WO2003033700A1 - Verfahren zur hemmung der replikation von viren - Google Patents

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WO2003033700A1
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    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
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    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Definitions

  • the invention relates to a method, a use and a medicament for inhibiting the replication of viruses.
  • the invention relates in particular to the field of inhibiting (+) strand RNA viruses, such as hepatitis C viruses.
  • the (+) strand RNA virus genome is a single-stranded coding RNA molecule (+ ssRNA).
  • the Picornaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Coronaviridae and Caliciviridae families belong to these viruses.
  • An important representative of the Flaviviridae family is the hepatitis C virus (HCV). It causes hepatitis C, an inflammatory disease of the liver that can be linked to liver fibrosis and liver cancer. A significant proportion of hepatitis C diseases are chronic. Infection with HCV occurs primarily parenterally, for example by blood transfusion or by administration of medication from blood products.
  • the hepatitis C virus was discovered in 1989 (Choo et al., Science 244: 359, 1989). Replication of the coding (+) strand is mediated by generating a replicative antisense or (-) strand. Several copies of the coding (+) strand are written off from the (-) strand.
  • HCV is characterized by a high level of genetic variability.
  • the high mutation rate of the viral nucleic acid has led to the development of several HCV genotypes which have a comparatively low sequence identity of approximately 70% (Simmonds et al., J. Gen Virol., 75: 1053, 1994).
  • the frequency of the individual genotypes varies from region to region.
  • the high variability of the HCV makes the treatment of diseases considerably more difficult.
  • a hepatitis C disease usually consists of several phases.
  • the first acute phase begins when the patient is infected with HCV.
  • An inflammatory process is triggered which is characterized by an increase in the liver enzyme concentration in the blood serum which begins about four weeks after the infection.
  • HCV-RNA polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • Interferon- ⁇ Interferon- ⁇
  • IFN-alpha Interferon- ⁇
  • dsRNA one strand of which is complementary in sections to a gene of a roundworm to be inhibited, inhibits the expression of this gene with a high effectiveness. It is believed that the particular effectiveness of the dsRNA used in roundworm cells is not based on the anti-sense principle, but is possibly due to the catalytic properties of the dsRNA or enzymes associated with dsRNA. This method is referred to as RNA interference and is used, for example, in WO 00/44895 to inhibit the expression of a given gene.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method and a use are to be specified which effectively inhibit the replication of viruses.
  • a drug and a dsRNA are to be specified with which a particularly effective inhibition of the replication of viruses can be effected.
  • the process provides for a structure within the 3 'UTR to be changed using a short double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) or an antisense oligonucleotide, a strand S1 of the dsRNA or the antisense oligonucleotide being changed in sections or is completely complementary to the 3 'UTR sequence of the viruses.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • antisense oligonucleotide a strand S1 of the dsRNA or the antisense oligonucleotide being changed in sections or is completely complementary to the 3 'UTR sequence of the viruses.
  • structure here means the primary, secondary or tertiary structure of a sequence formed from nucleic acid.
  • a change in the structure is e.g. B. before if the primary sequence is cut or changed by deletions or insertions.
  • a change can also affect the secondary structure, ie the base pairing.
  • the spatial structure ie the tertiary structure.
  • a short dsRMA is understood to mean a ⁇ dsRNA which is formed from less than 50 base pairs.
  • the antisense oligonucleotide can be formed from both DNA and RNA. It can be complementary to a region of the 3 'UTR and can change a structure within the 3' UTR by hybridizing with it.
  • the dsRNA or the antisense oligonucleotide generally has to be introduced into the respective cell or taken up by the cell to inhibit replication. It can be picked up by the cell itself. However, it can also be imparted by means of auxiliaries or aids.
  • the 3 'UTR is understood to mean either the entire non-translated region at the 3' end of the virus genome or a part of this region.
  • a sequence section forming the 3 'UTR can be cut.
  • the cutting can caused by the dsRNA and the enzymes present in the cell.
  • the 3 'UTR can be highly preserved.
  • the change in structure is expediently effected in a particularly highly conserved area of the 3 'UTR. This further increases the efficiency of the method because many virus genomes, especially the HCV genome, have a high sequence variability. Choosing a highly conserved area therefore opens up the possibility of inhibiting the replication of a larger number of viruses than in a less conserved or variable area.
  • a strand S1 of the dsRNA or the antisense oligonucleotide can be partially or completely complementary to the 3 'UTR sequence. This means that either a section of the antisense oligonucleotide or the strand S1 of the dsRNA or the entire strand S1 of the dsRNA or the entire antisense oligonucleotide is complementary to a section of the 3 'UTR or the complete 3' UTR ,
  • the dsRNA can be double-stranded at least in sections.
  • One end of the dsRNA, preferably both ends, can be smooth. Smooth means that the end of one strand does not protrude beyond the end of the other strand of the dsRNA, ie it does not form an overhang.
  • At least one strand, in particular strand S1 can have an overhang at the 3 'end, which can consist of 1 to 3, preferably 2, nucleotides.
  • the aforementioned features influence the plasma stability of the dsRNA.
  • dsRNA with at least one smooth end has a higher plasma stability than dsRNA with, in particular on both sides, overhangs, ie it becomes less in plasma or blood quickly dismantled.
  • the stability of such a dsRNA inside the cell is greater than that of a dsRNA with overhangs.
  • the stability in particular the plasma stability, can therefore be adapted to the respective requirements by the particular construction of the dsRNA.
  • Single-stranded overhangs reduce the stability of the dsRNA in blood, serum and cells and at the same time increase the replication-inhibiting effect of the dsRNA.
  • dsRNA overhang exclusively in one point, in particular its the 3 'end of the strand S having, end ⁇ a fwerst: The other end is "then at a double ended dsRNA smooth,
  • an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to increase the replication-inhibiting effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs: a dsRNA with only one Overhang has proven to be sufficiently stable and particularly effective in various cell culture media as well as in blood, serum and cells.
  • a region of the dsRNA or strand S1 that is at least partially complementary to the 3 ′ UTR sequence comprises less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, base pairs or bases
  • the dsRNA expediently has a length of less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, base pairs.
  • the length of the dsRNA thus essentially corresponds to the length of the complementary region.
  • Such a dsRNA can be produced particularly inexpensively.
  • the virus genome is expediently the genome of a (+) strand RNA virus, in particular a hepatitis C virus.
  • the dsRNA can be present in a solution, in particular in a phosphate-buffered saline solution. It has surprisingly been found that a dsRNA which is only dissolved in such a solution is taken up by cells and inhibits the replication of the viruses without the dsRNA having to be packaged in a special vehicle.
  • the dsRNA or the antisense oligonucleotide can also be enclosed by a micellar structure, preferably a liposome, a virus capsid or a capsoid. This can make it easier to take up cells.
  • the dsRNA can have a sense strand S2 with the sequence SEQ ID NO: 4 and an antisense strand S1 with the sequence SEQ ID NO: 5.
  • the antisense oligonucleotide can have a strand with the sequence SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO denotes the number of a sequence in the attached sequence listing.
  • dsRNA short double-stranded ribonucleic acids
  • an antisense oligonucleotide for inhibiting the replication of viruses with a non-translated region (3 '-UTR) located at the 3' end of the virus genome is also possible Modification of a structure within the 3 'UTR intended to treat a viral infection.
  • the use of such a dsRNA or of such an antisense oligonucleotide for the manufacture of a medicament for inhibiting the replication of viruses with a non-translated region located at the 3 'end of the virus genome (3' UTR) by changing a structure is within the 3 'UTR provided.
  • a strand S1 of the dsRNA or the antisense oligonucleotide is partially or completely complementary to the 3 'UTR sequence of the viruses.
  • the dsRNA can be present in a preparation which is suitable for inhalation, oral intake, infusion or injection, in particular for intravenous or intraperitoneal infusion or injection. Such preparations are known from pharmacy.
  • the dsRNA can be present in a physiologically compatible buffer, in particular a phosphate-buffered saline solution.
  • the dsRNA or the antisense oligonucleotide is of a micellar structure, preferably a liposome, ist ⁇ r "Vi ⁇ rus capsid or a capsoid enclosed before:
  • the dsRNA may be administered orally, by inhalation, infusion or injection, particularly intravenous or intraperitoneal infusion or injection
  • the dsRNA is preferably administered to a mammal, preferably a human, in a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, per kg of body weight and day.
  • a medicament is also proposed in which a short double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) or an antisense oligonucleotide is included to change the structure within the 3 'UTR, with a strand S1 of the dsRNA or the antisense oligonucleotide being used in sections or is completely complementary to the 3 'UTR sequence of the viruses.
  • the invention relates to a dsRNA with a strand S1, which is partially or completely complementary to a non-translated region (3 'UTR) located at the 3' end of a virus genome.
  • HCVPTO1 SEQ ID NO 12
  • HCVPT02 SEQ ID NO 13
  • HCVPT03 SEQ ID NO 14
  • sequence no. 1 of the sequence listing was cloned in front of a gene of a plasmid coding for E. coli- ⁇ -galactosidase.
  • Sequence No. 1 corresponds to a sequence comprising 24 nucleotides from a highly conserved region of the 3 'UTR of the HCV genome.
  • the sequence is transcribed as part of an mRNA coding for ⁇ -galactosidase.
  • the mRNA sequence corresponding to the 24 nucleotides is then identical to the sequence of the HCV genome. It was used as the target sequence.
  • the E. coli- ⁇ -galactosidase ( ⁇ -Gal) gene was isolated from the commercially available expression vector pßGal-Control (BD Biosciences Clontech, Tullastrasse 4, D-69126 Heidelberg, Germany, Gene Accession Number U13186; nucleotide 280-3429) ,
  • the HCV sequence is part of a fusion gene.
