DE10158860A1

DE10158860A1 - Massenspektrometrische Proteingemischanalyse

Info

Publication number: DE10158860A1
Application number: DE10158860A
Authority: DE
Inventors: Detlev Suckau; Peter Hufnagel; Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2001-11-30
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2003-06-18
Anticipated expiration: 2021-12-01
Also published as: US20030124606A1; GB0227671D0; DE10158860B4; GB2387653B; GB2387653A; US7070949B2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Analyse von komplexen Proteingemischen wie beispielsweise ganzen Proteomen, dabei insbesondere das schnelle Auffinden bisher unbekannter oder expressionsauffälliger Proteine, durch gemeinsamen enzymatischen Verdau, nachfolgende chromatographische Trennung und massenspektrometrische Analyse der Verdaupeptide. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, Fraktionen der durch Flüssig-Chromatographie getrennten Verdaupeptide einer zeitlich von der Chromatographie getrennten massenspektrometrischen Analyse in einem Tandem-Flugzeitmassenspektrometer mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) zu unterziehen. Dieses Verfahren findet ein Vielfaches der Proteine, die durch das bislang vorherrschende Verfahren der zweidimensionalen Gel-Elektrophorese mit nachfolgender Flugzeitmassenspektrometrie gefunden werden, es beseitigt ferner den Zeitdruck, der bei Echtzeit-Analysen in LC-MS-Kopplungen herrscht, und es erlaubt durch Zwischenbewertungen die Reduzierung der Messungen auf die interessierenden Proteine.

Description

Die Erfindung betrifft die Analyse von komplexen Proteingemischen wie beispielsweise ganzen Proteomen, dabei insbesondere das schnelle Auffinden bisher unbekannter oder expressionsauffälliger Proteine, durch gemeinsamen enzymatischen Verdau, nachfolgende chromatographische Trennung und massenspektroinetrische Analyse der Verdaupeptide.
Die Erfindung besteht darin, Fraktionen der durch Flüssig-Chromatographie getrennten Verdaupeptide einer zeitlich von der Chromatographie getrennten massenspektrometrischen Analyse in einem Tandem-Flugzeitmassenspektrometer mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) zu unterziehen. Dieses Verfahren findet ein Vielfaches der Proteine, die durch das bislang vorherrschende Verfahren der zweidimensionalen Gel- Elektrophorese mit nachfolgender Flugzeitmassenspektrometrie gefunden werden, es beseitigt ferner den Zeitdruck, der bei Echtzeit-Analysen in LC-MS-Kopplungen herrscht, und es erlaubt durch Zwischenbewertungen die Reduzierung der Messungen auf die interessierenden Proteine.

Stand der Technik

Ein Proteom ist als Gemeinschaft aller Proteine eines Zelltyps unter genau definierten Randbedingungen definiert. Da es in höheren Lebewesen einige Hundert Zelltypen gibt, gibt es auch Hunderte von Proteomen. Dabei gibt es Proteine, die allen Zelltypen des Lebewesens gemeinsam sind (housekeeping proteins), und solche, die für einen Zelltyp spezifisch sind. Das Proteom ist zudem nicht unveränderlich, es ändert sich qualitativ und quantitativ mit den Randbedingungen, wie beispielsweise dem Alter oder einem Stress des Zellverbandes durch die Gabe von Medikamenten.
Von besonderem Interesse sind naturgemäß die bisher noch nicht bekannten Proteine eines Proteoms, sowohl für ihre Verwendung als pharmazeutische Zielproteine (Targets), wie auch als mögliche eigenständige Wirkstoffe, also als Pharmaka geeignete Proteine. (Ein Beispiel für ein als Pharmakon geeignetes Protein ist Insulin; es gibt jedoch zahlreiche weitere Beispiele). Besonders die als Wirkstoffe geeigneten Proteine sind vorwiegend in nur sehr geringen Konzentrationen vorhanden und entgehen vielfach der klassischen Methode der Proteomanalytik.
Ebenfalls von hohem Kenntniswert für das Funktionieren der Zellverbände sind solche Proteine, deren Quantität sich bei Belastungen des Zellverbandes, beispielsweise durch Alterung, Pharmaka oder Krankheiten, ändert.
Säugetiere besitzen geschätzt weit über Hundertausend Proteine, deren Baupläne in etwa 30 000 bis 40 000 Genen zu finden sind. Es gibt Abschätzungen, dass aus einem Gen allein so genanntes "Splicing" im statistischen Schnitt etwa dreieinhalb verschiedenartige Proteine entstehen; hinzu kommen weit mehr Proteine durch posttranslationale Modifikationen. Ein Proteom enthält einige Tausend bis einige Zehntausend Proteine. Von den Proteinen des Menschen sind heute nicht einmal die Hälfte bekannt.
Bisherige Analysenverfahren für die Proteine eines Proteoms stützten sich im Wesentlichen auf eine Trennung der gelösten Proteine durch 2D-Gel-Elektrophorese, Ausstanzen der angefärbten Proteine, enzymatischem Verdau im Gelstückchen und nachfogender MALDI- Massenspektrometrie der Verdaupeptide in Flugzeitmassenspektrometern, wobei sowohl präzise Massen der Verdaupeptide wie auch, durch die so genannte PSD-Methode (post source decay), in etwas aufwendiger Weise Tochterionenspektren der Verdaupeptide gewonnen werden können. Die Proteine können über die präzisen Massen der Verdaupeptide in Proteinsequenzdatenbanken gefunden werden, wenn sie denn in ihnen enthalten sind. Bei Mehrdeutigkeiten der Identifizierung können Tochterionenspektren einzelner Verdaupeptide hinzugezogen werden. Ist das Protein nicht in der Proteinsequenzdatenbank enthalten, so bleibt eine Suche in EST-Daten (Expressed Sequenz Tags), die aus RNA gewonnen wurden, in cDNA-Daten oder in den DNA-Daten des Genoms.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass die Zugehörigkeit der Verdaupeptide zu einem Protein durch das Verfahren selbst gegeben ist, zumindest dann, wenn die Auftrennung durch die 2D- Gel-Elektrophorese genügend gut war. Es werden aber von einem Protein in der Regel nur 10 bis etwa 70 Prozent der Sequenz durch Verdaupeptide abgedeckt; vorwiegend eher unter 50 Prozent. Diese Sequenzabdeckung wird "Coverage" genannt. Ist das Protein in der Datenbank enthalten, so genügt wie geschildert für eine Identifizierung oft allein die Kenntnis der präzisen Massen einiger Verdaupeptide; bei mehrdeutigen Resultaten, die vor allem bei nicht genügend genauer Massenbestimmung vorkommen, führt ein zusätzliches Tochterionenspektrum eines Peptids, das dessen Aminosäuresequenz wiederspiegelt, zu gesicherter Identifizierung.
Es werden im 2D-Gel durchaus einige Tausend Spots angefärbt und gefunden, wobei sich allerdings während der Analysen herausstellt, dass es sich nur um etwa maximal Tausend (meist nur einige Hundert) verschiedene Proteine handelt, die mit diesem Verfahren in einem Proteom analytisch gefunden werden. Ein Proteom sollte aber erwartungsgemäß ein Vielfaches an Proteinen umfassen.
Ein anderes, eingeführtes analytisches Verfahren betrifft die Analyse von Gemischen einiger weniger Proteine durch den Verdau aller Proteine dieses Gemischs, flüssigkeitschromatographische Trennung der Verdaupeptide, Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI) und automatische MS/MS-Verfahren zur Peptidstrukurbestimmung in Ionenfallenmassenspektrometern oder Quadrupol-Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometern.
Bei diesem gemeinsamen Verdau der Proteine und der flüssigchromatographischen Auftrennung ist die Zuordnung der Peptide zu einem Protein nicht mehr durch das Analysenverfahren allein gegeben, hier kann die Zugehörigkeit verschiedener Verdaupeptide zu einem Protein erst durch die Suche in den Datenbanken erfolgen. Für die Suche in den Datenbanken und für das Zusammensuchen der zu einem Protein zugehörigen Peptide sind inzwischen sehr gute Programme entwickelt worden.
Dieses Verfahren der Echtzeit-LC/MS-Analyse läuft in Ionenfallen-Massenspektrometern oder in Flugzeitspektrometern mit orthogonalem Einschuß und einer Vortrennung und Fragmentierung in vorgeschalteten Quadrupolfiltern. Diese Geräte haben eine Aufnahmedauer für Tochterionenspektren von etwa ein bis zwei Sekunden. Daher können in einem hochauflösenden Flüssigkeitchromatogramm mit etwa zehn Sekunden Peakbreite nur maximal fünf, meist wesentlich weniger verschiedene Tochterionenspektren aufgenommen werden. Diese Verfahren sind daher auf niederkomplexe Proteingemische beschränkt. Es lassen sich Gemische mit etwa fünf bis zehn Proteinen noch gut analysieren, komplexere Gemische, etwa ein ganzes Proteom mit einigen Zehntausend Proteinen oder auch nur ein Teilproteom mit einigen Tausend Proteinen, lassen sich so nicht mehr analysieren. Das durchaus vielfach angewandte Verfahren der Echtzeit-LC-MS-Analyse wird durch den Zeitdruck, der durch die Chromatographie vorgegeben wird, in ihrer Anwendbarkeit eingeschränkt. Auch so genannte "stop- flow"-Methoden sind nur beschränkt hilfreich, da sie die Tennfähigkeit der Chromatographie einschränken.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die grundlegende Aufgabe der Erfindung, in einem Gemisch von Proteinen weitaus mehr Proteine zu finden und zu identifizieren, als das mit bisherigen Verfahren möglich ist. Es ist eine weitergehende Aufgabe der Erfindung, während der Analyse bereits die im Sinne der Analysenaufgabe interessierenden Proteine zu erkennen und von den vielen nicht interessierenden Proteinen des Gemischs zu unterscheiden. Noch weitergehend ist die Aufgabe, diese Kenntnis der interessierenden Peptide zu verwenden, um die Anzahl der zu messenden Spektren im Sinne der analytischen Zielsetzung einzuschränken.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren für die massenspektrometrische Analyse eines komplexen Proteingemisches besteht aus folgenden Schritten:

