WO2002050549A1

WO2002050549A1 - Verfahren zur fertilitätsbestimmung von säugetieren, insbesondere von menschen

Info

Publication number: WO2002050549A1
Application number: PCT/AT2001/000395
Authority: WO
Inventors: Karl Oskar Illmensee; Hans Dieplinger
Original assignee: Vitateq Biotechnology Gmbh
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2002-06-27
Also published as: AU2002220346A1; ATA21272000A

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, worin: einem Säugetier Körper- oder Organflüssigkeit entnommen wird; der Leptin- und Afamingehalt in dieser Körper- oder Organflüssigkeit bestimmt wird und der ermittelte Leptin- und Afamingehalt mit einem Leptin- und Afamin-Referenzwert zur Bestimmung der Fertilität verglichen wird, sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen.

Bedingt durch die Zunahme an Wissen und Fertigkeiten in der in vitro-Fertilisationstechnik ist der Bedarf an verlässlichen und auch kostengünstigen Fertilisationsbestimmungsmethoden stark gestiegen. Dabei geht es aber nicht nur um die prinzipielle Diagnose von Fertilisationsstörungen, sondern in zunehmendem Maße auch um die Detektion von Fertilisationsgraden und die Bestimmung der Befruchtung und/oder Einnistung der befruchteten Oozyten.

Afamin ist ein 87 kDa-Protein, welches zur Albumingruppe zählt und viele strukturelle und biochemische Gemeinsamkeiten mit den Proteinen dieser Gruppe, wie z.B. mit humanem Serumalbumin, humanem α-Fetoprotein oder humanem Vitamin D-Bindungsprotein, aufweist. Afamin wurde bereits kloniert und sequenziert und steht daher auch in rekombinanter Form zur Verfügung (WO 95/27059).

Darüberhinaus ergaben biochemische und physiologische Untersuchungen, dass dieses • Protein Vitamin E-bindende Eigenschaften aufweist. Es^" konnte nachgewiesen werden, dass Afamin nicht nur im Blut, sondern auch in anderen Körper- oder Organflüssigkeiten, wie beispielsweise Cerebrospinal-, Follikel- und Samenflüssigkeit, auftritt.-

Leptin wurde 1994 als zentrales, hungerregulierendes Stoffwechselhormon entdeckt und mit weiteren multiplen Funktionen verbunden. So konnte in einer Reihe von Untersuchungen die Bedeutung dieses Hormons für die Reproduktion bei Tier und Mensch gezeigt werden, wobei Funktion und Regulation von Leptin im Rahmen der Reproduktion noch nicht im Detail geklärt sind.

Leptin ist ein 16 kD-Protein aus der Zytokinfa ilie (Zhang Y. et al., Nature 1994, 372, S. 425-432) und wird von Adipocyten synthetisiert und sezerniert (R.V. Considine et al . , J. Clin. Invest 1995, 95, 2986-2988) . Leptin zirkuliert im Blut und ist gebunden an seinen löslichen Rezeptor (G.H. Lee et al . , Nature 1996, 379, 632-635) . Ein weiterer Rezeptor OB-R_s ist für den Transport von Leptin über die Blut-Hirnschranke verantwortlich (L.A. Tartaglia, Cell 1995, 83, 1263-1271). Im Hungerzentrum des Hypothalamus bindet Leptin an seinen langen, signalübertragenden Rezeptor OB-R_L (H. Chen et al . , Cell 1996, 84, 491-495), wodurch hier die Produktion des Neuropeptids Y (NPY) gehemmt wird (T.W. Stephens et al . , Nature 1995, 377, 530-532). Dadurch sinkt das Hungergefühl und steigt der Grundumsatz im Körper. Letztendlich kommt es zu einem Gewichtsverlust, vor allem zu einer Abnahme des Körperfett- anteils (M.A. Pelleymounter et al . , Science 1995, 269, 540-543, und J.L. Haiaas et al., Science 1995, 269, 543-546).

