADN, et (ii) l' activation en tant que déclencheur de l' électrochimiluminescence .Each stud making up a MICAM biochip specifically recognizing a particular molecule, for example a DNA sequence, the different molecules, for example different DNA sequences, present in a given sample can be detected simultaneously during analysis . For the application of the present invention, it suffices to apply, either sequentially or in parallel, to each of the pads of such a biochip, the potential for triggering the electrochemiluminescence of the marker in the presence of the redox relay. Thus, for example for DNA, from the plots which exhibit luminescence, it is possible to identify the DNA sequences present in the analyte. The support has a double active function allowing (i) the electro-controlled immobilization of the probe biological object, in this example DNA, and (ii) activation as a trigger for electrochemiluminescence.
La présente invention permet donc pour la première fois la mise en œuvre d'un procédé d' électrochimiluminescence sur un système analyse en parallèle ("multi-array") dans lequel le support d'immobilisation est aussi celui qui permet le déclenchement de la chimiluminescence.The present invention therefore allows for the first time the implementation of an electrochemiluminescence process on a parallel analysis system ("multi-array") in which the immobilization support is also that which allows the initiation of chemiluminescence.
L'application de la présente invention à un système multiparametrique permet en outre une lecture multiparametrique et/ou en parallèle que n'offre pas les dispositifs de positionnement successifs de l'art antérieur.The application of the present invention to a multi-parameter system further allows multi-parameter and / or parallel reading that does not offer the successive positioning devices of the prior art.
De plus, le procédé de la présente invention permet d'effectuer des analyses quantitatives directes tout en éliminant les problèmes de bruit de fond inhérents aux mesures par fluorescence. Enfin, dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur est réalisée spécifiquement sur la molécule cible contrairement aux procédés de l'art antérieur faisant intervenir des intercalants électrochimiluminescents dans le cas de biocapteurs à ADN.In addition, the method of the present invention makes it possible to carry out direct quantitative analyzes while eliminating the problems of background noise inherent in fluorescence measurements. Finally, in the present invention, the immobilization of the marker is carried out specifically on the target molecule unlike the methods of the prior art involving electrochemiluminescent intercalants in the case of DNA biosensors.
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier dans les exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif en référence à la figure annexée.Other characteristics and advantages will also appear to those skilled in the art in the following examples given by way of illustration and not limitation with reference to the appended figure.
Brève description de la figureBrief description of the figure
La figure 1 est une représentation schématique du mécanisme réactionnel de la présente invention. ExemplesFigure 1 is a schematic representation of the reaction mechanism of the present invention. Examples
Exemple 1 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du complexe Ru(bpy)3 + en solution sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole.Example 1: ELECTROCHIMILUMINESCENCE of the Ru (bpy) 3 + complex in solution on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
Les inventeurs entrepris 1 ' étude de 1 ' électrochimiluminescence à partir du complexe trisbipyridine de ruthénium (Ru(bpy)3 2+) en solution. Cette expérience a été réalisée à partir d'une solution 1 mM en Ru (bpy) 3 2+ + 50 mM de tripropylamine (TPA) + LiCl04 0,1 M en milieu mixte CH3CH/H20 (50 : 50 en volume) ou CH3CN pur sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole.The inventors undertook the study of electrochemiluminescence from the trisbipyridine complex of ruthenium (Ru (bpy) 3 2+ ) in solution. This experiment was carried out using a 1 mM Ru (bpy) 3 2+ solution + 50 mM tripropylamine (TPA) + 0.1 M LiCl0 4 in a mixed medium CH 3 CH / H 2 0 (50:50 by volume) or pure CH 3 CN on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
Sur l'électrode nue, comme attendu, l'émission lumineuse orange débute à partir d'une tension seuil de 0,8 V dont l'intensité croît jusqu'à 1,0 V pour se stabiliser dans la zone de potentiel exploré jusqu'à 1,2 V.On the bare electrode, as expected, the orange light emission starts from a threshold voltage of 0.8 V whose intensity increases to 1.0 V to stabilize in the area of potential explored until at 1.2 V.