a) es findet ein gemeinsamer enzymatischer Verdau aller Proteine des Proteingemisches statt,
b) die Verdaupeptide der Mischung werden flüssigchromatographisch getrennt, vorzugsweise mit möglichst hochauflösenden Säulen,
c) es werden Fraktionen der chromatographischen Trennung einzeln aufgefangen, vorzugsweise eine sehr hohe Anzahl einzelner Fraktionen (1000 bis 3000), wobei für sehr komplexe Gemische in jeder Fraktion immer noch eine größere Anzahl (bis zu 20 oder 30) von Verdaupeptiden zu finden sind,
d) die Mischungen der Verdaupeptide aus den einzelnen Fraktionen werden zusammen mit Matrixsubstanz auf je eine Stelle eines Probenträgers für ein Flugzeitmassenspektrometer präpariert,
e) die Verdaupeptide der Proben werden durch durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) ionisiert, es werden die Flugzeiten der Ionen im Flugzeitmassenspektrometer gemessen und aus den Flugzeiten werden die Massen der Verdaupeptid-Ionen bestimmt (die hier erzeugten Spektren heißen Verdaupeptidspektren),
f) es werden Tochterionenspektren aller oder ausgewählter Verdaupeptid-Ionen der Proben durch MALDI-Tandem-Flugzeitmassenspektrometrie gemessen, wobei die Tochterionen ionisierte Fragmente der Verdaupeptid-Ionen sind, und
g) die zugehörigen Proteine werden durch Suche in Proteinsequenz-, EST-, cDNA- oder DNA-Datenbanken identifizert.

