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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Scanmikroskop mit einer Scaneinrichtung für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und einem eine optische Achse aufweisenden Objektiv, wobei eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen ist.
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Scanmikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt und existieren in unterschiedlichen Ausführungsformen. Dabei sind beispielsweise Laser-Scanmikroskope bekannt, bei denen ein Beleuchtungslichtstrahl über eine Scaneinrichtung und ein Objektiv auf eine zu untersuchende Probe geführt wird. Von der Probe wird reflektiertes oder aufgrund einer Anregung erzeugtes Licht zurück über das Objektiv und die Scaneinrichtung zu einem Detektor geleitet.
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Bei den bekannten Mikroskopen muss aus bautechnischen und Kostengründen meist ein Objektiv mit kleiner numerischer Apertur eingesetzt werden. Dies hat zur Folge, dass ein Beleuchtungsfokus oder Detektionsfokus eine relativ lange Erstreckung entlang der optischen Achse des Objektivs oder eine relativ lange PSF (Point Spread Function) aufweist. Mit anderen Worten ist der Fokus entlang der optischen Achse des Objektivs durch ein längliches Volumen gebildet. Aufgrund dieser Längserstreckung ist die Auflösung der üblicherweise verwendeten Objektive begrenzt und in vielen Anwendungsfällen nicht ausreichend.
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Insbesondere sind aus der
DE 43 24 681 A1 ein Verfahren und eine Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustands einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung bekannt. Von einer Punktlichtquelle kommendes Anregungslicht wird mit einem Objektiv auf den zu messenden Probenpunkt fokussiert. Eine Verbesserung einer lateralen Auflösung erfolgt durch Zusammenwirken von wenigstens zwei Lichtanteilen unterschiedlicher Wellenlängen.
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Des Weiteren ist aus der
DE 196 32 040 A1 eine Strahlumlenkeinheit zur mehrachsigen Untersuchung in einem Mikroskop bekannt, welche einerseits die Beleuchtung und/oder die Beobachtung der Probe von mehreren Seiten und andererseits die Beobachtung der Probe in einem Winkel zur Beleuchtungsachse erlaubt.
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Weiterhin sind aus der
DE 101 18 463 A1 ein Verfahren und eine Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe bekannt, wobei ein Linienfokus der Anregungsstrahlung in der Probe erzeugt wird. Die Erhöhung der axialen und lateralen optischen Auflösung erfolgt durch eine Strukturierung des Linienfokus, die Strukturierung wiederum erfolgt durch Überlagerung der Scanlinie mit einer periodischen Struktur.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Scanmikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, bei dem eine hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln realisiert ist.
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Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Scanmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst. Danach ist das Scanmikroskop dadurch gekennzeichnet, dass der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls eine zur optischen Achse geneigte Beleuchtungsrichtung aufweist, dass die Pupille des Objektivs vom Beleuchtungslichtstrahl einseitig unterleuchtet ist, dass der Beleuchtungslichtstrahl schräg und/oder zu dem Detektionslichtstrahl versetzt in die Scaneinrichtung eingekoppelt ist und dass der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls und ein Detektionsfokus synchronisiert sind.
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Im Konkreten ist das Scanmikroskop mit einer Beleuchtungseinrichtung ausgerüstet, die einen auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahl mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung erzeugt. Beim Mikroskopierbetrieb schneiden sich hierdurch das Detektionsfokusvolumen und das Beleuchtungsfokusvolumen, wobei im Ergebnis ein Schnittvolumen verbleibt, das die Ortsauflösung des Mikroskops bestimmt. Mit anderen Worten stehen das längliche Detektionsfokusvolumen und das längliche Beleuchtungsfokusvolumen in einem Winkel zueinander, so dass sich ein Schnittvolumen hinsichtlich des Fokus ergibt. Die Auflösung des Mikroskops lässt sich hierdurch in Richtung der optischen Achse mindestens um den Faktor 3 verbessern.
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Zur sicheren Positionierung des Beleuchtungslichtstrahls auf der Probe ist die Pupille des Objektivs vom Beleuchtungslichtstrahl unterleuchtet. Hierdurch ist ein Versatz des Fokus des Beleuchtungslichtstrahls zum Detektionsfokus erreichbar.
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Des Weiteren ist der Beleuchtungslichtstrahl schräg und/oder zu einem Detektionslichtstrahl versetzt in die Scaneinrichtung eingekoppelt.
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Hinsichtlich einer besonders hohen Auflösung sind der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls und ein Detektionsfokus synchronisiert. Hierdurch ist gewährleistet, dass sich der Beleuchtungslichtstrahl und ein Detektionsfokus in geeigneter Weise schneiden.
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Folglich ist mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop ein Scanmikroskop angegeben, bei dem eine hohe Auflösung mit konstruktiv einfachen Mitteln realisiert ist.
