WO2001022091A2 - Verfahren zur fertilitätsbestimmung von säugetieren, insbesondere von menschen - Google Patents

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WO2001022091A2
WO2001022091A2 PCT/AT2000/000256 AT0000256W WO0122091A2 WO 2001022091 A2 WO2001022091 A2 WO 2001022091A2 AT 0000256 W AT0000256 W AT 0000256W WO 0122091 A2 WO0122091 A2 WO 0122091A2
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Hans Dieplinger
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

Definitions

  • the invention relates to a method for determining fertility in mammals, in particular humans.
  • Leptin was discovered in 1994 as a central, hunger-regulating metabolic hormone and associated with other multiple functions. A number of studies have shown the importance of this hormone for reproduction in animals and humans, although the function and regulation of leptin in reproduction have not yet been clarified in detail.
  • Leptin is a 16 kD protein from the cytokine family (Zhang Y. et al., Nature 1994, 372, pp. 425-432) and is synthesized and secreted by adipocytes (RV Considine et al., J. Clin. Invest 1995, 95, 2986-2988). Leptin circulates in the blood and is bound to its soluble receptor (GH Lee et al., Nature 1996, 379, 632-635). Another receptor OB-R s is responsible for the transport of leptin across the blood-brain barrier (LA Tartaglia, Cell 1995, 83, 1263-1271).
  • leptin In the hunger center of the hypothalamus, leptin binds to its long, signal-transmitting receptor OB-R L (H. Chen et al., Cell 1996, 84, 491-495), which inhibits the production of the neuropeptide Y (NPY) here (TW Stephens et al., Nature 1995, 377, 530-532). This reduces the feeling of hunger and increases the basic metabolism in the body. Ultimately, there is weight loss, especially a decrease in body fat (MA Pelleymounter et al., Science 1995, 269, 540-543, and JL Haiaas et al., Science 1995, 269, 543-546).
  • leptin influences the reproductive organs directly or indirectly via the hypothala o-pituitary axis.
  • the importance of leptin for human reproduction is also still completely unclear.
  • Receptor OB-R for leptin was first detected in 1996 by Northern blot analysis in the ovary (JA Cioffi et al., Nature Med. 1996, 2, 585-589), whereupon a possible significance of this hormone for human reproduction was postulated , The short leptin receptor OB-R s was subsequently found in granulosa and cumulus cells.
  • leptin and leptin RNA could be detected in granular and cumulus cells of the ovary using RT-PCR analysis and immunofluorescence.
  • leptin but not leptin-m-RNA, was found in mature human egg cells (JA Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472). It has been postulated that leptin, which is produced in the granulosa cells of the ovary, is taken up into the egg cell in a pinocytotic manner and is enriched peripherally and polarized in certain areas. After fertilization and further development, leptin is found in some cells of the pre-implantation embryo together with STAT 3, a key protein of intracellular signal transmission and transcription.
  • leptin is involved in the activation of this transcription factor and thus influences embryonic gene expression (M. Antzcak et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 1067-1086).
  • Another important physiological function of leptin is due to its effect on ovarian steroid hormone synthesis, whereby high concentrations of leptin inhibit 17ß-estradiol synthesis in granulosa cells and can thus impair the normal function of the ovary (RJ Zachow et al., Endocrinol. 1997, 138 (2), 847-850).
  • PCO polycystic ovarian syndrome
  • interfertility and obesity are functionally and causal connection with increased leptin values (D. Micic et al., Gynecol. Endocrinol. 1997, 11 (5), 315-320).
  • WO 98/33865 proposes screening methods for diseases, in particular cancer, by measuring leptin derived from non-adipose tissue. Furthermore, it was also recognized in this WO document that the amount of leptin in the plasma of pregnant women is significantly increased compared to the amount that would be expected from non-pregnant women on the basis of the body mass index (BMI) and has values which are approximately that of Leptin levels in plasma correspond to obesity. Accordingly, a pregnancy test is proposed in which pregnant women who are in the 8th to 36th week of pregnancy take samples from non-adipose tissue and determine the amount of leptin contained. The leptin content determined is then compared with the leptin content of a non-pregnant woman who has the same age and the same body mass index in order to determine the presence of a pregnancy.
  • BMI body mass index
  • the object of the present invention is therefore to provide a completely new fertility determination method with which - in addition to a "natural" fertility determination within the framework of a normal cycle - i.a. these indications are given and this monitoring can be guaranteed.
  • This object is achieved according to the invention by a method for determining the fertility of mammals, in particular humans, which is characterized in that
  • the leptin content in this body or organ fluid is determined and - The determined leptin content is compared with a reference value for determining the fertility.
  • the present invention is based on the surprising finding that the leptin concentration in the various body or organ fluids, where leptin is present, correlates directly with fertility properties. This correlation is not only limited to the presence of fertility disorders, but is also possible for the diagnosis of fertility fluctuations or for checking the event of an embryo implantation in the course of in vitro fertilization. According to the invention, it has even been shown that, in addition to the detection of the presence or absence of oocytes, the methodology according to the invention for determining the leptin content even makes a statement regarding the degree of maturation of oocytes.
