WO2003040288A2 - Isotopencodierte affinitätsmarker 3 - Google Patents

Isotopencodierte affinitätsmarker 3 Download PDF

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WO2003040288A2
WO2003040288A2 PCT/EP2002/012105 EP0212105W WO03040288A2 WO 2003040288 A2 WO2003040288 A2 WO 2003040288A2 EP 0212105 W EP0212105 W EP 0212105W WO 03040288 A2 WO03040288 A2 WO 03040288A2
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Hans-Ulrich Siegmund
Dorian Immler
Andreas Schumacher
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    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Definitions

  • the invention relates to new, isotope-coded affinity markers for the mass spectrometric analysis of proteins as well as their production and their use.
  • Proteomics technology opens up the possibility of identifying new biological targets and markers by analyzing biological systems at the protein level. It is known that only a certain part of all possible proteins of the proteins encoded in the genome is expressed, whereby, for example, tissue type, development status, activation of receptors or cellular interactions influence the expression patterns and rates. In order to determine differences in the expression of proteins in healthy or diseased tissue, various comparative methods for analyzing protein expression patterns can be used ((a) S.P. Gygi et al., Proc. Natl.
  • Isotope coding is implemented.
  • the protein mixtures are then combined, if necessary fractionated or proteolytically treated and purified by affinity chromatography. After the bound fragments have been eluted, the eluates are analyzed by combining liquid chromatography and mass spectrometry (LC-MS). Couples or groups of with themselves only in the Isotope coding distinguishing affinity markers labeled peptides are chemically identical and are eluted almost simultaneously in HPLC, but they differ in the mass spectrometer by the respective molecular weight differences due to different isotope patterns of the affinity markers. Relative protein concentrations can be obtained directly by measuring the peak areas.
  • Suitable affinity markers are conjugates of affinity ligands which are covalently linked to protein-reactive groups via bridge members. Different isotopes are built into the bridge members. The method was described using affinity markers in which hydrogen atoms were replaced by deuterium atoms (H / D isotope coding).
  • the object of the present invention was to provide improved isotope-coded affinity markers.
  • the invention relates to organic compounds suitable as affinity markers for the mass spectrometric analysis of proteins of the formula (I),
  • a for an affinity ligand residue or for a solid phase PRG for a protein reactive group
  • R and R 'on a piperazine ring independently of one another and independently of other R and R' on other piperazine rings of the same or the other of the two run variables 1 and m are each an ⁇ -amino acid side chain
  • Z ' is the amino acid residue CO- (CH 2 ) y -CHR y -NH with the amino acid side chain R and the number y from the value range from 0 to 5, which differs from Z in the different orientation with respect to the terminal CO- and NH group, and k, 1, m, n each independently represent a number from 0 to 10, the sum k + 1 + m + n being at least 1 and at most 40,
  • Deuterium, 13 C- or 13 C- and 15 N-labeled glycine building blocks or other correspondingly labeled amino acid building blocks are inexpensive starting materials which allow the isotope-labeled affinity markers to be constructed flexibly.
  • Affinity markers described in formula (I) can be introduced in a simple manner more than twenty 13 C labels and in addition up to ten 15 N isotopes.
  • the version with up to is preferred
  • the modular structure of the affinity markers enables a flexible combination of the individual components, which is adapted to the requirements of the workflow.
  • the affinity markers described can be equipped with an acid-labile predetermined breaking point, which enables the peptide fragments to be decomplexed by a much more efficient affinity chromatography, for example based on streptavidin or oligomeric avidin, for the biotin-modified peptide fragments or by a reversible connection to a solid phase. Furthermore, the tags remaining on the peptide fragments after acid cleavage have a low molecular weight and a high isotope density. The handling of the affinity markers is improved by improved solubility, by a crystalline or amorphous appearance and by increased stability.
  • the invention furthermore relates to the use of one or more differently isotope-labeled compounds according to the invention as a reagent for the mass spectrometric analysis of proteins, in particular for the identification of one or more proteins or protein functions in one or more protein-containing samples and for determining the relative expression levels of one or more proteins in one or more protein-containing samples.
  • the invention further relates to a kit for the mass spectrometric analysis of proteins, containing as reagents one or more differently isotope-labeled compounds according to the invention.
  • An affinity ligand A is used for the selective enrichment of samples using the
  • affinity columns are provided with the corresponding complementary partners to the affinity ligands, which enter into covalent or non-covalent bonds with the affinity ligands.
  • An example of a suitable affinity ligand is biotin or a biotin derivative which is strong, non-covalent with the complementary peptides avidin or streptavidin
  • Binds In this way, samples to be examined can be selectively isolated from sample mixtures with the aid of affinity chromatography.
  • carbohydrate residues for example, which can enter into non-covalent interactions with, for example, fixed lectins, can also be used as an affinity ligand.
  • Interaction of haptens with antibodies or the interaction of transition metals with corresponding ligands can be used as complexing agents or other systems that interact with each other.
  • the targeted depletion can also be carried out by selective, reversible
  • Suitable solid phases are, for example, Ainino-functionalized resins based on silica gel and are furthermore known from the peptide syntheses carried out as solid-phase syntheses, such as trityl resin, sasrin resin based on benzyl alcohol support, Wang resin based on benzyl alcohol support, Wang polystyrene resin, Rink amide MBHA resin or TCP (trityl chloride polystyrene) resin (in the formulas shown, the circled P stands for the rest of the resin):
  • solid phase A is a polymeric carrier, in particular a modified natural or synthetic resin, for example a resin based on silica gel or polyethylene glycol, with functional groups suitable for linking the linker L, for example hydroxyl, carboxy and amino groups, in particular amino groups ,
  • Particularly preferred as solid phase A is an amino-functionalized resin based on silica gel, for example an aminopropyl silica gel, as described, for. B. is sold by Aldrich under number 36425-8.
  • Protein-reactive groups PRG are used for the targeted labeling of proteins on selected functional groups. PRGs have a specific reactivity for terminal functional groups of the proteins.
  • Amino acids as elements of proteins that are often used for targeted labeling are, for example, mercaptoaminomonocarboxylic acids such as cysteine, diaminomono- carboxylic acids such as lysine or arginine or monoaminodicarboxylic acids such as aspartic acid or glutamic acid.
  • Protein-reactive groups can also be phosphate-reactive groups such as metal chelates and aldehyde-reactive and ketone-reactive groups such as semicarbazones or amines with subsequent treatment with sodium borohydride or sodium cyanoborohydride. It can also be groups which react with the reaction products after targeted protein derivatization, such as, for example, a bromine cyanide cleavage or an elimination of phosphate groups etc.
  • Z and Z ' are residues of the same or different amino acids.
  • the amino acids can optionally be in the D, L or racemic form.
  • Preferred compounds of the formula (I) according to the invention have a group of the formula (I ") in the linker L as a group of the formula (T) (all R and R 'in formula (V) are hydrogen):
  • Linker L is a group of formula (T), in particular a group of formula (I "), in which Z is the glycine residue NH-CH 2 -CO or Z 'is the glycine residue CO-CH 2 -NH, in particular in the Z the glycine residue NH-CH 2 -CO and Z 'the glycine residue CO-CH 2 -
  • linkers L are preferred which have a predetermined breaking point S such as, for. B. have an acid-labile functionality, which ensure cleavage of the affinity marker under certain conditions, for example under the action of acid, so as to. B. to facilitate the release of the affinity column, or to reduce the size of the residue remaining on the peptide, or to make the work processes more efficient overall.
  • the linker L can also be cleaved in another way, for example by chemical cleavage of, inter alia, silyl ethers, esters, carbamates, thioesters, acetals, disulfides or Schiff bases, furthermore by photochemical cleavage, or by enzymatic cleavage of Esters, amides, nucleotides or glycosides or by thermal cleavage of, for example, interacting nucleic acid strands.
  • existing acidic and / or basic functional groups in the form of their salts preferably their hydrochlorides, acetates, trifluoroacetates, alkali metal salts or ammonium salts, can be prepared and used.
  • the protein-reactive group PRG has solubility-improving functional groups.
  • Preferred compounds according to the invention are those of the formula (I), in particular of the formula (II),
  • A stands for the acyl radical of an affinity ligand, for example biotinyl or a biotin derivative, or for a functional group connected to a polymeric carrier, for example a carrier-bound hydroxyl, carboxy or amino group, in particular a carrier-bound amino group.
  • PRG stands for the rest of a protein-reactive group, which is characterized by an electrophilic group and a suitable bridge which enables or facilitates the attachment of the electrophilic group to Z '. Furthermore, such a group can also improve solubility, for example, by appropriate design.
  • a preferred protein-reactive group is an epoxide, a maleimido group, a halogen or an acrylic radical, in particular bridged electrophiles such as
  • PRG can be another known protein-reactive group, e.g. B. by WH Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, p. 30ff.
  • S stands for an acid-labile predetermined breaking point, such as
  • Y as a spacer with preferably 1-10, in particular 1-5, non-hydrogen atoms, which enables or facilitates the connection of the aryl radical to the affinity ligand or to the polymeric support, particularly preferably NH, NH-CH 2 , NH-CH 2 -CH 2 -NH-CO, CH 2 -CO, where Y can be ortho, meta and para to NH and the para position is preferred,
  • SK as the side chain residue of an ⁇ -amino acid of the formula SK-CH (NH 2 ) -COOH, which can be present in the D, L or racemic form for other SK as an H atom, for example the side chains of the 20th natural amino acids as well as their D-forms and racemates.
  • Z is the residue of an amino acid, especially the residue of
  • Glycine which may not be labeled or may contain 13 C or 15 N labels, or a combination of these labels.
  • L ' is a bridge that is a covalent link between two
  • L ' is preferably built up from the building blocks alkylene, in particular (CH 2 ) S , alkenylene, alkynylene, axylene, CO, CS and NH, in particular from a number of 2 to 10 such blocks.
  • V may contain further amino acid residues such as Z and Z ', in particular glycine residues, which may optionally contain 13 C or 15 N isotope labels or a combination of these labels, and is preferably a bridge selected from
  • CO-CO, CO- (CH 2 ) s -CO and CO-arylene-CO CO-CH 2 -NH- CO-NH-CH 2 -CO, CO-NH-CH 2 -CO, CO-CH2-NH -CO, CO- CH 2 -NH-CO-CO-NH-CH 2 -CO, CO-CH 2 -NH-CO- (CH 2 ) s -CO- NH-CH 2 -CO, CO-CH 2 - NH-CO-arylene-CO-NH-CH 2 -CO, (CH 2 ) s -NH-CO-CO-NH- (CH 2 ) s , (CH 2 ) 3 -NH-CO-CO-NH-
  • Side chains, in particular hydrogen are preferably identical amino acid side chains, in particular hydrogen, on all piperazine rings of one of the two run variables 1 and m, and are particularly preferably identical amino acid side chains, in particular hydrogen, on all piperazine rings.
  • Z ' is the residue of an amino acid, especially the residue of
  • Glycine which differs from Z in the different orientation with respect to the terminal CO and NH groups; it may not be labeled or contain 13 C, or 15 N labels, or a combination of these labels.
  • k, 1, m, n can each independently stand for numbers between 0 and 10, the sum of k + 1 + m + n preferably being greater than 0 and less than 20 and particularly preferably being less than 10.
  • M is preferably the number 0 or 1.
  • alkyl, alkylene, alkenylene, alkynylene, alkoxy and arylene have the following meaning:
  • Alkyl per se and "alk” and "alkyl” in alkylene, alkenylene, alkynylene and alkoxy stand for a linear or branched alkyl radical with generally 1 to 6, preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3 carbon atoms, by way of example and preferably for Methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • Alkylene, alkenylene and alkynylene represent divalent alkyl groups which, in the case of alkenylene or alkynylene, have one, two, three, four, five or more double or triple bonds and accordingly have at least 2 carbon atoms, for example and preferably for methylene, ethylene, ethenylene , Ethynylene, n-
  • Alkoxy is exemplary and preferably methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, tert-butoxy, n-pentoxy and n-hexoxy.
  • Arylene stands for a divalent mono- to tricyclic aromatic, carbocyclic radical with usually 6 to 14 carbon atoms; exemplary and preferably for phenylene, naphthylene and phenanthrenylene.
  • a third function of amino acids which may be present in an amino acid side chain R, R ', R x , R y or SK can optionally be present freely or protected with a protective group.
  • the side chains, in particular SK contribute to the improved solubility of the affinity markers.
  • the non-isotope-labeled compounds already represent isotope coding.
  • the compounds according to the invention are used for further isotope coding preferably isotopically labeled with at least one carbon atom of the 13 C isotope, in particular four to 20 13 C atoms.
  • the disadvantageous isotope effect in the LC observed with 1 H / 2 D isotope-coded affinity markers is significantly reduced or even not at all pronounced with 12 C / 13 C isotope coding.
  • the isotopes D, N, O, O and / or can also be used for labeling
  • C-labeled compounds are additionally isotopically labeled with at least one nitrogen atom of the 15 N isotope, preferably one to ten 15 N atoms, in particular one to three 15 N atoms.
  • the isotope markings are usually carried out in L and / or PRG, preferably in L and there in particular in groups Z, L ', Z' and / or in the piperazine-B blocks.
  • the compounds according to the invention can be prepared, for example, by firstly protecting an intermediate of the formula (III) which is protected with suitable orthogonal protective groups SG and SG ',
  • the protective group SG is first detached again after standard reactions and then, if appropriate, a further amino acid derivative which carries an identical or different protective group SG, in particular a Boc group, to the amino function, is attached, derivatives of the formula (IV ) can be obtained.
  • Third party functions available in SK may optionally be protected or freely available.
  • Protective groups that are optionally present can be retained permanently or in separate deblocking steps or simultaneously with the splitting off of one of the terminal groups
  • the protective group SG ' for example an Fmoc group with piperidine in DMF, can then be removed from (IN), so that in the next step the coupling with the derivative of a protein-reactive group or the activated precursor of the derivative of a protein-reactive group of the formula
  • U a group which enables the linkage of PRG with Z 'or possibly with another end group of L, for example by becoming a leaving group.
  • groups are activated Esters such as B. N-hydroxysuccinimide ester or chlorides or groups from which a leaving group can be generated during the coupling.
  • the terminal protective group SG is then removed, a conjugate of the formula (VI) being obtained.
  • an affinity ligand A-OH or A-NH 2 or an activated form of the same such as, for example, an activated ester, an acid chloride or the like, or a hydroxyl-, carboxy- or amino-functionalized solid phase A-OH or A-NH 2 or an activated form thereof under suitable coupling conditions with a compound
  • the derivative (VIII) is then, if appropriate after prior splitting off of an optionally introduced protective group with activated carbonic acid derivatives such as thiophosgene or thiocarbonylbisimidazole, converted into a corresponding isothiocyanate and then coupled with (VI) to the thiourea (IX).
  • the amino function on resins can first be reacted with Fmoc-protected p-aminobenzoic acid or with Fmoc-protected p-aminophenylacetic acid, then the Fmoc group can be removed and converted into the isothiocyanate with an activated carbonic acid derivative and converted to the thiourea.
  • Another object of the invention is accordingly a method for producing a compound according to claim 1, in which
  • the protective group SG is first detached from the intermediate of the formula (in) and then a further amino acid derivative which carries an identical or different protective group SG to the ⁇ -amino function which is detached is attached, with a derivative of the formula (IV) .
  • Y stands for the optionally branched spacer group
  • step vii) any protective groups still present are split off in an optional last step, the successive steps v) and vi) can be carried out at any time before step vii).
  • reversible cleavable protective groups can be used.