Seit der Entdeckung von Leptin 1994 wurde diesem Hormon stets auch eine Bedeutung für die Fortpflanzung zugeschrieben. Im Maus- modell sind weibliche Tiere, die kein Leptin produzieren^', unfruchtbar (A.-M. Ingalls et al . , J. Hered 1950, 41, 317-318). Wird ihnen jedoch Leptin zugeführt, entwickeln diese anatomisch und funktionell normale Fortpflanzungsorgane (F.F. Chehab et al . , Nature Genet. 1996, 12, 318-320, und K. Mounzih et al . , Endocrinol. 1997, 138, 1190-1193). Ein normaler Zyklus stellt sich ein, so- dass es regelmäßig zu Eisprung und Befruchtung kommen kann. Schwangerschaften werden wieder problemlos ausgetragen. Bis heute ist nicht bekannt, inwieweit Leptin direkt oder indirekt über die hypothalamo-hypophysäre Achse die Reproduktionsorgane beein- flusst. Die Bedeutung von Leptin für die Reproduktion beim Menschen ist ebenfalls noch völlig unklar. Rezeptor OB-R für Leptin wurde erstmals 1996 durch Northern-Blot-Analyse im Ovar nachgewiesen (J.A. Cioffi et al., Nature Med. 1996, 2, 585-589), woraufhin eine, mögliche Bedeutung dieses Hormons für die Fortpflanzung beim Menschen postuliert wurde. In weiterer Folge wurde der kurze Leptin-Rezeptor OB-R_s in Granulosa- und Cumuluszellen gefunden. Sowohl Leptin als auch Leptin-m-RNA konnten in Granulosa- und Cumuluszellen des Ovars mittels RT-PCR-Analyse und Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde in reifen menschlichen Eizellen nur Leptin, nicht jedoch Leptin-m-RNA gefunden (J.A. Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472). Es wurde postuliert, dass Leptin, das in den Granulosazellen des Ovars produziert wird, in die Eizelle pinocytotisch aufgenommen und darin in bestimmten Bereichen peripher und polarisiert ange- reichert wird. Nach der Befruchtung und weiteren Entwicklung findet sich Leptin in einigen Zellen des Präimplantationsembryos gemeinsam lokalisiert mit STAT 3, einem Schlüsselprotein der intrazellulären Signalübertragung und Transkription. Man nimmt an, dass Leptin an der Aktivierung dieses Transkriptionsfaktors beteiligt ist und damit die embryonale Genexpression beeinflusst (M. Antzcak et al . , Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 1067-1086). Eine weitere wichtige physiologische Funktion von Leptin beruht auf seiner Wirkung auf die Steroidhor onsynthese des Ovars, wobei hohe Konzentrationen an Leptin eine Hemmung der 17ß-Östradiolsyn- these in Granulosazellen verursachen, und damit die normale Funktion des Ovars beeinträchtigen können (R.J. Zachow et al . , Endo- crinol. 1997, 138(2), 847-850). Bei Patienten mit polycystischem Ovarialsyndrom (PCO) sind Interfertilität und Übergewicht in funktionellem und kausalem Zusammenhang mit erhöhten Leptinwerten gebracht worden (D. Micic et al . , Gynecol . Endocrinol . 1997, 11(5) , 315-320) .

In der WO 98/33865 werden Screening-Verfahren für Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, durch Messung von aus Nicht-Fettgewebe stammendem Leptin vorgeschlagen. Weiters wurde in dieser WO-Schrift auch erkannt, dass die Leptinmenge im Plasma von schwangeren Frauen im Vergleich zu der Menge, die auf Grund des Körpermasseindex (BMI) von nicht schwangeren Frauen zu erwarten wäre, deutlich erhöht ist und Werte aufweist, die etwa der Leptinmenge im Plasma von Übergewichtigen entsprechen. Demgemäß wird ein Schwangerschaftstest vorgeschlagen, bei welchem Schwangeren, die in der 8. bis 36. Schwangerschaftswoche sind, Proben aus Nicht-Fettgewebe entnommen und die enthaltene Leptinmenge bestimmt wird. Der ermittelte Leptingehalt wird dann mit dem Lep- tingehalt einer Nicht-Schwangeren, die das gleiche Alter und den gleichen Körpermasseindex hat, verglichen, um das Vorhandensein einer Schwangerschaft festzustellen.

Gerade in der Reproduktionsmedizin ist es aber erforderlich, noch vor der eigentlichen Schwangerschaft Anhaltspunkte für die Ferti- lität, z.B. für die Chancen bzw. Erfolgsaussichten eines Embryotransfers, zu erhalten. Weiters besteht Bedarf nach einer Methode, mit der der Zeitraum im Rahmen einer assistierten reproduktionsmedizinischen Behandlung überwacht werden kann. Verfahren zur Fertilitätsbestimmung, die sich auf die Bestimmung von Afamin bzw. Leptin alleine beziehen, sind in den PCT-Anmel- dungen Nr. PCT/AT00/00171 und PCT/AT00/00256 beschrieben.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt im Zurverfügungstellen einer neuartigen Fertilitätsbestimmungsmethode, mit der, neben der "natürlichen" Fertilitätsbestimmung im Rahmen eines normalen Zyklus, insbesondere ein in vitro-Fertilisationsprogramm, verlässlich überwacht werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, welches sich dadurch auszeichnet, dass

einem Säugetier Körper- oder Organflüssigkeit entnommen wird, . der Leptin- und Afamingehalt in dieser Körper- oder Organflüssigkeit bestimmt wird und - der ermittelte Leptin- und Afamingehalt mit einem Leptin- und Afamin-Referenzwert zur Bestimmung der Fertilität verglichen wird.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den zwei einleitend beschriebenen Verfahren, die über die Konzentrationsbestimmung von Leptin bzw. Afamin zu einer Fruchtbarkeitstestung gelangen, da beide Proteine direkt mit Fertilitätseigenschaften korrelieren. Da sich diese Korrelation der beiden Proteine nicht nur zur Diagnose von Fertilitätsstörungen sondern auch zur Diagnose von Fer- tilitätsschwankungen oder Schwangerschaften eignet, stellen die beiden getrennten Methoden für sich bereits effiziente Instrumente bei der Fruchtbarkeitsanalyse dar. So hat sich gezeigt, dass neben der Detektion von Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten über die Afamin- oder Leptintestung sogar eine Aussage hinsichtlich des Reifungsgrads von Oozyten möglich ist.