  • the present invention is therefore based on the knowledge that the fertility property (and not the pregnancy) correlates directly with the leptin content, that is to say at a much earlier point in time than the method according to WO 88/55865 , begins: While the determination of pregnancy according to WO 88/55865 is described as possible from the 8th week of pregnancy, the test according to the invention starts long before the onset of pregnancy, eg as part of normal cycle monitoring or assisted reproductive medication, and concludes with successful embryo implantation (i.e. 0th, 1st or 2nd week of pregnancy).
  • the present invention can be used in human medicine, in particular in the monitoring of in vitro fertilizations or in production diagnoses and reports. However, it also has enormous application possibilities in the context of modern animal breeding, since it can be standardized in a simple manner and no complicated laboratory facilities are required to carry out the test.
  • Leptin is present in many different body or organ fluids and it has been shown according to the invention that the leptin content in all these fluids with the fertility egg properties correlated. According to preferred embodiments of the present invention, however, the leptin content is predominantly determined in body or organ fluids which are distinguished by a high physiological leptin content, such as, for example, serum, follicular or seminal fluid.
  • a high physiological leptin content such as, for example, serum, follicular or seminal fluid.
  • other body or organ fluids such as cerebrospinal fluid, since the concentration of leptin in these other fluids is also in ranges which generally do not pose any problems with regard to the possible leptin detection limit ,
  • the leptin content can be determined immunologically, electrophoretically or chromatographically.
  • Immunological determination methods for leptin are often preferred according to the invention because not only are a number of different monoclonal antibodies available against various epitopes of leptin, but because immunological tests, for example in the form of standard ELISA tests, can easily be designed in such a way that they too can be carried out and evaluated without complex laboratory instruments (e.g. in combination with colorimetric detection methods). This makes it possible to provide the determination method according to the invention also in a form that can be carried out by laypeople.
  • free leptin is preferably determined in the sample.
  • a leptin normal value for the respective body or organ fluid is usually used as the reference value.
  • This can be used for example in the form of comparison values, comparison curves or comparison tables in the method according to the invention or - which is generally preferred - can be obtained together with the sample of the removed body or organ fluid by simultaneously determining a reference sample (with a defined leptin content).
  • the systematic error which can probably never be completely eliminated, the different determination methods or different determination conditions can bring with it from the outset. This can be particularly important for determinations where there are only gradual differences in the leptin content (e.g. when determining the degree of maturation of oocytes).
  • the sample measured according to the invention is preferably not only compared with one reference value, but with two or more reference values.
  • a reference value in addition to a "normal value", it is also possible to provide another reference value or a reference sample, such as a "pathological" reference or a “pregnancy” reference, etc.
  • a reference value for the leptin content in the corresponding body or organ fluid which corresponds to the leptin value of a normal patient (or in the case of animal breeding, the sample of the normal animal).
  • this reference value is preferably obtained by determining the leptin content of a reference sample in parallel with the fertility determination of the sample.
  • the determination of the leptin content by means of immunological methods, in particular using a monoclonal antibody is preferred, since standardization can be achieved very efficiently by this and the data obtained are compatible with one another for the most varied batches of a determination kit.
  • the present invention relates to the use of leptin for determining the fertility property of mammals.
  • Another aspect of the present invention relates to a kit for determining the fertility of mammals which
  • the choice of the reagent for the detection of the leptin content is of course dependent on the respective detection methodology.
  • the reagent for detecting the leptin content preferably comprises an antibody against leptin, in particular a monoclonal leptin antibody.
  • This leptin antibody preferably also has other detection means, such as fluorescent, radioactive or chromogenic groups, or can be bound by other detection means (e.g. by secondary antibodies).
  • the leptin reference agent preferably comprises a standardized amount of leptin, for example a reference sample of the respective body or organ fluid.
  • the leptin reference agent can also consist of a simple comparison value or a comparison table or a comparison curve, which is preferably standardized for the respective body or organ fluid and the respective detection method.
  • kits according to the invention are particularly preferred which has a whole series of standardized leptin samples which, for example define a calibration line or are representative of certain fertilization features.
  • the method according to the invention or the kit according to the invention are preferably used for monitoring patients in the context of fertilization methods, in particular in the case of in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection. It is necessary to routinely monitor the presence or absence of oocytes and their quality for successful fertilization or the functionality of sperm with a simple test.
  • the method according to the invention accordingly starts at a much earlier point in time than the pregnancy test described in WO 98/55865, and with a completely different approach, namely that of the fertility test.
  • the in vitro fertilization monitoring according to the invention it is also known exactly when the embryo is transferred, while this is unknown in pregnancy tests.
  • the present invention can also be used to determine fertility in spontaneous cycles or in irregular cycles. It is preferable to go to the Fertilization mainly from the data from the normal cycle.
