FR2841985A1 - DETECTION OF MOLECULAR RECOGNITION BY ELECTROCHIMILUMINESCENCE ON CONDUCTIVE POLYMER - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence médiatée sur polymère conducteur électronique. Ce procédé comprend les étapes consistant : a) à mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur, ledit film comportant une molécule sonde ; b) à marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent ; c) à mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible ; d) à rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c) ; et e) à soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d'électrochimiluminescence rendue possible par un transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox.The present invention relates to a method for detecting molecular recognition by electrochemiluminescence mediated on an electronically conductive polymer. This method comprises the steps of: a) bringing together a test support comprising a surface comprising a conductive polymer film, said film comprising a probe molecule; b) in labeling before or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent label; c) contacting the target molecule with the test support under physical and chemical conditions allowing molecular recognition and specific assembly between the probe molecule and the target molecule; d) rinsing the test support so as to remove the excess of electrochemiluminescent label while preserving the specific assembly between the probe molecule and the target molecule of step c); and e) in subjecting the rinsed test support obtained in step d) to a reading of the electrochemiluminescence signal made possible by an electronic transfer between the label of the target and the support via a redox relay.
Description
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DETECTION D'UNE RECONNAISSANCE MOLECULAIRE PAR
ELECTROCHIMILUMINESCENCE SUR POLYMERE CONDUCTEUR
DESCRIPTION Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence sur un polymère conducteur à conduction électronique. Elle permet de manière générale la détection quantitative et qualitative d'une reconnaissance moléculaire entre une première molécule fixée sur un support et une deuxième molécule recherchée dans un échantillon. DETECTION OF MOLECULAR RECOGNITION BY
ELECTROCHIMILUMINESCENCE ON CONDUCTIVE POLYMER
DESCRIPTION Technical field
The present invention relates to a method for detecting a molecular recognition by electrochemiluminescence on an electronically conductive conductive polymer. It generally allows the quantitative and qualitative detection of a molecular recognition between a first molecule fixed on a support and a second molecule sought in a sample.
Elle concerne le domaine au sens large des capteurs et biopuces, en particulier ceux ou celles comprenant au moins un film polymère conducteur électronique tel que le polypyrrole et leurs dérivés. It relates to the broad field of sensors and biochips, in particular those or at least one comprising an electronically conductive polymer film such as polypyrrole and their derivatives.
Cette invention est relative à la détection par chimiluminescence électrogénérée ou électrochimiluminescence (ECL) via un relais présentant des propriétés d'oxydo-réduction, appelé dans la présente relais rédox . This invention relates to detection by electrogenerated chemiluminescence or electrochemiluminescence (ECL) via a relay having oxidation-reduction properties, referred to herein as redox relay.
Selon l'invention, la reconnaissance moléculaire peut être définie comme une interaction spécifique entre deux molécules plus ou moins complexes, conduisant à une liaison ou assemblage des deux molécules suffisamment stable pour que les molécules puissent être détectées lorsqu'elles sont liées. Il peut s'agir par exemple d'une hybridation d'acides nucléiques (ADN et/ou ARN), d'une réaction de reconnaissance de type antigène/anticorps, d'une According to the invention, the molecular recognition can be defined as a specific interaction between two more or less complex molecules, leading to a bond or assembly of the two molecules sufficiently stable so that the molecules can be detected when they are linked. This may be, for example, a nucleic acid hybridization (DNA and / or RNA), an antigen / antibody type recognition reaction, a
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interaction de type protéine/protéine, d'une interaction sucre/protéine, d'une interaction de type enzyme/substrat, d'une interaction de type ADN double brin/protéine, etc. protein / protein interaction, sugar / protein interaction, enzyme / substrate interaction, double-stranded DNA / protein interaction, etc.
Le procédé de la présente invention trouve par exemple une application dans la détection dans le domaine des"Biopuces"au sens large c'est-à-dire des puces à acides nucléiques et des puces à protéines ou tous systèmes y compris multiparamétriques pour l'étude de la reconnaissance sonde-cible de substrats biologiques. Il s'agit par exemple de la détection d'hybridation d'acides nucléiques sur support solide, en milieu aqueux ou à l'air, par exemple dans le cadre d'un criblage ("screening") ou d'une détection d'hybridation sur une biopuce. The method of the present invention finds, for example, an application in the detection in the field of "microarrays" in the broad sense, that is to say nucleic acid chips and protein chips or all systems including multiparameter for the study of probe-target recognition of biological substrates. This is for example the detection of hybridization of nucleic acids on a solid support, in an aqueous medium or in the air, for example in the context of a screening ("screening") or a detection of hybridization on a biochip.
Le procédé de la présente invention peut être appliqué à toutes finalités de marquage sur des surfaces de polymères conducteurs à conduction électronique par un système électrochimiluminescent. The method of the present invention can be applied for all purposes of marking on electrically conductive conductive polymer surfaces by an electrochemiluminescent system.
Dans la présente description, les références entre crochets [] renvoient à la liste de référence annexée. In this description, references in square brackets [] refer to the attached reference list.
Etat de la technique
Les biocapteurs miniaturisés ou biopuces sont actuellement l'objet d'enjeux économiques majeurs. Cet attrait s'explique par leur capacité de pouvoir réaliser des milliers d'analyses en parallèle ainsi que par leur vaste champ d'application touchant à la fois le domaine du diagnostic médical, du contrôle environnemental et agro-alimentaire, ainsi que celui de la pharmacologie. State of the art
Miniaturized biosensors or biochips are currently the subject of major economic stakes. This attraction is due to their ability to perform thousands of parallel analyzes as well as their wide scope of application touching on the fields of medical diagnosis, environmental and agri-food control, as well as pharmacology.
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Ces systèmes sont constitués de molécules sondes, généralement de molécules biologiques telles que des fragments d'ADN, ou plus généralement des fragments d'oligonucléotides (ou ODN), immobilisées sur de très petites surfaces. Ces sondes, de par leur capacité de reconnaître spécifiquement des entités biologiques données, appelées molécules cibles, comme des brins d'ADN ou d'ODN complémentaires, confèrent au biocapteur une sélectivité de reconnaissance. These systems consist of probe molecules, generally biological molecules such as DNA fragments, or more generally fragments of oligonucleotides (or ODN), immobilized on very small surfaces. These probes, by their ability to specifically recognize given biological entities, called target molecules, such as DNA strands or complementary ODNs, give the biosensor recognition selectivity.
La sensibilité de ces biocapteurs dépend en partie de la technique mise en oeuvre pour révéler le phénomène de reconnaissance molécules sondes/molécules cibles. The sensitivity of these biosensors depends in part on the technique used to reveal the phenomenon of recognition molecules probes / target molecules.
De nombreux outils ont été développés pour détecter ces reconnaissances moléculaires. Certaines techniques utilisent des marqueurs fluorescents qui offrent une grande sensibilité de détection. Cependant, ces techniques nécessitent une excitation laser des fluorophores greffés sur les biomolécules cibles qui peut s'accompagner également par une fluorescence résiduelle parasite provenant de l'illumination du support et des biomolécules. Many tools have been developed to detect these molecular recognitions. Some techniques use fluorescent markers that offer high detection sensitivity. However, these techniques require laser excitation of the fluorophores grafted onto target biomolecules which may also be accompanied by residual parasite fluorescence from the illumination of the support and biomolecules.
