WO2003098182A2 - Verfahren zur quantifizierung von molekülen - Google Patents

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WO2003098182A2
WO2003098182A2 PCT/EP2003/005091 EP0305091W WO03098182A2 WO 2003098182 A2 WO2003098182 A2 WO 2003098182A2 EP 0305091 W EP0305091 W EP 0305091W WO 03098182 A2 WO03098182 A2 WO 03098182A2
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Werner Stegmann
Michael Cahill
André SCHRATTENHOLZ
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Proteosys Ag
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Publication of WO2003098182A3 publication Critical patent/WO2003098182A3/de
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    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the accumulation of stable isotopes in molecules, a method for determining the ratio of the protein frequencies of similar proteins in a first and an at least second sample, a method for determining the rate of incorporation of labeled substances into proteins and a method for Obtaining information about proteins and / or peptides.
  • the samples consist in particular of cells, cell systems, organisms or parts thereof.
  • the mass spectrometric methods used are MALDI-TOF mass spectrometry and ESI mass spectrometry.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ESI electro-spray ionization
  • Mass analyzers are used, which can examine ions according to their mass to charge ratio m / z.
  • Mass spectra of biomolecules show a mass distribution that arises due to the different masses of the naturally occurring isotopes of the elements from which the biomolecules are built. With mass spectrometers that have a sufficiently large mass resolution, the mass distributions of biomolecules can be resolved into individual mass peaks. Such mass peaks and their distributions are referred to below as isotopomers or isotopomer distributions. Since there is no uniform nomenclature in this area, the term isotopomer is also to be understood as isotopolog or comparable expressions below. The term isotopomer distribution can also be equated with the term isotope pattern.
  • leucine (Leu-d10) labeled with stable isotopes is incorporated into bacteria.
  • leucine (Leu-d3) labeled with stable isotopes is incorporated into mammalian cell cultures.
  • Mass spectrometry can be obtained.
  • a further prerequisite for these methods is that the marked protein or peptide fraction is marked as completely as possible in its marking positions, since only then can quantitative results be achieved.
  • an accurate quantification of the labeled and unlabeled cells is not possible without a complete incorporation of Leu-d3 in the proteins.
  • the object of the invention is to provide methods for the qualitative or quantitative analysis of molecules which can be carried out quickly, selectively and inexpensively.
  • the isotopomer distribution of the molecules is determined by mass spectrometry and the enrichment of the stable isotopes is calculated by comparing the determined isotopomer distribution with a reference distribution of the molecules.
  • the reference distribution is the theoretical, in particular naturally occurring
  • Isotopomer distribution of the molecules Any deviation from the naturally occurring isotopomer distribution can be attributed to the enrichment of the molecules with stable isotopes. Enrichment can be done by labeling the molecules with stable Isotopes occur and / or for example by mixing two samples, one sample having a natural or otherwise known isotopomer distribution and the other sample being labeled with one or more stable isotopes. In the case of a mixture of different samples, the ratio of the protein frequencies of similar proteins in the respective samples can be determined, provided that the isotopomer distributions of the molecules with the corresponding stable isotopes in all samples and all compounds are known and homogeneous.
  • the isotopomer distribution for this can be determined, for example, by a method for determining the accumulation of stable isotopes in proteins, peptides and / or their fragments.
  • the amino acids and / or the fragments of the proteins and / or peptides are obtained by, for example, hydrolysis and subsequent chromatography.
  • the isotope composition of the amino acids and / or the fragments and / or atoms is determined, and the isotopomer distributions can be determined from the determined isotope compositions.
  • the ICP (Inductively Coupled Plasma) MS is particularly suitable for determining the isotope compositions.
  • the molecular composition is known or the molecular composition is determined on the basis of the mass fingerprint of the molecules and the theoretical isotopomer distribution of the molecules is calculated using the Molecular composition and / or with the help of e.g. B. determined a database.
  • the reference distribution is determined from non-enriched molecules and / or enriched molecules with known enrichment.
  • the invention comprises a method for determining the different enrichment of stable isotopes in proteins, peptides and / or their fragments from different samples, which is characterized in that the stable isotope enrichment of the pool of one or more individual amino acid constituents in the sample the protein and / or peptide is determined experimentally.
  • amino acids and / or fragments of the proteins and / or peptides are obtained, for example, by hydrolysis and subsequent chromatography or MS / MS or the like, and the isotope composition of the amino acids and / or the fragments is determined.
  • the average enrichment rate of one or more individual amino acid components can be determined from the particular isotope compositions. This
  • Amino acid enrichment allows a mass spectrometric measurement of the labeled sample without calculating the theoretical isotopomer distributions from a comparison sample.
  • the method for determining the accumulation of stable isotopes in proteins in a sample comprises the following steps:
  • Separation means in particular a 2D gel, possibly in several steps, optionally obtaining fragments from the separated proteins by specific cleavage or digestion of the proteins before or after the separation,
  • the invention further comprises a method for determining the accumulation of stable isotopes in proteins, peptides and / or their fragments, in which the amino acids and / or the fragments of the proteins and / or peptides are obtained by hydrolysis and subsequent chromatography, the isotope composition of the amino acids and / or the fragments are determined and the enrichment rate is determined from the determined isotope compositions.
  • the ICP Inductively Coupied Plasma
  • MS is suitable for determining the isotope compositions.
  • a second sample can be labeled with, for example, 15 N and a possible third or further samples with, for example, 13 C or equivalent isotopes, and the samples can then be mixed.
  • a mixture of proteins from all samples can be quantified taking into account the isotopomers of several peptides of a protein, in particular by several measurements of differently combined mixtures of the samples.
  • the methods according to the invention have in common that for an analysis of molecules the isotopomer distribution of the molecules is determined with the aid of high-resolution mass spectrometry, in particular MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the isotopomer distributions come about through the existence of heavy isotopes of the elements from which the molecules are built.
  • mass resolution that can be achieved with TOF in particular MALDI-TOF, mass spectrometry is significantly higher than the mass resolution that can be achieved by other MS techniques (ESI quadrupole or lon-trap MS). Methods with comparable or better mass resolution, such as the FTICR-MS, can also be used.
  • MALDI-TOF mass spectrometry enables the isotopomer distributions of peptides to be determined reproducibly within narrow error limits.
  • the method for determining the ratio of the protein frequencies of similar proteins in a first and an at least second sample comprises the following steps:
  • Protein mixture and the at least second sample with the aid of a separating agent, in particular a 2D gel, optionally in several steps, - optionally obtaining fragments from the separated
  • Proteins by specific cleavage or digestion of the proteins, before or after the separation or directly after the labeling,
  • the frequencies of the similar, ie corresponding, proteins in the first or in the at least second sample are unknown.
  • the ratio of these frequencies is determined by the method according to the invention.
  • the method is analogous to determining the ratio of the frequencies of corresponding peptides in the first or in the at least second sample.
  • the proteins of the same type can be present in isolation or, for example, localized in cells. If the proteins are located in cells, the two samples typically consist of similar cell cultures, so-called cell pools.
  • the relative cellular protein frequencies are determined or quantified by the method according to the invention.
  • the different isotopomer distributions of the starting samples and the sample mixture or the sample mixtures for calculating the protein frequency ratios and the effects of an influencing agent on these ratios are determined.
  • the proteins of at least one sample are labeled with stable isotopes.
  • Labeling in the sense of the invention means the introduction of elements into the proteins to be labeled which do not naturally occur in this composition or which occur in different relative relationships to one another between the at least two samples. Introducing is understood to mean, for example, the incorporation, particularly in the case of biosynthesis within cells, of labeled amino acids into proteins and peptides to be labeled.
  • the labeling of cells can advantageously be carried out “in vivo” by growing the cells on a medium which contains labeled amino acids or other sources for the corresponding elements.
  • the amino acids for example enriched, are absorbed into the cells and incorporated into the cell proteins to be examined.
  • the amino acids can contain, for example, 15 N, 13 C, 1 ⁇ O, M S and / or 2 H 2 . Labeling "in vitro" is also possible, for example by protein alkylation.
  • a protein mixture of known amounts of protein from the first and the at least second sample manufactured In a second step, a protein mixture of known amounts of protein from the first and the at least second sample manufactured.
  • An amount of protein includes all of the proteins present in the sample and is determined by conventional methods.
  • the proteins of the first sample, the protein mixture and the at least second sample are separated using a separating agent, in particular a 2D gel.
  • a separating agent in particular a 2D gel.
  • the separation of the first sample and the second sample is only necessary if the accumulation of stable isotopes in these samples is otherwise unknown. This results in a separation of the proteins present in the sample on the basis of specific protein properties.
  • individual proteins found by the separation are analyzed. The frequencies of corresponding, corresponding proteins of the first and the at least second sample are related to one another.
  • the separated proteins are broken down into fragments or peptides by digestion, it being possible for the fragmentation to have been carried out beforehand.
  • the isotopomer distribution of the fragments is subsequently determined by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • Isotopomer distributions of the fragments can be determined in high resolution, reproducibly within narrow error limits. This is a basic requirement of the procedure.
  • the ratios of the protein frequencies between the first and the at least second sample are calculated from the determined isotopomer distributions.
  • the calculation can be carried out using the isotopomer distributions of a corresponding fragment from the first and the at least second sample.
  • the calculation can also be carried out using the isotopomer distributions of the otherwise known or estimated Stable isotope enrichments of each individual sample take place.
  • Several isotopomer distributions of different fragments or peptides of a protein can also be used for the calculation.
  • isotopomer distributions can be used directly to calculate the ratios of protein frequencies. This makes use of the fact that the natural isotopomer distribution of a molecule is specifically shifted when the molecule is artificially enriched with isotopes that do not occur in this frequency in nature.
  • the monoisotopic peaks of the protein or peptide molecules are the peaks with the lowest m / z values in an isotopomer distribution.
  • RIA values Relative Isotopologue Abundance values
  • RIA values Relative Isotopologue Abundance values
  • an RIA value of an isotopologist Mi of a specific protein or peptide fragment p results from:
  • the ion signals are determined from integrals via the corresponding peaks.
  • the mole fraction C is determined according to [Vogt 1993]:
  • n peaks of the isotopomer distribution can be used to determine the mole fraction C p or the molar ratio. So you get an n-fold redundancy, which can be used to increase the accuracy.
  • isotopomer distributions which can be determined with high resolution and reproducibly, for example with the help of MALDI-TOF mass spectrometry, to calculate ratios of protein frequencies, for example with the aid of the method described in [Vogt 1993] enables the determination of ratios of protein frequencies (e.g. B. quantification) or mixing ratios with low isotope enrichments, for example, about 20%.
  • All previously published methods rely on achieving very high isotope accumulations (> 90%) in one labeling step in order to generate separate, overlay-free and defined isotopomer distributions for labeled and unlabeled fragments or peptides and as complete a labeling of all designated labeling sites as possible [Gygi et al. , 1999 and other groups].
  • the process described here is many times faster and cheaper than comparable conventional processes in which isotope enrichments above 90% are required. It is therefore a new process that offers considerable advantages over the previously published processes.
  • the method according to the invention has the advantage that it does not require knowledge of how the label gets into the peptide and / or protein and whether it is one or more identical or different labels. In addition, it does not matter to what extent the label is enriched in the proteins or peptides. The only decisive factor is that the peptide fragment measurements measured by mass spectrometry
  • At least one sample is influenced, in particular stimulated, with at least one influencing agent before the production of the protein mixture.
  • the sample advantageously represents a biological sample, for example a cell culture or a cell system.
  • the sample can also be an organism or a part thereof or can be derived from it.
  • the ratios of the protein frequencies are a measure of the effect of the influencing or stimulation on the protein frequencies. In this way, for example, the effectiveness of an influencing agent on cell growth can be examined. The same can be done with inhibition.
  • the invention further comprises a method for determining the rate of incorporation of substances labeled with stable isotopes, in particular amino acids, into proteins which are formed by cells, with the following steps:
  • a separating agent in particular a 2D gel, possibly in several steps, optionally obtaining fragments of the separated proteins of the respective protein harvests by specific cleavage or digestion, in particular tryptic digestion, of the proteins before the after the separation, determining the isotopomer distribution of the fragments of the respective protein harvests by MALDI-TOF mass spectrometry and
  • the degree of enrichment can be determined from a measurement if deviations from the naturally occurring or otherwise expected isotopomer distribution are observed. Different levels of enrichment in different proteins indicate different incorporation rates.
  • the incorporation rate of substances for example amino acids, which are labeled with stable isotopes, into proteins or peptides is calculated.
  • the incorporation rate is understood to mean the change in the amount of substance incorporated in a protein per unit of time.
  • the substances can be labeled amino acids, for example.
  • the labeled amino acids can be introduced into a cell sample or a cell pool, the cells of the sample from the time of introduction of the substance, ie. H. of the labeled amino acids, begin to incorporate the substance into the cell's own proteins or peptides.
  • the labeled substances are mixed with the proteins. From this point in time, the substance can be incorporated into the proteins at a specific rate.
  • at least one protein harvest is obtained by removing the proteins at at least one specific point in time. As time progresses, substances are increasingly incorporated into the proteins according to the rate of incorporation. If protein harvests or protein samples are taken at defined times, it is possible to determine the incorporation rate on the basis of these protein harvests. If the sample to be examined is a labeled cell sample, cells are removed from the sample, washed and lysed.
  • the proteins of the respective protein crops are separated using a separating agent, in particular a 2D gel. This results in a separation of the proteins present in the sample on the basis of specific protein properties. Subsequently, individual proteins found by the separation are analyzed. The concentrations of the substances in the corresponding, corresponding proteins of the successive protein harvests are related to one another.
  • a separating agent in particular a 2D gel.
  • fragments of the separated proteins of the respective protein crops are obtained by specific cleavage or digestion, in particular by tryptic digestion, of the proteins.