Dans les mêmes conditions, mais en utilisant une électrode de platine recouverte d'un film homogène de polypyrrole d'épaisseur 0,08 μm (20 mC/cm2), aucune émission lumineuse est détectée jusqu'à un potentiel de 1,2 V.Under the same conditions, but using a platinum electrode covered with a homogeneous film of polypyrrole with a thickness of 0.08 μm (20 mC / cm 2 ), no light emission is detected up to a potential of 1.2 V .
Exemple 2 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du Pu(bpy)3 2+ en solution en présence de N-méthylphénothiazine ou de N- butylphénothiazine sulfonate de sodium sur une électrode de platine recouvert par un film de polypyrrole . Comme pour l'exemple 1,Example 2: ELECTROCHIMILUMINESCENCE of Pu (bpy) 3 2+ in solution in the presence of sodium N-methylphenothiazine or sodium N-butylphenothiazine sulfonate on a platinum electrode covered with a polypyrrole film. As for example 1,
1' électrochimiluminescence est étudiée à partir du complexe Ru(bpy)3 2+ en solution et d'une électrode de platine recouverte par un film de polypyrrole (20 mC/cm2). Si à la solution précédente (1 mM en Ru(bpy)3 2+ + 50 mM de tripropylaminé (TPA) + LiCl04 0,1 M dans CH3CN/H20) , on ajoute 2 mM de N- méthylphénothiazine, il est alors possible d'observer une émission luminescence orange centrée à 610 nm typique d' électrochimiluminescence du Ru(bpy)3 2+ sur cette électrode recouverte du film de polypyrrole en appliquant seulement qu'un potentiel de 0,65 V. Cette émission est constante tant que cette valeur de potentiel est imposée. Par contre si le potentiel est porté à 1 V, c'est à dire au potentiel où se produit la suroxydation du polypyrrole, cette émission disparaît presque instantanément et irréversiblement.Electrochemiluminescence is studied from Ru (bpy) 3 2+ complex in solution and a platinum electrode covered by a polypyrrole film (20 mC / cm 2 ). If to the preceding solution (1 mM in Ru (bpy) 3 2+ + 50 mM of tripropylamine (TPA) + LiCl0 4 0.1 M in CH 3 CN / H 2 0), 2 mM of N-methylphenothiazine are added, it is then possible to observe an orange luminescence emission centered at 610 nm typical of electrochemiluminescence of Ru (bpy) 3 2+ on this electrode covered with the polypyrrole film by applying only a potential of 0.65 V. This emission is constant as long as this potential value is imposed. On the other hand, if the potential is brought to 1 V, that is to say to the potential where the over-oxidation of the polypyrrole occurs, this emission disappears almost instantaneously and irreversibly.
Ainsi la présence d'un relais rédox conformément à la présente invention, par exemple la N- méthylphénothiazine dans cet exemple, permet d'abaisser le potentiel de déclenchement de 1' électrochimiluminescence du complexe Ru(bpy)3 2+ dans un domaine de potentiel où la matrice formant le film polymère de polypyrrole n'est pas suroxydée, c'est à dire dans un domaine où elle conserve ses propriétés de conductivité électronique. Thus the presence of a redox relay in accordance with the present invention, for example N-methylphenothiazine in this example, makes it possible to lower the potential for triggering the electrochemiluminescence of the Ru (bpy) 3 2+ complex in a potential domain where the matrix forming the polypyrrole polymer film is not over-oxidized, that is to say in a field where it retains its properties of electronic conductivity.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire entre une molécule sonde fixée sur un support et une molécule cible recherchée dans un échantillon à tester, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur sur lequel est fixée une molécule sonde, b) marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent, c) mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible, d) rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c) , et e) soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d' électrochimiluminescence déclenchée par transfert électronique indirect entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox.1. A method of detecting molecular recognition between a probe molecule fixed on a support and a target molecule sought in a test sample, said method comprising the following steps: a) bringing together a test support comprising a surface comprising a film conductive polymer to which a probe molecule is attached, b) mark before or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent marker, c) bring the target molecule into contact with the test support under physical and chemical conditions allowing recognition molecular and the specific assembly between the probe molecule and the target molecule, d) rinse the test support so as to remove the excess of electrochemiluminescent marker while preserving the specific assembly between the probe molecule and the target molecule of the step c), and e) subjecting the rinsed test support obtained in step d) to a reading of the electrochemical signal imiluminescence triggered by indirect electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le film polymère conducteur est un film de polypyrrole, de poly (3 , 4-éthylènedioxythiophène) ou de leur dérivés. 2. The method of claim 1, wherein the conductive polymer film is a film of polypyrrole, poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) or their derivatives.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la molécule sonde est choisie parmi de l'ADN simple ou double brin, un anticorps, une protéine ou un enzyme.3. Method according to claim 1, in which the probe molecule is chosen from single or double stranded DNA, an antibody, a protein or an enzyme.