  • test according to the invention or the kits according to the invention is to determine the degree of maturity of oocytes or sperm.
  • the method according to the invention or the kit according to the invention can be used for the investigation of fertility and reproductive disorders and is particularly well suited for broad series tests and for the systematic examination of large groups of people.
  • Another aspect of the present invention relates to the therapeutic use of leptin to support fertility properties.
  • leptin applied in the course of monitoring according to the invention of an in vitro fertilization program if the measured leptin amounts are not considered to be sufficient for a promising course of the program (for example if they are below the normal value by more than 10%, in particular more than 30%) for a successful course).
  • the present invention also relates to the use of leptin for the preparation of an agent to improve fertility.
  • An effective amount of leptin is administered to humans or animals (mammals) in order to increase the leptin content to the required values.
  • this is not only possible with in vitro fertilizations, but also in the course of monitoring natural fertilizations and pregnancies.
  • the sonographically controlled follicular puncture was performed transvaginally, followed by a microscopic examination for the presence of eggs in the aspirated follicular fluid. After the egg cells had been obtained, the individual follicular fluids were centrifuged and the supernatants kept at -196 ° C. for further determinations. For serum tests, the blood samples taken at the time of follicular puncture were centrifuged and the sera were also stored at -196 ° C. Leptin determination:
  • Leptin concentrations were determined by radioimmunometry (Linco Research, St. Charles, MO, USA) using an antiserum without cross-reactions with human insulin, proinsulin, rat insulin, C-peptide, glucagon, pancreatic propeptide or somatostatin.
  • the detection range is between 0.5 ng / ml and 100 ng / ml.
  • Ostradiol was determined by radioimmunometry (Estradiol MAIA, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italy). Follicular fluid was diluted 1: 100 with serum from postmenopausal women. The estradiol level of these sera was subtracted from the concentration in the follicular fluid.
  • Progesterone was also determined by radioimmunometry (Orion Diagnostica, Espoo, Finland). Follicular fluid was diluted 1: 1000 with the serum mentioned above. Prolactin was determined radioimmunometrically using a RIA kit (Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italy). Follicular fluids were diluted 1: 5 with zero standard to have an almost identical matrix for samples and standards. Measurements of the ostradiol, progesterone and prolactin values were carried out in accordance with the instructions of the product manufacturers. FSH was determined by radioimmunometry in the serum on the day of the puncture (FSH Maioclon, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italy).
  • the amount of protein in the follicular fluid and in the serum was determined by the Lowry method (OH Lowry et al., J. Biol. Chem. 1951, 193, 265-275), with BSA of known concentration (1 mg / ml) as standard was used. All samples were diluted in phosphate-buffered saline (PBS) and analyzed in the spectrophotometer. photometer (Beckman DU 62) measured at an excitation wavelength of 750 nm compared to the reference value.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the clinical data of the patients can be found in Table 1. Follicular fluids from follicles of different sizes in these patients were examined separately. Furthermore, it was considered whether an egg cell was present in the follicular fluid obtained.
  • leptin occurs in human follicular fluid and is produced by granulosa cells in the ovary (JA Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472). It is assumed that one of the leptins gets from the follicular fluid into the maturing oocyte and is stored there peripherally and polarized into the cytoplasm (M. Antczak et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 1067-1086). Patients during controlled hormonal ovarian stimulation show a significant increase in serum leptin from day three to nine of the stimulation cycle, which remains constant until the time of ovulation triggering (T. Strowitzki et al., Gynecol.
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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, worin einem Säugetier Körper- oder Organflüssigkeit entnommen wird, der Leptingehalt in dieser Körper- oder Organflüssigkeit bestimmt wird und der ermittelte Leptingehalt mit einem Referenzwert zur Bestimmung der Fertilität verglichen wird, die Verwendung von Leptin zur Bestimmung der Fertilität von Saügetieren, sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.

Description

Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen.
Bedingt durch die Zunahme an Wissen und Fertigkeiten in der in vitro-Fertilisationstechnik ist der Bedarf an verlässlichen und auch kostengünstigen Fertilisationsbestimmungs ethoden stark gestiegen. Dabei geht es aber nicht nur um die prinzipielle Diagnose von Fertilisationsstörungen, sondern in zunehmendem Maße auch um die Detektion von Fertilisationsgraden und die Bestimmung der Befruchtung und/oder Einnistung der befruchteten Oozyten.
Leptin wurde 1994 als zentrales, hungerregulierendes Stoffwechselhormon entdeckt und mit weiteren multiplen Funktionen verbunden. So konnte in einer Reihe von Untersuchungen die Bedeutung dieses Hormons für die Reproduktion bei Tier und Mensch gezeigt werden, wobei Funktion und Regulation von Leptin im Rahmen der Reproduktion noch nicht im Detail geklärt sind.
