WO2003097878A1 - Amorces d'amplification d'acide nucleique destinees a detecter des cytokeratines et technique d'examen utilisant ces amorces - Google Patents

Amorces d'amplification d'acide nucleique destinees a detecter des cytokeratines et technique d'examen utilisant ces amorces Download PDF

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WO2003097878A1
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primer set
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represented
seq
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PCT/JP2003/006256
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Sachiyo Tada
Yasumasa Akai
Yasuyuki Imura
Shigeki Abe
Harumi Minekawa
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Sysmex Corporation
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to a nuclear primer for detecting human cytokeratin.
  • Cytokeratin (hereinafter abbreviated as “CK” in the present specification) is one of the proteins that form the ⁇ ⁇ skeleton of a cell and forms a family consisting of at least 20 ⁇ ⁇ groups.
  • CK18 such as human CK18, human CK19 and human CK20 CK is expressed in ⁇ ⁇ cells.
  • human CK18 is expressed not only in fungi, lungs, MBs, stomachs, etc., but also in various cancer tissues, but human CK18 is a non-filamentous lymph node. It is not expressed in the force that is known. It is also expressed in human ⁇ 93 ⁇ 4 ⁇ cancer, stomach cancer, breast cancer, knee cancer, puerperium, etc .;
  • CK19 Human CK20 has been reported to be expressed in; ⁇ 3 ⁇ 4S, stomach cancer, merkeno sac carcinoma, gynecological late-night carcinoma, dendritic carcinoma, and chemocarcinoma. Differences in the incidence of human CK20 in Japanese CK20.
  • the presence or absence of cancer can be determined by examining the presence or absence of human 0 (18, human CK19 and Z or human CK20) in paper such as lymph nodes. By examining those that have differences in origin, ⁇ of cancer can also be determined.
  • detection of lymph node ablation can be an itif to determine whether to measure V, 1 ⁇ 1 of laparotomy, thoracotomy, or neck incision.
  • the removal is stopped, and it is used as an indicator for decision making such as administration of Hono ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ therapy. sell.
  • intraoperative cancer »diagnosis requires the ability to perform s.
  • One of the diagnostic methods is to detect CK protein as a cancer marker. For example, it is performed by cutting the excised lymph nodes and cutting the cut tissue.However, in such a method, there is a risk that small cancer will be caused because only the ⁇ f # of the cut surface is used. is there.
  • Recent advances in gene clarification technology have enabled effective cancer diagnosis by detecting the expression of cancer marker genes.
  • dozens of target DNA fragments are obtained by repeating the grafting of a DNA strand into a single strand, the primer ! It can be amplified a thousand times: (Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-274697), and can be used as a highly sensitive method for analyzing nucleic acids in various forms. For example, since it is possible to analyze nucleic acids in animals, which are originated from animals or night, it is useful for diagnosis of infectious disease transmission and cancer.
  • RT-PCR can be used to detect the thigh.
  • the RT-PCR method is, for example, to extract fragility from ⁇ 1 ⁇ profession, synthesize cDNA by reverse ⁇ ⁇ * (RT) using oligo (dT) or random hexamer as a primer, and It is a method to detect the width.
  • An example of a diagnosis of Tsurugi Tadashi using this challenge has been reported ( ⁇ , P. 135-141, vol. 66 (2), (1991)).
  • RT-PCR made it possible to detect the mRNA expression of CK S from the excised fiber, and it was possible to avoid the problem associated with cancer. Jffi ⁇ cancer diagnosis In the field, such a nuclear method has been put into practical use (1 Grace, 31st edition, p. 1314, ⁇ Publishing Co., Ltd., published on September 20, 1998).
  • the PCR method required an operation of denaturing double-stranded DNA into single-stranded DNA, and amplification had to be repeated under a plurality of conditions. Also, it takes two hours to obtain a detectable amplification product, which is not preferable for an intraoperative test requiring sex.
  • the LAMP method has been reported (Patent Document 1).
  • the LAMP method is a gene amplification method using a plurality of primers, which forms a hairpin of an amplification product as the strand arrangement advances.
  • F3 primer two types of inner primers
  • F3 primer two viewer primers
  • R3 primer) Rxmm imk polymerase synthesizes a dumbbell-like structure with single-stranded components at both ends from DNA. This structure becomes the starting point of the amplification cycle. From the third rule of this structure, the elongation of DA increases with itself as ⁇ .
  • the amplified product is composed of the repeating # structure of, and the unit of the repeating f structure is the intercalation between the primers.
  • the LAMP method requires reading raw DNA from double-stranded to single-stranded I "raw operation. All 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4, ⁇ width ⁇ & are isothermally proceeding to the rippled strand.
  • the origin structure can be synthesized in the same manner by adding ⁇ to the ⁇ of DNA, so that amplification can proceed (RT -LAP method)
  • RT -LAP method an amplification product power of 30 can be obtained for detection at 30. Therefore, the time required for nucleic acid detection S is discussed. It can be used for the diagnosis of cancer in the lymph nodes, and since the results can be obtained quickly, it can be expected to convert to intraoperative diagnosis.
  • Non-Patent Document 3 PCR primers or probes for detecting human CK18
  • Patent Document 3 a primer or probe for PCR for detecting human CK19 has already been reported
  • Patent Document 3 non-exclusion: 3 ⁇ 4Sfe4
  • PCR primers or probes for detecting human CK20 have also been reported previously (Helicitation 5, 6).
  • Patent Literature 1 National Publication W0 00/28082
  • Patent Document 2 National Publication W0 02/2
  • Patent Document 3 US 6203992 Special Information ⁇
  • Non-Patent Document 1 Bio Venture, Vol. 1, No. 1, p. 109-115 (2001)
  • Non-Patent Document 2 BIO INDUSTRY, Vol. 18, No. 2, p. 15-29 (2001)
  • Non-patent 3 Gene, 159 (1), p. 43-47 (1995)
  • Non-patent document 4 Breast Cancer Research and Treatment 60, p. 143-151 (2000)
  • Non-Patent Document 6 British J. of Cancer, 82 (1), pl57-160 (2000) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to provide a novel primer for use in a nuclear width S for detecting human CK. More specifically, it relates to the use of a primer for a nuclear ⁇ if width by the LAMP method.
  • the inventors of the present invention have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have been effective in the LAMP method.
  • a nuclear primer for detecting human CK, which is applied to DNA, could be constructed.
  • a primer for nuclear width for detecting cytokeratin by the LAMP method 1.
  • the ttS1 is selected from the group consisting of cytokeratin 18, cytokeratin 19 and cytokeratin 20.
  • Oligonucleotide K3 ⁇ 4r ⁇ consisting of rooster 3 ⁇ sized from the following groups: Nucleus for detection of human cytokeratin 18 ⁇ primer for lf width;
  • Nucleotide primer for detecting human cytokeratin 18 consisting of oligonucleotides of the ⁇ g sequence represented by the systematic number 66-88 or 179-341.
  • Nuclear width primer according to fiS 3 or 4, wherein the means of nuclear width is LAMP method. • 6. Oligonucleotide consisting of rooster J, which is scaled from the following groups. A primer set for nucleic acid amplification for detecting human cytokeratin 18 wherein at least two species are disciplined from the animal;
  • At least two of the primers included in the tirt self primer set are:
  • the primer included in the Fujimi primer set recognizes the ⁇ SIH sequence represented by No. 1 and at least 6 strands of Z or its complementary strand.
  • a system primer 234-341 ⁇
  • the primer set of 11 or 12 above which is a nucleus 1 ⁇ primer for detecting human cytokeratin 18 comprising oligonucleotides in the columns represented by SEQ ID NOs: 202 to 233,
  • Primer set for nucleic acid amplification for detecting cytokeratin 18 consisting of any of the following 1) to 4);
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide of its own sequence represented by SEQ ID NOs: 252, 297, 68 and 182;
  • a primer set comprising, as a primer, oligonucleotides of its own sequence represented by SEQ ID NOs: 278, 331, 79 and 193;
  • Primer set for nucleic acid amplification for detection of human cytokeratin 18 consisting of the following 1-) to 4) f1;
  • SEQ ID NOs: 234, 287, 66, 179, 203 and 220 a primer set containing the oligonucleotide of ⁇ as a primer, 2) a primer set comprising, as primers, oligonucleotides of sequence 3 ⁇ 4
  • ⁇ represented by SEQ ID NOs: 252, 297, 68, 182, 211, and 223;
  • SEQ ID NOs: 278, 331, 79, 193, 214 and 228 a primer set comprising an oligonucleotide of ⁇ SfE ⁇ J as a primer
  • a nuclear primer set for detecting human cytokeratin 18 consisting of any of 1) to 8);
  • a primer set containing, as a primer, an oligonucleotide of the sequence represented by 3 ⁇ 43 ⁇ 4g represented by SEQ ID NOs: 280, 334, 82 and 195;
  • a primer set containing the oligonucleotides of its own sequence as primers represented by rooster numbers 285, 340, 87 and 200
  • a primer set comprising, as a primer, oligonucleotides of the iggga row represented by SEQ ID NOs: 286, 341, 88 and 201;
  • a primer set for nucleic acid amplification for detecting human cytokeratin 18 consisting of any of the following 1) to 6): 1) A primer set I comprising the oligonucleotides of itSi ⁇ [J represented by SEQ ID NOs: 282, 336, 84, 197, 216 and 229 as primers,
  • a primer set comprising, as a primer, an oligonucleotide represented by SEQ ID NOs: 283, 338, 85, 198, 217, and 232;
  • a primer set comprising, as a primer, an oligonucleotide represented by SEQ ID NOs: 286, 341, 88, 201, 218 and 233;
  • a primer set including, as a primer, an oligonucleotide of ⁇ 5 ⁇ represented by SEQ ID NOs: 286, 341, 88, 201, 219 and 233;
  • SEQ ID NO: 342 ⁇ is from the strand of the complementary strand of the 270th to 930th orders of the SgS sequence, and is a rooster 3 ⁇ 342 and Z or a sequence of its complementary strand; Oligonucleotides containing
  • Rooster [Rooster with J number 357-361 or 378-434 S ⁇ J number: ⁇ S3 row, human cytokeratin consisting of oligonucleotides that are more or less scaled 19 for detection Primers for nucleic acid amplification,
  • the primer for nucleic acid amplification for detecting human cytokeratin 19 according to 21 or 20 wherein the means of nuclear width is the LAMP method
  • a nucleus for human cytokeratin 19 detection by selecting at least two types from nucleation primers containing oligonucleotides consisting of sequences selected from the following groups ⁇ # ( Primer set;
  • the primers contained in the primer set to recognize at least the region of at least 6% of the sequence represented by Toriban No. 342 and / or its complementary strand.
  • One of them is a nuclear primer set for detecting human cytokeratin 19 of Fiber,
  • each of the primers is selected as a fiber, and a primer set is selected from the group consisting of:
  • a primer for nuclear ⁇ width for detecting human cytokeratin 19 comprising an oligonucleotide of 3 ⁇ 4 £
  • System symbols 413, 418, 357, 378, 385 and 402 represented by the following symbols: ⁇ ⁇ A primer set containing the oligonucleotide of the own sequence as a primer,
  • Alignment ⁇ (Fuji No. 436 to 460, the oligonucleotide consisting of ⁇ ⁇ i represented by "f ⁇ , 3) ItftBl) or the complementary strand of the oligonucleotide according to 2), 4) Any one of HolB l) to 3) may be an oligonucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with the oligonucleotide of interest.
  • an oligonucleotide comprising at least 5 or more of SEQ ID NO: 435 and / or its complementary strand, which is selected from the 340th to 5050th positions of the column represented by the system symbol 435 and the complementary strand thereof;
  • System symbol 436 to 460 An oligonucleotide consisting of a raiS sequence.
  • oligonucleotides described in 1) to 4) are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition: including the raia sequence and having a primer function Oligonucleotides',
  • At least two of the bimers included in the Fujimi Bimer set are represented by No. 435; the recognition of ⁇ 3 ⁇ 4B and Z, or their complementary strands, recognizes each 2 « ⁇ 1 region.
  • a primer contained in the SfflB primer set represented by the primer J No. 435: the recognition of the ⁇ S sequence and at least 6 regions of Z or its complementary strand as claimed in claims 38 to 41. 4.
  • a nuclear ⁇ width primer for detection of human cytokeratin 20 consisting of oligonucleotides represented by numbers 461 to 466 and 468 to 473; (a) SEQ ID NOs: 461 to 466; (b) Rooster J number 468-473; ⁇ , a primer set that is difficult to include ⁇ : a set of 1 discriminating primers from the ⁇ class;
  • a primer for detecting human cytokeratin 20 containing, as a primer, a primer set described in 43 or 44 further comprising an oligonucleotide of one sequence represented by the system number 457 and Z or 459 or 460 as a primer Set,
  • Rooster represented by J numbers 443, 454, 467 and 474; a primer set for detection of human cytokeratin 20 containing a ⁇ Sf ⁇ lJ oligonucleotide as a primer, 4 7.
  • a nucleic acid detection method in which the necessary primers are selected from the primers described in 35 or 36, or the primer set is 37
  • Nucleic acid detection Nucleic acid detection as described in the preceding paragraph 18, 34 or 48, which is the LAMP method: ⁇ , 50. 3 ⁇ 4 Nucleic acid detection as described in 8, 34, 48 or 49; ⁇ shelf The fiber
  • Figure 1 shows the LAMP method using primer set I of human CK18: It is a figure showing the result of ⁇ .
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using primer set II of human CK18. (Experiment 1—1)
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the LAMP method using primer set III of human CK18. (Experimental example 1-1)
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using primer set IV of human CK18.
  • FIG. 5 is a view showing the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using the primer set of human CK18 (with primer I). (Experimental examples 1 and 2)
  • FIG. 6 is a view showing the results of ⁇ which was performed by the LAMP method using primer set I of human CK18 (/ "primer U”. Test Example 1-2)
  • FIG. 7 is a ⁇ T diagram showing the amplification characteristics of ⁇ which were subjected to the LAMP method using the primer set I of human CK18. Valley test example 1—3)
  • FIG. 8 is a graph showing the results of LAMP method using the primer set A of human CK19 (without primer): ⁇ .
  • Fig. 9 shows the results of the LAMP method using the primer set A of human CK19 (no primer).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of performing the LAMP method using primer set A of human CK19 (with primer). (Experimental example 2-1)
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of performing the LAMP method using the primer set A of human CK19 (with primer). ( ⁇ Example 2-1)
  • Fig. 12 is a diagram showing the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using the primer set A (with primer for human CK19) (Experimental example 2-1).
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of performing the LAMP method using primer set C of human CK19 (no top primer). (Experimental example 2-2)
  • Fig. 14 shows the results of the LAMP method using the human CK19 primer set C (with primers): ⁇ (Experimental example 2-2).
  • Fig. 15 is a diagram showing the results of ⁇ using the LAMP method with the primer set C of human CK19 (with primer) (Experimental example 2-2).
  • Fig. 16 shows that the LAMP method was performed using the primer set C of human CK19 (with primer); It is a figure showing the result of ⁇ . ( ⁇ Example 2-2)
  • Fig. 17 shows the results of the LAMP method performed using the primer set C of human CK19 (with primers) (Experimental example 2-2).
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using the primer set C of human CK19 (with primer C). (Experimental example 2-2)
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of 3 ⁇ 4 ⁇ obtained by performing the LAMP method using the human CK19 primer set C primer. ( ⁇ Experiment 2-2)
  • FIG. 20 shows the results of ⁇ obtained by performing the LAMP method using the primer set D of human CK19 (without primer). (Experimental example 2-3)
  • FIG. 21 shows the results of LAMP method using the primer set D of human CK19).
  • FIG. 22 shows the results of # ⁇ obtained by performing the LAMP method using primer set A of human CK19.
  • Example 2-4 shows the results of # ⁇ obtained by performing the LAMP method using primer set A of human CK19.
  • FIG. 23 shows the results of the LAMP method using the primer set B of human CK19. (Experimental example 2-4)
  • FIG. 24 shows the results of LAMP method using the primer set C of human CK19: ⁇ .
  • FIG. 25 shows the results of the LAMP method using the primer set D of human CK19: ⁇ . (Experiment 2-4) ''
  • FIG. 26 is a diagram showing the amplification specificity of ⁇ which was subjected to the LAMP method using primer set A of human CK19. (Experiment 2-5)
  • FIG. 27 shows the amplification specificity of the LAMP method using primer set B of human CK19. (Experimental example 2-5)
  • FIG. 28 shows the LAMP method using primer set C of human CK19: amplification specificity of ⁇ . ( ⁇ Experiment 2-5)
  • FIG. 29 shows the amplification specificity of the LAMP method using primer set D of human CK19. ( ⁇ Experiment 2-5)
  • FIG. 10 shows the results of # ⁇ where the LAMP method was performed. (3 ⁇ 4 ⁇ Example 2-6)
  • FIG. 31 shows the results of the LAMP method using primer set C of human CK19. (Experimental example 2-7)
  • FIG. 32 shows the results of ⁇ using the primer set 1 of human CK20 and performing the LAMP method.
  • FIG. 33 shows the amplification specificity of the LAMP method using primer set 1 of human CK20. (Experimental example 3-3)
  • FIG. 34 shows the results of the LAMP method performed using primer set 3 of human CK20.
  • FIG. 35 is a diagram showing the amplification specificity of the LAMP method using primer set 3 of human CK20 (shows production. (Experimental example 3-5).
  • the present invention provides a primer for nuclear nuclei that can be used for the nuclear width method of human CK, preferably the LAMP method.
  • the primer is derived from, for example, the sequence of CK represented by SEQ ID NO: 1, 342, 435 and the like or the sequence of Z or its unique sequence: an oligonucleotide that contains at least 5 or more ⁇ Can be selected and designed.
  • primers used in the LAMP method are as described in Patent Document 1. Specifically, for the target DA to be amplified, the fibers F3c, F2c, and FLc in order from the rule 3 '3 ⁇ 4 ⁇ For at least these six regions, the length of the substantially identical: sequence, or substantially complementary; ⁇ -containing oligonucleotide chain is measured, and at least four primers are specified.
  • An oligonucleotide according to the present invention can be used: ⁇
  • the terms identical or phase-change used for the labeling of the SIE column do not need to be identical or complementary to ⁇ , i.e. Identical to a sequence means that it hybridizes to Can be.
  • Hiro Complementary means a rooster 2 ⁇ that can hybridize under stringent rice cakes and can have a 3 ′ to form a phase capture chain.
  • the primer of the present invention is capable of performing a pairing with a complementary strand while maintaining a required specific life under the conditions given in various nuclei described below. Have a length. Specifically, it is 5 to 200 pairs, more preferably 10 to 50 pairs.
  • the chain length of the part that is to be used must be longer.
  • ⁇ s.
  • a chain length such as Sift itself is exemplified as a desirable range.
  • the terms “use”, “use”, and “use” mean a nucleic acid on the side where complementary strand synthesis is activated.
  • a complementary chain with its own sequence complementary to awakening is a force that has a meaning as a chain that can hybridize to ⁇
  • the relationship between the two is merely relative. That is, a strand synthesized as a complementary strand can function as a re-strand. That is, the complementary strand can be ⁇ S.
  • the primer selected from the base sequence of the target DNA is any one of FIP (forward inner primer), F3 primer (forward outer primer), RIP (reverse inner primer) and R3 primer (reverse outer primer).
  • FIP forward inner primer
  • F3 primer forward outer primer
  • RIP reverse inner primer
  • R3 primer reverse outer primer
  • FIP has 3 'of the F2 region that substantially interacts with the F2c region of the target DNA: ®3 ⁇ 4
  • Substantially the same as the Flc region of the target DNA in ⁇ Design to have rows.
  • the target DM does not depend on the target DM, and the rooster itself intervenes.
  • the length of the sequence is 0-50, preferably 0-40, which does not depend on the target DNA.
  • the F3 primer is designed to have substantially the same 3 ⁇ 4S
  • the RIP is designed to have a 3 'J in the R2 region that is substantially parallel to the R2c region of the target DNA, and to have substantially the same sequence as the Rlc region of the target DNA.
  • RIP like FIP, does not depend on the target DNA during R2 and Rlc roosters, good.
  • the R3 primer is designed to have substantially the same 3 ⁇ 4Sffi ⁇ J as the R3 R complementary to the R3c region of the target DNA.
  • a long time can be obtained by using at least one or more zotop primers (Reference 2).
  • a primer is a single-stranded portion of the dumbbell-structured 5 'rule, which has a complementary sequence between the R1 and R2 regions or between the F1 and F2 regions.
  • the use of a primer makes it possible to increase the frequency of DNA synthesis. These primers do not hybridize to the FIP or RIP force generated during the DNA synthesis process! / Design to hybridize to the backup area.
  • oligonucleotide containing at least 5 or more Ts from a sequence consisting of 1412 assassin and / or a complementary sequence thereof as shown in System 1 Is designed.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is based on Genbank accession No. 4557887.
  • Primers for human CK18 detection are also designed with a very large area according to the above primer principle.
  • the region of the primer for detection of human CKI8 is determined by rnm, GC content, secondary structure, 3 ⁇ 4 value, etc., and the length of the self-recognition sequence for recognizing the DNA region is at least 5 ass, preferably 10 to More preferably 30 to 25 can be used.
  • the Tm value can be calculated using the Nearest Neighbor method. DNA fibers having a Tm value of 55 to 65 ° C, preferably 58 to 64 ° C can be selected, and those having a GC content of 40 to 70%, preferably 50 to 65% can be measured.
  • the region of the primer selected in the present invention is a region of the 270 to 1375th ⁇ phase capture shell region of the iffi sequence represented by rooster number 1, preferably the sequence of the primer sequence. 280-580 and are included in the fg of its complementary strand.
  • Human CK18 detection primer is 1) Ryo positions Pi of 27 0 to 13 ⁇ 5th sequence represented by SEQ ID NO: 1 Z or contained in the region of its phase Tokusari, beta: at least 5 or more oligo Nucleotides, 2) System number 2-41: Oligonucleotide consisting of rows, 3) Oligonulete described in key S 1) or 2); 4) Stft self 1) ⁇ 3) Or an oligonucleotide capable of hybridizing under a stringent condition with the oligonucleotide described in 1 or 5) m, or one or more oligonucleotides described in 1) to 4). Oligonucleotides containing mutated sequences, such as substitutions, deletions, insertions, or additions, are cut and designed.
  • Oligonucleotides can be produced by the method of q per se, and can be chemically combined, for example. Alternatively, it is also possible to cleave a natural nucleic acid by control or the like, to modify it so that it is composed of the above-mentioned sequence, or to ligate it. Specifically, an oligonucleotide synthesizer (Applied Biosystems)
  • Expedite Model 8909 can be combined using a thigh joint or the like. Also, the play of mutated oligonucleotides in which one or several donkeys are substituted, deleted, inserted, or added can also present difficulties in themselves.
  • the site-directed mutagenesis method, the gene homology application method, the primer extension method or the PCR method may be used as a combatant or a suitable method, for example, [3: Molecular Cloning; A Laboratory Manual ⁇ 2
  • Stringent hybridization ⁇ (cows are commonly known; can be measured; for example, 50% formamide, 5XSSC (150mM NaCl N 15mM sodium carbonate), 50mM sodium phosphate, pH7. 6, 5 X Den Hearts descendants night, 10% de Kistran sulfate and 20 ⁇ g / ml DNA ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 42 42, 42. After overnight hybridization at C, first wash in 2XSSC-0.1% SDS at room temperature, then at 65 ° C in 0.1XSSC, 0.1% SDS secondary, etc. ⁇ (I can give you a cow.
  • the nucleic acid to be amplified here is mRNA of human CK18
  • the primer for detecting human CK19 can be designed in the same manner as the primer for detecting human CK18.