  • the isotopomer distribution of the fragments of the respective protein crops is then determined by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • the isotopomer distributions of the fragments can be determined in high resolution, reproducible within narrow error limits. This is a basic prerequisite of the method, since the enrichment of the protein in two successive points in time, depending on the installation rate and the time difference between the different points in time, can differ only slightly.
  • the rate of incorporation of the substance is calculated from the isotopomer distributions of the respective protein crops. If the peptide sequence is known and with it the amino acids present, the incorporation rate for specific amino acids can be calculated.
  • Isotopomer distributions can, for example, be used directly to calculate the rate of incorporation of the substance from the determined isotopomer distributions of the respective protein crops.
  • the method for determining the incorporation rates of labeled substances in proteins is used to determine the effect of an influence, in particular stimulation, on the incorporation rates of similar proteins in a first and an at least second labeled sample. At least one of the samples is influenced with an influencing agent. The installation rates of the substance are determined for the respective sample and the effect of the influence is determined by forming the ratio of the respective installation rates.
  • the proteins are labeled by amino acids which have been enriched with stable isotopes.
  • a cell culture is grown on a medium which contains amino acids enriched with isotopes. This can be the same or different amino acids with the same or different isotope labels.
  • the isotopes are 15 N, 14 C,
  • the isotope enrichments are less than 95%, preferably less than 90%, in particular less than 80%, preferably less than 40% and particularly preferably less than 30%.
  • Known methods are dependent on high isotope enrichments of, for example, greater than 90%, since, for example, a superposition of the isotopomer distributions of the naturally occurring molecules with the isotopomer distributions of the enriched molecules makes analysis difficult or impossible.
  • the combination of MALDI-TOF mass spectrometry in connection with, for example, the method described in [Vogt 1993] makes it possible for the first time to evaluate such low isotope accumulations. This fact is also an important advantage when determining installation rates, since only slight differences in the isotope accumulations can occur between two different measurement times.
  • the invention further comprises a method for obtaining information about amino acid sequences of peptides, in which the information about the amino acid sequences is determined by means of high-resolution mass spectrometry
  • the isotopomer distribution of a peptide or protein is used to obtain information about amino acid sequences of the peptide in addition to other specific parameters, for example the peptide mass. This information can be used as additional information in the qualification of the peptide to be examined. For example, in a peptide in the peptide mass fingerprint method next to the m / z value the isotopomer distribution can be used as an additional independent search parameter.
  • the information about the amino acid sequences relates to the amino acid sequence composition of the peptides.
  • Stabilisotope enriched peptides must contain stabilized isotope enriched amino acids. If the distribution of the stable isotopes over all amino acids is known, the isotopomer distribution of the peptides of a protein also contains amino acid sequence information, because the stable isotope incorporation is sequence-specific. This applies not only to artificially enriched stable isotopes, but also to naturally occurring stable isotopes, especially in the presence of sulfur-containing amino acids.
  • the presence of the sulfur-containing amino acids cysteine and methionine in a peptide leads to a specific isotopomer distribution of such peptides due to the characteristic isotope distribution of the element sulfur.
  • the element sulfur has the 4 stable isotopes 32 S (frequency 95%), 33 S (0.75%), ⁇ S (4.2%) and 36 S (0.015%).
  • the high proportion of the heavy isotope 34 S of 4.2% shifts the focus of the isotopomer distributions of cys- or met-containing peptides towards heavier masses. If ⁇ S is artificially enriched, this effect becomes greater.
  • the detection of the shift in the center of gravity of the isotopomer distribution towards heavier masses is a feature of the presence of stable isotope-containing, in particular sulfur-containing, amino acids, according to a further preferred embodiment of the invention.
  • the invention comprises a method for improving the ionization ability of peptides and / or proteins after an enzymatic and / or chemical digestion. After digestion, various amino acids are formed both at the C- and N-terminal ends, which vary greatly in their ionization capacity due to their different pK values.
  • the lysine peptides are severely disadvantaged compared to the arginine peptides.
  • a first modification substance By modifying the, preferably N- and C-terminal, amino acids, especially in the region of the side chains, with a first modification substance, the ionization efficiency of, in particular lysine-containing, peptides is increased and the strength of the signals of the mass spectrometric analysis is greatly increased.
  • O-methylisourea or nicotinyl-N-hydroxysuccinimide [James 2000] are used for both C- and N-terminal modifications.
  • the molecules to be examined are first cleaned before the mass spectrometric examination and separated, for example with the aid of a polyacrylamide gel.
  • a high stoichiometric efficiency is obtained for the modification of amino acids by immobilizing the proteins or peptides, in particular in a polyacrylamide gel matrix or on a reversed phase material.
  • the invention further comprises a method for identifying molecules which contain at least one phospho group or carbohydrates linked via an oxygen atom, in particular peptides and / or proteins, such as, for example, phosphoserines or phosphothreonines.
  • the process removes sulfur-containing groups, preferably by Michael addition of sulfur-containing nucleophiles or by beta-elimination of at least one Phospho group, in particular by nucleophilic sulfur-containing reagents, which displace at least one phospho group, introduced.
  • Subsequent detection of the shift in the center of gravity of the isotopomer distribution to heavy masses, due to the displacement of the phospho group by the sulfur-containing nucleophile is indirect evidence of the presence of a phosphoprotein or peptide.
  • the introduced sulfur-containing group in particular a sulfhydryl group
  • a more easily ionizable group in the form of a suitable reagent, preferably an alkylating agent, in particular 3- (acrylamidopropyl) trimethylammonium chloride [Brune 1992] or 1, 1, 3 , 3-tetramethylguanidine, thereby replacing and simplifying the identification of phospho group-containing peptides and proteins, in particular by increasing the strength of the signals in mass spectrometric detection and improving the statistics for higher isotopomers.
  • the negative charge for example of a phosphate group
  • a basic group for example, a phosphate group
  • Michael addition takes place before, for example, tryptic digestion
  • new t ⁇ / ptic cleavage sites can be introduced.
  • these peptide pairs have an isotopomeric sulfur-specific signature, which according to the invention can be attributed to the reagent introduced during the Michael addition.
  • the invention relates to the analysis of samples from proteins or mixtures of proteins or fragmented proteins, in which the isotopomer distributions can be measured with a sufficiently large mass resolution.
  • the different isotope patterns of the ions from different samples are determined empirically, which makes it possible to (a) determine the differences between two samples by measuring the relative isotopomer abundances of each sample and (b) the mole fraction of each sample, i.e. its Quantify relationship to each other by using the mixture of two samples for mass spectrometric measurement.
  • Proteins or peptides which can be investigated according to the invention consist of molecules with two or more amino acids which are linked by one or more peptide bonds with the aid of a ribosome.
  • synthetic or artificially synthesized polypeptides or proteins can also be produced as long as they are also synthesized by ribosomes.
  • translation systems based on cell extracts and thus producing proteins can also be used.
  • the invention further comprises a method in which at least two differently labeled samples are analyzed.
  • the samples preferably originate from complex biological systems, such as, for example, from cultivated cells, organisms, tissues Organisms, cellular fractions or chromatographic fractions from biological systems. These samples generally do not consist of individual proteins, the chemical composition of which would be known.
  • An important aspect of the invention is to increase the sensitivity of existing methods in order to enable the analysis of different proteins in proteome applications. For example, the response of a system, in particular a complex biological system, to experimental treatments can be examined.
  • the required sensitivity of the method according to the invention results u. a. from the examples in combination with the figures.
  • the samples generally contain various proteins and / or protein isoforms.
  • These protein isoforms are chemically different types of protein that are synthesized by one or more mRNA molecules, the mRNA molecules being transcribed by the same or at least by highly homologous genes.
  • protein isoforms include proteins that are synthesized by differently spliced mRNAs or proteins that are modified differently post-translationally.
  • the proteins or protein isoforms used according to the invention are synthesized on ribosomes and are not synthetically produced by non-biological, chemical methods.
  • the invention covers methods in which individual protein abundances of non-synthetically produced polypeptides or proteins are determined in at least one sample.
  • the method according to the invention does not need to know the amino acid sequence of the peptides or proteins to be analyzed. Rather, the method according to the invention is suitable for analyzing and in particular quantifying previously completely unknown peptides, for example containing cysteine.
  • An aim of the invention is to detect those proteins or peptides in the samples which have different stable isotope contents and / or to differentiate these proteins in different samples with regard to their relative abundance or frequency, in order to thus quantify the differences in to enable the frequencies.
  • the method according to the invention makes it possible to provide information about relative changes in the frequencies of a single protein or a group of proteins between different samples and the changes in the proportional stable isotope content of these proteins, as results, for example, from different experimental treatment of the biological systems that the source can provide for the samples that are analyzed according to the invention.
  • the different samples can initially be identical.
  • the origin of the samples can be experimentally equivalent categories of the sample, such as different animals or groups of animals or different cultures of cultured cells derived from a mother culture or groups of a mother culture.
  • the different samples in particular the different cell cultures or animals or groups of animals, are treated differently during the course of the experiment.
  • the experimental conditions should be chosen accordingly.
  • the relative stable isotope contents can be determined and thus the relative quantitative relationships between different multiple pairs or groups of polypeptide ions or protein ions of the same chemical structure or the same monoisotopic mass can be determined from the different samples.
  • Said ions differ only in their stable isotope content within the different samples.
  • One or more daughter ions, such as tryptic peptide ions, from the same protein in each sample can be used to calculate the differences in stable isotope content and / or in the protein frequency ratio between the samples.
  • the proteins and / or peptides in the samples can be subjected to different labels with stable isotopes by metabolically labeling the living systems, in particular cells, before, during or after the treatment.
  • the labeling reagents do not have to be homogeneous.
  • the samples can additionally or alternatively be labeled with different stable isotopes, for example by adding alkylation reagents with different stable isotope contents to the proteins or peptides of each sample. These alkylation reagents need not have homogeneous stable isotope compounds.
  • Various stable isotopic elements can be combined in a sample for labeling, for example 2 H, 13 C and / or 15 N. These different isotopic elements can be incorporated into the different chemical compounds of the proteins and / or peptides.
  • the actual or alleged amino acid sequence of the analyzed ions can be identified, for example, by peptide mass fingerprinting or by measuring the masses of the fragments of the analyzed ions. Furthermore can the distribution of the stable isotopes over certain amino acids can also be determined by computer simulation.
  • the ions are fragmented during mass spectrometry in order to generate daughter ions which differ in their masses from one another due to components which are linked to the ion via peptide bonds, such as amino acids, post-translationally modified amino acids or other chemically modified amino acids.
  • a fragmentation is carried out for this, which is based on a collision in MS / MS analyzes or is based on a "post source decay fragmentation" after MALDI ionization.
  • An analysis of the isotopomer distributions of the daughter ions enables a determination of the stable ones Isotope levels of each amino acid in the polypeptide ions from each individual sample.
  • one or more changes in the stable isotope content of the proteins or peptides can be used in combination with information from other sources to interpret the response of the biological system to the experimental conditions.
  • the possibly observed higher frequency of stable isotopes in one or more proteins known to be involved in a stress response may indicate an opposite effect or a toxic response to a particular experimental treatment for certain cells in the system.
  • a change in the content of the stable isotopes in one or more proteins which presumably play a role in redox regulation, can indicate an oxidative stress or hydroxyl reaction of the system to the treatment.
  • this aspect of the invention also relates to the method according to the invention with regard to qualitative statements.
  • the results regarding the abundance of one or more proteins in combination with information from other sources are evaluated in order to interpret the response of the biological system to the experimental conditions.
  • the method according to the invention is particularly suitable for examining two or more proteins or peptides in one or more samples.
  • two or more proteins or peptides in one or more samples.
  • even more than 10 or even more than 100 different proteins can be analyzed in one or more samples according to the invention.
  • the method according to the invention is carried out in an automated manner, for example using robots or the like.
  • This automated procedure can be used, for example, for the preparation of the samples, the separation of the samples, the fragmentation of the samples and / or for carrying out the mass spectrometric analysis, which advantageously increases the sample throughput and thus of course generally reduces the costs.
  • Fig. 1 Measured with MALDI-TOF mass spectrometry
  • Fig. 2 Isotopomer distribution of a peptide with a mass of approx. 1,570 DA measured with MALDI-TOF mass spectrometry
  • Fig. 3 Isotopomer distribution of a peptide with a mass of approx. 2,200 DA measured with MALDI-TOF mass spectrometry
  • the figures show peptides from different mass ranges of the mass spectra belonging to the same protein from a cell pool A, a cell pool B and from a mixture AB.
  • a) is a published method: Oda et al., 1999; Pasa-Tolic et al., 1999; Smith et al., 2001.
  • trypsin is used to digest the separated proteins. Trypsin not only digests the proteins but also itself, i.e. H. specific trypsin fragments arise with each digestion. These trypsin fragments have defined masses (e.g. 842.5, 2.211, 2.283, 1.045) and are used in MALDI-TOF spectra of tryptically digested proteins to calibrate the mass scale. They are therefore particularly suitable for determining the reproducibility of isotopomer distributions using MALDI-TOF.
  • Isotopomer distributions of peptides from MALDI-TOF mass spectra contain information about the protein sequence of the peptides.
  • the isotopomer distributions which are caused by the presence of the sulfur-containing amino acids cysteine and methionine, were investigated.
  • the element sulfur has the 4 stable isotopes 32 S (frequency 95%), 33 S (0.75%), M S (4.2%) and 36 S (0.015%).
  • the high proportion of the heavy isotope 34 S of 4.2% shifts the focus of the isotopomer distributions of C- or M-containing peptides towards heavier masses.