  • a protective group SG can be retained, or can be removed simultaneously with the Boc protective group or can be removed in a separate step.
  • Suitable protective groups are, for example, the Boc protective group which can be cleaved with trifluoroacetic acid or the Fmoc protective group which can be cleaved with piperidine or morpholine.
  • Other suitable protecting groups and the corresponding methods for introduction and separation were z.
  • the affinity markers can also be built up in reverse order, the Boc protective group being first detached from derivatives of the formula (IV). The deblocked compounds are then reacted with isothiocyanates correspondingly generated from (Vffl) to give compounds of the formula
  • the invention accordingly furthermore relates to a method for producing a compound according to claim 1, in which
  • the protective group SG is first detached from the intermediate of the formula (III) and then a further amino acid derivative which bears an identical or different protective group SG to the -amino function is attached, a derivative of the formula (IV )
  • Y stands for the optionally branched spacer group
  • step vi) the successive steps iv) and v) can be carried out at any time before step vi).
  • the reactions can be carried out at various pressure and temperature ratios, for example at 0.5 to 2 bar and preferably under normal pressure, or -30 to +100 ° C and preferably -10 to + 80 ° C, in suitable solvents such as dimethylformamide ( DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide ( DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • suitable solvents such as dimethylformamide ( DMF), tetrahydrofuran (THF), dichloromethane, chloroform, lower alcohols, acetonitrile, dioxane, water or in mixtures of the solvents mentioned.
  • DMF dimethylformamide
  • affinity markers can be produced in various ways, both linearly and by coupling blocks which have already been prepared.
  • the modular construction principle enables a multitude of conceivable combinations and, with the appropriate selection of isotope-labeled modules, any type, number and placement of the isotope markings. In molecules of the same type, any number, preferably up to 30, of isotope marker ranges can only be realized with the inclusion of C and N isotopes. This opens the way to simultaneous analysis of several, preferably up to 4, complex protein samples.
  • composition of solvent and eluent mixtures is stated by specifying the components separately from “/” and reproducing the relative parts by volume.
  • So z. B. "Acetonitrile / water 10/1" a mixture of acetonitrile and water in
  • biotin derivatives of the educt series 1 and the piperazine derivatives of the educt series 2 were first prepared.
  • the piperazine derivatives were then converted into the intermediates of the intermediate series 1 to 3.
  • These intermediates were then implemented with the biotin derivatives to the corresponding affinity markers.
  • Educt series 1 biotin derivatives
  • Mono-Fmoc-protected p-phenylene diamine was prepared using standard methods such as those described in e.g. B. in Houben-Weyl; Methods of organic chemistry; Fourth edition; Volume XV parts 1 and 2; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, or in Hans-Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit: amino acids, peptides, proteins; Verlag Chemie, Weinheim 1982 are produced.
  • the target product was precipitated from dichloromethane / methanol with diethyl ether.
  • This building block was produced analogously to E.2.4 starting from glycine- 13 C 2 - 15 N.
  • the intermediate series 2 products were manufactured according to the same general procedure as previously described for the intermediate series 1.
  • Boc-Gly-Gly-OH was then attached in the presence of EDCI / HOBT.
  • the Fmoc protective group was detached from 72 mg (0.13 mmol) of this intermediate with piperidine in DMF. According to standard conditions with EDCI / HOBT, the deprotected product was coupled with benzyloxycarbonylglycylglycine to the target product in the presence of ethyldiisopropylamine. Yield: 82%
  • Educts 1.2.3, E.l.l; Variant A Special features: Instead of maleimidoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester, maleimidopropionic acid was linked with EDCI / HOBT.
  • maleimidoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester
  • maleimidoacetic acid N-hydroxysuccinimide ester was linked with EDCI / HOBT.
  • this affinity marker forms an affinity marker quadraplet which enables a parallel analysis of four protein samples.
  • the Fmoc group is then removed with 2 ml of 20% piperidine in DMF and the resin is washed four times with DMF and dioxane.
  • Ethyldiisopropylamine was added and after another 1 hour the mixture was washed three times with dioxane, DMF and DCM.
  • the Fmoc grape is then removed with 2 ml of 20% piperidine in DMF and the resin is washed four times with DMF. 1 ml of DMF is added, followed by 22 mg (0.12 mmol) of 4-maleimido-butyric acid, 15 mg (0.12 mmol) of diisopropylcarbodiimide and 16 mg (0.12 mmol) of HOBT, and the mixture is stirred at RT overnight. Then it is washed three times with DMF, DCM and THF.
  • Buffer 1 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA; 0.5% (w / v) SDS
  • Buffer 2 10 mM NH 4 acetate, pH 7
  • Buffer 3 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA
  • the affinity columns (Monomeric Avidin, Perbio Science GmbH, Bonn) with a column volume of 200 ⁇ l were freshly prepared before cleaning and prepared by the following washing steps:
  • the sample was eluted with the following steps:
  • the eluate was evaporated to dryness and only dissolved again shortly before the analysis with mass spectrometry.
  • LC-MS high pressure liquid chromatography
  • eluent A 0.025% (v / v) trifluoroacetic acid
  • eluent B 0.025% (v / v) trifluoroacetic acid / 84% (v / v) acetonitrile
  • the eluting peptides were automatically recognized by the device's acquisition software and fragmented for identification. The identity of the peptides could thus be clearly determined.
  • Sample 1 was also added human interleukin-4, which was not present in sample 2.
  • Buffer 3 filled up to 200 ⁇ l and halved in each case (samples la and lb or 2a and 2b).
  • the proteins were precipitated by adding four times the volume of ice-cold acetone / ethanol 1: 1 for 15 minutes at -20 ° C. The sediment was washed once with acetone ethanol / water 4: 4: 2 and then dried in vacuo. The sample was dissolved in 10 ⁇ l buffer 1 and diluted with 260 ⁇ l buffer 3. 40 ⁇ l of trypsin solution were added to cleave the proteins and the sample was incubated at 37 ° C. for 1 h. The sample was then briefly heated to 95 ° C. to inactivate the enzyme.
  • Buffer 1 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA; 0.5% (w / v)
  • SDS buffer 2 10 mM NH 4 acetate, pH 7
  • Buffer 3 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 5mM EDTA
  • Trypsin solution 1 mg / ml trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in buffer 3
  • an affinity purification was carried out using a self-made avidin column (Monomeric Avidin, Perbio Science GmbH, Bonn). The column was manufactured and used in accordance with the manufacturer's instructions. The peptides were eluted with 0.4% trifluoroacetic acid / 30% acetonitrile.
  • LCQdeka An ion trap mass spectrometer (LCQdeka, ThermoFinnigan, San Jose) was used to analyze the peptides. time chromatography is connected (LC-MS). A reversed-phase column (C 18 phase) was used as the separation column. The peptides were dissolved in eluent A (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid) and injected. They were eluted with a gradient of eluent B (0.025% (v / v) trifluoroacetic acid / 84% (v / v) acetonitrile). The eluting peptides were automatically recognized by the device's acquisition software and fragmented for identification. The identity of the peptides could thus be clearly determined.
  • Interleukin-4 peptides should be in the form of a doublet of signals with a
  • FIG. 4 shows the signals of the peptide NLWGLAGLNSCPVK from Interleukin-4. As expected, a doublet of signals with an intensity ratio of 1: 1 appears. In this way, the signal can be clearly distinguished from peptides that are unlabeled and that have been purified by non-specific adsorption on the affinity column. The identity of the peptide was confirmed by MS / MS experiments.
  • Fig. 2 The ion traces for the m / z values 647.3 Da, 648.9 Da, 650.9 Da and 652.9 Da. It is the triple-charged ion of the peptide LQGIVSWGSGCAQK in the forms reacted with Examples 38 to 41. The identity of the peptides was confirmed by MS / MS experiments.
  • Fig. 4 MS spectrum of the triple-charged ion of the peptide NLWGLAGLNSCPVK from Interleukin-4. Since it was only present in Sample 1, a doublet of signals occurs, corresponding to the peptide with 0 or 17 isotope marker orange.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und deren Verwendung.

Description

Isotopencodierte Affinitätsmarker 3
Die Erfindung betrifft neue, isotopencodierte Affinitätsmarker zur massenspektro- metrischen Analyse von Proteinen sowie deren Herstellung und deren Verwendung.
Die Proteomics-Technologie eröffnet die Möglichkeit, durch Analyse von biologischen Systemen auf der Proteinebene neue biologische Targets und Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass von den im Genom codierten Proteinen nur jeweils ein bestimmter Teil aller möglichen Proteine exprimiert wird, wobei beispielsweise Gewebetyp, Entwicklungsstand, Aktivierung von Rezeptoren oder zelluläre Interaktionen die Expressionsmuster und -raten beeinflussen. Um Unterschiede der Expression von Proteinen in gesundem oder krankem Gewebe festzustellen, können verschiedene vergleichende Methoden zur Analyse von Protein-Expressionsmustern herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. U. S. A., 2000, 97, 9390; (b) D. R. Goodlett et al., Proteome Protein Anal., 2000, 3; (c) S. P. Gygi et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11, 396).
Eine leistungsfähige Methode ist dabei die massenspektrometrische Detektion von Proteinen. Bei Verwendung von unterschiedlich isotopencodierten Affinitätsmarkern
(ICAT® = Isotope Coded Affinity Tags) und Tandem-Massenspektrometrie kann dieses Verfahren zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinmischungen herangezogen werden ((a) S. P. Gygi et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 994; (b)
R. H. Aebersold et al., WO 00/11208). Das Verfahren beruht darauf, dass jede von zwei oder mehr zu vergleichenden Proteinmischungen, die in verschiedenen
Zeilzuständen erhalten worden sind, mit einem Affinitätsmarker anderer
Isotopencodierung umgesetzt wird. Die Proteinmischungen werden danach kombiniert, gegebenenfalls fraktioniert oder proteolytisch behandelt und affinitätschromatographisch gereinigt. Nach Elution der gebundenen Fragmente werden die Eluate durch Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massen- spektrometrie (LC-MS) analysiert. Paare bzw. Gruppen von mit sich nur in der Isotopencodierung unterscheidenden Affinitätsmarkern markierten Peptiden sind chemisch identisch und werden in der HPLC nahezu zeitgleich eluiert, sie unterscheiden sich im Massenspektrometer jedoch um die jeweiligen Molekulargewichtsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Isotopenmuster der Affinitätsmarker. Relative Proteinkonzentrationen können direkt durch Messungen der Peakfiächen erhalten werden. Geeignete Affinitätsmarker sind Konjugate aus Affinitätsliganden, die über Brückenglieder kovalent mit proteinreaktiven Gruppen verknüpft sind. Dabei werden in die Brückenglieder unterschiedliche Isotope eingebaut. Das Verfahren wurde anhand von Affinitätsmarkern, in denen Wasserstoffatome durch Deuteriumatome ersetzt wurden ( H/ D-Isotopencodierung), beschrieben.
Die im Stand der Technik beschriebene Methode mit 1H/2D-isotopencodierten Affinitätsmarkern weist verschiedene Nachteile auf, insbesondere eine(n) Isotopeneffekt der unterschiedlich markierten, aber ansonsten identischen
Peptidfragmente im LC, nicht ausreichende Stabilität der Affinitätsmarker im allgemeinen und speziell im LC-MS/MS, mangelnde Effizienz der Avidin-Monomer- basierten Affinitätschromatographie, mangelnde Flexibilität beim Einbau der Isotopenmarkierungen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung verbesserter isotopencodierter Affinitätsmarker.
Gegenstand der Erfindung sind organische Verbindungen, geeignet als Affinitäts- marker zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affmitätsliganden-Rest oder für eine feste Phase, PRG für eine proteinreaktive Gruppe und
L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
wobei der Linker L eine Gruppe der Formel (!') enthält,
Figure imgf000004_0001
in der
der Aminosäure-Rest NH-CHRx-(CH2)x-CO mit der Aminosäure- Seitenkette Rx und der Zahl x aus dem Wertebereich von 0 bis 5 ist,
eine Brücke ist, die eine kovalente Verknüpfung zweier Piperazin-Reste ermöglicht oder erleichtert, oder im Falle von 1 > 2 gleiche oder verschiedene solche Brücken sind,
R und R' an einem Piperazin-Ring unabhängig voneinander und unabhängig von anderen R und R' an anderen Piperazin-Ringen der gleichen oder der anderen der beiden Laufvariablen 1 und m jeweils eine α- Aminosäure- Seitenkette ist,
Z' der Aminosäure-Rest CO-(CH2)y-CHRy-NH mit der Aminosäure- Seitenkette R und der Zahl y aus dem Wertebereich von 0 bis 5 ist, der sich von Z in der unterschiedlichen Orientierung bezüglich der terminalen CO- und NH-Gruppe unterscheidet, und k, 1, m, n unabhängig voneinander jeweils für eine Zahl von 0 bis 10 stehen, wobei die Summe k + 1 + m + n mindestens 1 und höchstens 40 beträgt,
oder deren Salze.
Die erfindungsgemäßen Affinitätsmarker weisen gegenüber dem Stand der Technik insbesondere folgende Vorteile auf:
Deuterium, 13C- oder 13C- und 15N-markierte Glycin-Bausteine oder andere entsprechend markierte Aminosäurebausteine sind wohlfeile Edukte, die einen flexiblen Aufbau der isotopenmarkierten Affinitätsmarker ermöglichen. In den in der
Formel (I) beschriebenen Affinitätsmarker können in einfacher Weise mehr als zwanzig 13C-Markierungen und zusätzlich bis zu zehn 15N Isotope eingeführt werden. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Affinitätsmarkern mit einer deutlich kleineren Massendifferenz (ΔM=8) ist so auch die parallele Analyse mehrerer Proteom-Proben durch jeweilige Modifizierung mit Affinitätsmarkern mit verschiedenen Massendifferenzen möglich. Bevorzugt ist die Ausführung mit bis zu
4 unterschiedlich markierten Affinitätsmarkern, die die gleichzeitige Analyse und relative Quantifizierung von bis zu 4 komplexen Proteom-Proben ermöglicht.
Der modulare Aufbau der Affinitätsmarker ermöglicht eine flexible, den Erfordernissen des Arbeitsablaufs angepasste Kombination der einzelnen Bausteine.
Die beschriebenen Affinitätsmarker lassen sich mit einer säurelabilen Sollbruchstelle ausrüsten, die eine Dekomplexierung der Peptidfragmente durch eine wesentlich effizientere, beispielsweise auf Streptavidin oder oligomerem Avidin basierende Affinitätschromatographie für die Biotin-modifizierten Peptidfragmete oder durch eine reversible Anbindung an eine feste Phase ermöglicht. Weiterhin haben die nach Säurespaltung an den Peptidfragmenten verbleibenden Tags haben ein niedriges Molekulargewicht und eine hohe Isotopendichte. Die Handhabung der Affinitätsmarker wird durch verbesserte Löslichkeit, durch eine kristalline oder amorphe Erscheinungsart sowie durch erhöhte Stabilität verbessert.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter erfindungsgemäßer Verbindungen als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, insbesondere zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben und zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Kit zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, enthaltend als Reagenzien eine oder mehrere unterschiedlich isotopenmarkierte erfindungsgemäße Verbindungen.
