WO2002095367A1 - Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer oberflächenaktiven substanz - Google Patents

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Detlef Knebel
Matthias Amrein
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Jpk Instruments Ag
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    • G01N13/00—Investigating surface or boundary effects, e.g. wetting power; Investigating diffusion effects; Analysing materials by determining surface, boundary, or diffusion effects
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    • G01N2013/0275—Investigating surface tension of liquids involving surface-active agents

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for examining a surface-active substance.
  • Surface-active substances form a molecular film at interfaces between two immiscible fluids. They allow the targeted production of molecularly defined layers and are of considerable importance, for example, in nonlinear optics.
  • Surface-active, biological macromolecules for example, form a functional component in the human lung (lung surfactant) or serve as a model of the plasma membrane in the life sciences.
  • the film pressure IT of the surface-active substances counteracts the surface tension of the boundary layer. For example, the following relationship applies to the boundary layer between water and air:
  • ⁇ 0 is the surface tension of pure water (-72 mN / m at 25 ° C), and ⁇ is the resulting surface tension of a filmed boundary layer.
  • One property here is that the film pressure increases with decreasing average area per molecule and the surface tension decreases accordingly. This relationship takes a characteristic form depending on the surface-active substance and is recorded at a constant temperature in a so-called pressure-surface isotherm, which can be measured, for example, using a "captive bubble surfactometer".
  • a “Captive Bubble Surfactometer” the surface tension of an interface can be determined from the bubble geometry of a gas bubble in liquid using a mathematical method. as described, for example, by Kwok et al. in the journal “Polymer Engineering and Science”, (1998) 38: 757. Because of its buoyancy in the liquid, the gas bubble is driven onto a slightly dome-shaped agar roof and is fixed in this way. By changing the chamber pressure, then the volume and thereby the area of the gas bubble can be changed. From this the associated surface tension can be changed be determined.
  • Schürch et al. “A captive bubble method reproduces the in situ behavior of lung surfactant monolayers”, J. Appl. Physiol. (1989) 67: 2389-96.
  • a capillary filled with a gas is immersed in a liquid which is arranged in a closed vessel, and the volume of the liquid in the vessel is then reduced by a predetermined amount. This causes a bubble of gas with the appropriate volume to emerge from the capillary into the liquid, and the interfacial tension at the interface between the gas and the liquid can be calculated using a mathematical method.
  • a less dense liquid which is immiscible with the liquid in which the gas bubble is otherwise introduced, can also be used in the two methods described.
  • the pressure-surface isotherms determined with the aid of the described methods provide information about thermodynamic phenomena, such as first-order or higher-order phase transformations, miscibility in multi-component systems, etc., in connection with the surface film which comprises the surface-active substance.
  • the molecular architecture of the surface film during this compression is of great interest because it allows conclusions to be drawn about the molecular basis of the characteristic behavior of a substance. It has been shown that a surface film in the area of the boundary layer between two fluids has phase boundaries between molecules in different physical states. stand may contain; in the case of mixed films, there can be a characteristic distribution of the molecules within the surface film, etc.
  • the pulmonary surfactant forms a complex three-dimensional molecular architecture that is directly related to its function and has so far only been partially elucidated.
  • a method for the structural investigation of surface-active substances in surface films is the fluorescence labeling of certain components and subsequent observation with a fluorescence light microscope (cf. Lösche et al., "Fluorescence microscope to observe dynamical processes in monomolecular layerst at the air / water interface", (1984) 55 : 1968-1972)
  • a fluorescence light microscope cf. Lösche et al., "Fluorescence microscope to observe dynamical processes in monomolecular layerst at the air / water interface", (1984) 55 : 1968-1972
  • a so-called film balance in which a substance is applied to the gas-liquid interface of a liquid-filled trough (typically with an interface size of several cm 2 ) and compressed over a movable barrier (cf. for example Ulman, A., "An introduction to ultrathin organic films” Academic Press, Boston, 1991, p. 442).
  • an objective for epifluorescence light microscopy is placed at a central point above the surface
  • This method has the disadvantage that the surface film on the film scale is subjected to currents which can be very strong, especially at low film pressures, but which also occur spontaneously at high film pressures. This significantly impairs the microscopic examination of the surface film. Due to the large interface exposed to the environment and the tendency of the liquid to vibrate in the trough, the system is also extremely sensitive to disturbances from the environment, such as air circulation in the laboratory or vibrations in the building. This prevents an observation of the temporal behavior of individual structures of the surface film or at least requires complex shielding of the apparatus from the surroundings.
  • a change in the interface size leads to further flows and tensions in the surface film, which is described, for example, by Malcom, "The Flow and Deformation of Synthetic Polypeptide Monolayers during Compression", J. Colloid Interface Sei., (1985) 104: 520 in addition, the surface film shifts relative to the light microscope objective during compression or expansion, so that the structures of interest disappear from the field of view of the examination.
  • creeping often occurs on a film scale: Instead of further compression of the molecules, they move away from the water-air interface. For example, the molecules are pushed under the movable barrier.
  • the invention essentially comprises the introduction of a fluid in the form of a sample volume into another fluid which is immiscible with the one fluid, so that an interface between the one fluid and the other fluid is formed at least in a partial area of a surface of the sample volume, wherein the sample volume is formed axially symmetrically about a predefined definition axis, so that the boundary layer is formed axially symmetrically to the predefined definition axis.
  • the surface-active substance is spread over the boundary layer to form a surface film in the region of the boundary layer.
  • the boundary layer between the two fluids is characterized by high mechanical and temporal stability.
  • the sample volume of one fluid is well shielded from acoustic disturbances and thermal fluctuations of the environment by the surrounding other fluid. If, for example, the pressure in the measuring space deviates from the ambient pressure, an almost complete acoustic decoupling from the environment is achieved. If a very small sample volume is selected, the tendency to vibrate at the interface is drastically reduced compared to the measurement with a film scale. This eliminates the need for complex and costly shielding of the equipment from the surroundings.
  • High-resolution microscopes such as as the scanning probe microscopy (cf. Colton et al., "Scanning probe microscopy", Curr. Opin. Chem. Biol. (1997) 1: 370-377) can be used.
  • the surface film contracts or expands symmetrically to the predetermined definition axis when the surface changes.
  • the stabilization of the surface film achieved allows an investigation of dynamic structural changes of the surface-active substance in the surface film at the interface between the two fluids. Furthermore, in comparison to the known investigation using the film balance, microscopy using high-resolution methods is made possible. Furthermore, optical microscopic observation of an active interface film has so far only been possible on a gas-liquid interface.
  • An axially symmetrical sample volume and thereby an axially symmetrical boundary layer can, for example, thereby. be formed that the one fluid with the lower density is introduced into the other fluid with the higher density and the buoyancy of the sample volume is limited with the aid of an element whose properties are close to those of the other fluid, so that the interface between the two fluids in the area of the surface of the sample volume is not significantly affected.
  • the element With the help of the design of the element as a dome-shaped roof, self-centering of the sample volume can be achieved in a horizontal plane. Other forms of centering can also be provided, for example mechanical adjustment in the horizontal plane.
  • One fluid can be introduced, for example, via a valve and / or via a syringe. Other forms of introduction are of course conceivable.
  • one fluid can enter the other fluid from one capillary.
  • the interface or boundary layer is not closed in an area in which the sample volume and capillary touch.
  • a measurement of the surface tension is possible with the aid of an analysis of the shape of the interface.
  • the pressure can be changed, as is known in connection with the “captive bubble surfactometer”
  • the principle underlying the "pulsating bubble surfactometer” described above can be used to change the interface.
  • the volume of the other fluid is changed, as a result of which a volume of the one fluid corresponding to the change enters or exits the capillary.