D'autres techniques utilisent des marqueurs électrochimiluminescents tels que le luminol et ses dérivés ou les composés organométalliques tel que le complexe Ru(2, 2'-bipyridine) , Ru (bpy) " [1] et [2]. Other techniques use electrochemiluminescent markers such as luminol and its derivatives or organometallic compounds such as Ru complex (2,2'-bipyridine), Ru (bpy) "[1] and [2].
Malheureusement dans le cas du luminol et de ses dérivés, l'êlectrochimiluminescence (ECL) conduit à une destruction irréversible de la molécule de luminol ou de ses dérivés. L'émission de lumière correspond alors Unfortunately in the case of luminol and its derivatives, electrochemiluminescence (ECL) leads to irreversible destruction of the luminol molecule or its derivatives. The emission of light then corresponds
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à un flash, son intensité diminuant rapidement dans le temps.
Pour les marqueurs type Ru (bpy) , l'émission de luminescence ne s'accompagne pas de la destruction du luminophore, le complexe Ru(bpy) 32+ étant régénéré, mais sont utilisation ne peut malheureusement pas se faire sur tout type de support. For Ru (bpy) type markers, the luminescence emission is not accompanied by the destruction of the phosphor, the Ru (bpy) 32+ complex being regenerated, but unfortunately they can not be used on any type of support. .
L'électrochimiluminescence du Ru(bpy)32+ est induite par la désactivation du complexe à l'état excité Ru (bpy) 3 *. The electrochemiluminescence of Ru (bpy) 32+ is induced by the deactivation of the excited complex Ru (bpy) 3 *.
Ce complexe peut-être formé suivant une première voie par la réaction d'annihilation, réaction (3) ci-
dessous, entre le Ru (bpy) 33+ et le Ru (bpy) 32+ ; chacune de ces deux espèces étant électrogénérée à partir du complexe Ru(bpy)32+, respectivement par oxydation, décrite par la réaction (1) ci-dessous, et réduction, décrite par la réaction (2) ci-dessous, de ce dernier en appliquant alternativement, à une fréquence de l'ordre de 0,2 Hz, un potentiel de +1,3 V et-1, 3 V (vs Ag/AgCl).
below, between Ru (bpy) 33+ and Ru (bpy) 32+; each of these two species being electrogenerated from the Ru (bpy) 32+ complex, respectively by oxidation, described by reaction (1) below, and reduction, described by reaction (2) below, of the latter alternately applying, at a frequency of the order of 0.2 Hz, a potential of +1.3 V and -1.3 V (vs. Ag / AgCl).
Cette réaction d'annihilation (3) conduit à la formation du complexe à l'état excité Ru(bpy) 32+* qui lors de sa désactivation, réaction (4), émet sous forme de flash une lumière centrée à 610 nm en redonnant le complexe initial Ru(bpy)32+. This annihilation reaction (3) leads to the formation of the excited state complex Ru (bpy) 32 + * which, when it is deactivated, reaction (4), emits in the form of a flash a light centered at 610 nm while giving back the initial complex Ru (bpy) 32+.
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Cette première voie ne concerne pas le procédé de la présente invention. This first route does not relate to the process of the present invention.
Il est également possible, suivant une deuxième voie, à partir du complexe Ru(bpy)32+ d'observer une émission permanente à 610 nm par électrochimiluminescence en appliquant un potentiel constant de +1,3 V (vs Ag/AgCl). Dans ce cas, la présence d'un co-substrat, appelé aussi substrat sacrificiel, est alors requise. Ce composé qui peut- être une amine aliphatique type tripropylamine (Pr3N),
comme le décrit le document [1], génère un agent réducteur PrsN-CH'-CHs-CHs, comme le décrit la réaction (6) ci-dessous, qui peut soit réagir avec le complexe Ru(bpy)33+ pour former l'état excité Ru (bpy) *, selon la réaction (7) ci-dessous, ou réduire l'espèce Ru(bpy) 3 en Ru(bpy)3+, selon la réaction (8) cidessous, pour conduire au Ru(bpy) zo selon la réaction (3) ci-dessus. Comme précédemment, le complexe Ru(bpy)3 n'est pas épuisé mais régénéré lors de l'électrochimiluminescence par contre le co-substrat est irréversiblement consommé.
as described in [1], generates a reducing agent PrsN-CH'-CHs-CHs, as described in reaction (6) below, which can either react with the Ru (bpy) 33+ complex to form the excited state Ru (bpy) *, according to reaction (7) below, or reducing the Ru (bpy) 3 species to Ru (bpy) 3+, according to reaction (8) below, to yield Ru ( bpy) zo according to reaction (3) above. As previously, the Ru (bpy) 3 complex is not exhausted but regenerated during electrochemiluminescence against the co-substrate is irreversibly consumed.
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C'est pourquoi par rapport au luminol ou ses dérivés les composés Ru (bpy) sont des candidats plus attractifs en tant que marqueurs pour une détection par électrochimuluminescence. This is why, compared to luminol or its derivatives Ru (bpy) compounds are more attractive candidates as markers for electrochemuluminescence detection.
Malheureusement, les potentiels de lecture du signal émis pour les marqueurs électrochimiluminescents tels que les complexes de ruthénium sont trop élevés pour pouvoir être utilisés sur des films de polymères conducteurs tels que ceux utilisés pour la fabrication de la pluspart des capteurs et biopuces, par exemple tels que le polypyrrole dans les systèmes MICAM (marque déposée). En effet, ces potentiels conduisent à une suroxydation du film de polymère conducteur qui perd alors ses propriétés de conductivité électronique rendant le transfert électronique support/sonde insuffisant pour permettre une détection par ECL. Unfortunately, the reading potentials of the signal emitted for electrochemiluminescent markers such as ruthenium complexes are too high to be used on conductive polymer films such as those used for the manufacture of most of the sensors and biochips, for example such than polypyrrole in MICAM (registered trademark) systems. Indeed, these potentials lead to an overoxidation of the conductive polymer film which then loses its electronic conductivity properties making the electronic transfer support / probe insufficient to allow detection by ECL.
Foster et coll. [3] ont élaboré un capteur à base
21 de Ru (bpy) 32+ pour la détection d'ions oxalate. Dans ce cas, le complexe Ru (bpy) 32+ est immobilisé par un lien covalent dans une matrice poly (4-vinylpyridine). Le principe de la détection des oxalates repose sur la génération électrochimique de Ru(bpy) 33+ qui réagit ensuite avec l'analyte CsC'pour conduire au complexe à l'état excité Ru(bpy) 32+*. Ce dernier émet ensuite à 610 nm lors de sa désactivation suivant la réaction (4) ci-dessus. Foster et al. [3] developed a sensor based
Ru (bpy) 32+ 21 for the detection of oxalate ions. In this case, the Ru (bpy) 32+ complex is immobilized by a covalent bond in a poly (4-vinylpyridine) matrix. The principle of the detection of oxalates is based on the electrochemical generation of Ru (bpy) 33+ which then reacts with the CsC 'analyte to drive the complex to Ru (bpy) 32 + * excited state. The latter then emits at 610 nm when it is deactivated according to reaction (4) above.