Ein Affinitätsligand A dient zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe der
Affinitätschromatographie. Die Affinitätssäulen sind mit den entsprechenden komplementären Partnern zu den Affinitätsliganden versehen, welche kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit den Affinitätsliganden eingehen. Ein Beispiel für einen geeigneten Affinitätsliganden ist Biotin oder ein Biotin-Derivat, das mit den komplementären Peptiden Avidin oder Streptavidin starke, nicht kovalente
Bindungen eingeht. Auf diese Weise können zu untersuchende Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie selektiv aus Probenmischungen isoliert werden. Im gleichen Sinn können beispielsweise auch Kohlenhydrat-Reste, die nicht kovalente Wechselwirkungen mit beispielsweise fixierten Lektinen eingehen können, als Affinitätsligand verwendet werden. Weiterhin kann im gleichen Sinn die
Wechselwirkung von Haptenen mit Antikörpern oder die Interaktion von Übergangsmetallen mit entsprechenden Liganden als Komplexbildner genutzt werden oder andere Systeme die miteinander in Wechselwirkung treten.
Alternativ kann die gezielte Abreicherung auch durch selektive, reversible
Anbindung an eine entsprechend funktionalisierte feste Phase A erreicht werden. Geeignete feste Phasen sind beispielsweise Ainino-funktionalisierte Harze auf Kieselgel-Basis und weiterhin von den als Festphasen-Synthesen durchgeführten Peptid-Synthesen her bekannt, wie etwa Tritylharz, auf Benzylalkohol-Trägerung basierendes Sasrin-Harz, auf Benzylalkohol-Trägerung basierendes Wang-Harz, Wang-Polystyrol-Harz, Rink-Amid-MBHA-Harz oder TCP (Tritylchlorid- Polystyrol)-Harz (in den abgebildeten Formeln steht das eingekreiste P jeweils für den Rest des Harzes):
Figure imgf000007_0001
Bevorzugt ist als feste Phase A ein polymerer Träger, insbesondere ein modifiziertes natürliches oder synthetisches Harz, beispielsweise ein Harz auf Kieselgel- oder Polyethylenglykol-Basis, mit zur Anbindung des Linker L geeigneten funktioneilen Gruppen, beispielsweise Hydroxy-, Carboxy- und Aminogruppen, insbesondere Aminogruppen. Besonders bevorzugt ist als feste Phase A ein Amino- funktionalisiertes Harz auf Kieselgel-Basis, beispielsweise ein Aminopropyl- Kieselgel, wie es z. B. von der Fa. Aldrich unter der Nummer 36425-8 vertrieben wird.
Proteinreaktive Gruppen PRG dienen der gezielten Markierung der Proteine an ausgewählten funktionellen Gruppen. PRGs haben eine spezifische Reaktivität für endständige funktionelle Gruppen der Proteine. Aminosäuren als Elemente von Proteinen, die häufig für gezielte Markierungen verwendet werden, sind beispielsweise Mercaptoaminomonocarbonsäuren wie Cystein, Diaminomono- carbonsäuren wie Lysin oder Arginin oder Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Weiterhin können proteinreaktive Gruppen auch phosphatreaktive Gruppen wie beispielsweise Metallchelate sowie aldehydreaktive und ketonreaktive Gruppen wie beispielsweise Semicarbazone oder auch Amine mit nachfolgender Behandlung durch Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid sein. Ebenso können es Gruppen sein, die nach einer gezielten Proteinderivatisierung wie beispielsweise einer Bromcyanspaltung oder einer Elimination von Phosphatgruppen etc. mit den Umsetzungsprodukten reagieren.
Z und Z' sind Reste gleicher oder verschiedener Aminosäuren. Bevorzugt sind Reste von L-α- Aminosäuren, insbesondere der 20 natürlichen proteinogenen Aminosäuren (x = 0 bzw. y = 0), beispielsweise Glycin-Reste, und Reste von ω- Aminosäuren, wie bespielsweise NH-(CH2)2-CO und CO-(CH2)2-NH. Die Aminosäuren können dabei gegebenenfalls in der D-, L- oder racemischen Form vorliegen.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I) weisen im Linker L als Gruppe der Formel (T) eine Gruppe der Formel (I") auf (alle R und R' in Formel (V) sind Wasserstoff):
Figure imgf000008_0001
Ebenfalls bevorzugte erfmdungsgemäße Verbindungen der Formel (I) weisen im
Linker L eine Gruppe der Formel (T), insbesondere eine Gruppe der Formel (I") auf, in der Z der Glycin-Rest NH-CH2-CO oder Z' der Glycin-Rest CO-CH2-NH ist, insbesondere in der Z der Glycin-Rest NH-CH2-CO und Z' der Glycin-Rest CO-CH2-
NH ist. In einer weiteren Ausführungsform sind Linker L bevorzugt, die eine Sollbruchstelle S wie z. B. eine säurelabile Funktionalität besitzen, die unter bestimmten Bedingungen beispielsweise unter Säureeinwirkung eine Spaltung des Affinitätsmarkers gewährleisten, um so z. B. die Freisetzung von der Affinitätssäule zu erleichtern, oder den am Peptid verbleibenden Rest zu verkleinern oder die Arbeitsabläufe insgesamt effizienter zu gestalten. Anstelle einer säurelabilen Sollbruchstelle kann die Spaltung der Linker L auch auf andere Art und Weise herbeigeführt werden, beispielsweise durch chemische Spaltung von u.a. Silylethern, Estern, Carbamaten, Thioestern, Acetalen, Disulfiden oder Schiffschen Basen, weiterhin durch photochemische Spaltung, oder durch enzymatische Spaltung von Estern, Amiden, Nucleotiden oder Glycosiden oder durch thermische Spaltung beispielsweise von interagierendenNukleinsäuresträngen.
Zur Verbesserung der Löslichkeit der erfindungsgemäßen Affinitätsmarker können vorhandene saure und/oder basische funktionelle Gruppen in Form ihrer Salze, bevorzugt ihrer Hydrochloride, Acetate, Trifluoracetate, Alkalimetall-Salze oder Ammonium-Salze, hergestellt und eingesetzt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist die proteinreaktive Gruppe PRG löslichkeitsverbessernde funktionelle Gruppen auf.
Bevorzugte erfmdungsgemäße Verbindungen sind solche der Formel (I), insbesondere der Formel (II),
Figure imgf000009_0001
bei denen eine oder melirere der Gruppen A, PRG, S, Z, L', Z' und k, 1, m, n, insbesondere alle diese Gruppen, gemäß den nachfolgenden Definitionen ausgewählt sind:
A steht für den Acylrest eines Affinitätsliganden, beispielsweise Biotinyl oder ein Biotin-Derivat, oder für eine mit einem polymeren Träger verbundene funktionelle Gruppe, beispielsweise eine trägergebundene Hydroxy-, Carboxy- oder Aminogruppe, insbesondere eine trägergebundene Amino- gruppe.
PRG steht für den Rest einer proteinreaktiven Gruppe, die charakterisiert ist durch eine elektrophile Gruppe und eine geeignete Brücke, die die Anbindung der elektrophilen Gruppe an Z' ermöglicht oder erleichtert. Weiterhin kann eine solche Gruppe durch entsprechende Ausführung beispielsweise auch die Löslichkeit verbessern. Eine bevorzugte proteinreaktive Gruppe ist ein Epoxid, eine Maleinimidogruppe, ein Halogen oder ein Acrylrest, insbesondere verbrückte Elektrophile wie
Figure imgf000010_0001
-CO-[CH2]r-Cl mit r = 1-10, -CO-CH=CH2.
Weiterhin kann PRG eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe sein, wie sie z. B. von W.H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammen- gefasst wurden.
S steht für eine säurelabile Sollbruchstelle, wie beispielsweise
Figure imgf000011_0001
mit Y als Abstandshalter mit bevorzugt 1-10, insbesondere 1-5, Nicht- Wasserstoff-Atomen, der die Anbindung des Arylrestes an den Affinitätsliganden oder an den polymeren Träger ermöglicht oder erleichtert, besonders bevorzugt NH, NH-CH2, NH-CH2-CH2-NH-CO, CH2-CO, wobei Y ortho-, meta- und para-ständig zu NH stehen kann und die para-Stellung bevorzugt ist,
und mit SK als Seitenketten-Rest einer α-Aminosäure der Formel SK-CH(NH2)-COOH, die für andere SK als ein H-Atom in der D-, L- oder racemischen Form vorliegen kann, beispielsweise die Seitenketten der 20 natürlichen Aminosäuren sowie deren D-Formen und Racemate.
Z ist der Rest einer Aminosäure, insbesondere der Rest von
Glycin, der nicht markiert oder 13C- oder 15N-Markierungen, oder eine Kombination dieser Markierungen enthalten kann.
L' ist eine Brücke, die eine kovalente Verknüpfung zweier
Piperazin-Reste ermöglicht oder erleichtert. L' ist vorzugsweise aus den Bausteinen Alkylen, insbesondere (CH2)S, Alkenylen, Alkinylen, Axylen, CO, CS und NH aufgebaut, insbesondere aus einer Anzahl von 2 bis 10 solcher Bausteine. V kann weitere Aminosäure-Reste wie Z und Z', insbesondere Glycin-Reste, enthalten, die gegebenenfalls 13C- oder 15N-Isotopen- markierungen oder eine Kombination dieser Markierungen enthalten kömien, und ist bevorzugt eine Brücke ausgewählt aus
CO-CO, CO-(CH2)s-CO sowie CO-Arylen-CO, CO-CH2-NH- CO-NH-CH2-CO, CO-NH-CH2-CO, CO-CH2-NH-CO, CO- CH2-NH-CO-CO-NH-CH2-CO, CO-CH2-NH-CO-(CH2)s-CO- NH-CH2-CO, CO-CH2-NH-CO-Arylen-CO-NH-CH2-CO, (CH2)s-NH-CO-CO-NH-(CH2)s, (CH2)3-NH-CO-CO-NH-
(CH2)3, (CH2)s-CO, (CH2)2-CO, CO und CS ist, wobei s bevorzugt eine ganze Zahl zwischen 1 und 6, beispielsweise 2, 3, 4 oder 5.
und ' an einem Piperazin-Ring sind jeweils gleiche Aminosäure-
Seitenketten, insbesondere Wasserstoff, sind vorzugsweise an allen Piperazin-Ringen einer der beiden Laufvariablen 1 und m gleiche Aminosäure-Seitenketten, insbesondere Wasserstoff, und sind besonders bevorzugt an allen Piperazin-Ringen gleiche Aminosäure-Seitenketten, insbesondere Wasserstoff.
Z' ist der Rest einer Aminosäure, insbesondere der Rest von
Glycin, der sich von Z in der unterschiedlichen Orientierung bezüglich der terminalen CO- und NH-Gruppe unterscheidet; er kann nicht markiert sein oder 13C-, oder 15N-Markierungen, oder eine Kombination dieser Markierungen enthalten.
k, 1, m, n können unabhängig voneinander jeweils für Zahlen zwischen 0 und 10 stehen, wobei die Summe von k + 1 + m + n bevorzugt größer als 0 und kleiner als 20 ist und besonders bevorzugt kleiner als 10 ist. Vorzugsweise steht m für die Zahl 0 oder 1. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben Alkyl, Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Alkoxy und Arylen, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkylen, Alkenylen, Alkinylen und Alkoxy stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n- Hexyl.
Alkylen, Alkenylen und Alkinylen stehen für bivalente Alkylgruppen, die im Falle von Alkenylen bzw. Alkinylen eine, zwei, drei, vier, fünf oder mehr Doppel- bzw. Dreifachbindungen und dementsprechend mindestens 2 Kohlenstoffatome aufweisen, beispielsweise und vorzugsweise für Methylen, Ethylen, Ethenylen, Ethinylen, n-
Propylen, iso-Propylen, n-Propenylen, Methylethenylen und Propinylen.
Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Arylen steht für einen bivalenten mono- bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 14 Kohlenstoffatomen; beispielhaft und vorzugsweise für Phenylen, Naphthylen und Phenanthrenylen.
Eine gegebenenfalls in einer Aminosäure-Seitenkette R, R', Rx, Ry oder SK vorliegende Drittfunktion von Aminosäuren kann optional frei oder mit einer Schutzgruppe geschützt vorliegen. In einer besonderen Ausführungsform tragen die Seitenketten, insbesondere SK, zur verbesserten Löslichkeit der Affinitätsmarker bei.
Die nicht-isotopenmarkierten Verbindungen stellen bereits eine Isotopencodierung dar. Zur weiteren Isotopencodierung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise mit mindestens einem Kohlenstoff-Atom des Isotops 13C, insbesondere vier bis 20 13C-Atomen, isotopenmarkiert. Der mit 1H/2D-isotopencodierten Affinitätsmarkern beobachtete nachteilige Isotopeneffekt in der LC ist bei 12C/13C- Isotopencodierung deutlich verringert oder sogar gar nicht ausgeprägt. Alternativ oder zusätzlich können zur Markierung auch die Isotope D, N, O, O und/oder
34 S eingesetzt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden C-markierte Verbindungen zusätzlich mit mindestens einem Stickstoff-Atom des Isotops 15N, vorzugsweise ein bis zehn 15N-Atomen, insbesondere ein bis drei 15N-Atomen, isotopenmarkiert.
Die Isotopenmarkierungen werden üblicherweise in L und/oder PRG vorgenommen, vorzugsweise in L und dort insbesondere in den Gruppen Z, L', Z' und/oder in den Piperazin-B austeinen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise hergestellt werden, indem zunächst ein mit geeigneten orthogonalen Schutzgruppen SG und SG' geschütztes Intermediat der Formel (III),
SG-(Z)k (ZVSG' (in)
Figure imgf000014_0001
beispielsweise mit der Boc- und der Fmoc-Gruppe gemäß Formel (IQ'),
(IIP)
Figure imgf000014_0002
hergestellt wird. Die Synthese dieser Intermediate verläuft nach klassischen Methoden der Peptidchemie wie sie dem Fachmann bekannt sind, und wie sie beispielsweise in Houben-Weyl; Methoden der Organischen Chemie; Vierte Auflage; Band XV Teil 1 und 2; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, oder in Hans- Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie,
Weinheim 1982 beschrieben wurden.
Aus diesen Intermediaten wird erneut nach Standardreaktionen zunächst die Schutzgruppe SG abgelöst und anschließend gegebenenfalls ein weiteres Aminosäurederivat, das eine zu der abgelösten gleiche oder verschiedene Schutzgruppe SG, insbesondere eine Boc-Gruppe, an der -Aminofunktion trägt, angeknüpft, wobei Derivate der Formel (IV) erhalten werden. Gegebenenfalls in SK vorliegende Drittfunktionen können optional geschützt oder frei vorliegen. Optional vorhandene Schutzgruppen können permanent erhalten bleiben oder in separaten Deblockierungsschritten oder gleichzeitig mit der Abspaltung einer der terminalen
Schutzgruppen abgelöst werden.
(IV)
SG-NH-CH(SK)-CO-(Z)k
Figure imgf000015_0001
Anschließend kann aus (IN) die Schutzgruppe SG', beispielsweise eine Fmoc-Gruppe mit Piperidin in DMF, abgelöst werden, so dass im nächsten Schritt die Kupplung mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe der Formel
U-PRG (V)
mit U einer Gruppe, die die Verknüpfung von PRG mit Z' oder gegebenenfalls mit einer anderen Endgruppe von L ermöglicht, indem sie zum Beispiel zu einer Abgangsgruppe wird, erfolgen kann. Beispiele für solche Gruppen sind aktivierte Ester wie z. B. N-Hydroxysuccinimid-ester oder Chloride oder Gruppen, aus denen während der Kupplung eine Abgangsgruppe generiert werden kann.
hi einem weiteren Schritt wird dann die terminale Schutzgruppe SG abgelöst, wobei ein Konjugat der Formel (VI) erhalten wird.