  • Cell pool A labeled cells
  • Cell pool B unlabeled cells a) The cells from cell pool A are grown in a medium which
  • the 15 N-enriched amino acids are taken up by the cells and into the
  • Cell pool B The separation of the proteins from cell pool A, cell pool B and mixture
  • AB is done using 2D gel electrophoresis.
  • d2) In-gel tryptic digestion of the separated proteins.
  • e1) Measurement of the 15 N (or 13 C) accumulations of the proteins
  • Protein fragments from cell pool A, cell pool B and mixture AB are used to calculate the protein mixture ratios PM.
  • Mixing ratios PM> 1 and PM ⁇ 1 are a measure of the effect of the stimulation on the protein frequencies.
  • Cell pool A labeled cells
  • Cell pool B unlabeled cells
  • Cell pool C unlabeled cells
  • the cells from cell pool A are grown in a medium which contains 15 N (or 13 C) -enriched amino acids. The 15 N-enriched amino acids are taken up by the cells and incorporated into the cell proteins. A larger amount of cell pool A is grown to perform multiple stimulation experiments. This amount can also be used as a reference in further experiments and / or to produce a test set.
  • mixture AB mixture of equal amounts of protein from cell pool A and cell pool B.
  • mixture AC mixture of equal amounts of protein from cell pool A and cell pool C.
  • d1) separation of the proteins from cell pool A, Cell pool B, cell pool C, mixture AB and mixture AC are carried out by means of 2D gel electrophoresis.
  • the protein mixture ratios PM are calculated from the isotopomer distributions of corresponding tryptic protein fragments from cell pool A, cell pool B, cell pool C, mixture AB and mixture AC.
  • Mixing ratios P M > 1 and P M ⁇ 1 are a measure of the effect of stimulation on protein frequencies.
  • Cell pool A labeled cells
  • Cell pool B labeled stimulated cells a) The cells from cell pool A are placed at a time to in a medium which contains 15 N (or 13 C) -enriched amino acids. The 15 N-enriched amino acids are absorbed by the cells from time to and incorporated into the cell proteins. b) The cells from cell pool B are placed at a time to in a medium which contains the stimulating substance and 15 N (or 13 C) -enriched amino acids. The 15 N-enriched amino acids are absorbed by the cells from time to and incorporated into the cell proteins. c) Cell harvesting: A t0 , An, At2, A t3 , ... and B t0 , B t ⁇ , Bß, B t3 , ...
  • step a the proteins from cell pool A were enriched to about 25% in 15 N (based on the natural 15 N isotope frequency 0.37%).
  • Cell pool B consisted of stem cells with a natural isotope composition.
  • steps b) - d the MALDI spectra of the tryptically digested proteins from cell pool A, cell pool B and mixture AB were measured in e1) and e2).
  • Figs. 5 and 6 The pictures show peptides from different mass ranges of the mass spectra belonging to the same protein from cell pool A, cell pool B and from the mixture AB.
  • a mixture ratio of 1.1: 1 with a standard deviation of ⁇ 6% for the mixture proportions of cell pool A and cell pool B in the mixture AB was calculated from the MALDI spectra from FIGS. 5 and 6 using f). Within the error limits, this confirms what has been experimentally set due to pipetting
  • the method according to the invention allows the detection of very small amounts of stable isotopes in proteins, which enables the following experiment.
  • mice are fed stable isotope-labeled amino acids.
  • the diet can contain one or more amino acids of the 20 occurring amino acids.
  • the labeled amino acid can advantageously be 99% enriched with the stable labeled amino acid.
  • D10 leucine is used, which is only minimally metabolized into other products and induces a mass shift of 10 per leucine.
  • the amino acid pool that is available for protein synthesis in the mouse is fed by the material taken in with the feed and the breakdown of existing proteins into amino acids. Since the biomass of the proteins in the mouse is large, incorporation of more than 90% into new proteins is difficult to achieve.
  • the newly synthesized proteins are chemically indistinguishable from existing proteins that do not contain labeled stable isotopes. Therefore, the stable isotopes are diluted in the amino acid pool stage and in the mixture stage with the existing proteins.
  • the mouse After starting the diet with the stable isotopes, the mouse is stimulated. For this, the mouse is subjected to a tutorial.
  • the learning process is associated with the synthesis of new proteins in certain regions of the world Brain, especially the hypocampus. Therefore, a tutorial is to be equated with the influencing agent as described in the general part above.
  • the hypocampus is extracted and the various proteins are separated using a 2D PAGE.
  • the proteins are then fragmented.
  • the analysis is done for proteins that contain more stable isotopes in the mice of the tutorial than in the mice without a tutorial. Detection of increased stable isotopes in a particular protein indicates translational up-regulation of the protein in response to the stimulus, that is, to learning.
  • Gygi S.P. Rist B., Gerber S.A., Turecek F., Gelb M.H., Aebersold R .; Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotech., 77, 994-999, 1999.
  • Proboscis DH and Edmondson RD High-resolution mass spectrometry and accurate mass measurements with emphasis on the characterization of peptides and proteins by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Mass Spectrometry, 32, 263-276, 1997.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine in einer ersten und einer mindestens zweiten Probe ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Molekülen und ein Verfahren zur Bestimmung der Einbaurate von markierten Substanzen in Proteine.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Quantifizierung von Molekülen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Molekülen, ein Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine in einer ersten und einer mindestens zweiten Probe, ein Verfahren zur Bestimmung der Einbaurate von markierten Substanzen in Proteine und ein Verfahren zur Gewinnung von Informationen über Proteine und/oder Peptide. Die Proben bestehen insbesondere aus Zellen, Zellsystemen, Organismen oder Teilen davon.
In der Proteinanalytik hat die Verwendung von Massenspektrometern im vergangenen Jahrzehnt einen großen Aufschwung erlebt. Dies hängt mit der Entwicklung spezieller massenspektrometrischer Methoden zusammen, mit denen die Massen großer Biomoleküle, beispielsweise Proteine oder Peptide, mit hoher Präzision bestimmt werden können. Aufgrund solcher Massenbestimmungen und Informationen aus Gen- und Proteindatenbanken können Proteine heute im Hochdurchsatz identifiziert werden.
Die angewandten massenspektrometrischen Methoden sind MALDI- TOF-Massenspektrometrie und ESI-Massenspektrometrie. Dabei sind MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation) und ESI (Electro- Spray-Ionisation) lonisierungsmethoden, mit denen Biomoleküle "schonend", d. h. zerstörungsfrei, ionisiert werden können. Zum Massennachweis der ionisierten Biomoleküle werden
Massenanalysatoren benutzt, die Ionen entsprechend ihres Masse zu Ladung Verhältnisses m/z untersuchen können. Als Massenanalysatoren sind Flugzeit (TOF = Time Of Flight) MS, Quadrupol MS, lonenfallen MS und FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonanz) MS (MS = Massenspektrometrie) im Gebrauch.
Massenspektren von Biomolekülen zeigen eine Massenverteilung, die aufgrund der unterschiedlichen Massen der natürlich vorkommenden Isotope der Elemente entstehen, aus denen die Biomoleküle aufgebaut sind. Mit Massenspektrometern, die eine genügend große Massenauflösung besitzen, können die Massenverteilungen von Biomolekülen in einzelne Massenpeaks aufgelöst werden. Solche Massenpeaks bzw. ihre Verteilungen werden im folgenden als Isotopomere bzw. Isotopomerenverteilungen bezeichnet. Da in diesem Bereich keine einheitliche Nomenklatur besteht, ist im folgenden unter Isotopomer auch Isotopolog oder vergleichbare Ausdrücke zu verstehen. Der Begriff Isotopomerenverteilung ist auch mit dem Begriff Isotopenmuster gleichzusetzen.
Beispiele für die Verwendung von Massenspektrometrie in der Proteinanalytik, hier in Verbindung mit der Markierung von Analysaten mit stabilen Isotopen, sind die in [Chen 2000], [Veenstra 2000], [Ong 2002] und [Pratt 2002] beschriebenen Verfahren, welche die Bestimmbarkeit von Proteinen bzw. Peptiden durch Massen-Fingerprints verbessern bzw. erleichtern.
Bei dem in [Chen 2000] beschriebenen Verfahren wird zweifach deuteriertes Glycin oder dreifach deuteriertes Methionin zu qualitativen Zwecken in Proteine von Bakterien eingebaut, um dadurch die Bestimmbarkeit von Proteinen bzw. Peptiden durch Massen-Fingerprints zu verbessern. Aufgrund der geringen Massendifferenzen zwischen markierten und nicht markierten Aminosäuren und den daraus resultierenden Überlappungen ihrer Isotopomerenverteilungen ist dieses Verfahren nur für Peptide mit einer Masse von kleiner als 2000 Da anwendbar.
Bei den in [Veenstra 2000] und [Pratt 2002] beschriebenen Verfahren wird mit stabilen Isotopen markiertes Leucin (Leu-d10) in Bakterien eingebaut. In einer ähnlichen Vorgehensweise, bei dem in [Ong 2002] beschriebenen Verfahren, wird mit stabilen Isotopen markiertes Leucin (Leu-d3) in Säugetierzellkulturen eingebaut. Diese Studien sind so angelegt, daß möglichst große Massendifferenzen zwischen markierten und nicht markierten Proteinen bzw. Peptiden erzeugt werden, um getrennte, nicht überlappende Isotopomerenverteilungen, die mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie bzw. ESI-Q-TOF-
Massenspektrometrie ermittelt werden, zu erhalten. Neben der Voraussetzung weitestgehender Überlappungsfreiheit der Isotopomerenverteilungen markierter bzw. nicht markierter Moleküle ist eine weitere Voraussetzung bei diesen Verfahren, daß die markierte Protein- bzw. Peptidfraktion möglichst vollständig in ihren Markierungspositionen markiert ist, da nur dann quantitative Ergebnisse erzielt werden können. Insbesondere ist hiernach ohne eine komplette Inkorporation von Leu-d3 in den Proteinen eine genaue Quantifizierung der markierten und unmarkierten Zellen nicht möglich.
Die oben erwähnten Verfahren sind daher nur zur Untersuchung von Organismen oder Zellen geeignet, in denen Aminosäuren mit normaler Isotopenzusammensetzung nahezu vollständig durch entsprechende, mit stabilen Isotopen markierte Aminosäuren ausgetauscht werden können. Dabei ist man im wesentlichen auf Zellen bzw. einzellige Organismen beschränkt, die in mit stabilen Isotopen markierten Kulturmedien gezüchtet werden können. Nicht verwendbar sind diese konventionellen Methoden für die "in vivo" Markierung ganzer Lebewesen, z. B. von Mäusen, da die erforderlichen hohen Markierungsgrade dort nicht erreicht werden können. Wünschenswert sind daher neue Verfahren zur Gewinnung weiterer molekülspezifischer Parameter, die eine weitere qualitative und/oder quantitative Analyse von Molekülen, insbesondere Proteinen und/oder Peptiden, ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur qualitativen bzw. quantitativen Analyse von Molekülen bereitzustellen, die schnell, selektiv und kostengünstig durchgeführt werden können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen genannt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch die Auswertung der Isotopomerenverteilung von Molekülen diesbezügliche Aussagen getroffen werden können.
Erfindungsgemäß wird bei einem Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Molekülen, insbesondere in Proteinen und/oder Peptiden, die Isotopomerenverteilung der Moleküle durch Massenspektrometrie ermittelt und die Anreicherung der stabilen Isotope durch Vergleich der ermittelten Isotopomerenverteilung mit einer Referenzverteilung der Moleküle berechnet.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist die Referenzverteilung die theoretische, insbesondere natürlich vorkommende,
Isotopomerenverteilung der Moleküle. Jede Abweichung von der natürlich vorkommenden Isotopomerenverteilung kann auf die Anreicherung der Moleküle mit stabilen Isotopen zurückgeführt werden. Die Anreicherung kann durch Markierung der Moleküle mit stabilen Isotopen erfolgen und/oder beispielsweise durch Mischung von zwei Proben, wobei eine Probe eine natürliche oder sonst bekannte Isotopomerenverteilung aufweist und die andere Probe mit einem oder mehreren stabilen Isotopen markiert ist. Im Fall einer Mischung verschiedener Proben kann das Verhältnis der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine in den jeweiligen Proben bestimmt werden, vorrausgesetzt, daß die Isotopomerenverteilungen der Moleküle mit den entsprechenden stabilen Isotopen in allen Proben und alle Verbindungen bekannt und homogen sind.
Die Isotopomerenverteilung hierzu kann beispielsweise durch ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Proteinen, Peptiden und/oder deren Fragmenten ermittelt werden. Hierbei werden die Aminosäuren und/oder die Fragmente der Proteine und/oder Peptide durch beispielsweise Hydrolyse und anschließende Chromatographie gewonnen. Die Isotopenzusammensetzung der Aminosäuren und/oder der Fragmente und/oder Atome wird bestimmt, und aus den bestimmten Isotopenzusammensetzungen können die Isotopomerenverteilungen ermittelt werden. Für die Bestimmung der Isotopenzusammensetzungen ist insbesondere die ICP-(inductively coupled plasma)-MS geeignet.