R. Blanchard et coll. [4] ont également développé un capteur pour la détection d'ions oxalates en R. Blanchard et al. [4] have also developed a sensor for the detection of oxalate ions in
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piégeant électrostatiquement un dérivé du complexe Ru(bpy) 32+ dans une matrice polymère conducteur électronique. Le complexe de ruthénium sous sa forme sulfonique RuBPS (acide tris (4, 7-diphenyl-1, 10phénantrolinedisulfonique) ruthénium II) est inséré en tant que contre-ion dopant dans la matrice polymère (polyMPP) lors de son électrosynthèse via l'oxydation électrochimique de monomères 1-méthyl-3- (pyrrol-1- ylmethyl) pyridinium chlorure (MPP). En imposant à ce film RuBPS/polyMPP en présence d'ions oxalate, un potentiel de 1,250 V vs Ag/AgCl, une réponse lumineuse par électrochimiluminescence est alors détectée. electrostatically trapping a Ru (bpy) 32+ complex derivative in an electronically conductive polymer matrix. The ruthenium complex in its sulfonic form RuBPS (tris (4, 7-diphenyl-1, 10phenantrolinedisulfonic acid) ruthenium II) is inserted as a doping counterion in the polymer matrix (polyMPP) during its electrosynthesis via oxidation. electrochemical monomer 1-methyl-3- (pyrrol-1-ylmethyl) pyridinium chloride (MPP). By imposing on this RuBPS / polyMPP film in the presence of oxalate ions, a potential of 1.250 V vs Ag / AgCl, a light response by electrochemiluminescence is then detected.
Cependant ces auteurs notent une faible stabilité dans le temps du film RuBPS/PMPP résultant d'une solubilisation de ce polymère. En outre ils soulignent également la possibilité d'émission d'électrochimiluminescence du RuBPS à l'interface de l'électrode conséquence de son exclusion par diffusion de la matrice PMPP. However, these authors note a low stability in time of the RuBPS / PMPP film resulting from a solubilization of this polymer. In addition, they also highlight the possibility of electrochemiluminescence emission of RuBPS at the interface of the electrode as a result of its exclusion by diffusion of the PMPP matrix.
Dans cet exemple, la sonde d'électrochimiluminescence est piégée électrostatiquement à la surface de l'électrode. Cette méthode d'immobilisation pose donc un problème en terme de stabilité puisque les complexes de ruthénium peuvent être exclus de la matrice polymère par simple diffusion. De plus, comme le montrent des études réalisées à partir de polypyrroles solubles fonctionnalisés par des complexes polypyridyle de ruthénium II [5], on peut envisager dans le cas de l'insertion des complexes Ru (bpy) 3 dans une matrice polymère type polypyrrole, un effet de quenching de In this example, the electrochemiluminescence probe is electrostatically trapped on the surface of the electrode. This immobilization method therefore poses a problem in terms of stability since the ruthenium complexes can be excluded from the polymer matrix by simple diffusion. In addition, as shown by studies carried out using soluble polypyrroles functionalized with ruthenium II polypyridyl complexes [5], it is possible to envisage in the case of the insertion of Ru (bpy) 3 complexes in a polypyrrole-type polymer matrix, a quenching effect of
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l'état excité Ru(bpy) 32+* induit par son confinement dans la matrice polymère. On peut donc penser que
21 l'immobilisation du complexe Ru (bpy) 32+ par un lien électrostatique ou covalent dans un polymère est peu favorable à son emploi comme marqueur en vue d'une détection par électrochimiluminescence. the excited state Ru (bpy) 32 + * induced by its confinement in the polymer matrix. We can therefore think that
Immobilization of the Ru (bpy) 32+ complex by electrostatic or covalent bonding in a polymer is unfavorable for its use as a marker for electrochemiluminescence detection.
Xu et coll. [6-7] ont adopté une autre démarche où cette fois-ci la molécule cible est marquée par la sonde d'électrochimiluminescence. Cette dernière n'est donc plus insérée à l'électrode via une matrice polymère comme précédemment. Ces auteurs, pour contourner le problème précité de suroxydation du film de polymère conducteur, ont appliqué cette détection par électrochimiluminescence à un biocapteur à ADN constitué de simples brins d'ADN immobilisés sur une électrode recouverte par un film d'alcanebisphosphonate d'aluminium. Le phénomène d'hybridation entre ces fragments d'ADN immobilisés et des brins complémentaires en solution a été mis en évidence via électrochimiluminescence de complexes Ru(bpy) 32+ soit insérés comme intercalant ou greffés préalablement sur les brins complémentaires. Xu et al. [6-7] have adopted another approach where this time the target molecule is marked by the electrochemiluminescence probe. The latter is therefore no longer inserted into the electrode via a polymer matrix as previously. These authors, to circumvent the aforementioned problem of overoxidation of the conductive polymer film, applied this detection by electrochemiluminescence to a DNA biosensor consisting of single strands of DNA immobilized on an electrode covered with an aluminum alkanebisphosphonate film. The hybridization phenomenon between these immobilized DNA fragments and complementary strands in solution has been demonstrated via electrochemiluminescence of Ru (bpy) 32+ complexes either inserted as intercalating or grafted beforehand on the complementary strands.
Il existe donc un réel besoin d'une méthode alternative de détection d'une reconnaissance moléculaire par électrochimiluminescence, qui puisse facilement être mise en oeuvre, même sur des capteurs et biopuces telles que les systèmes MICAM (marque déposée), et qui ne présente pas les inconvénients des techniques de l'art antérieur, et notamment, qui ne s'accompagne pas d'une destruction irréversible du There is therefore a real need for an alternative method for detecting a molecular recognition by electrochemiluminescence, which can easily be implemented, even on sensors and biochips such as MICAM (registered trademark) systems, and which does not exhibit the disadvantages of the techniques of the prior art, and in particular, which is not accompanied by irreversible destruction of the
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marqueur électrochimiluminescent et surtout du film de polymère conducteur. electrochemiluminescent marker and especially conductive polymer film.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention a précisément pour but de fournir une telle méthode alternative et de résoudre les problèmes précités de l'art antérieur en fournissant un procédé de détection d'une reconnaissance moléculaire entre une molécule sonde fixée sur un support et une molécule cible recherchée dans un échantillon à tester, ledit procédé permettant en outre une détection qualitative et quantitative précise et sensible de la molécule cible lorsqu'elle est présente dans un échantillon. STATEMENT OF THE INVENTION
The present invention is specifically intended to provide such an alternative method and to solve the aforementioned problems of the prior art by providing a method of detecting a molecular recognition between a probe molecule fixed on a support and a target molecule sought in a sample to be tested, said method further allowing a precise and sensitive qualitative and quantitative detection of the target molecule when present in a sample.