Leptin ist ein 16 kD-Protein aus der Zytokinfamilie (Zhang Y. et al., Nature 1994, 372, S. 425-432) und wird von Adipocyten synthetisiert und sezerniert (R.V. Considine et al . , J. Clin. Invest 1995, 95, 2986-2988) . Leptin zirkuliert im Blut und ist gebunden an seinen löslichen Rezeptor (G.H. Lee et al . , Nature 1996, 379, 632-635) . Ein weiterer Rezeptor OB-Rs ist für den Transport von Leptin über die Blut-Hirnschranke verantwortlich (L.A. Tartaglia, Cell 1995, 83, 1263-1271). Im Hungerzentrum des Hypothalamus bindet Leptin an seinen langen, signalübertragenden Rezeptor OB- RL (H. Chen et al . , Cell 1996, 84, 491-495), wodurch hier die Produktion des Neuropeptids Y (NPY) gehemmt wird (T.W. Stephens et al., Nature 1995, 377, 530-532). Dadurch sinkt das Hungergefühl und steigt der Grundumsatz im Körper. Letztendlich kommt es zu einem Gewichtsverlust, vor allem zu einer Abnahme des Körperfettanteils (M.A. Pelleymounter et al . , Science 1995, 269, 540- 543, und J.L. Haiaas et al . , Science 1995, 269, 543-546).
Seit der Entdeckung von Leptin 1994 wurde diesem Hormon stets auch eine Bedeutung für die Fortpflanzung zugeschrieben. Im Mausmodell sind weibliche Tiere, die kein Leptin produzieren, unfruchtbar (A.M. Ingalls et al . , J. Hered 1950, 41, 317-318). Wird ihnen jedoch Leptin zugeführt, entwickeln diese anatomisch und funktioneil normale Fortpflanzungsorgane (F.F. Chehab et al . , Nature Genet. 1996, 12, 318-320, und K. Mounzih et al . , Endocri- nol. 1997, 138, 1190-1193). Ein normaler Zyklus stellt sich ein, sodass es regelmäßig zu Eisprung und Befruchtung kommen kann. Schwangerschaften werden wieder problemlos ausgetragen. Bis heute ist nicht bekannt, inwieweit Leptin direkt oder indirekt über die hypothala o-hypophysäre Achse die Reproduktionsorgane beeinflußt. Die Bedeutung von Leptin für die Reproduktion beim Menschen ist ebenfalls noch völlig unklar. Rezeptor OB-R für Leptin wurde erstmals 1996 durch Northern-Blot-Analyse im Ovar nachgewiesen (J.A. Cioffi et al., Nature Med. 1996, 2, 585-589), woraufhin eine mögliche Bedeutung dieses Hormons für die Fortpflanzung beim Menschen postuliert wurde. In weiterer Folge wurde der kurze Leptin-Rezeptor OB-Rs in Granulosa- und Cumuluszellen gefunden. Sowohl Leptin als auch Leptin- -RNA konnten in Granulosa- und Cumuluszellen des Ovars mittels RT-PCR-Analyse und Immunfluores- zenz nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde in reifen menschlichen Eizellen nur Leptin, nicht jedoch Leptin-m-RNA gefunden (J.A. Cioffi et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472). Es wurde postuliert, dass Leptin, das in den Granulosazellen des Ovars produziert wird, in die Eizelle pinocytotisch aufgenommen und darin in bestimmten Bereichen peripher und polarisiert angereichert wird. Nach der Befruchtung und weiteren Entwicklung findet sich Leptin in einigen Zellen des Präi plantationsembryos gemeinsam lokalisiert mit STAT 3, einem Schlüsselprotein der intrazellulären Signalübertragung und Transkription. Man nimmt an, dass Leptin an der Aktivierung dieses Transkriptionsfaktor beteiligt ist und damit die embryonale Genexpression beeinflußt (M. Antzcak et al . , Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 1067-1086). Eine weitere wichtige physiologische Funktion von Leptin beruht auf seiner Wirkung auf die Steroidhormonsynthese des Ovars, wobei hohe Konzentrationen an Leptin eine Hemmung der 17ß-Östradiolsynthese in Granulosazellen verursachen, und damit die normale Funktion des Ovars beeinträchtigen können (R.J. Zachow et al . , Endocrinol . 1997, 138(2), 847-850). Bei Patienten mit polycystischem Ovarial- syndrom (PCO) sind Interfertilität und Übergewicht in funktionel- lern und kausalem Zusammenhang mit erhöhten Leptinwerten gebracht worden (D. Micic et al . , Gynecol . Endocrinol . 1997, 11(5), 315- 320) .
In der WO 98/33865 werden Screening-Verfahren für Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, durch Messung von aus NichtFettgewebe stammendem Leptin vorgeschlagen. Weiters wurde in dieser WO-Schrift auch erkannt, dass die Leptinmenge im Plasma von schwangeren Frauen im Vergleich zu der Menge, die auf Grund des Körpermasseindex (BMI) von nicht schwangeren Frauen zu erwarten wäre, deutlich erhöht ist und Werte aufweist, die etwa der Leptinmenge im Plasma von Übergewichtigen entsprechen. Demgemäß wird ein Schwangerschaftstest vorgeschlagen, bei welchem Schwangeren, die in der 8. bis 36. Schwangerschaftswoche sind, Proben aus Nicht-Fettgewebe entnommen und die enthaltene Leptinmenge bestimmt wird. Der ermittelte Leptingehalt wird dann mit dem Lep- tingehalt einer Nicht-Schwangeren, die das gleiche Alter und den gleichen Körpermasseindex hat, verglichen, um das -Vorhandensein einer Schwangerschaft festzustellen.