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Im Hinblick auf eine besonders hohe Auflösung könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels des Objektivs auf die Probe fokussierbar sein. Dabei wird der Beleuchtungslichtstrahl mit demselben Objektiv auf die Probe fokussiert, mit dem ein Detektionslichtstrahl zu einem Detektor geführt wird. Hierdurch ist ein besonders kleines Volumen des Beleuchtungslichtstrahlfokus und damit ein besonders kleines Schnittvolumen mit dem Volumen des Detektionsfokus erreichbar.
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Im Hinblick auf eine einfache Realisierung eines zur optischen Achse des Objektivs geneigten Beleuchtungslichtstrahls könnte der Beleuchtungslichtstrahl schräg in das Objektiv eingekoppelt sein.
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Bei einer weiteren Ausgestaltung des Scanmikroskops könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zweiten Objektivs auf die Probe fokussierbar sein. Die Fokussierung des Beleuchtungslichtstrahls könnte dabei unabhängig vom ursprünglich vorhandenen Objektiv erfolgen, mit welchem das Detektionslicht zum Detektor geführt wird.
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Die Fokussierung des Beleuchtungslichtstrahls zu einem möglichst kleinen Volumen des Beleuchtungsfokus bietet den weiteren Vorteil, dass die Probe in einem nur sehr kleinen und eng definierten Bereich durch das Beleuchtungslicht belastet ist. Bei lichtempfindlichen Proben hat dies eine wesentlich geringere Schädigung oder Beeinflussung der Probe zur Folge, als dies bei einer flächigen Beleuchtung der Fall ist.
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Bei einer alternativen Ausgestaltung könnte der Beleuchtungslichtstrahl mittels eines zusätzlichen und vorzugsweise konfokalen Scanners über die Probe führbar sein. Hierdurch ist ein von der üblichen Scaneinrichtung unabhängiges Scannen des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe ermöglicht.
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Je nach Anwendungsfall könnte der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls dem Detektionsfokus in vorgebbarem Umfang vorauseilen. Hierdurch wäre quasi ein Vorlaufscanner realisiert.
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Die vorliegende Erfindung könnte beispielsweise im Rahmen eines konfokalen Scanmikroskops realisiert werden. Des Weiteren könnte die vorliegende Erfindung bei einem Mikroskop realisiert werden, das als Objektiv eine Makrolinse aufweist. Derartige Mikroskope werden üblicherweise als Stereomikroskope bezeichnet. Bei einer konkreten Ausgestaltung könnte eine Makrolinse mit einem konfokalen Scanner kombiniert werden. Bei Einsatz der vorliegenden Erfindung bei einem Stereomikroskop könnte die Beleuchtung im Rahmen des linken oder rechten Strahlengangs realisiert sein.
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Die Beleuchtung der Probe könnte mittels des durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugten Beleuchtungslichtstrahls und eines entlang der optischen Achse verlaufenden weiteren Beleuchtungslichtstrahls gleichzeitig oder zeitlich versetzt erfolgen. Mit anderen Worten könnten in diesem Fall nicht nur der mit der Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl sondern auch ein weiterer entlang der optischen Achse verlaufender Beleuchtungslichtstrahl verwendet werden.
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In weiter vorteilhafter Weise könnten der durch die Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl und ein entlang der optischen Achse verlaufender weiterer Beleuchtungslichtstrahl unterschiedliche Wellenlängen aufweisen. Mit anderen Worten könnte in diesem Fall mit unterschiedlichen Wellenlängen beleuchtet und manipuliert werden. Eine derartige Manipulation der Probe könnte durch das Anregen einer Fluoreszenz in der Probe realisiert sein.
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Bei der vorliegenden Erfindung könnten die Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und die Detektions-PSF teilweise überlappen. Ein derartiges Überlappen ist insbesondere bei kleinen Vergrößerungen und bei Stereoobjektiven vorteilhaft.
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Des Weiteren könnte eine Erhöhung der Auflösung durch ein Überlagern der Sideloops der Beleuchtungs- oder Anregungs-PSF (Point Spread Function) und der Detektions-PSF realisiert werden. Sowohl die zuletzt genannte Überlappung als auch die zuletzt genannte Überlagerung lassen sich in einfacher Weise durch einen erfindungsgemäß geneigten Beleuchtungslichtstrahl einfach erreichen.
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Bei der vorliegenden Erfindung könnten die Beleuchtung und die Detektion mittels desselben Objektivs erfolgen, wobei eine Neigung des Beleuchtungslichtstrahls zur optischen Achse zu erfolgen hat. Alternativ hierzu könnten die Beleuchtung und die Detektion mittels separater Objektive erfolgen. Der Neigungswinkel des Beleuchtungslichtstrahls zur optischen Achse könnte grundsätzlich etwa 10° bis 20° betragen.
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Der von der Beleuchtungseinrichtung erzeugte Beleuchtungslichtstrahl könnte zur alleinigen oder zur zusätzlichen Beleuchtung der Probe dienen. Hierbei ist auf den jeweiligen Anwendungsfall abzustellen.