Weiters können mit diesen Tes.ts auch Fertilitätseigenschaften (und nicht erst bei Schwangerschaften) direkt mit dem Afamin- bzw. Leptingehalt korreliert werden, also zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt, als es die "üblichen" Schwangerschaftstests erlauben. <

Leptin und Afamin sind in vielen verschiedenen Körper- oder Organflüssigkeiten vorhanden und der Gehalt an diesen Proteinen ist in all diesen Flüssigkeiten mit den Fertilitätseigenschaften verbunden.

Erfindungsgemäß hat sich nun gezeigt, dass durch die Kombination dieser beiden Bestimmungsmethoden nicht nur die Vorteile jeder dieser einzelnen Bestimmungen in der gemeinsamen Bestimmung von Afamin und Leptin zutagetreten, sondern auch dass Unscharfen oder Fehler, die beispielweise auf sehr niedrige Konzentrationen in bestimmten Körper- oder Organflüssigkeiten zurückzuführen sind, durch die kombinierte Testung weitgehend vermieden werden können. Der erfindungsgemäße kombinierte Test von Afamin und Leptin führt daher in synergistischer Weise zu einem noch verlässlicheren Fruchtbarkeitstest als dies schon für die Afamin- bzw. Leptiribe- stimmung im Einzelnen belegt ist.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Afamin- bzw. Leptingehalt vorwiegend in Körper- oder Organflüssigkeiten bestimmt, die sich durch einen hohen physiologischen Afamin- und/oder Leptingehalt auszeichnen, wie z.B. Serum, Follikel- oder Samenflüssigkeit. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren mit anderen Körperoder Organflüssigkeiten, wie etwa Cerebrospinalflüssigkeit, durchzuführen, da auch die Konzentration von Leptin bzw. Afamin in diesen anderen Flüssigkeiten in Bereichen liegt, die hinsichtlich der möglichen Leptin- bzw. Afamin-Nachweisgrenze in der Regel keine Probleme mit sich bringen und durch die kombinierte Testung von Leptin und Afamin Fehler bzw. die Möglichkeit von Un- genauigkeiten im Hinblick auf die niedrige Konzentration ausgeschalten werden.

Die Art und Weise, wie das erfindungsgemäße Verfahren in der Praxis durchgeführt wird, ist vollkommen beliebig, vor allem, was die Art der Entnahme der Körper- oder Organflüssigkeiten oder die Bestimmung des Leptin- oder Afamingehaltes anbelangt. Beispielsweise kann der Leptin- und Afamingehalt immunologisch, elektro- phoretisch oder chromatographisch bestimmt werden. Immunologische Bestimmungsverfahren für Leptin und Afamin werden erfindungsgemäß oft bevorzugt, da nicht nur eine Reihe verschiedener monoklonaler Antikörper gegen verschiedenste Epitope von Leptin und Afamin zur Verfügung stehen, sondern weil sich gerade immunologische Tests, etwa in Form von Standard-ELISA-Tests leicht derart konzipieren lassen, dass sie auch ohne aufwendiges LaborInstrumentarium durchgeführt und ausgewertet werden können (etwa in Kombination mit kolorimetrischen Nachweisverfahren) . Dadurch ist es möglich, das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren auch in einer für Laien durchführbaren Form zur Verfügung zu stellen. Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß freies Afamin und/oder freies Leptin in der Probe bestimmt.

Als Referenzwert wird üblicherweise ein Afamin- bzw. Leptin-Nor- malwert für die jeweilige Körper- oder Organflüssigkeit herangezogen. Dieser kann beispielsweise in Form von Vergleichswerten, Vergleichskurven oder Vergleichstabellen beim erfindungsgemäßen Verfahren herangezogen oder - was generell bevorzugt wird - durch gleichzeitige Bestimmung einer Referenzprobe (mit definiertem Afamin- bzw. Leptingehalt) zusammen mit der Probe der entnommenen Körper- oder Organflüssigkeit erhalten werden. In letzterem Fall wird der wahrscheinlich nie ganz auszuschaltende systematische Fehler, den unterschiedliche Bestimmungsmethoden bzw. unterschiedliche Bestimmungsbedingungen mit sich bringen können, von vornherein hintangehalten. Dies kann vor allem bei Bestimmungen, wo es nur um graduelle Unterschiede im Afamin- oder Leptingehalt geht (etwa bei Bestimmung des Reifungsgrades von Oozyten)., wichtig sein.

Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäß vermessene Probe nicht nur mit einem Referenzwert, sondern mit zwei oder mehreren Referenzwerten verglichen. So kann man beispielsweise neben einem "Normalwert" auch einen anderen Referenzwert bzw. eine Referenzprobe vorsehen, wie etwa eine "pathologische" Referenz oder eine "Schwangerschafts"-Referenz, usw.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist aber jedenfalls das Vorsehen eines Referenzwertes für den Afamin- und/oder Leptingehalt in der entsprechenden Körper- oder Organflüssigkeit, die dem Afamin- oder Leptinwert eines Normalpatienten (oder im Falle der Tierzucht der Probe des normalen Tieres) entspricht. Dieser Referenzwert wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugterweise dadurch erhalten, dass parallel zur Fertilitätsbestimmung der Probe der Afamin- bzw. Leptingehalt einer Referenzprobe ermittelt wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Bestimmung des Afamin- bzw. Leptingehaltes mittels immunologischer Methoden durchgeführt, insbesondere unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, da hiedurch die Standardisierung sehr effizient zu erreichen ist und auch für verschiedenste Chargen eines Bestimmungskits die Kompatibilität der ermittelten Daten zueinander gegeben ist.

Es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass insbesondere in der Samen- und Follikelflüssigkeit neben dem Afamin- bzw. Leptingehalt auch der Vitamin E-Gehalt direkt mit der Fertilitätseigenschaft korreliert und daher ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren herangezogen werden kann. Bevorzugterweise wird daher das erfindungsgemäße Verfahren weiters mit einer Bestimmung des Vitamin E- Gehaltes in der jeweiligen Körper- oder Organflüssigkeit verbunden, welcher Vitamin E-Gehalt dann gegebenenfalls auch mit einem Referenzwert verglichen wird.

Verfahren zur Bestimmung von Vitamin E in Körper- oder Organflüssigkeiten sind mannigfaltig beschrieben. Wie bei der Bestimmung des Afamin- oder Leptingehaltes im Rahmen der vorliegenden Erfindung, ist auch die spezifische Art und Weise, wie der Vitamin E- Gehalt bestimmt wird, für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, jedoch sind HPLC oder andere biochemische Methoden die bevorzugten Methoden für die Bestimmung von Vitamin E-Konzentratio- nen.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Afamin und Leptin zur Bestimmung der Fertilitätseigenschaft von Säugetieren.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zur Bestimmung der Fertilität von Säugetieren, welcher

- eine Probe einer Körper- oder Organflüssigkeit eines Säugetieres oder ein Gefäß zur Aufnahme der Körper- oder Organ- flüssigkeit,

- ein Reagens zur Detektion des Afamingehaltes in der Probe,

- ein Reagens zur Detektion des Leptingehaltes in der Probe,

- ein Afamin-Referenzmittel und ^■

- ein Leptin-Referenzmittel umfasst.

Wie oben erwähnt, ist die Wahl des Reagens zur Detektion des Afamin- oder Leptingehaltes selbstverständlich abhängig von der jeweiligen Detektionsmethodik. Beispielsweise umfasst das Reagens zur Detektion des Afamin- bzw. Leptingehaltes vorzugsweise einen Antikörper gegen Afamin bzw. Leptin, insbesondere einen monoklo- nalen Afamin- bzw. Leptin-Antikörper .• Bevorzugterweise weist dieser Afamin- bzw. Leptin-Antikörper auch weitere Nachweismittel, wie etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Gruppen auf, oder kann durch anderen Detektionsmittel gebunden werden (z.B. durch Sekundär-Antikörper) .-

Das Afamin- und/oder Leptin-Referenzmittel umfasst bevorzugterweise eine standardisierte Menge an Afamin und/oder Leptin, etwa eine Referenzprobe der jeweiligen Körper- oder Organflüssigkeit. Andererseits kann das Afamin- und/oder Leptin-Referenzmittel aber auch aus einem einfachen Vergleichswert oder einer Vergleichstabelle bzw. einer Vergleichskurve bestehen, die bevorzugterweise für die jeweilige Körper- oder Organflüssigkeit und die jeweilige Nächweismethodik standardisiert ist.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer Kit, welcher eine ganze Reihe von standardisierten Afamin- bzw. Leptinproben aufweist, die z.B. eine Eichgerade definieren oder für bestimmte Fertilisationsmerkmale repräsentativ sind.

Wenn mit dem erfindungsgemäßen Kit auch der Vitamin E-Gehalt der jeweiligen Körper- oder Organflüssigkeit bestimmt werden soll, sind selbstverständlich auch die für diese Messung erforderlichen Reagentien und Referenzmittel (letztere sind beim Vorsehen von Referenzproben natürlich identisch) erforderlich.

Das Detektionsreagens für Leptin und/oder Afamin kann selbstverständlich auch ein kombiniertes Detektionsreagens sein, wo entwe- der beide Detektionsmittel für Leptin und Afamin in einem Gemisch enthalten sind und, mit verschiedenen, individuellen Nachweisrea- gentien, wie z.B. verschiedene seltene Erden, wie Eu, Yt, etc., oder verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe, oder gar durch eine einzige Molekülentität erkannt werden kann (beispielsweise durch einen bifunktionellen Antikörper, der sowohl Afamin als auch Leptin erkennen kann) . Derartige Antikörper können durch rekombinante DNA-Technologien genauso hergestellt werden wie durch chemische Kopplung einer Leptin-identifizierenden Entität mit einer Afamin- identifizierenden Entität.