  • the HCV sequence is part of the open reading frame of the sequence coding for ⁇ - " galactosidase, " so that "" the HCV sequence is also expressed as part of a fusion protein.
  • 1 shows the relevant sequence section of plasmid p2 according to sequence no. 2 of the sequence listing.
  • the HCV sequence is shown in italics.
  • the beginning of the ⁇ -gal gene (including 6 nucleotides of the Kozak sequence before the codon ATG) is underlined.
  • the N-terminal amino acid sequence of the fusion protein HCV- ⁇ -galactosidase is listed under the DNA sequence.
  • the HCV sequence is part of a fusion gene.
  • the HCV sequence is outside the open reading frame of the sequence coding for ⁇ -galactosidase, so that the HCV sequence is not expressed as part of a fusion protein.
  • 2 shows the relevant sequence section of plasmid p3 according to sequence No. 3 of the sequence listing.
  • the HCV sequence is shown in italics.
  • the beginning of the ⁇ -gal gene (including 6 nucleotides of the Kozak sequence before the start codon ATG) is underlined.
  • the N-terminal amino acid sequence of the expressed ⁇ -galactosidase is listed under the DNA sequence.
  • the fusion genes generated in this way were cloned into the commercially available expression plasmid pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Life Technologies, Technologiepark Düsseldorf, Emmy-Noether-Str. 10, D-76131 Düsseldorf, Germany, catalog number mer V790-20).
  • This plasmid contains a resistance gene against the antibiotic neomycin. It gives the HuH-7 cells transfected with it a resistance to the neomycin analogue G418, so that in the presence of G418 only HuH-7 cells are selected which stably incorporate the plasmid genome and thus the reporter gene into their genome to have.
  • DsRNA ligonucleotides used Three short, double-stranded ribonucleic acids (dsRNA) were used to carry out the RNA interference. These dsRNAs consist of 2 short oligoribonucleotides, which are complementary to each other over almost the entire sequence area. At both 3 'ends of the oligoribonucleotides, two nucleotides have no partners and therefore form overhangs in the dsRNA.
  • the sequence of the one oligoribonucleotide is identical to the target sequence of the mRNA. This oligonucleotide is therefore called the sense strand.
  • the sequence of the other oligonucleotide is complementary to the target sequence of the mRNA. This oligonucleotide is therefore called an antisense strand.
  • FIG. 3 shows the double-stranded oligoribonucleotide referred to as HCVl-2 compared to the HCV sequence of the mRNA formed by means of plasmids p2 and p3.
  • the nucleotides shown in capital letters correspond to the HCV sequence in plasmids p2 and p3.
  • HCV1-2 consists of the sense strand HCV 1 and the anti-sense strand HCV 2, with two nucleotides at the 3 'ends of the strands Have partners.
  • the sense strand (HCV 1) shown in sequence no. 4 of the sequence listing has almost the same nucleotide sequence as the HCV sequence of an mRNA formed by means of plasmids p2 or p3.
  • the antisense strand shown in sequence no. 5 of the sequence listing is complementary to HCV 1 and thus also to the HCV sequence of an mRNA formed by means of plasmids p2 or p3.
  • the HCV sequence corresponds to a 3 'untranslated region of the HCV genome.
  • GALl-2 A dsRNA designated as GALl-2 was used for positive control. This is shown in FIG. 4 compared to an mRNA sequence corresponding to the ⁇ -Gal gene of plasmids p2 and p3 (referred to as mRNA in FIG. 4).
  • GALl-2 consists of the sense strand Gal 1 and the antisense strand Gal 2, two nucleotides each having no partner at the 3 'ends of the strands.
  • the sense strand (Gal 1) shown in sequence No. 6 of the sequence listing has almost the same nucleotide sequence as the mRNA sequence corresponding to the ⁇ -Gal gene.
  • the antisense strand (Gal 2) shown in sequence no. 7 of the sequence listing is complementary to Gal 1 and thus also to the mRNA sequence corresponding to the ⁇ -Gal gene.
  • HCV3-4 consists of the
  • HCV 3 sense strand and HCV 4 antisense strand two nucleotides each having no partner at the 3 'ends of the strands.
  • the sense strand (HCV 3) shown in sequence no. 8 of the sequence listing shows almost no similarity to the mRNA formed by means of plasmids p2 and p3 and is therefore unrelated to the genes expressed.
  • the antisense strand (HCV 4) shown in sequence no. 9 of the sequence listing is complementary to HCV 3 and is therefore also unrelated to the mRNA formed.
  • a dsRNA designated as K22 was used as a negative control, which likewise has no relation to a gene expressed here (FIG. 6).
  • the sequences of both the dsRNA-forming Oligoribonukleo- tide “are” “irr” the "” S “e” sequences "Nr. 10 and Sequenzproto- _ ⁇ Kolls illustrated. 11
  • HCVPTOl HCVPT02
  • HCVPT03 HCVPTOl and HCVPT02 are related to different areas of the
  • Plasmid p3 formed complementary HCV mRNA sequence.
  • HCVPT03 is unrelated to the target sequence.
  • HCVPTOl, HCVPT02 and HCVPT03 are shown in relation to the HCV mRNA sequence in FIG. 7.
  • HuH-7 liver cell lines HuH-7 liver cell lines (Nakabayashi et al. 1982). This cell line can be infected by HCV and is used to cultivate these viruses.
  • the cells were in DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium) with 10% fetal
  • HuH-7 transfected - " The amount of DNA transfected - per " well was constant.
  • the amount of dsRNA was added to the plasmid mixtures in decreasing concentrations from 400 nmol / 1 to 12.5 nmol / 1 (in relation to 110 ⁇ l transfection volume).
  • the initial concentration of the dsRNAs HCVl-2, GAL1-2 and the non-specific HCV3-4 in the respective stock solution was 20 ⁇ mol / 1 in each case.
  • the dsRNAs were gradually diluted to the final concentration by mixing with equal volumes of annealing buffer (AB, 100 mmol / 1 NaCl, 20 mmol / 1 Na phosphate, pH 6.8).
  • Plasmids and dsRNA were co-transfected.
  • Gene Porter 2 (PeQLab, Carl-Thiersch-Str. 2B, D-91052 Er Weg, Germany, catalog number 13-T202007) was used as the transfection agent. Each co-transfection was done in triplicate.
  • DNA Diluent B supplied together with Gene Porter 2 from PeQLab. This mixture was mixed with a mixture of 6.0 ⁇ l Gene Porter 2 and 19 ⁇ l serum-free medium. The total volume of the mixture thus obtained was 50 ⁇ l, of which 16.5 ⁇ l were added to 2 ⁇ 10 4 HuH-7 in 100 ⁇ l medium.
  • This mixture was mixed with a mixture of 6.0 ⁇ l Gene Porter 2 and 19 ⁇ l serum-free medium.
  • the total volume of the mixture thus obtained was 50 ⁇ l, of which 16.5 ⁇ l were added to 2 ⁇ 10 4 HuH-7 in 100 ⁇ l medium.
  • the transfected cells were incubated at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • "3" 5 ⁇ ⁇ r "fresh medium was added per well and the cells incubated for a further 24 h. Then, the digestion was carried out of the cells.
  • the effect of the dsRNA on the expression of the reporter genes was determined by quantifying the ⁇ -galactosidase and luciferase activity by means of chemiluminescence. For this purpose, lysates were added using the Tropix lysis buffer from Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404 USA; Cat. No. BD100LP manufactured according to the manufacturer's instructions.
  • a reduction in the ⁇ -galactosidase expression can also be detected (FIG. 9).
  • the HCVl-2 and GALl-2 dsRNAs inhibit the ⁇ -galactosidase activity with comparable efficiency.
  • the activity of the ⁇ -galactosidase drops to about 20% compared to untreated cells.
  • the inhibitory effect diminishes as the concentration of dsRNA decreases.
  • the control dsRNA HCV3-4 shows a weak inhibition of the over the entire concentration range ⁇ -galactosidase activity to about 70% compared to untreated cells.
  • dsRNA HCVl-2 In the presence of dsRNA HCVl-2, a clear reduction in the ⁇ -galactosidase activity was thus detectable for both plasmid p2 and plasmid p3. Comparable effects were shown by dsRNA GAL1-2 (positive control). The second control dsRNA HCV3-4 led to no or significantly less inhibition of the ⁇ -galactosidase activity.
  • p3 was stably transfected into HuH-7 cells using LipofecamaminePLUS (GIBCO BRL Life Technologies, Technologiepark Düsseldorf, Emmy-Noether-Str. 10, D-76131 Düsseldorf, Germany).
  • 2 x 10E4 cells were sown per well of a 96-well cell culture plate. After 24 h, the medium was drawn off and replaced with 50 ⁇ l serum-free medium (DMEM).
  • the transfection mixture consisted of 0.2 ⁇ g p3, 16.7 ⁇ l DMEM, 2 ⁇ l PLUS reagent and 1 ⁇ l Lipofectamine reagent. The transfection was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • the transfection medium was replaced by 150 ⁇ l of complete medium (DMEM + 10% fetal calf serum).
  • DMEM + 10% fetal calf serum After 48 hours, the cells were transferred to wells of a 12-well cell culture plate and cultured in full medium in the presence of 400 ⁇ g / ml G418 (Amersham Biosciences, Munzinger Str. 9, D-79111 Freiburg, Germany). Growing cell clusters were removed regularly and transferred to new wells on a 12-well cell culture plate. Out after 14-21 days growing cells were separated in new wells and cultivated until the end of the selection in the presence of 400 ⁇ g / ml G418. After about three separations, the activity of ⁇ -galactosidase was determined using enzyme measurements as described below.
  • the number of galactosidase-expressing cells was determined using X-Gal stains.