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Mit der vorliegenden Erfindung wird quasi eine Verkippung der Beleuchtung zur optischen Achse oder z-Achse erreicht, wobei die Detektion über die reguläre PSF zu einem kleinen Schnittvolumen zwischen Beleuchtungsfokus und Detektionsfokus führt.
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Mit dem Neigungswinkel könnte die Auflösung eingestellt werden. Grundsätzlich können mit der vorliegenden Erfindung sehr dicke Präparate untersucht werden. Mit einer Multiphoton-Beleuchtung könnte ein dickes Präparat in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung noch tiefer als bisher untersucht werden.
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Die Anwendung der vorliegenden Erfindung kann bei großen Präparaten im Millimeter- bis Zentimeterbereich mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern erfolgen. Die vorliegende Erfindung könnte im Rahmen der Photoaktivierung, Photochemie (CALI), Release Caged Compound und bei anderen Techniken vorzugsweise an großen Objekten angewendet werden.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Lehre anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
- 1 in einer schematischen Darstellung den Teilüberlapp der Volumina eines Beleuchtungsfokus und eines Detektionsfokus und das entsprechende Schnittvolumen bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops,
- 2 in einer schematischen Darstellung die Überlagerung der Sideloops einer Beleuchtungs-PSF und einer Detektions-PSF bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops und
- 3 in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops mit unterleuchteter Eintrittspupille.
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1 zeigt in einer schematischen Darstellung den teilweisen Überlapp der Volumina eines Beleuchtungsfokus 1 und eines Detektionsfokus 2 und im rechten Bereich der 1 das entsprechende Schnittvolumen 3 bei einem Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scan- oder Rastermikroskops. Das Ausführungsbeispiel weist eine hier nicht gezeigte Scaneinrichtung für einen Beleuchtungs- und/oder Detektionslichtstrahl und ein eine optische Achse aufweisendes und hier ebenfalls nicht gezeigtes Objektiv auf. Im Hinblick auf eine hohe Auflösung weist das Scanmikroskop eine Beleuchtungseinrichtung zur Erzeugung eines auf die Probe fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung auf.
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Der in 1 gezeigte Detektionsfokus 2 verläuft entlang der optischen Achse des Objektivs, üblicherweise die z-Achse. Der Beleuchtungsfokus 1 verläuft in einem Winkel zum Detektionsfokus 2, so dass ein Schnittvolumen 3 gebildet ist, das eine verbesserte Auflösung des Scanmikroskops gegenüber herkömmlichen Scanmikroskopen ergibt.
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2 zeigt in einer schematischen Darstellung die Überlagerung der Sideloops 4 der Anregungs-PSF und der Detektions-PSF bei einem weiteren Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops. Die Überlagerung ist durch eine gekreuzte Schraffur in der Mitte der 2 erkennbar. Als Folge der Überlagerung der Sideloops 4 ergibt sich eine deutlich verbesserte Ortsauflösung bei dem Scanmikroskop.
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3 zeigt in einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Scanmikroskops. Das Scanmikroskop weist eine Laserlichtquelle 21 zur Erzeugung eines auf die Probe 19 fokussierbaren Beleuchtungslichtstrahls mit einer zur optischen Achse geneigten Beleuchtungsrichtung auf. Mit anderen Worten dient die Laserlichtquelle 21 hier als Beleuchtungseinrichtung. Des Weiteren weist das Scanmikroskop einen Detektor 22 zur Detektion eines Detektionsprofils 23 auf.
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Die Laserlichtquelle 21 erzeugt einen Laserstrahl 24, der über eine Linse 6 auf ein Pinhole 8 fokussiert und dann auf einen Strahlteiler 9 geleitet wird. Als Strahlteiler kann ein normaler Dichroit oder ein AOBS verwendet werden.
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Dem Detektor 22 sind ein Pinhole 7 und eine Linse 5 zugeordnet.
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Im Strahlengang nach dem Strahlteiler 9 ist eine Kollimationslinse 10 angeordnet, die den Strahl auf eine Scaneinrichtung 11 führt. Nach der Scaneinrichtung 11 sind eine Scan-Linse 12 und eine Tubus-Linse 13 im Strahlengang angeordnet. Mit der Bezugsziffer 14 ist der Detektionsstrahlengang, mit der Bezugsziffer 15 der Beleuchtungsstrahlengang und mit der Bezugsziffer 16 die Eintrittspupille bezeichnet. Hierbei ist gut erkennbar, dass die Eintrittspupille 16 mittels des Beleuchtungsstrahlengangs 15 einseitig unterleuchtet wird. Hierdurch wird ein geneigter Beleuchtungslichtstrahl oder schräg gestellter Fokus erzeugt.
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Das Objektiv 17 ist mit einem Immersionsmedium 18 in Kontakt. Das Objekt oder die Probe 19 ist auf einem Schlitten 20 angeordnet.
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Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Scanmikroskops wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf diese Ausführungsbeispiele einschränken.