Dieses Verfahren unterscheidet sich von dem oben geschilderten Verfahren der Kopplung zwischen Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie grundlegend dadurch, dass hier sowohl die Verdaupeptidspektren wie auch die Tochterionenspektren nicht während des Chromatographie-Laufs, sondern zeitlich und instrumentell entkoppelt später gemessen werden. Dadurch können, wenn das Massenspektrometer empfindlich genug misst und der Substanzvorrat in einer Probe ausreicht, alle Verdaupeptide nacheinander einer Tochterionenmessung zugeführt werden, ohne dass der durch die Chromatographie zwangsläufig gegebene Zeitdruck eine Rolle spielt. Außerdem werden hier zunächst alle Verdaupeptidspektren gemessen, diese können ausgewertet werden und erst dann werden die Tochterionenspektren gemessen, wobei letztere auch noch in beliebiger Reihenfolge gemessen werden können. Dieser höchst entscheidende Unterschied zu Echtzeit-LC-MS-Analysen erlaubt es, die Messung von Tochterionenspektren auf die interessierenden Peptide einzuschränken.
Gegenüber der Trennung durch 2D-Gel-Elektrophorese werden mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren etwa vier- bis fünfmal so viele Proteine in einem Proteom gefunden. Geeignete Programme setzen die Verdaupeptide nach erfolgreicher Suche in Proteinsequenz-, cDNA- oder Genomdatenbanken wieder zu Proteinen zusammen.
Es muss dabei in Schritt (a) nicht ein ganzes Proteom als Proteingemisch gemeinsam verdaut werden; es ist oft vorteilhaft, vorher eine grobe Vortrennung in Teilproteome vorzunehmen. Vorzugsweise können dabei subzelluläre Teilproteome verwendet werden, wie sie beipielsweise durch mechanischen oder Ultraschall-Aufschluss eines Zellverbandes mit nachfolgendem Zentrifugieren hergestellt werden können. Diese subzellulären Teilproteome enthalten dann jeweils die Proteine einzelner Zellbestandteile, beispielsweise die Proteine bestimmter Organellen wie Zellkern, Lysosom oder Golgi-Apparat. Es können aber auch Teilproteome durch Chromatographie oder Elektrophorese, insbesonder durch "free flow electrophoresis", hergestellt werden. Von besonderem Interesse sind auch Teilproteome, die durch Affinitätsextraktion von Proteingruppen hergestellt werden.
Insbesondere kann das in Schritt (a) gemeinsam verdaute Proteingemisch auch aus der Mischung der gleichen Teilproteome zweier verschieden gestresster Zellverbände bestehen, deren Proteine vor der Mischung mindestens teilweise jeweils mit massenspektrometrisch unterscheidbaren Markern modifiziert wurden. Eine Kombination aus Modifikationen der Proteine zweier Zellverbände mit einer Affinitätextraktion kann insbesondere durch eine Derivatisierung der Proteine mit "isotopencodierten Affinitäts-Tags" (ICAT) durchgeführt werden. Die Affinitätsextraktion kann auf die Proteine vor dem Verdau, bevorzugt aber auf die Verdaupeptide nach dem Verdau, also zwischen den Schritten (a) und (b), angewandt werden. Diese Methode kann insbesondere für das Studium von quantitativen Protein- Expressionsunterschieden in zwei verschiedenen Proteomen, beispielsweise aus einem gesunden und einem gestressten Zellverband, verwendet werden (R. Aebersold et al., WO 0011208). Der Stress kann beispielsweise durch Alterung, Temperatur, chemische Behandlung (Pharmaka) oder Krankheit hervorgerufen worden sein.
Das Auffangen der chromatographischen Fraktionen in Schritt (c) kann vorteilhaft direkt auf der Probenträgerplatte geschehen, die bereits vorher mit peptid-affinen, möglichst wasserunlöslichen Matrixsubstanzen belegt wurden. Die Präparation in Schritt (d) besteht dann beispielsweise in nachfolgenden Waschvorgängen und einem Einbau der Verdaupeptide in die Matrixkriställchen durch kurzes Anlösen der Kriställchen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel. Die Sequenzüberdeckung der Proteine durch die gefundenen Peptide (coverage) ist, besonders durch das Auffangen der Fraktionen auf der Probenträgerplatte, besser als durch das Verfahren der Trennung mit 2D-Gel-Elektrophorese und anschließender MALDI- Flugzeitmassenspektrometrie.
Es können in Schritt (f) alle Peptide einer Probe jeweils einer Messung ihres Tochterionenspektrums unterzogen werden. Es besteht für Proben mit einer Vielzahl an Peptiden aber die Möglichkeit der Erschöpfung der Probe. Daher kann es vorteilhaft sein, durch ein intelligentes Auswahlverfahren nur die für das Analysenverfahren günstigsten Peptide dieser Messung der Tochterionenspektren zu unterziehen.
Zielt das Analysenverfahren auf das Auffinden neuer, unbekannter, in einer Referenzproteinsequenzdatenbank nicht enthaltener Proteine ab, so wird hier im Rahmen der Erfindungsaufgabe folgendes intelligente Auswahlverfahren vorgeschlagen:
Nach Schritt (e) sind die Massen aller Verdaupeptide aller Proben auf der Probenträgerplatte bekannt. Es werden nun zunächst von einem Programm die Proben herausgesucht, die nur eine kleine Anzahl von Verdaupeptiden, beispielsweise höchstens vier Verdaupeptide, enthalten. Diese werden nun zunächst in einem ersten Messdurchlauf einer Tochterionenmessung unterzogen. Nach jeder Messung eines Tochterionenspektrums wird dieses einer Suchmaschine zugeführt, die das zugehörige Protein in der Proteinreferenzdatenbank sucht. Da die Spezifität der Suche mit derartigen Spektren außerordentlich hoch ist, ist die Identifizierung in aller Regel eindeutig, wenn das Protein in der Datenbank vorhanden ist. Die durch eine Suchmaschine gefundene Proteinstruktur wird dann von einem Rechenprogramm einem virtuellen Verdau nach den bekannten Regeln für das verwendet Enzym unterzogen, die Massen der Verdaupeptide werden berechnet, und in dem Vorrat aller gemessenen Massen aus allen Proben werden die Peptide mit diesen Massen als bereits bekannt markiert. Zusätzlich können auch aus der bekannten Struktur der virtuellen Verdaupeptide ihre chromatographischen Retentionszeiten berechnet werden, die eine gezielte Einschränkung der Markierungen in der sehr hohen Zahl von Peptidmassen zulassen.
Nachdem die Proben mit geringen Anzahlen an Peptiden in einem ersten Messdurchlauf abgearbeitet sind, können jetzt für einen zweiten Messdurchlauf diejenigen Proben herausgesucht werden, in denen jetzt nur noch eine geringe Anzahl von nicht als bekannt markierten Peptiden übriggeblieben sind. In dieser Weise wird die Anzahl der Peptide, für die Messungen der Tochterionenspektren notwendig sind, in weiteren Messdurchläufen immer weiter verringert. Schließlich bleiben auch für Proben, die eine sehr hohen Anzahl von Peptiden enthalten, nur eine mäßig große Anzahl von Peptiden zur Messung der Tochterionenspektren übrig.
Die Gesamtheit der Peptide, die nicht zu bekannten Proteinen der Datenbank zugehören, gehören zu unbekannten Proteinen, die schließlich für ihre Identifizierung und die Bestimmung ihrer Zusammengehörigkeit einer Suche in einer EST-, cDNA- oder Genomdatenbank unterworfen werden müssen. Ist auch diese Suche erfolglos, können die Daten einer de-novo- Sequenzierung unterworfen werden.
Befinden sich die Verdaupeptide eines Chromatographie-Laufs nicht auf einer einzigen Probenträgerplatte, so können auch hier durch Wechseln der Probenträgerplatten zunächst die Massenspektren der Verdaupeptide, und dann erst die Tochterionenspektren der Verdaupeptide gemessen werden. Besonders bevorzugt können die verschiedenen Probenträgerplatten auch verschiedenen Massenspektrometern zur gleichzeitigen Analyse zugeführt werden, wobei dann die Ausschlussmarkierungen der bekannten Peptide gemeinsam für alle Proben auf allen Probenträgern vorgenommen werden.
Für Expressionsanalysen an Gemischen aus zwei Proteomen oder Teilproteomen kann die intelligente Auswahl der zu messenden Tochterionenspektren auf den Intensitätsunterschieden der jeweils gleichen, aber isotopisch verschieden markierten Peptide beruhen. Auch hier kann die Anzahl der notwendigerweise zu messenden Tochterionenspektren durch die Kenntnisse über die Identität der Proteine aufgrund von Tochterionenspektren einzelner Verdaupeptide verringert werden.
Es sei hier betont, dass die intelligente Auswahl der Verdaupeptide für eine Messung ihrer Tochterionenspektren, sei es für die Suche nach unbekannten Proteinen, sei es für das Studium von Expressionsunterschieden in verschieden gestressten Zellverbänden, allein durch die erfindungsgemäße Trennung der Chromatographie und der nachfolgenden Tandem-Flugzeitmassenspektrometrie möglich gemacht wird.