  • the medium was removed and the cells were deepened in a 96-well cell culture plate overnight in 100 ⁇ l of X-Gal solution (10 mmol / 1 Na phosphate pH 7.0, 1 mmol / 1 MgCl 2 , 150 mmol / 1 NaCl, 3.3 mmol / 1
  • the antisense DNA oligonucleotides HCVPTOl, HCVPT02 and HCVPT03 have been prepared in each case with a concentration of 100 ⁇ mol / 1.
  • 1.2 ul were mixed with 2, 4 ul Fugene 6 and 108 ul DMEM.
  • the dsRNA is then present in a concentration of 200 nmol / 1.
  • 5 wells of a 96-well cell culture plate were transfected with 20 ⁇ l each of this approach.
  • the effect of the dsRNA oligonucleotides and antisense DNA oligonucleotides on the expression of the reporter genes was determined by quantifying the ⁇ -galactosidase activity by chemiluminescence.
  • "" lysates “were made using the Tropix " lysis buffer from Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404 USA; Catalog number BD100LP manufactured according to the manufacturer's instructions.
  • the chemiluminescence measurement was carried out as follows:
  • ⁇ -Gal assay buffer (1 ml of 1 mol / 1 Na phosphate buffer, pH 8.0, 10 ⁇ l of 1 mol / 1 MgCl 2 , 10 ⁇ l of 1 25 mg / ml galacton (Tropix GC020, Applied Biosystems), 9 ml deionized water).
  • ß-Gal-Stop-Mix (1 ml 2 mol / 1 NaOH, 250 ⁇ l 2.5% Emerald Enhancer (Applied Biosystems, Tropix, LAY250), 8.75 ml deionized water) , thoroughly mixed and immediately measured on the luminometer.
  • the reagents are from SIGMA.
  • the luminescence is in each case in the luminometer Berthold Sirius from Berthold Detection Systems GmbH, Bleichstr. 56-68, 75173 Pforzheim, Germany. 5 wells of a 96-well cell culture plate are evaluated per transfection batch.
  • the ⁇ -galactosidase activity is determined and an average of the 5 individual values is determined.
  • the mean for non-transfected cells is arbitrarily defined as 1.0.
  • the mean values for transfected cells are in relation to the mean value for non-transfected cells applied.
  • a value of, for example, 0.6 corresponds to an inhibition of the ⁇ -galactosidase activity by 40% compared to untreated cells. The results are shown in Fig. 10.
  • HCVPTOl reduces the activity of the ⁇ -galactosidase by 35% and HCVPT02 by 40%.
  • the oligonucleotide HCVPT03 used as a negative control increases the activity by 40% compared to untreated cells.
  • the dsRNAs HCV1-2 and GALl-2 inhibit the ß-
  • Galactosidase activity with comparable efficiency.
  • the activity of the ⁇ -galactosidase decreases in each case by 37% compared to untreated cells.
  • the non-specific control K22 increases the activity by 15% compared to untreated cells.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3'-Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-translatierten Region (3'-UTR), bei welchem eine Struktur innerhalb der 3'-UTR unter Verwendung einer kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) oder eines Antisinn-Oligonukleotids geändert wird.

Description

Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und ein Medikament zur Hemmung der Replikation von Viren.
Die Erfindung betrifft insbesondere das Gebiet der Hemmung von (+) -Strang-RNA-Viren, wie Hepatitis-C-Viren.
Das Genom von (+) -Strang-RNA-Viren ist ein einzelsträngiges kodierendes RNA-Molekül (+ssRNA) . Zu diesen Viren gehören die Familien Picornaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Co- ronaviridae und Caliciviridae. Ein bedeutender Vertreter der Familie Flaviviridae ist das Hepatitis-C-Virus (HCV) . Es verursacht Hepatitis C, eine entzündliche Erkrankung der Leber, die mit Leberfibrose und Leberkrebs verbunden sein kann. Ein erheblicher Teil der Hepatitis-C-Erkrankungen verläuft chronisch. Die Infektion mit HCV erfolgt vor allem pa- renteral, beispielsweise durch Bluttransfusion oder durch Gabe von Medikamenten aus Blutprodukten.
Das Hepatitis-C-Virus wurde 1989 entdeckt (Choo et al . , Science 244: 359, 1989). Die Replikation des kodierenden (+)- Strangs wird durch die Erzeugung eines replikativen antisen- se bzw. (-) -Strangs vermittelt. Vom (-) -Strang werden mehrere Kopien des kodierenden (+) -Strangs abgeschrieben. Das HCV-Genom, welches ca. 9600 Nukleotide umfasst, wird zu einem Polyprotein mit ca. 3000 Aminosäuren translatiert (Leinbach et al., Virology, 204: 163, 1994). Virale und zelluläre Proteasen schneiden aus diesem Polyprotein die funktionsfähigen Viruseiweiße heraus. Sowohl am 5 '-Ende, als auch am 3 ' -Ende des HCV-Genoms , befinden sich hochkonservierte Sequenzen, welche ausgeprägte Sekundär- und TertiärStrukturen ausbilden. Diese Sequenzen besitzen für die Translation und die Replikation der HCV-Viren eine große Bedeutung, werden aber bei der Eiweißsynthese nicht translatiert . Diese Sequenzen werden als 5 ' -UTR und 3 ' -UTR bezeichnet (UTR = untranslated region) .
HCV ist durch eine hohe genetische Variabilität gekennzeichnet. Die hohe Mutationsrate der viralen Nukleinsäure hat zur Entwicklung mehrerer HCV-Genotypen geführt, die eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität von etwa 70 % aufweisen (Simmonds et al . , J. Gen Virol . , 75: 1053, 1994). Die Häufigkeit der einzelnen Genotypen ist regional unterschiedlich. Darüber hinaus"besteht eine Abhängigkeit von der "Art" "^ der Übertragung, wobei eine gleichzeitige Ansteckung mit verschiedenen HVC-Genomen möglich ist. Die hohe Variabilität des HCV erschwert die Behandlung von Erkrankungen erheblich.
Eine Hepatitis-C-Erkrankung umfasst in der Regel mehrere Phasen. Die erste akute Phase beginnt mit der Ansteckung des Patienten mit HCV. Es wird ein Entzündungsvorgang auslöst, der durch einen etwa vier Wochen nach der Ansteckung begin- nenden Anstieg der Leberenzymkonzentration im Blutserum gekennzeichnet ist. Vor dem Anstieg der Leberenzymkonzentration ist es möglich, im Blutserum des Patienten HCV-RNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachzuweisen. In diesem Stadium zeigen nur etwa 25 % der Patienten Symptome wie Gelbsucht, so dass bei 75 % die Infektion unerkannt bleibt. Auch wenn die akute HCV-Infektion eine nicht-maligne Erkrankung ist, führt die Infektion in etwa 80 % zu einer chronischen Lebererkrankung, die durch einen dauerhaften Anstieg des Alaninaminotransferase-Niveaus im Serum gekennzeichnet ist. Aus einer chronischen HCV-Erkrankung entwickelt sich bei mehr als 20 % der Patienten eine Leberzirrhose und bei einer nicht unerheblichen Zahl ein malignes Hepatom. Die Lebenserwartung nach der Diagnose eines malignen Hepatoms beträgt in der Regel zwölf Monate. Bisher bekannte therapeutische Verfahren zur Behandlung von HCV-Infektionen haben nur einen begrenzten Erfolg gehabt und führten bei der Mehrzahl der Patienten zu keiner anhaltenden Besserung. Die heute vorherrschende Therapieform verwendet spezielle Zytokine, die als Interferone bezeichnet werden. Vorzugsweise wird Interferon-α(IFN-alpha) eingesetzt, das nach 6-monatiger Therapie bei etwa 50 % der Patienten zu einer Verringerung der Alaninaminotransferase-Werte im Serum führt. Allerdings steigen diese Werte bei vielen Patienten nach dem Ende der Behandlung wieder an. Überdies ist die Behandlung mit einer"Vierzahl von Nebenwirkungen verbunden (Dusheiko et al, J. Viral Hepatitis, 1: 3, 1994). Trotzdem ist die Interferon-Therapie bisher das wichtigste Verfahren, um das Risiko der Entstehung von Leberzirrhose und eines ma- lignen Hepatoms zu verringern. Ein Impfschutz gegen HCV ist bisher nicht möglich.
Es sind deshalb Versuche unternommen worden, die virale Proteintranslation unter Einsatz spezieller Ribozyme zu hemmen. Beispielsweise beschreiben Welch et al . (Gene Therapy, 3
(11) : 994, 1996) zwei vektorexprimierte Hairpin-Ribozyme, die gegen HCV gerichtet sind. Lieber et al . (Virology, 70 (12): 8782, 1996) beschreiben die Beseitigung von HCV-RNA in infizierten menschlichen Hepatozyten durch Adenovirus-vermittelte Expression von bestimmten Hammerhead-Ribozymen. WO 99/55847 offenbart Ribozyme, die HCV-RNA-Spezies in konservierten Sequenzen in 5 ' - und 3 ' -nicht-kodierenden Bereichen und am 5 ' - Ende des für das Kernprotein kodierenden Bereichs schneiden können. Auch das US-Patent Nr. 5,610,054 offenbart enzymati- sehe Nukleinsäuremoleküle, welche die Replikation von HCV inhibieren können. Der therapeutische Erfolg dieser Verfahren bei der Behandlung von HCV-Infektionen ist jedoch noch nicht erwiesen. Ein generelles Problem besteht darin, dass die en- zy atische Aktivität von Ribozymen vergleichsweise gering ist. Es besteht ein Bedürfnis, weitere Verfahren zur effizi- enten Behandlung von HCV-Infektionen bzw. Virusinfektionen zu entwickeln .