  • a lateral image of the sample volume can be recorded from a direction perpendicular to the axis of symmetry of the sample volume with an optical observation device. From this, the surface tension can be calculated exactly or in good approximation using various mathematical methods.
  • an acoustic excitation of the sample volume can be used to measure the surface tension.
  • the resonance frequencies due to the capillary forces depend on the surface tension and can therefore be determined from a frequency spectrum.
  • the spectrum can be detected optically by observing standing waves at certain frequencies. Sufficient excitation energy must be applied so that the amplitudes are large enough for optical detection. When using a scanning probe microscope, amplitudes in the nm range can be detected.
  • the detection of a spectrum could also be carried out via an absorption measurement, since a particularly large amount of energy for the excitation of the vibration is absorbed in the resonance and is at least partially scattered isotropically. A recording could take place, for example, with the aid of a microphone.
  • the interface between the two fluids is to be changed in order, for example, to study surface-induced changes in the surface film
  • this is a fluid which forms the sample volume, preferably a gas.
  • the two fluids are arranged in a pressure-resistant chamber.
  • a pressure change is carried out to change the volume and thus the surface of the sample volume from gas.
  • an objective must be attached the sample volume can be introduced.
  • the lens can be optically matched to the other fluid for optimal observation, ie, for example, be a water immersion lens when the other fluid is water, and immersed in it. Provision can also be made to observe the sample volume in the airtight chamber through a transparent disk.
  • the probe of a scanning probe microscope or the observation device of another microscopic technique can also be used.
  • the object plane of the microscope used to examine the surface film always lies in the lowest point on the surface of the sample volume, which is also referred to as the apex.
  • the possibility of shifting the sample volume in the direction of the optical beam path is provided.
  • the possibility of an adjustment perpendicular to the optical axis can be provided in order to bring the apex into the optical axis.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration to explain a method for examining a surface-active substance in a surface film
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a “captive bubble surfactometer” for using the method for examining the surface-active substance
  • FIG. 3 shows a schematic illustration to explain a change in volume and refocusing in connection with the “captive bubble surfactometer” according to FIG. 2;
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of a “pulsating bubble surfactometer” for using the method for examining the surface-active substance;
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of another “captive bubble surfactometer” with an atomic force microscope for examining the surface film
  • FIG. 6 shows a schematic illustration to explain a further method for examining a surface-active substance in a surface film.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration to explain a method for examining a surface-active substance in a surface film.
  • a sample volume 1 from a fluid 2 is surrounded by another fluid 3.
  • a boundary layer 5 between the two fluids 2, 3 is formed on a surface 4 of the sample volume 1.
  • One or more surface-active substances whose physical properties are to be investigated are applied in the area of the boundary layer 5.
  • the applied surface-active substances form a surface film in the area of the boundary layer 5 on the sample volume 1.
  • the sample volume 1 and thereby the boundary layer 5 are formed axially symmetrically to an axis 6. Because of the axial symmetry, the surface film cannot flow if the molecules of the surface film formed from the surface-active substance are not soluble in the two fluids 2, 3 and the two fluids 2, 3 are not miscible.
  • a microscope 20 For microscopic observation of the surface film, a microscope 20 is provided, the optical axis of which suitably coincides with the axis 6. In this way, an apex 7, i.e. H. the lowest point of the sample volume 1 or the boundary layer 5 can be arranged opposite the microscope 20. A distance 40 between the microscope 20 and the apex 7 is expediently kept constant during the measurement.
  • the axis 15 does not have to go through the center of the sample volume 1. It is only necessary to ensure that the entire outline or a part of the outline of the sample volume sufficient to determine the surface tension can be seen. Due to the axial symmetry of the sample volume 1 to the axis 6, the 3-dimensional shape can be determined from the outline.
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a “captive bubble surfactometer” for using the method for examining the surface-active substance.
  • the fluid 3 here is, for example, water which is filled in an airtight chamber 8.
  • the fluid 2 is a gas.
  • the sample volume 1 is pressed by the buoyancy against a hydrophilic dome-shaped roof 71, which is agar gel, for example, and the boundary layer 5 that is axially symmetrical to the axis 6 is formed.
  • the sample volume 1 has a diameter of approximately 100 ⁇ m to 300 In principle, however, smaller or larger dimensions are also conceivable
  • the sample volume 1 is fixed in the chamber 8 by the agar gel 4 and its shape.
  • the fluid 3 can be supplied and optionally exchanged via dispersion pumps 50, 51.
  • the dipension pumps 50, 51 are supplied via pressure and vacuum solid feedthroughs 52, 53 from “high pressure liquid chromatography” (HPLC) into the chamber 8.
  • the fluid 2 for shaping the sample volume 1 can also be supplied via a valve 54.
  • the surface-active substance is sprayed onto the boundary layer 5 via a syringe 55 (cf. Putz et al, "A spreading technique for forming a film in a captive bubble in a surfactometer ", Biophysical Journal 1998 75: 2229-39).
  • the syringe 55 must be removed after the spreading so that an undisturbed expansion and observation of the sample volume 1 is possible.
  • the sample volume 1 can be displaced in the x and y directions via a manually or motor-adjustable cross table 85 and via a motorized micrometer screw 86 or another adjusting device in the z direction.
  • a mechanical contact to the motorized micrometer screw 86 is made via a plunger 81.
  • a spring 82 provides mechanical contact with the motorized micrometer screw 86.
  • the displacement in the z direction of the plunger 81 can also be achieved with the aid of a piezo element. In this case, the spring 82 is used to generate a preload.
  • the microscopic examination of the sample volume 1 is carried out in the exemplary embodiment according to FIG. 2 with the aid of a light microscope 100.
  • the light microscope 100 can be an epifluorescence light microscope, for example, which is operated either confocal or conventionally.
  • an objective 21 is immersed in the fluid 3.
  • the microscopic image which is, for example, a fluorescence distribution, is then imaged on a CCD chip 23 with the aid of a lens 22, digitized and sent to an evaluation in an evaluation device 70, which is, for example, a personal computer.
  • lateral observation of the sample volume 1 is provided to determine the surface tension of the surface film on the sample volume 1.
  • a borescope 110 is used for this.
  • a bushing 111 is designed as an HPLC bushing.
  • the borescope 110 takes the outline of the surface tension to determine the surface tension Sample volume 1.
  • Subsequent digitization is also implemented via a CCD chip 33, onto which the image is focused using a lens 32.
  • the digitized image is then evaluated using the evaluation device 70.
  • the surface tension between the two fluids, which are influenced by the surface film on the sample volume 1, can be determined by means of the ADSA algorithm. With the aid of the evaluation device 70, an associated surface tension is assigned to each microscopic image and stored.
  • a change in the size of the sample volume 1 and thereby the boundary layer 5 is possible via a pressure change using a disperser pump 60, which is designed in a software-controlled manner.
  • a pressure sensor 61 controls the pressure in the chamber 8 and can also be read out using suitable software.
  • Bushings 200, 201 of the disperser pump 60 and the pressure transducer 61 are designed as HPLC bushings.
  • the disperse pump 60 changes a gas pressure in a space 202 above the fluid 3 in the chamber 8. This changes the volume of the sample volume 1. Usually, a negative pressure is generated with the aid of the disperse pump 60, but it can also be provided to apply an overpressure.
  • the sample volume 1 can be shifted in the z direction in order to keep the distance 40 between the apex 7 of the sample volume 1 and the objective 21 constant, even if the volume of the sample volume 1 changes.
  • FIGS. 3A to 3C show schematic representations to explain a change in volume and refocusing in connection with the “Capive Bubble Surfactometer” according to FIG. 2.
  • the starting situation in the arrangement according to FIG. 2 is shown in FIG. 3A shown.
  • the chamber 8 is filled, for example, with approximately 100 ⁇ l buffer.