Gerade in der Reproduktionsmedizin ist es aber erforderlich, noch vor der eigentlichen Schwangerschaft Anhaltspunkte für die Ferti- lität, z.B. fü die Chancen bzw. Erfolgsaussichten eines Embryotransfers, zu erhalten. Weiters besteht Bedarf nach einer Methode, mit der der Zeitraum im Rahmen einer assistierten reproduktionsmedizinischen Behandlung überwacht werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher im Zurverfü- gungstellen einer völlig neuartigen Fertilitätsbestimmungsmetho- de, mit der - neben einer "natürlichen" Fertilitätsbestimmung im Rahmen eines normalen Zyklus - u.a. diese Anhaltspunkte gegeben und diese Überwachung gewährleistet werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, welches sich dadurch auszeichnet, dass
- einem Säugetier Körper- oder Organflussigkeit entnommen wird,
- der Leptingehalt in dieser Körper- oder Organflussigkeit bestimmt wird und - der ermittelte Leptingehalt mit einem Referenzwert zur Bestimmung der Fertüitat verglichen wird.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass die Leptinkonzentration in den verschiedenen Körperoder Organflüssigkeiten, wo Leptin vorhanden ist, direkt mit Fer- tilitätseigenschaften korreliert. Diese Korrelation beschränkt sich nicht nur auf das Vorhandensein von Fertilitätεstörungen, sondern ist auch zur Diagnose von Fertilitätsschwankungen oder zur Kontrolle des Ereignisses der Einnistung eines Embryos im Zuge einer in-vitro-Fertilisierung möglich. Erfindungsgemäß hat sich sogar gezeigt, dass neben der Detektion von Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten über die erfindungsgemäße Methodologie zur Bestimmung des Leptingehaltes sogar eine Aussage hinsichtlich des Reifungsgrades von Oozyten möglich ist.
Im Gegensatz zum Schwangerschaftstest gemäß der WO 98/55865 beruht die vorliegende Erfindung daher auf der Erkenntnis, dass die Fertilitätseigenschaft (und nicht die Schwangerschaft) direkt mit dem Leptingehalt korreliert, also zu einem wesentlich früheren Zeitpunkt, als die Methode gemäß der WO 88/55865, einsetzt: Während die Schwangerschaftsbestimmung gemäß der WO 88/55865 ab der 8. Schwangerschaftswoche für möglich beschrieben wird, setzt der erfindungsgemäße Test bereits lange vor dem Eintritt der Schwangerschaft ein, z.B. im Rahmen einer normalen Zyklusüberwachung oder einer assistierten Reproduktionsmedikation, und schließt mit der erfolgreichen Embryoeinnistung ab (also 0., 1. oder 2. Schwangerschaftswoche) .
Die vorliegende Erfindung kann in der Humanmedizin, insbesondere bei der Überwachung von in vitro-Fertilisationen oder bei Ferti- lisationsdiagnosen und -gutachten, eingesetzt werden. Sie hat aber auch enorme Einsatzmöglichkeiten im Rahmen der modernen Tierzucht, da sie sich in einfacher Weise standardisieren lässt und keine komplizierten Laboreinrichtungen zur Durchführung des Tests erforderlich sind.
Leptin ist in vielen verschiedenen Körper- oder Organflüssigkei- ten vorhanden und es hat sich erfindungsgemäß gezeigt, dass der Leptingehalt in all diesen Flüssigkeiten mit den Fertilitätsei- genschaften korreliert. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Leptingehalt aber vorwiegend in Körper- oder Organflüssigkeiten bestimmt, die sich durch einen hohen physiologischen Leptingehalt auszeichnen, wie z.B. Serum, Follikel- oder Samenflüssigkeit. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren mit anderen Körperoder Organflüssigkeiten, wie etwa Cerebrospinalflüssigkeit, durchzuführen, da auch die Konzentration von Leptin in diesen anderen Flüssigkeiten in Bereichen liegt, die hinsichtlich der möglichen Leptin-Nachweisgrenze in der Regel keine Probleme mit sich bringt.