Bei Verwendung dieses Verfahrens muß vorteilhafterweise nur eine Massenspektrometrie einer Mischung von beispielsweise zwei unterschiedlichen Proben durchgeführt werden, um das Verhältnis der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine dieser Proben bestimmen zu können.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist die Molekülzusammensetzung bekannt bzw. wird die Molekülzusammensetzung auf Basis des Massen- Fingerprints der Moleküle ermittelt und die theoretische Isotopomerenverteilung der Moleküle rechnerisch anhand der Molekülzusammensetzung und/oder mit Hilfe z. B. einer Datenbank bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Referenzverteilung aus nicht angereicherten Molekülen und/oder angereicherten Molekülen mit bekannter Anreicherung bestimmt.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der unterschiedlichen Anreicherung von stabilen Isotopen in Proteinen, Peptiden und/oder deren Fragmenten von verschiedenen Proben, welches sich dadurch auszeichnet, daß die stabile Isotopenanreicherung des Pools von einem oder mehreren individuellen Aminosäuren- Bestandteilen in der Probe mit dem Protein und/oder Peptid experimentell bestimmt wird. Hierbei werden Aminosäuren und/oder Fragmente der Proteine und/oder Peptide beispielsweise durch Hydrolyse und anschließende Chromatographie oder MS/MS oder ähnliches gewonnen und die Isotopenzusammensetzung der Aminosäuren und/oder der Fragmente bestimmt. Aus den bestimmten Isotopenzusammensetzungen kann die durchschnittliche Anreicherungsrate von einem oder mehreren individuellen Aminosäurebestandteilen bestimmt werden. Diese
Aminosäurenanreicherung erlaubt eine massenspektrometrische Messung der markierten Probe ohne die theoretischen Isotopomer- Verteilungen von einer Vergleichsprobe zu errechnen.
Erfindungsgemäß umfaßt das Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Proteinen in einer Probe folgende Schritte:
Markieren der Proteine der Probe mit stabilen Isotopen, - Separation der Proteine der Probe mit Hilfe eines
Separationsmittels, insbesondere eines 2D-Gels, gegebenenfalls in mehreren Schritten, gegebenenfalls Gewinnung von Fragmenten aus den separierten Proteinen durch spezifisches Spalten oder Verdau der Proteine vor oder nach der Separation,
Ermitteln der Isotopomerenverteilung der Fragmente durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie und
Berechnung der Anreicherung von stabilen Isotopen aus der ermittelten Isotopomerenverteilung im Vergleich mit einer zu erwartenden Isotopomerenverteilung eines Referenzwertes, z. B. die natürlich vorkommende oder eine bekannte Isotopomerenverteilung.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Proteinen, Peptiden und/oder deren Fragmenten, bei dem die Aminosäuren und/oder die Fragmente der Proteine und/oder Peptide durch Hydrolyse und anschließende Chromatographie gewonnen, die Isotopenzusammensetzung der Aminosäuren und/oder der Fragmente bestimmt und aus den bestimmten Isotopenzusammensetzungen die Anreicherungsrate bestimmt wird. Für die Bestimmung der Isotopenzusammensetzungen ist beispielsweise die ICP-(lnductively coupied Plasma)-MS geeignet.
Werden mehr als zwei Proben untersucht, kann beispielsweise eine Probe unmarkiert bleiben, eine zweite Probe mit beispielsweise 15N und eine eventuelle dritte oder weitere Proben mit beispielsweise 13C oder gleichwertigen Isotopen markiert und die Proben anschließend gemischt werden. Wenn die Isotopenverteilung der Aminosäuren für alle Proben bekannt ist, kann eine Mischung von Proteinen aus allen Proben unter Berücksichtigung der Isotopomeren mehrerer Peptide eines Proteins, insbesondere durch mehrere Messungen unterschiedlich kombinierter Mischungen der Proben, quantifiziert werden. Den erfindungsgemäßen Verfahren ist gemeinsam, daß zu einer Analyse von Molekülen die Isotopomerenverteilung der Moleküle mit Hilfe einer hochauflösenden Massenspektrometrie, insbesondere der MALDI-TOF-Massenspektrometrie, ermittelt wird. Ausgehend von den derart ermittelten Isotopomerenverteilung ist es möglich, verschiedene qualitative und/oder quantitative Aussagen über die Moleküle zu treffen. Die Isotopomerenverteilungen kommen durch die Existenz von schweren Isotopen der Elemente zustande, aus denen die Moleküle aufgebaut sind. Den größten Einfluß bei Isotopomerenverteilungen von Peptiden haben hierbei die relativ häufigen schweren Isotope der Elemente Kohlenstoff (13C = 1 ,1 %) und Stickstoff (15N = 0,37 %).
Die mit der TOF-, insbesondere MALDI-TOF-, Massenspektrometrie erzielbare Massenauflösung liegt deutlich über der durch andere MS- Techniken (ESI-Quadrupol- bzw. lon-Trap-MS) erzielbaren Massenauflösung. Auch Verfahren mit vergleichbarer oder besserer Massenauflösung, wie der FTICR-MS, können angewandt werden.
Überraschenderweise konnte aufgezeigt werden, daß mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie die Isotopomerenverteilungen von Peptiden hochauflösend, innerhalb enger Fehlergrenzen reproduzierbar ermittelt werden können.
Die Reproduzierbarkeit solcher, mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie gemessenen, Isotopomerenverteilungen wurde bislang nicht eingehend getestet. Zum qualitativen Vergleich wurden diese Verteilungen zwar oft herangezogen, dagegen wurden quantitative Aussagen nicht aus Einzelverteilungen bzw. Überlagerungen von Einzelverteilungen, sondern nur aus massenmäßig weit auseinanderliegenden, durch hohe Isotopenanreicherungen der Moleküle gewonnene, Einzelverteilungen abgeleitet. Argumente gegen ihre quantitative Verwendung wurden mit verfälschenden, nicht kalibrierbaren Einflüssen aus dem MALDI- lonisationsprozeß und der TOF-Massenanalyse begründet.
Erfindungsgemäß umfaßt das Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine in einer ersten und einer mindestens zweiten Probe folgende Schritte:
Markieren der Proteine mindestens einer Probe mit stabilen
Isotopen,
Herstellung einer Proteinmischung gleicher Proteinmengen aus der ersten und der mindestens zweiten Probe, getrennte Separation der Proteine der ersten Probe, der
Proteinmischung und der mindestens zweiten Probe mit Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D-Gels, gegebenenfalls in mehreren Schritten, - gegebenenfalls Gewinnung von Fragmenten aus den separierten
Proteinen durch spezifisches Spalten oder Verdau der Proteine, vor oder nach der Separation oder direkt nach der Markierung,
Ermitteln der Isotopomerenverteilung der Fragmente durch
MALDI-TOF-Massenspektrometrie und - Berechnung der Verhältnisse der Proteinhäufigkeiten zwischen der ersten und der mindestens zweiten Probe aus den ermittelten
Isotopomerenverteilungen.
Die Häufigkeiten der gleichartigen, d. h. sich entsprechenden, Proteine in der ersten bzw. in der mindestens zweiten Probe sind unbekannt. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird das Verhältnis dieser Häufigkeiten bestimmt. Das Verfahren ist analog zur Bestimmung des Verhältnisses der Häufigkeiten sich entsprechender Peptide in der ersten bzw. in der mindestens zweiten Probe geeignet. Die gleichartigen Proteine können isoliert vorhanden oder beispielsweise in Zellen lokalisiert sein. Sind die Proteine in Zellen lokalisiert, bestehen die beiden Proben typischerweise aus gleichartigen Zellkulturen, sogenannten Zellpools. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden hierbei die relativen zellulären Proteinhäufigkeiten bestimmt bzw. quantifiziert.
Bei diesem Verfahren werden die unterschiedlichen Isotopomerenverteilungen der Ausgangsproben und der Probenmischung bzw. der Probenmischungen zur Berechnung der Proteinhäufigkeitsverhältnisse und die Auswirkungen eines Beeinflussungsmittels auf diese Verhältnisse bestimmt.
In einem ersten Schritt werden die Proteine mindestens einer Probe mit stabilen Isotopen markiert. Unter Markierung im Sinne der Erfindung wird das Einbringen von Elementen in die zu markierenden Proteine verstanden, die in dieser Zusammensetzung nicht natürlich vorkommen, oder in verschiedenen relativen Verhältnissen zu einander zwischen den mindestens zwei Proben vorkommen. Unter Einbringen wird beispielsweise der Einbau, insbesondere bei der Biosynthese innerhalb von Zellen, markierter Aminosäuren in zu markierende Proteine und Peptide verstanden.
Die Markierung von Zellen kann vorteilhafterweise "in vivo" durch das Anzüchten der Zellen auf einem Medium erfolgen, das markierte Aminosäuren oder andere Quellen für die entsprechenden Elemente enthält. Die beispielsweise angereicherten Aminosäuren werden in die Zellen aufgenommen und in die zu untersuchenden Zellproteine eingebaut. Die Aminosäuren können beispielsweise 15N, 13C, 1δO, MS und/oder 2H2 enthalten. Eine Markierung "in vitro" ist gleichfalls möglich, beispielsweise durch Protein-Alkylierung.
In einem zweiten Schritt wird eine Proteinmischung bekannter Proteinmengen aus der ersten und der mindestens zweiten Probe hergestellt. Eine Proteinmenge umfaßt alle in der Probe vorkommenden Proteine und wird durch herkömmliche Verfahren bestimmt.
In einem weiteren Schritt werden die Proteine der ersten Probe, der Proteinmischung und der mindestens zweiten Probe mit Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D-Gels, aufgetrennt. Die Trennung der ersten Probe und der zweiten Probe sind nur dann notwendig, wenn die Anreicherung von stabilen Isotopen in diesen Proben sonst unbekannt ist. Man erhält dadurch eine Auftrennung der in der Probe vorhandenen Proteine anhand von spezifischen Proteineigenschaften. In Folge werden einzelne, durch die Separation gefundene Proteine analysiert. Hierbei werden die Häufigkeiten zugehöriger, sich entsprechender gleichartiger Proteine der ersten und der mindestens zweiten Probe zueinander in Beziehung gesetzt.
Im einem nächsten Schritt werden die separierten Proteine durch Verdau in Fragmente bzw. Peptide aufgespalten, wobei die Fragmentierung auch bereits vorher durchgeführt worden sein kann.
Nachfolgend wird die Isotopomerenverteilung der Fragmente durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermittelt. Die
Isotopomerenverteilungen der Fragmente kann hochauflösend, innerhalb enger Fehlergrenzen reproduzierbar ermittelt werden. Dies ist eine Grundvoraussetzung des Verfahrens.
In einem letzten Schritt werden die Verhältnisse der Proteinhäufigkeiten zwischen der ersten und der mindestens zweiten Probe aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen berechnet. Die Berechnung kann mit Hilfe der Isotopomerenverteilungen jeweils eines sich entsprechenden Fragments aus der ersten und der mindestens zweiten Probe erfolgen. Die Berechnung kann auch mit Hilfe der Isotopomerenverteilungen der jeweils sonst bekannten oder geschätzten Stabilisotopanreicherungen jeder einzelnen Probe erfolgen. Es können auch mehrere Isotopomerenverteilungen von unterschiedlichen Fragmenten bzw. Peptiden eines Proteins zur Berechnung verwendet werden.
Die dargestellten Reihenfolgen der Schritte der erfindungsgemäßen Verfahren sind nur beispielhaft gewählt und nicht zwingend.
Das in [Vogt 1993] beschriebene Verfahren zur Bestimmung von Isotopenanreicherungen unter Verwendung von
Isotopomerenverteilungen kann beispielsweise direkt zur Berechnung der Verhältnisse der Proteinhäufigkeiten angewendet werden. Hierbei wird von der Tatsache Gebrauch gemacht, daß sich die natürliche Isotopomerenverteilung eines Moleküls bei einer künstlichen Anreicherung des Moleküls mit Isotopen, die in dieser Häufigkeit in der Natur nicht vorkommen, spezifisch verschiebt.
Die Berechnung basiert vorteilhafterweise auf der Bestimmung der relativen Häufigkeiten von Peaks der Isotopomerenverteilung der Proteine bzw. Peptide. Diese Peaks werden mit Integer-Werten (i=0,...,n) bezeichnet, die den Massen-Offset bezüglich des monoisotopischen Peaks (i=0) in Richtung zunehmender m/z-Werte beschreiben. Die monoisotopischen Peaks der Protein- bzw. Peptid- Moleküle sind die Peaks mit den niedrigsten m/z-Werten in einer Isotopomerenverteilung. Die Isotopomerenverteilungen von Molekülen sind massenspektrometrische Abbildungen ihrer isotopologischen Verteilung Mi (i=1..n), wobei Mi Isotopologe mit dem gleichen Massen- Offset i bezeichnet.
Als Rechengrößen werden sogenannte RIA-Werte (Relative Isotopologue Abundance-Werte) verwendet, welche die relative Anzahl aller Isotopologe mit gleichem Massen-Offset i eines Proteins bzw. Peptids bezogen auf die Summe aller massenspektrometrisch bestimmbarer Isotopologe des Proteins bzw. Peptids darstellen. Dementsprechend ergibt sich ein RIA-Wert eines Isotopologes Mi eines bestimmten Protein- bzw. Peptid-Fragments p durch:
Figure imgf000014_0001
wobei Sp,i (i=0,...,n) die massenspektrometrisch gemessenen Ionen- Signale sind, die aus einer Isotopomerenverteilung der n Peaks einer isotopologischen Verteilung eines Peptids p abgeleitet werden. Die lonensignale werden aus Integralen über die entsprechenden Peaks bestimmt.
Wenn die molare Mengen eines isotopisch markierten Proteins mit L und die molare Menge eines Proteins in natürlich isotopischer Zusammensetzung mit N bezeichnet wird, ergibt sich der Molenbruch C eines Gemischs dieser Proteine durch:
C = IJ(L+N) (2)
Der Molenbruch C bestimmt sich gemäß [Vogt 1993] zu:
_ RIAp ι (L + N) - RIAp ι (N) RIApj (L) - RIAp ι (N)
Durch Einsetzen der gemessenen Werte RIAp,j(L+N), RIAp i(L) und RIAp j(N) läßt sich der entsprechende Molenbruch CPιj berechnen, wobei RIAp,i(L+N) die RIA-Werte des Gemisch, RIAPιi(L) die RIA-Werte der markierten und RIAPιj(N) die RIA-Werte der natürlich vorkommenden Proteine bzw. Peptide sind. Das molare Verhältnis R = UN ergibt sich aus:
(4)
N 1 - C
Zur Bestimmung des Molenbruchs Cp bzw. des molaren Verhältnisses lassen sich alle n Peaks der Isotopomerenverteilung verwenden. Man erhält also eine n-fache Redundanz, die zur Erhöhung der Genauigkeit verwendbar ist.