  • the sample volume 1 with a diameter of approximately 100 ⁇ m, for example, is injected.
  • the diameter here relates to the largest extent of the sample volume 1 in the x direction, ie perpendicular to the optical axis 6.
  • the diameter is then increased to approximately 300 ⁇ m in the selected example by applying a negative pressure.
  • the observation with the light microscope 100 and the borescope 110 is started and the sample volume 1 is brought into the optical axis.
  • the apex 7 of the sample volume 1 is then brought into the focal plane of the light microscope 100.
  • the surfactant is now injected.
  • the adsorption of the surface-active substance is examined structurally with the aid of the light microscope 100 and functionally with the aid of the borescope 110 (reduction of the surface tension).
  • the size of the sample volume 1 is varied.
  • the volume of the sample volume 1 is increased, as a result of which the distance 40 between the apex 7 and the objective 21 is reduced.
  • the original shape of the sample volume 1 is shown in broken lines in FIG. 3B.
  • the original distance 40 must be restored. This is achieved with the aid of the stamp 81, which is shown in FIG. 3C.
  • the original position of the stamp 81 is shown in dashed lines in FIG. 3C.
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of a “pulsating bubble surfactometer” for using the method for examining the surface-active substance.
  • the chamber 8 is covered with a roof 300 and completely filled with the fluid 3 in which it is
  • the fluid 2 can be a gas or a liquid which is immiscible with the fluid 3.
  • the fluid 2 does not form a closed boundary layer 5, but emerges from a hose 65 which, for example can be positioned with the aid of a plunger 67.
  • the hose 65 is connected to a chamber volume 66, which is, for example, a gas-filled syringe with a locking ring.
  • a change in the sample volume 1 can be achieved, for example, by moving the stamp 67. Another possibility would be to supply a gas via the syringe 55.
  • the “creeping” that is fundamentally possible in the embodiment according to FIG. 4, ie migration of the molecules of the surface-active substance, can be minimized, for example, by the hose 65 being coated on the outside with a hydrophilic coating and on the inside with a hydrophobic coating.
  • the sample volume 1 in the chamber 8 is positioned with the help of the manual cross table 85 and the motorized micrometer screw 86. This is automatically possible with the help of a software-based control.
  • FIG. 5 shows a schematic illustration of another “captive bubble surfactometer” in which a scanning force microscope (SFM — “scanning force microscopy”) is provided as the microscope.
  • SFM scanning force microscope
  • SNOM optical near field microscope
  • the cantilever 90 is attached to a piezo 91, which in turn is attached to the chamber 8 Alternatively, the piezo could also be attached to the lens 21.
  • the piezo must be designed in such a way that it can move the cantilever in all three spatial directions so that a raster movement can be carried out over the surface and at the same time the distance can be maintained as it is the respective type of imaging requires
  • x and y denote the displacement perpendicular to the optical axis 6.
  • z denotes the axis parallel to this in the following.
  • an embodiment known from scanning probe microscopy would be a piezo tube.
  • the piezo could only be in the lateral direction (x and y) scan and the shift ng in the vertical direction (z direction) could be mediated by a piezo attached to the stamp. This would then move the air bubble vertically itself.
  • the cantilever bending is detected by the light display principle, which is widespread in atomic force microscopy.
  • the laser beam 92 from a laser 93 is directed onto the cantilever by a beam splitter 95.
  • the objective 21 assumes the function of focusing the laser beam on the cantilever.
  • the reflected beam 96 is then again directed via a beam splitter 97 onto a 4-segment photodiode 98.
  • the signals obtained at the photodiode are evaluated in control electronics 99 and the deflection of the piezos is controlled thereby. In addition, the signals are passed on to the PC for evaluation.
  • FIG. 6 shows a very simple application of the method to a liquid drop 1 which is surrounded, for example, by a gas.
  • the immobility of the surface film is again guaranteed due to the axially symmetrical shape.
  • the base 45 could, for example, consist of Teflon if the medium 1 is hydrophilic and of agar gel if the liquid is hydrophobic. This would ensure that the interface at the contact point is only slightly disturbed. With a lateral observation 31, the outline of the drop can be used to determine the surface tension.
  • an upright microscope could be used with the objective 21 and the optimal alignment of the objective and the drop with respect to one another could be carried out using the adjusters which are commercially available.
  • the surface could be changed using a syringe 48, which, however, disrupts the interface and thus enables the above-described creeping.
  • a measurement method is presented for the first time with which a surface-active film can be observed microscopically directly at the interface, which stands still within the scope of the resolution of the respective microscope. Furthermore, several devices for performing the method were presented, in which the surface tension can be measured simultaneously. Furthermore, compression or expansion of the film is possible with simultaneous microscopic observation of selected surface areas without these being pushed out of the image area.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen von Eigenschaften, insbesondere physikalischen Eigenschaften, einer oberflächenaktiven Substanz. Ein Fluid wird in Form eines Probenvolumens in einem anderen, mit dem einen Fluid nicht mischbaren Fluid eingebracht, so dass zumindest in einem Teilbereich einer Oberfläche des Probenvolumens eine Grenzschicht zwischen dem einen Fluid und dem anderen Fluid gebildet ist. Hierbei ist das Probenvolumen axialsymmetrisch um eine vorgegebene Definitionsachse ausgebildet, so dass die Grenzschicht axialsymmetrisch zu der vorgegebenen Definitionsachse gebildet ist. Die oberflächenaktive Substanz wird über die Grenzschicht gespreitet, um einen Oberflächenfilm im Bereich der Grenzschicht mit der oberflächenaktiven Substanz zu bilden. Der Oberflächenfilm kann dann mikroskopisch untersucht werden.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum Untersuchen einer oberflächenaktiven Substanz
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen einer oberflächenaktiven Substanz.
Oberflächenaktive Substanzen bilden an Grenzschichten zwischen zwei nicht mischbaren Fluiden einen molekularen Film. Sie erlauben die gezielte Herstellung molekular definierter Schichten und sind beispielsweise in der nichtlinearen Optik von erheblicher Bedeutung. Oberflächenaktive, biologische Makromoleküle bilden zum Beispiel in der menschlichen Lunge (Lungensurfactant) einen funktioneilen Bestandteil oder dienen in den Lebenswissenschaften als Model der Plasmamembran. Der Filmdruck IT der oberflächenaktiven Substanzen wirkt der Oberflächenspannung der Grenzschicht entgegen. Beispielsweise gilt für die Grenzschicht von Wasser zu Luft der folgende Zusammenhang:
r = y0 -n (l)
γ 0 ist die Oberflächenspannung von reinem Wasser (-72 mN/m bei 25° C), und γ ist die resultierende Oberflächenspannung einer befilmten Grenzschicht. Eine Eigenschaft hierbei besteht darin, daß der Filmdruck mit abnehmender mittlerer Fläche pro Molekül zu- und die Oberflächenspannung entsprechend abnimmt. Dieser Zusammenhang gestaltet sich je nach oberflächenaktiver Substanz in charakteristischer Weise und wird bei einer konstanten Temperatur in einer sogenannten Druck-Flächen-Isotherme aufgezeichnet, die beispielsweise mittels eines „Captive Bubble Surfactometers" gemessen werden kann.