H2N-CH(SK)-CO-(Z)k (Z')n-PRG (VI)
Figure imgf000016_0001
Parallel dazu wird ein Affinitätsligand A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form desselben wie beispielsweise ein aktivierter Ester, ein Säurechlorid oder ähnliches, oder eine Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-funktionalisierte feste Phase A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form davon unter geeigneten Kupplungsbedingungen mit einer Verbindung
Figure imgf000016_0002
die optional auch eine Schutzgruppe tragen kann, zum Derivat
Figure imgf000016_0003
umgesetzt. Das Derivat (VIII) wird dann ggf. nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe mit aktivierten Kohlensäurederivaten wie Thiophosgen oder Thiocarbonylbisimidazol in ein entsprechendes Isothiocyanat überfuhrt und anschließend mit (VI) zum Thioharnstoff (IX) gekuppelt. NH-CH(SK)-CO-(Z)k (Z')π-PRG (IX)
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Beispielsweise kann die Aminofunktion an Harzen zunächst mit Fmoc-geschützter p-Aminobenzoesäure oder mit Fmoc-geschützter p-Amino-phenylessigsäure umgesetzt werden, anschließend die Fmoc-Gruppe abgelöst und mit einem aktivierten Kohlensäurederivat in das Isothiocyanat überführt und zum Thiohamstoff umgesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem
i) ein geschütztes Intermediat der Formel (III),
Figure imgf000017_0003
in der SG und SG' für zwei orthogonale Schutzgruppen stehen,
hergestellt wird,
ii) aus dem intermediat der Formel (in) zunächst die Schutzgruppe SG abgelöst wird und anschließend ein weiteres Aminosäurederivat, das eine zu der abgelösten gleiche oder verschiedene Schutzgruppe SG an der α- Aminofunktion trägt, angeknüpft wird, wobei ein Derivat der Formel (IV), SG-NH-CH(SK)-CO-(Z)k (Z SG' (IV)
Figure imgf000018_0001
in der SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
erhalten werden,
iii) nach Ablösung der Schutzgruppe SG' aus dem Derivat der Formel (IV) mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Gruppe steht, die die Verknüpfung von PRG mit Z' oder gegebenenfalls mit einer anderen Endgruppe von L ermöglicht,
umgesetzt wird,
iv) die terminale Schutzgruppe SG abgelöst wird, wobei ein Konjugat der Formel (VI)
H2N-CH(SK)-CO-(Z)k (Z')n-PRG (VI)
Figure imgf000018_0002
erhalten wird, v) ein Affinitätsligand A-OH oder A-NH oder eine Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-funktionalisierte feste Phase A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form davon mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000019_0001
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergruppe steht,
die optional eine Schutzgruppe tragen kann, zum Derivat der Formel (VIII)
Figure imgf000019_0002
umgesetzt wird,
vi) das Derivat der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe in ein entsprechendes Isothiocyanat überfuhrt wird,
vii) das Isothiocyanat anschließend mit dem Konjugat der Formel (VI) zum Thiohamstoff der Formel (IX) gekuppelt wird und
Figure imgf000019_0003
vii) in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgruppen abgespalten werden, wobei die aufeinanderfolgenden Schritte v) und vi) zu einem beliebigen Zeitpunkt vor Schritt vii) durchgeführt werden können.
In allen Reaktionsschritten können reversibel abspaltbare Schutzgrappen, wie sei in der Peptidchemie üblich sind, eingesetzt werden. Eine Schutzgruppe SG kann erhalten bleiben, oder gleichzeitig mit der Boc-Schutzgruppe abgelöst oder in einem separaten Schritt abgelöst werden. Geeignete Schutzgruppen sind beispielsweise die mit Trifluoressigsäure spaltbare Boc-Schutzgruppe oder die mit Piperidin oder Morpholin spaltbare Fmoc-Schutzgruppe. Weitere geeignete Schutzgruppen und die entsprechenden Methoden zur Einführung und Abspaltung wurden z. B. beschrieben in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder im Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Vierte Auflage; Band 15.1 und 15.2, herausgegeben von E. Wünsch.
Optional können die Affinitätsmarker auch in umgekehrter Reihenfolge aufgebaut werden, wobei zunächst aus Derivaten der Formel (IV) die Boc-Schutzgruppe abgelöst wird. Die deblockierten Verbindungen werden dann mit entsprechend aus (Vffl) generierten Isothiocyanaten umgesetzt zu Verbindungen der Formel
Nach Ablösung der Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin wird im letzten Schritt die Kupplung mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe
U-PRG (V)
vorgenommen und so ebenfalls Verbindungen der Formel (IX) erhalten. Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem
i) ein geschütztes Intermediat der Formel (III),
SG-(Z)k (Z')n-SG' (III)
Figure imgf000021_0001
in der SG und SG' für zwei orthogonale Schutzgrappen stehen,
hergestellt wird,
ii) aus dem Intermediat der Formel (III) zunächst die Schutzgruppe SG abgelöst wird und anschließend ein weiteres Aminosäurederivat, das eine zu der abgelösten gleiche oder verschiedene Schutzgrappe SG an der -Amino- funktion trägt, angeknüpft wird, wobei ein Derivat der Formel (IV),
SG-NH-CH(SK)-CO-(Z)k (Z')n-SG' (IV)
Figure imgf000021_0002
in der SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
erhalten werden,
iii) die terminale Schutzgrappe SG abgelöst wird, wobei ein Konjugat der Formel (VT) (VI')
H2N-CH(SK)-CO-(Z)k
Figure imgf000022_0001
erhalten wird,
iv) ein Affinitätsligand A-OH oder A-NH2 oder eine Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-funktionalisierte feste Phase A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form davon mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000022_0002
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergrappe steht,
die optional eine Schutzgrappe tragen kann, zum Derivat der Formel (VQI)
Figure imgf000022_0003
umgesetzt wird,
v) das Derivat der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgrappe in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt wird,
vi) das Isothiocyanat anschließend mit dem Konjugat der Formel (VT) zum Thiohamstoff der Formel (X') gekuppelt wird und
Figure imgf000023_0001
vii) nach Ablösung der Schutzgrappe SG' aus dem Thiohamstoff der Formel (X') mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Gruppe steht, die die Verknüpfung von PRG mit Z' oder gegebenenfalls mit einer anderen Endgruppe von L ermöglicht,
umgesetzt wird und
viii) in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutz- grappen abgespalten werden,
wobei die aufeinanderfolgenden Schritte iv) und v) zu einem beliebigen Zeitpunkt vor Schritt vi) durchgefül rt werden können.
Die Reaktionen können bei verschiedenen Drack- und Temperaturverhältnissen durchgeführt werden, beispielsweise bei 0,5 bis 2 bar und vorzugsweise unter Normaldrack, bzw. -30 bis +100 °C und vorzugsweise -10 bis + 80 °C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind
Reaktion in DMF, Dichlormethan, THF, Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur oder unter Eiskühlung und Normaldrack bevorzugt. Somit können die beschriebenen Typen von Affinitätsmarkern auf verschiedenen Wegen sowohl linear als auch durch Kupplung bereits vorgefertigter Blöcke hergestellt werden. Das modulare Aufbauprinzip ermöglicht eine Vielzahl von denkbaren Kombinationen und damit bei geeigneter Auswahl von isotopenmarkierten Modulen eine beliebige Festlegung von Art, Zahl und Plazierung der Isotopenmarkierungen. In Molekülen gleicher Bauart lassen sich nur unter Einbezug von C- und N-Isotopen beliebig viele, vorzugsweise bis zu 30 Isotopenmarkierangen, realisieren. Damit wird der Weg zur Simultananalyse von mehreren, bevorzugt bis zu 4 komplexen Proteomproben eröffnet.
Beispiele
Es wurden 42 Affinitätsmarker der Formel (II), in der A der Acyl-Rest von Biotin ist, und ein Affinitätsmarker der Formel (II), in der A ein mit Aminograppen fünktionalisierter polymerer Träger ist, (Beispiel 42) hergestellt und sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. Z und Z' stehen dabei, soweit vorhanden, mit Ausnahme von Z in Beispiel 26 und Z' in Beispiel 43 für den jeweiligen Glycin- Rest, so dass jeweils nur der Wert von k bzw. n angegeben sowie für (Z in Beispiel
1
26 die Gruppe Z und für (Z')n in Beispiel 43 die Gruppe Z angegeben und definiert ist.
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0001
Verwendete Abkürzungen:
Ausb. - Ausbeute
Boc - tert-Butoxycarbonyl
DIEA - Diisopropylethylamin (Hünig's base)
DMAP - Dimethylaminopyridin
DMF - Dimethylformarnid DMSO - Dimethylsulfoxid
EI - Elektronenstoß-Ionisation
ESI - Elektrospray-Ionisation
Fmoc - Fluorenyl-9-methoxycarbonyl
HPLC - High-performance liquid chromatography MALDI - Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation
MS - Massenspektroskopie
MTBE - Methyl tert-butyl ether quant. - quantitative (d. h. vollständige) Umsetzung
RP - Reverse phase RT - Raumtemperatur
TCEP - Triscarboxyethylphosphin TFA - Trifluoressigsäure
THF - Tetrahydrofuran
TLC - Thin layer chromatography
(v/v) - Konzentrationsangabe in Volumen pro Volumen (w/v) - Konzentrationsangabe in Masse pro Volumen
Die Angabe der Zusammensetzung von Lösungsmittel- und Elutionsmittelgemischen erfolgt, soweit nicht ausdrücklich anders angegeben, durch jeweils von "/" getrennte Angabe der Komponenten und nachgestellt der relativen Volumenteile. So bedeutet z. B. "Acetonitril/Wasser 10/1" ein Gemisch von Acetonitril und Wasser im
Volumenverhältnis von 10 zu 1.
Bevorzugt verwendete Elutionsmittel (Bezugnahme durch Angabe von l' etc.):
1} Acetonitril/Wasser 10/1
2) Acetonitril/Wasser 20/1
3) Dichloπnethan/Methanol 97,5/2,5
4) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/1/0,1
5) Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2 6) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5
7) Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/2/0,2
8) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/5/3
9) Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5
Zur nachfolgend beschriebenen Herstellung der beispielhaften Affinitätsmarker wurden zunächst die Biotin-Derivate der Edukt-Serie 1 und die Piperazin-Derivaten der Edukt-Serie 2 hergestellt. Anschließend wurden die Piperazin-Derivate in die Zwischenprodukte der Intermediat-Serien 1 bis 3 überführt. Diese Intermediate wurden schließlich mit den Biotin-Derivaten zu den entsprechenden Affinitäts- markern umgesetzt. Edukt-Serie 1: Biotin-Derivate
E.l.l
Figure imgf000029_0001
1 g (4,09 mmol) Biotin, 500 mg (4,09 mmol) 4-Aminobenzylamin sowie 830 mg (6,14 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol, 942 mg (4,91 mmol) N-(3-Dimethyl- aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und 1587 mg Ethyl-diisopropyl- amin wurden in 40 ml DMF zusammengegeben. Es wurde über Nacht bei
Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand aufgereinigt durch Flash- Chromatographie an Kieselgel (Elutionsgemisch: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrührt und abgesaugt. Es wurden 1097 mg (77 %) des Zwischenproduktes erhalten
[TLC: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5: Rf = 0,58] [ESI- MS: m/e = 349 (M+H)+].
600 mg (1,72 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 40 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 298 mg (2,58 mmol) Thiophosgen und 890 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt E.l.l wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.
Ausbeute: 616 mg (92 %) [TLC: Rf = 0,56 5)] [ESI-MS: m/e = 391 (M+H)+]. E.1.2
Figure imgf000030_0001
Mono-Fmoc-geschütztes p-Phenylen-diamin wurde nach Standard-Methoden, wie sie z. B. in Houben-Weyl; Methoden der Organischen Chemie; Vierte Auflage; Band XV Teil 1 und 2; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, oder in Hans-Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie, Weinheim 1982 beschrieben sind, hergestellt.
200 mg (0,82 mmol) Biotin wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 974 mg (8,2 mmol) Thionylchlorid versetzt. Nach 1 h Rühren wurde eingeengt und zweimal mit Dichlormethan nachdestilliert.
Das entstandene Säurechlorid (0,81 mmol) wurde in 30 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 387 mg (4,9 mmol) Pyridin sowie mit 242 mg (0,55 mmol) von Mono-Fmoc-geschütztem p-Phenylen-diamin versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt und das ausgefallene Produkt abfiltriert. Erhalten wurden 300 mg (99 %) des Intermediats, das ohne weitere Aufreinigung in den nächsten Reaktionsschritt eingesetzt wurde [TLC: Rf = 0,5 1)].
Das Rohprodukt wurde in 5 ml DMF aufgenommen und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch 7)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der
Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 69 mg (39 %) des entschützten Intermediats. 65 mg (0,19 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 10 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 33 mg (0,29 mmol) Thiophosgen und 100 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt E.1.2 wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.
Ausbeute: 65 mg (89 %) [TLC: Rf = 0,43 1}] [ESI-MS: m/e = 377 (M+H)+].
E.1.3
Figure imgf000031_0001
500 mg (3,65 mmol) 4-Amino-benzoesäure wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 872 mg (2,73 mmol) vom Hydrochlorid des Mono-Fmoc-geschützten Ethylendiamms sowie mit 739 mg (5,47 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und mit 839 mg (4,38 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand in 200 ml Dichlormethan aufgenommen. Es wurde dreimal mit 200 ml Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 639 mg (59 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,68 2)]
400 mg (1 mmol) des Intermediats wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt
(Elutionsgemisch: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 147 mg (82 %) des entschützten Intermediats [TLC: Rf = 0,18 5)].
191 mg (0,78 mmol) Biotin wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 158 mg
(1,17 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und 180 mg (0,94 mmol) N-(3-Dimethyl- aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 10 min bei RT gerührt und dann 303 mg Ethyl-diisopropylamin sowie 140 mg (0,78 mmol) des entschützten Intermediats zugesetzt. Dann wurde nochmals 6 h bei RT gerührt, eingeengt und das Rohprodukt aus Dichlormethan mit Diethylether ausgefallt. Der
Rückstand wurde abgetrennt und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Es wurden 222 mg (70 %) des Zwischenproduktes erhalten [TLC: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak
(17 %) 15/4/0,5: Rf= 0,47].
200 mg (0,54 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 15 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 94 mg (0,81 mmol) Thiophosgen und 210 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das
Zielprodukt wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.
Ausbeute: 230 mg (95 %) [TLC: Rf = 0,44 5)] [ESI-MS: m/e = 448 (M+H)+].
Edukt-Serie 2: Piperazin-Derivate
E.2.1
Figure imgf000033_0001
3,85 g (13 mmol) Fmoc-Glycin, sowie 2,19 g (16,2 mmol) 1 -Hydroxy- 1H- benzotriazol und 2,48 g (13 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 80 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 2,01 g (10,8 mmol) Boc-Piperazin gelöst in 40 ml DMF zugetropft und weiterhin 2,8 g Ethyl-diisopropylamin hinzugefügt. Es wurde über 2h bei RT gerülirt und eingeengt. Man nahm den Rückstand in Dichlormethan auf und schüttelte zweimal mit Wasser. Die organische Phase wurde abgetrennt, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das
Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 3,91 g (78 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,58 2)].
3,9 g (8,4 mmol) dieses Intermediats wurden in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 25 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt, abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 4,8 g (93 %) des Zielproduktes E.2.1 [TLC: Rf = 0,31 5)]. E.2.2
Figure imgf000034_0001
0,53 g (3 mmol) Boc-Glycin sowie 0,51 g (3,75 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und 0,58 g (3 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 40 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 1 g Ethyl-diisopropylamin und dann langsam 1,2 g (2,5 mmol) des Produktes E.2.1 hinzugefügt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Natrium- hydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser 30/1). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 760 mg (58 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,6 2)].