Bevorzugte Ausführungsformen

Es wird hier im Detail zunächst eine Ausführungsform des Verfahrens geschildert, das von subzellulären Teilproteomen ausgeht und besonders auf die schnelle Entdeckung von bisher unbekannten Proteinen, die nicht in einer Referenzdatenbank der Proteinsequenzen enthalten sind, ausgerichtet ist. Das Analysenziel ist also das Auffinden unbekannter Proteine.
In dieser Ausführungsform werden die Zellbestandteile eines Zellverbandes beispielsweise durch Ultraschall-Aufschluss unter Zufügen von Detergentien freigesetzt und durch Zentrifugieren in einige Teilproteome aufgetrennt, wobei verschiedene Organellen durch ihre verschiedene Dichte getrennt werden. Es können dabei leicht etwa zehn bis zwanzig Teilproteome hergestellt werden. Die Trennung wird möglichst so gewählt, dass in den Teilproteomen grob etwa die gleichen Anzahlen an Proteinen zu finden sind; doch ist das nicht Voraussetzung. Die Erfahrung zeigt, dass sich die Proteine in den Teilproteomen meist charakteristisch unterscheiden, es werden also - bis auf einen Stamm ubiquitärer Proteine - spezifische Proteine der verschiedenen Teilproteome gefunden. In üblicher Weise werden die Proteine dann beispielsweise durch Behandeln mit Harnstoff solubilisiert und in wässrige Lösung gebracht.
Ein subzelluläres Teilproteom kann aber auch anderen Ausgangsmaterialien als Zellverbänden hergestellt werden, beipielsweise aus einer einzelnen Zelle. Gleichzusetzende Teilproteome können auch aus Blut oder Liquor hergestellt werden.
Diese Teilproteome werden dann tryptisch verdaut, wobei jeweils einige Tausend bis Zehntausend Verdaupeptide entstehen. Ein "tryptischer" Verdau ist ein Verdau durch das Enzym Trypsin, das die Proteine spezifisch jeweils C-terminal an den beiden basischen Aminosäuren Lysin und Arginin zerschneidet. Die Verdaupeptide haben mittlere Größen von etwa zehn Aminosäuren (leicht abhängig vom statistischen Anteil von Lysin und Arginin im Proteom), die Größen variieren in einer Poisson-Verteilung von einer Aminosäure bis zu etwa 40 Aminosäuren. Die Mehrzahl der Peptide ist im Massenbereich von 800 bis 4000 atomaren Masseneinheiten gut mit MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie vermessbar. Die Verdaupeptide überdecken relativ gleichmäßig den Bereich von extremer Hydrophilität bis zu extremer Hydrophobizität.
Die Verdaupeptide dieser Teilproteome werden je einer langsamen, hochauflösenden Flüssigkeitschromatographie zugeführt, wobei beispielsweise eine Flussrate von etwa zehn bis zwanzig Mikrolitern pro Minute eingestellt wird. Es wird eine "reversed-phase" Chromatographie gewählt, die im Wesentlichen nach Hydrophobie und Hydrophilie trennt. Dadurch ergibt sich eine relativ gleichmäßige Auftrennung der Verdaupeptide über die Zeit. Die Chromatographie mit zehn bis zwanzig Mikroliter pro Minute gilt als relativ leicht handzuhabende Chromatographie. Je nach der Menge an Ausgangsmaterial für die Extraktion der Proteome oder Teilproteome können auch andere Arten der Flüssigkeitschromatographie eingesetzt werden, beipielsweise Mikro- oder Nano-Flüsigkeitschromatographie.
Das Eluat aus der chromatographischen Säule wird über eine dünne Kapillare direkt einer massenspektrometrischen Probenträgerplatte zugeführt. Bei Mikro- oder Nano-LC empfiehlt sich ein Auftragen der Eluate auf die Probenträgerplatte durch Tröpfchen-Dispenser, beispielsweise Piezo-Dispenser, da hier die Flussraten geringer sind.
Es gibt kommerzielle Flugzeitmassenspektrometer, die Probenträgerplatten in der Größe von Mikrotiterplatten verarbeiten. Eine solche Probenträgerplatte kann auf 1536 hydrophilen Ankern (die Durchmesser zwischen etwa 200 und 1000 Mikrometer haben können) in jeweils hydrophober Umgebung vor der Belegung mit Eluat mit dünnen Matrixkristallschichten präpariert werden. Während der Chromatographie werden diese Anker dann in beispielsweise jeweils etwa sechs Sekunden mit je einem bis zwei Mikroliter Eluat belegt, wobei ein Roboter die relative Bewegung zwischen Probenträgerplatte und Kapillarende bewirkt. Die Schicht aus Matrixkriställchen bindet die Verdaupeptide so fest, dass sie anschließend vorsichtig in Wasser gewaschen werden können. Damit die Tröpfchen auf benachbarten Ankern, die jeweils nur 2,25 Millimeter voneinander entfernt sind, nicht in Gefahr laufen, wegen zu geringen Abstands ineinanderzulaufen, kann die Belegung der Ankerflächen durch Belegen nur jeden zweiten Ankers in jeder zweiten Reihe der Platte aufgelockert werden. Die Lücken werden später gefüllt, wenn die zuerst aufgetragenen Tröpfchen getrocknet sind.
Als Matrixsubstanz kann beispielsweise α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure verwendet werden. Diese Substanz ist nicht wasserlöslich, bildet nach Aufbringen aus einer Acetonitril- oder Acetonlösung eine dünne Schicht winziger Kristalle auf der Oberfläche der Probenträgerplatte aus und bindet die Verdaupeptide fest an ihrer Oberfläche (siehe J. Goborn et al., "α-Cyano- 4-Hydroxycinnamic Acid Affinity Sample Preparation. A Protocol for MALDI-MS Peptide Analysis in Proteomics", Anal. Chem. 2001, 73, 434-438). Es können auf geeigneten Probenträgerplatten beipielsweise 1536 kleine Probenflecken, die je mit einer solchen Matrix- Dünnschicht belegt sind, mit den Proben je einer Fraktion beladen werden. Das Eluat mit den Verdaupeptiden wird mit einem Roboter direkt aus der beweglichen Trennkapillare des Flüssigkeitschromatographen auf die Kristalldünnschichten aufgetragen. Die Tröpfchen können vorzugsweise etwa 30 Sekunden nach dem Aufbringen abgezogen werden, mit einer Saugpipette oder mit Filterpapier, um das Eintrocknen von Verunreinigungen zu vermeiden.
Dauert die Chromatographie etwa 2,5 Stunden, so wird bei einer Taktrate von sechs Sekunden gerade eine Probenträgerplatte mit 1536 Ankern belegt. Gibt es beispielsweise zwölf Teilproteome, so können sie auf vier Chromatographen in einer Arbeitsschicht chromatographiert werden und ergeben zwölf Probenträgerplatten, die jeweils ein Teilproteom tragen. Die verschiedenen Verdaupeptide eines Proteins befinden sich in diesem Falle jeweils auf nur einer einzigen Probenträgerplatte, wenn auch in ganz verschiedenen Fraktionen. Das ist wichtig für die spätere Markierung von bereits bekannten Peptiden.
Nach vollständiger Chromatographie können die dann getrockneten Platten mit deionisiertem Wasser, das 0,1-molar mit Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert wurde, gewaschen werden, um alle restlichen Salze und Puffersubstanzen der Chromatographie zu beseitigen. Die Verdaupeptide bleiben dabei an die Matrixkriställchen gebunden. Nach dem Waschen und Trocknen wird auf die Proben jeweils etwa ein halber Mikroliter Lösungsmittel (beispielsweise Ethanol : Aceton : Ameisensäure 6 : 3 : 1) aufpipettiert, um die Matrixkriställchen wieder weitgehend aufzulösen. Die Matrixsubstanz rekristallisiert durch die schnelle Verdunstung des Lösungsmittels sehr schnell und baut dabei die Verdaupeptidmoleküle in ihre Kristallstruktur ein. Dadurch sind sie ideal geeignet für die anschließende massenspektrometrische Analyse mit Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Diese Art der Probenbehandlung vermeidet Zwischengefäße, worin durch Bindungen an der Wand der Gefäße unvermeidbar Verluste an Verdaupeptiden auftreten.