In einem „Captive Bubble Surfactometer" kann die Oberflächenspannung einer Grenzfläche aus der Blasengeometrie einer Gasblase in Flüssigkeit mittels eines mathematischen Verfahrens bestimmt werden. Ein mögliches Verfahren zum Bestimmen der Oberflächenspannung ist die sogenannte axialsymmetrische Tropfenform Analyse (ADSA - „Axisymmetric Drop Shape Analysis"), wie sie beispielsweise von Kwok et al. in der Zeitschrift „Polymer Engi- neering and Science", (1998) 38: 757 beschrieben ist. Die Gasblase wird wegen ihres Auftriebs in der Flüssigkeit an ein leicht kuppeiförmiges Agar-Dach getrieben und auf diese Weise fixiert. Mittels einer Änderung des Kammerdrucks kann dann das Volumen und hierdurch die Fläche der Gasblase geändert werden. Hieraus kann die zugehörige Oberflächenspannung bestimmt werden. Bezüglich weiterer Einzelheiten zum „Captive Bubble Surfactometer" wird auf die folgende Veröffentlichung verwiesen: Schürch et al., „A captive bubble method reproduces the in situ behavor of lung surfactant monolayers", J. Appl. Physiol. (1989) 67: 2389-96.
Ein weiters Verfahren Messen von Druck-Flächen-Isothermen wird in einem „Pulsating Bubble Surfactometer" genutzt, was beispielsweise von Enhorning in einem Artikel mit dem Titel "A pulsating bubble technique for evaluating pulmonary surfactant", J. Appl. Physiol. (1977) 43: 198-203, beschrieben ist. In einer möglichen Ausfuhrungsform wird eine mit ei- nem Gas gefüllte Kapillare in eine Flüssigkeit getaucht, die in einem geschlossenen Gefäß angeordnet ist. Anschließend wird das Volumen der Flüssigkeit in dem Gefäß um einen vorbestimmten Betrag verringert. Hierdurch tritt eine Blase des Gases mit dem entsprechenden Volumen aus der Kapillare in die Flüssigkeit aus. Die Grenzflächenspannung an der Grenzfläche zwischen dem Gas und der Flüssigkeit kann mit Hilfe eines mathematischem Verfah- rens berechnet werden.
Die Grundlage der Berechnung der Oberflächenspannung ist die Laplace'sche Formel, bei der ■ Δp den Druckunterschied zwischen beiden Fluiden beschreibt, γ ist die Oberflächenspannung, und C) und c2 sind die Hauptkrümmungsradien der Oberfläche:
Δp = γ(cl + c2) (2)
Anstelle des Gases kann bei den beiden beschriebenen Verfahren auch eine weniger dichte Flüssigkeit genutzt werden, die mit der Flüssigkeit, in welcher sonst die Gasblase eingebracht wird, nicht mischbar ist.
Die mit Hilfe der beschriebene Verfahren ermittelten Druck-Flächen-Isotherme geben Auskunft über thermodynamische Phänomene, wie Phasenumwandlungen erster oder höherer Ordnung, Mischbarkeit bei Mehrkomponentensystemen etc, in Verbindung mit dem Oberflä- chenfilm, welcher die oberflächenaktive Substanz umfaßt. Die molekulare Architektur des Oberflächenfilmes während dieser Kompression ist von großem Interesse, da diese Rückschlüsse auf die molekularen Grundlagen des charakteristischen Verhaltens einer Substanz zuläßt. Es hat sich gezeigt, daß ein Oberflächenfilm im Bereich der Grenzschicht zwischen zwei Fluiden Phasengrenzen zwischen Molekülen in unterschiedlichem physikalischen Zu- stand enthalten kann; bei Mischfilmen kann es zu einer charakteristischen Verteilung der Moleküle innerhalb des Oberflächenfϊlms kommen, etc. So bildet beispielsweise das Lungen- surfactant eine komplexe dreidimensionale molekulare Architektur aus, die in direktem Zusammenhang mit seiner Funktion steht und bisher nur ansatzweise aufgeklärt ist.
Eine Methode zur Strukturuntersuchung oberflächenaktiver Substanzen in Oberflächenfilmen ist die Fluoreszenzmarkierung bestimmter Komponenten und anschließende Beobachtung mit einem Fluoreszenzlichtmikroskop (vgl. hierzu Lösche et al., „Fluorescence microscope to observe dynamical processes in monomolecular layerst at the air/water interface", (1984) 55: 1968-1972). Um eine Struktur einem bestimmten Zustand des Films zuordnen zu können, werden solche Untersuchungen an der Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht mit Hilfe einer sogenannten Filmwaage ausgeführt. Hierbei wird eine Substanz an die Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht eines flüssigkeitsgefüllten Trogs (typischerweise mir einer Grenzflächengröße von mehreren cm2) gespreitet und über eine bewegliche Barriere komprimiert (vgl. beispiel- weise Ulman, A., „An introduction to ultrathin organic films" Academic Press, Boston, 1991, S. 442). Hierbei wird ein Objektiv zur Epifluoreszenzlichtmikroskopie an zentraler Stelle über dem Oberflächenfilm auf der Filmwaage angeordnet.
Diese Verfahren hat den Nachteil, daß der Oberflächenfilm auf der Filmwaage Strömungen unterworfen ist, die insbesondere bei niedrigen Filmdrücken sehr stark sein können, aber auch bei hohen Filmdrücken spontan auftreten. Hierdurch wird die mikrokopische Untersuchung des Oberflächenfilms erheblich beeinträchtigt. Aufgrund der großen, zur Umgebung exponierten Grenzfläche und der Schwingungsneigung der Flüssigkeit im Trog ist das System zudem ausgeprägt empfindlich gegenüber Störungen aus der Umgebung, wie zum Beispiel der Luftzirkulation im Labor oder Schwingungen des Gebäudes. Dieses verhindert eine Beobachtung des zeitlichen Verhaltens einzelner Strukturen des Oberflächenfilms oder erfordert zumindest eine aufwendige Abschirmung der Apparatur von der Umgebung.
Eine Änderung der Grenzflächengröße führt zu weiteren Strömungen und zu Spannungen im Oberflächenfilm, was beispielsweise von Malcom, „The Flow and Deformation of Synthetic Polypeptide Monolayers during Compression", J. Colloid Interface Sei., (1985) 104:520, beschrieben wird. Darüber hinaus verschiebt sich der Oberflächenfilm relativ zum lichtmikroskopischen Objektiv bei Kompression oder Expansion, so daß die interessierenden Strukturen aus dem Untersuchungsblickfeld verschwinden. Bei hohen Filmdrücken tritt auf einer Filmwaage oft das sogenannten "Creeping" auf: Statt einer weiteren Verdichtung der Moleküle entfernen diese sich von der Wasser-Luft- Grenzfläche. Die Moleküle werden beispielsweise unter die bewegliche Barriere geschoben.
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung anzugeben, bei dem (der) Oberflächenfilme mit einer oberflächenaktiven Substanz an einer Grenzfläche zwischen zwei Fluiden für eine mikroskopische Untersuchung so zur Verfügung stehen, daß die Untersuchung mit größerer Genauigkeit und einer verminderten Fehleranfälligkeit ausgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach dem unabhängigen Anspruch 1 und eine Vorrichtung nach dem unabhängigen Anspruch 13 gelöst.
Die Erfindung umfaßt als wesentlichen Gedanken das Einbringen eines Fluids in Form eines Probenvolumens in einem anderen, mit dem einen Fluid nicht mischbaren Fluid, so daß zumindest in einem Teilbereich einer Oberfläche des Probenvolumens eine Grenzschicht zwischen dem einen Fluid und dem anderen Fluid gebildet wird, wobei das Probenvolumen axialsymmetrisch um eine vorgegebene Definitionsachse ausgebildet wird, so daß die Grenz- schicht axialsymmetrisch zu der vorgegebenen Definitionsachse geformt ist. Die oberflächenaktive Substanz ist über die Grenzschicht zum Ausbilden eines Oberflächenfilms im Bereich der Grenzschicht gespreitet.