Ledit procédé de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) mettre en présence un support test comprenant une surface comportant un film polymère conducteur électronique sur lequel est fixée une molécule sonde, b) marquer avant ou après l'étape c) la molécule cible avec un marqueur électrochimiluminescent, c) mettre en contact la molécule cible avec le support test dans des conditions physiques et chimiques permettant la reconnaissance moléculaire et l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible, d) rincer le support test de manière à supprimer l'excès de marqueur électrochimiluminescent tout en préservant l'assemblage spécifique entre la molécule sonde et la molécule cible de l'étape c), et Said method of the present invention comprises the following steps: a) bringing together a test medium comprising a surface comprising an electronically conductive polymer film to which a probe molecule is attached, b) marking before or after step c) the target molecule with an electrochemiluminescent label, c) contacting the target molecule with the test medium under physical and chemical conditions allowing for molecular recognition and specific assembly between the probe molecule and the target molecule, d) flushing the test medium so as to removing the excess electrochemiluminescent label while preserving the specific assembly between the probe molecule and the target molecule of step c), and
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e) soumettre le support test rincé obtenu à l'étape d) à une lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique entre le marqueur de la cible et le support en présence d'un relais rédox. e) subjecting the rinsed test support obtained in step d) to a reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an electronic transfer between the marker of the target and the support in the presence of a redox relay.
La détection d'une chimiluminescence à l'étape e) révèle un assemblage par reconnaissance moléculaire au sens précité entre la molécule sonde fixée sur le support et la molécule cible recherchée, et donc la présence de la molécule cible dans l'échantillon testé. The detection of a chemiluminescence in step e) reveals a molecular recognition assembly in the aforementioned sense between the probe molecule fixed on the support and the target molecule sought, and therefore the presence of the target molecule in the test sample.
Dans le procédé de la présente invention, la détection de la reconnaissance entre la molécule sonde et la molécule cible marquée est basée sur la chimiluminescence électrogénérée, ou électrochimiluminescence (ECL). Il s'agit d'une détection optique permettant de s'affranchir des inconvénients des procédés de l'art antérieur tout en conservant la sensibilité des détecteurs optiques. En effet, le déclenchement électrique de la chimiluminescence ne concerne que le marqueur chimiluminescent et non pas le support test ou les biomolécules. En outre, ce nouveau mode de détection appliqué aux biopuces permet d'effectuer des mesures quantitatives de la reconnaissance molécules sondes/molécules cibles contrairement à la détection par fluorescence. De plus, l'excitation par une impulsion électrique conforme à la présente invention permet un contrôle spatial et une mise en oeuvre rapide et aisée tout en s'affranchissant d'un appareillage coûteux d'excitation laser utilisé dans l'art antérieur. In the method of the present invention, detection of recognition between the probe molecule and the labeled target molecule is based on electrogenerated chemiluminescence, or electrochemiluminescence (ECL). This is an optical detection to overcome the disadvantages of the processes of the prior art while maintaining the sensitivity of the optical detectors. Indeed, the electrical activation of chemiluminescence only concerns the chemiluminescent marker and not the test medium or the biomolecules. In addition, this new detection mode applied to biochips makes it possible to perform quantitative measurements of the recognition of probe molecules / target molecules unlike fluorescence detection. In addition, the excitation by an electrical pulse according to the present invention allows a spatial control and a quick and easy implementation while avoiding a costly apparatus of laser excitation used in the prior art.
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La présente invention trouve donc notamment une application dans le domaine des biopuces, où le support sur lequel est déposé le film conducteur conformément à la présente invention forme la biopuce. The present invention therefore particularly finds application in the field of biochips, where the support on which the conductive film is deposited in accordance with the present invention forms the biochip.
Selon l'invention, le support peut être un quelconque des supports utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces. A titre d'exemples non limitatifs, peuvent être utilisés un support en métal tel que Au, Pt, etc. ; un support constitué d'un matériau semi-conducteur ; un support verre/ITO ; un support en verre ou quartz métallisé ; un support plastique/ITO ; un support en plastique métallisé ; un support en carbone vitreux ; ou un support formé par dépôt d'un matériau conducteur sérigraphié sur un substrat isolant ou sur un des supports précités. According to the invention, the support may be any of the supports used by those skilled in the art for the manufacture of biochips. By way of non-limiting examples, may be used a metal support such as Au, Pt, etc. ; a carrier made of a semiconductor material; a glass / ITO support; a support in glass or metallic quartz; a plastic / ITO support; a metallized plastic support; a glassy carbon support; or a support formed by depositing a screen-printed conductive material on an insulating substrate or on one of the abovementioned supports.
Selon la présente invention, le film polymère conducteur électronique peut être un film de polymère conducteur tel que ceux utilisés par l'homme du métier pour la fabrication de biopuces sur lesquelles sont greffées des sondes. Par exemple le polymère peut être un polymère conducteur tel que ceux décrits dans les Techniques de l'Ingénieur -A3140-sous la dénomination polymères conducteurs intrinsèques : il s'agit de polymères formés de molécules porteuses de liaisons conjuguées (oligomères ou réseaux réticulés) et éventuellement dopés par des dopants donneurs ou accepteurs d'électrons tels que les poly(acétylène), le poly(nitrure de soufre), le polyphénylène, le polypyrrole, le poly(sulfure de phénylène), le polythiophène, le polyaniline etc. A titre d'exemple non limitatif, il peut s'agir d'un film de According to the present invention, the electronically conductive polymer film may be a conductive polymer film such as those used by those skilled in the art for the manufacture of biochips onto which probes are grafted. For example, the polymer may be a conductive polymer such as those described in the techniques of the Engineer -A3140-under the name intrinsic conducting polymers: these are polymers formed of molecules carrying conjugated bonds (oligomers or crosslinked networks) and optionally doped with doping donors or electron acceptors such as poly (acetylene), poly (sulfur nitride), polyphenylene, polypyrrole, poly (phenylene sulfide), polythiophene, polyaniline etc. By way of non-limiting example, it may be a film of
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polypyrrole ; de poly(3, 4-éthylènedioxythiophène) (PEDOT) ou de leur dérivés. polypyrrole; poly (3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) or their derivatives.
Selon la présente invention, le film polymère conducteur peut être déposé sur le support en utilisant les techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple l'électrodéposition ou
l'électropolymêrisation ou le dépôt par centrifugation ("spin coating") ou encore le jet d'encre. According to the present invention, the conductive polymer film may be deposited on the support using conventional techniques known to those skilled in the art, for example electrodeposition or
electropolymerization or spin coating or ink jet.
Selon l'invention, le film polymère conducteur peut être élaboré à partir de simples monomères de type pyrrole ou d'oligomères pré-synthétisés comme des oligothiophènes, ainsi qu'à partir de systèmes moléculaires plus complexes comme des unités complexantes de métaux de transition tels que les phénantrolines, la phénylpyridine, etc., portant des unités électropolymérisables ce qui conduit lors de l'élaboration du polymère à un réseau conjugué. According to the invention, the conductive polymer film can be prepared from simple pyrrole-type monomers or pre-synthesized oligomers such as oligothiophenes, as well as from more complex molecular systems such as complexing complexes of transition metals such as Phenantrolines, phenylpyridine, etc., carrying electropolymerizable units which leads during the development of the polymer to a conjugated network.