4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le marqueur électrochimiluminescent est un complexe organométallique dont le potentiel de déclenchement de 1' électrochimiluminescence se situe dans un domaine de potentiel où le film polymère conducteur électronique présente un effet de suroxydation.4. The method of claim 1, wherein the electrochemiluminescent marker is an organometallic complex whose potential for triggering electrochemiluminescence is in a potential range where the electronic conductive polymer film has an overoxidation effect.
5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le marqueur électrochimiluminescent est choisi dans le groupe comprenant les complexes d'osmium et de ruthénium avec des ligands identiques ou différents de bi ou terpyridine et/ou de phénantroline et leurs dérivés ; un cryptate d'europium ou des esters d'acridinium.5. The method of claim 1, wherein the electrochemiluminescent marker is selected from the group comprising osmium and ruthenium complexes with identical or different ligands of bi or terpyridine and / or phenanthroline and their derivatives; a europium cryptate or acridinium esters.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, dans lequel la lecture du signal d' électrochimiluminescence déclenchée par transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox est réalisée en présence d'un substrat sacrificiel.6. The method of claim 4 or 5, wherein the reading of the electrochemiluminescence signal triggered by electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay is carried out in the presence of a sacrificial substrate.
7. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, le relais rédox est choisi parmi un groupement métallocène tel que le ferrocêne ou le diferrocène ; des complexes de métaux de transition tels qu'un complexe de cobalt ; un groupement de la famille de la phénothiazine, du méthylviologène et de leurs dérivés respectifs ; ou des intercalants de l'ADN possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox ; ainsi que des aminés aromatiques ou hétérocycles .7. The method of claim 1, wherein the redox relay is selected from a metallocene group such as ferrocene or diferrocene; transition metal complexes such as a cobalt complex; a group of the family of phenothiazine, methylviologene and their derivatives respective; or DNA intercalants having redox properties or comprising redox groups; as well as aromatic amines or heterocycles.
8. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le relais rédox est en solution ; greffé au film conducteur à conduction électronique ou à la molécule sonde ; ou sous la forme d'intercalant de la molécule sonde possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox.8. The method of claim 1, wherein the redox relay is in solution; grafted to the conductive film with electronic conduction or to the probe molecule; or in the form of an intercalator of the probe molecule having redox properties or comprising redox groups.
9. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le film polymère conducteur est un film de polypyrrole, le marqueur électrochimiluminescent est un complexe de ruthénium, le relais rédox est une N-méthylphénothiazine, et dans lequel la lecture du signal d' électrochimiluminescence rendue possible par transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support via le relais rédox est réalisée en présence d'une amine aliphatique telle que la tripropylamine .9. The method of claim 1, wherein the conductive polymer film is a polypyrrole film, the electrochemiluminescent label is a ruthenium complex, the redox relay is an N-methylphenothiazine, and wherein the reading of the electrochemiluminescence signal made possible by electronic transfer between the target marker and the support via the redox relay is carried out in the presence of an aliphatic amine such as tripropylamine.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le support est un support multiparametrique.10. Method according to any one of claims 1 to 9, in which the support is a multi-parameter support.
11. Utilisation d'un procédé selon la revendication 1, pour réaliser une analyse quantitative ou qualitative d'une molécule cible présente dans un échantillon. 11. Use of a method according to claim 1, for carrying out a quantitative or qualitative analysis of a target molecule present in a sample.
12. Utilisation d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans un système d'analyse multiparametrique et/ou en parallèle. 12. Use of a method according to any one of claims 1 to 9, in a multi-parameter and / or parallel analysis system.
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