Es ergeben sich für die Mikroskopie des Oberflächenfilms mit der oberflächenaktiven Sub- stanz gegenüber dem Stand der Technik mehrere Vorteile. Die Grenzschicht zwischen den beiden Fluiden zeichnet sich durch eine hohe mechanische und zeitliche Stabilität aus. Das Probenvolumen des einen Fluids ist durch das umgebende andere Fluid gut von akustischen Störungen und thermischen Schwankungen der Umgebung abgeschirmt. Weicht beispielsweise der Druck in dem Meßraum vom Umgebungsdruck ab, ist eine nahezu vollständige akustische Entkopplung von der Umgebung erzielt. Bei Wahl eines sehr kleinen Probenvolumens ist die Schwingungsneigung der Grenzfläche im Vergleich zur Messung mit der Filmwaage drastisch reduziert. Damit erübrigt sich eine aufwendige und kostspielige Abschirmung der Apparatur von der Umgebung. Hochauflösende Mikroskopien, wie beispiels- weise die Rastersondenmikroskopie ( vgl. Colton et al., „Scanning probe microscopy", Curr. Opin. Chem. Biol. (1997) 1 : 370-377) können eingesetzt werden.
Bei geeigneter Anordnung kontrahiert bzw. expandiert der Oberflächenfilm bei einer Flä- chenänderung symmetrisch zu der vorgegebenen Definitionsachse.
Das obengenannte „creeping" des Oberflächenfilms bei hohem Filmdruck wird bei der Nutzung des „Captive Bubble Surfactometers" vollständig vermieden.
Die erreichte Stabilisierung des Oberflächenfilms erlaubt eine Untersuchung dynamischer Strukturveränderungen der oberflächenaktiven Substanz in dem Oberflächenfilmn an der Grenzschicht zwischen den beiden Fluiden. Weiterhin ist im Vergleich zu der bekannten Untersuchung mit der Filmwaage eine Mikroskopie mittels hochauflösender Verfahren ermöglicht. Des weiteren ist eine lichtmikroskopischen Beobachtung eines aktiven Grenzflä- chenfilms bisher nur auf einer Gas-Flüssigkeitsgrenzschicht möglich.
Ein axialsymmetrisches Probenvolumen und hierdurch eine axialsymmetrische Grenzschicht kann beispielsweise dadurch. gebildet werden, daß das eine Fluid mit der geringeren Dichte in das andere Fluid mit der größeren Dichte eingebracht wird und der Auftrieb des Probenvolu- mens mit Hilfe eines Elements begrenzt wird, daß in seinen Eigenschaften denen des anderen Fluids nahe kommt, so daß die Grenzfläche zwischen den beiden Fluiden im Bereich der Oberfläche des Probenvolumens nicht wesentlich beeinflußt wird. Mit Hilfe der Ausbildung des Elements als kuppeiförmiges Dach kann eine Selbstzentrierung des Probenvolumens in einer horizontalen Ebene erreicht werden. Es können auch andere Formen zur Zentrierung vorgesehen sein, beispielsweise eine mechanische Verstellung in der horizontalen Ebene. Das Einbringen des einen Fluids kann beispielsweise über ein Ventil und/oder über eine Spritze erfolgen. Weitere Formen des Einbringens sind natürlich denkbar.
Alternativ kann das eine Fluid aus einer Kapillare in das andere Fluid eintreten. Bei dieser Ausführungsform ist die Grenzfläche bzw. Grenzschicht in einem Bereich, in welchem sich Probenvolumen und Kapillare berühren, nicht geschlossen. Bei beiden beschrieben Ausführungsformen ist eine Messung der Oberflächenspannung mit Hilfe einer Analyse der Form der Grenzfläche möglich. Um die Möglichkeit einer gezielten Änderung der Grenzfläche zu schaffen, kann bei der Ausführungsform, die das Einbringen des Probenvolumens des einen Fluids in dem anderen Fluid ohne Kapillare vorsieht, der Druck geändert werden, wie es in Verbindung mit dem „Captive Bubble Surfactometer" bekannt ist. Beim Einbringen des Probenvolumens mittels Kapillare kann zur Änderung der Grenzfläche das dem oben beschriebenen „Pulsating Bubble Surfac- tometers" zugrunde liegende Prinzip verwendet werden. Hierbei wird das Volumen des anderen Fluids geändert, wodurch ein der Änderung entsprechendes Volumen des einen Fluids in die Kapillare eintritt oder aus dieser austritt.
Zum Messen der Oberflächenspannung zwischen den beiden Fluiden, die durch den Oberflächenfilm auf den Probenvolumen beeinflußt werden, kann aus einer Richtung senkrecht zur axialen Symmetrieachse des Probenvolumens mit einer optischen Beobachtungseinrichtung ein seitliches Abbild des Probenvolumens aufgenommen werden. Hieraus kann mittels verschiedener mathematischer Methoden die Oberflächenspannung exakt oder in guter Näherung berechnet werden.
Alternativ kann zur Messung der Oberflächenspannung eine akustische Anregung des Probenvolumens genutzt werden. Die auf die Kapillarkräfte zurückzuführenden Resonanzfrequenzen sind von der Oberflächenspannung abhängig und somit aus einem Frequenzspektrum bestimmbar. Die Detektion des Spektrums kann bei einer Ausfuhrungsform optisch erfolgen, indem bei gewissen Frequenzen stehenden Wellen beobachtet werden. Es muß genügend Anregungsenergie aufgebracht werden, damit die Amplituden groß genug für eine optische Detektion sind. Bei der Nutzung eines Rastersondenmikroskops können Amplituden im nm- Bereich detektiert werden. Wahlweise könnte die Detektion eines Spektrums auch über eine Absoφtionsmessung durchgeführt werden, da in der Resonanz besonders viel Energie für die Anregung der Schwingung absorbiert wird und zumindest teilweise isotrop gestreut wird. Eine Aufnahme könnte beispielsweise mit Hilfe eines Mikrofons erfolgen.
Soll bei einer Ausfuhrungsform der Erfindung die Grenzfläche zwischen den beiden Fluiden verändert werden, um beispielsweise flächeninduzierte Veränderungen im Oberflächenfilm zu studieren, ist das eine Fluid, welches das Probenvolumen bildet, vorzugsweise ein Gas. Die beiden Fluide sind in einer druckfesten Kammer angeordnet. Zur Veränderung des Volumens und damit der Oberfläche des Probenvolumens aus Gas wird eine Druckänderung durchgeführt. Zur Beobachtung des Probenvolumens mit einem Lichtmikroskop muß ein Objektiv an das Probenvolumen herangeführt werden. Das Objektiv kann für eine optimale Beobachtung an das andere Fluid optisch angepaßt sein, d. h. beispielsweise ein Wasserimmersionsobjektiv sein, wenn das andere Fluid Wasser ist, und in dieses eintauchen. Es kann auch vorgesehen sein, das Probenvolumen in der luftdichten Kammer durch eine transparente Scheibe zu beob- achten. Anstelle des Lichtmikroskopobjektivs kann auch die Sonde eines Rastersondenmikroskops oder die Beobachtungseinrichtung einer anderen mikroskopischen Technik treten.
Bei einer zweckmäßigen Weiterbildung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Objektebene des zum Untersuchen des Oberflächenfilms genutzten Mikroskops stets im niedrigsten Punkt der Oberfläche des Probenvolumens, der auch als Apex bezeichnet wird, liegt. Zu diesem Zweck ist die Möglichkeit einer Verlagerung des Probenvolumens in Richtung des optischen Strahlengangs vorgesehen. Ebenso kann die Möglichkeit eine zur optischen Achse senkrechten Verstellung vorgesehen sein, um den Apex in die optische Achse zu bringen.