Die Art und Weise, wie das erfindungsgemäße Verfahren in der Praxis durchgeführt wird, ist vollkommen beliebig, vor allem, was die Art der Entnahme der Körper- oder Organflüssigkeit oder die Bestimmung des Leptingehaltes anbelangt. Beispielsweise kann der Leptingehalt immunologisch, elektrophoretisch oder chromatographisch bestimmt werden. Immunologische Bestimmungsverfahren für Leptin werden erfindungsgemäß oft bevorzugt, da nicht nur eine Reihe verschiedener monoklonaler Antikörper gegen verschiedenste Epitope von Leptin zur Verfügung stehen, sondern weil sich gerade immunologische Tests, etwa in Form von Standard-ELISA-Tests leicht derart konzipieren lassen, dass sie auch ohne aufwendiges Laborinstrumentarium durchgeführt und ausgewertet werden können (etwa in Kombination mit kolorimetrischen Nachweisverfahren) . Dadurch ist es möglich, das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren auch in einer für Laien durchführbaren Form zur Verfügung zu stellen. Bevorzugterweise wird erfindungsgemäß freies Leptin in der Probe bestimmt.
Als Referenzwert wird üblicherweise ein Leptin-Normalwert für die jeweilige Körper- oder Organflussigkeit herangezogen. Dieser kann beispielsweise in Form von Vergleichswerten, Vergleichskurven oder Vergleichstabellen beim erfindungsgemäßen Verfahren herangezogen oder - was generell bevorzugt wird - durch gleichzeitige Bestimmung einer Referenzprobe (mit definiertem Leptingehalt) zusammen mit der Probe der entnommenen Körper- oder Organflüssigkeit erhalten werden. In letzterem Fall wird der wahrscheinlich nie ganz auszuschaltende systematische Fehler, den unterschiedliche Bestimmungsmethoden bzw. unterschiedliche Bestimmungsbedin- gungen mit sich bringen können, von vornherein hintangehalten. Dies kann vor allem bei Bestimmungen, wo es nur um graduelle Unterschiede im Leptingehalt geht (etwa bei Bestimmung des Reifungsgrades von Oozyten) , wichtig sein.
Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäß vermessene Probe nicht nur mit einem Referenzwert, sondern mit zwei oder mehreren Referenzwerten verglichen. So kann man beispielsweise neben einem "Normalwert" auch einen anderen Referenzwert bzw. eine Referenzprobe vorsehen, wie etwa eine "pathologische" Referenz oder eine "Schwangerschafts "-Referenz, usw.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist aber jedenfalls das Vorsehen eines Referenzwertes für den Leptingehalt in der entsprechenden Körperoder Organflüssigkeit, die dem Leptinwert eines Normalpatienten (oder im Falle der Tierzucht der Probe des normalen Tieres) entspricht .
Dieser Referenzwert wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugterweise dadurch erhalten, dass parallel zur Fertilitätsbestimmung der Probe der Leptingehalt einer Referenzprobe ermittelt wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Bestimmung des Leptingehaltes mittels immunologischer Methoden, insbesondere unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, da hiedurch die Standardisierung sehr effizient zu erreichen ist und auch für verschiedenste Chargen eines Bestimmungskits die Kompatibilität der ermittelten Daten zueinander gegeben ist.
Im Gegensatz zu Schwangerschaftstests , wie auch gemäß der WO 98/55865, bei welchen eine Präimplantationsentwicklung nicht überprüft oder verifiziert werden kann, sondern erst nach rund 3 Wochen (wobei der Schwangerschaftsbeginn nur auf Grund des Ausbleibens der letzten Regelblutung abgeschätzt wird) kann mit dem erfindungsgemäßen Test bereits in einem früheren Stadium der erfolgreiche Einnistungsprozess verifiziert werden, also bereits in der 0., 1. oder 2. Woche. Diese Verifizierung erfolgt erfindungsgemäß bereits exakt, während mit einem Schwangerschaftstest auf Grund der oben erwähnten Schätzung immer eine Woche zu spät ge- schätzt wird (dies wird dann durch Ultraschalluntersuchungen korrigiert) . Eine derartige Korrektur ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr erforderlich, da hierbei der Zeitpunkt der Einnistung des Embryos bzw. des Embryotransfers bekannt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Leptin zur Bestimmung der Fertilitätseigenschaft von Säugetieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zur Bestimmung der Fertüitat von Säugetieren, welche
- eine Probe einer Körper- oder Organflüssigkeit eines Säugetieres oder ein Gefäß zur Aufnahme der Körper- oder Organflüssigkeit,
- ein Reagens zur Detektion des Leptingehaltes in der Probe, und
- Leptin-Referenzmittel, umfasst .
Wie oben erwähnt, ist die Wahl des Reagens zur Detektion des Leptingehaltes selbstverständlich abhängig von der jeweiligen Detek- tionsmethodik. Beispielsweise umfasst das Reagens zur Detektion des Leptingehaltes vorzugsweise einen Antikörper gegen Leptin, insbesondere einen monoklonalen Leptin-Antikörper . Bevorzugterweise weist dieser Leptin-Antikörper auch weitere Nachweismittel, wie etwa fluoreszierende, radioaktive oder chromogene Gruppen auf, oder kann durch anderen Detektionsmittel gebunden werden (z.B. durch Sekundär-Antikörper) .