Selon l'invention, la molécule sonde peut être par exemple de l'ADN simple ou double brin, un oligonucléotide, un anticorps, une protéine, un sucre ou un enzyme, ainsi que toute molécule ou biomolécule permettant une reconnaissance spécifique et un assemblage tels que définis ci-dessus. According to the invention, the probe molecule can be, for example, single or double-stranded DNA, an oligonucleotide, an antibody, a protein, a sugar or an enzyme, as well as any molecule or biomolecule allowing a specific recognition and assembly such as as defined above.
Selon l'invention, la fixation de la molécule sonde sur le film polymère conducteur peut se faire par les méthodes classiques de chimie utilisées pour fixer des sondes sur une biopuce. La liaison entre le film et la sonde peut être d'adsorption, électrostatique, chimique obtenue par auto-assemblage, silanisation, ou par toute méthode chimique, électrochimique, photochimique, etc. connue de l'homme du métier pour le According to the invention, the fixing of the probe molecule on the conductive polymer film can be done by the conventional methods of chemistry used to fix probes on a biochip. The bond between the film and the probe can be adsorption, electrostatic, chemical obtained by self-assembly, silanization, or by any chemical, electrochemical, photochemical, etc. method. known to those skilled in the art for the
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dépôt de la molécule sonde par exemple fonctionnalisée par un groupement apportant la propriété d'autoassemblage, d'ancrage, de couplage, ou polymérisable chimiquement, électrochimiquement, photochimiquement ou électrophotochimiquement par photosensibilisation. deposition of the probe molecule, for example functionalized by a group providing the property of self-assembly, anchoring, coupling, or polymerizable chemically, electrochemically, photochemically or electrophotochemically by photosensitization.
Selon l'invention, liaison entre le film polymère conducteur électronique déposé sur le support et la sonde peut être obtenue en une étape par exemple par le procédé MICAM (marque déposée). According to the invention, a connection between the electronically conductive polymer film deposited on the support and the probe can be obtained in one step, for example by the MICAM (registered trademark) method.
Les documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 et US 5 810 989 décrivent par exemple des techniques de dépôt de film et de fixation de molécules sondes utilisables dans la présente invention. Il s'agit par exemple d'électro-copolymérisation sur un support, par exemple sur un substrat de silice, de monomères précurseurs du polymère conducteur, tel que le pyrrole, avec des monomères, par exemple de pyrrole, fonctionnalisés par une molécule sonde selon la présente invention, par exemple des oligonucléotides. Dans ces techniques, on exploite l'adhésion du film conducteur de polypyrrole sur le substrat de façon à y réaliser la fixation des molécules sondes de reconnaissance. Documents FR-A-2 787 581, FR-A-2 787 582 and US 5 810 989 describe, for example, film deposition techniques and fixation of probe molecules that can be used in the present invention. It is for example electro-copolymerization on a support, for example on a silica substrate, of precursor monomers of the conductive polymer, such as pyrrole, with monomers, for example pyrrole, functionalized by a probe molecule according to the present invention, for example oligonucleotides. In these techniques, the adhesion of the polypyrrole conductive film to the substrate is exploited so as to fix the recognition probe molecules therein.
Selon l'invention, la sonde peut aussi être fixée sur le film après son dépôt sur le support par exemple par post-fonctionnalisation du film, par exemple de polypyrrole (Ppy), déposé par exemple par électrogreffage sur le support, par un système de reconnaissance par affinité, par exemple un système avidine/biotine ou des systèmes équivalents, ou des dérivés de ces systèmes. Ceci conduit par exemple aux According to the invention, the probe can also be fixed on the film after it has been deposited on the support, for example by post-functionalization of the film, for example of polypyrrole (Ppy), deposited for example by electrografting on the support, by a system of affinity recognition, for example an avidin / biotin system or equivalent systems, or derivatives thereof. This leads for example to
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structures support (S)-film conducteur-molécule sonde suivantes : S-PPy-ADN ; S-PPy-biotine/avidine/biotineADN ; S-PPy-biotine/avidine-protéine ; S-PPybiotine/avidine/biotine-anticorps, utilisables selon la présente invention. Ces structures sont par exemple utilisables sur un support (S) d'or (Au) ou de silice, ou sur tout support précité permettant le greffage du polymère conducteur. support structures (S) -film conductive-molecule probe following: S-PPy-DNA; S-PPy-biotin / avidin / biotin DNA; S-PPy-biotin / avidin-protein; S-PPybiotin / avidin / biotin-antibody, usable according to the present invention. These structures are for example usable on a support (S) of gold (Au) or silica, or on any aforementioned support for grafting the conductive polymer.
Cette fixation peut se faire par exemple avec adressage des sondes. Il s'agit par exemple d'un adressage photochimique, d'un adressage mécanique, par exemple par micropipetage à l'aide d'un robot disperseur, ou d'un adressage électrochimique. Ces techniques de fixation de sondes sur un film polymère sont connues de l'homme du métier. L'adressage présente l'avantage qu'il permet ensuite des analyses multiparamétriques. This attachment can be done for example with addressing probes. This is for example a photochemical addressing, a mechanical addressing, for example by micropipetting using a robot disperser, or electrochemical addressing. These techniques for fixing probes on a polymer film are known to those skilled in the art. Addressing has the advantage that it then allows multiparametric analyzes.
L'ancrage de la molécule sonde peut se faire par simple couplage entre deux fonctions chimiques réactives, par exemple type ester activé et une amine, l'une de ces fonctions étant portée par la molécule sonde et l'autre ancrée sur le film. Le couplage chimique sonde/film peut être empêché en bloquant la réactivité de la fonction chimique portée par le film. The anchoring of the probe molecule can be done by simple coupling between two reactive chemical functions, for example activated ester type and an amine, one of these functions being carried by the probe molecule and the other anchored on the film. Probe / film chemical coupling can be prevented by blocking the reactivity of the chemical function carried by the film.
L'empêchement peut être levé, débloqué , en rendant à nouveau la fonction réactive, ceci grâce par exemple à une activation électrochimique ou photochimique. A l'issue, le couplage de la molécule sonde sur le film est à nouveau possible. The impediment can be lifted, unlocked, rendering the reactive function again, for example by electrochemical or photochemical activation. At the end, the coupling of the probe molecule on the film is again possible.
Selon l'invention, le marquage de la cible par le marqueur électrochimiluminescent peut être antérieur ou According to the invention, the marking of the target by the electrochemiluminescent marker may be anterior or
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postérieur à l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test. En d'autres termes, le marquage de la molécule cible peut être effectué soit sur l'échantillon à tester avant sa mise en contact avec le support test, c'est à dire avant que l'assemblage molécule sonde/molécule cible se fasse, soit sur le support test après l'étape c) de mise en contact de la molécule cible avec le support test, c'est à dire, lorsque l'assemblage molécule sonde/molécule cible s'est fait. L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention par exemple suivant le type de molécules sonde/cible mises en jeu. after step c) contacting the target molecule with the test medium. In other words, the labeling of the target molecule can be carried out either on the sample to be tested before it comes into contact with the test medium, ie before the probe molecule / target molecule assembly is made, or on the test support after step c) of bringing the target molecule into contact with the test medium, that is to say, when the probe molecule / target molecule assembly has been made. Those skilled in the art will be able to adapt the process of the present invention for example according to the type of probe / target molecules involved.