Weitere Vorteile und zweckmäßige Fortbildungen der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausfuhrungsbeispielen unter Bezugnahme auf eine Zeichnung. Hierbei zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Verfahrens zum Untersuchen einer oberflächenaktiven Substanz in einem Oberflächenfilm; Figur 2 eine schematische Darstellung eines „Captive Bubble Surfactometers" zur Nutzung des Verfahrens zum Untersuchen der oberflächenaktiven Substanz;
Figur 3 eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer Volumenänderung und einer Nachfokussierung in Verbindung mit dem „Captive Bubble Surfactometer" nach Figur 2; Figur 4 eine schematische Darstellung eines „Pulsating Bubble Surfactometers" zur Nutzung des Verfahrens zum Untersuchen der oberflächenaktiven Substanz;
Figur 5 eine schematische Darstellung eines anderen „Captive Bubble Surfactometers" mit einem Rasterkraftmikroskop zum Untersuchen des Oberflächenfilms; und
Figur 6 eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines weiteren Verfahrens zum Unter- suchen einer oberflächenaktiven Substanz in einem Oberflächenfilm.
In Figur 1 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Verfahrens zum Untersuchen einer oberflächenaktiven Substanz in einem Oberflächenfilm gezeigt. Ein Probevolumen 1 aus einem Fluid 2 ist von einem anderen Fluid 3 umgeben. Auf einer Oberfläche 4 des Probenvolumen 1 ist eine Grenzschicht 5 zwischen den beiden Fluiden 2, 3 gebildet. Im Bereich der Grenzschicht 5 werden eine oder mehrere oberflächenaktive Substanzen aufgebracht, deren physikalische Eigenschaften untersucht werden sollen. Die aufgebrachten oberflächenak- tiven Substanzen bilden hierbei einen Oberflächenfilm im Bereich der Grenzschicht 5 auf dem Probenvolumen 1. Das Probenvolumen 1 und hierdurch die Grenzschicht 5 sind axialsymmetrisch zu einer Achse 6 gebildet. Aufgrund der Axialsymmetrie ist ein Fließen des Oberflächenfilms dann ausgeschlossen, wenn die Molekühle des aus der oberflächenaktiven Substanz gebildeten Oberflächenfilms in den beiden Fluiden 2, 3 nicht löslich sind und die beiden Fluide 2, 3 nicht mischbar sind.
Zum mikroskopischen Beobachten des Oberflächenfilms ist ein Mikroskop 20 vorgesehen, dessen optische Achse zweckmäßig mit der Achse 6 übereinstimmt. Auf diese Weise kann ein Apex 7, d. h. der niedrigste Punkt des Probenvolumens 1 bzw. der Grenzschicht 5 dem Mi- kroskop 20 gegenüberliegend angeordnet werden. Ein Abstand 40 zwischen dem Mikroskop 20 und dem Apex 7 wird während der Messung zweckmäßig konstant gehalten.
Eine optische Beobachtungseinrichtung 30, deren optische Achse mit 15 gekennzeichnet ist und senkrecht zur Achse 6 steht, ermöglicht die Bestimmung einer Oberflächenspannung des Oberflächenfilms aufgrund der Form der Grenzschicht 5. Die Achse 15 muß nicht durch den Mittelpunkt des Probenvolumens 1 gehen. Es muß lediglich gewährleistet sein, daß der gesamte Umriß oder ein zur Bestimmung der Oberflächenspannung hinreichender Teil des Umrisses des Probevolumens zu sehen ist. Aufgrund der Axialsymmetrie des Probenvolumen 1 zur Achse 6 ist aus dem Umriß die 3-dimensionale Form bestimmbar.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung eines „Captive Bubble Surfactometer" zur Nutzung des Verfahrens zum Untersuchen der oberlächenaktiven Substantz. Bei dem Fluid 3 handelt es sich hier beispielsweise um Wasser, das in einer luftdichten Kammer 8 eingefüllt ist. Das Fluid 2 ist ein Gas. Das Probenvolumen 1 wird durch den Auftrieb gegen ein hydro- philes kuppeiförmiges Dach 71, das beispielsweise Agar-Gel ist, gedrückt und es bildet sich die zur Achse 6 axialsymmetrische Grenzschicht 5. Das Probenvolumen 1 weist im Ausführungsbeispiel einen Durchmesser von etwa 100 μm bis 300 μm auf. Es sind prinzipiell aber auch kleinere oder größere Abmessungen denkbar. Durch das Agar-Gel 4 und dessen Form ist das Probenvolumen 1 in der Kammer 8 fixiert. Über Dispensionspumpen 50, 51 kann das Fluid 3 zugeführt und gegebenenfalls ausgetauscht werden. Zuführungen der Dipensionspumpe 50, 51 erfolgen über Druck- und Vakuumfest- durchführungen 52, 53 aus der „high pressure liquid cromatography" (HPLC) in die Kammer 8. Über ein Ventil 54 kann zusätzlich das Fluid 2 zum Formen des Probenvolumens 1 zugeführt werden. Ferner ist es möglich, hierüber die oberlfächenaktive Substanz einzubringen, die an die Grenzschicht 5 gespreitet wird. Alternativ kann auch vorgesehen sein, die oberlfächenaktive Substanz über eine Spritze 55 an die Grenzschicht 5 zu spritzen (vgl. Putz et al, „A spreading technique for forming a film in a captive bubble in a surfactometer", Biophysical Journal 1998 75:2229-39). Damit eine ungestörte Ausdehnung und Beobachtung des Probenvolumens 1 möglich ist, muß die Spritze 55 nach dem Spreiten entfernt werden.
Das Probenvolumen 1 kann über einen manuell oder motorisch_verstellbaren Kreuzstisch 85 in x- und y-Richtung und über eine motorische Mikrometerschraube 86 oder eine sonstige Versteileinrichtung in z-Richtung verlagert werden. Gemäß Figur 2 ist ein mechanischer Kontakt zur motorischen Mikrometerschraube 86 über einen Stempel 81 ausgebildet. Eine Feder 82 sorgt für einen mechanischen Kontakt zu der motorischen Mikrometerschraube 86. Die Verlagerung in z-Richtung des Stempels 81 kann bei einer alternativen Ausführungsform auch mit Hilfe eines Piezoelements erreicht werden. In diesem Fall dient die Feder 82 zum Erzeugen einer Vorspannung.
Das mikroskopische Untersuchen des Probenvolumens 1 wird bei dem Ausführungsbeispiel nach Figur 2 mit Hilfe eines Lichtmikroskops 100 ausgeführt. Bei dem Lichtmikroskop 100 kann es sich beispielsweise um ein Epifluoreszenzlichtmikroskop handeln, das wahlweise konfokal oder konventionell betrieben wird. Hierbei taucht ein Objektiv 21 in das Fluid 3 ein. Die mikroskopische Abbildung, bei der es sich beispielsweise um eine Fluoreszenzverteilung handelt, wird dann mit Hilfe einer Linse 22 auf einen CCD-Chip 23 abgebildet, digitalisiert und einer Auswertung in einer Auswerteeinrichtung 70 zugeführt, bei der es sich beispielsweise um einen Personalcomputer handelt.
Darüber hinaus ist eine seitliche Beobachtung des Probenvolumens 1 zum Bestimmen der Oberflächenspannung des Oberflächenfilms auf dem Probenvolumen 1 vorgesehen. Hierzu wird ein Boreskop 110 genutzt. Eine Durchführung 111 ist als eine HPLC-Durchführung ausgelegt. Das Boreskop 110 nimmt zum Bestimmen der Oberflächenspannung den Umriß des Probenvolumens 1 auf. Eine anschließende Digitalisierung wird ebenfalls über einen CCD- Chip 33 realisiert, auf den das Bild mit Hilfe einer Linse 32 fokussiert wird. Das digitalisierte Bild wird dann mit Hilfe der Auswerteeinrichtung 70 ausgewertet. Mittels des ADSA- Algorithmus kann die Oberflächenspannung zwischen den beiden Fluiden, die durch den Oberflächenfilm am Probenvolumen 1 beeinflußt werden, bestimmt werden. Mit Hilfe der Auswerteeinrichtung 70 wird jedem mikroskopischen Bild eine zugehörige Oberflächenspannung zugeordnet und abgespeichert.