760 mg (1,45 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 5 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt, abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 780 mg des Zielproduktes E.2.2
(quantitative Umsetzung) [TLC: Rf = 0,4 5)]. E.2.3
Figure imgf000035_0001
3,85 g (13 mmol) Fmoc-Glycin, sowie 2,19 g (16,2 mmol) 1 -Hydroxy- lH-benzo- triazol und 2,48 g (13 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 80 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 2,01 g (10,8 mmol) Boc-Piperazin gelöst in 40 ml DMF zugetropft und weiterhin 2,8 g Ethyl-diisopropylamin hinzugefügt. Es wurde über 2 h bei RT gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 3,91 g (78 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,58 2)].
730 mg (1,57 mmol) dieses Intermediats wurden in 5 ml DMF gelöst und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde eingeengt und durch Flash- Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 7)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der
Rückstand wurde mit Diethylether/Petrolether 1/1 verrührt, anschließend abfiltriert und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 222 mg (58 %) des Zielproduktes E.2.3 [TLC: Rf = 0,18 7)]. E.2.4: Piperazin-13C4
Figure imgf000036_0001
Die Aminogruppe von Glycin-13C2 wurde nach Standardbedingungen mit der t-Butoxycarbonyl(Boc)-Schutzgrappe geschützt.
Anschließend wurden 1,175 g (3,83 mmol) Boc-Glycin-13C2 in Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 2,5 g (7,67 mmol) Cäsiumcarbonat versetzt. Es wurde lyophilisiert, das Produkt in DMF aufgenommen und dann mit 2,72 g (19,17 mmol) Iodmethan versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt. Die organische Phase wurde nochmals mit Wasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Erhalten wurden 530 mg (72 %) des Methylesters.
525 mg (2,75 mmol) des Boc-geschützten Methylesters wurden dann an der Aminogruppe mit Trifluoressigsäure entschützt (Ausbeute: 506 mg; 90 %).
Das erhaltene Produkt (500 mg) wurde nach Standardbedingungen mit Boc-Glycin- 13C2 zum beidseitig geschützten, vier 13C-Atome enthaltenden Dipeptid-Konjugat umgesetzt (Ausbeute: 452 mg; 74 %).
Von diesem Zwischenprodukt wurde erneut mit TFA die Boc-Grappe abgelöst (quantitative Umsetzung).
475 mg (1,8 mmol) dieses N-terminal deblockierten, 13C-markierten Dipeptidmethyl- ester-Trifluoracetats wurden in 15 ml Methanol gelöst und mit 697 mg (5,4 mmol) Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 3 Tage bei RT gerührt, wobei sich das Diketopiperazin bildete und ausfiel. Es wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet (Ausbeute: 138 mg; 65 %).
130 mg (1,1 mmol) des 13C-markierten Diketopiperazins wurden unter Argon in 40 ml THF aufgenommen und mit 284 mg (3,3 mmol) THF-Boran-Komplex versetzt. Es wurde 12 h unter Rückfluß gerülirt und erneut 284 mg (3,3 mmol) THF- Boran-Komplex zugesetzt. Nach weiteren 16 h Rückfluß wurde abkühlen gelassen und mit 6 ml 10 %iger Salzsäure gequencht. Es wurde noch 30 min gekocht, dann abkühlen gelassen, eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan/Methanol nachdestilliert. Der Rückstand wurde dann mit Dichlormethan/Methanol 4:1 gewaschen und abfiltnert. Erhalten wurden 145 mg (81 %) des vierfach C- markierten Piperazins E.2.4 [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5: Rf = 0,23] [EI-MS: m/z = 90 (M)+ Radikal-Ion].
E.2.5: Piperazin-15N2-13C4
Figure imgf000037_0001
Dieser Baustein wurde analog zu E.2.4 hergestellt ausgehend von Glycin-13C2-15N.
Aus diesen 13C-markierten bzw. den 1 C- und 15N-markierten Intermediaten E.2.4 und E.2.5 wurden alle Zwischen- und Endprodukte der nachfolgenden Intermediat- Serien und Beispiele in gleicher Weise wie für die nicht-markierten 12C- und 14N- Analoga beschrieben hergestellt. E.2.6
Figure imgf000038_0001
7,459 g (24,36 mmol) Benzyloxycarbonyl-glycin-N-hydroxysuccinimidester wurden in 70 ml DMF mit 3 g (34,83 mmol) Piperazin und Ethyldiisopropylamin zusammengegeben und 2h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/2/0,2). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der
Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 4,04 g (60 %) der Zielverbindung [TLC: Rf = 0,26 5)].
E.2.7
Figure imgf000038_0002
In die Verbindung E.2.5 wurde nach Standardbedingungen mit 0,5 Äquivalenten Boc- Anhydrid die Boc-Schutzgruppe eingeführt. Ausbeute: 65 % [TLC: Rf = 0,225)]. E.2.8
Figure imgf000039_0001
In die Verbindung E.2.7 wurde zunächst nach Standardbedingungen mit Fmoc-Cl die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt und anschließend mit Trifluoressigsäure die Boc- Schutzgruppe abgelöst. [TLC: Rf = 0,32 5)].
E.2.9
Figure imgf000039_0002
Das zwei 15N und drei 13C-Labels tragende, geschützte Dipeptid wurde nach Standardbedingungen über 5 Stufen hergestellt: Zunächst wurde in [Bis-13C, 15N]- Glycin mit Benzyloxycarbonyl-chlorid in Dioxan/IN Natronlauge die Z-Schutz- gruppe eingeführt (Ausbeute: 47 %). Dieses Aminosäurederivat wurde mit [Bis-13C]- Glycin-methylester (Zwischenprodukt bei der Herstellung von E.2.4 ) gekuppelt (Ausbeute: 77 %) und im letzten Schritt mit 2N Lithiumhydroxid in Methanol der Methylester gespalten (Ausbeute: 75 %). [TLC: Rf = 0,25 4)] [ESI-MS: m/e = 272 (M+H)+]. E.2.10
Figure imgf000040_0001
Herstellung analog zu E.2.6 oder aus Fmoc-Pip.
[TLC: Rf = 0,35 5)].
Intermediat-Serie 1: Voϊlgeschützte Aminosäure-flankierte Piperazin-Derivate
Allgemeine Formel :
Figure imgf000040_0002
Allgemeine Vorschrift:
3 mmol eines Boc-geschützten Aminosäure-Derivats sowie 0,51 g (3,75 mmol) 1- Hydroxy-lH-benzotriazol und 0,58 g (3 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'- ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 40 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 1 g Ethyl-diisopropylamin hinzugefügt und dann 2,5 mmol der Produkte E.2.1 oder E.2.2 in 40 ml DMF gelöst, zugetropft.
Es wurde über Nacht bei RT gerührt und eingeengt. Man nahm den Rückstand in Dichlormethan auf und schüttelte zweimal mit Natriumhydrogencarbonatlösung aus. Die organische Phase wurde abgetrennt, eingeengt und der Rückstand entweder durch Fällung aus Dichlormethan mit Diethylether oder durch Flash- Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser 30/1). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden die vollgeschützten
Intermediate.
1.1.1 (R = H (Rest von Glycin))
Edukte: Boc-Glycin; E.2.1
Ausbeute: 58 % Rf = 0,45 1}
1.1.2 (R = Rest von D-Valin)
Edukte: Boc-D-Valin; E.2.1
Reinigung: Flash-Chromatographie; Eluent: Dichlormethan/Methanol 98/2 Ausbeute: 76 % Rf = 0,3 3)
Intermediat-Serie 2: Vollgeschützte Peptid-flankierte Piperazin-Derivate
Allgemeine Formel:
Die Produkte der Intermediat-Serie 2 wurden nach der gleichen allgemeinen Vorschrift wie zuvor für die Intermediat-Serie 1 beschrieben hergestellt.
1.2.1 (R = H (Rest von Glycin (Gly)))
Edukte: Boc-Glycin; E.2.2
Ausbeute: 86 % Rf = 0,55 1}
1.2.2 (R = Rest von Seitenketten-Boc-geschütztem Histidin (His))
Edukte: Bis-Boc-Histidin-N-hydroxysuccinimidester; E.2.2
Besonderheiten: Anstelle der EDCI/HOBT Aktivierang wurde hier sofort der
Hydroxy-succinimidester eingesetzt. Reinigung durch Fällung. Ausbeute: 85 % Rf = 0,47
1.2.3 (R = Rest von Seitenketten-tert-butylester-geschützter Asparaginsäure (A p))
Edukte: Boc-Asparaginsäure-γ-tert-butylester; E.2.2 Besonderheiten: Reinigung durch Fällung.
Ausbeute: 68 % Rf = 0,66 υ
1.2.4 (R = Rest von Valin (Val))
Edukte: Boc-Valin; E.2.2
Besonderheiten: Reinigung durch Fällung. Ausbeute: 79 % Rf = 0,64 4)
1.2.5 (R = Rest von Asparagin (Asn))
Edukte: Boc-Asparagin; E.2.2 Besonderheiten: Reinigung durch Flashchromatographie mit Elutionsmittel 2) Ausbeute: 66 % Rf = 0,47 1)
1.2.6 (R = Rest von Prolin (Pro))
Edukte: Boc-Prolin-N-hydroxysuccinimidester; E.2.2
Besonderheiten: Das aktivierte Aminosäurederivat wurde anstelle von EDCI/HOBT eingesetzt. Reinigung durch Flashchromatographie mit
Acetonitril/Wasser 15/1. Ausbeute: 98 % Rf = 0,55 5)
1.2.7 (R = Rest von D-Valin (D-Val))
Edukte: Boc-D-Valin; E.2.2 Besonderheiten: Reinigung durch Flashchromatographie mit Acetonitril/Wasser 30/1
Ausbeute: 80 % Rf = 0,64 )
1.2.8 (R = Rest von ß-Alanin)
Edukte: Boc-ß-Alanin; E.2.1
Besonderheiten: Zunächst wurde E.2.1 mit Boc-ß-Alanin umgesetzt, dann die Boc-
Grappe abgelöst, und schließlich Boc-Glycin angeknüpft. Ausbeute: 15 % über 3 Stufen Rf = 0,45 7)
1.2.9 (R = Rest von tert-Butylester-geschützter Glutaminsäure)
Edukte: Boc-Glutaminsäure-γ-tert-butylester; E.2.2
Ausbeute: 98 % Rf = 0,75 Intermediat-Serie 3: Oligo-Piperazin-Derivate
1.3.1
Figure imgf000044_0001
1438 mg (7,72 mmol) Boc-Piperazin wurden in 100 ml Dichlormethan gelöst und dann mit 500 mg (3,86 mmol) Oxalylchlorid und mit 625 μl Pyridin versetzt. Nach lh Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand zweimal mit Wasser verrührt. Der verbleibende Feststoff war ausreichend rein und wurde im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 1230 mg (75 %).
Nach Standardbedingungen wurden aus 1230 mg dieses Intermediats beide Boc- Schutzgrappen abgelöst (Ausbeute: 1330 mg; quantitative Umsetzung).
305 mg (1,31 mmol) Boc-Glycyc-glycin, sowie 242 mg (1,79 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol und 275 mg (1,43 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 25 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 543 mg (1,2 mmol) des beidseitig entschützten Intermediats gelöst in 5 ml DMF zugetropft und weiterhin 625 μl Ethyl- diisopropylamin hinzugefügt. Es wurde 1 h bei RT gerührt und dann eingeengt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 5)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 276 mg (53 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,32 5)]. 182 mg (0,61 mmol) Fmoc-Glycin, sowie 124 mg (0,92 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol und 141 mg (0,74 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbo- diimid Hydrochlorid wurden in 20 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 2270 mg (0,61 mmol) des oben beschriebenen
Zwischenproduktes und weiterhin 320 μl Ethyl-diisopropylamin hinzugefügt. Es wurde über 2h bei RT gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Wasser geschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde dann aus Dichlormethan/Methanol 1/1 mit Diethylether gefällt. Der
Niederschlag wurde abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 195 mg (44 %) des Zwischenproduktes 1.3.1 [TLC: Rf = 0,52 4)].
1.3.2
Figure imgf000045_0001
30 mg (0,123 mmol) des Edukts E.2.3 wurden in Dichlormethan gelöst und dann mit 25 mg (0,123 mmol) Chlorameisensäure-4-mtrophenylester versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT gab man 172 μl Diisopropylethylamin zu und nach weiteren 30 min 59 mg (0,123 mmol) des Eduktes E.2.1. Man ließ über Nacht bei RT stehen und engte danach ein. Der Rückstand wurde in 20 ml Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 2)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand in Dioxan/Wasser 1/1 aufgenommen und lyophilisiert. Erhalten wurden 55 mg (70 %) des Zwischenproduktes 1.3.2 [TLC: Rf = 0,52 °] [ESI-MS: m/e = 635 (M+H)+].
1.3.3
Figure imgf000046_0001
368 mg (0,63 mmol) des Intermediats 1.2.1 wurden in 5 ml DMF aufgenommen und mit 500μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 204 mg (90 %) des Ziel- produktes Boc-Gly-Gly-Pip-Gly [TLC: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak
(17 %) 15/4/0,5: Rf = 0,28].
70 mg (0,196 mmol) dieses Intermediats wurden in 18 ml Dichlormethan gelöst und dann mit 59 mg (0,294 mmol) Chlorameisensäure-4-nitrophenylester versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurden 273 μl Diisopropylethylamin und nach weiteren 2 h
105 mg (0,196 mmol) der Verbindung E.2.2 zugegeben. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Dabei fiel ein Feststoff aus, der abfiltriert wurde. Erhalten wurden 15 mg (10 %) des Zwischenproduktes 1.3.3 [TLC: Rf = 0,18 4)] [ESI-MS: m/e = 806 (M+H)+], 1.3.4
Figure imgf000047_0001
Aus der Verbindung 1.3.2 wurde zunächst nach bekannter Weise die Boc- Schutzgrupee abgelöst. Anschließend wurde Boc-Gly-Gly-OH in Gegenwart von
EDCI/HOBT angeknüpft. Erhalten wurden das Zielprodukt 1.3.4 in einer Ausbeute von 46 % über 2 Stufen.[TLC: Rf = 0,62 5)]
1.3.5
Figure imgf000047_0002
47 mg (0,193 mmol) des Edukts E.2.3 wurden in Dichlormethan gelöst und dann mit 39 mg (0,193 mmol) Chlorameisensäure-4-nitrophenylester versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurden 269 μl Diisopropylethylamin zugegeben und weitere 20 min bei RT gerührt.
Parallel dazu wurde aus der Verbindung 1.3.2 in bekannter Weise die Boc- Schutzgruppe abgelöst. 125 mg (0,193 mmol) des entschützten Produktes wurden dann zu obigem Ansatz hinzugefügt. Es wurde 4 h bei RT gerührt und anschließend mit 10 ml Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan/Methanol 1/1 mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und getrocknet. Erhalten wurden 124 mg (80 %) des Zwischenproduktes [TLC: Rf = 0,2 4)].
Aus diesem Intermediat wurde emeut in bekannter Weise die Boc-Schutzgrappe abgelöst. Anschließend wurde Boc-Gly-Gly-OH in Gegenwart von EDCI/HOBT angeknüpft. Erhalten wurden das Zielprodukt in einer Ausbeute von 35 % über 2 Stufen [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2: Rf = 0,42] [ESI-MS: m/e = 918 (M+H)+].