Gleichfalls kann auch das Afamin- und das Leptin-Referenzmittel im Kit in kombinierter Form zur Verfügung gestellt werden (beispielsweise eine kombinierte Eichgerade oder eine Probe mit kombinierten Standardwerten von Leptin und Afamin) .

Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäß Kit werden bevorzugterweise zur Überwachung von Patienten im Rahmen von Fertilisierungsverfahren, insbesondere bei in vitro-Fertilisie- rung und intrazytoplasmischer Spermien-Injektion, verwendet. Hierbei ist es erforderlich, bei Testpersonen sehr genau die Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten sowie deren Qualität für eine erfolgreiche Befruchtung bzw. die Funktionalität von Sper- mien mit einem einfachen Test routinemäßig zu überwachen.

Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung im Rahmen einer assistierten reproduktionsmedizinischen Behandlung ist besonders die Überwachung des Zeitraums, beginnend mit der Niederregulierung bis zur Kontrolle der erfolgreichen Embryoeinnistung, wesentlich. Dieser Zeitraum (Niederregulierung - Stimulation - Punktion - Embryokultur - Embryotransfer in den Uterus - Einnisten des Embryos) kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verlässlich und eindeutig kontrolliert und observiert werden (also rund 4 Wochen vor bis 2 Wochen nach dem Embryotransfer) .

Damit ist eine prädiktive und prognostische Überwachung bzw. ein prädiktiver und prognostischer Marker für eine Diagnose im Verlauf eines in-vitro-Fertilisationsprogra ms möglich bzw. zur Ver^¬ fügung gestellt. Insbesondere können mit der vorliegenden Erfindung auch die Erfolgsaussichten bereits während der hormoneilen Stimulation, prognostiziert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren setzt demgemäß zu einem viel früheren Zeitpunkt an, als z.B. der in der WO 98/55865 beschriebene Schwangerschaftstest, und mit einem völlig anderen Ansatz, nämlich dem des Fertilitätstests . Insbesondere ist auch im Rahmen der erfindungsgemäßen in vitro-Fertilisationsüberwachung auch genau bekannt, wann der Embryo transferiert wird, während dies bei Schwangerschaftstests unbekannt ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt kann mit der vorliegenden Erfindung auch die Fruchtbarkeit bei Spontanzyklen bzw. bei unregelmäßigen Zyklen bestimmt werden. Bevorzugterweise geht man dabei bei der Befruchtung vor allem von den Daten vom normalen Zyklus aus .

Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Tests bzw. der erfindungsgemäßen Kits liegt in der Bestimmung des Reifegrades von Oozyten oder Spermien.

Weiters kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Kit zur Untersuchung von Fertilitäts- und Reproduktions- störüngen verwendet werden und ist insbesondere (für breite Reihentests und zur systematischen Untersuchung von großen Personengruppen sehr gut geeignet.

Die vorliegende Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichungsfiguren näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 : die Korrelation von Afamin in Follikel-Flüssigkeit von Personen mit oder ohne Eizelle;

Fig. 2 : die Korrelation von Afamin-Konzentration und Follikel- größe;

Fig. 3 : die Korrelation von Afamin und -Tocopherol-Konzentra- tion in Follikel-Flüssigkeit;

Fig. 4 : die Korrelation von Afamin und Reifungsgrad von Oozyten in Follikel-Flüssigkeit und Serum, aufgeschlüsselt nach großen, mittleren und kleinen Oozyten; Fig. 5 : SDS-PAGE mit Immunoblotting von 9 Proben Follikel-Flüssigkeit;

Fig. 6 : SDS-PAGE mit Immunobiotfing von 3 Proben liguor cerebro- spinalis .

Fig. 7 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten von Fol- likeln unterschiedlicher Größe;

Fig. 8 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten mit und ohne Eizelle;

Fig. 9 : die Korrelation zwischen der Konzentration von Leptin in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und im Serum von Patientinnen am Tag der Follikelpunktion;

Fig. 10 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration und dem Proteingehalt von Follikelflüssigkeiten großer Follikel;

Fig. 11 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und dem FSH-Spiegel im Serum nach hormoneller Stimulation mit rekombinantem FSH; und

Fig. 12 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration Östradiol (O) , Progesteron (Δ) und Prolactin (□) in Follikelflüssigkeiten großer Follikel.