Das Leptin-Referenzmittel umfasst bevorzugterweise eine standardisierte Menge an Leptin, etwa eine Referenzprobe der jeweiligen Körper- oder Organflüssigkeit. Andererseits kann das Leptin-Referenzmittel aber auch aus einem einfachen Vergleichswert oder einer Vergleichstabelle bzw. einer Vergleichskurve bestehen, die bevorzugterweise für die jeweilige Körper- oder Organflussigkeit und die jeweilige Nachweismethodik standardisiert ist.
Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer Kit, welcher eine ganze Reihe von standardisierten Leptinproben aufweist, die z.B. eine Eichgerade definieren oder für bestimmte Fertilisationsmerk- male repräsentativ sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäß Kit werden bevorzugterweise zur Überwachung von Patienten im Rahmen von Fertilisierungsverfahren, insbesondere bei in vitro-Fertilisie- rung und intrazytoplasmischer Spermien-Injektion, verwendet. Hierbei ist es erforderlich, bei Testpersonen sehr genau die Anwesenheit oder Abwesenheit von Oozyten sowie deren Qualität für eine erfolgreiche Befruchtung bzw. die Funktionalität von Sper- mien mit einem einfachen Test routinemäßig zu überwachen.
Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung im Rahmen einer assistierten reproduktionsmedizinischen Behandlung ist besonders die Überwachung des Zeitraums, beginnend mit der Niederregulierung bis zur Kontrolle der erfolgreichen Embryoeinnistung, wesentlich. Dieser Zeitraum (Niederregulierung - Stimulation - Punktion - Embryokultur - Embryotransfer in den Uterus - Einnisten des Embryos) kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ver- lässlich und eindeutig kontrolliert und observiert werden (also rund 4 Wochen vor bis 2 Wochen nach dem Embryotransfer) .
Damit ist erstmals eine prädiktive und prognostische Überwachung bzw. ein prädiktiver und prognostischer Marker für eine Diagnose im Verlauf eines in-vitro-Fertilisationsprogramms möglich bzw. zur Verfügung gestellt. Insbesondere können mit der vorliegenden Erfindung auch die Erfolgsaussichten bereits während der hormoneilen Stimulation prognostiziert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren setzt demgemäß zu einem viel früheren Zeitpunkt an, als der in der WO 98/55865 beschriebene Schwangerschaftstest, und mit einem völlig anderen Ansatz, nämlich dem des Fertilitätstests . Insbesondere ist auch im Rahmen der erfindungsgemäßen in vitro-Fertilisationsüberwachung auch genau bekannt, wann der Embryo transferiert wird, während dies bei Schwangerschaftstests unbekannt ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann mit der vorliegenden Erfindung auch die Fruchtbarkeit bei Spontanzyklen bzw. bei unregelmäßigen Zyklen bestimmt werden. Bevorzugterweise geht man dabei bei der Befruchtung vor allem von den Daten vom normalen Zyklus aus.
Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Tests bzw. der erfindungsgemäßen Kits liegt in der Bestimmung des Reifegrades von Oozyten oder Spermien.
Weiters kann das erfindungsgemäße Verfahren bzw. der erfindungsgemäße Kit zur Untersuchung von Fertilitäts- und Reproduktionsstörungen verwendet werden und ist insbesondere für breite Rei- hentests und zur systematischen Untersuchung von großen Personengruppen sehr gut geeignet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den therapeutischen Einsatz von Leptin zur Unterstützung der Fertili- tätseigenschaften. Dabei wird z.B. im Zuge von erfindungsgemäßen Überwachungen eines in vitro-Fertilisierungsprogrammes Leptin appliziert, wenn die gemessenen Leptin-Mengen als nicht ausreichend für einen erfolgversprechenden Verlauf des Programms angesehen werden (z.B. wenn sie, um mehr als 10 %, insbesondere mehr als 30 %, unter dem Normalwert für einen erfolgreichen Verlauf liegen) .
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Leptin zur Herstellung eines Mittels zur Verbesserung der Fertilität. Dabei wird eine effektive Menge an Leptin an den Menschen oder das Tier (Säugetier) verabreicht, um den Leptingehalt auf die erforderlichen Werte zu steigern. Dies ist selbstverständlich nicht nur bei in vitro-Fertilisationen möglich, sondern auch im Zuge der Überwachung natürlicher Befruchtungen und Schwangerschaften.
Die vorliegende Erfindung wird an Hand des nachfolgenden Beispiels und der Zeichungsfiguren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten von Follikeln unterschiedlicher Größe;
Fig. 2 : Leptin-Konzentrationen in Follikelflüssigkeiten mit und ohne Eizelle; Fig. 3 : die Korrelation zwischen der Konzentration von Leptin in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und im Serum von Patientinnen am Tag der Follikelpunktion;
Fig. 4 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration und dem Proteingehalt von Follikelflüssigkeiten großer Follikel;
Fig. 5 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration in Follikelflüssigkeiten großer Follikel und dem FSH-Spiegel im Serum nach hormoneller Stimulation mit rekombinantem FSH; und
Fig. 6 : die Korrelation zwischen der Leptin-Konzentration Östra- diol (•) , Progesteron (A) und Prolactin (■) in Follikelflüssigkeiten großer Follikel.