1.3.6
Figure imgf000048_0001
Ausgehend von 1.3.2 wurden folgende Umsetzungen nach Standardbedingungen durchgeführt: Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan (Ausbeute: 87 %), Umsetzung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (Ausbeute: 99 %). [TLC:
Rf = 0,6 1}].
1.3.7
Figure imgf000049_0001
1455 mg (11,46 mmol) Oxalylchlorid wurden in 2 ml Dichlormethan gelöst und dann mit 100 mg (0,24 mmol) Fmoc-Piperidin in 10 ml Dichlormethan versetzt. Nach lh wurde das Lösungsmittel in vacuo abdestilliert und der Rückstand mit Dichlormethan nachdestilliert.
Der Rückstand wurde dann emeut in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und zu einer Lösung aus 44 mg (0,24 mmol) Boc-Piperidin und 187 mg Pyridin in 10 ml
Dichlormethan gegeben. Nach 1 h Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel in vacuo abgetrennt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (Eluent: Dichlormethan/Methanol 97,5/2,5) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abdestilliert. Man erhielt 74 mg (57 %) des voll geschützten Zwischenproduktes [TLC: Acetonitril/Wasser 20/1 : Rf = 0,6] .
Aus 72 mg (0,13 mmol) dieses Zwischenproduktes wurde mit Piperidin in DMF die Fmoc-Schutzgruppe abgelöst. Nach Standardbedingungen mit EDCI/HOBT wurde das entschützte Produkt in Gegenwart von Ethyldiisopropylamin mit Benzyloxycarbonyl-glycyl-glycin zum Zielprodukt gekuppelt. Ausbeute: 82 %
[TLC: Rf = 0,5 4)]. 1.3.8
Figure imgf000050_0001
713 mg (2,93 mmol) N-3-Aminopropyl-N'-tert-butoxycarbonyl-piperazin und 2,3 g Ethyl-diisopropylamin wurden in 100 ml Dichlormethan vorgelegt und dann tropfenweise mit 225 mg (1,78 mmol) Oxalylchlorid versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT verdünnte man mit weiteren 100 ml Oxalylchlorid und schüttelte dreimal mit 5 %iger Natriumhydrogencarbonatlösung aus. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mit Diethylether digeriert und das Produkt abfiltriert. Die Mutterlauge wurde nochmals mit
Petrolether gefällt. Man erhielt 515 mg (54 %) des voll geschützten Intermediats [TLC: Rf = 0,3 6)].
Aus diesem wurde mit Trifluoressigsäure die Boc-Schutzgrupe abgelöst (quantitative Umsetzung). Nach Standardbedingungen mit EDCI/HOBT wurde anschließend das entschützte Produkt in Gegenwart von Ethyldiisopropylamin mit Boc-glycin zum Zielprodukt gekuppelt. Ausbeute: 42 % [TLC: Rf = 0,61 9)] [ESI-MS: m/e = 655 (M+H)+].
1.3.9
Figure imgf000050_0002
793 mg (1,38 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.3.7 wurden in 40 ml Methanol und 15 ml THF gelöst und über Palladium/ Aktivkohle (10 % Pd) hydriert. Nach 1 h wurde der Katalysator abgetrennt und das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde in Dioxan/Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 512 mg (84 %) der Zielverbindung [TLC: Rf = 0,17 5)].
1.3.10
Figure imgf000051_0001
49,9 mg (0,272 mmol) ω-Maleimidobuttersäure sowie 46 mg (0,34 mmol)
1-Hydroxy-lH-benzotriazol und 52 mg (0,272 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)- N'-ethylcarbodiirnid Hydrochlorid wurden in 20 ml DMF zusammengegeben und 90 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0,227 mmol) der Verbindung aus Beispiel 1.3.9 und weiterhin 120 μl Ethyl-diisopropylamin hinzugefügt. Es wurde über 6 h bei RT gerührt und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und dreimal mit Wasser geschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde dann aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 78 mg (Ausbeute: 57 %) des Zwischenproduktes.
Aus diesem wurde mit Trifluoressigsäure die Boc-Schutzgrappe abgelöst, um die Zielverbindung zu erhalten (quantitative Umsetzung) [TLC: Rf = 0,28 6)]. 1.3.11
Figure imgf000052_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.10 ausgehend von 1.3.9. Ausbeute: 72 % [TLC: Rf = 0,38 6)].
1.3.12
Figure imgf000052_0002
500 mg (1,94 mmol) N-2-Carboxyethyl-N'-tert.butoxycarbonyl-piperazin wurden mit 537 mg (1,94 mmol) Benzyloxycarbonyl-glycyl-piperazin (Verbindung E.2.6) nach Standardbedingungen mit EDCI/HOBT gekuppelt. Man erhielt 630 mg (Ausbeute: 63 %) des voll geschützten Intermediats [TLC: Rf = 0,4 5)].
400 mg des Intermediats wurden in 40 ml Methanol und über Palladium/Aktivkohle (10 % Pd) hydriert. Nach 3 h wurde der Katalysator abgetrennt und das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand getrocknet. Man erhielt 401 mg (Ausbeute: 95 %) [TLC: Rf = 0,2 6)].
Dieses Intermediat wurde wie in Beispiel 1.3.10 beschrieben mit ω-Maleimidobuttersäure mit Hilfe von EDCI/HOBT gekuppelt. Anschließend wurde mit Trifluoressigsäure die Boc-Gruppe abgelöst. Man erhielt die Zielverbindung in einer Ausbeute von 46 % über 2 Stufen [TLC: Rf = 0,21 8)].
1.3.13
Figure imgf000053_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.7 mit den Bausteinen: Fmoc-Piperidin Oxalylchlorid Boc-Piperidin
Verbindung aus Beispiel E.2.9.
Ausbeute: 52 % über 4 Stufen [TLC: Rf = 0,47)] [ESI-MS : m/e = 580 (M+H)+] .
1.3.14
Figure imgf000053_0002
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.7 mit den Bausteinen:
Fmoc-Piperidin Oxalylchlorid Verbindung aus Beispiel E.2.7
Verbindung aus Beispiel E.2.9.
Ausbeute: 38 % über 4 Stufen [TLC: Rf - 0,4 7)] [ESI-MS: m/e = 586 (M+H)+].
1.3.15
Figure imgf000054_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.7 mit den Bausteinen:
Verbindung aus Beispiel E.2.8
Oxalylchlorid
Verbindung aus Beispiel E.2.7 Verbindung aus Beispiel E.2.9.
Ausbeute: 41 % über 4 Stufen [TLC: Rf = 0,55 4)] [ESI-MS: m/e = 592 (M+H)+]. 1.3.16
Figure imgf000055_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.9 und 1.3.10 ausgehend von: Verbindung aus Beispiel 1.3.13
Ausbeute: 60 % über 3 Stufen [TLC: Rf= 0,16 5)]
1.3.17
Figure imgf000055_0002
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.9 und 1.3.10 ausgehend von: Verbindung aus Beispiel 1.3.14
Ausbeute: 66 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,16 5)] 1.3.18
Figure imgf000056_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu Beispiel 1.3.9 und 1.3.10 ausgehend von: Verbindung aus Beispiel 1.3.15
Ausbeute: 49 % über 3 Stufen [TLC: Rf = 0,16 5)]
Beispiele für säurespaltbare Affinitätsmarker
Beispiel 1; Herstellungsverfahren (Variante A)
Figure imgf000057_0001
368 mg (0,63 mmol) des Intermediats 1.2.1 wurden in 5 ml DMF aufgenommen und mit 500 μl Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel: Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %ig) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 204 mg (90 %) des Zielproduktes [TLC: DichlormethanMethanol/Ammoniak 17 %ig 15/4/0,5 Rf = 0,28].
26 mg (73 μmol) von diesem Zwischenprodukt wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 18,4 mg (73 μmol) Maleimidoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester sowie mit 19 mg Ethyldiisopropylamin versetzt und 1 h bei RT gerührt. Alternativ kann ebenso Maleimidoessigsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT mit der Amin- komponente gekuppelt wurden. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 2)).
Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 34 mg (95 %) des gewünschten Produktes [TLC: Rf = 0,17 2)].
33 mg (67 μmol) dieses Intermediats wurden in 5 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Nach Filtration und Trocknung erhielt man 33 mg (97 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5 Rf = 0,22] [ESI-MS: m e = 395 (M+H)+].
32 mg (63 μmol) des entschützten Intermediats und 26 mg (70 μmol) des Isothiocyanats E.l.l aus der Edukt-Serie 1 wurden in 5 ml DMF gelöst, mit 37μl Ethyldiisopropylamin versetzt und dann 4 h bei RT gerührt. Man engte ein, verrührte den Rückstand mit Wasser und saugte ab. Der Rückstand wurde abgetrennt und dann dreimal mit Dichlormethan/Methanol 1:1 und noch zweimal mit Methanol im Ultraschallbad behandelt. Nach Trocknung wurden 19 mg (35 %>) der Zielverbindung erhalten [TLC: Rf = 0,5 5)] [ESI-MS: m/e = 785 (M+H)+].
Beispiel 2; Herstellungsverfahren (Variante B)
Figure imgf000058_0001
182 mg (0,31 mmol) der Verbindung 1.1.1 wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Nach Filtration und Trocknung erhielt man 175 mg (94 %) des gewünschten
Produkts als Trifluoressigsäuresalz [TLC: Rf = 0,2 5)].
170 mg (286 μmol) des entschützten Intermediats wurden in 10 ml DMF vorgelegt und mit 112 mg (286 μmol) des Isothiocyanats E.l.l aus der Edukt-Serie 1 sowie mit 150 μl Ethyldiisopropylamin versetzt und dann über Nacht bei RT gerührt. Es wurde eingeengt, der Rückstand mit 10 ml Wasser verrührt und abgesaugt. Der Rückstand wurde abgetrennt und dann mit Dichlormethan verrührt. Nach Filtration und Trocknung wurden 244 mg (98 %) der gewünschten Verbindung erhalten [TLC: Rf = 0,23 4)].
240 mg (0,276 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 500μl Piperidin versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan digeriert. Anschließend wurde abfiltriert und der Filterrückstand in einer Mischung aus 5 ml DMF und 10 ml Dichlormethan suspendiert. Nach Zugabe von 10 ml Diethylether fiel das Produkt vollständig aus und wurde abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 135 mg (76 %) des Zielproduktes [TLC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5 Rf = 0,2].
30 mg (46 μmol) von diesem Zwischenprodukt und 18 mg Ethyldiisopropylamin wurden zu einer Lösung aus 8 mg (46 μmol) Maleimidopropionsäure, 9,4 mg (70 μmol) HOBT, 11 mg (56 μmol) EDCI in 10 ml DMF, die zuvor 30 min vorreagiert hat, zugegeben und dann über Nacht bei RT gerülirt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand mit 5 ml Wasser verrührt. Der feste Rückstand wurde dann mit 5 ml Dichlormethan/Methanol 1 : 1 verrührt und anschließend mit 5 ml Diethylether versetzt. Das ausgefällte Produkt wurde im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 28 mg (76 %) [TLC: Rf = 0,4 5)] [ESI-MS: m/e = 799 (M+H)+].
Folgende Beispiele wurden in analoger Weise zu Beispiel 1 (Variante A) oder Beispiel 2 (Variante B) hergestellt. Die Variante ist nachfolgend jeweils angegeben.
Beispiel 3
Figure imgf000059_0001
Edukte: 1.2.2, E.l.l; Variante A Ausbeute: 33 % über 4 Stufen, anschließend Überführung in das Hydrochlorid mit 1,5 Equivalenten einer 0,1 M wässrigen Salzsäurelösung
Rf = 0,3 6) [ESI-MS: m/e = 865 (M+H)+]
Beispiel 4
Figure imgf000060_0001
Edukte: 1.2.3, E.l.l; Variante A Besonderheiten: Anstelle von Maleimidoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde Maleimidopropionsäure mit EDCI/HOBT angeknüpft.
Ausbeute: 33 % über 4 Stufen
Rf = 0,33 5)
[ESI-MS: m/e = 857 (M+H)+]
Beispiel 5
Figure imgf000060_0002
Edukte: 1.2.4, E.l.l; Variante A
Besonderheiten: Anstelle von Maleimidoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde Maleimidopropionsäure mit EDCI/HOBT angeknüpft. Ausbeute: 30 % über 4 Stufen Rf= 0,55 5)
[ESI-MS: m/e = 841 (M+H)+]
Beispiel 6
Figure imgf000061_0001
Edukte: 1.2.6, E.l.l; Variante A Besonderheiten: Anstelle von Maleimidoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde Maleimidopropionsäure mit EDCI/HOBT angeknüpft.
Ausbeute: 23 % über 4 Stufen
Rf = 0,445)
[MALDI-MS: m/e = 861 (M+Na)+]
Beispiel 7
Figure imgf000061_0002
Edukte: 1.2.7, E.l.l; Variante A
Besonderheiten: Anstelle von Maleimidoessigsäure-N-hydroxysuccinimidester wurde Maleimidopropionsäure mit EDCI/HOBT angeknüpft.
Ausbeute: 37 % über 4 Stufen
Rf = 0,56 5) [ESI-MS: m/e = 841 (M+H)+] Beispiel 8
Figure imgf000062_0001
Edukte: Ll.l, E.l.l; Variante A
Ausbeute: 70 % über 4 Stufen
Rf=0,535)
[ESI-MS: m/e = 742 (M+H)+]
Beispiel 9
Figure imgf000062_0002
Edukte: 1.2.5, E.l.l; Variante B
Ausbeute: 57 % über 4 Stufen Rf=0,285) [MALDI-MS: m/e = 878 (M+Na)+] Beispiel 10
Figure imgf000063_0001
Edukte: 1.2.1, E.1.3; Variante A
Ausbeute: 34 % über 4 Stufen Rf-0,255) [MALDI-MS: m/e = 878 (M+Na)+]
Beispiel 11
Figure imgf000063_0002
Edukte: 1.2.1, E.1.2; Variante A
Ausbeute: 31 % über 4 Stufen Rf=0,45)
[MALDI-MS: m/e = 807 (M+Na)+]
Beispiel 12
Figure imgf000063_0003
Edukte: 1.1.2, E.l.l; Variante A
Ausbeute: 34 % über 4 Stufen Rf = 0,38 4) [ESI-MS: m/e = 784 (M+H)+]
Beispiel 13
Figure imgf000064_0001
Edukte: 1.2.1, E.1.2; Variante B
Besonderheiten: An Stelle der Anknüpfung von Maleimidopropionsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, wurde hier im letzten Schritt die Amin- Vorstufe des Endproduktes mit ε-Maleimidocaprylsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT umgesetzt.
Ausbeute: 15 mg (19 % über 4 Stufen)
Rf= 0,5 5)
[ESI-MS : m/e - 827 (M+H)+]
Beispiel 14
Figure imgf000064_0002
Edukte: 1.2.1, E.1.2; Variante B Besonderheiten: An Stelle der Anknüpfung von Maleimidopropionsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, wurde hier im letzten Schritt die Amin- Vorstufe des Endproduktes mit ε-Maleimidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT umgesetzt.
Ausbeute: 12 % über 4 Stufen Rf = 0,5 5) [ESI-MS: m/e = 799 (M+H)+]
Beispiel 15
Figure imgf000065_0001
Edukte: 1.2.1, E.1.2; Variante B
Besonderheiten: An Stelle der Anknüpfung von Maleimidopropionsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, wurde hier im letzten Schritt die Amin- Vorstufe des Endproduktes mit Acrylsäurechlorid (6Eq) in Dichlormethan in Gegenwart von 2 Equivalenten Pyridin umgesetzt. Die entstehende Zielverbindung wurde durch Flash- Chromatographie (Eluent: Acetonitril/Wasser 10/1) gereinigt.