  • the primer for detecting human CK19 consists of 1360 ass, represented by ⁇ fl rooster IJ No. 342: 3 ⁇ 4Continuous from SI self and Z or its complementary bulge ij; Designed by selecting nucleotides. Note that the system number 342 is based on Genbank accession No. 4504916.
  • the primer for detecting human CK19 is also designed by disciplining the fibers following the above thigh.
  • the fibers of the primer for detecting human CK19 are as follows: 270 to 930 in the sequence represented by SEQ ID NO: 342 and the sensitivity of the complementary strand thereof, preferably 270 to 560, 370 to 585, and 625 to 854. Or in the region of positions 655-930 and their complementary chains.
  • a primer for detecting human CK19 is represented by 1) No. 342: ⁇ contained in ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ Z of 270-930 or its complement, preferably 270-560, 370-585th, 625-854th or 655-930ths ⁇ Z or their complementary chain ⁇ ⁇ region, which has at least 5 or more oligonucleotides, 2) consists of 3 ⁇ 4 ⁇ sequence represented by SEQ ID NOs: 343-382 Oligonucleotides, 3) knitting 1) or 2) complementary oligonucleotides of fiber oligonucleotides, 4) selfie 1) to 3), or the oligonucleotides described in 1 above Among stringent ⁇ (oligonucleotides that can hybridize under cows, or 5) of the oligonucleotides described in 1) to 4) above, at least one of them is substituted, deleted, inserted or Mutated, such as additions: ⁇ The oligonucleotide containing the sequence is scaled,
  • Primers for detecting human CK20 can also be designed in the same manner as primers for detecting human C18 ⁇ human CK19.
  • the primer for detecting human CK20 is 1275, which is represented by O
  • a primer for detecting human CK20 is also designed in accordance with the above request.
  • the primer for detecting human CK20 is the 340 to 1050 ⁇ OT phase capture (7 ⁇ 1, preferably 340 to 490 or 495 to 1050 ___) of the iffi sequence represented by rooster number 435. Regions of these complementary chains, more preferably positions 340 to 490, positions 495 to 570, or positions 790 to 10,050, and their complementary chains (included in the shell region).
  • the primer for detecting human CK20 is included in 1) 340 to 5050th and Z of the self sequence or its complement shown in the system number 435, preferably 340 to 490th or 495 to 1050. And at least one of Z and Z or their phase-trapping region, more preferably at positions 340-490, 495-570 or 790-1050 and / or their phase-trapping region, 2) Oligonucleotide consisting of ⁇ sequence represented by SEQ ID NOs: 436 to 474; 3) Complementary strand of oligonucleotide described in 1) or 2); 4) Tiff self 1) to 3) The oligonucleotides that can hybridize under stringent conditions with the oligonucleotides according to the above f) or 1), or 5) of the oligonucleotides according to the above 1) to 4), Mutated, such as fiber, deletion, insertion or addition; It is oligonucleotide mosquito selection including, Designed. '' (Primer set)
  • the primers of the present invention are inverted to perform nuclei, and at least two types are combined and shelves as primer sets.
  • at least four types of primers (FIP, F3 primer, RIP, R3 primer) are shelved as a primer set.
  • the pair of the above primers is paired ⁇ : and the primer set is ⁇ ffled.
  • the RT-LAMP method is a LAMP method in which RNA is ⁇ , and the 3 ⁇ 4 ⁇ concept of the LAMP method is as described in Patent Document 1.
  • the starting structure of the LAMP method is synthesized while synthesizing cDNA from ⁇ fragile in one job. Specifically, after the following step 1), the DNA elongation force S is repeated by repeating steps 2) to 5) to amplify the target DNA.
  • FIP is applied to the awake RNA strand, and the DNA strand that is recommended for the apparent RNA strand is extended.
  • This uses the inversion ⁇ , for example, the inversion from Xiao.
  • the DNA strand is extended to the DNA strand, and the starting structure of the LAMP method is synthesized. -
  • the synthesized DNA strand has a sequence complementary to its own sequence, and most of it forms a thigh age. By using this method, it is possible to detect amplified pirates.
  • the primers of the present invention are used under the condition of a double-stranded intercalator, such as ethidium amide, SYBER GREEN I, or Pico Green, with the primers of the present invention, the nuclear load may increase. The increase of fluorescent daughters is summarized. If this is monitored, amplification of DNA and increase in fluorescence can be simultaneously traced in a closed system. Proposal of a test method, 31st edition, p. 1318; see JP-A-2001-242169. Hereinafter, it is simply referred to as “real-time method j”).
  • ⁇ necessary for detecting a nucleic acid using the primers of the present invention can be packaged in advance and can be removed.
  • the present invention covers the entire nucleic acid detection system such as primers and primer sets for nuclear band width, nucleic acid detection methods using these primers, detection kits used for nucleic acid detection methods, and nucleic acid detection kits. .
  • Example 1-1 Human CK18; ⁇ From his own line ( ⁇
  • R2 The system ffi in the l ⁇ f standing on the rooster example represented by the system [Bango 1]
  • loop R An area of strict standing on the sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • 09FA970- 378 ttgaagtaatggctccagtctctgagcaaatccgggagc (Rooster himself ⁇ ( ⁇ number 244) 09FA970- 384 ttgaagtaatggctccagtctctaatccgggagcacttgg (Toriki self-regulated No. 245) 09FA999-369 gggtccct tctccaaggaggctggagagcaaaa (Rooster S system No. 246) 09FA994- 369 acctggggtcccttcttgaggctggagagcaaaa (Distribution system (J number 247)
  • 09RA420-923 cagagactggagccattacttcatgtccacagtatttgcgaa (Rooster (1 No. 291)
  • 09RA420-921 cagagactggagccattacttcaattgtccacagtatttgcga (Rooster No.
  • 13RA624-692 caccaatatcacacgactgcagggcctttacttcctcttcg Translation No. 312) 13RA631 - 700 atcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (quietness J No. 313) 13RA631-699 atcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (SEQ ID NO: 314) 13RA631-692 atcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (Rooster J No.
  • 18RA743-604 ctgggttgaccgtggagcggatgtctgccatgatc ⁇ No. 320) 18RA743 -605 ctgggttgaccgtggagggatgtctgccatgatctt catgatc Translation No. 324) 18RA749-605 tgaccgtggaggtagatgcggatgtctgccatgatctt No. 325) 18RA751-605 accgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatctt ( ⁇ No.
  • F312-470 1 ⁇ number 68
  • F312-466 (rooster fj number 69)
  • R3 primer (represented by ⁇ own column number: ⁇ Primer consisting of SI column)
  • R312-700 number 183 R313-673 (i-column number 184),.
  • R321-503 (Rooster U number 189), R32 G 520 ® Own row number 190), R323-453 (g number 191), R327-392 @E column number 192),
  • R2 region in the complementary capture of the sequence described in SEQ ID NO: 342
  • R3 A region in the complementary strand of the sequence of Na systema 342
  • Each primer was shown as a primer set to be inverted in the RT-LAMP method of the present invention, and was classified into four groups A to D for each region. It is selected from the 270th to 560th region of ⁇ SIB ⁇ and the region of its complementary strand, and each primer of B Bump is similarly the 370th to 585th self S region and its complementary region, C gno Similarly, each primer of the primer group is interpolated from the region of the complementary strand of TO treated at positions 625 to 854, and each primer of the D-gnop is similarly interrogated from the region of the g of positions 655 to 930 and the working region of the complementary chain. You.
  • F3 primer (F3 fiber; same sequence as MS column)
  • F3 primer (sequence identical to row F of F3 region)
  • R3 primer (Same sequence as R3 im ⁇ mm)
  • LPF1-EK 5 '-agaatcttgtcccgcagg-3' SEQ ID NO: 392
  • LPF2-EK 5 '-gaatcttgtcccgcagg-3' Tori selfie No. 393
  • F3 primer (The same sequence as; ⁇ own line of F3 fiber)
  • R2 Region in the complementary region of the sequence described in I-ban 435
  • R3 The region in the complementary strand of the sequence described in the system string 435
  • loop F «in the complementary strand of the sequence described in SEQ ID NO: 435
  • FIP (Concatenation of iffi's own sequence in regions Flc and F2)
  • F3 primer (sequence identical to; ⁇ own line of F3 fiber)
  • R3 primer (sequence identical to the 4ffi3 row of R3 fiber)
  • Human CK18 cDNA was obtained from total RNA derived from KAT0III (gastric cancer cells) by performing RT-PCR using primers designed based on human CK18: 3 ⁇ 4
  • Primer Set I with a short time required for amplification, S was shortened by 31 mm, and primers were used: ⁇ and not used. An experiment was performed for the purpose.
  • Example 1-1 The same operation as in Example 1-1 was carried out to prepare copy numbers of 60,000, 6000, 600 and 0 (control).
  • Primer set-Table 1 shows the primer set I and the primer set I. The primer set excluding each primer was used.
  • RT-LAMP method 6 3 ⁇ 4X was carried out by heating human CK18 to 2 ⁇ 1 at 23 ° C, containing 4 types of plies, and heating at 65 ° C for 1 hour.
  • the measurement was performed by the real-time method as in Experimental Example 1-1.
  • Cytokeratin (CK) is known to have human CK18 and human CK19, 20 and other isoforms, which have about 60% homology with human CK18; At the age measured using the above primer set, an experiment was conducted for the purpose of examining whether or not human CK19 or 20 could be identified as possible.
  • Example 11 The same operation as in Example 1 was performed to prepare a human CK18 thigh having a copy number of 60,000. Retention was similarly prepared for human CK19 and human C20.
  • the primer set I shown in Table 1 was used.
  • the fibers used were the same as those in Experimental Example 1-1, and were ⁇ ffl.
  • Figure 7 shows the results. As a result, when primer set I was used, human CK18 band was amplifying at all. Human CK19RNA and human CK20RA were completely amplified.
  • Example 2-1 Effect of primer set for detecting human CK19
  • the thigh of human CK19 was subjected to RT-LAMP using the primer set composed of ⁇ gno ⁇ "shown in Example 2-2.
  • the experiment was performed with the aim of examining the amplification pattern of ⁇ measured by the method.
  • FIP FA-401
  • RIP RA-401
  • F3 F3-401 and R3: R3-401
  • each primer set, and each primer LPF-401 and LPR-401, LPF-401 and LPR
  • Human CK19 cDNA was isolated from total fragility derived from KAT0III (gastric cancer cells) by RT-PCR using primers designed based on the ⁇ ⁇ f ⁇ (J of human CK19.
  • PBluescript STRATAGE A transcript was synthesized from human CK19 cDNA cloned into a plasmid using the in vitro ⁇ ⁇ 5 sam (Riboprobe in vitro transcription system (Promega ⁇ i).) The thigh concentration of the resulting stock solution was measured at 260 nra Then, prepare 50 ng / ⁇ yeast awake (Amibon3 ⁇ 4 $ 3 ⁇ 4) so that the RNA copy number of human CK19 is 60,000, 6000, 600, and 0 (control) based on the results. ⁇
  • the measurement was performed by the real-time method as in Experimental Example 1-1.
  • Human CK19 marauder was measured by the RT-LAMP method using the primer set from the group shown in Example 2-2. An experiment was conducted to examine the amplification pattern of ⁇ . .
  • FIP FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101 and R3: R3-1101 primer set, and each @ / primer: LPF-1101, LPR-1101, LPF-1101 And LPR-1102, LPF-1101 and LPR-1103, LPF-1101 and LPR_1104, LPF-1102 and LPR-1101, or LPF-1103 and LPR-1101. .
  • Figures 13 to 19 show the results of the primer set without the I-primer and the primer set with the O-primer. It took about 30 minutes after the start of the fiber (Fig. 13), while LPF-1101, LPR-1101 (Fig. 14), and LPF-1 -1101 and LPR-1102 (Fig. 15), LPF-1101 and LPR-1104 (Fig. 17), LPF-1102 and LPR-1110 (Fig. 18), or LPF-1103 and LPR-1101 (Fig. 15) The amplification can be performed in about 10 to 20 minutes with the combination of LPF-1101 and LPR-1103 (Fig. 16). In about 20 minutes, the # width could be changed.
  • a primer set consisting of FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3-601 and R3: R3-601 primers, and a pair of no-primers: LPF-601 and LPR-601 were used. was examined for the primer set.
  • Experimental example 2-1 Measurement of human CK19 bandages using ply sets woven from each group of ACD shown in 2-3 and ply sets selected from B group ⁇ An experiment was conducted with the aim of examining.
  • a / P FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3-401 R3: R3-401,
  • F3 F3-1101, R3: R3- 1101,
  • Cytokeratin (CK) is known to have human isoforms such as human CK19 and human CK19, as well as human CK19, which have about 60% homology with human CK19; An experiment was conducted for the purpose of determining whether or not human CK18 or 20 could be tested for their ability to be tested by measuring using the above primer set.
  • FIP FA- 1101 RIP: M- 1101
  • F3 F3- 1101
  • R3 R3 - 1101 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇
  • "Pupurai LPF-1101 and the LPR - 1101 were examined Te Nitsure ⁇ ply set using Te set.
  • the turbidity of the RT-LAMP product was measured over time with an absorbent at a wavelength of 500 nm. Measurement The measuring device used was LA-200 manufactured by Telamexne i.
  • FIP FA-1101
  • RIP RA-1101
  • F3 F3_1101
  • R3 R3-1101
  • primers A primer set using LPF-1101 and LPR-1101 and an RNase inhibitor I checked it.
  • Example 2-6 Furthermore, except that 25 U of RNase Inhibitor ⁇ ) was added, the same ⁇ night as in Example 2-6 was performed.
  • Human CK20 cDNA was isolated from total RNA derived from KAT0III (stomach cancer cells) by RT-PCR using primers designed based on the human ⁇ CK20 of ⁇ CK.
  • the transcript was synthesized using human CK20 cDNA cloned in pBluescript (STRATAGENE; ⁇ plasmid) using an in vitro transcription system, "CiSam” (Riboprobe in vitro transcription system (Promega @ C ⁇ )).
  • the concentration of the undiluted solution in the thigh was calculated by absorption measurement at 260 nra, and based on the value, ⁇ prepared using 50 tig / ⁇ L yeast RNA (Amibon Neiss) so that the thigh copy of human CK20 became 600,000. And Hyun.
  • Table 2 shows the time required for amplification. The result was a maximum of 40 minutes and was recommended within 30 minutes for most primer sets.
  • Experimental example 3 Among the primer sets examined in L, the time required for amplification was measured. S Short-length primer set was extremely large, and the primer set of ⁇ -primer was used. An experiment was conducted with the aim of examining the age sensitivity measured by the LAMP method.
  • F3 primer KF3-5
  • R3 primer KR3-5
  • F3 primer KF3-5
  • R3 primer KR3-5
  • I ⁇ ffl is the same as in Experimental Example 1-1.
  • FIG. 32 shows the results of the examination of the primer set 1.
  • the amount of human CK20 RNA was high, and the time required for the increase in the amount of RNA was short.
  • the amount of ⁇ was 190 copies, easy amplification was recognized within 30 minutes, and even if the amount of awakening was 600,000 copies, the A was amplified by 10 separations with 10 separations. Similar results were obtained at the age of one set of primer.
  • Cytokeratin (CK) includes human CK20, human CK18, There are known isoforms, such as 19, which have about 60% homology with human CK20; ⁇ consists of a sequence of human CK20 or human CK18 or 19 at the age determined using the primer set of the present invention. The experiment was conducted with the aim of examining the feasibility of the method.
  • the primer sets 1 and 2 which were measured in Experimental Example 3-2 were used.