B e i s p i e l e :

B e i s p i e l A: Afamin-Test

Patienten die einer Ovulationsinduktion für in vitro-Fertilisie- rung (IVF) oder intrazytoplasmatischer Spermien-Injektion (ICSI) unterzogen wurden, wurden Follikel verschiedener Größe mittels Ultrasonographischer Mittel individuell punktiert. Die individuellen Proben der Follikel-Flüssigkeit wurden auf Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten getestet, zentrifugiert und zur weiteren Untersuchung gelagert. Blutproben dieser Patienten wurden am Tag der Follikelpunktion entnommen und für die Serumaufarbeitung gesammelt. Die Konzentration von Afamin in der Follikel-Flüssigkeit und im Serum wurde quantitativ mittels Sandwich-ELISA (unter Ver- Wendung von monoklonalen Antikörpern) gemessen. Die Bestimmung von Vitamin E in diesen Proben wurde nach Proteinfällung und re- versed-phased HPLC vorgenommen. Qualitative Analyse von Afamin in Follikel-Flüssigkeit und Serum wurde mittels SDS-PAGE und Immuno- blotting vorgenommen.

Zunächst wurden jeweils 27 Proben von Patienten mit bzw. ohne Eizelle entnommen und der Afamingehalt ermittelt. Es zeigte sich, dass die Proben von Patienten mit Eizelle eine mittlere Afamin- konzentration von 38,9 μg/ml aufwiesen, die Proben von Patienten ohne Eizelle jedoch nur 30,5 (Fig. 1). Es zeigte sich also, dass die Afamirikonzentration bei Patienten mit Eizelle um nur 30 % höher lag, als der "Normalwert" (= ohne Eizelle) .

Im Anschluß daran wurde untersucht, ob und wie die Größe des Fol- likels mit der Afaminkonzentration korreliert. Dabei wurden die Follikel in 3 verschiedene Größentypen klassifiziert und wie in Fig. 2 gezeigt gegen die ermittelte Afaminkonzentration aufgetragen. Es zeigte sich, dass auch hierbei eine eindeutige Korrelation hervortritt, so dass die Afaminkonzentration ein direktes Maß für den Reifungsgrad einer Eizelle darstellt.

Aus Fig. 3 ergibt sich, dass auch eine eindeutige Korrelation zwischen der Vitamin E-Konzentration und der Afaminkonzentration in der Follikelflüssigkeit besteht, d.h.-, je höher die Afaminkonzentration ist, desto höher liegt die Vitamin E-Konzentration.

In einer weiteren Versuchsreihe wurde getestet, ob die für Follikelflüssigkeit erwiesene Korrelation zwischen An-/Abwesenheit von Eizellen bzw. den verschiedenen Reifungsgraden der Oozyten auch z.B. in Serum gegeben ist.

Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, können auch in Serum die verschiedenen Reifungsgrade von Eizellen über den Afamingehalt bestimmt werden.

In Fig. 5 ist eine Reihe von 9 verschiedenen Proben durch SDS- PAGE und Immunoblotting mit einem monoklonalen Afamin-Antikörper dargestellt. Hierbei kann die Bestimmung von Afamin über den Standard (ganz links in Fig. 5) vorgenommen werden. Schließlich wurde auch getestet, ob das erfindungsgemäße System auch in Cerebrospinal-Flüssigkeit Anwendung finden kann (Fig. 6) . Wie sich aus dieser Fig. 6 ergibt, lassen sich auch dort aufgrund der Varianz in den Afamin-Gehalten eindeutige Aussagen über die Fertilitätseigenschaften treffen.

B e i s p i e l B : eptin-Test

Follikelflüssigkeit und Serum

31 Patientinnen für eine IVF- oder ICSI-Behandlung wurden mit Leuprorelinacetat (3,75 mg s . a . ; Enantone Gyn, Takeda) als GnRH- Analogon am 21. Zyklustag "downreguliert" und anschließend mit rekombinantem FSH (Gonal-F, Serono und Puregon, Organon) hormoneil stimuliert. Die jeweils zu applizierende Dosis von FSH wurde über Ultraschall und Östradiolbestimmung individuell angepasst. Wenn mindestens zwei Follikel einen Durchmesser von 20 mm erreicht hatten, wurde die Ovulation durch intramuskuläre Gabe von hCG (10.000 IU; Profasi, Serono) ausgelöst. Etwa 36 Stunden nach hCG-Applikation erfolgte transvaginal die sonographisch gesteuerte Follikelpunktion mit anschließender mikroskopischer Untersuchung auf das Vorhandensein von Eizellen in der aspirierten Follikelflüssigkeit. Nach Gewinnung der Eizellen wurden die individuellen Follikelflüssigkeiten zentrifugiert und die Überstände bei -196°C für die weiteren Bestimmungen aufbewahrt. Für Serumuntersuchungen wurden die zum Zeitpunkt der Follikelpunktion abgenommenen Blutproben zentrifugiert und die Seren ebenfalls bei -196°C gelagert.

Leptinbestimmung:

Leptin-Konzentrationen wurden radioimmunometrisch bestimmt (Linco Research, St. Charles, MO, USA), wobei ein Antiserum ohne Kreuzreaktionen mit menschlichem Insulin, Proinsulin, Ratteninsulin, C-Peptid, Glucagon, Pancreas-Propeptid oder Somatostatin zur Anwendung kam. Der Nachweisbereich liegt zwischen 0,5 ng/ml und 100 ng/ml . Hormonbestimmungen:

Ostradiol wurde radioimmunometrisch bestimmt (Estradiol MAIA, Bio Chem Immuno Systems, Bologna,- Italien). Follikelflüssigkeit wurde mit Serum postmenopausaler Frauen 1:100 verdünnt. Der Östradiol- spiegel dieser Seren wurde von der Konzentration in der Follikel- flüssigkeit abgezogen.