Die Probenträger werden in das Vakuumsystem des Massenspektrometers überführt. Dort werden die Proben jeweils mit einem gepulsten, fokussierten Laserstrahl beschossen, wodurch in einer kleinen Plasmawolke, die vorwiegend aus Matrixmolekülen und einigen wenigen Matrixionen besteht, die Verdaupeptidmoleküle durch so genannte Protonenübertragung ionisiert werden. Die Peptidionen werden dann in das Flugrohr des Massenspektrometers hinein beschleunigt. Im Massenspektrometer wird ihre Flugzeit bis zu einem Ionendetektor sehr präzise bestimmt. In einem etwa 1,5 Meter langem Reflektor- Flugzeitmassenspektrometer lässt sich die Flugzeit auf etwa einige Hundert Picosekunden genau bestimmen, wodurch sich für die Massenbestimmung eine Genauigkeit von etwa zehn bis zwanzig Parts per Million (ppm) ergibt. In jeder Probe, also in jeder der chromatographischen Fraktionen, finden sich bei idealer Ausführung des Verfahrens etwa drei bis dreißig solcher Verdaupeptide.
Während der Spektrenaufnahme der Verdaupeptide werden die Spektren der jeweils letzten Aufnahmen bereits von Flugzeiten auf Massen umgerechnet. Dabei werden auch die Isotopenmuster berücksichtigt, die für jedes Verdaupeptid bestehen. Wie in DE 198 03 309 beschrieben, wird dadurch die Genauigkeit der Massenbestimmung erhöht und es wird für die Isotopengruppe nur eine Masse, die Masse des so genannten monoisotopischen Peaks, bestimmt. Diese Masse wird auch von den Suchmaschinen verwendet. Zur Erhöhung der Massengenauigkeiten können gegebenenfalls auch die Massen von Referenzsubstanzen herangezogen werden, die vor der chromatographischen Aufgabe der Verdaupeptide auf die Anker mit den Matrixsubstanzen aufgebracht sein können. In einem anderen Verfahren der Verbesserung der Massenbestimmung werden Referenzproben in der jeweiligen Nachbarschaft zu den auszuwertenden Proben benutzt. So können von den 1536 Ankerflächen bereits 24, 48 oder 96 gleichmäßig über die Probenträgerplatte verteilte Anker mit Referenzproben besetzt sein, die für die Massenbestimmung herangezogen werden können, beispielsweise, um leichte Unebenheiten der Probenträgerplatte, die die Flugzeiten beeinflussen, ausgleichen zu können. Diese Anker mit Referenzsubstanzen werden bei der Belegung mit Verdaupeptiden übersprungen.
Außerdem wird während der Verdaupeptidspektrenaufnahmen über aufeinanderfolgend belegte Probenanker hinweg untersucht, ob ein Verdaupeptid mehrere MALDI-Proben belegt, weil das Verdaupeptid einen zeitlich breiten chromatographischen Peak bildet, der sich über zwei oder mehr Proben hinwegzieht. In diesen Fällen wird die Probe mit dem intensivsten Spektrum für die späteren Aufnahmen von Tochterionenspektren ausgewählt. Die Verdaupeptidmassen in den anderen Proben werden in einer Liste aller Verdaupeptide in allen Proben als nicht auswertungswürdig markiert.
Für die Aufnahme von Tochterionenspektren sind in den letzten zwei Jahren neue Prinzipien (siehe dazu beispielsweise die Patentschriften DE 198 56 014 A1 und das äquivalente US 6,300,627) und neue Massenspektrometer vom Typ MALDI-Tandem-Flugzeitmassenspektrometer für eine schnelle und besonders substanzsparende Aufnahme der Tochterionenspektren entwickelt worden (für diese Geräte hat sich inzwischen die generische Abkürzung TOF/TOF eingeführt). Diese Tandem-Flugzeitmassenspektrometer bestehen aus einem ersten Flugzeitmassenspektrometer, das zerfallende Elternionen und deren dabei entstehenden Tochterionen selektiert und alle anderen Ionen ausschließt, und einem zweiten Flugzeitmassenspektrometer, das mit Hilfe einer Nachbeschleunigung die entstandenen Tochterionen durch ihre Flugzeiten der Masse nach analysiert. Ebenfalls recht neu sind MALDI-Tandem-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss der Ionen, bei denen das erste, ionenselektierende Massenspektrometer ein Quadrupolfilter ist, dem eine Quadrupol-Stoßkammer für die Fragmenterung der Ionen folgt. Für diese Geräte hat sich die Abkürzung MALDI-Q-TOF eingeführt.
Ohne diese beiden Arten von neuen MALDI-Tandem-Flugzeitmassenspektrometern wäre die jetzige Erfindung nicht ausführbar.
Tochterionen sind ionisierte Fragmente der Verdaupeptid-Ionen, die durch laserinduzierten, metastabilen Zerfall der Verdaupeptid-Ionen oder stoßinduziert in einer Stoßkammer gewonnen werden können. Da die Fragmentierung in der Regel sehr einfachen Regeln folgt, kann aus dem Tochterionenspektrum eines Verdaupeptids zumindestens eine Teilsequenz der Aminosäuren im Peptid gewonnen werden. Die Suchmaschinen können aber auch ohne die Bestimmung einer Teilsequenz die Tochterionenspektren für eine Proteinidentifizierung benutzen.
Trotz der gegenüber bisherigen Verfahren substanzsparenden Aufnahmeverfahren mit diesen neuen Geräten kann sich für solche Proben, die außergewöhnlich viele Verdaupeptide enthalten, der Substanzvorrat in einer Probe erschöpfen, bevor alle Tochterionenspektren aufgenommen worden sind. Es ist daher auch Aufgabe der Erfindung, eine Strategie zu entwickeln, die die Anzahl der aufzunehmenden Tochterionenspektren in einer Probe herabsetzt und die richtigen Peptide zur Messung von Tochterionenspektren auswählt.
Sind die Verdaupeptidspektren (also noch nicht die Tochterionenspektren) aller Proben durchgemessen, so werden die gemessenen Peptidlisten, die jetzt die monoisotopischen Massen und Markierungen der Auswertungswürdigkeit enthalten, einer weiteren Untersuchung zugeführt, während gleichzeitig das Flugzeitmassenspektrometer automatisch auf den Betrieb zur Aufnahme von Tochterionenspektren umjustiert wird. Diese Untersuchung stellt fest, wie viele auswertungswürdige Verdaupeptide sich in den einzelnen Proben befinden. Dabei werden solche Proben, die nur eine kleine Anzahl von auswertungswürdigen Peptiden enthalten, beispielsweise höchstens vier Peptide, für eine sofortige Auswertung in einem ersten Messdurchlauf für Tochterionenspektren markiert.
Nach der Umjustierung des Massenspektrometers auf die Aufnahme von Tochterionenspektren, die zur Stabilisierung der neueingestellten elektronischen Spannungsversorgungen einige Minuten in Anspruch nimmt, werden nun von allen Proben, die für die sofortige Auswertung markiert sind, die Tochterionenspektren der Verdaupeptide gemessen. Nach der Aufnahme eines jeden Tochterionenspektrums wird dieses sofort einer Proteinsuche in der Referenzproteinsequenzdatenbank durch eine Suchmaschine zugeführt. Die Suchmaschine ist ein Programm zur intelligenten Suche in der Datenbank nach dem Protein, das dieses Verdaupeptid enthält. Diese Suche ist normalerweise völlig eindeutig, da die Tochterionenspektren der Verdaupeptide sehr spezifisch für die Proteine sind. Man erkennt auch sofort, ob sich das zugehörige Protein in der Datenbank befindet oder nicht. Die Suche, die normalerweise auf einem eigens dafür bestimmten Server vorgenommen wird, geht sehr schnell, sie dauert in der Regel nur etwa eine Sekunde.