  • FIG. 33 shows the results of the examination of the primer set 1.
  • Human CK20 RNA is amplified in the primer set, but human CK18 RNA and human OQ9RA are quite widespread. • 3 ⁇ 4rf was tested for its specificity for human CK20 RNA. Similar results were obtained for primer set 2.
  • Fiber was used to examine the measurement sensitivity of human CK20 thighs measured using the primer set.

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Description

明 細 書 サイトケラチ の検出のための核 ,幅用プライマーおょひ該プライマーを用いた 検鼓法 技術分野
本発明は、 ヒトサイトケラチンを検出するための核麵幅用プライマーに関する。 背景技術
サイトケラチン（以下、本明細書中では 「CK」 と記 rる） は、 細胞の瞧性骨格 を形 β¾1 "るタンパク質の一つで、少なくとも 20個の遺 ί ^群からなるファミリ一を形 成し、 ヒト CK18、ヒト CK19及びヒト CK20等カ¾^1である。 CKは ±^細胞で発現され る。
例えばヒト CK18は、享瞧、肺、 MB,胃などの正 且锇だけでなくそれぞれの癌組 織においても発現されること力報告されているが、ヒト CK18は 系糸纖ではないリ ンパ節では発現されないこと力 s知られている。 また、 ヒト αα9 ¾ΐΐ癌、 胃癌、乳癌、 膝癌、 前立藤等で発現されること;^報告されており、 正常糸纖と癌糸且锇でのヒト
CK19の発糧に差が認められる。 ヒト CK20は;^ ¾S、 胃癌、 メルケノ 田胞癌、婦人 科親夜癌、樹亍 J½癌、瞻癌 '胆管癌で発現されること力 s報告されており、 やはり正 職と癌糸職でのヒト CK20の発 ¾4に差が認められる。
そこで、 リンパ節等の紙辙においてヒト 0(18、 ヒト CK19及び Z又はヒト CK20の発 現の有無を調べることで癌の »の有無を β、することができる、 さらに上 IBIES a 織と癌 で発 の差が認められるものを調べることでも癌の!^を β、すること ができる。
癌細胞は、原病巣部位を ϋΗ、 血流やリンパ系を経由して全身に繊する。 癌の手 術では、 できるだけ確実に病巣を取り除くこと力 S必要であるため、 繊を正確に検出 し、率 の度合に応じて適切な処置をすること力 S要求される。 このため、術中のリン ノ、。節への癌繊診断は極めて重要な意義を有している。 例えは 癌の には、 Q0L 向上のために享 纖囲を縮/ wt る傾向であるが、 術中のリンパ節癌繊診断は、 最 小限のリンパ節郭 «tasを決定するための錢な請となりうる。食道癌においては、 リンパ節 の謝 έを検出することにより、 開腹、 閉胸、 頸部切開のうち、 V、1^1の 術式を ¾尺するかの決定するための itifとなりうる。 前立 においては、 リンパ節 があれば摘出 は中止し、 ホノ^ Ε·ン療法を行う等の意思決定の指標となり、 さ らに胃癌においても、術 ¾¾¾ ^後の治療方針の顧の搬となりうる。 又、 唐者へ の負担を考えると、術中の癌 »診断は、 に行うこと力 s必要である。
リンパ節への癌 »診断の 1雜として、癌マーカーとして CKタンパク質を検出す る方法がある。 例えば、切除したリンパ節を it tし、 結した組織の切断面を す る等により行われているが、 このような手法では切断面の†f#のみであるから微小癌 を とす危険性がある。
近年の遺伝子角晰技術の発展により、 癌マーカー遺伝子の発現を検出することで、 効果的に癌診断が行われるようになった。例えば PCR法は、 DNA鎖の 1本鎖への角镇植、 DNA鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの!^、 DNAポリメラーゼによる DNA 合 を繰り返すことによって、 目的の DNA断片を数十万倍にも増幅できる： で あり （特開昭 61 - 274697 報)、種々の^中の核酸の高感度分析法として使用可能 である。 例えば、 動物 ίお夜や織由来の歸中の核酸の分析が可能であるため、感染 症^ t伝病や癌の診断などに有用である。
腿の検出には、 RT-PCR法が利用できる。 RT - PCR法とは、 例えは Ί1 ^職から脆 を抽出し、 オリゴ (dT)又はランダムへキサマーをプライマーにして逆転^^ *(RT)に より cDNAを合成し、 この cDNAを PCR法で 幅し、 検出する方法である。 この挑を 用いた纖荆田月刨重の診断の例が報告されている ( ^ ^ , P. 135-141, vol. 66 (2) , (1991))。 RT- PCRにより、 切除した糸纖から CKの mR A発現の検出力 S可能とな り、 癌歸の としの間題はある ¾t回避されるようになった。 Jffi^癌の診断分 野では、このような核醜幅方法が実用化されている（1«猶¾ 要、第 31版 1314 頁、 麵出版赋会社、 1998年 9月 20日発行)。
しかし、 PCR法では、 匪 DNAの 2本鎖から 1本鎖への変性の操作を必要とし、 増 幅 は複数の 条件で繰り返し行う必要があった。 また、 ~«に検出可能な増幅 産物を得るのに 2時間鍵かかり、 性を要求される術中に行う検査としては好ま しいものではなレ、。
PCR法]^の DNA増幅:^去として、 LAMP法が報告されている （特許文献 1 )。 LAMP 法は、 鎖置 が進 ί ると増幅産物の こヘアピ «造を形财るプライマー ¾Τ ^む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。 まず、 初期 において、 2種 類のィンナーブラィマー（FIP、 RIP)と 2觀のァゥタープラィマー（F3プラィマー、
R3プライマー） Rxmm imkポリメラーゼにより ,DNAから両端に一本鎖 分をもつダンベル状の構造が合成される。 この構造が増幅サイクルの起点 と なって、 この構造の 3，篇則から自己を麵として D Aの伸長'合^ &が進む。増 幅産物は の繰り返 #造からなり、 繰り返 f造の単位はプライマーに挟まれた 被増 ||1畐«を f冓^ 1~る 2本の核酸の: Mi己歹が逆向きになった同^ 内の相補†生 |g域 からなる。 LAMP法は、醒 DNAの 2本鎖から 1本鎖への読 I"生の操作を必要と ·¾τΤ、 增幅^ &はすべて等温で漣鎖に進 t ることカ赚である （非特言牧献 1、 2)。铸 型が RNAの;^には、■が DNAの^の^ にさらに ^を添加する ことで同様に起点構造を合成することができ、 増幅を進めることができる (RT-LA P 法)。 LAMP法では、 30 で検出に十分な増幅産物力 S得られる。 したがって、核酸 検出に要する時間力 S議されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的と したリンパ節への癌 の診断に删できる。 又、迅速に結果が得られることから、 術中診断への翻も期待できる。
LAMP法に删されるプライマーの S ^な考え方は、特許她 1及漏午黨 2に 記載されている。
ヒト CK18検出用の PCR用プライマー又はプローブにつレヽて〖概に報告されている (非特許文献 3)。 同様に、 ヒト CK19検出用の PCR用プライマー又はプローブについ ても既に報告されている （特許文献 3、 非賺: ¾Sfe4)。 また、 同様にヒト CK20検出 用の PCR用プライマー又はプローブにっレ、ても既に報告されてレ、る （嫌許文献 5、 6)。
しかしながら、 ヒト CK検出用であって、 LAMP法に されるプライマーの報告は な その開発が望まれている。 また、 その他の核醜幅手段に細されるプライマ 一でも、 のプライマーのほかに新たなプライマー又は測定に有用なプライマーセ ットの觀が望まれている。
洗行文,
特許文献 1 ：国 開 W0 00/28082 報
特許文献 2：国 開 W0 02/2穩号公報
特許文献 3：米国 US 6203992特 報 ·
非 午文献 1 ： Bioベンチャー、 Vol. 1, No. 1, p. 109-115 (2001)
非特許文献 2： BIO INDUSTRY, Vol. 18, No. 2, p. 15-29(2001)
非特許 3： Gene, 159 (1) , p. 43-47 (1995)
非特許文献 4： Breast Cancer Research and Treatment 60, p. 143-151 (2000) 非特許: ¾5 ： British J. of Cancer, 77(8)， p. 1327 - 1332 (1998)
非特許文献 6： British J. of Cancer, 82(1)， pl57-160 (2000) 発明の開示
(発明カ 決しようとする翻
本発明は、ヒト CKを検出するための核^ ¾幅 S ^に用いる新規プライマーを ^す ることを目的とする。 より具体的には、 LAMP法による核^ if幅用のプライマーを^^ することに関する。
(^^早決するための手段）
本発明者らは、上記纏を解決するために鋭儲討を重ねた結果、 LAMP法に効果的 に適用されるヒト CKを検出するための核麵幅用プライマーを構築することができ た。
即ち本発明は、
1 . LAMP法によりサイトケラチンを検出するための核 幅用プライマー、 2. サイトケラチンが、 サイトケラチン 1 8、 サイトケラチン 1 9及びサイトケラチ ン 2 0からなる群より選択される tt S 1に の核隱 Φ畐用プライマー、
3. 以下の群より凝尺される酉 3 ^からなるオリゴヌクレオチ K¾r ^むヒトサイトケラ チン 1 8検出のための核 ^lf幅用プライマー；
1 ) 配歹瞎号 1で表される; M己列の 270〜1375番目の!¾¾ΐΗ:の相補鎖の領域か ら選択され、 酉 噃号 1及び Ζ又はその相補鎖の連続する纏を少なくとも 5以上含 むオリゴヌクレ才チド、
2) 配歹 I潘号 2〜341のいずれかで表される ¾ae列からなるオリゴヌクレオチド、
3 ) ffflB l ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相捕鎖、
4) ΙΐΠΒΐ) 〜3 ) のいずれか 1に言識のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイプリダィズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )廳己 1 )〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレ、し数個の纏が藤、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された:^己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレ才チド、、
4. 配歹隙号 66-88又は 179〜341で表される ¾¾g己列のレ、ずれかより厭されるォ リゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための核 幅用プライマ
5. 核^ t 幅の手段が LAMP法である fi S 3又は 4に記載の核醜幅用プライマー、 •6. 以下の群より凝尺される酉 Jからなるオリゴヌクレ^ド む核 幅用プラ イマ一から少なくとも 2種を懲尺することを赚とするヒトサイトケラチン 1 8検出 のための核酸増幅用プライマーセット；
1 ) 配歹播号 1で表される 列の 270〜1375番目の«¾1^の相補鎖の繊か ら選択され、 酉^!番号 1及び/又はその相補鎖の する ffiを少なくとも 5以上含 むオリゴヌクレオチド、
2) 配歹噃号 2〜341のいずれかで表される ¾M己列からなるオリゴヌクレオチド、
3 ) 編己 1 ) 又は 2) に言己載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、
4) m l ) ~ 3 ) のレヽずれか 1に纖のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな ^(牛下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )藤己 1 )〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な ヽし数個の：^ ¾が 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された: M己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド、
7 ·核^ If幅の手段が LAMP法である fif¾6に記載のヒトサイトケラチン 1 8検出のた めの核 畐用プライマーセット、
8. オリゴヌクレオチドを含む核薩幅用プライマーから少なくとも 4種を還尺する ことを «とする 7に記載のヒトサイトケラチン 1 8検出のためのプライマーセ ッ K
9. tirt己プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも 2種が、 配歹 I潘号
1で表される; Ma列及び z又はその相補鎖の各々 2 «の領域を認識することを特 徴とする tiPS6〜8のいずれか 1に言識のヒトサイトケラチン 1 8検出のためのブラ ィマーセット、
1 0. 藤己プライマーセットに含まれるプライマーが、 番号 1で表される ^SIH 列及び Z又はその相補鎖の少なくとも 6 «の繊を認識することを赚とする翻
7〜 9の 、ずれか 1に記載のプラィマーセット、
1 1.配歹幡号 234〜341で表される: ¾|己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイ トケラチン 1 8検出のための核酸増 ψ畐用プライマーであって、
( a )酉 (！番号 234〜286、及び （b ) 酉 I播号 287〜341、
に分類した:^の、 （a )及び (b )力 各 1のプライマーを選択した組^:を含むこ とを赚とするプライマーセット、 1 2 . 前項 1 1のプライマーセットに、配列番号 66〜88又は |^【J番号 179〜201で表 される; ¾¾|己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核 幅用プライマーであって、
( c ) 番号 66〜88、 及び ( d) 配歹蹯号 179〜201、
に分類した:^の、 （c )及ぴ ( d)力ら各 1のプライマーを邀尺した組 のプライ マーをさらに含むことを赚とするプライマーセット、
1 3 .前項 1 1又は 1 2のプライマーセットに、配列番号 202〜233で表される 列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための核輔1^用プ ライマーであって、
( e ) 配列番号 202~219、 及び （f ) 配列番号 220〜233、
に分類した の、 (e)及び ( f ) カ ら各 1のプライマーを選択した組"^:のプライ マーをさらに含むことを fi [とするプライマーセット、
1 4. 次に示す 1 ) ~4) のいずれかからなるサイトケラチン 1 8検出のための核酸 増幅用プライマーセット ；
1 )配列番号 234、 287、 66及び 179で表される： ¾g己列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
2)配列番号 252、 297、 68及び 182で表される «|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
3 )配列番号 259、 307、 72及び 184で表される »g己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット、
4)配列番号 278、 331、 79及び 193で表される 己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット、
1 5 . 次に示す 1 -) 〜4) のい f lかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核酸増幅用プライマーセット ；
1 )配列番号 234、 287、 66、 179、 203及び 220で表される: ^のォリゴヌクレオ チドをプライマ一として含むプライマーセット、 2)配列番号 252、 297、 68、 182、 211及び 223で表される ¾|Β列のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット、
3 )配列番号 259、 307、 72、 184、 212及ぴ 226で表される;^! fjのオリゴヌクレオ チドをプライマ一として含むプラィマーセット、
4)配列番号 278、 331、 79、 193、 214及び 228で表される： ^SfE^Jのオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット、
1 6. 次に 1 ) 〜8 ) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核麵畐用プライマーセット；
1 )配列番号 280、 334、 82及び 195で表される ¾¾g己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
2)配列番号 281、 335、 83及び 196で表される ¾¾|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
3 )配列番号 282、 336、 84及び 197で表される ¾|Β列のオリゴヌクレオチドをブラ イマ一として含むプライマーセット、
4 )酉 番号 282、 337、 84及び 197で表される ¾¾S列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット、
5 )配列番号 283、 338、 85及び 198で表される; 己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット、
6)酉己列番号 284、 339、 86及び 199で表される; MI3 ^のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
7)酉己列番号 285、 340、 87及び 200で表される ¾¾|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
8 )配列番号 286、 341、 88及び 201で表される iggga列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット、
1 7. 次に示す 1 ) 〜6) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核酸増幅用プライマーセット； 1 )配列番号 282、 336、 84、 197、 216及び 229で表される itSi^[Jのオリゴヌクレオ チドをプライマ一として含むプラィマーセッ I、、
2)配列番号 282、 337、 84、 197、 216及び 230で表される;^ £|例のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット、
3 )配列番号 282、 337、 84、 197、 216及び 231で表される： 己列のォリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット、
4)配列番号 283、 338、 85、 198、 217及ぴ 232で表される のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット、
5)配列番号 286、 341、 88、 201、 218及ぴ 233で表される のオリゴヌクレオ チドをプライマ一として含むプライマーセット、
6)配列番号 286、 341、 88、 201、 219及び 233で表される ^^5^のオリゴヌクレオ チドをプライマ一として含むプライマーセット、
1 8. tt S3若しくは 4に記載のプライマーから必要なプライマーを慰尺し、 又は請 求項 5〜 1 7のいずれか 1に雄のプライマーセットを «して使用することによる ヒトサイトケラチン 1 8の核酸検出^去、
1 9. 以下の群より 尺される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケ ラチン 1 9検出のための核 幅用プライマー；
1 )配列番号 342で表される:^ SgS列の 270〜930番目の令 の相補鎖の繊か ら潘尺され、 酉 3 ^番号 342及び Z又はその相補鎖の連続する； ¾を少なくとも 5以上 含むォリゴヌクレオチド、
2) 配歹幡号 343〜432のい 1^かで表される ^SIS列からなるオリゴヌクレオチド、
3 ) fulBl ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相捕鎖、
4) i) 〜3) のいずれか 1に言 のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )藤己 1 ) 〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な！/、し数個の が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された; 己列 ¾r ^み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレ才チ
2 0. 酉 【J番号 357〜361又は 378〜434の酉 S^J番号に表される:^ S3列のレ、ずれかよ り激尺されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 9検出のための核酸 増幅用プライマー、
2 1 ·核赚幅の手段が LAMP法である fi l l 9又は 2 0に記載のヒトサイトケラチン 1 9検出のための核酸増幅用プライマー、
2 2. 以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核輔幅用プ ライマーから少なくとも 2種を選択することを とするヒトサイトケラチン 1 9検 出のための核^ #(·冨用プライマーセット；
1 )配列番号 342で表される； ¾g己列の 270-930番目の麵扱 ϋ ^の相捕鎖の赚か ら慰尺され、 酉 番号 342又はその相補鎖の連^る を少なくとも 5以上含むォ リゴヌクレオチド、
2) 配歹播号 343〜434で表される ¾S|己列からなるオリゴヌクレオチド、
3) tiftB l ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎮、
4) S l ) 〜3 ) のいずれか 1に |¾のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 餅下でハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )藤己 ）〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な！、し数個の驢が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された; S¾己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド、
2 3.核^ #幅の手段が LAMP法である前項 2 2に記載のヒトサイトケラチン 1 9検出 のためのプライマーセット、
2 4. オリゴヌクレオチドを含む核翻幅用プライマーから少なくとも 4種を邀尺す ることを とする tf S 2 2又は 2 3に記載のヒトサイトケラチン 1 9検出のための プライマーセット、
2 5. stfiBプライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも 2種が、 号 342で表される ^及び/又はその相捕鎖の各々 2箇所 頁域を認識すること を赚とする翻2 2〜2 4のいずれか 1に記載のヒトサイトケラチン 1 9検出のた めのプライマーセット、
2 6. プライマーセットに含まれるプライマーが、 酉 潘号 342で表される纏 配列及び/又はその相補鎖の少なくとも 6麵の領域を認織することを難とする前 項 2 2〜2 5のいずれか 1に纖のヒトサイトケラチン 1 9検出のための核鹏幅用 プライマーセット、
2 7.配歹隙号 413〜434に表される:^ ¾己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイ トケラチン 1 9検出のための核 幅用プライマーであって、
( a ) fj番号 413〜417、 419、 422若しくは 424〜427、及び
(b ) 酉 E^IJ番号 418、 420、 421、 423若しくは 428〜434、
に分類した の、 (a)及び (b )力ら各 1のプライマーを纖した組 を含むこ とを赚とするプライマ セット、
2 8. 翻 2 7で選択された各プライマーの組^:に、
酉己列番号 357〜361又は 378〜384に表される^ ¾己列のオリゴヌクレオチドからなる ヒトサイトケラチン 1 9検出のための核輔幅用プライマーであって、
( c ) 酉 B ^番号 357〜361、及ぴ（d) 酉 ϋ番号 378〜384、
に分類した の、 ( c )及び ( d )力 各 1のプライマーを選択した組^:のプライ マーをさらに含むことを纖とするプライマーセット、
2 9. 2 7又は 2 8で 尺された各プライマーの組 "^に、
配列番号 385—412に表される ¾£| ijのオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケ ラチン 1 9検出のための核 ^^幅用プライマーであって、
( e ) 酉 3^[J番号 385〜398、及び（f ) 酉^ Γ潘号 399〜412、
に分類した:^の、 (e)及び ( f )力 各 1のプライマーを選択した組^:を含むこ とを赚とするプライマーセット、
3 0. 13列番号に表される; g¾|己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラ チン 1
Figure imgf000012_0001
マーであって、 1) 〜4》 のいずれかの糸且合 せを含むプライマーセット；
1) (a) 配列番号 413〜417、 (b) 配歹播号 418、 (c) 酉 墦号 357、 (d) 配歹播 号 378に分類した^の、 各分類から 1のプライマーを爵尺した組^:。
2) (a) 配列番号 419、 (b) 酉 IJ番号 420〜421、 (c) 酉 2 ^番号 358、 (d) 配歹蹯 号 379に分類した：^の、各分類から 1のプライマーを鐵尺した組^:。
3) (a) la^J番号 422、 (b) 配歹瞎号 423、 (c) 配列番号 359、 (d) 配歹瞎号 380 に分類した の、各プライマーを激尺した組^:。
4) (&)配列番号424〜427、 （b)配歹躍号 428〜434、 （c)配歹 I墦号 360〜361、 (d) 配列番号 381〜384に分類した の、各分類から 1のプライマーを激尺した組 ：、 31. 1己列番号に表される 己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラ チン 19検出のための 幅用プライマーであって、 1) 〜4) のい かの組合 せを含むプライマーセット；
1) (a) 配列番号 413〜417、 (b) 配歹噃号 418、 (c) 番号 357、 (d) 配歹噃 号 378、 （e)膨!)番号 385〜391、 （ f )酉 番号 399~402に分類した の、各分類 から 1のプライマーを 尺し 且^¾：。
2) (a) 配列番号 419、 (b) 酉 fl^J番号 420~421、 (c) 酉 番号 358、 (d) 配歹噃 号 379、 (e) S ^番号 392〜393、 (f)酉 S^J番号 403〜406に分類した ¾ ^の、各分類 力 1のプライマーを ¾ した組^:。
3) (a)配歹瞎号 422、 （b)配歹播号 423、 （c)配列番号 359、 （d)配歹播号 380、 ( e )配歹幡号 394-396, ( f )配歹躍号 407-409に分類した^の、各分類から 1 のプライマーを選択した組^:。
4) (&)配列番号424〜427、 （b)配歹隙号 428〜434、 （c)配歹噃号 360〜361、 (d) 配列番号 381〜384、 (e) 配列番号 397〜398、 (f) 配歹蹯号 411〜412に分類した場 合の、各分類から 1のブラィマーを邀尺し: ^：、
32. 1) ~3) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 19検出のための核麵幅 用プライマーセット； 1 ) 配歹 I墦号 413、 418、 357及ぴ 378で表される ¾¾|2列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマーセット。
2) 配歹 I潘号 419、 421、 358及び 379で表される ^£1己列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマーセット。
3 ) 配歹瞎号 424、 431、 360及び 381で表される; MS己列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマーセット。
3 3. 1) 〜4) のい かからなるヒトサイトケラチン 1 9検出のための核 幅 用プライマーセット；
1 ) 配歹瞎号 413、 418、 357、 378、 385及ぴ 402で表される:^ ^己列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット、
2) 配歹瞎号 419、 421、 358、 379、 392及ぴ 404で表される: 己列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセヅト、
3 ) 配歹蹯号 422、 423、 359、 380、 394及ぴ 407で表される: 列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット、
4)配歹 1墦号 424、 431、 360、 381、 397及び 411で表される 己列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット、
3 4. 麵 1 9若しくは 2 0に記載のブラィマーから必要なプライマーを選択し、 又 は醒 2 1〜3 3のい" mかから蒙されるプライマーセットを棚することによる 核酸検出方法、
3 5. 以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケ ラチン 2 0検出のための核酸増幅用プライマー；
1 )配列番号 35で表される:！ ¾己列の 340〜490番目若しくは 495〜1050番目 域 及びそれらの相補鎖 廳から疆され、 酉 3 ^番号 435及び Z又はその相補鎖の連続 する を少なくとも 5以上含むォリゴヌクレ;^ド、
2)配^ (藤号 436〜460のい "f^かで表される ¾¾i己列からなるオリゴヌクレオチド、 3 ) ItftBl) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、 4) HolB l ) 〜3) のいずれか 1に謹のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )藤己 1 )〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレ、し数個の驢が謹、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された謹己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド、
3 6. 【J番号 443、 444又は 454〜474の酉 番号に表される 列のレ、ずれかよ り選択されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 2 0検出のための核酸 増幅用プライマー、
3 7.核^ t|幅の手段が LAMP法である薩 3 5又は 3 6に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のための核 幅用プラィマー、
3 8. 以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核醜幅用プ ライマーから少なくとも 2種を 尺することを«とするヒトサイトケラチン 2 0検 出のための核^ if幅用プライマーセット；
1 ) 配歹瞎号 435で表される 列の 340〜1050番目及びその相補鎖の «から選 択され、 配列番号 435及び/又はその相補鎖の;^する ¾Sを少なくとも 5以上含む オリゴヌクレオチド、
2) 配歹瞎号 436から 460のいずれかで表される: raiS列からなるオリゴヌクレオチ ド。
3) SfflB l ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相捕鎖、
4) fiifBl ) 〜3) のいずれか 1に のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド、
5 )嫌己 1 )〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な 、し数個の が置換、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された: raia列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレ才チド'、
3 9.核鍵幅の手段が LAMP法である讓 3 8に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出 のためのネ亥 幅用プライマーセット、 4 0. オリゴヌクレオチドを含む核麵幅用プライマーから少なくとも 4種を懲尺す ることを赚とする Μ¾3 9に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマ 一セッ卜、