Aus Fire et. al (Nature, 391: 806, 1998) ist es bekannt, dass dsRNA, deren einer Strang abschnittsweise komplementär zu einem zu hemmenden Gen eines Fadenwurms ist, die Expression dieses Gens mit einer hohen Wirksamkeit hemmt. Es wird die Auffassung vertreten, dass die besondere Wirksamkeit der verwendeten dsRNA in Zellen des Fadenwurms nicht auf dem An- tiSinn-Prinzip beruht, sondern möglicherweise auf katalyti- sehe Eigenschaften der dsRNA oder mit dsRNA assoziierten Enzyme zurückzuführen ist. Dieses Verfahren wird als RNA-Interferenz bezeichnet und wird beispielsweise in WO 00/44895 zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens verwen- det.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfahren und eine Verwendung angegeben werden, welche die Replika- tion von Viren wirksam hemmen. Darüber hinaus soll ein Medikament und eine dsRNA angegeben werden, mit dem eine besonders wirksame Hemmung der Replikation von Viren bewirkbar ist .
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 15,
16, 33 und 49 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 14, 17 bis 32, 34 bis 48 und 50 bis 62.
Nach Maßgabe der Erfindung ist verfahrensseitig vorgesehen, dass eine Struktur innerhalb der 3 ' -UTR unter Verwendung einer kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) oder eines Antisinn-Oligonukleotids geändert wird, wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist.
Unter dem Begriff "Struktur" wird hier die Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur einer aus Nukleinsäure gebildeten Sequenz verstanden. Eine Änderung der Struktur liegt z. B. vor, wenn die Primärsequenz geschnitten oder durch Deletionen oder Insertionen verändert wird. Eine Änderung kann auch die Sekundärstruktur, d.h. die Basenpaarung, betreffen. Schließlich ist auch eine Änderung der räumlichen Struktur, d.h. der Tertiärstruktur, möglich. Unter einer kurzen dsRMA wird eine ~ dsRNA verstanden, welche aus weniger als 50 Basenpaaren gebildet ist. Das Antisinn-Oligonukleotid kann sowohl aus DNA als auch aus RNA gebildet sein. Es kann komplementär zu einem Bereich der 3 ' -UTR sein und eine Struktur innerhalb der 3 ' - UTR ändern, indem es damit hybridisiert. Da die Replikation von Viren in der Regel in einer Zelle stattfindet, muss die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid zur Hemmung der Replikation im Allgemeinen in die jeweilige Zelle eingeführt bzw. von der Zelle aufgenommen werden. Das Aufnehmen kann durch die Zelle selbst erfolgen. Es kann aber auch durch Hilfsstoffe oder Hilfsmittel vermittelt werden. Unter der 3 ' -UTR wird entweder der gesamte nicht-translatierte Bereich am 3 ' -Ende des Virus-Genoms oder ein Teil dieses Bereichs verstanden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass durch eine Änderung der Struktur innerhalb der 3 ' -UTR die Replikation des Virus-Genoms gehemmt oder blockiert werden kann und dass dies besonders effektiv unter Verwendung einer dsRNA oder eines Antisinn-Oligonukleotids erreicht werden kann. Damit ist es möglich, Viren mit einer 3 ' -UTR besonders effizient zu bekämpfen.
Nach einer Ausgestaltung kann ein die 3 ' -UTR bildender Se- quenzabschnitt geschnitten werden. Das Schneiden kann dabei durch die dsRNA und die in der Zelle vorhandenen Enzyme bewirkt werden. Die 3 ' -UTR kann hochkonserviert sein. Die Änderung der Struktur wird zweckmäßigerweise in einem besonders hoch konservierten Bereich der 3 ' -UTR bewirkt. Das steigert weiter die Effizienz des Verfahrens, weil viele Virus-Genome, insbesondere das HCV-Genom, eine hohe Sequenzvariabilität aufweisen. Die Auswahl eines hochkonservierten Bereichs eröffnet daher die Möglichkeit der Hemmung der Replikation einer größeren Zahl von Viren als in einem weniger konservier- ten oder variablen Bereich.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, den Sequenzabschnitt unter Verwendung einer kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zu ändern, insbesondere zu schneiden oder dessen Schneiden durch die dsRNA zu bewirken. Ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid kann abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR- Sequenz sein. Darunter wird verstanden, dass entweder ein Abschnitt des Antisinn-Oligonukleotids bzw. des Strangs Sl der dsRNA oder der gesamte Strang Sl der dsRNA bzw. das gesamte Antisinn-Oligonukleotid komplementär zu einem Abschnitt der 3 ' -UTR oder zur vollständigen 3 ' -UTR ist.
Nach einer weiteren Ausgestaltung kann die dsRNA zumindest abschnittsweise doppelsträngig ausgebildet sein. Ein Ende der dsRNA, vorzugsweise beide Enden, können glatt ausgebildet sein. Glatt bedeutet, dass das Ende eines Strangs nicht über das Ende des anderen Strangs der dsRNA hinausragt, d.h. keinen Überhang bildet. Zumindest ein Strang, insbesondere der Strang Sl, kann am 3 ' -Ende einen Überhang haben, der aus 1 bis 3, vorzugsweise 2, Nukleotiden bestehen kann. Die vorerwähnten Merkmale beeinflussen die Plasmastabilität der dsRNA. dsRNA mit zumindest einem glatten Ende weist eine höhere Plasmastabilität als dsRNA mit, insbesondere beidseitigen, Überhängen auf, d.h. sie wird in Plasma bzw. Blut weniger schnell abgebaut. Darüber hinaus ist die Stabilität einer solchen dsRNA im Zellinneren größer als diejenige einer dsRNA mit Überhängen. Die Stabilität, insbesondere die Plasmastabilität, kann also durch die jeweilige Konstruktion der dsRNA an die jeweiligen Erfordernisse angepasst werden. Einzel- strängige Überhänge verringern die Stabilität der dsRNA in Blut, Serum und Zellen und verstärken gleichzeitig die replikationshemmende Wirkung der dsRNA. Besonders effektiv ist die Hemmung der Replikation, wenn die dsRNA den Überhang aus- schließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende~a fwerst : Das andere Ende ist" dann bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der replikationshemmenden Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend beständig und besonders wirksam erwiesen.
Weiterhin hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn ein zumindest abschnittsweise zur 3 ' -UTR-Sequenz komplementärer Bereich der dsRNA bzw. des Strangs Sl weniger als 30, vorzugs- weise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare bzw. Basen umfasst. Die dsRNA weist zweckmäßigerweise eine Länge von weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare auf. Damit entspricht die Länge der dsRNA im Wesentlichen der Länge des komplementären Bereichs. Eine solche dsRNA kann besonders preisgünstig hergestellt werden.
Zweckmäßigerweise ist das Virus-Genom das Genom eines (+)- Strang-RNA-Virus, insbesondere eines Hepatitis-C-Virus. Die dsRNA kann in einer Lösung, insbesondere in einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegen. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einer solchen Lösung gelöste dsRNA von Zellen aufgenommen wird und die Replikation der Viren hemmt, ohne dass die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss . Die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid kann auch von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus- Kapsid oder einem Kapsoid umschlossen vorliegen. Dadurch kann die Aufnahme in Zellen erleichtert sein. Darüber hinaus wird dadurch die Möglichkeit gegeben, die dsRNA" "durch bestimmte Oberflächenstrukturen gezielt zu bestimmten Zellen zu steuern, so dass vor allem diese Zellen die dsRNA aufnehmen. Die dsRNA kann einen Sinn-Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 und einen Antisinn-Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 5 aufweisen. Das Antisinn-Oligonukleotid kann einen Strang mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13 aufweisen. "SEQ ID NO" bezeichnet jeweils die Nummer einer Sequenz im anliegenden Sequenzprotokoll.
Erfindungsgemäß ist weiter die Verwendung von kurzen doppel- strängigen Ribonukleinsäuren (dsRNA) oder eines Antisinn- Oligonukleotids zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-transla- tierten Region (3' -UTR) durch Änderung einer Struktur innerhalb der 3 ' -UTR zur Behandlung einer Virusinfektion vorgesehen. Weiterhin ist die Verwendung einer solchen dsRNA oder eines solchen Antisinn-Oligonukleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-translatierten Region (3' -UTR) durch Änderung einer Struktur innerhalb der 3 ' -UTR vorgesehen. Bei beiden Verwendungen ist ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren. Die dsRNA kann in einer Zubereitung vorliegen, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Solche Zubereitungen sind aus der Pharmazie bekannt. Die dsRNA kann dabei in einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegen.
Vorzugsweise liegt die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, eineπr"Vi~rus-Kapsid oder einem Kapsoid umschlossen vor: Die dsRNA kann oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenöser oder intraperitonealer Infusion oder Injektion, verabreicht werden. Vorzugsweise wird die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, pro kg Körpergewicht und Tag einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, verabreicht.
Zur Lösung der Aufgabe wird ferner ein Medikament vorgeschlagen, bei dem zur Änderung der Struktur innerhalb der 3 ' -UTR eine kurze doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) oder ein Antisinn-Oligonukleotid enthalten ist, wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist. Ferner betrifft die Erfindung eine dsRNA mit einem Strang Sl, welcher abschnittsweise oder vollständig zu einer am 3 ' -Ende eines Virus-Genoms befindlichen nicht-transla- tierten Region (3' -UTR) komplementär ist.
Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verwendung und des erfindungsgemäßen Medikaments wird auf die zum Verfahren beschriebenen Merkmale verwiesen, welche sinngemäß auch hier Anwendung finden können. Nachfolgend wird anhand der Figuren ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 den relevanten Sequenzbereich aus Plasmid p2 und die N-terminale Aminosäuresequenz des entsprechenden Reporterproteins,
Fig. 2 den relevanten Sequenzbereich aus Plasmid p3 und die N-terminale Aminosäuresequenz des ent- sprechenden Reporterproteins,
Fig. 3 die dsRNA HCVl-2 (SEQ ID NO 4 , SEQ ID NO 5) gegenüber der HCV-Sequenz einer mittels der Plasmide p2 und p3 gebildeten mRNA (SEQ ID NO 15),
Fig. 4 die dsRNA GAL1-2 (SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 ) gegenüber einer dem ß-Gal-Gen entsprechenden mRNA-Sequenz (SEQ ID NO 16) (Positivkontrolle) ,
Fig. 5 die dsRNA HCV3-4 (SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9), welche keinen Bezug zu exprimierten Genen aufweist (Negativkontrolle) ,
Fig. 6 die dsRNA K22 (SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11), welche keinen Bezug zu exprimierten Genen aufweist (Negativkontrolle) ,
Fig. 7 die Antisinn-Oligonukleotide HCVPTOl (SEQ ID NO 12), HCVPT02 (SEQ ID NO 13) und HCVPT03 (SEQ ID NO 14) gegenüber der HCV-Sequenz einer mittels des Plasmids p3 gebildeten mRNA (SEQ ID NO 15) ,
Fig. 8 Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen der dsRNAs HCVl-2, GALl-2 und HCV3-4 auf die Akti- vität der mittels des Plasmids p2 exprimierten ß-Galaktosidase,
Fig. 9 Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen der dsRNAs HCV1-2, GAL1-2 und HCV3-4 auf die Aktivität der mittels des Plasmids p3 exprimierten ß-Galaktosidase und
Fig. 10 Wirkung der Antisinn-Oligonukleotide HCVPTOl, HCVPT02, HCVPT03, der dsRNAs HCV1-2, GALl-2,
K22 uncj einer Kontrol -dsRNA~ auf"- die Aktivität der mittels des Plasmids p3 exprimierten ß- Galaktosidase .
Ausführungsbeispiel
Molekularbiologische Analysen mit Hepatitis-C-Viren in Zellkultur sind sehr schwierig. Der Effekt der RNA-Interferenz und von Antisinn-RNA auf virale Gensequenzen wird an Hand nicht-pathogener Ersatzsysteme untersucht. Als nicht-pathoge- nes Reportersystem zum Studium der RNA-Interferenz und der Wirkung von Antisinn-Oligonukleotiden wurde die Sequenz Nr. 1 des Sequenzprotokolls vor ein für E. coli-ß-Galaktosidase kodierendes Gen eines Plasmids kloniert . Die Sequenz Nr. 1 ent- spricht einer 24 Nukleotide umfassenden Sequenz aus einem hochkonservierten Bereich des 3 ' -UTR des HCV-Genoms . Nach Transfektion des Plasmids in humane HuH-7-Leberzellen wird die Sequenz als Teil einer für ß-Galaktosidase kodierenden mRNA transkribiert. Die den 24 Nukleotiden entsprechende Se- quenz der mRNA ist dann identisch mit der Sequenz des HCV- Genoms. Sie wurde als Zielsequenz verwendet. Herstellung von Plasmid p2 und p3 als Reportersystem
Das E. coli-ß-Galaktosidase (ß-Gal) -Gen wurde aus dem kommerziell erhältlichen Expressionsvektor pßGal-Control (BD Biosciences Clontech, Tullastrasse 4, D-69126 Heidelberg, Deutschland, Gene Accession Number U13186; Nukleotid 280- 3429) isoliert.
In Plasmid p2 ist die HCV-Sequenz Teil eines Fusionsgens. Die HCV-Sequenz ist Teil des offenen Leserahmens der für ß- "Galaktosidase kodierenden Sequenz, "so dass" "auch-die HCV-Sequenz als Teil eines Fusionsproteins exprimiert wird. Fig. 1 zeigt den relevanten Sequenzabschnitt von Plasmid p2 gemäß Sequenz Nr. 2 des Sequenzprotokolls. Die HCV-Sequenz ist kur- siv dargestellt. Der Beginn des ß-Gal-Gens (einschließlich 6 Nukleotide der Kozak-Sequenz vor dem Codon ATG)ist unterstrichen. Die N-terminale Aminosäuresequenz des Fusionsproteins HCV-ß-Galaktosidase ist unter der DNA-Sequenz aufgeführt.
Auch in Plasmid p3 ist die HCV-Sequenz Teil eines Fusionsgens . Die HCV-Sequenz befindet sich aber außerhalb des offenen Leserahmens der für ß-Galaktosidase kodierenden Sequenz, so dass die HCV-Sequenz nicht als Teil eines Fusionsproteins exprimiert wird. Fig. 2 zeigt den relevanten Sequenzabschnitt von Plasmid p3 gemäß Sequenz Nr. 3 des Sequenzprotokolls. Die HCV-Sequenz ist kursiv dargestellt. Der Beginn des ß-Gal-Gens (einschließlich 6 Nukleotide der Kozak-Sequenz vor dem Startcodon ATG)ist unterstrichen. Die N-terminale Aminosäuresequenz der exprimierten ß-Galaktosidase ist unter der DNA-Se- quenz aufgeführt.
Die so generierten Fusionsgene wurden in das kommerziell erhältliche Expressionsplasmid pcDNA3.1 (+) kloniert (Invitrogen, Life Technologies, Technologiepark Karlsruhe, Emmy- Noether-Str. 10, D-76131 Karlsruhe, Deutschland, Katalognum- mer V790-20) . Dieses Plasmid enthält ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Neomycin. Es verleiht den damit transfizier- ten HuH-7-Zellen eine Resistenz gegen das Neomycin-Analogon G418, so dass in Gegenwart von G418 nur HuH-7-Zellen selek- tioniert werden, welche das Plasmidgenom und damit das Reportergen stabil in ihr Genom aufgenommen haben.
Als Kontrollplasmid für die Transfektionseffizienz wurde das kommerziell erhältliche Plasmid pGL3-ctrl (Promega GmbH, High-Tech-Park, Schildkrötstr. 15, D-68199 Mannheim, Deutschland, ~Gen~e~ÄC"C"es"sion "Nu ber U47296) verwendet. Es" kodiert und exprimiert das Gen der "Firefly Luciferase" .
Verwendete dsRNA-Qligonukleotide Zur Durchführung der RNA-Interferenz wurden drei kurze, dop- pelsträngige Ribonukleinsäuren (dsRNA) verwendet. Diese dsRNAs bestehen aus jeweils 2 kurzen Oligoribonukleotiden, welche über fast den gesamten Sequenzbereich zueinander komplementär sind. An beiden 3 ' -Enden der Oligoribonukleotide besitzen jeweils zwei Nukleotide keine Partner und bilden deshalb in der dsRNA Überhänge.
Die Sequenz des einen Oligoribonukleotids ist identisch mit der Zielsequenz der mRNA. Dieses Oligonukleotid wird deshalb als Sinn-Strang bezeichnet. Die Sequenz des anderen Oligonu- kleotids ist zu der Zielsequenz der mRNA komplementär. Dieses Oligonukleotid wird deshalb als Antisinn-Strang bezeichnet.
In Fig. 3 ist das als HCVl-2 bezeichnete doppelsträngige Oli- goribonukleotid gegenüber der HCV-Sequenz der mittels der Plasmide p2 und p3 gebildeten mRNA dargestellt. Dabei entsprechen die mit Großbuchstaben dargestellten Nukleotide der HCV-Sequenz in den Plasmiden p2 und p3. HCV1-2 besteht aus dem Sinn-Strang HCV 1 und dem Antisinn-Strang HCV 2, wobei jeweils zwei Nukleotide an den 3 ' -Enden der Stränge keinen Partner aufweisen. Der in Sequenz Nr. 4 des Sequenzprotokolls dargestellte Sinn-Strang (HCV 1) weist nahezu dieselbe Nu- kleotidsequenz wie die HCV-Sequenz einer mittels der Plasmide p2 bzw. p3 gebildeten mRNA auf. Am 5 ' -Ende fehlen drei Nu- kleotide der HCV-Sequenz und am 3 ' -Ende befinden sich zwei Nukleotide, die nicht Bestandteil der HCV-Sequenz sind. Der in Sequenz Nr. 5 des Sequenzprotokolls dargestellte Antisinn- Strang (HCV 2) ist abgesehen von den zwei Nukleotiden am 3 ' - Ende komplementär zu HCV 1 und damit auch zu der HCV-Sequenz einer mittels der Plasmide p2 bzw. p3 gebildeten mRNA. Die HCV-Sequenz" entspricht einer 3 ' -nicht-translatierten Region des HCV-Genoms .
Zur positiven Kontrolle wurde eine als GALl-2 bezeichnete dsRNA verwendet. Diese ist in Fig. 4 gegenüber einer dem ß- Gal-Gen der Plasmide p2 und p3 entsprechenden mRNA-Sequenz (in Fig. 4 als mRNA bezeichnet) dargestellt. GALl-2 besteht aus dem Sinn-Strang Gal 1 und dem Antisinn-Strang Gal 2, wobei jeweils zwei Nukleotide an den 3 ' -Enden der Stränge kei- nen Partner aufweisen. Der in Sequenz Nr. 6 des Sequenzprotokolls dargestellte Sinn-Strang (Gal 1) weist nahezu dieselbe Nukleotidsequenz wie die dem ß-Gal-Gen entsprechende mRNA- Sequenz auf. Der in Sequenz Nr. 7 des Sequenzprotokolls dargestellte Antisinn-Strang (Gal 2) ist abgesehen von den zwei Nukleotiden am 3 ' -Ende komplementär zu Gal 1 und damit auch zu der dem ß-Gal-Gen entsprechenden mRNA-Sequenz .