Selon l'invention, le marqueur peut être un des marqueurs électrochimiluminescents connus de l'homme du métier. Il peut s'agir au sens large d'un marqueur ayant des propriétés d'électrochimiluminescence dont le potentiel de déclenchement de l'ECL en présence du cosubstrat, se situe dans un domaine de potentiel où le film polymère conducteur présente un effet de suroxydation. Cette suroxydation se manifeste par une dégradation notable des propriétés de conductivités électroniques du film polymère conducteur. According to the invention, the marker may be one of the electrochemiluminescent markers known to those skilled in the art. It may be in the broad sense of a marker having electrochemiluminescence properties whose triggering potential for ECL in the presence of the cosubstrate, is in a range of potential where the conductive polymer film has an overoxidation effect. This overoxidation is manifested by a significant degradation of the electronic conductivity properties of the conductive polymer film.
Avantageusement, le marqueur électrochimiluminescent peut être un complexe organométallique. Il peut être choisi par exemple dans le groupe comprenant les complexes d'osmium et de ruthénium avec des ligands identiques ou différents de bi ou terpyridine et/ou de phénantroline et leurs dérivés ; un cryptate d'europium ou des esters d'acridinium. Advantageously, the electrochemiluminescent marker may be an organometallic complex. It can be chosen for example from the group comprising osmium and ruthenium complexes with identical or different ligands of bi or terpyridine and / or phenanthroline and their derivatives; europium cryptate or acridinium esters.
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Dans ce cas, le marquage de la cible peut se faire par liaison entre la cible et le complexe métallique. Elle peut être directe par couplage chimique, comme par exemple entre le complexe métallique portant une fonction ester activé et la molécule cible possédant une fonction terminale amine NH2, ou par le biais d'un couplage par affinité de type biotine/avidine, par exemple ADNcible-biotine/avidine- métal. Des protocoles de marquage de la cible utilisables dans la présente invention sont décrits par exemple dans les documents [1] et [2]. In this case, the marking of the target can be done by binding between the target and the metal complex. It can be direct by chemical coupling, such as, for example, between the metal complex carrying an activated ester function and the target molecule having an amine NH 2 terminal function, or by means of a biotin / avidin affinity coupling, for example a DNA target. -biotin / avidin-metal. Target labeling protocols that can be used in the present invention are described for example in documents [1] and [2].
Dans le procédé de la présente invention, le relais rédox a pour but, dans l'étape e), de pouvoir déclencher l'électrochimiluminescence du marqueur à un potentiel inférieur à celui appliqué en l'absence de relais rédox par transfert des électrons du marqueur vers le film polymère déposé sur le support. Il agit comme un relais rédox entre le marqueur et le film, et abaisse le potentiel de lecture de l'électrochimiluminescence. Ainsi, le potentiel de lecture de l'électrochimiluminescence étant inférieur à celui qui devrait être utilisé pour le marquer seul, le film polymère conduceur est préservé de la suroxydation et donc de la dégradation notable de ses propriétés de conductivités électroniques. In the process of the present invention, the purpose of the redox relay is, in step e), to be able to trigger the electrochemiluminescence of the marker at a potential lower than that applied in the absence of redox relays by transfer of the electrons from the marker to the polymer film deposited on the support. It acts as a redox relay between the marker and the film, and lowers the reading potential of electrochemiluminescence. Thus, the reading potential of the electrochemiluminescence being lower than that which should be used to mark it alone, the conductive polymer film is preserved from over-oxidation and therefore from the significant degradation of its electronic conductivity properties.
Ce relais rédox peut être en solution, ou immobilisé, par exemple par greffage, sur le support avec le film ou avec l'assemblage résultant de la reconnaissance moléculaire entre la sonde et la cible, par exemple sous la forme d'intercalant possédant des propriétés redox ou comportant des groupements redox. This redox relay may be in solution, or immobilized, for example by grafting, on the support with the film or with the assembly resulting from the molecular recognition between the probe and the target, for example in the form of intercalant having properties redox or with redox groups.
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L'homme du métier saura adapter le procédé de la présente invention en fonction des molécules cibles et sondes en jeu. A titre d'exemples non limitatifs, il peut être choisi parmi : un groupement métallocène, par exemple un ferrocène ou un diferrocène ; des complexes de métaux de transition tel qu'un complexe de cobalt, ou d'autres métaux de transition ; un groupement de la famille de la phénothiazine, du méthylviologène et de leurs dérivés respectifs ; ou des intercalants de l'ADN possédant des propriétés rédox ou comportant des groupements rédox des amines aromatiques ou hétérocycles, etc. Those skilled in the art will be able to adapt the process of the present invention as a function of the target molecules and probes involved. By way of nonlimiting examples, it may be chosen from: a metallocene group, for example a ferrocene or a diferrocene; transition metal complexes such as a cobalt complex, or other transition metals; a group of the family of phenothiazine, methylviologen and their respective derivatives; or DNA intercalators having redox properties or having redox moieties of aromatic amines or heterocycles, etc.
Dans certains cas, par exemple pour les complexes du ruthénium, la lecture du signal d'électrochimiluminescence déclenchée par un transfert électronique indirect entre le marqueur de la cible et le support via un relais rédox peut devoir être réalisée en présence d'un substrat sacrificiel. Ce composé peut-être par exemple un de ceux décrits dans le document [1], par exemple une amine aliphatique
telle que la tripropylamine (Pr3N) qui génère un agent réducteur PrsN-CH'-CHB-CHg, selon la réaction (6) ci- dessus, qui peut soit réagir avec le complexe Ru(bpy) 33+ pour former l'état excité Ru(bpy) 32+*, selon la réaction (7) ci-dessus, ou réduire l'espèce Ru (bpy) en Ru(bpy) 3+, selon la réaction (8) ci-dessus, pour conduire au Ru(bpy) * selon la réaction (3) ci-dessus. In some cases, for example for the ruthenium complexes, the reading of the electrochemiluminescence signal triggered by an indirect electronic transfer between the target marker and the support via a redox relay may have to be performed in the presence of a sacrificial substrate. This compound may be for example one of those described in document [1], for example an aliphatic amine
such as tripropylamine (Pr3N) which generates a PrsN-CH'-CHB-CHg reducing agent, according to reaction (6) above, which can either react with the Ru (bpy) 33+ complex to form the excited state Ru (bpy) 32 + *, according to reaction (7) above, or reducing the Ru (bpy) species to Ru (bpy) 3+, according to reaction (8) above, to yield Ru ( bpy) * according to reaction (3) above.