Die Verwendung von Isotopomerenverteilungen, die beispielsweise mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie hochauflösend und reproduzierbar ermittelt werden, zur Berechnung von Verhältnissen von Proteinhäufigkeiten, beispielsweise mit Hilfe des in [Vogt 1993] beschriebenen Verfahrens, ermöglicht die Bestimmung von Verhältnissen von Proteinhäufigkeiten (z. B. Quantifizierung) bzw. Mischungsverhältnissen mit niedrigen Isotopenanreicherungen, von beispielsweise ca. 20 %. Alle bisher veröffentlichten Methoden sind auf das Erreichen sehr hoher Isotopenanreicherungen (> 90 %) in einem Markierungsschritt angewiesen, um getrennte, überlagerungsfreie und definierte Isotopomerenverteilungen für markierte und unmarkierte Fragmente bzw. Peptide und möglichst vollständige Markierung aller vorgesehenen Markierungsstellen zu erzeugen [Gygi et al., 1999 und andere Gruppen].
Das hier beschriebene Verfahren ist um ein Vielfaches schneller und billiger als vergleichbare herkömmliche Verfahren, bei welchen Isotopenanreicherungen über 90 % benötigt werden. Es handelt sich daher um ein neues Verfahren, daß beträchtliche Vorteile gegenüber den bisher veröffentlichten Verfahren bietet. Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass es keine Kenntnisse darüber voraussetzt, wie die Markierung in das Peptid und/oder Protein gelangt und ob es sich dabei um einen oder mehrere gleiche oder verschiedene Markierungen handelt. Außerdem spielt es keine Rolle, in welchem Umfang die Markierung in den Proteinen oder Peptiden angereichert wird. Ausschlaggebend ist allein, daß sich die maßenspektrometrisch gemessenen Peptidfragment-
Isotopomerenverteilungen der zu vergleichenden markierten und unmarkierten Proteine genügend unterscheiden, um auswertbar zu sein.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird mindestens eine Probe vor der Herstellung der Proteinmischung mit mindestens einem Beeinflussungsmittel beeinflußt, insbesondere stimuliert. Die Probe stellt vorteilhafterweise eine biologische Probe dar, beispielsweise eine Zellkultur oder ein Zellsystem. Die Probe kann auch ein Organismus oder ein Teil davon sein oder davon abstammen. Die Verhältnisse der Proteinhäufigkeiten sind ein Maß für die Auswirkung der Beeinflussung bzw. der Stimulation auf die Proteinhäufigkeiten. Auf diese Weise kann beispielsweise die Wirksamkeit eines Beeinflussungsmittels auf das Zellwachstum untersucht werden. Analog kann mit Inhibition gearbeitet werden.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Einbaurate von, mit stabilen Isotopen markierten, Substanzen, insbesondere von Aminosäuren, in Proteine, welche von Zellen gebildet werden, mit folgenden Schritten:
Mischen der markierten Substanzen mit den Zellen, Gewinnung von mindestens einer Proteinernte durch Entnahme der Proteine zu mindestens einem bestimmten Zeitpunkt, - getrennte Separation der Proteine der jeweiligen Proteinernten mit
Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D-Gels, gegebenenfalls in mehreren Schritten, gegebenenfalls Gewinnung von Fragmenten der separierten Proteine der jeweiligen Proteinernten durch spezifisches Spalten oder Verdau, insbesondere tryptischen Verdau, der Proteine vor der nach der Separation, - Ermitteln der Isotopomerenverteilung der Fragmente der jeweiligen Proteinernten durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie und
Berechnung der Einbaurate der Substanz aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen der jeweiligen Proteinernten.
Alternativ kann der Anreicherungsgrad aus einer Messung bestimmt werden, wenn Abweichungen von den natürlich vorkommenden oder anders erwarteten Isotopomerenverteilung beobachtet werden. Verschiedene Anreicherungsgrade in verschiedenen Proteinen weisen auf verschiedenen Einbauraten hin.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Einbaurate von Substanzen, beispielsweise Aminosäuren, die mit stabilen Isotopen markiert sind, in Proteine bzw. Peptide berechnet. Unter Einbaurate ist die Veränderung der eingebauten Substanzmenge in einem Protein pro Zeiteinheit zu verstehen. Bei den Substanzen kann es sich beispielsweise um markierte Aminosäuren handeln. Die markierten Aminosäuren können in eine Zellprobe bzw. einen Zellpool eingebracht werden, wobei die Zellen der Probe ab dem Zeitpunkt des Einbringens der Substanz, d. h. der markierten Aminosäuren, mit dem Einbau der Substanz in die zelleigenen Proteine bzw. Peptide beginnen.
In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die markierten Substanzen mit den Proteinen gemischt. Ab diesem Zeitpunkt kann es zu einem Einbau der Substanz mit einer zu bestimmenden Einbaurate in die Proteine kommen. In einem weiteren Schritt wird mindestens eine Proteinernte durch Entnahme der Proteine zu mindestens einem bestimmten Zeitpunkt gewonnen. Mit fortschreitender Zeit werden entsprechend der Einbaurate zunehmend Substanzen in die Proteine eingebaut. Werden zu definierten Zeitpunkten Proteinernten bzw. Proteinproben entnommen, ist es möglich, anhand dieser Proteinernten die Einbaurate zu bestimmen. Handelt es sich bei der zu untersuchenden Probe um eine markierte Zellprobe, werden Zellen aus der Probe entnommen, gewaschen und lysiert.
In einem nächsten Schritt werden die Proteine der jeweiligen Proteinernten mit Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D- Gels, separiert. Man erhält dadurch eine Auftrennung der in der Probe vorhandenen Proteine anhand von spezifischen Proteineigenschaften. In Folge werden einzelne, durch die Separation gefundene Proteine analysiert. Hierbei werden die Anreicherungen der Substanzen in den zugehörigen, sich entsprechenden gleichartigen Proteinen der zeitlich aufeinanderfolgenden Proteinernten zueinander in Beziehung gesetzt.
Nachfolgend werden Fragmente der separierten Proteine der jeweiligen Proteinernten durch spezifische Spaltung oder Verdau, insbesondere durch tryptischen Verdau, der Proteine gewonnen.
Danach wird die Isotopomerenverteilung der Fragmente der jeweiligen Proteinernten durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermittelt. Die Isotopomerenverteilungen der Fragmente kann hochauflösend, innerhalb enger Fehlergrenzen reproduzierbar, ermitteln werden. Dies ist eine Grundvoraussetzung des Verfahrens, da sich die Substanzanreicherung von Proteinernten zweier aufeinanderfolgenden Zeitpunkte, abhängig von der Einbaurate und der Zeitdifferenz zwischen den unterschiedlichen Zeitpunkten, nur geringfügig unterscheiden kann. In einem letzten Schritt wird die Einbaurate der Substanz aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen der jeweiligen Proteinernten berechnet. Ist die Peptidsequenz bekannt und damit auch die vorhandenen Aminosäuren, kann die Einbaurate für spezifische Aminosäuren berechnet werden.
Das in [Vogt 1993] beschriebene Verfahren zur Bestimmung von Isotopenanreicherungen unter Verwendung von
Isotopomerenverteilungen kann beispielsweise direkt zur Berechnung der Einbaurate der Substanz aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen der jeweiligen Proteinernten angewendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Bestimmung der Einbauraten von markierten Substanzen in Proteine zur Bestimmung der Auswirkung einer Beeinflussung, insbesondere einer Stimulation, auf die Einbauraten gleichartiger Proteine in einer ersten und einer mindestens zweiten markierten Probe verwendet. Mindestens eine der Proben wird mit einem Beeinflussungsmittel beeinflußt. Die Einbauraten der Substanz werden für die jeweilige Probe ermittelt und die Auswirkung der Beeinflussung wird durch Bildung des Verhältnisses der jeweiligen Einbauraten bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine durch Aminosäuren markiert, die mit stabilen Isotopen angereichert wurden. Hierbei wird beispielsweise eine Zellkultur auf einem Medium gezüchtet, das mit Isotopen angereicherte Aminosäuren enthält. Hierbei kann es sich um gleiche oder verschiedene Aminosäuren mit gleichen oder verschiedenen Isotop-Markierungen handeln.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die Isotope 15N, 14C,
13 13N 18Q 34g und oder 2H2 ln besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren sind die Isotopenanreicherungen kleiner als 95 %, vorzugsweise kleiner als 90 %, insbesondere kleiner als 80 %, vorzugsweise kleiner als 40 % und besonders bevorzugt kleiner als 30 %. Bekannte Verfahren sind auf hohe Isotopenanreicherungen von beispielsweise größer als 90 % angewiesen, da beispielsweise eine Überlagerung der Isotopomerenverteilungen der natürlich vorkommenden Moleküle mit den Isotopomerenverteilungen der angereicherten Moleküle eine Analyse erschwert bzw. unmöglich macht. Durch die Kombination von MALDI-TOF-Massenspektrometrie in Verbindung mit beispielsweise dem in [Vogt 1993] beschriebenen Verfahren ist es erstmals möglich, derart geringe Isotopenanreicherungen auszuwerten. Ein wesentlicher Vorteil ist diese Tatsache auch bei der Bestimmung von Einbauraten, da hier zwischen zwei unterschiedlichen Meßzeitpunkten nur geringe Unterschiede in den Isotopenanreicherungen auftreten können.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Gewinnung von Informationen über Aminosäurensequenzen von Peptiden, bei dem die Informationen über die Aminosäurensequenzen mit Hilfe der durch hochauflösende Massenspektrometrie ermittelten
Isotopomerenverteilung der Peptide gewonnen wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Isotopomerenverteilung eines Peptids bzw. Proteins dazu benutzt, neben anderen spezifischen Parametern, beispielsweise der Peptidmasse, Informationen über Aminosäurensequenzen des Peptids zu gewinnen. Diese Informationen können als zusätzliche Information bei der Qualifizierung des zu untersuchenden Peptids verwendet werden. Beispielsweise kann in einem Peptid bei der Peptide-Mass-Fingerprint Methode neben dem m/z-Wert die Isotopomerenverteilung als zusätzlicher unabhängiger Suchparameter verwendet werden.
In einer Weiterbildung des Verfahrens betreffen die Informationen über die Aminosäurensequenzen die Aminosäuren-Sequenzzusammensetzung der Peptide. Stabilisotopangereicherte Peptide müssen stabilisotopangereicherte Aminosäuren enthalten. Wenn die Verteilung der Stabilisotope über alle Aminosäuren bekannt ist, so enthält die Isotopomerenverteilung der Peptide eines Proteins auch Aminosäuresequenzinformationen, weil die Stabilisotopinkorporation sequenzspezifisch ist. Dies trifft nicht nur für künstlich angereicherte Stabilisotope, sondern auch für natürlich vorkommende Stabilisotope, insbesondere in Anwesenheit von schwefelhaltigen Aminosäuren, zu.
Die Anwesenheit der schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin in einem Peptid führt aufgrund der charakteristischen Isotopenverteilung des Elements Schwefel zu einer spezifischen Isotopomerenverteilungen derartiger Peptide. Das Element Schwefel besitzt die 4 stabilen Isotope 32S (Häufigkeit 95 %), 33S (0,75 %), ^S (4,2 %) und 36S (0,015 %). Der hohe Anteil des schweren Isotops 34S von 4,2 % verschiebt den Schwerpunkt der Isotopomerenverteilungen von Cys- oder Met-haltigen Peptiden zu schwereren Massen hin. Wenn ^S künstlich angereichert wird, wird dieser Effekt größer.
Wird die Isotopomerenverteilung von Peptiden bestimmt, ist gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Detektion der Verschiebung des Schwerpunkts der Isotopomerenverteilung zu schwereren Massen ein Merkmal für die Anwesenheit von stabile Isotope enthaltenden, insbesondere schwefelhaltigen, Aminosäuren. In einer Weiterbildung umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der lonisationsfähigkeit von Peptiden und/oder Proteinen nach einem enzymatischen und/oder chemischen Verdau. Nach einem Verdau ergeben sich verschiedene entständige Aminosäuren sowohl am C- wie N-terminalen Ende, welche aufgrund ihrer unterschiedlichen pK- Werte in ihrer lonisationsfähigkeit stark variieren. Dabei sind im Falle eines beispielsweise tryptischen Verdaus die Lysin-Peptide gegenüber den Arginin-Peptiden stark benachteiligt. Durch eine Modifikation der, vorzugsweise N- und C-terminalen, Aminosäuren, insbesondere im Bereich der Seitenketten, mit einer ersten Modifikationssubstanz wird die lonisationseffizienz von, insbesondere lysinhaltigen, Peptiden gesteigert und die Stärke der Signale der massenspektrometrischen Untersuchung stark erhöht. Als derartige Substanzen werden beispielsweise O-Methylisoharnstoff oder Nicotinyl-N-hydroxysuccinimid [James 2000] sowohl für C- wie auch für N-terminale Modifikationen verwendet.