Als Proteinsequenzbibliothek für die bekannten Proteine kann beispielsweise die ständig auf neuestem Stand gehaltene Datenbank "SwissProt™" der Firma GeneBio (Geneva Bioinformatics S. A.), Genf, verwendet werden. Es gibt jedoch auch andere Datenbanken, die hier benutzt werden können, zum Beispiel die Datenbank NCBInr vom National Institute of Health, USA, die neben Proteindaten auch Genomdaten enthält. Als Suchmaschine ist beispielsweise das Programm "Mascot™" der Firma Matrix Science Ltd., London, zu nennen, aber auch hier gibt es mehrere vergleichbare Suchmaschinen auf dem Markt. Die Suche kann über das Internet geschehen, aber auch im eigenen Hause (per "Intranet"), wenn die Datenbank (durch entsprechende Vertragsabschlüsse) und die wöchentlichen Ergänzungen der Datenbank über das Internet auf eigene Server heruntergespielt werden.
Wird ein zugehöriges Protein gefunden, so ist dieses Protein bekannt und damit gemäß der hier angenommenen Analysenzielsetzung für die weitere Analyse uninteressant. Es wird dann die Struktur dieses Proteins aus der Datenbank heruntergeladen, durch ein Programm "virtuell" verdaut, und es werden die präzisen Massen der virtuellen Verdaupeptide berechnet. Außerdem wird die Hydrophobie dieser virtuellen Peptide anhand ihrer Zusammensetzung aus Aminosäuren und deren Reihenfoge bestimmt. Aus der Hydrophobie lässt sich einigermaßen gut die Retentionszeit dieses Peptids für die verwendete "reversed phase"- Chromatographie bestimmen. Es werden nun im jeweiligen Retentionszeitfenster alle Massen der realen Verdaupeptide auf das Vorkommen eines Peptids mit der Masse des virtuellen Verdaupeptids verglichen. Findet man ein solches Peptid, so wird es als bekannt markiert und von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Fehlmarkierungen sind dabei recht selten, können aber durch Bestätigungen weiter herabgesetzt werden.
Schon die Zahl der so für ein Tochterionenspektrum als zugehörig gefundenen proteineigenen Peptide gibt eine Bestätigung dafür, dass die Identifizierung richtig ist. Es kann aber auch zur Bestätigung ein zweites Verdaupeptid desselben Proteins zur Messung des Tochterionenspektrums zugelassen werden, nach Möglichkeit eines, das ebenfalls in einer Probe mit nur wenigen Peptiden liegt. War die Identifizierung zweifelhaft, können die Markierungen zurückgenommen werden.
Sind alle MALDI-Proben für die sofortige, erste Untersuchung durch die Aufnahme der Tochterionenspektren durchgemessen (zur Erinnerung: es handelt sich hier um die Proben, die höchstens vier auswertbare Peptide enthielten), so hat sich auf diese Weise die Anzahl der noch zu messenden Tochterionenspektren in den übrigen MALDI-Proben bereits erheblich reduziert. Es wird nun in einem Rechenprogramm für einen zweiten Messdurchlauf untersucht, welche der restlichen Proben jetzt eine nur geringe Anzahl von Verdaupeptiden zur Aufnahme von Tochterionenspektren besitzen, also von Peptidmassen, die nicht als messunwürdig oder als einem bekannten Protein zugehörig markiert sind. In aufeinanderfolgenden Messdurchläufen wird so die Zahl der zu messenden Tochterionenspektren immer weiter reduziert, so dass auch für die Proben, die eine hohe Anzahl von Peptiden besitzen, die Anzahl der auszuwertenden Peptide auf ein erträgliches Maß heruntergedrückt wird.
Die Gesamtheit der Peptide, die nicht zu bekannten Proteinen der Datenbank zugehören, gehören zu den gesuchten unbekannten Proteinen. Diese müssen schließlich für ihre Identifizierung und die Bestimmung ihrer Zugehörigkeit zu einem Protein einer Suche in einer cDNA- oder DNA-Datenbank unterworfen werden. Als cDNA-Datenbänke stehen die EST- Datenbänke (Expressed Sequence Tags) zur Verfügung, die allerdings meist nicht die vollständige Sequenz des Proteins enthalten. Vollständige cDNA-Datenbänke sind aber im Aufbau. Als DNA-Datenbänke dienen die meist im Internet stehenden Genom-Datenbänke, die für einige Spezies (darunter für den Menschen) einigermaßen vollständig sind.
Es wird durch dieses Ausschlussverfahren nicht nur der Gefahr der Erschöpfung einer Fraktion, also einer MALDI-Probe, begegnet, es wird auch die gesamte Messzeit erheblich herabgesetzt.
Bei durchschnittlich zehn Tochterionenspektren pro Probe und etwa zehn Sekunden Spektrenaufnahme pro Verdaupeptid würde die gesamte Vermessung einer Probe durchschnittlich fast zwei Minuten dauern, die Vermessung aller 1536 Fraktionen mit etwa 15000 Verdaupeptiden im vollautomatischen Betrieb etwa zwei volle Tage. Das gilt für jetzt kommerziell erhältliche Geräte. Für künftige Weiterentwicklungen ist zu erwarten, dass die 1536 Fraktionen einer Probenträgerplatte unter obigen Konditionen in rund zwölf Stunden aufgenommen werden können. Diese Zeit ist außerordentlich lang. Wird die Anzahl der Tochterionenspektren aber durch intelligente Auswahl auf etwa vier Spektren pro Probe herabgedrückt, so wird die Analyse eines Proteoms oder Teilproteoms auf einer Probenträgerplatte mit künftigen Geräten auf weniger als etwa sechs Stunden möglich sein.
Die zwölf Probenträgerplatten mit den Teilproteomen unseres Beispiels werden dann mit automatischem Nachschub der Probenträgerplatten in drei Tagen durchgemessen werden können. Diese Zeit ist immer noch sehr lang, da die Probenqualität auf den Probenträgerplatten im Verlauf von Tagen langsam abnimmt. Es ist daher zweckmäßig, für diesen Zweck drei Massenspektrometer parallel einzusetzen, die die Analysenaufgabe in einem Tag schaffen. Für das Durchsuchen eines Proteoms nach neuen Proteinen ist das eine bisher unerreicht kurze Zeit.
Die Anzahl von Proteinen, die mit diesem Verfahren insgesamt gefunden werden, ist um ein Mehrfaches größer als mit bisherigen Verfahren gefunden werden können. Die Überdeckung (Coverage) der Proteine mit Verdaupeptiden ist ebenfalls größer. Es können damit nicht nur mehr Proteine als bisher in einem Proteom gefunden werden, es können auch mehr Unterschiede zu den in den Datenbanken vorhandenen Sequenzen gefunden werden. Damit ist dieses Verfahren vielfach mächtiger als die bisher verwendeten Verfahren.
Von diesem Verfahren gibt es viele mögliche Variationen.
So können die chromatographischen Fraktionen zwischenzeitlich in Fraktionssammlern aufgefangen werden, bevor sie mit Matrixsubstanzen zusammen auf Probenträgerplatten verbracht werden. Einige Chromatographen können mit solchen Fraktionssammlern ausgestattet werden; die Fraktionssammelgefäße können aber auch hydrophobe Verdaupeptide an den Wänden unwiederbringlich adsorbieren.
Die Fraktionen müssen nicht über äquidistante Zeitperioden gesammelt werden. Mit modernen Betriebssystemen für Chromatographen ist es möglich, die Fraktionen nach der Häufigkeit der Peaks oder nach einem Gesamtionenstrom zu schneiden. Das Auftreten von Peaks oder der Totalionenstrom kann dabei entweder über UV-Detektoren oder durch Massenspektrometrie eines Teilstroms des Eluates bestimmt werden.
Das Verfahren kann auch einer weiteren Chromatographie-Stufe unterworfen werden, um die Anzahl der Verdaupeptide in jeweils einer Fraktion herabzusetzen, beispielsweise für eine Analysenaufgabe, die auf das Aufspüren von Strukturunterschieden der realen Proteine des Gemischs zu denen in der Datenbank gerichtet ist. Dadurch kann das massenspektrometrische Verfahren empfindlicher gemacht werden, da jede Aufnahme eines Tochterionenspektrums eines Verdaupeptids immer auch die anderen Verdaupeptide verdampft und so Substanz für weitere Analysen vernichtet. Eine solche Chromatographie kann beispielsweise die Einzelfraktionen zyklisch in nur 20 Sammelfraktionen geben. Es entstehen dadurch Sammelfraktionen, die beispielsweise die 1., die 21., die 41., die 61. Fraktion und so weiter enthalten. Die zwanzig Sammelfraktionen können dann auf anderem Säulenmaterial nochmals chromatographiert werden, um hier eine gleichmäßige Belegung mit Peaks zu erreichen.