4 1 . 藤己ブラィマーセットに含まれるブラィマーのうち少なくとも 2種が、 号 435で表される; ^¾B 及び Z又はその相補鎖の各々 2«© 1域を認識すること を賺とする |ί ΐ 3 8〜4 0のいずれか 1に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のた めのプライマーセット、
4 2. SfflBプライマーセットに含まれるプライマーカ 酉 J番号 435で表される：^ S 配列及び Z又はその相補鎖の少なくとも 6 « 域を認識することを とする請 求項 3 8〜 4 1の ヽずれか 1に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマ ーセット。
4 3. 番号 461〜466及び 468〜473に表される; のオリゴヌクレオチドか らなるヒトサイトケラチン 2 0検出のための核 ^^幅用プライマーであって、 （a ) 配列番号 461〜466、 (b )酉 J番号 468〜473に分類した;^の、 ^^類から 1のプラ イマーを懲尺した組^:を含むことを難とするプライマーセット、
4 4. 醒 4 3で豫された各プライマーの組^:に、 さらに酉 I潘号 444及確列 番号 455で表される 己列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むヒトサイ トケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
4 5. 3又は 4 4に記載のプライマーセットにさらに配歹播号 457及び Z又は 459若しくは 460で表される «1己列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含む ヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット、
4 6. 酉 【J番号 443、 454、 467及ぴ 474で表される；^ Sf^lJのオリゴヌクレオチドを プライマーとして含むヒトサィトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット、 4 7. I^IJ番号 443、 454、 467及び 474で表される; のオリゴヌクレオチドの 他にさらに配歹幡号 456及び Z又は 458で表される:^ β ^のオリゴヌクレオチドを プライマーとして棚するヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット、 48. 翻 35若しくは 36に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、 又 は翻 37〜47のレ、ずれかから厭されるプライマーセット删して行う核酸検出 方法、
49. 核酸検出: が LAMP法である前項 18、 34又は 48に記載の核酸検出:^去、 50. ¾ l 8、 34、 48又 fま 49に言己載の核酸検出;^去に棚する纖、
51. ffSl 8、 34、 48又は 49に記載の核酸検出; ^去に麵する纖キット、
52. m i 8N 34、 48又は 49に記載の核酸検出; を用いた核酸検出システ ム、 からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒト CK18のプライマーセット Iを用 、て LAMP法を行つた:！^の結果を 示す図である。 溪験例 1— 1)
第 2図は、ヒト CK18のプライマーセット IIを用いて LAMP法を行った^の結果を 示す図である。 ( 験例 1— 1)
第 3図は、 ヒト CK18のプライマーセット IIIを用レ、て LAMP法を行った^の結果 を^図である。 （実験例 1— 1)
第 4図は、ヒト CK18のプライマーセット IVを用いて LAMP法を行った^の結果を 示す図である。 溪験例 1— 1)
第 5図 、 ヒト CK18のプライマーセット Iひ I ^ププライマーあり）を用いて LAMP 法を行った^^の結果を示す図である。 （実験例 1一 2)
第 6図は、 ヒト CK18のプライマーセット I (/ "ププライマーな Uを用いて LAMP 法を行った^の結果を示す図である。 験例 1-2)
第 7図は、 ヒト CK18のプライマ セット Iを用、て LAMP法を行った^の増幅特 異十生を^ T図である。 溪験例 1— 3)
第 8図は、ヒト CK19のプライマーセット A (Λ^ププライマーなし）を用いて LAMP 法を行った:^の結果を示す囡である。 （実験例 2— 1) 第 9図は、ヒト CK19のプライマーセット A (ノ "ププライマーなし）を用いて LAMP 法を行った の結果を示す図である。 （実験例 2-1)
第 10図は、 ヒト CK19 のプライマーセット A ひ ~ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った の結果を示す図である。 （実験例 2— 1)
第 11図は、 ヒト CK19のプラィマーセット A ひ ププラィマーあり） を用レ、て LAMP法を行った の結果を示す図である。 （^^例 2-1)
第 12図は、 ヒト CK19のプライマーセット A "ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った^の結果を示す図である。 （実験例 2— 1)
第 13図は、 ヒト CK19のプライマーセット C (ノトププライマ一なし） を用いて LAMP法を行った の結果を示す図である。 （実験例 2— 2)
第 14図は、 ヒト CK19 のプライマーセット C ひ "ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った:^の結果を示す図である。 （実験例 2— 2)
第 15図は、 ヒト CK19のプライマーセット C "ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った^の結果を示す図である。 （実験例 2-2)
第 16図は、 ヒト CK19 のプライマーセット C ~ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った;！^の結果を示す図である。 （^例 2-2)
第 17図は、 ヒト CK19のプライマーセット C ひ "ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った： ^の結果を示す図である。 （実験例 2-2)
第 18図は、 ヒト CK19 のプライマーセット C ひトププライマ一あり） を用いて LAMP法を行った^の結果を示す図である。 （実験例 2— 2)
第 19図は、 ヒト CK19のプライマーセット C ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った ¾ ^の結果を示す図である。 （^験例 2— 2)
第 20図は、 ヒト CK19 のプライマーセット D ププライマ一なし） を用いて LAMP法を行った^ ^の結果を示す図である。 （実験例 2-3)
第 21図は、 ヒト CK19のプライマーセット D ププライマーあり） を用いて LAMP法を行った：^の結果を示す図である。 （実験例 2-3) 第 2 2図は、 ヒト CK19のプライマーセット Aを用いて LAMP法を行った #^の結果 を示す図である。 （実験例 2— 4)
第 2 3図は、 ヒト CK19のプラィマーセット Bを用レ、て LAMP法を行つた の結果 を示す図である。 （実験例 2— 4)
第 2 4図は、 ヒト CK19のプライマーセット Cを用 、て LAMP法を行った： ^の結果 を示す図である。 （実験例 2— 4)
第 2 5図は、 ヒト CK19のプライマーセット Dを用いて LAMP法を行つた:^の結果 を示す図である。 （実験例 2— 4) '
第 2 6図は、 ヒト CK19のプライマーセット Aを用 、て LAMP法を行った ^の増幅 特異性を示す図である。 （実験例 2— 5)
第 2 7図は、 ヒト CK19のプライマーセット Bを用レ、て LAMP法を行った の増幅 特異性を示す図である。 （実験例 2— 5 )
第 2 8図は、 ヒト CK19のプライマーセット Cを用レ、て LAMP法を行った:^の増幅 特異性を^ iaである。 （^験例 2— 5)
第 2 9図は、 ヒト CK19のプライマーセット Dを用!/、て LAMP法を行った の増幅 特異性を示す図である。 （^験例 2— 5)
第 3 0図は、 ヒト CK19のプライマーセット Cを用！/、て LAMP法を行った # ^の結果 を示す図である。 （¾^例2— 6 )
第 3 1図は、 ヒト CK19のプライマーセット Cを用いて LAMP法を行つた の結果 を示す図である。 （実験例 2— 7)
第 3 2図は、 ヒト CK20のプライマーセット 1を用!、て LAMP法を行った^の結果 を示す図である。 （^験例 3— 2)
第 3 3図は、 ヒト CK20のプライマーセット 1を用レ、て LAMP法を行った:^の増幅 特異性を示す図である。 （実験例 3— 3)
第 3 4図は、 ヒト CK20のプライマーセット 3を用いて LAMP法を行った の結果 を示す図である。 （実,験 ί列 3—4) 第 3 5図は、 ヒト CK20のプライマ一セット 3を用 、て LAMP法を行った の増幅 特異' (■生を示す図である。 （実験例 3— 5) 発明の実施するための最良の形態
(プライマーの設計）
本発明は、 ヒト CKの核 幅法、好ましくは LAMP法に删可能な核薩幅用のプ ライマーを^ るものである。該プライマーは、例えば、^!の配列番号 1， 342, 435 等に表される CKの 列及び Z又はその相 »な配列から ^する：^ ¾を少なく とも 5以上含 当なォリゴヌクレ^^ドを選択して設計することができる。
LAMP法で用いるプライマーの な考 ^は、 特許文献 1に記載の通りである。 具体的には、増幅すべき標的 D Aの、 3' ¾{則から順に F3c、 F2c、 FLcという繊を、 5' ¾¾(則から順に尺3、82、1?1という ΐ滅を規定し、少なくともこの 6つ 域に対し、 実質的に同一な: 列、 又は実質的に相補的な;^ を含むオリゴヌクレオチド 鎖を 尺し、 少なくとも 4種のプライマーを設言十する。
実質的に同じ ¾|己列とは、 次のように錢される。 すなわち、 ある;^ SS己列を铸 型として合成された相補鎖が、 目的の iffiE に対してハイブリダィズし、 相補鎖合 成の起点を与えるとき、 この配列は目的の iffl iJに対して実質的に同一である。 例 えば、 F2に対して実質的に同一な;^ Jとは、 F2と全く同一な; 己列に加えて、 F2にハイブリダィズして相補鎖合成の起点となりうる;^ £|β^を与える,として 機能する:^ IE ^を含む。
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構财る:^ SIE列の賺付けのために用いら れる同一、 あるいは相涵という用語はい も に同一、 あるいは ^^に相補的 であることを要しない έ すなわち、 ある配列と同一とは、 ある に対してハイプリ ダイズするこ
Figure imgf000020_0001
とができる。紘 相補的とは、 ストリンジェントな餅下でハイブリダィズすることができ、 相捕鎖合 成の となる 3' を»することができる酉 2 ^を意味する。 本発明のプライマーは、 以下に述べる各種の核^^ におレ、て与えられた のもとで、必要な特異十生を維持しながら相補鎖との «対 ^を行うことができる の鎖長をもつ。 具体的には 5〜200驢、 より望ましくは 10~50 ¾¾対とする。 配列 依存的な核^^を 某する^のポリメラーゼカ S認識するプライマーの鎖長は 最低 5驢前後であることから、 ノ、イブリダイス、する部分の鎖長はそれ以上である必 要がある。カロえて、 己列としての特異性を膽するためには、 ΙΟΙββΟ:の長さ を維持するの力 s望ましい。 一方、 あまりにも長い; 己列は化学合成によって調製す ることが困難となること力ゝら、 Sift己のような鎖長が望ましい範囲として例示される。 本発明にぉレ、て用レ、られる麵とレ、う用語は、相補鎖合成の醒となる側の核酸を 意味する。 醒に相補的な 己列を持つ相補鎖は、 麵にハイブリダィズしうる鎖 としての意味を持つ力 \両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、 相補鎖として合成された鎖は、 再! «として機能することができる。 つまり、相補 鎖は^ Sになることができる。
本発明において、 標的 DNA の塩基配列から選択されるプライマーは、 各々 FIP (forward inner primer)、 F3プライマー (forward outer primer)、 RIP (reverse inner primer) 及ぴ R3プライマー (reverse outer primer) のいずれ力、を†冓^" t"る。
FIPは、標的 DNAの F2c領域と実質的に相働な F2領域の: ®¾| Jを 3' にもち、
5， ¾に標的 DNAの Flc領域と実質的に同じ: 列をもつように設計する。 この場 合にぉレ、て、 F2及ぴ Flcの酉 E ^間に標的 DMに依存しな 、酉己列が介在してレ、ても良レ、。 この標的 DNAに依存しなレ、配列の長さは 0〜50 、 好ましくは 0〜40驢であれば 言午容しうる。
F3プライマーは、標的 DNAの F3c領域と実,に相 ffi^な F3 ^Sfe戈と実質的に同じ ¾S|己列をもつように設計する。 -
RIPは、標的 DNAの R2c領域と実質的に相欄な R2領域の： Jを 3' にもち、 5， こ標的 DNAの Rlc領域と実質的に同じ 列をもつように設計する。 RIPも FIPと同様に、 R2及ぴ Rlcの酉 』の間に標的 DNAに依存しなレ、酉 力介在してレ、ても 良い。
R3プライマーは、標的 DNAの R3c領域と実 ®½に相補的な R3 «と実質的に同じ ¾Sffi^Jをもつように設計する。
また、 LAMP法では、少なくとも 1種以上のゾトププライマーを併用することで增幅 時間を »Τることができる （赚文献 2)。 ププライマーとは、ダンベル構造の 5' ¾ 則のノ "プの 1本鎖部分、 具励には例えば R1領域と R2領域の間、 あるいは F1領域と F2領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。 ノ ププライマーを 用いることにより DNA合成の起 を増 "こと力 S可能となる。 このノ1^~ププライマ一 は、 DNA合成過程でできた FIP又は RIP力 Sハイブリダイズしな！/ プ領域にハイブ リダイズするように設計する。
(ヒト CK18検出用のプライマーの設計）
ヒト CK18検出用のプライマーは、 の配歹瞎号 1に表される 1412驢よりなる 己列及び/又はその相補的な配列から、連^ Tる を少なくとも 5以上含む適 当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。 尚、 配列番号 1 に示 ¾翻己列は Genbank accession No. 4557887に基づく。
ヒト CK18検出用のプライマーも、上記プライマーの原理に従った領域を激尺して設 計する。
ヒト CKI8検出用プライマーの領域は、 rnm , GC含量、 二次構造、 ¾値などに ¾ し、 DNA領域を認識する纏己列の長さは、 が少なくとも 5驢以上、 好 ましくは 10~30 より好ましくは 17~25 のものを激尺することができる。 Tm値は、 に Nearest Neighbor法で求めることができる。 DNA繊は、 Tm値が 55〜65°C、 好ましくは 58〜64°Cのものを選択し、 GC含量が 40〜70%、好ましくは 50 〜65%のものを 尺することができる。
このような条件により、 本発明で選択されたプライマーの領域は、酉 番号 1で表 される iffi己列の 270〜1375番目の ^の相捕鎖 貝域、好ましくは 己列 の 280〜580番目の領¾¾びその相補鎖の fg¾に含まれる。
ヒト CK18検出用プライマーは、 1) 配列番号 1で表される 列の270~13ァ5番 目の領職ぴ Z又はその相捕鎖の領域に含まれ、 β:が少なくとも 5以上のオリゴ ヌクレオチド、 2) 配歹幡号 2〜41でまされる: 列からなるオリゴヌクレ^ド、 3) 鍵 S 1)又は 2)に記載のオリゴヌタレ; ドの相漏、 4) Stft己 1)〜3)のレヽずれか 1に記載のォリゴヌクレオチドとストリンジェントな条 ί牛下でハイブリダィズしうる オリゴヌクレオチド、 又は、 5) m 1)〜4)に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1 ないし数個の纏が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された 己列を含 むオリゴヌクレオチド、 力ゝら截尺され、 設計される。
オリゴヌクレオチドは、 自体^ qの方法により製 ることができ、例えば化学的 に合^ ることができる。 あるいは、天然の核酸を制 などによって切断し、 上 記のような i∞己列で構成されるように改変し、あるい〖继結することも可能である。 具体的には、 オリゴヌクレオチド合成装置 （アプライドバイオシステムズ社製
Expedite Model 8909腿合 等を用いて合 ^ ^ることができる。 また、 1ない し数個の驢が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチ ドの合戯も、 自体^]の難を删することができる。 例えば、 部位特異的変異導 入法、遺伝子相同糸應ぇ法、 プライマー伸長法又は PCR法を戦虫又は適: ¾且^¾：て、 例 【3：、 Molecular Cloning;A Laboratory Manual^ 2 |¾、 Sambrook り編、 コーノレド ' スプリング ·ハーバ一■ラポラトリ一'プレス、 コールド ·スプリング ·ハーバー、 ニューヨーク、 1989年； [ラボマ二ユアノ Ht伝子工学]、ネ 公正鶴、丸 ¾ ^会社、 1988年； [PCRテクノロジー、 DNA増幅の と応用]、 Ehrlich, HE.編、 ストックト ンプレス、 1989年等に記載の; ^去に準じて、あるいはそれらの^去を改変して す ることができ、例えば Ulmerの技術 (Science(1983) 219:666)を利用することができる。 ストリンジェントなハイブリダイゼーション ^(牛は一般に知られたものを; ϋί尺する ことができる。 その一例としては、 50%ホルムアミド、 5XSSC (l50mMNaClN 15mMク ン^サナトリウム)、 50mMリン酸ナトリウム， pH7. 6、 5 Xデンハーツ裔夜、 10%デ キストラン硫 及び 20 μ g/mlの DNA ¾ ^む裔夜中、 42。Cで一晩ハイブリダイゼーシ ヨンした後、 室温で 2 XSSC - 0. 1%SDS 中で一次洗浄し、 次いで、約 65°Cにおいて 0. 1 XSSC , 0. 1%SDSで二次 »といった^ (牛があげられる。
ここで増幅されるべき核酸の,はヒト CK18の mRNAであるから、 するプライ マーが、検体中に含まれるゲノム DNAを増幅しないように設計すること力 S必要とされ る。 具働には、 本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも 1つ は、ヒト CK18の遺 において複数のエタソンにまたがる領域 ¾r ^むものであること 力望ましい。 このような工夫を行うことによって、 ゲノム DNA由来の配列の増幅が排 除され、 ヒト CK18の mRNA由来の配列を邀 に増幅すること力 S可能となる。
(ヒト CK19検出用のプライマーの設計）
ヒト CK19検出用のプライマーも、 ヒト CK18検出用プライマーと同様に、 設計する ことができる。 ヒト CK19検出用プライマーは、 ^flの酉 IJ番号 342に表される 1360 驢よりなる: ¾SI己列及ぴ Z又はその相補的な膨 ijから、連続する; Μを少なくとも 5以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。 尚、 配歹蹯号 342に示 は Genbank accession No. 4504916に基づく。
ヒト CK19検出用プライマーも、 上記の腿に従った繊を懲尺し、設計する。 ヒト CK19検出用プライマーの繊は、配列番号 342で表される ίΙΜ己列の 270〜930 番目の镇 びその相補鎖の領敏、好ましくは 270〜560番目、 370〜585番目、 625〜 854番目の しくは 655~930番目及びそれらの相補鎖の領域に含まれる。
ヒト CK19検出用プライマーは、 1) 配歹幡号 342で表される:^ ¾己列の 270〜930 番 の«¾ぴ Z又はその相補鎮の繊に含まれ、 好ましくは 270〜560番目、 370〜 585番目、 625〜854番目若しくは 655〜930番目 ぴ Z又はそれら相補鎖^ ^域 に含まれ、 が少なくとも 5以上のオリゴヌクレオチド、 2) 配列番号 343〜382 で表される ¾β列からなるオリゴヌクレオチド、 3) 編己 1)又は 2)に纖のオリゴ ヌクレオチドの相補鎮、 4) 謝己 1)〜3)のレ、ずれか 1に記載のォリゴヌクレオチドと ストリンジェントな^ (牛下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、 5)前 記 1) ~4)に のォリゴヌクレ^ドのうち、 1な ヽし数個の が置換、欠失、揷 入もしくは付加といった変異された: ^己列を含むオリゴヌクレオチドカゝら澍尺され、
IX 5十 5れる。
(ヒト CK20検出用のプライマーの設計）
ヒト CK20検出用のプライマーも、ヒト C 18検出用プライマ^^ヒト CK19検出用の プライマーと同様に、設計することができる。 ヒト CK20検出用プライマーは、 Oの 酉己列番号 435に表される 1275 よ
Figure imgf000025_0001
連続する を少なくとも 5以上含 ¾1当なオリゴヌクレオチドを選択して設計され る。 尚、配列番号 435に示す 己列は Genbank accession No. 402644に基づく。 ヒト CK20検出用プライマーも、 上記の願に従った滅を舰し、設計する。 ヒト CK20検出用プライマーの繊は、 酉 番号 435で表される iffi己列の 340〜 1050番目の^ ¾OTの相捕鎖 (7^1域、好ましくは 340〜490番目若しくは 495〜1050 番目の _Β¾¾Ό ^れらの相捕鎖の領域、 さらに好ましくは 340〜490番目、 495〜570 番目若しくは 790〜1050番目 びそれらの相補鎖 (^貝域に含まれる。
ヒト CK20検出用プライマーは、 1) 配歹播号 435で表される «I己列の 340〜1050 番目の び Z又はその相補鎮の«に含まれ、好ましくは 340〜490番目若しくは 495〜1050番目の び Z又はそれらの相捕鎖の領域、さらに好ましくは、 340〜490 番目、 495〜570番目若しくは 790〜1050番目の び/又はそれらの相捕鎖 域 に含まれ、 [が少なくとも 5以上のオリゴヌクレオチド、 2) 配列番号 436〜474 で表される^ ¾己列からなるオリゴヌクレオチド、 3) ΙίϊΙΒ 1)又は 2)に言 のオリゴ ヌクレオチドの相補鎖、 4) tiff己 1)〜3)のレヽ f¾か 1に記載のォリゴヌクレオチドと ストリンジェントな条件下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、 5)前 記 1)〜4)に記載のオリゴヌクレオチドのうち、 1ないし数個の が纖、欠失、揷 入もしくは付加といった変異された; 己列を含むオリゴヌクレオチドカ 選択され、 設計される。 ' (プライマーセット）
本発明のプライマーを翻して核 畐を行う^、少なくとも 2種を組^:てプ ライマーセットとして棚する。 LAMP法では、少なくとも 4種のプラィマー (FIP、 F3 プライマー、 RIP、 R3プライマー)を糸且^:てプライマーセットとして棚する。 さら に、 1 上のノ ププライマーを組^:て、 プライマーセットとして^ fflすること あでさる。 (RT-LAMP法）
RT-LAMP法は、 RNAを βとする LAMP法であり、 LAMP法の ¾Φ的な考え方は、特許 文献 1に記載の通りである。 RT-LAMP法では一つの、職中で、麵脆から cDNAを合 成しながら、 LAMP法の起 構造が合成される。具脑には次の 1)のステップを経た後、 2)〜5)ステップの繰り返しにより、 DNAの伸長力 S繰り返され、標的 DNAの増幅が行わ れる。
1)醒 RNA鎖に FIP力 し、顯 RNA鎖に相勸な DNA鎖が伸長する。 この は 逆転^^、例えば蕭由来の逆転 等を用いる。
2) 上記 1)で合成した FIPからの DNA鎖を、 F3プライマーが, RNAから剥がしなが ら、羅腿鎖に相補的な DNA鎖が伸長する。 以降 DNA鎖の伸長は DNAポリメラーゼ による。
3) 上記 2)で がされた DNA鎖に、 RIP力 S して DNA鎖が伸長する。
4) 上記 3)で伸長した RIPからの DNA鎖を R3プライマーカ S剥がしながら、 FIPからの
DNA鎖に相猶な DNA鎖が伸長し、 LAMP法の起点構造が合成される。 -
5) 上記 4)で剥がされた D A鎖の両端の配列は、 同じ諷鎖の配列中に相補的な配列 を有するので、 各々ノヽイブリダィズし、 両端に/ "プ構造を持つ。
なお、例えば BcaDNA polymeraseのように、 逆転^^活性と DNAポリメラーゼ活 性の両活性を有する酵があり、 このような^ *を使用する ^は、 上記の は 1 つの酵素で実施することができる。
(検出方法）
LAMP法では、合成された DNA鎖は自己の配列に対して相捕的な配列をもつので、そ の大部分が腿対齡を形成している。 この赚を利用して、 増幅賊物の検出が可 能である。 ェチジゥムブ口マイド、 SYBER GREEN I、 あるいは Pico Greenのような 2 本鎖インターカーレーターである蛍 ¾fe素の 下で本発明のプライマーを用いて核 鹏幅を謹すれば、 «物の増加に伴って蛍光娘の増大が纏される。 これをモ 二ター lば、閉鎖系で DNAの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である 検査法 提要、 31版 1318頁；特開 2001 - 242169号公報参照。 以下単に 「リアルタイム法 j と いう）。
また、 LAMP法では、増! fi¾&の過程で、副産物として †生のピロリ^^マグネシ ゥムが し、 白濁する。 そこで、 夜の濁りを目視により鶴忍する、 あるいは反 夜の吸¾ ^^乱光艘を測定して濁度を検出する、 または 夜を有色のフィル ターでろ過し、 フィルター上の残渣を廳することにより増幅 «物の有無を検出す ることができる （国！^開 W001/83817号参照)。 m, 難キット、 その
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の^^は、 あらか じめパッケージングしてキッ Ηはることができる。 具励には、 本発明の相補鎖合 成のプライマーとして、 あるいは置細のプライマーとして必要な各種のオリゴヌク レオチド、逆転 性を有する,、相補鎖合成の基質となる d TP、鎖置換型の相補 鎖合成を行う DNAポリメラーゼ、 酵素 に好適な条件を与える緩衝液、 必要があれ ば RNaseインヒビターのように増幅 を |5且害する物質を除去するための難 I さら に必要に応じて 物の検出のために必要な がキットとして撒される。 本宪明は、核綱幅用プライマー及びプライマーセット、 ならびにこれらのプライ マーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に ^fflされる検出藤、核酸検出キットな らぴ〖 酸検出システム全体に及ぶ。
(実施 )
以下、 本発明を謹例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に 限定されるものではない。 (実施例 1 - 1 ) ヒト CK18； ^己列から (^靡の蒙
配列番号 1に記 ^るヒト CK18の ¾¾^fjから、プローブ 計ソフトを用いて LAMP 法に適切な領域の位置を検討した。 Flc及び Rlcは Tm値が 58. 5-63. 5°C、 F2及び R2 は Tra値が 61. 5-62. 5°C、 F3及び R3は Tm値が 58. 5-62. 5°Cの条件により領域を選択 した結果、 7火に ^1 "ものが選択された。 選択された領域は、 配歹蹯号 1で表される塩 翻 3列の 340〜1050番目の領 びその相捕鎖 (^貝域に含まれる。
Flc：配歹蹯号 1
Figure imgf000028_0001
442- 420 tgaagtaatggctccagtctctg fl歹蹯号
439-418 agtaatggctccagtctctgac 己歹瞎号 3)
443- 421 ttgaagtaatggctccagtctct ©己歹 I潘号 4)
419-403 acctggggtcccttctt ®己歹瞎号 5)
414-396 gggtcccttcttctccaag ®E歹蹯号 6)
413-394 ggtcccttcttctccaagtg ®Ξ歹 (潘号 7)
412-393 gtcccttcttctccaagtgc @己歹瞎号 8)
411-392 tcccttcttctccaagtgct 己歹【] 号 9)
410-392 cccttcttctccaagtgctc ®己歹幡号 10)
409-390 ccttcttctccaagtgctcc 号 11) 584-568 acagactggcgcatggc d己歹蹯号 12)
620- 602 tcaatgaccttgcggagcc 墦号 13)
621- 602 atcaatgaccttgcggagcc ©己歹蹯号 14)
622- 603 catcaatgaccttgcggagc (K歹蹯号 15) 623-603 tcatcaatgaccttgcggagc 變墦号 16)
666-648 agcctcgatctctgtctcc 己歹噃号 17)
743-726 gagctggcaatctgggct ®己歹噃号 18)
742-725 agctggcaatctgggctt 配歹噃号 19)
741-724 gctggcaatctgggcttg ®己歹噃号 20) 740-720 ctggcaatctgggcttgtagg ®己歹噃号 21)
739-720 tggcaatctgggcttgtagg ®己歹噃号 22)
738-719 ggcaatctgggcttgtaggc ©己 墦号 23)
756-740 cacggtcaacccagagc 醇墦号 24)
795-777 gatcttggcgaggtcctga ®B歹蹯号 25) 809-789 cggatgtctgccatgatcttg (I己歹噃号 26)
829-810 ccagctcgtcatattgggcc ©己歹噃号 27)
913-894 cagcagactgtgtggtgacc 醇墦号 28)
941-924 gtgagcgtcgtctcagca ®己歹蹯号 29)
1008-987 gctggccttcagatttctcatg (E歹噃号 30) 355—335 ccaggctcctcactctgtcca 醇潘号 31)
430-410 tccagtctctgacctggggtc 配歹蹯号 32)
588-569 ctccacagactggcgcatgg ®己歹噃号 33)
769—748 gggcatctacctccacggtcaa 己歹噃号 34)
897-877 gaccactgtggtgctctcctc ©己歹噃号 35) 925-904 cagctccaacctcagcagactg ®己歹噃号 36) 1263-1242 ggtttgcatggagttgctgctg (配列番号 37) ：配歹瞎号 1で表される 上の 立置の領域
376-392 gagagcaaaatccggga ®己歹'潘号 38)
377-393 agagcaaaatccgggag ©己歹幡号 39)
378-394 gagcaaaatccgggagc ®己歹 t潘号 40)
384-400 aatccgggagcacttgg 配歹隙号 41)
369-385 gaggctggagagcaaaa (I己歹幡号 42)
523-540 cgtcttgctgctgatgac feci歹【潘 43)
524-542 gtcttgctgctgatgactt ®己歹'潘号 44)
543-565 tagagtcaagtatgagacagagc 配歹瞎号 45)
544-565 agagtcaagtatgagacagagc ©己歹躍号 46)
546-566 agtcaagtatgagacagagct ¾歹隙号 47)
588-604 gaacgacatccatgggc 己歹! ί¾=号 48)
660-676 cgaggctctcaaggagg ©3^'墦号 49)
661-677 gaggctctcaaggagga 己 墦号 50)
662-678 aggctctcaaggaggag 墦号 51)
687-706 catgaagaagaaccacgaag ®己歹'潘 52)
719-736 gcctacaagcccagattg ©己歹'墦 53)
747-763 gttgaccgtggaggtag (¾歹 (潘 54)
768-784 ccccaaatctcaggacc 歹『潘号 55)
839-855 accgagaggagctagac 己歹『潘 56)
878-894 aggagagcaccacagtg 己歹蹯号 57)
943-960 gagctgagacgtacagtc 潘号 58)
295-314 gagaccatgcaaagcctgaa 己歹【潘号 59)
369-388 gaggctggagagcaaaatcc ©己歹蹯号 60)
523-542 cgtcttgctgctgatgactt ®己歹蹯号 61)
708-729 ggaagtaaaaggcctacaagcc @己歹嘴号 62) 837 - 857 gaaccgagaggagctagacaa 己歹噃号 63 864-884 gtctcagcagattgaggagag ®己列番号 64: 1202-1221 tggaagatggcgaggacttt (嗣番号 65) ：配歹蹯号 1で表される酉 上の簡立置 域 322-338 ctggcctcttacctgga ®2歹幡号 66:
293-309 aggagaccatgcaaagc ®己歹蹯号 67
470-489 tcttcgcaaatactgtggac ©己歹噃号 68:
466-486 cagatcttcgcaaatactgtg ®S歹噃号 69
473-491 tcgcaaatactgtggacaa (SB歹隙 70. 476-495 caaatactgtggacaatgcc ©己歹噃号 71
523-540 cgtcttgctgctgatgac 号 72:
546-566 agtcaagtatgagacagagct 己歹 73.