Die zu untersuchenden Moleküle, insbesondere Proteine und/oder Peptide, werden vor der massenspektrometrischen Untersuchung zunächst gereinigt und beispielsweise mit Hilfe eines Polyacrylamidgels aufgetrennt. Für die Modifikation von Aminosäuren wird durch Immobilisierung der Proteine oder Peptide, insbesondere in einer Polyacrylamidgelmatrix oder auf einem Umkehrphasenmaterial, eine hohe stöchiometrische Effizienz erhalten.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Identifikation von Molekülen, welche mindestens eine Phosphogruppe oder über ein Sauerstoffatom angebundene Kohlenhydrate enthalten, insbesondere Peptide und/oder Proteine, wie beispielsweise Phosphoserine oder Phosphothreonine. Durch das Verfahren werden schwefelhaltige Gruppen, vorzugsweise durch Michael-Addierung von schwefelhaltigen Nukleophilen oder durch beta-Eliminierung mindestens einer Phosphogruppe, insbesondere durch nukleophile schwefelhaltige Reagenzien, welche mindestens eine Phosphogruppe verdrängen, eingeführt. Eine anschließende Detektion der Verschiebung des Schwerpunktes der Isotopomerenverteilung zu schweren Massen, bedingt durch die Verdrängung der Phosphogruppe durch das schwefelhaltige Nukleophil, ist ein indirekter Nachweis für die Anwesenheit eines Phosphoproteins oder -peptids.
In einer Fortführung des Verfahrens wird die eingeführte schwefelhaltige Gruppe, insbesondere eine Sulfhydrylgruppe, durch eine leichter ionisierbare Gruppe in Form eines geeigneten Reagenz, vorzugsweise eines Alkylierungsmittel, insbesondere 3-(Acrylamidopropyl)-trimethyl- ammoniumchlorid [Brune 1992] oder 1 ,1 ,3,3-Tetramethylguanidin, ersetzt und vereinfacht dadurch die Identifikation phosphogruppenbeinhaltender Peptide und Proteine, insbesondere durch eine Erhöhung der Stärke der Signale bei der massenspektrometrischen Detektion und eine Verbesserung der Statistik bei höheren Isotopomeren.
Die negative Ladung beispielsweise einer Phosphatgruppe wird dadurch zu einer basischen Gruppe konvertiert. In einer Weiterbildung des Verfahrens, bei der die Michael-Addierung vor dem beispielsweise tryptischen Verdau stattfindet, können dadurch neue tπ/ptische Spaltstellen eingeführt werden. Die Kombination von neuen Spaltstellen und damit neuen Peptiden, zusammen mit einer isotopomerischen schwefel-spezifischen Signatur, identifiziert nach der Erfindung eindeutig das Vorhandensein und die Position der Phosphatgruppe. Wenn die Michael-Addierung mit einer Mischung von Reagenzien durchgeführt wird, wobei mindestens ein Reagenz eine positive Ladung einführt und mindestens eines dieser Reagenzien keine positive Ladung einführt, so entstehen pro Phosphat zwei Peptide (= ein Peptidpaar) mit Massenunterschieden, die abhängig sind von dem Massenunterschied der mindestens zwei verschiedenen Alkylierungsmoleküle: (1 ) von der tryptischen Spaltung nach der das Phosphat enthaltenden Aminosäure, (2) von der tryptischen Spaltung nach der am nächsten stehenden basischen Aminosäure. Diese Peptidpaare besitzen für alle phosphatenthaltenden Peptide eine isotopomerische schwefelspezifische Signatur, die erfindungsgemäß auf das bei der Michael- Addierung eingeführte Reagenz zurückzuführen ist.
Die Erfindung bezieht sich auf die Analyse von Proben aus Proteinen oder Gemischen von Proteinen oder fragmentierten Proteinen, bei denen die Isotopomeren-Verteilungen mit genügend großer Massenauflösung meßbar sind.
Bei der bereits bekannten Massenanalyse von Isotopomeren-Ver- teilungen (MIDA), beispielsweise beschrieben in Analytical biochemistry 267, 1-16 (1999), wird das Schicksal eines bestimmten Precursors, beispielsweise markiertes Leucin, verfolgt. Im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Verfahren ist es mit MIDA nicht möglich, mehr als einen markierten Precursor, also beispielsweise eine markierte Aminosäure, zu verwenden. Die erfindungsgemäßen Verfahren haben dem gegenüber weiterhin den Vorteil, daß der oder die markierten Precursor auch in andere Aminosäuren metabolisiert werden können. Die hier offenbarten Verfahren unter Einsatz von RIA können mit mehr als einem Precursor eingesetzt werden. Durch den Vergleich von beobachteten und zu erwartenden Isotopomer-Verteilungen können sie mit einer Probe durchgeführt werden. Darüber hinaus können mit diesen Verfahren qualitative und/oder quantitative Aussagen über Proteine von zwei oder mehr Proben gemacht werden, wobei für quantitative Aussagen vorzugsweise Proteinproben miteinander gemischt und ein Massenspektrum dieses Gemisches analysiert wird. Hierbei ist es unerheblich, von welcher Art das oder die stabilen Isotope sind, welche in die Peptide und/oder Proteine eingebaut werden oder auf welche Art und Weise die Markierung metabolisch ein- oder umgebaut wird. Hierdurch wird es ermöglicht, beispielsweise kostengünstige stabile Isotopenquellen zu verwenden, wie beispielsweise Hefeextrakte, die mit 15N markiert sind, wobei beispielsweise die Aminosäuren teilweise oder auch vollständig markiert sind. Derartige Isotopenquellen eignen sich beispielsweise zur Fütterung von Mäusen oder anderen Versuchstieren.
Die verschiedenen Isotopen-Muster der Ionen von verschiedenen Proben werden empirisch bestimmt, wodurch es möglich ist, (a) die Unterschiede zwischen zwei Proben durch Messung der relativen Isotopomeren-Abundanzen jeder Probe zu bestimmen und (b) die Molfraktion von jeder Probe, also deren Verhältnis zueinander, durch Verwendung des Gemisches von zwei Proben zur massenspektrometrischen Messung zu quantifizieren.
Proteine oder Peptide, die erfindungsgemäß untersucht werden können, bestehen aus Molekülen mit zwei oder mehr Aminosäuren, die durch eine oder mehrere Peptidbindungen mit Hilfe eines Ribosoms verbunden sind. Für die Zwecke der Erfindung können auch synthetische oder künstlich synthetisierte Polypeptide oder Proteine hergestellt werden, solange sie ebenfalls durch Ribosomen synthetisiert werden. Es können also auch beispielsweise Translationssysteme eingesetzt werden, die auf Zellextrakten beruhen und so Proteine produzieren.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren, bei dem wenigstens zwei unterschiedlich markierte Proben analysiert werden. Vorzugsweise stammen die Proben aus komplexen biologischen Systemen, wie beispielsweise aus kultivierten Zellen, Organismen, Gewebe von Organismen, zelluläre Fraktionen oder chromatographische Fraktionen von biologischen Systemen. Diese Proben bestehen im allgemeinen nicht aus einzelnen Proteinen, deren chemische Zusammensetzung bekannt wäre.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist, die Sensitivität von bestehenden Methoden zu erhöhen, um so die Analyse von verschiedenen Proteinen in Proteom-Anwendungen zu ermöglichen. Beispielsweise kann so die Antwort eines Systems, insbesondere eines komplexen biologischen Systems, auf experimentelle Behandlungen untersucht werden. Die erforderliche Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich u. a. aus den Beispielen in Kombination mit den Figuren.
Die Proben enthalten im allgemeinen verschiedene Proteine und/oder Protein-Isoformen. Diese Protein-Isoformen sind chemisch verschiedene Proteinarten, die von einer oder mehreren mRNA-Molekülen synthetisiert werden, wobei die mRNA-Moleküle von dem gleichen oder zumindest von hoch homologen Genen transkribiert werden. So umfassen Protein-Isoformen beispielsweise Proteine, die von unterschiedlich gespleißten mRNAs synthetisiert werden oder auch Proteine, die post-translational unterschiedlich modifiziert werden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Proteine oder Protein-Isoformen werden an Ribosomen synthetisiert und sind nicht durch nicht-biologische, chemische Methoden synthetisch hergestellt. In dem Fall, daß synthetisch synthetisierte Polypeptide oder Proteine dieser Art zu den Proben zugegeben werden, deckt die Erfindung Verfahren ab, bei denen individuelle Protein-Abundanzen von nicht-synthetisch hergestellten Polypeptiden oder Proteinen in mindestens einer Probe bestimmt werden.
Im Gegensatz zur bekannten massenspektrometrischen Analyse von Isotopomeren-Verteilungen (MIDA) ist es vorteilhafterweise für das erfindungsgemäße Verfahren nicht erforderlich, die Aminosäuresequenz der zu analysierenden Peptide oder Proteine zu kennen. Vielmehr ist das erfindungsgemäße Verfahren dazu geeignet, bisher völlig unbekannte, beispielsweise Cystein-enthaltende Peptide zu analysieren und insbesondere zu quantifizieren. Ein Ziel der Erfindung ist es, solche Proteine oder Peptide in den Proben zu detektieren, die unterschiedliche stabile Isotopen-Gehalte aufweisen und/oder diese Proteine in verschiedenen Proben bezüglich ihrer relativen Abundanz bzw. Häufigkeit zu differenzieren, um so eine relative Quantifizierung der Unterschiede in den Häufigkeiten zu ermöglichen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Bereitstellung von Informationen über relative Änderungen in den Häufigkeiten eines einzelnen Proteins oder einer Gruppe von Proteinen zwischen verschiedenen Proben und die Veränderungen im proportionalen stabilen Isotopengehalt dieser Proteine, wie sie beispielsweise aus unterschiedlicher experimenteller Behandlung der biologischen Systeme resultiert, welche die Quelle für die Proben bereitstellen kann, die erfindungsgemäß analysiert werden.
Die verschiedenen Proben können ursprünglich identisch sein. Andererseits kann es sich bei dem Ursprung der Proben um experimentell äquivalente Kategorien der Probe handeln, wie beispielsweise unterschiedliche Tiere oder Gruppen von Tieren oder verschiedene Kulturen von kultivierten Zellen, die von einer Mutterkultur oder Gruppen einer Mutterkultur abstammen. Vor der Zellernte bzw. - entnähme werden die verschiedenen Proben, insbesondere die verschiedenen Zellkulturen oder Tiere bzw. Tiergruppen während des Verlaufes des Experiments unterschiedlich behandelt. Für Kontrollproben sollten die experimentellen Bedingungen entsprechend gewählt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die relativen stabilen Isotopengehalte bestimmt werden und so die relativen quantitativen Beziehungen zwischen verschiedenen multiplen Paaren oder Gruppen von Polypeptid-Ionen oder Protein-Ionen der selben chemischen Struktur oder der selben monoisotopischen Masse von den verschiedenen Proben ermittelt werden. Besagte Ionen unterscheiden sich lediglich in ihrem stabilen Isotopen-Gehalt innerhalb der verschiedenen Proben. Eine oder mehrere Tochter-Ionen, wie beispielsweise tryptische Peptid-Ionen, von dem selben Protein in jeder Probe können benutzt werden, um die Unterschiede im stabilen Isotop-Gehalt und/oder im Proteinhäufigkeitsverhältnis zwischen den Proben zu errechnen.
Die Proteine und/oder Peptide in den Proben können unterschiedlichen Markierungen mit stabilen Isotopen unterzogen werden, indem die lebenden Systeme, insbesondere Zellen, vor, während oder nach der Behandlung metabolisch markiert werden. Die Reagenzien zur Markierung müssen hierbei nicht homogen sein. Die Proben können zusätzlich oder alternativ mit verschiedenen stabilen Isotopen markiert werden, indem beispielsweise Alkylierungsreagenzien mit verschiedenen stabilen Isotopen-Gehalten zu den Proteinen bzw. Peptiden jeder Probe gegeben werden. Diese Alkylierungsreagenzien müssen nicht homogene stabile Isotopenverbindungen aufweisen. Für die Markierung können verschiedene stabile isotopische Elemente in einer Probe kombiniert werden, beispielsweise 2H, 13C und/oder 15N. Diese verschiedenen isotopischen Elemente können in die verschiedenen chemischen Verbindungen der Proteine und/oder Peptide eingebaut werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die tatsächliche oder angebliche Aminosäuresequenz der analysierten Ionen beispielsweise durch Peptid-Massen-Fingerprinting oder durch Messung der Massen der Fragmente analysierter Ionen identifiziert werden. Weiterhin kann auch die Verteilung der stabilen Isotope über bestimmte Aminosäuren durch rechnerische Simulation ermittelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Ionen während der Massenspektrometrie fragmentiert, um Tochter-Ionen zu generieren, die in ihren Massen durch Bestandteile voneinander abweichen, die über Peptidbindungen mit dem Ion verbunden sind, wie beispielsweise Aminosäuren, posttranslational modifizierte Aminosäuren oder andere chemisch modifizierte Aminosäuren. Beispielsweise wird hierfür eine Fragmentation durchgeführt, die auf einer Kollision in MS/MS-Analysen basiert oder aber auf einer „post source decay fragmentation" nach einer MALDI-Ionisierung beruht. Eine Analyse der Isotopomeren-Verteilungen der Tochter-Ionen ermöglicht eine Bestimmung der stabilen Isotopengehalte von jeder Aminosäure in den Polypeptid-Ionen aus jeder einzelnen Probe.