Ainsi, le complexe Ru(bpy) 32+ n'est pas épuisé mais régénéré lors de l'électrochimiluminescence par contre le substrat sacrificiel est irréversiblement consommé. Thus, Ru (bpy) 32+ complex is not exhausted but regenerated during electrochemiluminescence against the sacrificial substrate is irreversibly consumed.
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La figure 1 est une représentation schématique d'un transfert électronique entre la molécule cible marquée et le support via le relais rédox et le film conducteur électronique lors d'une lecture d'électrochimiluminescence conformément au procédé de la présente invention. Sur cette figure, su représente le support, f le film conducteur électronique, li la liaison film conducteur électronique/molécule sonde, S la molécule sonde, C la molécule cible, m le marqueur, t la
liaison entre la molécule cible et le marqueur, le transfert d'électrons, le relais (M) e' rédox (ox = oxydant ; réd = réducteur) permettant le transfert électronique, et hv l'électroluminescence. La présence d'une éventuelle molécule sacrificielle n'est pas représentée. Fig. 1 is a schematic representation of an electron transfer between the labeled target molecule and the support via the redox relay and the electronically conductive film during an electrochemiluminescence reading according to the method of the present invention. In this figure, su represents the support, f the electronically conductive film, li the electronically conductive film / probe molecule binding, S the probe molecule, C the target molecule, m the marker, t the
binding between the target molecule and the label, electron transfer, (M) e 'redox (ox = oxidant, red = reductant) relay allowing electronic transfer, and hv electroluminescence. The presence of a possible sacrificial molecule is not represented.
L'étape finale de lecture d'électrochimiluminescence peut être réalisée au moyen d'un luminomètre qui mesure l'intensité de luminescence émise, par exemple à 610 nm pour les complexes du ruthénium. L'intensité de luminescence émise est proportionnelle à la concentration de molécules cibles assemblées aux molécules sondes. The final step of electrochemiluminescence reading can be carried out by means of a luminometer which measures the emitted luminescence intensity, for example at 610 nm for the ruthenium complexes. The intensity of emitted luminescence is proportional to the concentration of target molecules assembled to the probe molecules.
Dans le procédé de la présente invention, la détection directe, c'est à dire sans relais rédox, est impossible ou très difficile. En effet, comme illustré dans la partie art antérieur ci-dessus, le potentiel de déclenchement de l'ECL sans relais rédox est incompatible avec les propriétés de conduction électronique du film de polymère tel que le pyrrole car situé dans un domaine de potentiel où le pyrrole est In the method of the present invention, direct detection, ie without redox relay, is impossible or very difficult. Indeed, as illustrated in the prior art above, the triggering potential of the ECL without redox relay is incompatible with the electronic conduction properties of the polymer film such as pyrrole because located in a potential range where the pyrrole is
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dans un état de suroxydation avancée et donc joue le rôle d'une couche quasi-passivante rendant le transfert électronique direct support/sonde insuffisant pour permettre la détection de l'ECL. in an advanced state of overoxidation and thus plays the role of a quasi-passivating layer making the direct electron transfer support / probe insufficient to allow the detection of ECL.
Le potentiel de lecture de l'ECL dans le procédé de la présente invention est abaissé, ce qui préserve le film de polymère de sa suroxydation, et permet la lecture de l'ECL. The reading potential of the ECL in the process of the present invention is lowered, which preserves the polymer film from being overoxidized, and allows reading of the ECL.
Dans le procédé de la présente invention, le transfert électronique du support vers le marqueur électrochimiluminescent en présence du relais rédox peut donc s'effectuer au travers d'un film polymère conducteur électronique ce qui n'est pas le cas dans les systèmes développés par Xu et coll. [6-7]. En effet pour ces systèmes de l'art antérieur, l'ancrage du groupement électrochimiluminescent sur le support est réalisé par l'intermédiaire respectivement d'alcane bisphosphonate d'aluminium et d'aminohexane, couches qui sont non-conductrices. In the method of the present invention, the electronic transfer of the support to the electrochemiluminescent marker in the presence of the redox relay can therefore be effected through an electronically conductive polymer film, which is not the case in the systems developed by Xu. et al. [6-7]. Indeed for these systems of the prior art, the anchoring of the electrochemiluminescent group on the support is carried out respectively by alkane aluminum bisphosphonate and aminohexane, which layers are non-conductive.
Dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur électrochimiluminescent est réalisée spécifiquement sur l'analyte cible contrairement aux procédés où le complexe est immobilisé dans une matrice polymère sur l'électrode [3,4]. In the present invention, the immobilization of the electrochemiluminescent label is performed specifically on the target analyte in contrast to the methods where the complex is immobilized in a polymer matrix on the [3,4] electrode.
L'emploi d'un relais rédox selon la présente invention favorise et rend possible le transfert électronique support/film conducteur électronique/marqueur et donc les performances de ce mode de détection par électrochimiluminescence. The use of a redox relay according to the present invention promotes and makes possible the electron transfer support / electronically conductive film / marker and thus the performance of this detection mode by electrochemiluminescence.
De plus, dans le procédé de la présente invention, le support peut présenter une double In addition, in the method of the present invention, the support may have a double
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fonction active permettant (i) l'immobilisation électro-contrôlée de l'objet biologique au sein du film conducteur électronique et (ii) l'activation en tant que"déclencheur"du processus d'électrochimiluminescence du marqueur électrochimiluminescent en présence du relais ce qui permet son application à un système multiparamétrique (analyse en parallèle, ou"multi-array") de type biopuce basée sur la technologie développée depuis plusieurs années utilisant un réseau d'électrodes de type MICAM (marque déposée). an active function allowing (i) electro-controlled immobilization of the biological object within the electronically conductive film and (ii) activation as a "trigger" of the electrochemiluminescence process of the electrochemiluminescent label in the presence of the relay, which allows its application to a multiparametric system (parallel analysis, or "multi-array") biochip type based on technology developed for several years using a network of electrodes type MICAM (registered trademark).
Chaque plot composant une biopuce de type MICAM reconnaissant de manière spécifique une molécule particulière, par exemple une séquence d'ADN, les différentes molécules, par exemple différentes séquences d'ADN, présentes dans un échantillon donné peuvent être détectées simultanément lors de l'analyse. Since each block composing a MICAM type biochip specifically recognizes a particular molecule, for example a DNA sequence, the different molecules, for example different DNA sequences, present in a given sample can be detected simultaneously during the analysis. .
Pour l'application de la présente invention, il suffit d'appliquer, soit de manière séquentielle, soit en parallèle, à chacun des plots d'une telle biopuce, le potentiel de déclenchement de l'êlectrochimiluminescence du marqueur en présence du relais rédox. Ainsi, par exemple pour de l'ADN, à partir des plots qui présentent une luminescence, il est possible d'identifier les séquences d'ADN présentes dans l'analyte. Le support présente une double fonction active permettant (i) l'immobilisation électrocontrôlée de l'objet biologique sonde, dans cet exemple l'ADN, et (ii) l'activation en tant que déclencheur de l'électrochimiluminescence. For the application of the present invention, it suffices to apply, either sequentially or in parallel, to each of the pads of such a biochip, the triggering potential of the electrochemiluminescence of the marker in the presence of the redox relay. Thus, for example for DNA, from the luminescent spots, it is possible to identify the DNA sequences present in the analyte. The carrier has a dual active function allowing (i) electrocontrolled immobilization of the probe biological object, in this example DNA, and (ii) activation as a trigger for electrochemiluminescence.