624 - 643 caccaatatcacacgactgc ©B歹噃号 74
687-706 catgaagaagaaccacgaag 3歹 (Ι¾^Τ 75 695-712 agaaccacgaagaggaag (@5歹隙号 76.
747-763 gttgaccgtggaggtag ®S列番号 77:
812-829 cccaatatgacgagctgg @己歹躍号 78
845-864 aggagctagacaagtactgg 己歹瞎兮 79.
855-873 caagtactggtctcagcag ®S列番号 80: 907-923 tctgctgaggttggagc ©fi歹【墦号 81
275-294 gaggcatccagaacgagaag 己歹 I潘 82.
349-366 agcctggagaccgagaac (¾ΰ歹幡 83
490-507 aatgcccgcatcgttctg @己歹【潘号 84.
672-690 ggaggagctgctcttcatg (@己歹噃号 85 807-824 ccgggcccaatatgacga ¾!■歹1潘 86.
840-859 ccgagaggagctagacaagt (IS歹瞎号 87 1176-1193 tgagatcgccacctaccg (E^tl番号 88) Rlc：配歹播号 1で表される酉^!上の; ¾ί立置 貝域
444-463 gatcatcgaggacctgaggg ®fl歹噃号 89)
420-442 cagagactggagccattacttca S歹蹯号 90) 424-447 gactggagccattacttcaagatc (I己歹蹯号 91)
425- 448 actggagccattacttcaagatca 己歹瞎号 92)
426- 450 ctggagccattacttcaagatcatc (I己歹瞎号 93)
427- 451 tggagccattacttcaagatcatcg ®己歹噃号 94)
428- 451 ggagccattacttcaagatcatcg ©己歹噃号 95) 429-453 gagccattacttcaagatcatcgag @己歹噃号 96)
430- 454 agccattacttcaagatcatcgagg (I己歹幡号 97)
431- 454 gccattacttcaagatcatcgagg 噃号 98)
432- 456 ccattacttcaagatcatcgaggac ®己歹噃号 99)
433- 457 cattacttcaagatcatcgaggacc ®Η歹噃号 100) 587-605 agaacgacatccatgggct 噃号 101)
588- 606 gaacgacatccatgggctc @己歹【潘号 102)
589- 607 aacgacatccatgggctcc ®己歹 I潘号 103)
590- 607 acgacatccatgggctcc 醇潘号 104) 598 - 614 catgggctccgcaaggt ®己歹躍号 105) 632-649 tcacacgactgcagctgg ®己歹 I潘号 106)
624-645 caccaatatcacacgactgcag ®己歹噃号 107)
630- 649 tatcacacgactgcagctgg © 噃号 108)
631- 649 atcacacgactgcagctgg ®己歹噃号 109) 685 - 708 ttcatgaagaagaaccacgaagag (Ε歹噃号 110) 739-756 agctctgggttgaccgtg 瞎号 111)
740-756 gctctgggttgaccgtg ®Ξ歹瞎号 112) 741-757 ctctgggttgaccgtgg 噃号 113)
742-758 tctgggttgaccgtgga (IE歹噃号 114)
743-759 ctgggttgaccgtggag ®己 号 115)
744-760 tgggttgaccgtggagg ®己歹蹯号 116)
746-764 ggttgaccgtggaggtaga ®己歹瞎号 117)
747-767 gttgaccgtggaggtagatgc (1己歹噃号 118)
748-767 ttgaccgtggaggtagatgc d己歹噃号 119)
749-767 tgaccgtggaggtagatgc fl歹噃号 120)
750-768 gaccgtggaggtagatgcc (1己歹噃号 121)
751-768 accgtggaggtagatgcc (1己歹噃号 122)
766-783 gcccccaaatctcaggac ®己歹瞎号 123)
812-831 cccaatatgacgagctggct ®己歹瞎号 124)
855-877 caagtactggtctcagcagattg ®己歹瞎号 125)
924-941 tgctgagacgacgctcac 己歹噃号 126)
947-966 tgagacgtacagtccagtcc ®己歹播号 127)
1016-1032 acagcctgagggaggtg 醇 J番号 128)
360-379 cgagaaccggaggctggaga ®己歹蹯号 129)
443-464 agatcatcgaggacctgagggc ®己歹蹯号 130)
592-611 gacatccatgggctccgcaa (1己歹噃号 131)
778-799 caggacctcgccaagatcatgg (S歹噃号 132)
900-921 cacacagtctgctgaggttgga ®己歹噃号 133)
928-948 gagacgacgctcacagagctg 墦号 134)
1277-1296 ccacccgccggatagtggat (嗣番号 135)
R2 ：配歹【潘号 1で表される酉例上の l ¾f立置に る相 ffi
540-523 gtcatcagcagcaagacg ®己難号 136)
541-523 agtcatcagcagcaagacg (E歹皤号 137) 494-475 gcattgtccacagtatttgc 墦号 138
493-474 cattgtccacagtatttgcg (I己歹 l潘号 139
492-473 attgtccacagtatttgcga ©2歹噃号 140:
491-473 ttgtccacagtatttgcga (@己歹1墦号 141 490-472 tgtccacagtatttgcgaa (I己難号 142
489-470 gtccacagtatttgcgaaga ®己歹播号 143
488-468 tccacagtatttgcgaagatc 醇潘号 144
487-467 ccacagtatttgcgaagatct ®己歹蹯号 145
486-466 cacagtatttgcgaagatctg ®己帰号 146) 678-662 ctcctccttgagagcct ®己歹隙号 147
677-661 tcctccttgagagcctc ®己歹噃号 148
676-660 cctccttgagagcctcg ®己歹幡号 149
675-659 ctccttgagagcctcga 己歹蹯号 150)
673-657 ccttgagagcctcgatc ®己歹幡号 1 672-655 cttgagagcctcgatctc ®己歹噃号 152
667-651 gagcctcgatctctgtc ©己歹躍号 153
666-649 agcctcgatctctgtctc 播号 154:
665-649 gcctcgatctctgtctc ®歹蹯号 155
713- 696 acttcctcttcgtggttc 醇潘号 156 721-702 ggccttttacttcctcttcg 墦号 157
714- 696 tacttcctcttcgtggttc ®己歹蹯号 158 762-746 tacctccacggtcaacc (MS歹噃号 159 809-792 cggatgtctgccatgatc (E離号 160 808-790 ggatgtctgccatgatctt (SB歹蹯号 161 829-812 ccagctcgtcatattggg 歹蹯号 162
877-858 caatctgctgagaccagtac (12歹【潘号 163 874-856 tctgctgagaccagtactt @己歹皤号 164)
922-906 ctccaacctcagcagac ®己歹幡号 165) 985-969 agtccaggtcgatctcc «歹瞎号 166) 1006-987 tggccttcagatttctcatg (嗣番号 167) 1011-994 caagctggccttcagatt (配列番号 168) 1086—1070 aaggtgcagcaggatcc 翻番号 169) 437-417 taatggctccagtctctgacc @己歹蹯号 170) 515-496 tcaatctgcagaacgatgcg (E歹播号 171) 669-649 gagagcctcgatctctgtctc ©3歹噃号 172) 669-650 gagagcctcgatctctgtct ほ己歹幡号 173) 857-837 ttgtctagctcctctcggttc 衝噃号 174) 857-838 ttgtctagctcctctcggtt ®己歹隙号 175) 981-962 caggtcgatctccaaggact ®己歹躍号 176) 1008-989 gctggccttcagatttctca 删番号 177)
1350—1331 gctggcttaatgcctcagaa 麵番号 178) ：配歹【墦号 1で表される酉 』上の 置に る相補鎖の領域 566-546 agctctgtctcatacttgact (！ 蹯号 179)
541-523 agtcatcagcagcaagacg 噃号 180) 540-523 9gtcatcagcagcaagacg 師蹯号 181) 721-702 ggccttttacttcctcttcg ®a難号 182) 713-696 acttcctcttcgtggttc 己歹 IJ 号 183) 740-724 ctggcaatctgggcttg 瞎号 184) 786-769 gaggtcctgagatttggg ®己歹 IJ 号 185) 854-837 tctagctcctctcggttc ©己歹播号 186) 877-858 caatctgctgagaccagtac ®己歹噃号 187) 922-906 ctccaacctcagcagac 己歹蹯号 188) 910-894 cagactgtgtggtgacc ©己歹噃号 189)
893—877 actgtggtgctctcctc ®己歹蹯号 190)
960-943 gactgtacgtctcagctc 墦号 191)
1021-1005 ggctgttctccaagctg 翻番号 192)
1056-1039 catctgtagggcgtagcg 麵番号 193)
1141-1125 catactcctgggcctgg 画番号 194)
476-458 gcgaagatctgagccctca @己歹噃号 195)
538-521 catcagcagcaagacggg 潘号 196)
688-670 tgaagagcagctcctcctt 醇播号 197)
885-866 gctctcctcaatctgctgag 噃号 198)
1008-989 gctggccttcagatttctca 翻番号 199)
1030-1012 cctccctcaggctgttctc 細番号 200)
1370-1352 ccaaagggtaccctgcttc 翻番号 201) loop F：配列番号 1で表される配列上の； 置に る相補鎖の領域
419-403 acctggggtcccttctt ® 潘号 202)
414-396 gggtcccttcttctccaag ® 番号 203)
413-394 ggtcccttcttctccaagtg (嗣番号 204)
399-380 caagtgctcccggattttgc 翻番号 205)
398 - 380 aagtgctcccggattttgc 翻番号 206)
397-379 agtgctcccggattttgct 翻番号 207)
396-378 gtgctcccggattttgctc 綱番号 208)
395-377 tgctcccggattttgctct 翻番号 209)
394-376 ' gctcccggattttgctctc 麵番号 210)
567-544 cagctctgtctcatacttgactct 綱番号 211)
584-568 acagactggcgcatggc 翻番号 212)
709-688 cctcttcgtggttcttcttcat (酉^！番号 213) 916-898 cctcagcagactgtgtggt 糊番号 214)
913-894 cagcagactgtgtggtgacc (IB ^番号 215)
567-544 cagctctgtctcatacttgactct ©例番号 216)
743-726 gagctggcaatctgggct 糊番号 217)
1243-1224 tgtccaaggcatcaccaaga 画番号 218)
1242-1222 gtccaaggcatcaccaagatt 師噃号 219)
loop R：配列番号 1で表される配列上の謹立置の領域
474-495 cgcaaatactgtggacaatgcc 例番号 220)
466-489 cagatcttcgcaaatactgtggac 麵番号 221)
444-463 gatcatcgaggacctgaggg @3¾番号 222)
626-646 ccaatatcacacgactgcagc 灘号 223)
617-640 ttgatgacaccaatatcacacgac 翻番号 224)
632-649 tcacacgactgcagctgg 麵番号 225)
659-676 tcgaggctctcaaggagg 麵番号 226)
767-784 cccccaaatctcaggacc 細番号 227)
970-986 gagatcgacctggactc 麵番号 228)
622- 643 gacaccaatatcacacgactgc (嗣番号 229)
621-643 tgacaccaatatcacacgactgc 番号 230)
623- 644 acaccaatatcacacgactgca ®己列番号 231)
810-829 ggcccaatatgacgagctgg 番号 232)
1296-1315 tggcaaagtggtgtctgaga «3歹瞎号 233)
( m 1 - 2) CKIS検出用プライマーの設計
難例 1— 1で邀尺された嫌の酉 E ^から、 LAMP法に適用される次の核醜幅用プ ライマーが得られた。 FIP： (領域 Flc及びと F2の ¾M己列を離した; 列からなるプライマー） 09FA971-376 tgaagtaatggctccagtctctggagagcaaaatccggga (配歹'」番号 234) 09FA971- 377 tgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccgggag (配歹瞎号 235) 09FA971-378 tgaagtaatggctccagtctctggagcaaaatccgggagc (酉己歹 I潘 23ο 09FA971-384 tgaagtaatggctccagtctctgaatccgggagcacttgg (配歹播 237) 09FA974- 376 agtaatggctccagtctctgacgagagcaaaatccggga (配歹播^" 238) 09FA974-377 agtaatggctccagtctctgacagagcaaaatccgggag (配歹 (潘 239) 09FA974-378 agtaatggctccagtctctgacgagcaaaatccgggagc (配歹播" ¾* 40) 09FA974- 384 agtaatggctccagtctctgacaatccgggagcacttgg (酉己^11¾~亏241) 09FA970- 376 ttgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccggga (酉 S歹 [|番号 242) 09FA970- 377 ttgaagtaatggctccagtctctagagcaaaatccgggag (酉己歹蹯号 243) 09FA970- 378 ttgaagtaatggctccagtctctgagcaaaatccgggagc (酉己歹 (ί番号 244) 09FA970- 384 ttgaagtaatggctccagtctctaatccgggagcacttgg (酉己歹瞎号 245) 09FA999-369 gggtcccttcttctccaaggaggctggagagcaaaa (酉 S歹噃号 246) 09FA994- 369 acctggggtcccttcttgaggctggagagcaaaa (配歹 (J番号 247)
09FA1000- 369 ggtcccttcttctccaagtggaggctggagagcaaaa (配歹皤号 248) 09FA1002-369 tcccttcttctccaagtgctgaggctggagagcaaaa (酉 fl歹 (潘号 249) 09FA1004-369 ccttcttctccaagtgctccgaggctggagagcaaaa (酉己歹 (1番号 250) 12FA829- 523 acagactggcgcatggccgtcttgctgctgatgac (酉 S歹瞎号 251) 12FA829-524 acagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgactt (配^！墦号 252) 13FA793-543 tcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (酉己歹 0¾· 53) 13FA793- 544 tcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (酉己歹 254) 13FA793-546 tcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct (配歹 ¾·"?Τ 255) 13FA792-543 atcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (lE^fe^ 6) 13FA792-544 atcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (酉 番 257) 13FA792— 546 atcaatgaccttgcggagcca tcaagtatgagacagagct (酉己歹 (J番 ^58) 13FA791-543 catcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc (酉^ J番号 259)
13FA791-544 catcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (酉 260)
13FA791-546 catcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct
Figure imgf000039_0001
13FA790-543 tcatcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc ( 播号 262) 13FA790-544 tcatcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (配歹幡 263)
13FA790-546 tcatcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct (酉 'J¾^ 264)
1 FA747-588 agcctcgatctctgtctccgaacgacatccatgggc (配列番号 265)
18FA675-660 ggcaatctgggcttgtaggccgaggctctcaaggagg (關番号 266)
18FA670 - 660 gagctggcaatctgggctcgaggctctcaaggagg 麵番号 267) 18FA670-662 gagctggcaatctgggctaggctctcaaggaggag (嗣番号 268)
18FA674-660 tggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagg (嗣番号 269)
18FA674-662 tggcaatctgggcttgtaggaggctctcaaggaggag 細番号 270)
18FA675- 661 ggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagga 麵番号 271)
18FA675 662 ggcaatctgggcttgtaggcaggctctcaaggaggag (嗣番号 272) 19FA657-687 cacggtcaacccagagccatgaagaagaaccacgaag (嗣番号 273)
21FA618-719 gatcttggcgaggtcctgagcctacaagcccagattg 麵番号 274)
21FA604-747 cggatgtctgccatgatcttggttgaccgtggaggtag (酉 (J番号 275)
23FA584-768 ccagctcgtcatattgggccccccaaatctcaggacc 画番号 276)
27FA500-839 cagcagactgtgtggtgaccaccgagaggagctagac 删番号 277) 29FA472-878 gtgagcgtcgtctcagcaaggagagcaccacagtg (嗣番号 278)
32FA405-943 gctggccttcagatttctcatggagctgagacgtacagtc 麵番号 279) ek 335—295 ccaggctcctcactctgtccagagaccatgcaaagcctgaa (酵噃号 280) ek 410-369 tccagtctctgacctggggtcgaggctggagagcaaaa 翻番号 281) ek 569-523 ctccacagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgac 麵番号 282) ek 748-708 gggcatctacctccacggtcaaggaagtaaaaggcctacaagcc 283) ek 877-837 gaccactgtggtgctctcctcgaaccgagaggagctagacaa (1^1潘 4) ek 904-864 cagctccaacctcagcagactggtctcagcagattgaggagag (酉 E^'J番号 285) ek 1242-1202 ggtttgcatggagttgctgctgtggaagatggcgaggacttt (酉 [J番号 286) RIP： (領域 Rlc及び R2の 列を連結した 列からなるプライマー） 09RA444-873 gatcatcgaggacctgaggggtcatcagcagcaagacg (酉^! ¾~ 287) 09RA444-872 gatcatcgaggacctgagggagtcatcagcagcaagacg
Figure imgf000040_0001
288) 09RA420-927 cagagactggagccattacttcacacagtatttgcgaagatctg 号 289)
09腸 20- 925 cagagactggagccattacttcatccacagtatttgcgaagatc
Figure imgf000040_0002
09RA420-923 cagagactggagccattacttcatgtccacagtatttgcgaa (酉 (1番号 291) 09RA420-921 cagagactggagccattacttcaattgtccacagtatttgcga (酉 番号 292) 09RA420-919 cagagactggagccattacttcagcattgtccacagtatttgc (配列番号 293) 09RA424-927 gactggagccattacttcaagatccacagtatttgcgaagatctg (酉己歹噃 294) 09RA424-923 gactggagccattacttcaagatctgtccacagtatttgcgaa (酉 [1番号 295) 09RA424-921 gactggagccattacttcaagatcattgtccacagtatttgcga (酉 Ε ¾·号 296) 12RA598-737 catgggctccgcaaggtcctccttgagagcctcg (酉 1』番号 297) 12RA587-746 agaacgacatccatgggctgagcctcgatctctgtc (配^！番号 298) 12RA588-737 gaacgacatccatgggctccctccttgagagcctcg (園番号 299) 12RA588-746 gaacgacatccatgggctcgagcctcgatctctgtc (鋼番号 300) 12RA588-748 gaacgacatccatgggctcgcctcgatctctgtctc 麵番号 301) 12RA590-737 acgacatccatgggctcccctccttgagagcctcg 翻番号 302) 12RA590-746 acgacatccatgggctccgagcctcgatctctgtc 翻番号 303) 12RA590-748 acgacatccatgggctccgcctcgatctctgtctc (配列番号 304) 12RA598-740 catgggctccgcaaggtccttgagagcctcgatc (酉 番号 305) 12RA598-746 catgggctccgcaaggtgagcctcgatctctgtc (配列番号 306) 13RA632-700 tcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc 麵番号 307) 13RA632-692 tcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (酉 2^番号 308) 13RA632— 699 tcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (配列番号 309) 13RA624-700 caccaatatcacacgactgcagacttcctcttcgtggttc 翻番号 310) 13RA624-699 caccaatatcacacgactgcagtacttcctcttcgtggttc 翻番号 311) 13RA624-692 caccaatatcacacgactgcagggccttttacttcctcttcg 翻番号 312) 13RA631 - 700 atcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (靜 J番号 313) 13RA631-699 atcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (配列番号 314) 13RA631-692 atcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (酉 J番号 315) 13RA630 - 700 tatcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc 麵番号 316) 13應 30 - 699 tatcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc 麵番号 317) 13RA630-692 tatcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (g^U番号 318) 14RA685-651 ttcatgaagaagaaccacgaagagtacctccacggtcaacc (麵番号 319) 18RA743-604 ctgggttgaccgtggagcggatgtctgccatgatc 麵番号 320) 18RA743-605 ctgggttgaccgtggagggatgtctgccatgatctt · (嗣番号 321) 18RA747-604 gttgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc (酉 番号 322) 18RA749-604 tgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc 翻番号 323) 18RA751-604 accgtggaggtagatgcccggatgtctgccatgatc 翻番号 324) 18RA749-605 tgaccgtggaggtagatgcggatgtctgccatgatctt 番号 325) 18RA751-605 accgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatctt (嗣番号 326) 19RA766-584 gcccccaaatctcaggacccagctcgtcatattggg (酉 【潘号 327) 21RA812-536 cccaatatgacgagctggctcaatctgctgagaccagtac (陋リ番号 328) 23RA855-491 caagtactggtctcagcagattgctccaacctcagcagac 翻番号 329) 27RA924 - 428 tgctgagacgacgctcacagtccaggtcgatctcc 画番号 330) 29RA947-402 tgagacgtacagtccagtcccaagctggccttcagatt 翻番号 331) 29RA947-407 tgagacgtacagtGcagtcctggccttcagatttctcatg 翻番号 332) 32RA1016-327 acagcctgagggaggtgaaggtgcagcaggatcc 卿 J番号 333) ek 360-417 cgagaaccggaggctggagataatggctccagtctctgacc (配列番号 334) ek 443-496 agatcatcgaggacctgagggctcaatctgcagaacgatgcg (配列番号 335) ek 592 - 649 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtctc (配列番号 336) ek 592-650 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtct (酉 3^(J番 <337) ek 778-837 caggacctcgccaagatcatgggaaccgagaggagctagacaa (酉 幡^" J38) ek 900-962 cacacagtctgctgaggttggacaggtcgatctccaaggact 列番" ^ 339) ek 928-989 gagacgacgctcacagagctggctggccttcagatttctca (酉例番号 340) ek 1277 - 1331 ccacccgccggatagtggatgctggcttaatgcctcagaa (酉^ J番号 341) F3プライマー -. ( 己列番号で表される: 列からなるプライマー）
F309-322 ¾洌番号 66)、 F309- 293 (鋼番号 67)、
F312-470 ,1】番号 68)、 F312- 466 (酉 fj番号 69)、
F312-473 ® U番号 70)、 F312- 476 ®E ^番号 71)、
F313-523 ®Β 番号 72)、 F314-546 番号 73)、
F319-624 (酉 I潘号 74)、 F321-687 (@ lj番号 75)、
F321-695 潘号 76)、 F323- 747 潘号 77)、
F327-812 番号 78)、 F329-845 ® ^ί1番号 79)、
F329-855 (酉 B^j番号 80)、 F332-907 (酉 [J番号 81)、
F3 8 (| IJ番号 82)、 F3 13 ほ IJ番号 83)、
F3 14 (@ (1番号 84)、 F3 16 (酉 11番号 85)、
F3 23 (酉 IJ番号 86)、 F3 29 (酉 【墦号 87)
F3 37 潘号 88)
R3プライマー：（铺己列番号で表される:^ SI己列からなるプライマー）
R309-847 (嗣番号 179)、 R309-872 (S列番号 180)、
R309-873 (酉 B ^番号 181)、 R312-692 @己列番号 182)、
R312-700 番号 183)、 R313-673 (i己列番号 184)、 .
R314-627 (| lj番号 185)、 R318-559 ®己列番号 186)、
R319-536 (酉 【潘号 187)、 R321-491 ©己列番号 188)、
R321-503 (酉 U番号 189)、 R32ト 520 ®己列番号 190)、 R323-453 (g 番号 191)、 R327-392 @E列番号 192)、
R329-357 ©3 ^番号 193)、 R332-272 ®S列番号 194)、
B3 8 (le^J番号 195)、 B3 13 ®己列番号 196) .
B3 1 麵番号 197)、 B3 19 翻番号 198) .