Ausbeute: 3 % über 4 Stufen
Rf = 0,15 4)
[ESI-MS: m/e = 688 (M+H)+] Beispiel 16
Figure imgf000066_0001
Edukte: 1.2.1, E.1.2; Variante B
Besonderheiten: An Stelle der Anknüpfung von Maleimidopropionsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, wurde hier im letzten Schritt die Amin- Vorstufe des Endproduktes mit Chloracetylchlorid in Dichlormethan in Gegenwart von 2 Equivalenten Pyridin umgesetzt.
Ausbeute: 22 % über 4 Stufen
Rf= 0,12 1}
[MALDI-MS: m/e = 732 (M+Na)+]
Beispiel 17
Figure imgf000066_0002
Edukte: 1.3.4, E.1.2; Variante B
Ausbeute: 58 % über 4 Stufen Rf = 0,2 5)
[ESI-MS : m e = 954 (M+H) ++] Beispiel 18
Figure imgf000067_0001
Edukte: 1.3.5, E.1.2; Variante B
Beispiel 19
Figure imgf000067_0002
Edukte: 1.3.1, E.1.2; Variante B Ausbeute: 83 % über 4 Stufen
R = 0,45)
[ESI-MS : m/e = 925 (M+H)+]
Beispiel 20
Figure imgf000067_0003
Edukte: 1.3.3 E.1.2; Variante B Beispiel 21
Figure imgf000068_0001
Edukte: I.2.2., E.1.2; Variante B Ausbeute: 56 % über 4 Stufen Rf=0,38) [ESI-MS: m/e = 879 (M+H)+]
Beispiel 22
Figure imgf000068_0002
Edukte: I.2.9., E.1.2; Variante A
Ausbeute: 26 % über 4 Stufen
Rf=0,55)
[ESI-MS: m/e = 871 (M+H)+] Beispiel 23
Figure imgf000069_0001
Die Herstellung erfolgte durch Überführung der Verbindung aus Beispiel 21 in das
Hydrochlorid mit 0,1 M wäßriger HCl. Rf = 0,23 6) [ESI-MS : m e = 879 (M+H)+]
Beispiel 24
Edukte: Ll.l, E.l.l; Variante B
Ausbeute: 47 % über 4 Stufen Rf = 0,5 5)
[ESI-MS: m/e = 756 (M+H)+]
Beispiel 25
Figure imgf000069_0002
Edukt: E.2.3, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen: Verknüpfung mit ω-Maleimidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (61 %), Boc- Abspaltung (88 %),
Verknüpfung mit Bis-Boc-Histidin-N-Hydroxysuccinimidester (52 %), Boc-Abspaltung (69 %),
Umsetzung mit E.l.l (96 %).
Rf = 0,4 6) [ESI-MS : m/e = 836 (M+H)+]
Beispiel 26
Figure imgf000070_0001
Edukte: 1.2.8, E.l.l; Variante B
Ausbeute: 23 % über 4 Stufen
Rf = 0,3 5)
[ESI-MS: m/e = 827 (M+H)+]
Beispiel 27
Figure imgf000070_0002
Edukte: 1.3.6, E.1.2; Variante B
Ausbeute: 27 % über 4 Stufen
Rf= 0,26 5)
[ESI-MS : m/e = 911 (M+H)+]
Beispiel 28
Figure imgf000071_0001
Edukt: 1.3.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Verknüpfung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (71 %), Boc- Abspaltung mit Trifluoressigsäure (80 %), Verknüpfung mit E.l.l (54 %).
Rf = 0,38 5) [ESI-MS : m/e = 953 (M+H)+]
Beispiel 29
Figure imgf000071_0002
Edukt: 1.3.8, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Boc- Abspaltung an beiden terminalen Aminograppen mit Trifluoressigsäure (quant.), Umsetzung mit V% Eq. der Verbindung E.l.l zum Mono-Thioharnstoff (28 %) [Rf = 0,15 9)]
Umsetzung mit ω-Maleidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (50 %), [ESI-MS: m/e = 1010 (M+H)+]
Beispiel 30
Figure imgf000072_0001
Edukt: 1.3.12, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (84 %), Boc- Abspaltung mit Trifluoressigsäure (quant.), [Rf = 0,28 8)] Umsetzung mit E.l.l (60 %), [Rf = 0,46 6)] [ESI-MS: m/e = 896 (M+H)+] Beispiel 31
Figure imgf000073_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu der Verbindung aus Beispiel 30.
Umsetzung mit E.1.2 anstelle von E.l.l (52 %), [Rf = 0,55 6)] [ESI-MS: m/e = 882 (M+H)+]
Beispiel 32
Figure imgf000073_0002
Edukt: 1.3.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Bis-Boc-Histidin-N-hydroxysuccinimidester (39 %)
Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (87 %), [Rf = 0,44 8)] Umsetzung mit Kl.2 (45 %), [Rf = 0,44 6)] [ESI-MS: m/e = 1019 (M+H)+] Beispiel 33
Figure imgf000074_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu der Verbindung aus Beispiel 32.
Umsetzung mit E.l.l anstelle von E.1.2 (35 %), [Rf = 0,3 6)] [ESI-MS: m/e = 1033 (M+H)+]
Beispiel 34
Figure imgf000074_0002
Edukt: 1.3.11, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (60 %) Boc- Abspaltung mit Trifluoressigsäure (quant.), [Rf = 0,3 6)] Umsetzung mit E.l.l (97 %), [Rf = 0,44 6)] [ESI-MS: m/e = 981 (M+H)+] Beispiel 35
Figure imgf000075_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu der Verbindung aus Beispiel 34 Umsetzung mit E.1.2 anstelle von E.l.l (73 %), [Rf = 0,48 5)] [ESI-MS: m/e = 967 (M+H)+]
Beispiel 36
Figure imgf000075_0002
Edukt: 1.3.11, dami folgten folgende standardmäßige Umsetzungen: Umsetzung mit Bis-Boc-Histidin-N-hydroxysuccinimidester (41 %) Boc- Abspaltung mit Trifluoressigsäure (quant.), [Rf = 0,12 6)] Umsetzung mit E.l.l (90 %), [Rf = 0,38 6)] [ESI-MS: m/e = 1061 (M+H)+] Beispiel 37
Figure imgf000076_0001
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu der Verbindung aus Beispiel 36.
Umsetzung mit E.1.2 anstelle von E.l.l (73 %), [Rf = 0,4 6)] [ESI-MS: m/e = 1047 (M+H)+]
Beispiel 38
Figure imgf000076_0002
Die Herstellung erfolgte in Analogie zu der Verbindung aus Beispiel 28. Umsetzung mit E.1.2 anstelle von E.1.1 (72 %), [Rf = 0,45 5)]
[ESI-MS: m/e = (M+H)+]
Dieser Affinitätsmarker bildet zusammen mit den Affinitätsmarkem der Beispiele 39, 40 und 41 ein Affimtätsmarker-Quadraplett, das eine parallele Analyse von vier Proteomproben ermöglicht. Beispiel 39
Figure imgf000077_0001
Edukt: 1.3.16, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Verknüpfung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (81 %), Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (98 %), Verknüpfung mit E.1.2 (81 %) Rf = 0,5 5)
[ESI-MS: m/e = 944 (M+H)+]
Beispiel 40
Figure imgf000077_0002
Edukt: 1.3.17, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Verknüpfung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (80 %), Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (quant.),
Verknüpfung mit E.1.2 (74 %) Rf= 0,5 5) [ESI-MS: m e = 950 (M+H)+] Beispiel 41
Figure imgf000078_0001
Edukt: 1.3.18, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Verknüpfung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (94 %), Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (98 %), Verlαiüpfung mit E.1.2 (38 %) Rf = 0,5 5)
[ESI-MS: m/e = 956 (M+H)+]
Beispiel 42
Figure imgf000078_0002
Edukt 1.3.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Verknüpfung mit Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid (78%), Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (93 %) [Rf = 0,2 6)] .
Parallel dazu wurden 100 mg (0,026 mmol) NovaSyn TG Resin 01-64-0043 dreimal mit DMF gewaschen. Anschließend gab man 28 mg (0,08 mmol) 4-(Fmoc-amino)- benzoesäure, 30 mg HATU, und 20 mg Diisopropylethylamin in 2 ml DMF zu und rührte über Nacht bei RT. Man wusch viermal mit DMF. Anschließend wurde nach Standardbedingungen die Fmoc-Gruppe abgelöst und das Harz viermal mit DMF gewaschen. Man fügte 2 ml Dioxan/Wasser 1/1 und 10 μl Thiophosgen zu. Nach 1 h wurden 200 μl Ethyldiisopropylamin zugegeben und nach wiederum 1 h wurde mit Wasser, Dioxan und DMF gewaschen. 35 mg der zuvor hergestellten Aminkomponente wurden in 2 ml DMF und 25 μl Ethyldiisopropylamin zugegeben. Nach 2 h wurde mit DMF und THF je zweimal gewaschen und getrocknet.
Beispiel 43
Figure imgf000079_0001
Edukt: E.2.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Z-Glu(tBu)-OSu (33%),
Hydrierung über Pd-C (92%),
Umsetzung mit Z-Leu in Gegenwart von EDCI / HOBT (88%),
Hydrierung über Pd-C (85%),
Verknüpfung mit ω-Maleimidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (66 %), Boc-Abspaltung (88 %),
Umsetzung mit E.l.l (88 %).
Rf = 0,26 4)
[ESI-MS: m/e = 941 (M+H)+] Beispiel 44
Figure imgf000080_0001
Edukt: E.2.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Fmoc-Leu-Leu in Gegenwart von EDCI / HOBT (58%), Boc-Abspaltung (78 %), Umsetzung mit E.l.l (90 %), Fmoc- Abspaltung mit Piperidin in DMF (68%),
Verknüpfung mit ω-Maleimidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (72 %),
Rf = 0,68 5)
[FAB-MS: m/e = 925 (M+H)+]
Beispiel 45
Figure imgf000080_0002
Herstellung analog Beispiel 44; im letzten Schritt erfolgt die Verknüpfung jedoch mit ω-Maleimidocaprylsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (61 %),
Rf = 0,4 4>
[FAB-MS: m/e = 953 (M+H)+] Beispiel 46
Figure imgf000081_0001
Edukt: E.2.10, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Umsetzung mit Fmoc-Leu-Leu in Gegenwart von EDCI / HOBT (58%>),
Boc-Abspaltung (78 %),
Umsetzung mit E.1.2 (72 %),
Fmoc- Abspaltung mit Piperidin in DMF (96%),
Verknüpfung mit ω-Maleimidobuttersäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (92 %),
Rf = 0,4 4)
[ESI-MS: m/e = 911 (M+H)+]
Beispiel 47
Figure imgf000081_0002
Herstellung analog Beispiel 46; im letzten Schritt erfolgt die Verknüpfung jedoch mit ω-Maleimidocaprylsäure in Gegenwart von EDCI/HOBT (61 %), Rf = 0,5 4) [FAB-MS: m/e = 939 (M+H)+] Beispiel 48
Figure imgf000082_0001
Edukt 1.2.1, dann folgten folgende standardmäßige Umsetzungen:
Boc-Abspaltung mit Trifluoressigsäure (94%) [Rf = 0,2 5)] Man erhält so die Aminkomponente A.
Parallel dazu wurden 42 mg (0,04 mmol) Aminopropyl-Kieselgel (Aldrich, 36425-8, Beladung 0,95 rnmol/g) in 2 ml DMF suspendiert und nacheinander mit 45 mg (0,12 mmol) 4-(Fmoc-amino)-phenylessigsäure, 2 μl Diisopropylethylamin, 15 mg (0,12 mmol) Diisopropylcarbodiimid und 16 mg (0,12 mmol) HOBT versetzt. Man lässt über Nacht bei RT stehen und wäscht dann viermal mit DMF.
Anschließend wird mit 2 ml 20% Piperidin in DMF die Fmoc-Gruppe abgelöst und das Harz je viermal mit DMF und Dioxan gewaschen.
Dann fügt man 1 ml Dioxan und 45 μl Thiophosgen zu. Nach 1 h werden 900 μl
Ethyldiisopropylamin zugegeben und nach wiederum 1 h wird je dreimal mit Dioxan, DMF und DCM gewaschen.
47 mg (0,08 mmol) der zuvor hergestellten Aminkomponente werden in 2 ml DMF und 40 μl Ethyldiisopropylamin zugegeben. Man lässt über Nacht bei RT stehen und wäscht dann viermal mit DMF.
Emeut wird mit 2 ml 20 % Piperidin in DMF die Fmoc-Grappe abgelöst und das Harz viermal mit DMF gewaschen. Man gibt 1 ml DMF zu und anschließend nacheinander 22 mg (0,12 mmol) 4- Maleimido-buttersäure, 15 mg (0,12 mmol) Diisopropylcarbodiimid und 16 mg (0,12 mmol) HOBT und rührt über Nacht bei RT. Anschließend wird je dreimal mit DMF, DCM und THF gewaschen.
Proteinanalytische Untersuchungen
Kupplung der Affinitätsmarker an SDS-7 und Beschreibung des Arbeitsablaufs für den Affinitätsmarker aus Beispiel 11
Als Probe wurde eine Mischung von sieben Proteinen verwendet, die auch Verwendung als Größenstandard in der Gelelektrophorese findet (SDS-7-Marker, Sigma- Aldrich GmbH, Taufkirchen).
24 μg der Proteinmischung wurden in 5 μl Puffer 1 gelöst und mit 135 μl Puffer 3 verdünnt. Durch Erhitzen auf 100 °C für 3 Minuten wurden die Proteine denaturiert. Zur Reduktion der vorhandenen Cysteine wurde 3 μl Reduktionslösung zugegeben und der Ansatz 10 Minuten bei 100 °C inkubiert. Zur Umsetzung der freien Cysteine mit dem Affinitätsmarker aus Beispiel 11 wurde dann 5 μl Derivatisierungslösung zugesetzt und für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert.
Nach der Derivatisierung wurden 3 μl Trypsinlösung zugesetzt. Die Spaltung der Proteine erfolgt über Nacht (ca. 17 Stunden) bei 37 °C.
Puffer 1 : 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA; 0,5 % (w/v) SDS
Puffer 2: 10 mM NH4Acetat, pH 7
Puffer 3: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA
Reduktionslösung: 50 mM TCEP in Puffer 2
Derivatisierungslösung: 30 μg/μl Affinitätsmarker (Beispiel 11) in DMSO Trypsinlösung: 1 mg/ml Trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in Puffer 3 Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide
Die Affinitätssäulen (Monomeric Avidin, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn) mit einem Säulenvolumen von 200 μl wurden vor der Aufreinigung frisch hergestellt und durch folgende Waschschritte vorbereitet:
- Zwei Säulenvolumina 2xPBS
- Vier Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril / 0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure
- Sieben Säulenvolumina 2xPBS - Vier Säulenvolumina 2 mM Biotin in 2xPBS
- Sechs Säulenvolumina 100 mM Glycin, pH 2,8
- Sechs Säulenvolumina 2xPBS
30 μl Probe wurden vor dem Auftragen mit 30 μl 2xPBS verdünnt und dann auf die Säule aufgetragen. Danach wurden zum Entfernen der nicht-biotinylierten Peptide folgende Waschschritte durchgeführt:
- Sechs Säulenvolumina 2xPBS
- Sechs Säulenvolumina PBS - Sechs Säulenvolumina 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat / 20 % (v/v)
Methanol
- Ein Säulenvolumen 0,3 % (v/v) Ameisensäure
Die Probe wurde mit folgenden Schritten eluiert:
- Drei Säulenvolumina 0,3 % (v/v) Ameisensäure
- Drei Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril / 0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure
Das Eluat wurde bis zur Trockenheit eingedampft und erst kurz vor der Analyse mit Massenspektrometrie wieder gelöst.