Ein weiteres hochinteressantes Verfahren kombiniert eine zweite Chromatographie mit einer zwischen erster und zweiter Chromatographie liegenden Modifikation aller oder einiger der Verdaupeptide, beispielsweise durch Oxidation von Methionin, durch enzymatsche Deglycosilierung oder dergleichen. Wird eine so modifizierte Fraktion aus einem ersten Chromatographielauf einem zweiten Chromatographielauf auf einer Säule gleichen Typs unterzogen, so verschieben sich die modifizierten Peptide gegenüber den nicht modifizierten, und die modifizierten Peptide können selektiv weiter verarbeitet werden.
Das Auftragen der Fraktionen auf die Probenträgerplatte kann auch anders als oben geschildert erfolgen. Die Probenträger können um kleine hydrophile Ankerflächen von etwa 300 Mikrometer Durchmesser herum jeweils Ringe mit breitbandaffinen Dünnschichten tragen, die einen Durchmesser von etwa 800 Mikrometer haben und von stark hydrophoben Oberflächen umgeben sind. Affine Dünnschichten mit Breitband-Adsorption bestehen beipielsweise aus oberflächlich gebundenen C18-Ketten; also Alkylketten mit 18 Kohlenstoffen, die kovalent an die metallische Oberfläche gebunden sind. Werden hier Tropfen mit etwa einem Mikroliter Eluat aufgegeben, so bedecken diese die affinen Ringe, wobei die Peptide breitbandig, also von sehr hydrophilen bis zu sehr hydrophilen Peptiden, gebunden werden. Nach Waschen und Trocknen können die Peptide durch Acetonitril mit 5 Prozent Wasser und etwas gelöster Matrixsubstanz wieder desorbiert werden. Die aufgebrachte Flüssigkeit zieht sich beim Trocknen auf die hydrophilen Anker zurück, dort werden dann die Matrixkriställchen gebildet, die dabei einen Teil der Peptide in sich aufnehmen.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das hier in einigem Detail geschildert werden soll, bezieht sich auf eine Analysenaufgabe, die die Quantisierung der Expression von Proteinen zum Ziel hat. Besonders interessant ist die Analyse der Unterschiede der Expression von Proteinen in zwei verschieden gestressten Zellverbänden. Damit können die Reaktionen in den Zellen auf äußere oder innere Stressbedingungen ermittelt und Einsicht in das Verhalten und das Arbeiten von Zellen gewonnen werden. Der Stress kann durch Alterung des Zellverbandes, durch Temperatureinwirkungen, durch Einwirkungen von Chemikalien, insbesondere von Pharmaka, oder durch verschiedenartige Krankheiten des Zellverbandes oder des Mutterorganismus gegeben sein.
Für dieses Studium ist es wiederum zweckmäßig, subzelluläre Teilproteome zu untersuchen. Es werden daher subzelluläre Teilproteome jeweils von normalen und von gestressten Zellverbänden hergestellt. Die aufgelösten Proteine der beiden Teilproteome werden nun vor dem Mischen modifiziert, und zwar so, dass die Modifizierungen massenspektrometrisch unterscheidbar sind, so dass die Zugehörigkeit eines Proteins zum einen oder anderen Teilproteom erkennbar bleibt. Das nachfolgende Mischen erzeugt dann das Proteingemisch, das in Schritt (a) des Anspruchs 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens einem gemeinsamen enzymatischen Verdau unterworfen wird.
Eine besonders vorteilhafte Methode ist unter dem Kürzel "ICAT" bekanntgeworden, das für "isotopically coded affinity tag" steht.
Ein ICAT-Reagenz zur Modifizierung besteht aus (1) einer reaktiven Gruppe, die mit einer speziellen Aminosäure reagieren kann, beispielseise mit der Thiol-Gruppe des Cystins, (2) eine Affinitätsgruppe, beispielsweise Biotin, die zu einer affinen Extraktion (hier beispielseise mit Streptavidin) verwendet werden kann, und (3) einem Linker in zwei verschieden isotopenmarkierten Formen.
Dabei wird nicht nur eine massenspektrometrisch unterscheidbare Modifikation vorgenommen, sondern eine Modifikation, die eben auch eine sehr spezifische Affinitätsgruppe enthält, so dass man in der Lage ist, die modifizierten Proteine, oder, nach dem gemeinsamen Verdau, die modifizierten Verdaupeptide herauszuextrahieren und von den nicht modifizierten Proteinen oder Verdaupeptiden zu trennen. Als Affinitätsgruppe wird beispielsweise Biotin benutzt; dieses Biotin ist durch den Linker und eine Reaktionsgruppe beispielsweise an ein Cystin gebunden. Der Linker enthält acht Wasserstoffatome, die so fest gebunden sind, dass sie nicht in Lösung austauschen können. Die Isotopencodierung besteht nun darin, dass der Linker in einem Falle acht normale Wasserstoffatome enthält, im anderen Falle acht Deuteriumatome. Die beiden Modifikationen unterscheiden sich also um genau acht atomare Masseneinheiten.
Die markierten Verdaupeptide werden nun vorzugsweise zwischen den Schritten (a) und (b) affin extrahiert. Die Extraktion gelingt beispielsweise durch Magnetkügelchen, die oberflächlich mit Streptavidin belegt sind und die Biotingruppen affin binden. Nach dem Waschen können die markierten Verdaupeptide durch vorsichtiges Zugeben von Ammoniak wieder vom Strepatavidin gelöste werden. Die markierten Verdaupeptide werden nun, wie im oben geschilderten Verfahren, flüssigkeitschromatographisch in einzelne Fraktionen getrennt. Die Fraktionen werden auf Probenträgerplatten präpariert. Es werden Massenspektren der Gemische von Verdaupeptiden der einzelnen Fraktionen aufgenommen.
Da die Isotopenmarkierungen der Modifikationen keine unterschiedllichen Retentionszeiten bewirken, befinden sich gleiche, aber verschieden codierte Verdaupeptide aus gleichen Proteinen beider Teilproteome in derselben Fraktion und somit in derselben MALDI-Probe.
Sind die beiden Proteine gleich stark exprimiert, so finden sich im Verdaupeptidspektrum zwei gleich intensive Isotopengruppen, die sich um genau acht (oder bei zwei Cystinen im Verdaupeptid um genau 16) Masseneinheiten unterscheiden. Die gleich intensiven Gruppen sind nach der Zielsetzung der Analyse uninteressant, interessant sind vielmehr diejenigen Gruppen, bei denen sich die Intensitäten unterscheiden. Manchmal taucht überhaupt nur eine Gruppe auf, es kann sich dabei um ein Protein handeln, das nur in der Stresssituation generiert oder in der Stresssituation überhaupt nicht mehr gebildet wird. Die Unterschiedlichkeit der Intensitäten kann zur Auswahl derjenigen Peptide herangezogen werden, deren Tochterionenspektren gemessen werden sollen. Über die Tochterionenspektren lassen sich wiederum die Proteine identifizieren, die einer unterschiedlichen Expression unterliegen.
Es wurden hier zwei bevorzugte Ausführungsformen mit verschiedenen Zielsetzungen durch die Analysenaufgabe im Detail beschrieben, eine weitere, das Auffinden von Unterschieden der Proteine im Proteom zu den Proteinen der Datenbank, wurde angerissen. Es gibt aber für das Grundverfahren, aber auch für das intelligente Auswahlverfahren eine Vielzahl von Abwandlungen, die von der analytischen Zielsetzung abhängen. Nach Kenntnis dieser Erfindung ist dem Fachmann möglich, eine Anpassung an seine analytische Zielsetzung vorzunehmen.