B3 21 (酉 I墦号 199)、 B3 35 己列番号 200)、
B3 37 師播号 201)
-： 番号で表される; 己列からなるプライマー)
LF09-994 (1番号 202: LF09-999 (配歹蹯号 203)、
LF09-1000 (酉 !1番号 204: LF09-1014 (1己歹瞎号 205)、
LF09-1015 ffi^U番号 206: LF09-1016 (配歹 I潘号 207)、
LF09-1017 (ffi^!j番号 208: LF09-1018 (1己歹 (! 号 209)、
LF09-1019 J番号 210: LF12-846 (配歹蹯号 211)、
LF13-829 ( 1潘号 212)、 LF18-704 (配歹噃号 213)、
LF29-497 ®例番号 214: LF29-500 (配歹噃号 215)、
LF 14 (麵番号 216: LF 20 (S己歹幡号 217)、
LF 371 翻番号 218: LF 372 (配歹皤号 219)
LR09-474 (画番号 220: LR09-466 (配歹噃号 221)、
LR09-44 (醇潘号 222: LR12-626 (配歹 I潘号 223)、
LR12-617 (画番号 224: LR12-632 (ffi歹躍号 225)、
LR13-659 (鋼番号 226: LR18-767 (¾歹噃号 227)、
LR29-970 (麵番号 228: LB 14 己歹幡号 229)、
LB 151 醇 J番号 230: LB 152 (gfl歹 f墦号 231)、
LB 371 ®^f番号 232: LB 372 (配歹噃号 233) (実施例 2 - 1 ) ヒト CK19： 列からの領域の選択
配列番号 342に記 るヒト CK19の遺丫5?の;^ Μ己列から、プロ一フ 言 用いて LAMP法に適切な嫌の位置を検討した。 Flc及び Rlcは Tm値が 58. 5-63. 5°C、 F2及び R2は Tm値が 61. 5〜62. 5°C、 F3及び R3は Tm値が 58. 5〜62. 5°Cの条件により 領域を藤した結果、 次に示すもの力 ¾1択された。 尺された領域は、酉 噃号 342 で表される: 列の 270~¾30番目の領 の相補鎖の遞に含まれる。
Flc：配歹 IJ 号 342に る配列の相捕鎖における領域
426-405 5' -tgtagtagtggctgtagtcgcg-3' ®己列番号 343)
429-407 £> -tcgtgtagtagtggctgtagtcg-3' (I己歹蹯号 344)
479-458 0 -ggagttctcaatggtggcacca-3 ほ己列番号 345)
7 ID- 700 o -ttggcccctcagcgtac-j' ®己歹噃号 346)
752—73s D -agcggaatccacctccac-3 翻番号 347)
747-728 5' -aatccacctccacactgacc-3' 翻番号 348)
746-728 5' -atccacctccacactgacc-3' (I己歹噃号 349)
745-728 5' - tccacctccacactgacc- 3' (配列番号 350)
F2：配歹噃号 342に言 る酉 上 (^域
352-370 5' -agctagaggtgaagatccg-3' (I己歹噃号 351)
3b4~380 o -agatccgcgactggtac-3' (配歹 I潘号 352)
360-3 /6 o -gtgaagatccgcgactg-3 (配歹 I潘号 353)
417-437 5 -actactacacgaccatccagg-3 ®己歹噃号 354)
658-674 5， -aagagctggcctacctg-3' (配歹噃号 355)
690-/09 5' -gaggaaatcagtacgctgag-3' (配列番号 356)
F3：配歹蹯号 342に言 »Tる隨上 域
275-293 5， -gctaaccatgcagaacctc-3' (K歹噃号 357)
375-392 0 -tggtaccagaagcagggg-3' 綱番号 358)
628-645 D -acctggagatgcagatcg-3' (配列番号 359)
658-0 /4 D -aagagctggcctacctg-3' (配歹蹯号 360)
6o丄ー 677 5' -agctggcctacctgaag-3' (配歹蹯号 361) Rlc：配歹噃号 342に言 »Τる配列上の領域
533-516 5 -gtgccaccattgagaactcc-3 (配列番号 362)
485- 505 5 -tgtcctgcagatcgacaacgc-3 «歹幡号 363)
486- 506 o -gtcctgcagatcgacaacgcc-3' (配歹噃号 364) 727-744 ΰ -aggtcagtgtggaggtgg-3' (配列番号 365) 764-783 5' -tctcgccaagatcctgagtg-3' ®己列番号 366) 766 - 785 5' -tcgccaagatcctgagtgac-3' 翻番号 367) 772-793 5' -agatcctgagtgacatgcgaag-3' (S己列番号 368)
R2 ：配列番号 342に記載する配列の相捕鎖における領域
533-516 ΰ -ggttcggaagtcatctgc-3 (配列番号 369)
545-526 ΰ -cgtctcaaacttggttcgga-3' ®己列番号 370)
547-528 b -tccgtctcaaacttggttcg-3' 麵番号 371)
790-773 5' -cgcatgtcactcaggatc-3' 翻番号 372)
841-824 5' -caggcttcagcatccttc-3' (配列番号 373) 848-832 5， -ggtgaaccaggcttcag-3' (配雨号 374)
847-831 5' -gtgaaccaggcttcagc-3' (配爾号 375)
845-828 5， -gaaccaggcttcagcatc-3' (配列番号 376)
843-827 5' -accaggcttcagcatcc-3' (配歹播号 377) R3 ：配歹幡号 342に |¾ ^る配列の相補鎖における領域
556-540 5' -agagcctgttccgtctc-3' (酉 3歹蹯号 378)
567—584 ΰ -gtggaggccgacatcaac-3' (配列番号 379)
841-824 ΰ -caggcttcagcatccttc-3' (配列番号 380)
916-900 5' -tcggacctgctcatctg-3' (I己歹噃号 381)
925-908 5， -tcagtaacctcggacctg-3' (配列番号 382) 923-907 5' -agtaacctcggacctgc-3' (配歹幡号 383)
921-905 5， -taacctcggacctgctc-3' (S3歹隙号 384) loop F：配列番号 342に記 る配列の相捕纖：ぉける «
395-381 5: -aggcccctgcttctg-3 (配列番号 385)
393-379 5； -gcccctgcttctggt-d' (配列番号 386)
392-376 5' -cccctgcttctggtacc-3 (配列番号 387)
392- 375 5 -cccctgcttctggtacca-3 涵番号 388)
393- 376 5： -gcccctgcttctggtacc-3 (配列番号 389) 395-380 5： -aggcccctgcttctgg-o' 翻番号 390)
394- 379 5 -ggcccctgcttctggt-o' (配列番号 391) 457-440 5: -agaatcttgtcccgcagg-3' (配列番号 392) 456-440 5 -gaatcttgtcccgcagg-3' (配列番号 393) 699-680 5! -tgatttcctcctcatgg tc-3' 翻番号 394) 698-679 5: -gatttcctcctcatggttct-3' (配列番号 395) 694-676 5: -tcctcctcatggttcttct-3' 翻番号 396) 734-318 5: -actgacctggcctccca-3' (配列番号 397) 724-710 5: -cctcccacttggccc-3' (配列番号 398) loop R：配列番号 342に記 iTTる綱上の領域
493-510 5' -agatcgacaacgcccgtc-ύ' (配列番号 399)
495-512 5' -atcgacaacgcccgtctg-ύ' 衝噃号赠
495-509 5' -atcgacaacgcccgt-ύ' 議番号樹)
496-509 5' -tcgacaacgcccgt-3' 翻番号 402)
506-520 5' -ccgtctggctgcaga-3' (配列番号 403)
507-520 5' -cgtctggctgcagatga-3' (配列番号 404)
508-525 5' -gtctggctgcagatgact-3' (SB列番号 405)
509-526 5' -tctggctgcagatgactt-3' (配列番号 406)
752-767 5， -tccgggcaccgatctc-3 綱番号 407)
756-771 5' -ggcaccgatctcgcca-3 ©己列番号 408) 755-769 5' -gggcaccgatctcgc-3' 麵番号 409) 757-771 5' -gcaccgatctcgcca-3' (配列番号 410)
805- 822 5' -tcatggccgagcagaacc-3' (配列番号 411)
806- 821 5，一 catggccgagcagaac- 3' (配列番号 412)
(実施例 2— 2) CK19検出用プライマーの設計
実施例 2— 1で邀尺された繊の酉 IJから、 LAMP法に翻される次の核醜 Φ畐用プ ライマーが得られた。
各プライマ一を、 本発明の RT- LAMP法において翻するプライマーセットとして示 し、領域ごとに A〜Dの 4つのグ "プに分類した。 Aク ^プの各プライマーは、 配列番号 342で表される:^ SIB^の 270〜560番目の領 びその相補鎖の領域から選 択され、 Bクン プの各プラィマーは、同様に 370〜585番自 © S職びその相補鎖の 領域、 Cグノ プの各プライマーは、同様に 625〜854番目の 扱 TOの相補鎖 域、 Dグノ プの各プライマ一は、同様に 655〜930番目の g¾¾びその相補鎖の働 ί の各領域から邀尺される。
(Αグノトプ）
FIP： (領域 Flc及び F2の塩翻己列を連結したもの）
FA-401 5' -tgtagtagtggctgtagtcgcgagctagaggtgaagatccg-3 (目 ϋ列番 413)
(醇番号 343及び 351に示 lffi^lを iS ^したもの）
FA-403 b -tgtagtagtggctgtagtcgcgagatccgcgactggtac-3 (酉 ci歹 'J畨号 414)
®^|J番号 343及ぴ 352に示 i Sia^lを i ^したもの）
FA-404 ¾ -tcgtgtagtagtggctgtagtcgagctagaggtgaagatccg-3' 歹畨号 41ΰノ
Figure imgf000047_0001
FA-405 ΰ -tcgtgtagtagtggctgtagtcggtgaagatccgcgactg-3 (目 C列畨 416) 翻番号 344及び 353に:^ ^例を糨したもの）
FA-406 5， -tcgtgtagtagtggctgtagtcgagatccgcgactggtac-3' (酉己歹!!番号 417) (酉^！番号 34 及ぴ 352に示 ¾¾g Jを連結したもの）
RIP： (領域 Rlc及び R2の 列を連結したもの）
RA-401 5' -gtgccaccattgagaactccggttcggaagtcatctgc-3 (fc列 ¾·号 418)
(酉^番号 362及び 369に示 己列を it したもの） F3プライマー： （F3繊の; MS列と同一の配列）
F3-401 5' -gctaaccatgcagaacctc-3' (配歹蹯号 357) R3プライマー：（R3領域の iffi己列と同一の配歹 IJ)
R3-401 5' -agagcctgttccgtctc-3' (酉己歹瞎号 378)
'マー：（loop F
Figure imgf000048_0001
同一の (J)
LPF-401 5 -aggcccctgcttctg-3 (酉己歹 (潘号 385) LPF-402 5， - gcccctgcttctggt- 3， (配列番号 386) LPF-403 5， -cccctgcttctggtacc-3 潘号 387) LPF-404 b -cccctgcttctggtacca-3 ®己列番号 388) LPF-405 5， -gcccctgcttctggtacc-3' 己列番号 389) LPF-406 5， -aggcccctgcttctgg-3' ®己列番号 390) LPF-407 5， -ggcccctgcttctggt-3' (E列番号 391) LPR-401 5， -agatcgacaacgcccgtc-3' d己列番号 399) LPR-402 5， -atcgacaacgcccgtctg-3' ®己列番号■) LPR-403 5， -atcgacaacgcccgt-3' (配歹噃号 401) LPR-404 5， -tcgacaacgcccgt-3' @己列番号 402) (Bグノトプ）
FIP： (領域 Flc及び F2の 列を連結したもの）
FA1-EK 5， -ggagttctcaatggtggcaccaactactacacgaccatccagg-3' (配列 ¾~ 419) 己列番号 346及び 354に示 ^を連結したもの）
RIP： (領域 Rlc及び R2の: Ml己列を したもの）
RA2-EK 5， -tgtcctgcagatcgacaacgccgtctcaaacttggttcgga-3' (SC歹' J¾~号 420) ®B列番号 363及び 370に示 を連結したもの）
RA6-EK 5 -gtcctgcagatcgacaacgcctccgtctcaaacttggttcg-3' fei列番号 421) ©己列番号 364及ぴ 371に示 i"¾¾|^J¾g結したもの）
F3プライマー： （F3領域の ¾¾¾列と同一の配列）
F3-EK 5 -tggtaccagaagcagggg-3 歹1 J番 358)
R3プライマー： （R3 im^ mmと同一の配列）
R3-EK 5' -gtggaggccgacatcaac-3' (酉 !!番号 379) ゾトププライマー：（loop F g¾Xは loop R ^の;^ と同一の配列）
LPF1-EK 5' -agaatcttgtcccgcagg-3' (配列番号 392) LPF2-EK 5' -gaatcttgtcccgcagg-3' (酉己歹幡号 393)
LPR1-EK 5' -ccgtctggctgcaga-3' (酉 S歹蹯号 403)
LPR2-EK 5' -cgtctggctgcagatga-3' (配歹蹯号 40'4)
LPR3-EK 5' -gtctggctgcagatgact-3' (配列番号 405)
LPR4-EK 5' -tctggctgcagatgactt-3' (配列番号 406) (Cグ /ト
FIP： (領域 Flc及び F2の 己列を連結したもの）
FA - 1101 5 -ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3' (酉己歹' J番号 422) ®己列番号 346及び 355に示 ^Sffi^を連結したもの）
RIP： (領域 Rlc及び R2の |¾己列を ii tしたもの）
RA - 1101 5' -aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3' (酉己歹！!番号 423) ■ ®己列番号 365及び 372に示 «l3^を連結したもの）
F3プライマー：（F3繊の: ¾|己列と同一の配歹 (D
F3-1101 5' -acctggagatgcagatcg-3' (酉己歹 (墦号 359) R3プライマー： （R3靡の; ^己列と同一の配歹 Φ
R3-1101 5' -caggcttcagcatccttc-3' (配歹躍号 380)
'マー： (loop F ¾Xは loop R繊の ^と同一の E^J) LPF-1101 5' -tgatttcctcctcatggttc-3' (配列番号 394) LPF-1102 5' -gatttcctcctcatggttct-3' (配列番号 395) LPF-1103 5' -tcctcctcatggttcttct-3' (配列番号 396) LPR-1101 5' -tccgggcaccgatctc-3' (酉己歹播号 407) LPR-1102 5'— ggcaccgatctcgcca - 3' (配歹噃号 408) LPR-1103 5' -gggcaccgatctcgc-3' (配歹瞎号 409) LPR-1104 5' -gcaccgatctcgcca-3' ©己歹幡号 410) (Dグ /トカ
P： (領威 Flc及び F2の塩翻己列を連結したもの）
FA-601 5' -agcggaatccacctccacgaggaaatcagtacgctgag-3' &i歹!] ¾·号 424)
,11番号 347及び 356に示 ^を連結したもの） FA-602 5 -aatccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3 fed歹 (J番^" 425)
®Ε 番号 348及び 356に示 を連結したもの） FA-603 5' -atccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3 歹' J¾~号 42οノ
(IS列番号 349及び 359に^ を連結したもの）
FA-604 5' -tccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3' fe歹 [¾·号 427)
Figure imgf000050_0001
P： (領域 Rlc及び R2の： 己列を連結したもの）
RA-601 5' -tctcgccaagatcctgagtgcaggcttcagcatccttc-3' (S3列番^ * 428) 陋' J番号 366及ぴ 373に示- 例を驗したもの）
RA-602 5' -tctcgccaagatcctgagtgggtgaaccaggcttcag-3' ®己歹'潘"^ 429)
(gd^J番号 366及び 374に示 ¾SSE を したもの） RA-603 5' -tctcgccaagatcctgagtggtgaaccaggcttcagc-3' (I己歹 (I番^ *430)
(ffi 番号 366及ぴ 375に示 を連結したもの） RA-604 5' -tctcgccaagatcctgagtggaaccaggcttcagcatc-3' (ffi歹幡 431)
U番号 366及び 376に示 を ¾||したもの） RA-605 5' -tctcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatcc-3' (IS列番号 432)
(E^番号 366及び 377に示 "¾^ 【』を連結したもの） RA-606 5' -tcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatccttc-3' @己列番号 433)
(酉 e ^番号 367及び 373に示" mss^iを連結したもの） RA-607 5 -agatcctgagtgacatgcgaagcaggcttcagcatccttc-3' 己列番号 434)
(酉 番号 368及び 373に示 Jを ¾ έしたもの） F3プライマー： （F3繊の;^己列と同一の配列）
F3-601 5' -aagagctggcctacctg-3' (ffi歹膝号 360) F3-602 5' -agctggcctacctgaag-3' (I己歹瞎号 361) R3プライマー：（R3繊の 己列と同一の配列）
R3-601 5' -tcggacctgctcatctg-3' (IS歹【潘号 381) R3-602 5' -tcagtaacctcggacctg-3' d己列番号 382) R3-603 5' -agtaacctcggacctgc-3' (I己歹隙号 383) R3-604 5' -taacctcggacctgctc-3' (I己歹 I潘号 384) ノトププラィマー： (loop F領 は loop R ^ ^^ΜΜと同一の (
LPF-601 5' -actgacctggcctccca-3' ®己歹播号 397)
LPF-602 5' -cctcccacttggccc-3' (I己列番号 398) LPR-601 5' -tcatggccgagcagaacc-3' ' 己列番号 411)
LPR-602 5' -catggccgagcagaac-3' (I己歹 (ί番号 412)
(実施例 3 - 1 ) ヒト CK20 列からの領域の選択
配列番号 435に記 gH "るヒト CK20の 己列から、 プローフ ¾計ソフトを用いて LAMP法に適切な領域の位置を検討した。 Flc及び Rlcは Tm値が 58. 5-63. 5°C、 F2及 び R2は Tm値が 61. 5-62. 5°C、 F3及び R3は Tm値が 58. 5-62. 5°Cの条件により領敏 を 尺した結果、 次に示すもの力 尺された。 還尺された領域は、 配歹 (潘号 435で表 される； SSffi列の 340〜1050番目の 扱 の相補鎖の領域に含まれる。 Flc：配歹 [瞎号 435に言 S«する配列の相補鎖における領域
920-900 5， -ttcatgctgagatgggactgg-3' ®己列番号 436) 915-895 5 -gctgagatgggactggagttc-3' ®己列番号 437) 436-416 5 -caatttgcaggacacaccgag-3' 靜墦号 438) F2 ：配歹噃号 435に¾1 "る配列上の領域
847-865 5 -gaggttcaactaacggagc-3 ®己列番号 439) 850-869 5 -gttcaactaacggagctgag-3 翻番号 440) 855-872 5 -actaacggagctgagacg-ό' @己列番号 441) 370-388 5, -attgaagagctgcgaagtc-3 ®己列番号 442) F3 ：配歹 I墦号 435に記 る配列上の領域
345-367 5 -cgactacagtgcatattacagac-3' ®己列番号 443) 805-822 5 -cagcaacaggtcacagtg-3 ®己列番号 444) Rlc：配歹蹯号 435に る配列上の領域
940-958 5 -ctagaggagaccaaggccc-3 ®己列番号 45) 939-958 5 -tctagaggagaccaaggccc-3' (I己列番号 446)
947-966 5 -agaccaaggcccgttacagc-3 配列番号 447) 452-472 t> -ctgctgaggacttcagactga-3' ®己列番号 448) R2 ：配歹 I潘号 435に言^ る配列の相補鎮における領域
1004 - 987 5' -agagagctcaacagcgac-3' 列番号 449) 1007 - 990 5' -tccagagagctcaacagc-3' 配列番号 450)
994-978 b -acagcgactggaggttg-3" ®己列番号 451) 1000-984 5 -agctcaacagcgactgg-3 配列番号 452) - 523 - 505 5 -cttggagatcagcttccac-3 @己列番号 453)
R3 ：配歹瞎号 435に言 る配列の相補鎖における領域
556-535 5 -gtagggttaggtcatcaaagac-3 翻番号 4¾)
1044-1027 5' -gcgttccatgttactccg-3' 配列番号 455) loop F：配列番号 435に記翁 る配列の相補鎖における «
409-389 5， -gcagttgagcatccttaatct-3' d己列番号 456) 891-875 5 -ctcaaggctctgggagg-3' ®己列番号 457) loop R：配列番号 435に記^ Tる配列上の
480-499 5 -gactgagagaggaatacgtc-3 (IB列番号 458) 968-985 5' -gccagttagccaacctcc-3 翻番号 459) 970-985 a -cagttagccaacctcc-3' ®己列番号 460) 例 3— 2) CK20検出用プライマーの設計
実施例 3 - 1で激尺された嫌の酉 (Jから、 LAMP法に删される次の核画幅用プ ライマーが得られた。
FIP： (領域 Flc及び F2の iffi己列を連結したもの）
KFA-5 5' -ttcatgctgagatgggactgggaggttcaactaacggagc-3 feci列 ¾~ 461)
(酉^ 1番号 436及び 439に示 jを連結したもの）
KFA-5a b -ttcatgctgagatgggactgggttcaactaacggagctgag-3 fee歹!] ¾~ォ 462)
@Ε 番号 436及ぴ 440に示" Jを連結したもの）
KFA-5b 5' -ttcatgctgagatgggactggactaacggagctgagacg-3' ®己歹 U¾ " 4ού)
Figure imgf000053_0001
KFA-5d 5' -gctgagatgggactggagttcgaggttcaactaacggagc-3' fee歹 4o¾) 番号 37及び 439に示す ¾M ^を連結したもの）
KFA-5e b -gctgagatgggactggagttcgttcaactaacggagctgag-3 fee歹！]番 465)
(酉 番号 437及び 440に示 Jを連結したもの） KFA-5f b -gctgagatgggactggagttcactaacggagctgagacg-3' 歹 lj番 466)
(K 番号 437及び 441に示 を連結したもの） AFA 5 -caatttgcaggacacaccgagattgaagagctgcgaagtc-3 ¼i列番" 75"4οί) 墦号 438及び 442に示 ¾Sffi^【Jを連結したもの） RIP： (領域 Rlc及ぴ R2の 己列を連結したもの）
KRA-5 5， -ctagaggagaccaaggcccagagagctcaacagcgac-3' ®己列番号 68)
(酉 S ^番号 45及び 449に示 己列を連結したもの） KRA-5a 5 -tctagaggagaccaaggccctccagagagctcaacagc-3 (¾ti列番 469)
(IS^IJ番号 46及ぴ 450に示 己列を ^ したもの）
KRA-5c 5 -tctagaggagaccaaggcccacagcgactggaggttg-3 (ki列番号 470) 潘号 446及び 451に示 ^Sl Jを連結したもの）
KRA-5d 5 -agaccaaggcccgttacagcagagagctcaacagcgac-3 列番号 471)
(13 ^番号 447及び 449に示 ¾¾I3^Jを連結したもの） KRA~5e 0 -agaccaaggcccgttacagctccagagagctcaacagc-3' (&列番号 472)
(潘号 447及ぴ 450に示 を連結したもの）
KRA~5r 0 -agac caaggcccgttacagcagctcaacagcgactgg-3' @C列番号 473) 番号 447及び 452に示 ^M^tlを連結したもの）
ARAf 5 -ctgctgaggacttcagactgacttggagatcagcttccac-3' ®己列番号 474)
(J番号 48及び 453に示1¾|3¾を連結したもの）
F3プライマー： （F3繊の;^^己列と同一の配列）
AF3 5' -cgactacagtgcatattacagac-3' (配歹'墦号 443) KF3-5 5' -cagcaacaggtcacagtg-3' ®己列番号 444) R3プライマー：（R3繊の 4ffi3列と同一の配列）
AR3 5' -gtagggttaggtcatcaaagac-3' ®Ξ列番号 454) KR3-5 5' -gcgttccatgttactccg-3' @己列番号 455) ノ ププライマー：（loop F又は； Loop R領域の 列と同一の配列）
LPF2 5' -gcagttgagcatccttaatct-3' (配歹瞎号 456)
K-LPF2 5' -ctcaaggctctgggagg-3' ®3^J 号 457) LPR6 5' -gactgagagaggaatacgtc-3' ®己列番号 458)
K-LPR1 5' -gccagttagccaacctcc-3' ®S列番号 459) K-LPR2 5' -cagttagccaacctcc-3' (I己列番号 460) (実験例）
上記で取得した CK18、 CK19又は CK20検出用の各種プラィマーを用!/、て RT- LAMP法 を雄した ¾ ^の効果を、 難例 1〜3により測定し、廳忍した。
(^験例 1— 1 ) 増幅の戯
ヒト CK18検出用の各種プライマーを次の組^:で RT- LAMP法で測定した^の、反 応を開始してから増幅カ嚷忍できるまでに要する時間を各プライマーセットにつレヽて 調べることを目的として実験を行つた。
1 ) ヒト CK18腿灘の調^法
ヒト CK18の: ¾| IJを基に設計したプライマーを用いて RT-PCRを行うことにより、 KAT0III (胃癌細胞） 由来トータル RNAから、 ヒト CK18cDNAを,した。 pBluescript (STMTAGENEネ i ^プラスミド） にクローユングしたヒト CK18cDNAから、 in vitroで の転 ·システム (Riboprobe in vitro transcription system (Promega fi ) ) を用 V、て転写産物を合成した。 得られた原液の RNA鍵を 260nraでの吸 ¾g測定により算 出し、その値をもとにヒト CK18の醒コピー ¾^ 60000、 6000、 600、 60、 6及ぴ 0 (対 照） となるように 50 ng/ β ΐ yeast RNA (Amibon ¾) で «調製し、顯とした。
2) ヒト CK18検出用プライマーセット
各種プライマーを （表 1 ) の糸且^:で用いた
■ (表 1 ) プライマーセット ·
(各番号は配歹幡号を示し、 プライマーは ^ffi歹播号で表される配列からなるプライ マーを織する） プライ セット I II III IV
FIP 234 252 259 278
RIP 287 297 307 332
F3プライ 66 68 72 79
R3プライ 179 182 184 193
ノ ノ ノ ノ
(loop F) 203 211 212 214
ププライ
(loop R) 220 223 226 228 ) 城
d TPs (GIBC0 ¾$¾ 0. 4 mM
MgS04 2 mM
ジチオトレイトー (dithiothreitol) 5 mM
ベタイン (betaine) (Sigma 640 mM
Thermopol buffer (New England BioLabs)
蕭逆転 素 （P egaネ 1. 25U
Bst脆ポリメラーゼ （New England BioLabs ¾fc$¾ 16U
ェチジゥムブロマィド (ethidium bromide) 0. 125 rag/mL
プライ
FIP 40pmol, RIP 40pmol,
F3プライ 5pmol R3プライ 5ptnol,
ププライマー（loop F, loop R) 各 20pmol
) RT- LAMP法
上記 6種のプライ ¾r む RJS夜 23 ;/ 1に、ヒト CK18の謹^ f斗を 2 μ 1添ロし、°Cで 1時間加温して行った。 5) 増幅の麟
増幅産物は 2本鎖構造をもつので、ェチジゥムプロマイドがインター力レートして 蛍光を究する。 その蛍光強度の増加 (Rn) を ABI社製 PRISM7700を用いてリアルタイ ム法により測定した。
6 ) 結果
；!〜 IVの各プライマーセットを用いた の結果を各々第 1〜4歸こ示した。 その 結果、各セットについてヒト CK18の醒の量が多いほう力 \増幅が廳¾、できるまでに 要する時間は短かかった。 プライマーセット I及び IIIでは、 600コピーの齢でも 20分以内に増幅力 され、 プライマーセット IIでは 6000コピーの ¾ ^に約 20分 で增幅力 ¾ ^され、プライマーセット IVの： ^は 6000コピーの： ^に約 20分で 幅 力 ¾Ι され、 600コピーの ^^でも約 30分で^ t幅が廳忍された。 賺例 1— 2) / ププライマーの効果
実験例 1—1で検討したプライマーセットのうち、 増幅の に要する時間力 S短か つたプライマーセット Iを 31ί尺し、 ププライマーを用いた：^と用いない:^で の感度を調べることを目的として実験を行った。
1 ) ヒト CK18RNA|^斗の調 去
»例 1—1と同様の操作を行い、 コピー数が 60000、 6000、 600及び 0 (対照） と なるよう,を調製した。
2 ) プライマ一セット - 表 1に プライマーセット I及ひプライマーセット I力 各ノ ププライマーを 除 ヽたプラィマーセットを用 、た。
3 ) ^ - 実験例 1— 1と同様のものを i^fflし、 ププライマーのなレヽセッ卜については、 "ププライマーを添かしなかった。
4) RT - LAMP法 6 ¾Xは 4種のプライ を含む^ ¾夜 23 1に、 ヒト CK18の讓謝を 2〃 1と なるよう添ロし、 65°Cで 1時間加温して行った。
5) 増幅の廳忍
実験例 1— 1と同様にリアルタィム法により測定した。
6 ) 結果
測 結果を第 5図及び第 6園 示した。 その結果、 ププライ を用いたほう 力 増幅が鶴忍できるまでに要する時間は短かかった。 しかし、ノ ププライマーを 用いない齢でも、 60000コピーの：^で約 50分でヒト CK18の増幅が廳忍された。 (実験例 1 - 3) ヒト CK18に ¾ "る増幅特異性
プライマーセット Iを用いて測定した^のヒト CK18に る増幅特異性を調べ た。 サイトケラチン （CK) には、 ヒト CK18のほかにヒト CK19, 20等のアイソフォー ムが知られており、 これらはヒト CK18と約 60%のホモロジ一を有する;^ 己列から なる。 上記プライマーセットを用いて測定した齢に、 ヒト CK19又は 20と識 I〗して 可能力 かを調べることを目的として宾験を行った。
1 ) 腿謝の調 W法
実験例 1一 1と同様の操作を行レ、、コピー数が 60000のヒト CK18の腿 を調製 した。 ヒト CK19及びヒト C 20の赚についても同様に滞を調製した。
2) プライマーセット
表 1に示すプライマーセット I を用いた。
3) 凝城
繊は実験例 1一 1と同様のものを^ fflした。
4) RT-LAMP法 .