PBS: Stammlösung lOx, GibcoBRL, Cat. No. 14200-067 Massenspektrometrische Analyse
Zur Analyse der Peptide wurde ein Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQdeka, ThermoFinnigan, San Jose) eingesetzt, das direkt mit einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed- Phase-Säule (C18-Phase) benutzt. Die Peptide wurden in Eluent A (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure) gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von Eluent B (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure / 84 % (v/v) Acetonitril) eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. Damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt wurden.
Fig. 1 zeigt ein Beispiel für ein Fragmentspektrum eines Peptides aus dieser Analyse. Das beobachtete Muster identifiziert das Peptid eindeutig als das Peptid mit der
Sequenz FLDDDLTDDIMCVK aus Lactalbumin, das Bestandteil der Probe war. Die Masse des Peptides und seine Fragmentierung bestätigen, dass der Affinitätsmarker in der erwarteten Weise durch Säure gespalten wurde.
Insgesamt wurden in einer Analyse 19 unterschiedliche Peptide aus der Probe identifiziert, die alle in der gleichen Weise die erwartete Masse des Affmitätsmarke- Restes tragen. Es wurde kein einziges Cystein-haltiges Peptid identifiziert, das einen noch vollständigen Affinitätsmarker trag.
Fig. 1: Fragmentspektrum eines mit der Verbindung aus Beispiel 11 derivatisierten
Peptides nach Isolierung über Avidin, d. h. mit säuregespaltenem Affinitätsmarker.
Kupplung der Affinitätsmarker an Proteine und Beschreibung des Arbeits- ablaufs für die Affinitätsmarker der Beispiele 38 bis 41 Als Probe wurde eine Mischung von sieben Proteinen verwendet, die auch Verwendung als Größenstandard in der Gelelektrophorese findet (SDS-7-Marker, Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen). Die beiden zur vergleichenden Proben enthielten folgende Proteine in identischer Menge:
Seramalbumin aus Rind Alpha-Lactalbumin aus Rind Trypsin-Inhibitor aus Sojabohne Trypsin aus Rind > SDS-7 Ovalbumin aus Huhn
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehoydrogenase aus Mensch Carboanhydrase aus Rind J
Probe 1 wurde außerdem humanes Interleukin-4 zugegeben, das in Probe 2 nicht vorhanden war.
In jeder Probe wurden etwa 240 μg Protein eingesetzt, die sich auf die oben genannten 7 bzw. 8 Proteine in etwa gleich verteilten. Die SDS-7-Proben wurden zunächst in 10 μl Puffer 1 gelöst und mit 95 μl Puffer 3 verdünnt. Dann wurden Probe 1 außerdem 10 μl Interleuking-4-Lösung zugegeben. Die Proben wurdenmit
Puffer 3 auf 200 μl aufgefüllt und jeweils halbiert (Proben la und lb bzw. 2a und 2b).
Durch Erhitzen auf 100°C für 3 Minuten wurden die Proteine anschließend denaturiert. Zur Reduktion der vorhandenen Cysteine wurden 3 μl Reduktionslösung zugegeben und die Ansätze 10 Minuten bei 100°C inkubiert. Zur Umsetzung der freien Cysteine mit den Affinitätsmarkern aus den Beispielen wurden jeder Probe 5 μl Derivatisierungslösung zugesetzt und für 120 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden alle 4 Proben gemischt und die Hälfte der Gesamtprobe wurde weiterverarbeitet. Probe la: Umsetzung mit Beispiel 38 Probe lb: Umsetzung mit Beispiel 41 Probe 2a: Umsetzung mit Beispiel 39 Probe 2b: Umsetzung mit Beispiel 40
Nach erfolgter Umsetzung wurden die Proteine durch Zugabe des vierfachen Volumens von eiskaltem Aceton/Ethanol 1:1 für 15 Minuten bei -20°C gefällt. Das Sediment wurde einmal mit Aceton Ethanol/Wasser 4:4:2 gewaschen und danach im Vakuum getrocknet. Die Probe wurde in 10 μl Puffer 1 gelöst und mit 260 μl Puffer 3 verdünnt. Zur Spaltung der Proteine wurden 40 μl Trypsinlösung zugegeben und die Probe 1 h bei 37°C inkubiert. Zur Inaktivierung des Enzyms wurde die Probe danach kurz auf 95 °C erhitzt.
Puffer 1: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA; 0,5 % (w/v) SDS Puffer 2: 10 mM NH4 Acetat, pH 7
Puffer 3: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3; 5 mM EDTA
Reduktionslösung: 50 mM TCEP in Puffer 2
Derivatisierungslösung: 36 μg/μl Affinitätsmarker (Beispiele 38-41) inDMSO
Trypsinlösung: 1 mg/ml Trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in Puffer 3
Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide
Zur selektiven Aufreinigung der derivatisierten Peptide aus der Probe wurde eine Affmitätsreinigung mit eine selbst hergestellten Avidin-Säule durchgeführt (Monomeric Avidin, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn). Die Herstellung und die Benutzung der Säule geschah nach den Vorschriften des Herstellers. Die Peptide wurden mit 0,4% Trifluoressigsäure / 30% Acetonitril eluiert.
Massenspektrometrische Analyse
Zur Analyse der Peptide wurde ein Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQdeka, ThermoFinnigan, San Jose) eingesetzt, das direkt mit einer Hochdruckflüssig- keitschromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed- Phase-Säule (C18-Phase) benutzt. Die Peptide wurden in Eluent A (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure) gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von Eluent B (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure / 84 % (v/v) Acetonitril) eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. Damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt wurden.
Aufgrund des experimentellen Ansatzes wurden folgende Ergebnisse erwartet:
• Alle Peptide aus der SDS-7-Mischung sollten in Form von vier identisch intensiven Signalen detektiert werden, die in der Chromatographie keinen Isotopeneffekt zeigen.
• Peptide aus Interleukin-4 sollten in Form eines Dubletts von Signalen mit einer
Massendifferenz von 17 Da auftreten.
Fig. 2 zeigt die Ionenspuren für die vier unterschiedlich markierten Varianten des Peptids LQGrVSWGSGCAQK aus Trypsinogen. Von oben nach unten handelt es sich um das Peptid mit der Markierung durch die Affinitätsmarker mit 0, 5, 11 und
17 Isotopenmarkierungen. Eine Retentionszeitdifferenz zwischen den Varianten ist nicht meßbar. Fig. 3 zeigt das zugehörige MS-Spektrum, das ein Quadraplett von annähernd gleich intensiven Signalen enthält. Die Identität des Peptides wurde durch MS/MS-Experimente bestätigt.
Fig. 4 zeigt die Signale des Peptids NLWGLAGLNSCPVK aus Interleukin-4. Wie erwartet zeigt sich ein Dublett von Signalen mit Intensitätsverhältnis 1:1. Auf diese Weise kann das Signal klar von Peptiden unterschieden werden, die unmarkiert sind und durch unspezifische Adsorption an der Affinitätssäule aufgereinigt wurden. Die Identität des Peptides wurde durch MS/MS-Experimente bestätigt. Fig. 2: Die Ionenspuren für die m/z- Werte 647,3 Da, 648,9 Da, 650,9 Da und 652,9 Da. Es handelt sich um das dreifach geladene Ion des Peptids LQGIVSWGSGCAQK in den mit den Beispielen 38 bis 41 umgesetzten Formen. Die Identität der Peptide wurde durch MS/MS-Experimente bestätigt.
Fig. 3: MS-Spektram unter dem in Fig. 2 gezeigten LC-Peaks. Es handelt sich um ein dreifach geladenes Peptidion.
Fig. 4: MS-Spektram des dreifach geladenen Ions des Peptids NLWGLAGLNSCPVK aus Interleukin-4. Da es nur in Probe 1 vorhanden war, tritt ein Dublett von Signalen auf, entsprechend dem Peptid mit 0 bzw. 17 Isotopenmarkierangen.

Claims

Patentansprüche
1. Organische Verbindung der Formel (I),
A-L-PRG (I)
in der
A für einen Affinitätsliganden-Rest oder für eine feste Phase,
PRG für eine proteinreaktive Gruppe und
L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,
dadurch gekennzeiclmet, dass der Linker L eine Gruppe der Formel (V) enthält,
Figure imgf000090_0001
in der
der Glycin-Rest NH-CH2-CO ist,
L' eine Brücke ist, die eine kovalente Verknüpfung zweier Piperazin-
Reste ermöglicht oder erleichtert,
R und R an einem Piperazin-Ring unabhängig voneinander und unabhängig von anderen R und R' an anderen Piperazin-Ringen der gleichen oder der anderen der beiden Laufvariablen 1 und m jeweils eine α-Aminosäure-Seitenkette ist, Z' der Glycin-Rest CO-CH2-NH ist, der sich von Z in der unterschiedlichen Orientierung unterscheidet, und
k, 1, m, n unabhängig voneinander jeweils für eine Zahl von 0 bis 10 stehen, wobei die Summe k + 1 + m + n mindestens 1 und höchstens 40 beträgt,
oder deren Salz.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L spaltbar ist.
3. Verbindung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L eine chemisch, photochemisch, enzymatisch oder thermisch spaltbare funktionelle Gruppe, insbesondere eine säurespaltbare Gruppe, aufweist.
4. Verbindung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L eine säurespaltbare Gruppe S der Formel,
Figure imgf000091_0001
in der
Y für einen Abstandshalter mit 1 bis 10 Nicht- Wasserstoff- Atomen, der die Anbindung des Arylrestes an A ermöglicht oder erleichtert, und
SK für den Rest einer Aminosäure-Seitenkette in der D-oder L- oder in der razemischen Form steht. Verbindung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die säurespaltbare Gruppe S die Grappe A mit der Grappe der Formel (T) verbindet.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker L aus der säurespaltbaren Grappe S und der Grappe der Formel (T) besteht.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Grappe PRG eine selektive Reaktivität für eine endständige Funktionalität einer Aminosäure, für eine Phosphatgruppe oder für eine möglicherweise vorher generierte Aldehyd- oder Keto-Grappe im Protein oder für das Reaktionsprodukt einer gezielten Umsetzung des Proteins aufweist.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinreaktive Grappe -PRG ausgewählt ist aus
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000092_0002
CO-[CH2]r-Cl mit r = 1-10 und
CO-C H=CH2.
Verbindung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass A ein Affinitätsliganden-Rest, bevorzugt der Rest von Biotin, eines Biotin-Derivats, eines Kohlenl ydrats, eines Haptens oder eines Komplexbildners, insbesondere von Biotin oder eines Biotin-Derivats, ist.
10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass A eine feste Phase, vorzugsweise ein modifiziertes natürliches oder synthetisches Harz mit zur Anbindung des Linker L geeigneten funktioneilen
Gruppen, insbesondere ein Amino-funktionalisiertes Harz auf Polyethylen- glycol- oder Kieselgel-Basis, ist.
11. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Ansprach 1 , bei dem
i) ein geschütztes Intermediat der Formel (III),
Figure imgf000093_0001
in der SG und SG' für zwei orthogonale Schutzgruppen stehen,
hergestellt wird,
ii) aus dem Intermediat der Formel (III) zunächst die Schutzgruppe SG abgelöst wird und anschließend ein weiteres Aminosäurederivat, das eine zu der abgelösten gleiche oder verschiedene Schutzgrappe SG an der α- Aminofunktion trägt, angeknüpft wird, wobei ein Derivat der Formel (IV),
SG-NH-CH(SK)-CO-(Z)k (Z')n-SG' (IN)
Figure imgf000093_0002
in der SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
erhalten werden,
iii) nach Ablösung der Schutzgruppe SG' aus dem Derivat der Formel (IV) mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Grappe steht, die die Verknüpfung von PRG mit Z' oder gegebenenfalls mit einer anderen Endgrappe von L ermöglicht,
umgesetzt wird,
iv) die terminale Schutzgruppe SG abgelöst wird, wobei ein Konjugat der Formel (VI)
H2N-CH(SK)-CO-(Z)k (VI)
Figure imgf000094_0001
erhalten wird,
v) ein Affinitätsligand A-OH oder A-NH2 oder eine Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-funktionalisierte feste Phase A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form davon mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000094_0002
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergruppe steht,
die optional eine Schutzgrappe tragen kann, zum Derivat der Formel (VIII)
Figure imgf000095_0001
umgesetzt wird,
vi) das Derivat der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgrappe in ein entsprechendes Isothiocyanat überfuhrt wird,
vii) das Isothiocyanat anschließend mit dem Konjugat der Formel (VI) zum Thiohamstoff der Formel (IX) gekuppelt wird und
Figure imgf000095_0002
vii) in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgrappen abgespalten werden,
wobei die aufeinanderfolgenden Schritte v) und vi) zu einem beliebigen Zeitpunkt vor Schritt vii) durchgeführt werden können.
12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem
i) ein geschütztes Intermediat der Formel (III),
Figure imgf000096_0001
in der SG und SG' für zwei orthogonale Schutzgruppen stehen,
hergestellt wird,
ii) aus dem Intermediat der Fomiel (III) zunächst die Schutzgrappe SG abgelöst wird und anschließend ein weiteres Ammosäurederivat, das eine zu der abgelösten gleiche oder verschiedene Schutzgrappe SG an der α- Aminofunktion trägt, angeknüpft wird, wobei ein Derivat der Formel (IV),
SG-NH-CH(SK)-CO-(Z)k (IV)
Figure imgf000096_0002
in der SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht,
erhalten werden,
iii) die terminale Schutzgruppe SG abgelöst wird, wobei ein Konjugat der Formel (VT)
H2N-CH(SK)-CO-(Z)k -N N-L'' N IM- (Z')n-SG' (VI') m
erhalten wird, iv) ein Affinitätsligand A-OH oder A-NH2 oder eine Hydroxy-, Carboxy- oder Amino-funktionalisierte feste Phase A-OH oder A-NH2 oder eine aktivierte Form davon mit einer Verbindung der Formel (VII),
Figure imgf000097_0001
in der Y für die optional verzweigte Abstandhaltergruppe steht,
die optional eine Schutzgruppe tragen kann, zum Derivat der Formel (VIII)
Figure imgf000097_0002
umgesetzt wird,
v) das Derivat der Formel (VIII) dann nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgrappe in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt wird,
vi) das Isothiocyanat anschließend mit dem Konjugat der Formel (VP) zum Thiohamstoff der Formel (X') gekuppelt wird und
Figure imgf000097_0003
vii) nach Ablösung der Schutzgrappe SG' aus dem Thiohamstoff der Formel (X') mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe des Derivats einer proteinreaktiven Gruppe der Formel (V),
U-PRG (V)
in der U für eine Gruppe steht, die die Verknüpfung von PRG mit Z' oder gegebenenfalls mit einer anderen Endgruppe von L ermöglicht,
umgesetzt wird und
viii)in einem optionalen letzten Schritt gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgrappen abgespalten werden,
wobei die aufeinanderfolgenden Schritte iv) und v) zu einem beliebigen
Zeitpunkt vor Schritt vi) durchgeführt werden können.
13. Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13 zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.
15. Verwendung gemäß Anspruch 13 zur Bestimmung der relativen Expressions- Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein- haltigen Proben.
16. Kit zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, enthaltend als
Reagenzien eine oder mehrere unterschiedlich isotopenmarkierte Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.
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