La présente invention permet donc pour la The present invention therefore makes it possible
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première fois la mise en oeuvre d'un procédé d'électrochimiluminescence sur un système analyse en parallèle ("multi-array") dans lequel le support d'immobilisation est aussi celui qui permet le déclenchement de la chimiluminescence. first time the implementation of an electrochemiluminescence process on a parallel analysis system ("multi-array") in which the immobilization support is also one that allows the triggering of chemiluminescence.
L'application de la présente invention à un système multiparamétrique permet en outre une lecture multiparamétrique et/ou en parallèle que n'offre pas les dispositifs de positionnement successifs de l'art antérieur. The application of the present invention to a multiparameter system also allows a multiparameter reading and / or parallel that does not offer the successive positioning devices of the prior art.
De plus, le procédé de la présente invention permet d'effectuer des analyses quantitatives directes tout en éliminant les problèmes de bruit de fond inhérents aux mesures par fluorescence. In addition, the method of the present invention allows for direct quantitative analyzes while eliminating the background noise problems inherent in fluorescence measurements.
Enfin, dans la présente invention, l'immobilisation du marqueur est réalisée spécifiquement sur la molécule cible contrairement aux procédés de l'art antérieur faisant intervenir des intercalants électrochimiluminescents dans le cas de biocapteurs à ADN. Finally, in the present invention, the immobilization of the marker is carried out specifically on the target molecule in contrast to the methods of the prior art involving electrochemiluminescent intercalants in the case of DNA biosensors.
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtront encore à l'homme du métier dans les exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif en référence à la figure annexée. Other features and advantages will become apparent to those skilled in the following examples given by way of illustration and not limitation with reference to the attached figure.
Brève description de la figure
La figure 1 est une représentation schématique du mécanisme réactionnel de la présente invention. Brief description of the figure
Figure 1 is a schematic representation of the reaction mechanism of the present invention.
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Exemples Exemple 1 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du complexe Ru(bpy) 32+ en solution sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole. EXAMPLES Example 1 Electrochemiluminescence of the Ru (bpy) 32+ complex in solution on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
Les inventeurs entrepris l'étude de l'électrochimiluminescence à partir du complexe trisbipyridine de ruthénium (Ru (bpy) ) en solution. Cette expérience a été réalisée à partir d'une solution 1 mM en Ru(bpy) 32+ + 50 mM de tripropylamine (TPA) + LiCl04 0,1 M en milieu mixte CH3CH/H20 (50 : 50 en volume) ou CH3CN pur sur une électrode de platine recouverte ou non d'un film de polypyrrole. The inventors undertook the study of electrochemiluminescence from trisbipyridine complex of ruthenium (Ru (bpy)) in solution. This experiment was carried out using a 1 mM solution of Ru (bpy) 32+ + 50 mM tripropylamine (TPA) + 0.1M LiClO4 in mixed medium CH3CH / H2O (50:50 by volume) or pure CH3CN on a platinum electrode covered or not with a polypyrrole film.
Sur l'électrode nue, comme attendu, l'émission lumineuse orange débute à partir d'une tension seuil de 0,8 V dont l'intensité croît jusqu'à 1,0 V pour se stabiliser dans la zone de potentiel exploré jusqu'à 1,2 V. On the bare electrode, as expected, the orange light emission starts from a threshold voltage of 0.8 V whose intensity increases to 1.0 V to stabilize in the potential area explored until at 1.2 V.
Dans les mêmes conditions, mais en utilisant une électrode de platine recouverte d'un film homogène de polypyrrole d'épaisseur 0,08 um (20 mC/cm2), aucune émission lumineuse est détectée jusqu'à un potentiel de 1,2 V. Under the same conditions, but using a platinum electrode covered with a homogeneous polypyrrole film with a thickness of 0.08 μm (20 mC / cm2), no light emission is detected up to a potential of 1.2 V.
Exemple 2 : ÉLECTROCHIMILUMINESCENCE du Pu(bpy) 32+ en solution en présence de N-méthylphénothiazine ou de Nbutylphénothiazine sulfonate de sodium sur une électrode de platine recouvert par un film de polypyrrole. EXAMPLE 2 Electrochemiluminescence of Pu (bpy) 32+ in solution in the presence of N-methylphenothiazine or of sodium N-butylphenothiazine sulphonate on a platinum electrode covered with a polypyrrole film.
Comme pour l'exemple 1, l'électrochimiluminescence est étudiée à partir du As for Example 1, the electrochemiluminescence is studied from the
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complexe Ru(bpy) 32+ en solution et d'une électrode de platine recouverte par un film de polypyrrole (20 mC/cm2). Si à la solution précédente (1 mM en Ru (bpy) 3 + 50 mM de tripropylamine (TPA) + LiCl04 0,1 M dans CH3CN/H20), on ajoute 2 mM de Nméthylphénothiazine, il est alors possible d'observer une émission luminescence orange centrée à 610 nm
21 typique d'électrochimiluminescence du Ru (bpy) sur cette électrode recouverte du film de polypyrrole en appliquant seulement qu'un potentiel de 0,65 V. Cette émission est constante tant que cette valeur de potentiel est imposée. Par contre si le potentiel est porté à 1 V, c'est à dire au potentiel où se produit la suroxydation du polypyrrole, cette émission disparaît presque instantanément et irréversiblement. Ru (bpy) 32+ complex in solution and a platinum electrode covered with a polypyrrole film (20 mC / cm 2). If in the preceding solution (1 mM Ru (bpy) 3 + 50 mM tripropylamine (TPA) + 0.1M LiClO4 in CH3CN / H2O), 2 mM N-methylphenothiazine is added, it is then possible to observe an emission orange luminescence centered at 610 nm
21 typical electrochemiluminescence of Ru (bpy) on this electrode covered with the polypyrrole film by applying only a potential of 0.65 V. This emission is constant as long as this potential value is imposed. On the other hand, if the potential is increased to 1 V, ie to the potential where the overoxidation of the polypyrrole occurs, this emission disappears almost instantaneously and irreversibly.
Ainsi la présence d'un relais rédox conformément à la présente invention, par exemple la Nméthylphénothiazine dans cet exemple, permet d'abaisser le potentiel de déclenchement de l'électrochimiluminescence du complexe Ru(bpy) 32+ dans un domaine de potentiel où la matrice formant le film polymère de polypyrrole n'est pas suroxydée, c'est à dire dans un domaine où elle conserve ses propriétés de conductivité électronique et. Thus, the presence of a redox relay according to the present invention, for example N-methylphenothiazine in this example, makes it possible to lower the triggering potential of the electrochemiluminescence complex Ru (bpy) 32+ in a potential range where the matrix forming the polypyrrole polymer film is not superoxidized, that is to say in a field where it retains its properties of electronic conductivity and.
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