実験例 1一 1と同様の条件で行つた。
5 ) 増幅の漏
実験例 1— 1と同様にリアルタイム法により測定した。 6 ) 結果
その結果を第 7図 した。その結果、プライマーセット Iを用いると、ヒト CK18匪 は増幅する力 ヒト CK19RNA及びヒト CK20R Aについては全く増幅 ·¾τΤ、 プライマー セット Iはヒト CK18脆に特異性があること力廳¾、された。
(実験例 2—1 ) ヒト CK19検出用プライマーセット ク ^プ） の効果 実施例 2 - 2で示された Αグノ^ "プから憲されるプライマーセットを用いてヒト CK19の腿を RT - LAMP法で測定した:^の増幅パターンを調べることを目的として実 験を行った。
1 ) プライマーセット （Aグノ ^ "プ）
FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3—401及び R3: R3—401の各プライマーからなる プライマーセット、並びにさらに各 ププライマー： LPF- 401と LPR - 401、 LPF-401 と LPR - 402、 LPF-401と LPR-403、又は LPF- 401と LPR-404を糸且^:て用いたプライマ ーセッ卜の齢について調べた。
2) ヒト CK19腿 ^[の調 $fc ^去
ヒト CK19の ¾¾f^(Jを基に設計したプライマーを用レ、て RT - PCRを行うことにより、 KAT0III (胃癌細胞） 由来トータル脆 から、 ヒ ト CK19cDNA を単離した。 pBluescript (STRATAGE Eネ環プラスミド）にクローエングしたヒト CK19cDNAから、 in vitroでの ¾5 ンスアム (Riboprobe in vitro transcription system (Promega ^i ) ) を用いて転写産物を合成した。 得られた原液の腿濃度を 260nraでの吸 ¾¾測定によ り算出し、 そ ®直をもとにヒト CK19の RNAコピー数が 60000、 6000、 600及び 0 (対 照）となるように 50 ng/μ ΐ yeast醒 (Amibon¾$¾ で 調製し、 麵とした。
3 ) rn^ s - 実験例 1— 1と同様のものを籠した。 ププライマ一のなレヽセットにつレ、ては、 ノトププラィマーは ¾¾¾しなかつた。
4) RT- LAMP法 上記のうちゾ!^ "ププライマ一を含まな ヽ 4種、又 f / "ププライマーを含む 6種の プラィマー^^む ®¾夜 23 Lに、 ヒ ト CK19の諷謝を 2 μ L添加し、 65°Cで 1時 間加温して行った。
5 ) 増幅の
実験例 1— 1と同様にリアルタィム法により測定した。
6 ) 結果
ノ ププライマーを用いないプライマーセット、 及 "ププライマーを用い たプライマーセットによる結果を第 8〜1 2図に示した。 その結果、ノトププライマ 一を用いなレ、齢には、核酸の増幅が藤できるまでに要する時間は纖開始後約 0 分であった。 一方、第 9〜1 2図に示すように、ノ ププライマーを加えた系では、 約 10分から 20分の間に増幅を鶴、することができた。 験例 2 - 2) ヒト CK19検出用ブラィマーセット （Cグノ I ^力 の効果
例 2— 2で示された〇グ ^プから遨尺されるプライマーセットを用いてヒト CK19の匪を RT- LAMP法で測定した:^の増幅パターンを調べることを目的として実 験を行った。
1 ) プライマーセット (Cグノト
FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3 - 1101及び R3: R3— 1101の各プライマーから なるプライマーセット、 並びにさらに各 @/ ププライマー： LPF - 1101と LPR - 1101、 LPF-1101 と LPR - 1102、 LPF— 1101 と LPR - 1103、 LPF - 1101 と LPR_1104、 LPF— 1102 と LPR-1101、 又は LPF - 1103と LPR - 1101を組^:て用いたプライマーセットの につ いて調べた。
2) ヒ ト CK19匪謝の調製、 ，
実験例 2—1と同様の操作を行い、 コピ^:が、 60000、 6000、 600、 60及び 0 (対 照）となるように調製した。
3 ) SJS¾！滅、 4) RT - LAMP 去及び 5 ) 増幅の廳忍は実,験例 2— 1と同様の 去に より行った。
6 ) 結果
ノ I ^ププライマーを用いないプライマーセット、及 O¾¾ "ププライマーを用い たプライマーセットによる結果を第 1 3〜1 9図に示した。 その結果、ゾ ププライ マーを用いない には、核酸の増幅が廳忍できるまでに要する時間は纖開始後約 30分であった （第 1 3図)。 一方、 ループプライマーを用いた系では、 LPF-1101 と LPR-1101 (第 1 4図）、 LPF-1101と LPR— 1102 (第 1 5図）、 LPF-1101と LPR - 1104 (第 1 7図）、 LPF-1102と LPR - 1101 (第 1 8図） 又は LPF-1103と LPR-1101 (第 1 9図） を組^ ·¾：た ¾ ^に約 10分から 20分の間に増幅を βすることができ、 LPF-1101と LPR-1103 (第 1 6図） を組^:た には約 20分で#幅を ϋ ^することができた。
(実験例 2— 3) ヒ ト CK19検出用プライマーセット （Dグノト の効果 実施例 2— 2で示された Dグ プから磨尺されるプライマーセットを用いてヒト CK19の腿を RT-LAMP法で測定した ¾ ^の増幅パターンを調べることを目的として実 験を行った。
1 ) プライマーセット （Dグノ 力
FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3— 601及び R3: R3-601の各プライマーからなる プライマーセット、並びにさらにノ ププライマー： LPF- 601と LPR - 601を組 ^て 用いたプライマーセットの について調べた。
2) ヒ ト CK19醒辩斗の調製
実験例 2—1と同様の操作を行い、 コピ^ fが、 60000、 6000、 600、 60及び 0 (対 照）となるように調製した。
3 ) SJ¾蘇城、 4 ) RT-LAMP 去及び 5 ) 増幅の鶴、は実験例 2— 1と同様の手法に より行った。
6 ) 結果
ノ^ "ププライマーを用いないプライマーセット及ぴ用いたプライマーセットによる 結果をそれぞれ第 2 0図及び第 2 1図に示した。 その結果、 "ププライマーを用い ない は、核酸の増幅力 ¾ΙΕできるまでに要する時間は約 70分であった。また、コ ピー数が 0でも 異的な増幅が起こり ¾W異 [·生が低かった。 一方、 ププライ マーを用いた は、約 20分離で 幅が礴忍でき、力 コピー数が 0で鎌難幅 は起こらなかった。 / "ププライ を用いることにより特異个生は向上した。 隱例 2— 4) 測定感度
実験例 2—1 2— 3で示された A C Dの各グ プから繊された各プライ セット及ぴ Bグ プから選択されたプライ セットを用いて測定した齢の、 ヒト CK19匪の測定^^を調べることを目的として実験を行つた。
1 ) プライマーセット：
Aグ / "プ： FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3- 401 R3: R3-401,
ププライ LPF— 401 LPR-404
Βダス ~プ： FIP: FA1-EK, RIP: RA6-EK, F3: F3-EK, R3: R3-EK,
^~ププライ LPF1— EK, 1PR2-EK
〇ク、 ^プ： FIP: FA - 1101 RIP: RA-1101,
F3: F3-1101, R3: R3- 1101,
ループプライマ一： LPF- 1101 LPR- 1101
Dグ プ： FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3- 601 R3: R3- 601
ププライマー： LPF-601, LPR-601
2) ヒト CK19RNA謝の調製
実験例 2— 1と同様の操作を行い、 コピー数が、 60000 20000 6000 2000 600 200 60 20及ぴ 0 (対照）となるように調製した。
3 ) KiSi¾g 4) RT— LAMP ί¾及ぴ 5 ) 増幅の は実験例 2— 1と同様の^ feに より行った。
6 ) 結果 結果を第 2 2〜 2 5図に示した。 その結果、 各グノ "プのプライマーセットについ て、 ヒ ト CK19脆のコピー数が大きい方が核酸の増幅が廳、できるまでに要する時間 力 S短く、 コピー数が 60000の^に 15〜25分 @¾で 幅が認められた。また、 Aグル ープにつレ、てはコピー数が 200以上の場合に 20〜30分 （第 2 2図)、 Bグノレ一プにつ Vヽてはコピー数が 200以上の齢に 15〜25分 （ 2 3図)、 Cグ Λ ^"プにつ ヽてはコ ピー数が 600以上の:^に 15〜25分（第 2 4図）及び Dグ プにつ ヽてはコピ^ ¾ が 200以上の；^に 25〜35分（第 2 5図） で 幅が認められた。
(実験例 2 - 5 ) ヒト CK19R Aに ¾ ^る増幅特異个生
実験例 2— 4で示された各プライマーセットを用いて測定した場合の、 ヒト CK19匪に る増幅特異性を調べた。 サイトケラチン（CK) には、 ヒト CK19のほか にヒト CK18, 20等のアイソフォーム力知られており、 これらはヒト CK19と約 60%の ホモロジ一を有する; IffiB列からなる。 上記プライマーセットを用いて測定した に、 ヒト CK18又は 20と識 (Jして検査可能力 かを調べることを目的として実験を行 つた。
1 ) プライマーセット
実験例 2— 4と同じプラィマーセットにつ ヽて調べた。
2 ) 匪繩の調製
実験例 2— 1と同様の操作を行 ヽ、 コピ が 60000、 6000、 600及び 0 (対照）と なるようにヒト CK19RNA を調製した。 ヒト OQ8及ぴヒト CK20の RNAにつ!/ヽては 同様に各々コピー数が 60000の^ I·を調製した。
3 ) 城、 4 ) RT-LAMP法及ぴ 5 ) 増幅の廳 Sは実験例 2 - 1の^ ¾によりお こなった。 . .
6) 結果
実験例 2— 4で示された各プライマーセットによる結果を第 2 6〜2 9図に示した。 その結果、 いずれのグノ I ^プのプライマーセットも、 ヒト CK19RNAに特異的に増幅が 認められたが、 ヒト CK18RNA及びヒト CK20RNAについて 幅を認めなかった c
(^験例 2 - 6 ) ヒト CK19匪に ¾Η "る増幅の廳忍 （濁度の測定）
1 ) プライ セット （Cグ
FIP: FA— 1101 RIP: M— 1101 F3: F3— 1101 R3: R3 - 1101及 Ό¾· ^ "ププライ LPF-1101と LPR - 1101を組 て用いたプライ セットの につレ λて調べた。
2) ヒト CK19醒^ |δ|·の調製、
実験例 2—1と同様の操作を行い、コピ^" 100000 10000 1000及び 0 (対照） となるように調製した。
Figure imgf000064_0001
d TPs (GIBC0ネ耀 0. 4 ra
MgS04 2 raM
ジチオトレイト (dithiothreitol) 5 raM
ベタイン (betaine) (Sigmaネ i ) 640 nM
Thermopol buffer (New England BioLabs)
AMV逆転^^ (Promega if ) 1. 25U
Bst DNAポリメラーゼ (New England BioLabs 16 U
タージトー/ (Sigma) l°/o
プライマー： FIP 40pmol, RIP 40pmol,
F3プライ 5pmol, R3プライ 5pmol
ププライ (loop F, loop ) 各 20pmol
Tis-HCl (pH 8) 60mM
4 ) - RT-LAMP法は 験例 2— 1と同様の雜により行つた 6 は 0. 2mlのチュ ブ 内で 65°Cで 1. 5時間行った。
5) 増幅の麵
RT- LAMP 物の濁度を、波長 500nmにおける吸體により経時的に測定した。 測 定装置はテラメックスネ i製の LA-200を使用した。
6 ) 結果
その結果を第 3 0図に示した。麵コピー数に応じて、測定開始後 11〜13分の間で、 増幅開始が認められた。
(実験例 2— 7) ヒト CK19腿に ¾~Τる増幅の廳忍 （濁度の測定）
1 ) プライマーセット （Cグ "
FIP: FA— 1101、 RIP: RA- 1101、 F3: F3_1101、 R3: R3— 1101及 Ό¾·ノ ププライマー： LPF-1101と LPR- 1101を糸且^:て用いたプライマーセット及ぴ RNaseインヒビターを 加えた にっ ヽて調べた。
2) ヒト CK19醒^の調製、
実験例 2 - 1と同様の操作を行レヽ、コピー数が、 100000、 10000、 1000及び 0 (対照） となるように調製した。
3 ) 贓
さらに、 RNase Inhibitor Μ) を 25U加える他は、実験例 2— 6と同様の ®¾顺夜を删した。
4 ) RT - LAMP法及び 5 ) 増幅の纏は実験例 2— 6と同様に行った。
6 ) 結果
その結果を第 3 1図に示した。麵コピー数に応じて、測定開始後 10〜12分の間で、 増幅開始が認められた。 RNase inhibitorを添口することによって、増幅 を阻害 する物質の影響が ί氐減され、 増幅の廳 こ要する時間を短くすることができた。
(実験例 3— 1 )
実施例 3 - 2に示される各種プライマーから、 次の組^:により RT - LAMP法で測定 した:^の、 を開始してから増幅が藤できるまでに要する時間を各プライマー セットにつ 、て調べることを目的として を行つた。 1 ) ヒト CK20諷謝の調
ヒト CK20の:^ SI Jを基に設計したプライマーを用いて RT- PCRを行うことにより、 KAT0III (胃癌細胞） 由来トータル RNA から、 ヒ ト CK20cDNA を単離した。 pBluescript (STRATAGENEネ； ^プラスミド)にクローニングしたヒト CK20cDNA力ゝら、 in vitroでの転 % "シスアム (Riboprobe in vitro transcription system (Promega ¾C^) ) を用レ、て転写産物を合成した。得られた原液の腿濃度を 260nraでの吸 測定によ り算出し、その値をもとにヒト CK20の腿コピ^が 600000となるように 50 tig/ μ L yeast RNA (Amibonネ懷） で «調製し、顯とした。
2) プライマーセット
各種プライマーを （表 2) の組 で用いた。
(表 2) プライマーセット及び増幅カ權忍できるまでに要する時間
FIP RIP F3プライマー — R3プライマー —時間 （分)
KFA-5 KRA-5 KF3-5 KR3-5 25
KFA-5a KRA-5 KF3-5 KR3-5 26
KFA-5b KRA-5 KF3-5 KR3-5 23
KFA-5d KRA-5 KF3-5 KR3-5 26
KFA-5e KRA-5 KF3-5 KR3-5 25
KFA-5f KRA-5 KF3-5 KR3-5 24
KFA-5 KRA-5a KF3-5 KR3-5 30
KFA-5 K A-5c KF3-5 KR3-5 35
KFA-5 腿 - 5d KF3-5 KR3-5 30
KFA-5 KRA-5e F3-5 KR3-5 36
KFA-5 KRA-5f KF3-5 KR3-5 40
3 ) 滅 実験例 1一 1と同様のものを棚し、 ノ ププライマーは励 Πしなかった。
4) RT - LAMP法
上記 4種のプライマー む^) ¾夜 23 に、ヒト CK20の腿 を 2 μ 1添ロし、 65¾で 1 間加温して行った。
5 ) 増幅の廳
例 1— 1と同様にリァゾレタイム法により測定した。
6) 結果
各プライマーセットにより させた の
増幅が瘸できるまでに要する時間を表 2に示した。 その結果、最大で 40分であり、 ほとんどのプライマーセットで、 30分以内で薦された。
(実験例 3— 2)
実験例 3—： Lで検討したプライマーセットのうち、 増幅の廳忍に要する時間力 S短レヽ プライマーセットを激尺し、 さらに ^·ププライマーを用いた組^のプライマーセ ットにより RT - LAMP法で測定した齢の感度を調べることを目的として案験を行つた。
1 ) ヒ
Figure imgf000067_0001
実験例 3— 1と同様の操作を行い、コピ^:が各々 0、 190、 960、 4800、 24000、 120000、 600000となるよう^ jSを調製した。
2) プライマーセット
次の各糸且^:のプラィマーセットにつレヽて検討を行つた。
セット 1 ： FIP (KFA - 5b)、 RIP (KRA-5) 、
F3プライマー （KF3- 5)、 R3プライマー （KR3- 5)、
. ノ^ "ププライマー （K—LPF2, K-LPR1) .
セット 2 ： FIP (KFA-5b) N RIP (KRA-5) 、
F3プライマー （KF3 - 5)、 R3プライマー （KR3- 5)、
ノ "ププライマー （K - LPF2， K-LPR2) 3 ) ^
実験例 1—1と同様のものを i^fflした。
4) RT- LAMP法及び 5 ) 増幅の鷂¾、は実験例 3— 1と同様の手法により行った。
6 ) 結果
プライマーセット 1について検討した結果を第 3 2図に示した。 その結果、 ヒト CK20の RNAの «の量が多レ、 のほう力 増畐が廳忍できるまでに要する時間は短 力かった。しかし麵の量が 190コピーの でも 30分以内に飄の増幅が認められ、 醒の量が 600000コピーの:^でも 10分離で D Aの増幅カ^!忍された。 プライマ 一セット 2を麵した齢にも同様の結果が得られた。
(実験例 3 - 3) ヒト CK20RNAに る増幅特異性
実験例 3 - 2で 尺したプライマーセットを用レヽて測定した^のヒト CK20の RNA に *Η "る増幅特異性を調べた。 サイトケラチン （CK) には、 ヒト CK20のほかにヒト CK18, 19等のアイソフォームが知られており、 これらはヒト CK20と約 60%のホモ口 ジーを有する;^ ¾己列からなる。本発明のプライマーセットを用いて測定した齢に、 ヒト CK18又は 19と調リして； ^可能力 かを調べることを目的として実験を行つた。 1 ) 謹謝の調 法
実験例 3— 1と同様の操作を行レヽ、 コピー数 600000のヒト CK20の RNA ^斗を調製 した。 ヒト CK18及ぴヒト CK19の匪について
Figure imgf000068_0001
2) プライマーセット
実験例 3 - 2で激尺したプライマーセット 1及びセット 2を用レヽた。
3 ) SJiW , 4) RT— LAMP？去及び 5) 増幅の は、 実験例 3— 2と同様の手法 により行った。 .