Eine Änderung der Größe des Probenvolumens 1 und hierdurch der Grenzschicht 5 ist über eine Druckänderung mittels einer Disperserpumpe 60 möglich, die softwaregesteuert ausgelegt ist. Ein Drucknehmer 61 kontrolliert den Druck in der Kammer 8 und kann ebenfalls mittels einer geeigneten Software ausgelesen werden. Durchführungen 200, 201 der Disperserpumpe 60 sowie des Drucknehmers 61 sind als HPLC-Durchfuhrungen ausgeführt. Die Disperseφumpe 60 verändert einen Gasdruck in einem Raum 202 oberhalb des Fluids 3 in der Kammer 8. Hierdurch ändert sich das Volumen des Probenvolumens 1. Üblicherweise wird mit Hilfe der Disperseφumpe 60 ein Unterdruck erzeugt, es kann jedoch auch vorgesehen sein, einen Überdruck anzulegen.
Mit Hilfe der motorischen Mikrometerschraube 86 kann das Probenvolumen 1 in z-Richtung verlagert werden, um den Abstand 40 zwischen dem Apex 7 des Probenvolumens 1 und dem Objektiv 21 konstant zu halten, auch wenn sich das Volumen des Probenvolumens 1 ändert.
Mit Hilfe der Auswerteeinrichtung 70 werden alle beschriebenen Funktionen der in Figur 2 dargestellten Anordnung über eine einheitliche Benutzeroberfläche bedient. Insbesondere werden die mikroskopischen Bildaufnahmen mit Hilfe des Lichtmikroskops 1 und des Bo- reskops 110 als Funktion der Oberfläche integriert. Wenn eine definierte Substanzmenge an die Grenzschicht 5 gespreitet wird, kann die Oberflächenspannung des Oberflächenfilms als Funktion der mittleren Fläche pro Molekül berechnet werden. Hieraus können beispielsweise Rückschlüsse auf Struktur-Funktionsbeziehungen der gespreiteten oberflächenaktiven Sub- stanz gezogen werden.
In den Figuren 3 A bis 3C sind schematische Darstellungen zur Erläuterung einer Volumenänderung und einer Nachfokussierung in Verbindung mit dem „Capive Bubble Surfactometer" nach Figur 2 gezeigt. In Figur 3A ist die Ausgangssituation bei der Anordnung nach Figur 2 dargestellt. Um diese Ausgangssituation herzustellen, wird die Kammer 8 beispielsweise mit ca. 100 μl Puffer gefüllt. Weiterhin wird das Probenvolumen 1 mit einem Durchmesser von beispielsweise ca. 100 μm injiziert. Der Durchmesser bezieht sich hierbei auf die größte Ausdehnung des Probenvolumens 1 in x-Richtung, d. h. senkrecht zur optischen Achse 6. An- schließend wird mittels des Anlegens eines Unterdrucks der Durchmesser bei dem gewählten Beispiel auf ca. 300 μm vergrößert. Die Beobachtung mit dem Lichtmikroskop 100 und dem Boreskop 110 wird begonnen, und das Probenvolumen 1 wird in die optische Achse gebracht. Anschließend wird der Apex 7 des Probenvolumens 1 in die Fokusebene des Lichtmikroskop 100 gebracht. Die oberflächenaktive Substanz wird nun injiziert. Die Adsoφtion der oberflä- chenaktiven Substanz wird strukturell mit Hilfe des Lichtmikroskops 100 und funktioneil mit Hilfe des Boreskops 110 (Reduktion der Oberlfächenspannung) untersucht.
Gemäß der Darstellung in Figur 3B wird die Größe des Probenvolumens 1 variiert. In dem dargestellten Beispiel wird das Volumen des Probenvolumens 1 vergrößert, wodurch sich der Abstand 40 des Apex 7 zum Objektiv 21 verringert. Die ursprüngliche Form des Probenvolumens 1 ist in Figur 3B gestrichelt eingezeichnet. Um eine scharfe optische Abbildung mit Hilfe des Lichtmikroskops 100 zu erhalten, muß der ursprüngliche Abstand 40 wieder hergestellt werden. Dieses wird mit Hilfe des Stempels 81 erreicht, was in Figur 3C gezeigt ist. In Figur 3C ist die ursprüngliche Position des Stempels 81 gestrichelt gezeigt.
Figur 4 zeigt eine schematische Darstellung eines „Pulsating Bubble Surfactometer" zur Nutzung des Verfahrens zum Untersuchen der oberlächenaktiven Substanz. Im Unterschied zu der Anordnung nach Figur 2 ist die Kammer 8 mit einem Dach 300 abgedeckt und komplett mit dem Fluid 3 gefüllt, bei dem es sich um eine Flüssigkeit handelt. Das Fluid 2 kann ein Gas oder ein mit dem Fluid 3 nicht mischbare Flüssigkeit sein. Das Fluid 2 bildet bei der Aus- führungsform nach Figur 4 keine geschlossene Grenzschicht 5, sondern tritt aus einem Schlauch 65 aus, der beispielsweise mit Hilfe eines Stempels 67 positionierbar ist. Der Schlauch 65 ist mit einem Kammervolumen 66 verbunden, bei dem es sich beispielsweise um eine gasgefüllte Spritze mit einem Feststellring handelt.
Eine Änderung des Probenvolumens 1 kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß der Stempel 67 bewegt wird. Eine andere Möglichkeit wäre eine Zuführung eines Gases über die Spritze 55. Das bei der Ausführungsform nach Figur 4 grundsätzlich mögliche „Creeping", d. h. ein Auswandern der Moleküle der oberflächenaktiven Substanz, kann beispielsweise dadurch minimiert werden, daß der Schlauch 65 außen hydrophil und innen hydrophob beschichtet ist.