Vorteilhafterweise kann eine oder mehrere Änderungen in dem stabilen Isotopengehalt der Proteine oder Peptide in Kombination mit Informationen aus anderen Quellen genutzt werden, um die Antwort des biologischen Systems auf die experimentellen Bedingungen zu interpretieren. Beispielsweise kann die möglicherweise beobachtete höhere Häufigkeit von stabilen Isotopen in einem oder mehreren Proteinen, welche bekanntermaßen in einer Streßantwort involviert sind, einen gegensätzlichen Effekt oder eine toxische Antwort auf eine bestimmte experimentelle Behandlung bei bestimmten Zellen in dem System indizieren. Weiterhin kann beispielsweise eine Veränderung in dem Gehalt der stabilen Isotope in einem oder mehreren Proteinen, die vermutlich bei der Redox-Regulation eine Rolle spielen, eine oxidative Streß- oder hydroxische Reaktion des Systems auf die Behandlung anzeigen. Dieser Aspekt der Erfindung betrifft neben dem erfindungsgemäßen Verfahren bezüglich quantitativer Aussagen auch das erfindungsgemäße Verfahren bezüglich qualitativer Aussagen. Für das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich quantitativer Aussagen werden die Ergebnisse bezüglich der Abundanzen von einem oder mehreren Proteinen in Kombination mit Informationen von anderen Quellen ausgewertet, um so die Antwort des biologischen Systems auf die experimentellen Bedingungen zu interpretieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in besonderer Weise dazu geeignet, zwei oder mehr Proteine oder Peptide in einer oder mehreren Proben zu untersuchen. Vorteilhafterweise können beispielsweise sogar mehr als 10 oder sogar mehr als 100 verschiedene Proteine in einer oder mehreren Proben erfindungsgemäß analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren in automatisierter Weise, beispielsweise unter Einsatz von Robotern oder ähnlichem durchgeführt. Diese automatisierte Vorgehensweise kann beispielsweise für die Vorbereitung der Proben, die Trennung der Proben, die Fragmentierung der Proben und/oder die Durchführung der massenspektrometrischen Analyse eingesetzt werden, wodurch vorteilhafterweise der Probendurchsatz erhöht wird und damit im allgemeinen natürlich die Kosten gesenkt werden.
Die genannten Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Experimenten in Verbindung mit den Unteransprüchen und Figuren. Hierbei können die Einzelmerkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen: Abb. 1 : Mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie gemessene
Isotopomerenverteilung eines Peptids mit einer Masse von ca. 840 DA,
Abb. 2: Mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie gemessene Isotopomerenverteilung eines Peptids mit einer Masse von ca. 1.570 DA,
Abb. 3: Mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie gemessene Isotopomerenverteilung eines Peptids mit einer Masse von ca. 2.200 DA,
Abb. 4: Mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie gemessene
Isotopomerenverteilung eines Peptids mit einer Masse von ca. 3.300 DA,
Abb. 5 und 6:
Die Abbildungen zeigen Peptide aus unterschiedlichen Massenbereichen der zum gleichen Protein gehörigen Massenspektren aus einem Zellpool A, einem Zellpool B und aus einer Mischung AB.
Methoden
Die in den folgenden Experimenten verwendeten Schritte bzw. Methoden sind mit Hilfe von Buchstaben bezeichnet, auf die nachfolgend Bezug genommen wird.
a) ist eine veröffentlichte Methode: Oda et al., 1999; Pasa-Tolic et al., 1999; Smith et al., 2001.
b), c), d) and e1 ) sind 'state of art' Methoden: Kellner, Lottspeich, Meyer, Microcharacterization of Proteins, Wiley-VCH, 1999; Schrattenholz (Hrsg.), Methoden der Proteomforschung, Spektrum Verlag, 2001.
e2) ist die Grundvoraussetzung für die hier beschriebenen Verfahren. Diese Grundvoraussetzung wurde durch eigene Messungen gefunden und auch nachgewiesen.
f) ist eine veröffentlichte Methode: Vogt et al., 1993.
Die Anwendung von f) auf e), d. h. die Verwendung der Isotopomerenverteilungen von MALDI-TOF-Spektren zur Berechnung von Mischungsverhältnissen normaler und schwach 15N (bzw. 13C)- angereicherter Proteine, wurde ebenfalls durch eigene Messung gefunden und bestätigt.
Als Massenspektrometer wurde ein Autoflex 3 der Firma Bruker Daltonics verwendet. Experiment 1 :
Bestimmung von Massenspektren von Peptiden mit MALDI-TOF- Massenspektrometrie.
Die mit MALDI-TOF gemessenen Massenspektren von Peptiden mit Massen von z. B. ca. 840, 1.570, 2.200 und 3.300 zeigen die in Abb.1 bis Abb. 4 gezeigten, typischen Isotopomerenverteilungen Diese Verteilungen kommen durch die Existenz von schweren Isotopen der Elemente zustande, aus denen die Peptide aufgebaut sind. Den größten Einfluß haben dabei die relativ häufigen schweren Isotope der Elemente Kohlenstoff (C13 = 1 ,1 %) und Stickstoff (N15 = 0,37 %).
Experiment 2: Reproduzierbarkeit von mit MALDI-TOF gemessenen
Isotopomerenverteilungen.
Beim Verdau der separierten Proteine wird das Enzym Trypsin verwendet. Trypsin verdaut aber nicht nur die Proteine sondern auch sich selbst, d. h. bei jedem Verdau entstehen spezifische Trypsinfragmente. Diese Trypsinfragmente haben definierte Massen (z. B.: 842.5, 2.211 , 2.283, 1.045) und dienen in MALDI-TOF-Spektren von tryptisch verdauten Proteinen zur Eichung der Massenskala. Sie eignen sich daher besonders zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit von Isotopomerenverteilungen mit Hilfe von MALDI-TOF.
Getestet wurde die Übereinstimmung bzw. Reproduzierbarkeit von jeweils 100 Isotopomerenverteilungen der Trypsinfragmente der Massen 842.5, 2.211 , 2.283, 1.045. Die Verteilungen stimmen innerhalb einer Schwankung von ± 5 % miteinander überein. Die mittleren Verteilungen stimmen innerhalb dieses Fehlers auch mit den theoretischen Isotopomerenverteilungen der Trypsinfragmente überein. Die Methode wurde außer für Trypsinfragmente auch für BSA- Fragmente verifiziert.
Experiment 3:
Isotopomerenverteilungen von Peptiden aus MALDI-TOF Massenspektren enthalten Informationen über die Proteinseguenz der Peptide.
Untersucht wurden die Isotopomerenverteilungen, die durch die Anwesenheit der schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin Zustandekommen.
Das Element Schwefel besitzt die 4 stabilen Isotope 32S (Häufigkeit 95 %), 33S (0,75 %), MS (4,2 %) und 36S (0,015 %). Der hohe Anteil des schweren Isotops 34S von 4,2 % verschiebt den Schwerpunkt der Isotopomerenverteilungen von C- oder M-haltigen Peptiden zu schwereren Massen hin.
Die Ergebnisse zeigen, daß die durch schwere Schwefel isotope hervorgerufenen Isotopomerenverteilungsverschiebungen mit MALDI- TOF immer dann eindeutig nachgewiesen werden können, wenn das C- bzw. M-haltige Peptid überlagerungsfrei mit genügend hoher Auflösung gemessen werden kann.
Experiment 4:
Relative Quantifizierung von zellulären Proteinhäufigkeiten mit Hilfe von stabilen Isotopen (2-Pool Methode).
Zellpool A: markierte Zellen Zellpool B: unmarkierte Zellen a) Die Zellen aus Zellpool A werden in einem Medium gezüchtet, das
15N (bzw. 13C)- angereicherte Aminosäuren enthält. Die 15N-angereicher- ten Aminosäuren werden von den Zellen aufgenommen und in die
Zellproteine eingebaut. b) Stimulation der unmarkierten Zellen aus Zellpool B. c) Mischung AB: Mischung gleicher Proteinmengen aus Zellpool A und
Zellpool B. d1 ) Die Separation der Proteine aus Zellpool A, Zellpool B und Mischung
AB geschieht mittels 2D-Gel-Elektrophorese. d2) In-Gel tryptischer Verdau der separierten Proteine. e1 ) Messung der 15N (bzw. 13C)-Anreicherungen der Proteine an
Peptiden, die aus dem tryptischen Verdau der Proteine gewonnen werden (MALDI-TOF-Verfahren). Als Ergebnisse erhält man die m/z-
Werte und die Isotopomerenverteilungen der Peptide. e2) Mit MALDI-TOF werden die Isotopomerenverteilungen der Peptide sehr reproduzierbar nachgewiesen. f) Aus den Isotopomerenverteilungen sich entsprechender tryptischer
Proteinfragmente aus Zellpool A, Zellpool B und Mischung AB werden die Proteinmischungsverhältnisse PM berechnet. Mischungsverhältnisse PM > 1 bzw. PM < 1 sind ein Maß für die Auswirkung der Stimulation auf die Proteinhäufigkeiten.
Der Meßbereich P = 0.1 bis PM = 10 kann noch mit einem Fehler < ± 10
% bestimmt werden.
Experiment 5:
Relative Quantifizierung von zellulären Proteinhäufigkeiten mit Hilfe von stabilen Isotopen (3-Pool Methode).
Zellpool A: markierte Zellen Zellpool B: unmarkierte Zellen Zellpool C: unmarkierte Zellen a) Die Zellen aus Zellpool A werden in einem Medium gezüchtet, das 15N (bzw. 13C)- angereicherte Aminosäuren enthält. Die 15N-angereicher- ten Aminosäuren werden von den Zellen aufgenommen und in die Zellproteine eingebaut. Von Zellpool A wird eine größere Menge zur Durchführung mehrerer Stimulationsexperimente gezüchtet. Diese Menge kann auch als Referenz in weiteren Experimenten und/oder zur Herstellung eines Testsets verwendet werden. b) Stimulation der unmarkierten Zellen aus Zellpool B. d ) Mischung AB: Mischung gleicher Proteinmengen aus Zellpool A und Zellpool B. c2) Mischung AC: Mischung gleicher Proteinmengen aus Zellpool A und Zellpool C. d1 ) Die Separation der Proteine aus Zellpool A, Zellpool B, Zellpool C, Mischung AB und Mischung AC geschieht mittels 2D-Gel-Elektropho- rese. d2) In-Gel tryptischer Verdau der separierten Proteine. e1 ) Messung der 15N (bzw. 13C)-Anreicherungen der Proteine an Peptiden, die aus dem tryptischen Verdau der Proteine gewonnen werden (MALDI-TOF-Verfahren). Als Ergebnisse erhält man die m/z- Werte und die Isotopomerenverteilungen der Peptide. e2) Mit MALDI-TOF werden die Isotopomerenverteilungen der Peptide sehr reproduzierbar nachgewiesen. f) Aus den Isotopomerenverteilungen sich entsprechender tryptischer Proteinfragmente aus Zellpool A, Zellpool B, Zellpool C, Mischung AB und Mischung AC werden die Proteinmischungsverhältnisse PM berechnet. Mischungsverhältnisse PM > 1 bzw. PM < 1 sind ein Maß für die Auswirkung der Stimulation auf Proteinhäufigkeiten.
Der Meßbereich PM = 0.1 bis P = 10 kann noch mit einem Fehler < ± 10 % bestimmt werden. Experiment 6:
Quantifizierung von zellulären Proteinumsatzraten bzw. von Einbauraten mit Hilfe von stabilen Isotopen.
Zellpool A: markierte Zellen
Zellpool B: markierte stimulierte Zellen a) Die Zellen aus Zellpool A werden zu einem Zeitpunkt to in ein Medium gebracht, das 15N (bzw. 13C)- angereicherte Aminosäuren enthält. Die 15N-angereicherten Aminosäuren werden ab dem Zeitpunkt to von den Zellen aufgenommen und in die Zellproteine eingebaut. b) Die Zellen aus Zellpool B werden zu einem Zeitpunkt to in ein Medium gebracht, das die stimulierende Substanz und 15N (bzw. 13C)- angereicherte Aminosäuren enthält. Die 15N-angereicherten Aminosäuren werden ab dem Zeitpunkt to von den Zellen aufgenommen und in die Zellproteine eingebaut. c) Zellernten: At0, An, At2, At3,... und Bt0, Btι , Bß, Bt3,...
Zu bestimmten Zeitpunkten ti, t2, t3, ... > t0 werden die Zellen aus den
Kulturmedien entfernt, gewaschen und lysiert. d1 ) Proteinseparation mittels 2D-Gel-Elektrophorese. d2) In-Gel tryptischer Verdau der separierten Proteine. e1 ) Messung der 15N (bzw. 13C)-Anreicherungen der Proteine an Peptiden, die aus dem tryptischen Verdau der Proteine gewonnen werden (MALDI-TOF-Verfahren). Als Ergebnisse erhält man die m/z- Werte und die Isotopomerenverteilungen der Peptide. e2) Mit MALDI-TOF werden die Isotopomerenverteilungen der Peptide sehr reproduzierbar nachgewiesen. f1 ) Aus den Isotopomerenverteilungen entsprechender tryptischer Proteinfragmente aus den Zellernten At0, Atι, A-s, At3,... wird die normale Einbaurate EN = Δ15N / Δt des stabilen Isotops 15N (bzw. EN = Δ13C / Δt für 13C) in die Proteine berechnet. f2) Aus den Isotopomerenverteilungen der tryptischen Proteinfragmente aus den Zellernten Bto, Btι, Bt2, Bt3,... wird die Einbaurate unter Stimulation Es = Δ15N / Δt des stabilen Isotops 15N (bzw. Es = Δ13C / Δt für 13C) in die Proteine berechnet. f3) Aus dem Vergleich der Einbauraten EN versus Es wird die Auswirkung der Stimulation auf die Proteinumsatzrate berechnet.
Experiment 7:
Relative Quantifizierung der Proteinhäufigkeiten von murinen Stammzellen mit Hilfe des stabilen Isotops 15N.