6 ) 結果
プライマーセット 1について検討した結果を第 3 3図に示した。 藤したプライマ ーセットではヒト CK20RNAは増幅するが、 ヒト CK18RNA及びヒト OQ9R Aは全く增幅 •¾rf、 ヒト CK20RNAに特異性があること力 ¾H された。 プライマーセット 2について あ同様の結果が得られた。
(実験例 3— 4)
プライマーセットを用 ヽて測定した^の、 ヒト CK20腿の測定感度を調べること を目的として纖を行った。
1 ) ヒト CK20腿難の調,法
実験例 3— 1と同様の操作を行い、 コピ^:が各々 0、 190、 960、 4800、 24000、 120000及び 600000となるように^ ^を調製した。
2)プライマーセット
次の^!且^:のプラィマーセットにつレ、て検討を行つた。
セット 3： FIP(AFA)、 RIP(AMf)、 F3プライマー (AF3)、 R3プライマー (AR3)、
ノ^ "ププライマー (LPF2， LPR6)
3)®S截膽、 4) RT - LAMP '法及び 5)増幅の鶴 ¾、は、実験例 3— 2と同様の手法によ り行った。
6)結果
その結果を第 3 4図に示した。その結果、ヒト CK20の賺の麵の量が多い齢の ほう 1 増幅力 ¾| ^できるまでに要する時間は短かかつた。 しかし »の量が 190コ ピーの でも 30分以内に DNAの増幅が認められ、 ,の量が 600000コピーの：！^ でも 10分 で DNAの増幅力 鶴 された。
(実験例 3— 5 )
実験例 3— 4で選択したプライマ一セットを用いて測定した^のヒト CK20腿に る増幅特異性を調べることを目的として 験を行った。
1 )赚 の調 法
実験例 3— 1と同様の操作を行レヽ、 コ H 600000のヒト CK20の 製した。 ヒト CK18及びヒト CK19の醒につレ、ても同様に酣を調製した。
2)プライマーセット
^^例 3— 4で選択したプライマーセット （セット 3) を選択した。
3 ) 滅、 4) RT - LAMP法及び 5 )増幅の礴忍は、実験例 3 _ 2と同様の手法によ り行った。
6 )結果
その結果を第 3 5図に示した。 賺したプラィマーセットではヒト CK20離〖满幅 するが、 ヒト CK18RNA及ぴヒト CK19RNAについては全く増幅 "¾rf、 ヒト CK20腿に特 異个生があること力 ¾tl忍された。 産業上の利用可能 |~生
以上説明したように、本発明のプライマー又はプライマーセットを用 、て LAMP法を 行うと、効; にヒト CK18RNA、 CK19RNA及び CK20RNAを特異的に増幅させることがで きることがわかった。 このこと力ゝら、本発明のプライマーを用いると、鄉寺間にヒト CK18腿、 CK19RNA及び CK20RNAを検出することが可能となり、核^ ¾Ψ畐手段を用!/、た リンパ節への; 診断に要する時間の纖化が可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . LAMP法によりサイトケラチンを検出するための核翻幅用プライマー。
2. サイトケラチンが、 サイトケラチン 1 8、 サイトケラチン 1 9及びサイトケラチ ン 2 0からなる群より激尺される請求の範囲第 1項に記載の核輔幅用プライマー。
3. 以下の群よ
Figure imgf000071_0001
むヒトサイトケラ チン 1 8検出のための核酸増幅用プライマー；
1 ) 配歹 IJ 号 1で表される; ^己列の 270〜1375番目の ^¾tH:の相補鎖の繊か ら激尺され、 配列番号 1及び Z又はその相補鎖の連続する； を少なくとも 5以上含 むオリゴヌクレオチド。
2) 配歹瞎号 2〜341のいずれかで表される 己列からなるオリゴヌクレオチド。
3 ) ΗΙΠΒ Ι ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相捕氣
4) ΙίΓΐ己 1 ) 〜3 ) のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド。
5 )藤己 1 ) 〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な 、し数個の；！ ^が藤、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された 列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレ才チド'。
4. 噃号 66〜88又は 179〜341で表される; ¾|己列のいずれかより選択されるォ リゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための核隱幅用プライマ 一。
5.核麟幅の手段が LAMP法である請求の繊第 3項又は第 4項に記載の核赚 Φ畐用 プライマー。
6. 以下の群より 尺される酉 IJからなるオリゴヌクレオチド¾ ^む核^ ¾幅用ブラ イマ一から少なくとも 2種を 尺することを賺とするヒトサイトケラチン 1 8検出 のための核^^幅用プライマーセット；
1 ) 配歹噃号 1で表される：^ ¾己列の 270〜1375番目の«¾1^の相補鎖の領域か ら 尺され、 S^J番号 1及び/又はその相補鎖の連続する を少なくとも 5以上含 むオリゴヌクレオチド。
2) 配歹瞎号 2〜341のいずれかで表される:^^己列からなるオリゴヌクレオチド。
3) 藤己 1 ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補齓
4) ffflBl ) ~ 3) のレヽずれか 1に纖のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
5 )搬己 ）〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレ、し数個の が置換、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された: fi¾己列を含み、 プライマ^"機能を有す るオリゴヌクレ才チド、。
7.核^ it幅の手段が LAMP法である請求の麵第 6項に言 Bgのヒトサイトケラチン 1 8検出のための核 幅用プライマーセット。
8. オリゴヌクレオチド む核^ f幅用プライマーから少なくとも 4種を選択する ことを置とする請求の範囲第 7項に記載のヒトサイトケラチン 1 8検出のためのプ ライマーセット。
9. ΙίΓΐ己プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも 2種が、配歹噃号
1で表される; ¾¾£SS列及び Ζ又はその相補鎖の各々 2箇所の領域を認識することを特 徴とする請求の範囲第 6〜8項のい 1 ^か 1に言織のヒトサイトケラチン 1 8検出の ためのプライマーセット。
1 0. tiriBプライマーセットに含まれるプライマーが、 酉 a ^番号 1で表される:^ 己 列及び Z又はその相補鎖の少なくとも 6箇所の g¾を認識することを赚とする請求 の範囲第 7〜 9項の 、ずれか 1に言己載のプライマーセット。
1 1.配歹噃号 234〜341で表される «|己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイ トケラチン 1 8検出のための核 幅用プライマーであって、
( a ) 綱番号 234〜286、及び （b)鋼番号 287〜341、
に分類した^の、 （a )及ぴ（b )力 各 1のプライマーを選択した組^: ¾ ^むこ とを賺とするプライマーセット。
1 2. 請求の範囲第 1 1項のプライマーセットに、配列番号 66〜88又は酵 (I番号 179 -201で表される ¾¾|己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 8検 出のための核 幅用プライマーであって、
( c ) 酉 番号 66〜88、 及ぴ（d) 配歹蹯号 179〜201ヽ
に分類した の、 ( c )及び（d)力 各 1のプライマーを選択した組^:のプライ マーをさらに含むことを赚とするプライマーセット。
1 3. 請求の麵第 1 1項又は第 1 2項のプライマーセットに、 配列番号 202〜233 で表される: 列のオリゴヌクレ チドからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のた めの核 幅用ブラィマーであって、
( e) 酉 E^U番号 202〜219、 及び ( f ) @S ^番号 220〜233、
に分類した ¾^の、 ( e )及ぴ（f ) カ ら各 1のプライマーを ίΐί尺した組 "β^Γのプライ マーをさらに含むことを とするプライマーセット。
1 4. 次に示す 1 ) 〜4) のいずれかからなるサイトケラチン 1 8検出のための核酸 増幅用プライマーセット；
1 )配列番号 234、 287、 66及び 179で表される:^ ¾己列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット。
2)配列番号 252、 297、 68及び 182で表される:^ ¾|5列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
3 )配列番号 259、 307、 72及び 184で表される:^ 己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
4)配列番号 278、 331、 79及び 193で表される:^ ¾g己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
1 5. 次に 〜4) のレ、ずれかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核 ,幅用プライマーセット；
1 )配列番号 234、 287、 66、 179、 203及び 220で表される i^gffi^のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。 2)配列番号 252、 297、 68、 182、 211及び 223で表される のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
3 )配列番号 259、 307、 72、 184、 212及び 226で表される:^ SSB^Jのオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
4)配列番号 278、 331、 79、 193、 214及び 228で表される;^ ¾|己列のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
1 6 . 次に示す 1 )〜8 ) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核^!幅用プライマーセット；
1 )配列番号 280、 334、 82及び 195で表される; Ml己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
2)配列番号 281、 335、 83及ぴ 196で表される:^ £|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
3 )配列番号 282、 336、 84及び 197で表される IffiB列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
4 )配列番号 282、 337、 84及び 197で表される:^ Sg己列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプラィマーセット。
5 )配列番号 283、 338、 85及び 198で表される:^ £|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
6 )配列番号 284、 339、 86及び 199で表される iffi己列のォリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
7)配列番号 285、 340、 87及び 200で表される 己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマーセット。
8 )配列番号 286、 341、 88及び 201で表される ¾S|己列のオリゴヌクレオチドをプラ イマ一として含むプライマ一セット。
1 7. 次に示す 1 ) ~ 6 ) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 1 8検出のための 核 ^if幅用プライマーセット； 1 )酉 B^J番号 282、 336、 84、 197、 216及ぴ 229で表される;^ のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
2)配列番号 282、 337、 84、 197、 216及び 230で表される ¾¾g5^のオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
3)配列番号 282、 337、 84、 197、
Figure imgf000075_0001
ゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
4)配列番号 283、 338、 85、 198、 217及ぴ 232で表される :^£1 (Jのオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
5)膨 U番号 286、 341、 88、 201、 218及び 233で表される: SS|2^Jのオリゴヌクレオ チドをブライマ一として含むプラィマーセット。
6 )配列番号 286、 341、 88、 201、 219及び 233で表される:^ SIB^Iのオリゴヌクレオ チドをプライマーとして含むプライマーセット。
1 8. 請求の麵第 3項若しくは第 4項に纖のプライマーから必要なプライマーを 選択し、 又は請求の賴第 5〜1 7項のいずれか 1に記載のプライマーセット¾¾尺 して することによるヒトサイトケラチン 1 8の核酸検出
1 9. 以下の群より翳尺される酉 Jからなるオリゴヌクレオチド ¾r ^むヒトサイトケ ラチン 1 9検出のための核 ,幅用プライマ一；
1 )配列番号 342で表される ¾¾|己列の 270-930番目の«¾1^：の相捕鎖の繊か ら激尺され、 酉 11番号 342及び Ζ又はその相補鎖の連続する を少なくとも 5以上 含むォリゴヌクレオチド。
2) 配歹 I潘号 343〜432のレ、 f lかで表される； 己列からなるオリゴヌクレオチド。
3) ifflSl ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補
4) 藤己 1 ) 〜3 ) のレヽずれか 1に言識のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 餅下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
5 )歸己 1 )〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレヽし数個の が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された: ^己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレ才チド。
2 0. 酉 E^【J番号 357〜361又は 378〜434の IB 番号に表される ¾SS己列のレ、ずれかよ り截尺されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 1 9検出のための核酸 増幅用プライマー。
2 1 .核赚幅の手段が LAMP法である請求の範囲第 1 9数は第 2 0項に鍵のヒト サイトケラチン 1 9検出のための核^ i i畐用プライマー。
2 2. 以下の群より邀尺される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核 ¾t|幅用プ ライマーから少なくとも 2種を 尺することを難とするヒトサイトケラチン 1 9検 出のための核酸増幅用プライマーセット；
1 )配列番号 342で表される:^^己列の 270〜930番目の領 の相補鎖の領域か ら選択され、 酉 B^【J番号 342又はその相補鎖の連^る; ¾を少なくとも 5以上含むォ リゴヌクレ才チド。
2) 配歹噃号 343〜434で表される 列からなるオリゴヌクレオチド。
3 ) ftrt己 1 ) 又は 2 ) に記載のォリゴヌクレオチドの相補氍 .
4) w! l ) ~ 3) のいずれか 1に記載のオリゴヌタレ^ドとストリンジェントな 下でハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
5) ffifai) ~4)に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1な 、し数個の驢が置換、 欠失、 挿入もしくは付加といった変異された 1MB列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド。
2 3.核藝幅の手段が LAMP？去である請求の範囲第 2 2項に記載のヒトサイトケラチ ン 1 9検出のためのプライマーセット。
2 4. オリゴヌクレオチドを含む核 幅用プライマーから少なくとも 4種を邀尺す ることを難とする請求の範囲第 2 2項又は第 2 3項に雄のヒトサイトケラチン 1 9検出のためのプライマーセット。
2 5. 編己プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも 2種が、 m 号 342で表される ¾S己列及び Z又はその相補鎖の各々 2箇所の領域を認識すること を赚とする請求の章漏第 22〜24項のいずれか 1に記載のヒトサイトケラチン 1 9検出のためのプライマーセット。
26. 籠己プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号 342で表される驢 配列及び/又はその相補鎖の少なくとも 6丽 貝域を認識することを赚とする請 求の範囲第 22〜25項のい か 1に記載のヒトサイトケラチン 19検出のための 核^ t幅用プライマーセット。
27.配歹瞎号 413〜434に表される; ¾|Β列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイ トケラチン 19検出のための核酸増幅用プライマーであって、
(a) IB 番号 413〜417、 419、 422若しくは 424〜427、 及び
(b) 酉 噃号 418、 420、 421、 423若しくは 428〜434、
に分類した齢の、 （a)及び (b)力 各 1のプライマーを選択した組^:を含むこ とを垂とするプライマーセット。
28. 言青求の麵第 27項で激尺された各プライマーの組 に、
酉 3 ^番号 357〜361又は 378〜384に表される;^ ¾B^Jのオリゴヌクレオチドからなる ヒトサイトケラチン 19検出のための核^ fi畐用プライマーであって、
(c) 画番号 357〜361、及ぴ (d) 嗣番号 378〜384、
に分類した齢の、 (c)及び (d)力ら各 1のプライマーを 尺した組 ·^のプライ マーをさらに含むことを とするプライマーセット。
29. 言青求の章涵第 27項又《^28項で 尺された各プライマーの組^:に、 配列番号 385〜412に表される:^^ 5^のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケ ラチン 19検出のための核^ if幅用プライマーであって、
(e) 配列番号 385〜398、及び（ί) 配列番号 399~412、
に分類した齢の、 （e)及び（f )力ら各 1のプライマーを選択した組^: ¾： ^むこ とを鍾とするプライマーセット。
30. 己列番号に表される: 己列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラ チン 1
Figure imgf000077_0001
1) 〜4) のいずれかの組合 せを含むプライマーセット；
1) (a) 配列番号 413〜417、 (b) 配歹噃号 418、 (c)酉 【墦号 357、 (d) 配歹噃 号 378に分類した の、 ^類から 1のプライマーを懲尺した組^:。
2) (a) 配列番号 419、 (b) 酉 fl ^番号 420〜421、 (c) 酉 IJ番号 358、 (d) 配歹嘴 号 379に分類した：^の、各分類から 1のプライマーを選択した組合せ。
3) (a) 配列番号 422、 (b) 酉^ 1J番号 423、 (c) 配列番号 359、 (d) 配歹噃号 380 に分類した ¾^の、 各プライマーを慰尺し ^且^:。
4) (a)配列番号 424~427、 （ b )配歹瞎号 428〜434、 （c)配歹噃号 360~361、 (d) 配列番号 381〜384に、類した^の、 各分類から 1のプライマーを舰した組^:。
31. 顿己列番号に表される: 列のオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラ チン 19検出のための核^ ¾幅用プライマーであって、 1) 〜4) のいずれかの組合 せを含むプライマーセット；
1) (a) 酉己列番号 413〜417、 (b) 配歹噃号 418、 (c)酉 j番号 357、 (d) 配歹瞎 号 378、 ( e )酉 番号 385〜391、 ( f )酉 lj番号 399-402に分類した:^の、各分類 から 1のプライマーを凝尺した組^:。
2) (a) 配列番号 419、 (b) 配列番号 420〜421、 (c) 酉 [|番号 358、 (d) 配歹 (潘 号 379、 ( e ) IE ^番号 392〜393、 ( f )酉 番号 403-406に分類した^の、各分類 力、ら 1のプライマーを激尺し:^且 。
3) (a)配歹【潘号 422、 （b)配歹播号 423、 （c)配列番号 359、 （d)配歹噃号 380、 ( e )配歹蹯号 394〜396、 ( f )配歹瞎号 407-409に分類した： ^の、各分類から 1 のプライマーを選択した組 ^¾：。
4) (a)配列番号 424〜427、 （b)配歹皤号 428〜434、 （c)配歹噃号 360〜361、 (d) 配列番号 381〜384、 (e) 配列番号 397〜398、 (f ) 配歹噃号 411〜412に分類した場 合の、 類から 1のプライマーを邀尺した組^:。
32. 1) 〜3) のいずれかからなるヒトサイトケラチン 19検出のための核騰幅 用プライマーセット； 1 ) 配 墦号 413、 418、 357及び 378で表される;^ SI己列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマーセット。
2) 配歹 1潘号 419、 421、 358及び 379で される ¾|S列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマ一セット。
3) 配歹瞎号 424、 431、 360及び 381で表される 列のオリゴヌクレオチドをプ ライマーとして含むプライマーセット。
3 3 . 1) 〜4) のレ、ずれかからなるヒトサイトケラチン 1 9検出のための核闘幅 用プライマーセット；
1 ) 配歹噃号 413、 418、 357、 378、 385及び 402で表される ¾|己列のオリゴヌクレ ォチドをプライマ一として含むブラィマーセット。
2) 配歹幡号 419、 421、 358、 379、 392及び 404で表される;^^己列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット。
3 ) 配歹 t潘号 422、 423、 359、 380、 394及び 407で表される 己列のオリゴヌクレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット。
4) 配歹瞎号 424、 431、 360、 381、 397及び 411で表される; ^¾己列のオリゴヌタレ ォチドをプライマーとして含むプライマーセット。
3 4. 請求の麵第 1 9項若しくは第 2 0項に記載のプライマーから必要なプライマ ーを激尺し、 又は請求の範囲第 2 1 - 3 3項のいずれかから選択されるプライマーセ ットを^ fflすることによる核酸検出^去。
3 5. 以下の群より 尺される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むヒトサイトケ ラチン 2 0検出のための核自幅用プライマー；
1 )配列番号 435で表される; 列の 340〜490番目若しくは 4%〜1050番目 域 及びそれらの相捕鎖の領域から選択され、酉 (』番号 435及び Z又はその相補鎖の連続 する m¾を少なくとも 5以上含むォリゴヌクレ; ド。
2) 配歹隙号 436〜460のいずれかで表される; ¾1己列からなるオリゴヌクレオチド。 3 ) flit己 1 ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補氟 4) ffitSl ) 〜3) のレヽずれか 1に fB¾のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな 条件下でハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチド。
5 )嫌己 1 ) 〜 4)に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレ、し数個の驢が置換、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された: ^己列 ¾ ^み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド。
3 6. 酉 E^lj番号 443、 444又は 454〜474の酉 番号に表される:^^ S列のい" f Lかよ り邀尺されるオリゴヌクレオチドからなるヒトサイトケラチン 2 0検出のための核酸 増幅用プライマー。
3 7.核^ #幅の手段が LAMP法である請求の範囲第 3 5¾Xは第 3 6項に記載のヒト サイトケラチン 2 0検出のための核^ i幅用プライマー。
3 8. 以下の群より凝尺される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核^ 1<畐用プ ライマーから少なくとも 2種を選択することを赚とするヒトサイトケラチン 2 0検 出のための核^ it幅用プライマーセット；
1 ) 配歹幡号 35で表される; ¾|己列の 340〜1050番目及びその相補鎖の«から選 択され、 配列番号 435及び Z又はその相補鎖の聽する驢を少なくとも 5以上含む オリゴヌタレ^ド。
2) 配歹【潘号 436から 460のレ、ずれかで表される:^ 列からなるオリゴヌクレオチ ド。
3 ) 1 ) 又は 2) に記載のオリゴヌクレオチドの相補
4) 編己 1 ) 〜3) のいずれか 1に のオリゴヌクレ^ドとストリンジェントな 条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチ κ
5 )謙 β 1 ) 〜 4 )に記載のォリゴヌクレオチドのうち、 1なレヽし数個の が置換、 欠失、挿入もしくは付加といった変異された; 己列を含み、 プライマー機能を有す るオリゴヌクレオチド。
3 9.核麟幅の手段が LAMP法である請求の範囲第 3 8項に記載のヒトサイトケラチ ン 2 0検出のための核^ I 幅用プライマーセット。
4 0. オリゴヌクレオチド む核酸 幅用プライマーから少なくとも 4種を邀尺す ることを とする請求の範囲第 3 9項に ΐ識のヒトサイトケラチン 2 0検出のため のプライマーセット。
4 1 . 肅己プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも 2種が、 m 号 435で表される;^己列及び Z又はその相補鎖の各々 2箇所の領域を認識すること を赚とする請求の章涵第 3 8 -4 0項のいずれか 1に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
4 2. 謝己プライマーセットに含まれるプライマーが、 膨 I潘号 435で表される腿 配列及び Z又はその相捕鎖の少なくとも 6ii /f( ^域を認識することを赚とする請 求の範囲第 3 8〜4 1項のい Lか 1に記載のヒトサイトケラチン 2 0検出のための プライマーセット。
4 3. SB^J番号 461〜466及び 468〜473に表される I^SS^IJのオリゴヌクレオチドか らなるヒトサイトケラチン 2 0検出のための核^^幅用プライマーであって、 （a) 配列番号 461〜466、 (b)酉 3 ^番号 468〜473に分類した場合の、各分類から 1のプラ イマ一を 尺した組^: ¾ ^むことを置とするプライマーセット。
4 4.請求の删第 4 3項で激尺された各プライマーの組 に、さらに配歹瞎号 444 及 己歹幡号 455で表される ¾M己列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含む ヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
4 5 · 請求の章姻第 4 3項又は第 4 4項に のプライマーセットにさらに配歹蹯号 457及び Z又は 459若しくは 460で表される:^ ¾己列のォリゴヌクレ^ ^ドをプライ マーとして含むヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
4 6. 酉 潘号 443、 454、 467及び 474で表される iffi Jのオリゴヌクレオチドを プライマーとして含むヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
4 7. 酉 (I番号 443、 454、 467及び 474で表される:^ Sffi^Jのオリゴヌクレオチドの 他にさらに配 潘号 456及び Z又は 458で表される; SS^(Jのオリゴヌクレオチドを プライマーとして使用するヒトサイトケラチン 2 0検出のためのプライマーセット。
48. 請求の麵第 35項若しくは第 36項に織のプライマーから必要なプライマ 一を緩尺し、 又は請求の範囲第 37〜47項のいずれかから ®ί尺されるプライマーセ ット删して行う核酸検出方
49.核酸検出 去が LAMP法である請求の範囲第 18、 34¾Xは第 48項に記載の 核酸検出方法。
50. 請求の麵第 18、 34、 48項又は第 49項に記載の核酸検出細こ棚す
51. 請求の麵第 18、 34、 48項又は第 49項に織の核酸検出 去に棚す る^ ¾キッ卜。
52. 請求の麵 18、 34、 48 ^IXは 49項に言己載の核酸検出 を用 ヽた核酸 検出システム。
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