Das Probenvolumen 1 in der Kammer 8 wird mit Hilfe des manuellen Kreuztisches 85 und der motorischen Mikrometerschraube 86 positioniert. Diese ist automatisch mit Hilfe einer softwarebasierten Steuerung möglich.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung eines anderen „Captive Bubble Surfactometer", bei dem als Mikroskop ein Rasterkraftmikroskop (SFM - „scanning force microscopy") vorgesehen ist. Bei einer anderen Ausführungsform kann eine andere Art eines Rastersondenmikroskops vorgesehen sein, beispielsweise ein optisches Nahfeldmikroskop (SNOM - „scanning near field microscopy"). Bei dem bevorzugten Ausführunsgbeispiel ist der Cantilever 90 an einem Piezo 91 angebracht, der seinerseits an der Kammer 8 befestigt ist. Der Piezo könnte alternativ auch am Objektiv 21 befestigt sein. Der Piezo muß derart beschaffen sein, dass er den Cantilever in allen drei Raumrichtunge bewegen kann, damit eine Rasterbewegung über die Oberfläche ausgeführt werden kann und gleichzeitig der Abstand so eingehalten werden kann, wie es die jeweilige Abbildungsart verlangt, x und y bezeichnen hierbei die Verschiebung senkrecht zur optischen Achse 6. z bezeichnet im folgenden die hierzu parallele Achse. Eignen würde sich z.B. ein in der Rastersondenmikroskopie bekannte Ausführung eine Pie- zoröhrchens. Alternativ könnte der Piezo nur in lateraler Richtung (x und y) scannen und die Verschiebung in vertikaler Richtung (z-Richtung) könnte von einem Piezo vermittelt werden, der am Stempel befestigt ist. Damit würde dann die Lufblase selbst vertikal verfahren. Es könnte natürlich auch die Luftblase in allen drei Raumrichungen bewegt werden. Die Detek- tion der Cantileververbiegung gelingt im gezeigten Ausführungsbeispiel durch das in der Rasterkraftmikroskopie weit verbreitete Lichtzeigeφrinzip. Der Laserstrahl 92 eines Lasers 93 wird mit einem Strahlteiler 95 auf den Cantilever gerichtet. Das Objektiv 21 übernimmt hierbei die Funktion der Fokussierung des Laserstrahls auf den Cantilever. Der reflektierte Strahl 96 wird dann wiederum über einen Strahlteiler 97 auf eine 4-Segment-Photodiode 98 gelenkt. Die an der Photodiode erhaltene Signale werden in einer Regel-Elektronik 99 ausgewertet und hierüber die Auslenkung der Piezos gesteuert. Außerdem werden die Signale an den PC zur Auswertung weitergegeben. Es können grundsätzlich alle bekannten Messmodi der Rastersondenmikroskopie auch an der Grenzfläche durchgeführt werden. In Figur 6 wird ein weiteres Ausführungsbeispiel gezeigt, daß eine sehr einfache Anwendung der Methode an einem Flüssigkeitstropfen 1 zeigt, der z.B. von einem Gas umgeben ist. Die Unbeweglichkeit des Oberflächenfilms ist aufgrund der axialsymmetrischen Form wiederum gewährleistet. Die Unterlage 45 könnte z.B. aus Teflon bestehen, wenn das Medium 1 hydro- phil ist, und aus Agar-Gel, wenn die Flüssigkeit hydrophob ist. Hiermit wäre gewährleistet, dass die Grenzfläche am Kontaktpunkt nur wenig gestört ist. Mit einer seitlichen Beobachtung 31 kann auch hier wieder der Umriss des Tropfens zur Bestimmung der Oberflächenspannung herangezogen werden. In diesem Ausführungsbeispiel könnte ein aufrechtes Mikroskop mit dem Objektiv 21 verwendet werden und die optimale Ausrichtung des Objektives und des Tropfens zueinander mit den handelsüblich vorhandenen Verstellern durchgeführt werden. Die Änderung der Oberfläche könnte über eine Spritze 48 erfolgen, die allerdings die Grenzfläche stört und somit das oben beschriebene Creeping ermöglicht.
Mit der vorliegenden Erfindung wird erstmals ein Messverfahren vorgestellt, mit dem ein oberflächenaktiver Film direkt an der Grenzfläche mikroskopisch beobachtet werden kann, der im Rahmen der Auflösung des jeweiligen Mikroskops still steht. Des weiteren wurden mehrere Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens vorgestellt, bei denen gleichzeitig die Oberflächenspannung gemessen werden kann. Ferner ist eine Komprimierung oder eine Expansion des Filmes bei gleichzeitiger mikroskopischer Beobachtung ausgewählter Oberflä- chenbereiche möglich, ohne daß diese aus dem Bildbereich geschoben werden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Untersuchen von Eigenschaften, insbesondere physikalischen Eigenschaften, einer oberflächenaktiven Substanz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- Einbringen eines Fluids (2) in Form eines Probenvolumens (1) in einem anderen, mit dem einen Fluid (2) nicht mischbaren Fluid (3), so daß zumindest in einem Teilbereich einer Oberfläche des Probenvolumens (1) eine Grenzschicht (5) zwischen dem einen Fluid (2) und dem anderen Fluid (3) gebildet wird, wobei das Probenvolumen (1) axialsymmetrisch um eine vorgegebene Definitionsachse (6) ausgebildet wird, so daß die Grenzschicht (5) axialsymmetrisch zu der vorgegebenen Definitionsachse (6) gebildet ist;
- Spreiten der oberflächenaktiven Substanz über die Grenzschicht (5) zum Ausbilden eines Oberflächenfilms im Bereich der Grenzschicht (5); und - mikroskopisches Untersuchen des Oberflächenfilms.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen (1) im wesentlichen kugelförmig ist, so daß die Grenzschicht (5) auf einer Kugeloberfläche gebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Grenzschicht (5) als eine geschlossene Schicht gebildet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvo- lumen (1) an einer Kapillare gehalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen (1) zum Positionieren des Probenvolumens (1) in dem anderen Fluid (3) an einer Stützfläche (71) angelegt wird, die gekrümmt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen (1) im Verlauf des mikroskopischen Untersuchens des Oberflächenfilms verändert wird, um die Grenzschicht (5) zu vergrößern und/oder zu verkleinern.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beim mikroskopischen Untersuchen des Oberflächenfilms eine Oberflächenspannung gemessen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Druck-Flächenisotherme der Oberflächenspannung gemessen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß beim mikro- skopischen Untersuchen des Oberflächenfilms ein „Captive Bubble Surfactometer" verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß beim mikroskopischen Untersuchen des Oberflächenfilms ein „Pulsating Bubble Surfactometer" verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum mikroskopischen Untersuchen des Oberflächenfilms ein Mikroskop (100) verwendet wird, dessen optische Achse kollinear zu der vorgegebenen Definitionsachse (6) ausgerichtet wird.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beim mikroskopischen Untersuchen ein Rastersondenmikroskop verwendet wird.
13. Vorrichtung zum Untersuchen von Eigenschaften, insbesondere physikalischen Eigenschaften, einer oberflächenaktiven Substanz, wobei die Vorrichtung die folgenden Merkmale aufweist:
- einen Meßraum (8), welcher wenigstens teilweise mit einem anderen Fluid (3) gefüllt ist; - eine Einführeinrichtung zum Einbringen eines Probenvolumens (1) eines Fluids (2) in dem anderen Fluid (3), welches mit dem einen Fluid (2) nicht mischbar ist, so daß zumindest in einem Teilbereich einer Oberfläche des Probenvolumens (1) eine Grenzschicht (5) zwischen dem einen Fluid (2) und dem anderen Fluid (3) gebildet ist, wobei das Probenvolumen (1) axialsymmetrisch um eine vorgegebene Definiti- onsachse (6) ausgebildet ist, so daß die Grenzschicht (5) axialsymmetrisch zu der vorgegebenen Definitionsachse (6) gebildet ist; und - eine Mikroskopeinrichtung zum mikroskopischen Untersuchen des Oberflächenfilms.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch eine Spreiteinrichtung (55) zum Einbringen einer oberflächenaktiven Substanz in dem Meßraum (8), um im Bereich der Grenzschicht (5) einen Oberflächenfilm zu bilden.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, gekennzeichnet durch eine Positioniereinrichtung zum Positionieren des Probenvolumens (1) in dem Meßraum (8) relativ zu der Mikroskopeinrichtung.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Positioniereinrichtung ein Positionierelement mit einer gekrümmten Stützfläche (71) zur Selbstpositionierung des Probenvolumens (1) umfaßt.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des Meßraums (8) verändert werden kann.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen (1) mittels der Positioniereinrichtung (85, 86) entlang einer x-, einer y- und einer z-Achse des Meßraums verlagert werden kann.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, gekennzeichnet durch Zuführmittel zum Einbringen des anderen Fluids (3) in dem Meßraum (8) umfaßt, wobei die Zuführmittel druck- und vakuumfest durch eine Wand des Meßraums (8) geführt sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Einführmittel zum Einbringen des Probenvolumens (1) eine Kapillareinrichtung umfassen, an welcher das Probenvolumen (1) nach dem Einbringen in dem Meßraum (8) fixiert ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroskopeinrichtung ein Lichtmikroskop (100) umfaßt.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung zum Messen einer Oberflächenspannung vorgesehen ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroskopeinrichtung ein Rastersondenmikroskop umfaßt.
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