Progesteron wurde ebenfalls radioimmunometrisch bestimmt (Orion Diagnostica, Espoo, Finnland). Follikelflüssigkeit wurde mit dem oben erwähnten Serum 1:1000 verdünnt. Prolactin wurde radioimmunometrisch mittels RIA-Kit (Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien) bestimmt. Follikelflüssigkeiten wurden mit Null-Standard 1:5 verdünnt, um eine nahezu idente Matrix für Proben und Standards zu haben. Messungen der Ostradiol-, Progesteron- und Pro- lactin-Werte wurden entsprechend den Anleitungen der Produkthersteller durchgeführt. FSH wurde im Serum am Tag der Punktion radioimmunometrisch bestimmt (FSH Maioclon, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien) .

Proteinbestimmung:

Die Proteinmenge in der Follikelflüssigkeit und im Serum wurde nach der Lowry-Methode (O.H. Lowry et al . , J. Biol . Chem. 1951, 193, 265-275) bestimmt, wobei BSA von bekannter Konzentration (1 mg/ml) als Standard verwendet wurde. Alle Proben wurden in Phos- phat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und im Spectro- photometer (Beckman DU 62) bei einer Exzitationswellenlänge von 750 nm gegenüber dem Referenzwert gemessen.

Statistik:

Statistische Berechnungen wurden mit Microsoft Excel Version 5.0a und Origin V 4.1 erstellt. Parametrische Daten wurden mittels "two-tailed t test" bestimmt, Korrelationen mittels Pearson-Kor- relationskoeffizient festgelegt, wobei ein p-wert <0,05 als signifikant erachtet wurde.

ERGEBNISSE:

Die klinischen Daten der Patientinnen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Follikelflüssigkeiten aus Follikeln unterschiedlicher Größe dieser Patientinnen wurden getrennt untersucht. Weiters wurde berücksichtigt, ob in der gewonnenen Follikelflüssigkeit eine Eizelle vorhanden war. Die Leptinkonzentration in großen Follikeln (0 >19mm) betrug im Mittel 9,03. +/- 5,15 ng/ml, in mittelgroßen Follikeln (0 16-19 mm) 4,67 +/- 2,96 ng/ml und in kleinen Follikeln (0 <16 mm) 3,99 +/- 2,19 ng/ml, wobei der Unterschied in der Leptinkonzentration- in großen zu mittleren Follikeln (p = 0,02) und kleinen Follikeln (p <0,01) statistisch signifikant war (Fig. 7) . In großen Follikeln mit Eizelle war die Leptinkonzentration in der Follikelflüssigkeit höher als in großen Follikeln ohne Eizelle (10,12 +/- 5,67 ng/ml v.s. 7,84 +/- 4,28 ng/ml, p = 0,07) (Fig. 8). Im Serum der Patientinnen war Leptin am Tag der Follikelpunktion etwa doppelt so hoch wie die üblicherweise für unstimulierte Frauen angegebenen Normwerte (12,68 +/- 8,98 ng/ml v.s. 5,5 ng/ml, siehe C. Schubring et al . , J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1997, 82, 1480-1483). Im Vergleich von Leptin im Serum mit Leptin in der Follikelflüssigkeit wurde eine statistisch hoch signifikante Korrelation (r = 0,74, p <0,0001) zwischen beiden Parametern (Fig. 9) gefunden. Um festzustellen, ob der Leptingehalt in der Follikelflüssigkeit möglicherweise mit einer allgemein vermehrten Proteinbiosynthese in Zusammenhang steht, wurde der Gesamtproteingehalt der Follikelflüssigkeiten bestimmt. Hierbei konnte keinerlei Korrelation zwischen Leptin und Proteinspiegel gefunden werden (r = 0,168, p = 0,165) (Fig. 10). Um eine mögliche hormoneile Regulation der Lep- tinproduktion unter Stimulationsbehandlung aufzudecken, wurde in einer Studie die applizierte Menge an rekombinantem FSH mit dem Leptinspiegel sowohl im Serum als auch in der Follikelflüssigkeit verglichen. Dabei zeigte sich, dass keinerlei Korrelation zwischen diesen beiden Parametern herzustellen war (Fig. 11). Wei- rr P- 3 « H t _ F DJ DJ fr¹ td H¹ P^ DJ φ rt