Das Experiment wurde an murinen Stammzellen durchgeführt. Die Bezeichnung der einzelnen Schritte wird entsprechend der vorhergehenden Experimente gemacht. In einem Schritt a) wurden die Proteine von Zellpool A in 15N (ausgehend von der natürlichen 15N- Isotopenhäufigkeit 0,37 %) auf ca. 25 % angereichert. Zellpool B bestand aus Stammzellen mit natürlicher Isotopenzusammensetzung. Nach der Durchführung der Schritte b) - d) wurden in e1 ) und e2) die MALDI-Spektren der tryptisch verdauten Proteine von Zellpool A, Zellpool B und Mischung AB gemessen. Ein Ergebnisbeispiel ist in den Abb. 5 und 6 gezeigt. Die Abbildungen zeigen Peptide aus unterschiedlichen Massenbereichen der zum gleichen Protein gehörigen Massenspektren aus Zellpool A, Zellpool B und aus der Mischung AB. Aus den MALDI-Spektren aus den Abbildungen 5 und 6 wurde mit Hilfe von f) ein Mischungsverhältnis von 1 ,1 :1 mit einer Standardabweichung von ± 6 % für die Mischungsanteile von Zellpool A und Zellpool B in der Mischung AB berechnet. Dies bestätigt innerhalb der Fehlergrenzen das experimentell aufgrund von Pipettierung eingestellte
Mischungsverhältnis von 1 :1. Experiment 8:
Untersuchung von Proteinen des Gehirns in Mäusen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Detektion von sehr geringen Mengen von stabilen Isotopen in Proteinen, wodurch das folgende Experiment ermöglicht wird.
Mäuse werden mit stabilen Isotop-markierten Aminosäuren gefüttert. Im Prinzip kann die Diät eine oder mehrere Aminosäuren der 20 vorkommenden Aminosäuren enthalten. Die markierte Aminosäure kann hierbei vorteilhafterweise zu 99 % mit der stabil markierten Aminosäure angereichert sein. In diesem Versuch wird D10-Leucin eingesetzt, welches nur minimal in andere Produkte metabolisiert wird und einen Massenshift von 10 pro Leucin induziert.
Der Aminosäurepool, der für die Proteinsynthese in der Maus verfügbar ist, speist sich aus dem mit dem Futter aufgenommenen Material und dem Abbau von existierenden Proteinen in Aminosäuren. Da die Biomasse der Proteine in der Maus groß ist, ist eine Inkorporation von mehr als 90 % in neue Proteine schwer zu erreichen.
Die neu synthetisierten Proteine sind chemisch nicht von den bereits existierenden Proteinen unterscheidbar, die keine markierten stabilen Isotope enthalten. Daher werden die stabilen Isotope im Stadium des Aminosäurepools und im Stadium des Gemischs mit den existierenden Proteinen verdünnt.
Nach Beginn der Diät mit den stabilen Isotopen wird die Maus stimuliert. Hierfür wird die Maus einem Lernprogramm unterzogen. Der Lernprozeß ist mit der Synthese von neuen Proteinen in bestimmten Regionen des Gehirns, insbesondere dem Hypocampus, assoziiert. Daher ist ein Lernprogramm mit dem Beeinflussungsmittel gemäß der vorherigen Beschreibung im allgemeinen Teil gleichzusetzen.
Nach dem Lernprozeß der mit den markierten Aminosäuren gefütterten Mäuse wird der Hypocampus extrahiert und die verschiedenen Proteine über ein 2D-PAGE separiert. Anschließend werden die Proteine fragmentiert. Die Analyse erfolgt in Hinblick auf Proteine, die in den Mäusen des Lernprogramms mehr stabile Isotope enthalten als in den Mäusen ohne Lernprogramm. Die Detektion von vermehrten stabilen Isotopen in einem bestimmten Protein indiziert eine translationale Hochregulierung des Proteins als Reaktion auf den Stimulus, also auf das Lernen.
Angenommenerweise beträgt der Anstieg für ein bestimmtes Protein 10 %, und dieses neu synthetisierte Protein weist 50 % Markierungseffizienz auf. Daraus folgt, daß der Anstieg des stabilen Isotops in den Pool dieses Proteins 5 % ausmacht. Unter diesen Umständen ist weder ein 2D-PAGE noch konventionelle Massenspektrometrie-Quantifizierung in der Lage, diese Veränderung zu detektieren. Das erfindungsgemäße Verfahren hingegen kann dieses Protein, welches in der Antwort auf den Stimulus involviert ist, identifizieren.
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der Proteinhäufig- keiten gleichartiger Proteine in einer ersten (a) und einer mindestens zweiten (b) Probe, mit den Schritten:
Markieren der Proteine mindestens einer Probe mit stabilen
Isotopen,
Herstellung einer Proteinmischung (c) bekannter Proteinmengen aus der ersten (a) und der mindestens zweiten (b) Probe, getrennte Separation der Proteine der ersten Probe (a), der Proteinmischung (c) und der mindestens zweiten Probe (b) mit Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D- Gels,
Ermitteln der Isotopomerenverteilung der Proteine aus den Proben (a), (b) und (c) durch Massenspektrometrie, insbesondere durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie, und Berechnung der Verhältnisse der Proteinhäufigkeiten zwischen der ersten (a) und der mindestens zweiten (b)
Probe aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine der Proben vor oder nach der Separation fragmentiert werden, insbesondere durch spezifische Spaltung oder Verdau der Proteine.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben aus einem in vivo-System stammen, insbesondere ein in vivo-System sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Markieren in vivo erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Probe vor der Herstellung der Proteinmischung mit mindestens einem Beeinflussungsmittel beeinflußt, insbesondere stimuliert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Beeinflussungsmittel eine Veränderung der Syntheserate von mindestens einem Protein in der Probe bewirkt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere zur Bestimmung der Einbaurate von mit stabilen Isotopen markierten Substanzen, insbesondere von Aminosäuren, in Proteine mit den Schritten:
Mischen der markierten Substanzen mit den Zellkulturen, Gewinnung von mindestens einer Proteinernte durch Entnahme der Proteine zu mindestens einem bestimmten Zeitpunkt, getrennte Separation der Proteine der jeweiligen Proteinernten mit Hilfe eines Separationsmittels, insbesondere eines 2D-Gels, gegebenenfalls Gewinnung von Fragmenten der separierten Proteine der jeweiligen Proteinernten durch spezifische
Spaltung oder Verdau, insbesondere tryptischen Verdau, der Proteine vor oder nach der Separation, Ermitteln der Isotopomerenverteilung der Fragmente der jeweiligen Proteinernten durch Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Berechnung der Einbaurate der Substanz aus den ermittelten Isotopomerenverteilungen der jeweiligen Proteinernten.
8. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 7 zur Bestimmung der. Auswirkung mindestens einer Beeinflussung, insbesondere einer Stimulation, auf die Proteinhäufigkeitsverhältnisse gleichartiger Proteine in einer ersten und einer mindestens zweiten markierten Probe, wobei mindestens eine der Proben mit mindestens einem Beeinflussungsmittel beeinflußt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Einbauraten der Substanz für die jeweilige Probe ermittelt werden und die Auswirkung der Beeinflussung durch Bildung des Verhältnisses der jeweiligen Einbauraten bestimmt wird.
9. Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von stabilen Isotopen in Molekülen, insbesondere in Proteinen oder Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Isotopomerenverteilung der Moleküle durch Massenspektrometrie ermittelt und die Anreicherung der stabilen Isotope durch Vergleich der ermittelten
Isotopomerenverteilung mit mindestens einer Referenzverteilung der Moleküle berechnet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzverteilung die theoretische, insbesondere natürlich vorkommende Isotopomerenverteilung der Moleküle ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekülzusammensetzung auf Basis des Massen-Fingerprints der Moleküle ermittelt und die theoretische Isotopomerenverteilung der Moleküle rechnerisch anhand der Molekülzusammensetzung und/oder mit Hilfe einer Datenbank bestimmt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzverteilung aus nicht angereicherten Molekülen und/oder angereicherten Molekülen mit bekannter Anreicherung bestimmt wird.
13. Verfahren zur Bestimmung der unterschiedlichen Anreicherung von stabilen Isotopen in Proteinen, Peptiden und/oder deren Fragmenten in unterschiedlichen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuren und/oder die Fragmente der Proteine und/oder Peptide durch Hydrolyse und anschließende Chromatographie gewonnen, die
Isotopenzusammensetzung der Aminosäuren und/oder der Fragmente bestimmt und aus den bestimmten Isotopenzusammensetzungen die durchschnittliche
Anreicherungsrate bestimmt wird.
14. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine durch Aminosäuren, die mit stabilen Isotopen angereichert wurden, markiert werden.
15. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Isotope 15N, 14C, 13C, 1βO, 34S und/oder 2H2 sind.
16. Verwendung oder Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Isotopenanreicherungen, insbesondere der Markierungsgrad in den gemessenen markierten Peptiden und/oder Proteinen, kleiner als 95 %, vorzugsweise kleiner als 90 %, insbesondere kleiner als 80 %, insbesondere kleiner als 30 %, sind.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lonisationsfähigkeit von zu untersuchenden Molekülen, insbesondere Proteinen und/oder Peptiden, durch Modifikation der Moleküle mit einer ersten
Modifikationssubstanz erhöht wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Modifikationssubstanz O-Methyl-isoharnstoff ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Modifikationssubstanz Nicotinyl-N-hydroxysuccinimid ist.
20. Verfahren zum Nachweis von Molekülen, insbesondere Phosphoproteine und/oder Phosphopeptide, die mindestens eine
Phosphogruppe enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphogruppe der Moleküle durch Schwefel, bevorzugt schwefelhaltige Alkylgruppen, ersetzt wird und der Nachweis durch die Verschiebung des Schwerpunkts der Isotopomerenverteilung der Moleküle zu schwereren Massen hin erfolgt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die lonisationsfähigkeit der Moleküle durch eine zweite Modifikationssubstanz erhöht wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der zweiten Modifikationssubstanz um ein Alkylierungsreagenz, vorzugsweise um 3-(Acrylamidopropyl)- trimethylammoniumchlorid, handelt.
23. Verfahren zur Ermittlung von qualitativen Informationen über Proteine und/oder Peptide in Proben, insbesondere in biologischen Proben mit Zellen und/oder Zellsystemen, insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteine und/oder Peptide mit zwei oder mehr stabilen isotopmarkierten Aminosäuren markiert werden, umfassend die Verfahrensschritte:
Behandeln mindestens einer Probe mit mindestens einem Beeinflussungsmittel vor und/oder nach der Markierung der Proteine und/oder Peptide in der Probe,
Ernten der Zellen und/oder Zellsysteme, Messung von einem oder mehreren Proteinen und/oder Peptiden durch Massenspektrometrie, Ermitteln der verschiedenen Isotopomeren-Verteilungen (RIA) für ausgewählte oder alle gemessenen Proteine und/oder Peptide einer Probe,
Analyse der Isotopomeren-Verteilungen zur Errechnung der qualitativen Informationen.
24. Verfahren zur Ermittlung von qualitativen Informationen über Proteine und/oder Peptide in mindestens zwei Proben, insbesondere biologischen Proben mit Zellen und/oder Zellsystemen, insbesondere nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proteine und/oder Peptide mit mindestens einer stabilen isotop-markierten
Aminosäure markiert werden, umfassend die Verfahrensschritte: Behandeln jeder Probe mit mindestens einem Beeinflussungsmittel vor und/oder nach der Markierung der Proteine und/oder Peptide in der Probe, - Ernten der Zellen und/oder Zellsysteme, Messung von mindestens zwei, insbesondere mindestens vier, vorzugsweise mindestens sechs Peptiden und/oder Proteinen von jeder Probe durch Massenspektrometrie, Ermittlung der verschiedenen Isotopomeren-Verteilungen (RIA) für ausgewählte oder alle gemessenen Proteine und/oder Peptide in einer ersten und mindestens einer zweiten Probe,
Analyse der Isotopomeren-Verteilungen zur Errechnung der qualitativen Informationen.
25. Verfahren zur Bestimmung des Verhältnisses der Proteinhäufigkeiten gleichartiger Proteine in einer ersten und mindestens einer zweiten Probe, insbesondere biologischen Probe mit Zellen und/oder Zellsystemen, wobei mindestens eine Probe mit mindestens einer stabilen Isotop-markierten Aminosäure markiert wird, umfassend die Verfahrensschritte:
Behandeln jeder Probe mit mindestens einem Beeinflussungsmittel vor und/oder nach der Markierung der Proteine und/oder Peptide in der Probe, - Ernte der Zellen und/oder Zellsysteme,
Mischung von Aliquots der Proben mit jeweils gleichem
Proteingehalt,
Messung von mindestens zwei, insbesondere mindestens vier, vorzugsweise mindestens sechs Proteinen der einzelnen Proben und der Mischungen der Proben durch
Massenspektrometrie,
Ermittlung der verschiedenen Isotopomeren-Verteilungen für ausgewählte oder alle gemessenen Proteine in einer ersten und mindestens einer zweiten Probe, - Analyse der Isotopomeren-Verteilungen zur Errechnung des
Verhältnisses der Proteinhäufigkeiten in jeder Probe unter Verwendung der Isotopomeren-Verteilungen der Proteine aus den mindestens zwei Proben und der Mischung der Proben.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Markierung ein Gemisch von zwei oder mehr verschiedenen markierten Aminosäuren, insbesondere unterschiedlich markierten Aminosäuren, eingesetzt wird.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Markierung eine stabile Isotopenquelle, die keine Aminosäure ist, eingesetzt wird, insbesondere demarkierter Zucker und/oder 15N-Atmosphäre.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide und/oder Proteine nach der
Markierung und vor der massenspektrometrischen Messung ein- oder mehrfach fragmentiert werden.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide und/oder Proteine in einem oder mehreren Trennungsschritten nach der Behandlung mit einem Beeinflussungsmittel und vor der massenspektrometrischen Messung aufgetrennt werden.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß MALDI-Ionisierung und/oder Electrospray- lonisierung für die massenspektrometrische Analyse mit zwei oder mehr Quadrupolen, „time of flight", „iontrap" und/oder „ioncyclotron" für die lonentrennung kombiniert wird.
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