Zur negativen Kontrolle wurde in einem Teil der Versuche eine als HCV3-4 bezeichnete dsRNA verwendet, die keinen Bezug zu hier exprimierten Genen hat (Fig. 5) . HCV3-4 besteht aus dem
Sinn-Strang HCV 3 und dem Antisinn-Strang HCV 4, wobei jeweils zwei Nukleotide an den 3 ' -Enden der Stränge keinen Partner aufweisen. Der in Sequenz Nr. 8 des Sequenzprotokolls dargestellte Sinn-Strang (HCV 3) weist nahezu keine Ähnlich- keit zur mittels der Plasmide p2 und p3 gebildeten mRNA auf und ist deshalb ohne Bezug zu den exprimierten Genen. Der in Sequenz Nr. 9 des Sequenzprotokolls dargestellte Antisinn- Strang (HCV 4) ist abgesehen von den zwei Nukleotiden am 3 ' - Ende komplementär zu HCV 3 und ist deshalb ebenfalls ohne Be- zug zur gebildeten mRNA.
Als Negativkontrolle wurde in einem anderen Teil der Versuche eine als K22 bezeichnete dsRNA verwendet, die ebenfalls keinen Bezug zu einem hier exprimierten Gen aufweist (Fig. 6) . Die Sequenzen der beiden die dsRNA bildenden Oligoribonukleo- tide "sind""irr"den""S"e"quenzen"Nr . 10 und 11 des Sequenzproto-_~ kolls dargestellt.
Zur Durchführung der Experimente mit Antisinn-Oligoribonu- kleotiden wurden drei jeweils 21 Nukleotide lange DNA-Anti- sinn-Oligonukleotide als Phosphothioate eingesetzt. Die Oli- gonukleotide wurden von der Firma Metabion GmbH, Lena-Christ- Str. 44, D-82152 Martinsried, Deutschland bezogen. Sie werden hier als HCVPTOl, HCVPT02 und HCVPT03 bezeichnet. HCVPTOl und HCVPT02 sind zu unterschiedlichen Bereichen der mittels des
Plasmids p3 gebildeten HCV-mRNA-Sequenz komplementär. HCVPT03 ist als Negativkontrolle ohne Bezug zur Zielsequenz. HCVPTOl, HCVPT02 und HCVPT03 sind gegenüber der HCV-mRNA-Sequenz in Fig. 7 dargestellt.
Für den Nachweis der RNA Interferenz wurden Experimente mit Leberzelllinien des Typs HuH-7 durchgeführt (Nakabayashi et al . 1982). Diese Zelllinie kann durch HCV infiziert werden und dient zur Kultivierung dieser Viren. Die Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium) mit 10 % fötalem
Kälberserum (FCS) kultiviert. a) Versuche zur RNA-Interferenz
Transfektion
Zur Vorbereitung einer Transfektion wurden 2 x 104 Zellen pro Vertiefung einer 96-well Zellkulturplatte ausgesät. 3 μg Plasmid p2 bzw. Plasmid p3 wurden mit 1 μg Kontrollplasmid pGL3-ctrl. gemischt. Es wurden 0,25 μg dieser Plasmidgemi- sche pro Vertiefung zur Transfektion eingesetzt. Etwa 24 Stunden nach dem Aussäen der Zellen wurden die Reporterplas- mide p2/pGL3-ctrl und p3/pGL3-ctrl zusammen mit dsRNA in
HuH-7 transfiziert—"Die Menge an transfizierter DNA—pro "Vertiefung war konstant.
Die Menge an dsRNA wurde in abnehmenden Konzentrationen von 400 nmol/1 bis 12,5 nmol/1 (in Bezug auf 110 μl Transfekti- onsvolumen) zu den Plasmidgemisehen zugegeben. Die Ausgangskonzentration der dsRNAs HCVl-2, GAL1-2 und des unspezifischen HCV3-4 in der jeweiligen Stammlösung betrug jeweils 20 μmol/1. Die dsRNAs wurden durch Mischen mit gleichen Vo- lumina Annealing buffer (AB, 100 mmol/1 NaCl, 20 mmol/1 Na- Phosphat, pH 6,8) stufenweise auf die Endkonzentration verdünnt .
Für eine Endkonzentration von 400 nmol/1 wurden bei einer Stammkonzentration an dsRNA von 20 μmol/1 2,2 μl Stammlösung auf 110 μl Transfektionsvolumen pro 1 Well bzw. 6,6 μl Stammlösung auf 330 μl Transfektionsvolumen pro 1 Well verwendet. Die Verdünnungsstufen wurden gemäß Tabelle 1 hergestellt. Tabel le 1
Herstellung von Verdünnungsstufen der dsRNA
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* Endkonzentration unter Verwendung von 6 , 6 μl der j eweiligen Lösung auf 330 μl Transf ektionsvolumen
Plasmide und dsRNA wurden co-transfiziert . Als Transfekti- onsagens wurde Gene Porter 2 (PeQLab, Carl-Thiersch-Str . 2B, D-91052 Erlangen, Deutschland, Katalognummer 13-T202007) eingesetzt. Jede Co-Transfektion wurde dreifach durchgeführt .
Für drei Vertiefungen in 96-well-Platten wurde ein Gemisch aus 2,0 μl eines Plasmidgemisches aus Plasmid p2 und Kon- trollplasmid pGL3 (0,3875 μg/μl; 3 : 1), 6,6 μl dsRNA (20,
10, 5, 2,5, 12,5 bzw. 0,62 μmol/1) und 16,4 μl DNA-Diluent B (wird zusammen mit Gene Porter 2 von der Firma PeQLab geliefert) hergestellt. Dieses Gemisch wurde mit einem Gemisch aus 6,0 μl Gene Porter 2 und 19 μl Serumfreiem Medium vermischt. Das Gesamtvolumen des so erhaltenen Gemisches betrug 50 μl, von denen 16,5 μl zu jeweils 2 x 104 HuH-7 in 100 μl Medium gegeben wurden . Weiterhin wurde ein Gemisch aus 2,0 μl eines Plasmidgemisches aus Plasmid p3 und Kontrollplasmid pGL3 (0,3875 μg/μl; 3 : 1), 6,6 μl dsRNA (20, 10, 5, 2,5, 12,5 bzw. 0,62 μmol/1) und 16,4 μl DNA-Diluent B hergestellt. Dieses Gemisch wurde mit einem Gemisch aus 6,0 μl Gene Porter 2 und 19 μl Serumfreiem Medium vermischt. Das Gesamtvolumen des so erhaltenen Gemischs betrug 50 μl, von denen 16,5 μl zu jeweils 2 x 104 HuH-7 in 100 μl Medium gegeben wurden.
Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C und 5% C02 inkubiert. Einen Tag nach der Transfektion wurden"3"5~μr "frisches Medium pro Vertiefung zugegeben und die Zellen weitere 24 h inkubiert. Dann erfolgte der Aufschluss der Zellen.
Verwendete Nachweismethoden
Der Effekt der dsRNA auf die Expression der Reportergene wurde durch Quantifizierung der ß-Galaktosidase- und Lucife- rase-Aktivität mittels Chemilumineszenz bestimmt. Dazu wurden Lysate mittels dem Tropix-Lysepuffer der Firma Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404 USA; Cat. No. BD100LP gemäß den Herstellervorschriften hergestellt .
Zur Quantifizierung der ß-Galaktosidase-Aktivitität wurden 2 μl Lysat pro Analyse sowie das Substrat Galcto-Star
(Applied Biosystems, Tropix, Katalognummer BM100S) gemäß den Herstellervorschriften verwendet. Zur Quantifizierung der Lu- ciferase-Aktivität wurden 5 μl Lysat pro Analyse sowie das Substrat Luciferin (Applied BiOOosystems , Tropix, Katalognum- mer BCIOOL) gemäß den Herstellervorschriften verwendet. Die Lumineszenz ist jeweils in dem Luminometer Berthold Sirius der Firma Berthold Detection Systems GmbH, Bleichstrasse 56- 68, D-75173 Pforzheim, Deutschland, gemessen worden. Ergebnisse
Pro Transfektionsansatz wurden drei 96-well-Vertiefungen ausgewertet, wobei jeweils eine Messung für ß-Galaktosidase und eine Messung für Luciferase erfolgte. Der Quotient aus relativen Lichteinheiten (RLU) für ß-Galaktosidase und den relativen Lichteinheiten für Luciferase wurde berechnet. Für diese drei Einzelwerte wurde ein Mittelwert ermittelt. Der Mittelwert für p2/pGL3- bzw. p3/pGL3-transfizierte Zellen ohne dsRNA wurde willkürlich als 1,0 definiert. Die unter dsRNA-Einfluss veränderten Werte werden im Verhältnis zu 1,0 aufgetragen (siehe FigT 8 und 9), d.h. ein Wert von 0,6 entspricht einer Hemmung der ß-Galaktosidase-Aktivität um 40 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
Aus Fig. 8 ist zu erkennen, dass bei einer Co-Transfektion von sequenzspezifischer dsRNA mit Plasmid p2 eine Reduktion der ß-Galaktosidase-Aktivität erfolgt. Die dsRNAs HCV1-2 und GAL1-2 hemmen die ß-Galaktosidase mit vergleichbarer Effizienz. Bei 400 nmol/1 und 200 mol/1 dsRNA im Transfektionsvolu- men sinkt die Aktivität der ß-Galaktosidase auf 40 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Mit abnehmender Konzentration der dsRNA lässt der hemmende Effekt nach. Die Kontroll-dsRNA HCV3-4 führt über den gesamten Konzentrationsbereich zu keiner Abnahme an ß-Galaktosidase-Aktivität im Lysat.