H- H- o H- o DJ 0 φ μ- rt φ 0 O: φ μ- μ- Φ

O <Q o r 0 Pi •Ö iQ - ι-5 •ö P^ DJ DJ ^|Q 0 li

P Φ p⁴ N o rr 0 0 rt o 0 0 φ DJ

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woraus geschlossen werden kann, dass diese Hormone keinen direkten Einfluss auf die Leptinmenge in der Follikelflüssigkeit ausüben. Auch im Serum der untersuchten Patientinnen stellt sich die Leptinmenge als unabhängig sowohl von der Menge an appliziertem, rekombinantem FSH als auch der Konzentration von Ostradiol, Progesteron und Prolactin heraus . Dies steht im Gegensatz zu Untersuchungen an Frauen im Spontanzyklus, bei denen Leptin- und Progesteronmengen im Serum korrelieren (L. Hardie et al . , Clin. En- docrinol . 1997, 47,101-106). Zusätzlich wurde in Übereinstimmung mit anderen Autoren (J.A. Cioffi et al . , Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472) gefunden, dass nach kontrollierter hormoneller Stimulation bei den untersuchten Patientinnen keinerlei Korrelation zwischen Serumleptin und BMI vorliegt, welches ebenfalls gegensätzlich zu hormoneil unstimulierten und nicht schwangeren Frauen steht, bei denen eine hoch signifikante Übereinstimmung dieser beiden Parameter besteht (L. Hardie et al . , Clin. Endocrinol . 1997, 47, 101-106) .

Es wurde aber eine hoch signifikante Korrelation zwischen der Konzentration von Leptin in der Follikelflüssigkeit großer Follikel und im Serum gefunden. Daraus kann geschlossen werden, dass unter hormoneller Stimulation sowohl die systemische als auch die ovarielle Produktion von Leptin angeregt wird. Wäre einerseits nur die systemische Produktion von Leptin für dessen Anreicherung verantwortlich, sollte in allen Follikeln ein und derselben Patientin annähernd gleiche Leptinspiegel gefunden werden. Dies ist jedoch nicht der Fall. Würde es sich um eine vorwiegend auf das Ovar bezogene Leptinstimulation handeln, wäre in den Follikel- ^' flüssigkeiten ein bedeutend höherer Leptinwert als im Serum zu erwarten. Auch diese Interpretation würde im Gegensatz zu den vorliegenden Ergebnissen stehen.

Es konnte eine deutliche Tendenz zu höheren Leptin-, Ostradiol-, Progesteron- und Prolactinwerten in Follikeln mit Eizelle in der punktierten Follikelflüssigkeit beobachtet werden. Weiters ist für alle untersuchten Hormone eine kontinuierliche Zunahme der Konzentration mit dem Follikeldurchmesser erkennbar. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass sowohl Leptin, als aucl Ostradiol, Progesteron und Prolactin für Wachstum und Differenzierung von Ovarialfollikeln von Bedeutung sind. Es ist jedoch kein direkter Einfluß von Ostradiol, Progesteron oder Prolactin auf die Leptinsynth.ese zu erkennen. Tatsache ist, dass unter hormoneller Stimulation die Leptinsynthese im Körper deutlich ist, jedoch einem anderen oder zusätzlichen Regulationsmechanismus unterliegt als im Spontanzyklus. Die erfindungsgemäße Methodologie ist somit als weiteres, unabhängiges und zuverlässiges Instrument zur Fertilitätsbestimmung universell einsetzbar.

T a b e l l e 1 FO IKELDURCHMESSER

Claims

P a t e n t an s p rü c h e :

1. Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass

- einem Säugetier Körper- oder Organflüssigkeit entnommen wird, der Leptin- und Afamingehalt in dieser Körper- oder Organflüssigkeit bestimmt wird und der ermittelte Leptin- und Afamingehalt mit einem Leptin- und Afamin-Referenzwert zur Bestimmung der Fertilität verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper- oder Organflüssigkeit Serum, Follikel- oder Samenflüssigkeit ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert der Afamin- und/oder Leptingehalt in der entsprechenden Körper- oder Organflüssigkeit eines Normalpatienten ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert parallel zur Fertilitätsbestimmung ermittelt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, dass der Afamin- und/oder Leptingehalt mittels immunologischer Methoden, insbesondere unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, ermittelt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich der Vitamin E-Gehalt in der Körperoder Organflüssigkeit bestimmt und gegebenenfalls mit einem Referenzwert verglichen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an freiem Afamin und/oder freiem Leptin bestimmt wird.

8. Kit zur Bestimmung der Fertilität von Säugetieren, umfassend

- eine Probe einer Körper- oder Organflüssigkeit eines Säugetieres oder ein Gefäß zur Aufnahme der Körper- oder Organ flüssigkeit,

- ein Reagens zur Detektion des Afamingehaltes in der- Probe, ein Reagens zur Detektion des Leptingehaltes in der Probe, ein Afamin-Referenzmittel, und ein Leptin-Referenzmittel.

9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens zur Detektion des Afamin- und/oder Leptingehaltes einen Antikörper, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, umfasst.

10. Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Afamin- bzw. Leptin-Referenzmittel eine standardisierte Menge an Afamin bzw. Leptin umfasst.

11. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Afamin- bzw. Leptin-Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Afamin- bzw. Leptin-Proben ist.

DA/Se