Claims

1. Verfahren für die massenspektrometrische Analyse von Proteingemischen, bestehend aus folgenden Schritten:

a) gemeinsamer enzymatischer Verdau aller Proteine des Proteingemisches,

b) chromatographische Trennung der Mischung der Verdaupeptide,

c) Auffangen einzelner chromatographischer Fraktionen,

d) Präparation von Proben auf einem Probenträger, wobei die Proben die Verdaupeptide aus den Fraktionen zusammen mit Matrixsubstanz enthalten,

e) Ionisierung der Verdaupeptide aus den Proben durch matrixunterstützte Laserdesorption in einem Flugzeitmassenspektrometer, Messung der Flugzeiten und Bestimmung der Massen der Verdaupeptid-Ionen aus den Flugzeiten,

f) Messung der Tochterionenspektren aller oder ausgewählter Verdaupeptid-Ionen aller oder ausgewählter Proben durch MALDI-Tandem-Flugzeitmassenspektrometrie, und

g) Identifizierung der zugehörigen Proteine durch Suche in Proteinsequenz-, cDNA- oder DNA-Datenbanken.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Proteingemisch um ein Proteom handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Proteingemisch um ein Teilproteom handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Proteingemisch um ein ein subzelluläres Teilproteom handelt, das durch Auftrennung in subzelluläre Fraktionen hergestellt wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die subzellulären Fraktionen durch Zentrifugieren getrennt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Teilproteom durch chromatographische oder elektrophoretische Grobtrennung hergestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Grobtrennung durch "free flow electrophoresis" vorgenommen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Teilproteom durch eine affine Extraktion aus einem Proteom oder Teilproteom gewonnen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Proteingemisch um eine Mischung aus den Proteinen zweier Proteome oder Teilproteome handelt, wobei die Zugehörigkeit zumindest eines Teils der Proteine zu den beiden Proteomen oder Teilproteomen durch massenspektrometrisch unterscheidbare Modifikationen erkennbar ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation auch eine affine Gruppe enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Proteine vor oder nach dem Verdau affin extrahiert werden, um sie von den nicht modifizierten Proteinen oder Verdaupeptiden zu trennen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Modifikationen mit isotopencodierten Affinitäts-Tags handelt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen chromatographischen Fraktionen in Schritt c) direkt auf einer mit Matrixsubstanz belegten Probenträgerplatte aufgefangen und dort in Schritt d) präpariert werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte e) und f) im gleichen Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer durchgeführt werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass für die Verdaupeptide aller Proben eine Liste mit Ausschlussmarkierungen geführt wird, die sie von einer Messung ihrer Tochterionenspektren ausschließt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass solche Peptide, die in zeitlich vorhergehend oder nachfolgend belegten Proben in höherer Intensität gefunden wurden, für den Ausschluss markiert werden.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass solche Peptide für den Ausschluss markiert werden, die aufgrund ihrer gemessenen Masse zu einem bereits bekannten Protein gehören, das anhand eines Tochterionenspektrums eines anderen Verdaupeptids als im Proteingemisch enthalten identifiziert wurde.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Masse auch eine berechnete Retentionszeit zur Markierung für den Ausschluss eines Peptids berücksichtigt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass für die Markierung für den Ausschluss von der Messung von Tochterionenspektren der Vergleich der Intensitäten gleicher Peptide herangezogen wird, die durch massenspektrometrisch unterscheidbare Modifikationen als zu verschiedenen Proteomen oder Teilproteomen gehörig erkannt werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Tochterionenspektren jeweils zuerst in denjenigen Proben gemessen werden, die nur wenige Peptide ohne Ausschlussmarkierungen aufweisen.