Bei einer Co-Transfektion von sequenzspezifischer dsRNA HCV1- 2 mit Plasmid p3 ist ebenfalls eine Reduktion der ß-Galakto- sidase-Expression nachweisbar (Fig. 9). Die dsRNAs HCVl-2 und GALl-2 hemmen die ß-Galaktosidase-Aktivität mit ver- gleichbarer Effizienz. Bei 400 nmol/1 und 200 nmol/1 dsRNA im Transfektionsvolumen sinkt die Aktivität der ß- Galaktosidase auf etwa 20 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Mit abnehmender Konzentration der dsRNA lässt der hemmende Effekt nach. Die Kontroll-dsRNA HCV3-4 zeigt über den gesamten Konzentrationsbereich eine schwache Hemmung der ß-Galaktosidase-Aktivität auf etwa 70 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen.
In Gegenwart von dsRNA HCVl-2 war somit sowohl für Plasmid p2 als auch Plasmid p3 eine deutliche Reduktion der ß-Galaktosidase-Aktivität erkennbar. Vergleichbare Effekte zeigte dsRNA GAL1-2 (positive Kontrolle) . Die zweite Kontroll-dsRNA HCV3-4 führte zu keiner bzw. einer deutlich geringeren Hemmung der ß-Galaktosidase-Aktivität.
'Die Expression'uήcϊ/oder die Stabilität der RNA konnte im be-" schriebenen Experiment durch dsRNA stark gemindert werden. Dies gelang auch für HCV-ZielSequenzen außerhalb des offenen Leserahmens, welches der Situation für den natürlichen 3'- UTR Bereich von HCV entspricht.
b) Versuche mit Antisinn-DNA-Oligonukleotiden
Zur Vorbereitung der Experimente wurde p3 mittels Lipofecta- minePLUS (GIBCO BRL Life Technologies, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether-Str . 10, D-76131 Karlsruhe, Deutschland) in HuH-7-Zellen stabil transfiziert . Hierfür wurden 2 x 10E4 Zellen pro Vertiefung einer 96-well-Zellkulturplatte ausgesät. Nach 24 h wurde das Medium abgezogen und durch 50 μl serumfreies Medium (DMEM) ersetzt. Das Transfektionsgemisch bestand aus 0,2 μg p3, 16,7 μl DMEM, 2 μl PLUS Reagenz und 1 μl Lipofectamine Reagenz. Die Transfektion wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach 3 h wurde das Trans- fektionsmedium durch 150 μl Vollmedium (DMEM + 10 % Fötales Kälberserum) ersetzt. Nach 48 h wurden die Zellen in Vertiefungen einer 12-well-Zellkulturplatte überführt und in Gegenwart von 400 μg/ml G418 (Amersham Biosciences, Munzinger Str. 9, D-79111 Freiburg, Deutschland) in Vollmedium kultiviert. Wachsende Zellhaufen wurden regelmäßig entnommen und in neue Vertiefungen einer 12-well-Zellkulturplatte überführt. Aus diesen wurden nach 14 - 21 Tagen wachsende Zellen in neuen Vertiefungen vereinzelt und bis zum Ende der Selektion in Gegenwart von 400 μg/ml G418 kultiviert. Nach etwa drei Vereinzelungen wurde mit Hilfe von Enzymmessungen die Aktivität an ß-Galaktosidase wie unten beschrieben bestimmt. Des Weiteren wurden mit X-Gal-Färbungen die Zahl der Galaktosidase-expri- mierenden Zellen festgestellt. Hierzu wurde das Medium abgezogen und die Zellen in Vertiefung einer 96-well-Zellkultur- platte über Nacht in 100 μl X-Gal-Lösung (10 mmol/1 Na-Phos- phat pH 7,0, 1 mmol/1 MgCl2, 150 mmol/1 NaCl, 3,3 mmol/1
K4Fe(CN)6*3H20, 3,3 mmol7"l"K3Fe"(CN) 6, 0,2 % X-Gal) (X-Gal von— PeQLab, Erlangen, Deutschland; alle anderen Chemikalien von SIGMA, Grünwalder Weg 30, D-82024 Taufkirchen, Deutschland) gefärbt. Der beste Klon wurde als "HuH-7 blue" bezeichnet und für die Experimente eingesetzt.
Transfektion mit dsRNA und Antisinn-DNA-Oligonukleotiden Zur Vorbereitung einer Transfektion wurden 2 x 10E4 Zellen HuH-7 blue in 100 μl DMEM + 10 % FCS pro Vertiefung einer 96- well-Zellkulturplatte ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die dsRNA und die Antisinn-DNA-Oligonukleotide transfiziert . Für diese Transfektionen wurde Fugene 6 (Röche Applied Sciences, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Deutschland; Katalognummer 1814443) eingesetzt. Je 5 Vertiefungen mit HuH7 blue Zellen wurden nicht behandelt. Von den dsRNAs HCV 1-2, GAL 1- 2 und K22 wurden jeweils Stammlösungen mit einer Konzentration von 20 μmol/1 hergestellt. Von dieser Stammlösung sind jeweils 1,6 μl mit 0,9 μl Fugene 6 und 108 μl DMEM gemischt worden. Die dsRNA liegt dann in einer Konzentration von 50 nmol/1 vor. Jeweils 5 Vertiefungen einer 96-well-Zellkultur- platte wurden mit je 20 μl dieses Ansatzes transfiziert .
Von den Antisinn-DNA-Oligonukleotiden HCVPTOl, HCVPT02 und HCVPT03 sind jeweils Stammlösungen mit einer Konzentration von 100 μmol/1 hergestellt worden. Von diesen Stammlösungen sind jeweils 1,2 μl mit 2 , 4 μl Fugene 6 und 108 μl DMEM gemischt worden. Die dsRNA liegt dann in einer Konzentration von 200 nmol/1 vor. Jeweils 5 Vertiefungen einer 96-well- Zellkulturplatte wurden mit je 20 μl dieses Ansatzes transfi- ziert.
Nachweismethoden
Der Effekt der dsRNA-Oligonukleotide und Antisinn-DNA-Oligo- nukleotide auf die Expression der Reportergene wurde durch Quantifizierung der ß-Galaktosidase-Aktivität durch Chemilu- mineszenz bestimmt. Dazu wurden""Lysäte "mittels dem Tropix-" Lysepuffer der Firma Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404 USA; Katalognummer BD100LP gemäß den Herstellervorschriften hergestellt. Die Chemilumineszenz- messung wurde wie folgt durchgeführt:
Pro Reaktionsgefäß wurden 5 μl Lysat vorgelegt und auf 30 μl mit ß-Gal-Assay-Puffer (1 ml 1 mol/1 Na-Phosphat-Puffer, pH 8,0, 10 μl 1 mol/1 MgCl2, 10 μl 1,25 mg/ml Galakton (Tropix GC020, Applied Biosystems), 9 ml entionisiertes Wasser) aufgefüllt. Nach 30 Minuten Inkubation ist mit ß-Gal-Stopp-Mix (1 ml 2 mol/1 NaOH, 250 μl 2,5 % Emerald Enhancer (Applied Biosystems, Tropix, LAY250) , 8,75 ml entionisiertes Wasser) auf 100 μl aufgefüllt, gründlich gemischt und sofort am Lumi- nometer gemessen worden. Wenn nicht anders angegeben, stammen die Reagenzien von der Firma SIGMA. Die Lumineszenz ist jeweils in dem Luminometer Berthold Sirius der Firma Berthold Detection Systems GmbH, Bleichstr. 56-68, 75173 Pforzheim, Deutschland, gemessen worden. Pro Transfektionsansatz werden je 5 Vertiefungen einer 96-well-Zellkulturplatte ausgewertet. Dazu wird jeweils die ß-Galaktosidase-Aktivität bestimmt und ein Mittelwert der 5 Einzelwerte ermittelt. Der Mittelwert für nicht-transfizierte Zellen wird willkürlich als 1,0 definiert. Die Mittelwerte für transfizierte Zellen werden im Verhältnis zu dem Mittelwert für nicht-transfizierte Zellen aufgetragen. Ein Wert von beispielsweise 0,6 entspricht einer Hemmung der ß-Galaktosidase-Aktivität um 40% im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt.
Ergebnisse
Bei der Transfektion von sequenzspezifischen Antisinn-Oligo- nukleotiden (200 nmol/1) und dsRNA Oligonukleotiden (50 nmol/1) in die Zelllinie HuH-7 blue ist eine Reduktion der ß- Galaktosidase-Aktivität nachweisbar." HCVPTOl reduziert die Aktivität der ß-Galaktosidase um 35 % und HCVPT02 um 40 %. Das als Negativkontrolle eingesetzte Oligonukleotid HCVPT03 steigert die Aktivität um 40 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die dsRNAs HCV1-2 und GALl-2 hemmen die ß-
Galaktosidase-Aktivität mit vergleichbarer Effizienz. Die Aktivität der ß-Galaktosidase sinkt jeweils um 37 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die unspezifische Kontrolle K22 steigert die Aktivität um 15 % im Vergleich zu unbehan- delten Zellen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-transla- tierten Region (3' -UTR),
dadurch gekennzeichnet, dass
eine Struktur innerhalb der 3 ' -UTR unter Verwendung einer kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) oder eines Antisinn-Oligonukleotids geändert-wi"rd, "wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein die 3 ' -UTR bildender Sequenzabschnitt geschnitten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Struktur in einem hochkonservierten Bereich der 3 ' -UTR geändert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA zumindest abschnittsweise doppelsträngig ausgebildet ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Ende der dsRNA, vorzugsweise beide Enden, glatt sind.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Strang, insbesondere der Strang Sl, der dsRNA am 3 ' -Ende einen Überhang hat.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Überhang aus 1 bis 3 Nukleotiden, vorzugsweise 2 Nukleotiden, gebildet ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zumindest abschnittsweise zur 3 ' -UTR-Sequenz komplementärer Bereich der dsRNA weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare umfasst.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA eine Länge von weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare aufweist .
"10. Verfahren nach einem der"vorhergehenden Ansprüche, wobei das Virus-Genom das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der (+) -Strang-RNA-Virus ein Hepatitis-C-Virus ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid oder einem Kapsoid umschlossen vorliegt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA einen Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 und einen Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 5 oder wobei das Antisinn-Oligonukleotid einen Strang mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13 aufweist.
15. Verwendung von kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäuren (dsRNA) oder eines Antisinn-Oligonukleotids zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-translatierten Region (3' -UTR) durch Ände- rung einer Struktur innerhalb der 3 ' -UTR, wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist .
16. Verwendung von kurzen doppelsträngigen Ribonukleinsäuren (dsRNA) oder einer Antisinn-Oligonukleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-transla- tierten Region (3' -UTR) durch Änderung einer Struktur innerhalb"""der™3~'~-UTR, wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei ein die 3'- UTR bildender Sequenzabschnitt mittels der dsRNA geschnitten wird oder dessen Schneiden durch die dsRNA bewirkt wird.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die 3 ' -UTR hochkonserviert ist.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die dsRNA zumindest abschnittsweise doppelsträngig ausgebildet ist .
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei ein Ende der dsRNA, vorzugsweise beide Enden, glatt sind.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei zu- mindest ein Strang, insbesondere des Strangs Sl, der dsRNA am
3 ' -Ende einen Überhang hat.
22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Überhang aus 1 bis 3 Nukleotiden, vorzugsweise 2 Nukleotiden, gebildet wird.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei ein zumindest abschnittsweise zur 3 ' -UTR-Sequenz komplementärer Bereich der dsRNA weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare umfasst.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei die dsRNA eine Länge von weniger als 30, vorzugsweise weniger als
25. besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare aufweist.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei das "Virus-Genom das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus ist.
26. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 25, wobei der (+) -Strang-RNA-Virus ein Hepatitis-C-Virus ist.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 26, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 27, wobei die dsRNA in einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegt.
29. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 28, wobei die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid oder einem Kapsoid umschlossen vorliegt.
30. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 29, wobei die dsRNA oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenöser oder intraperitonealer Infusion oder Injektion, verabreicht wird.
31. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 30, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, pro kg Körpergewicht pro Tag einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, verabreicht wird.
32. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 31, wobei die dsRNA einen Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 und einen Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder wobei das Anti- sinn-Oligonukleotid einen Strang mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder "SEQ" ID NO: 13 aufweist"."
33. Medikament zur Hemmung der Replikation von Viren mit einer am 3 ' -Ende des Virus-Genoms befindlichen nicht-transla- tierten Region (3' -UTR),
dadurch gekennzeichnet, dass
zur Änderung der Struktur innerhalb der 3 ' -UTR eine kurze doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) oder ein Antisinn- Oligonukleotid enthalten ist, wobei ein Strang Sl der dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid abschnittsweise oder vollständig komplementär zur 3 ' -UTR-Sequenz der Viren ist.
34. Medikament nach Anspruch 33, wobei die kurze doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) oder das Antisinn-Oligonukleotid den 3 ' -UTR bildenden Sequenzabschnitt schneidet oder dessen Schneiden bewirkt.
35. Medikament nach Anspruch 33 oder 34, wobei die 3 ' -UTR hochkonserviert ist.
36. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 35, wobei die dsRNA zumindest abschnittsweise doppelsträngig ausgebildet ist.
37. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei ein Ende der dsRNA, vorzugsweise beide Enden, glatt sind.
38. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei zumindest ein Strang, insbesondere der Strang Sl, der dsRNA am 3 ' -Ende einen Überhang hat .
39. Medikament nach Anspruch 38, wobei der Überhang aus 1 bis 3 Nukleotiden, vorzugsweise 2 Nukleotiden, gebildet ist.
40. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 39, wobei ein zumindest abschnittsweise zur 3 ' -UTR-Sequenz komplementärer Bereich der dsRNA weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare umfasst.
41. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 40, wobei die dsRNA eine Länge von weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare aufweist.
42. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 41, wobei das Virus-Genom das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus ist.
43. Medikament nach Anspruch 42, wobei der (+) -Strang-RNA- Virus ein Hepatitis-C-Virus ist.
44. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 43, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
45. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 44, wobei die dsRNA in einem physiologisch verträglichen Puffer, insbeson- dere einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegt.
46. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 45, wobei die dsRNA oder das Antisinn-Oligonukleotid von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid um- schlössen vorliegt.
47. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 46, wobei die dsRNA pro vorgesehener Verabreichungseinheit in einer Menge enthalten ist, welche einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, "besonders"bevorzugt höchstens 100" μg, pro "kg Körpergewicht entspricht .
48. Medikament nach einem der Ansprüche 33 bis 47, wobei die dsRNA einen Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 und einen
Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder wobei das Antisinn-Oligonukleotid einen Strang mit der Sequenz SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13 aufweist.
49. Doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) mit einem
Strang Sl, welcher abschnittsweise oder vollständig zu einer am 3 ' -Ende eines Virus-Genoms befindlichen nicht-translatierten Region (3' -UTR) komplementär ist.
50. DsRNA nach Anspruch 49, wobei die dsRNA das Schneiden des 3 ' -UTR bildenden Sequenzabschnitts bewirken kann.
51. DsRNA nach Anspruch 49 oder 50, wobei die 3 ' -UTR hochkonserviert ist.
52. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 51, wobei die dsRNA zumindest abschnittsweise doppelsträngig ausgebildet ist .
53. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 52, wobei ein Ende der dsRNA, vorzugsweise beide Enden, glatt sind.
54. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 53, wobei zumin- dest ein Strang, insbesondere der Strang Sl, der dsRNA am 3 ' - Ende einen Überhang hat .
55. DsRNA nach Anspruch 54, wobei der Überhang aus 1 bis 3 Nukleotiden, vorzugsweise 2 Nukleotiden, gebildet ist.
56. DsRNA"nach einem der Ansprüche 49 bis 55, wobei ein zumindest abschnittsweise zur 3 ' -UTR-Sequenz komplementärer Bereich der dsRNA weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare umfasst.
57. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 56, wobei die dsRNA eine Länge von weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Basenpaare aufweist.
58. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 57, wobei das Virus-Genom das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus ist.
59. DsRNA nach Anspruch 58, wobei der (+) -Strang-RNA-Virus ein Hepatitis-C-Virus ist.
60. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 59, wobei die dsRNA in einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, vorliegt.
61. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 60, wobei die dsRNA von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegt.
62. DsRNA nach einem der Ansprüche 49 bis 61, wobei die dsRNA einen Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO : 4 und einen Strang Sl mit der Sequenz SEQ ID NO : 5 aufweist.
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Ribophar a AG
<120> Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
<130> 422399
<140> <141>
<160> 16
<170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1 <211> 24
<212> _DNA_
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Eine einem Bereich des HCV-Genoms entsprechende DNA-Sequenz <400> 1 gtcacggcta gctgtgaaag gtcc 24
<210> 2 <211> 57
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Fusionsgen
<400> 2 gtcaccatgt cgtcacggct agctgtgaaa ggtccagtca ccatgtcgtt tactttg 57
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Fusionsgen
<400> 3 gtcaccttgt cgtcacggct agctgtgaaa ggtccagtca ccatgtcgtt tactttg 57
<210> 4
<211> 23 <212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Sinn-Strang einer dsRNA <400> 4 acggcuagcu gugaaagguc cgu 23
<210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Antisinn-Strang einer dsRNA
<400> 5 ggaccuuuca cagcuagccg uga 23
<210> 6
<211> 23 <212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Sinn-Strang einer dsRNA
<400> 6 gugaaauuau cgaugagcgu ggu 23
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Strang einer dsRNA <400> 7 cacgcucauc gauaauuuca ccg 23
<210> 8 <211> 21
<212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Sinn-Strang einer dsRNA
<400> 8 agacagucga cuucagccug g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA <213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Strang einer dsRNA <400> 9 aggcugaagu cgacugucug g 21
<210> 10 <211> 24 <212> RNA <213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Sinn-Strang einer dsRNA
<400> 10 _ _ gaugaggauc guuucgcaug auug 24
<210> 11 <211> 24 <212> RNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Strang einer dsRNA
<400> 11 aucaugcgaa acgauccuca uccu 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Oligonukleotid
<400> 12 ggacctttca cagctagccg t 21
<210> 13
<211> 21 <212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Oligonukleotid
<400> 13 cctttcacag ctagccgtga c 21
<210> 14 <211> 21
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Antisinn-Oligonukleotid
<400> 14 tgccgatcga cactttccag g 21
<210> 15 <211> 28 <212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Mittels der Plasmide p2 oder p3 gebildete eine HCV-Sequenz enthaltende mRNA
<400> 15 ucgucacggc uagcugugaa agguccag 28
<210> 16
<211> 25
<212> RNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Dem ß-Gal-Gen entsprechende mRNA.
<400> 16 cggugaaauu aucgaugagc guggu 25
PCT/EP2002/011432 2001-10-12 2002-10-11 Verfahren zur hemmung der replikation von viren WO2003033700A1 (de)

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US10/384,512 US7348314B2 (en) 2001-10-12 2003-03-07 Compositions and methods for inhibiting viral replication
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US12/631,689 US8273868B2 (en) 2001-10-12 2009-12-04 Compositions and methods for inhibiting viral replication
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