B e i s p i e l :
Follikelflüssig eit und Serum
31 Patientinnen für eine IVF. oder iCSI-Behandlung wurden mit Leuprorelinacetat (3,75 mg s . c . ; Enantone Gyn, Takeda) als GnRH- Analogon am 21. Zyklustag "downreguliert" und anschließend mit rekombinantem FSH (Gonal-F, Serono und Puregon, Organon) hormo- nell stimuliert. Die jeweils zu applizierende Dosis von FSH wurde über Ultraschall und Östradiolbestimmung individuell angepaßt. Wenn mindestens zwei Follikel einen Durchmesser von 20 mm erreicht hatten, wurde die Ovulation durch intramuskuläre Gabe von hCG (10.000 IU; Profasi, Serono) ausgelöst. Etwa 36 Stunden nach hCG-Applikation erfolgte transvaginal die sonographisch gesteuerte Follikelpunktion mit anschließender mikroskopischer Untersuchung auf das Vorhandensein von Eizellen in der aspirierten Follikelflüssigkeit. Nach Gewinnung der Eizellen wurden die individuellen Follikelflüssigkeiten zentrifugiert und die Überstände bei -196°C für die weiteren Bestimmungen aufbewahrt. Für Serumuntersuchungen wurden die zum Zeitpunkt der Follikelpunktion abgenommenen Blutproben zentrifugiert und die Seren ebenfalls bei -196°C gelagert. LeptinbeStimmung:
Leptin-Konzentrationen wurden radioimmunometrisch bestimmt (Linco Research, St. Charles, MO, USA), wobei ein Antiserum ohne Kreuzreaktionen mit menschlichem Insulin, Proinsulin, Ratteninsulin, C-Peptid, Glucagon, Pancreas-Propeptid oder Somatostatin zur Anwendung kam. Der Nachweisbereich liegt zwischen 0,5 ng/ml und 100 ng/ml .
Hormonbestimmungen:
Ostradiol wurde radioimmunometrisch bestimmt (Estradiol MAIA, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien). Follikelflüssigkeit wurde mit Serum postmenopausaler Frauen 1:100 verdünnt. Der Östradiol- spiegel dieser Seren wurde von der Konzentration in der Follikel- flüssigkeit abgezogen.
Progesteron wurde ebenfalls radioimmunometrisch bestimmt (Orion Diagnostica, Espoo, Finnland) . Follikelflüssigkeit wurde mit dem oben erwähnten Serum 1:1000 verdünnt. Prolactin wurde radioimmunometrisch mittels RIA-Kit (Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien) bestimmt. Follikelflüssigkeiten wurden mit Null-Standard 1:5 verdünnt, um eine nahezu idente Matrix für Proben und Standards zu haben. Messungen der Ostradiol-, Progesteron- und Pro- lactin-Werte wurden entsprechend den Anleitungen der Produkther- steller durchgeführt. FSH wurde im Serum am Tag der Punktion radioimmunometrisch bestimmt (FSH Maioclon, Bio Chem Immuno Systems, Bologna, Italien).
Proteinbestimmung:
Die Proteinmenge in der Follikelflüssigkeit und im Serum wurde nach der Lowry-Methode (O.H. Lowry et al . , J. Biol . Chem. 1951, 193, 265-275) bestimmt, wobei BSA von bekannter Konzentration (1 mg/ml) als Standard verwendet wurde. Alle Proben wurden in Phos- phat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und im Spectro- photometer (Beckman DU 62) bei einer Exzitationswellenlänge von 750 nm gegenüber dem Referenzwert gemessen.
Statistik:
Statistische Berechnungen wurden mit Microsoft Excel Version 5.0a und Origin V 4.1 erstellt. Parametrische Daten wurden mittels "two-taüed t test" bestimmt, Korrelationen mittels Pearson-Kor- relationskoeffizient festgelegt, wobei ein p-Wert <0,05 als signifikant erachtet wurde.
ERGEBNISSE:
Die klinischen Daten der Patientinnen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Follikelflüssigkeiten aus Follikeln unterschiedlicher Größe dieser Patientinnen wurden getrennt untersucht. Weiters wurde berücksichtigt, ob in der gewonnenen Follikelflüssigkeit eine Eizelle vorhanden war. Die Leptinkonzentration in großen Follikeln (0 >19mm) betrug im Mittel 9,03 +/- 5,15 ng/ml, in mittelgroßen Follikeln (0 16-19 mm) 4,67 +/- 2,96 ng/ml und in kleinen Follikeln (0 <16 mm) 3,99 +/- 2,19 ng/ml, wobei der Unterschied in der Leptinkonzentration in großen zu mittleren Follikeln (p = 0,02) und kleinen Follikeln (p <0,01) statistisch signifikant war (Fig. 1). In großen Follikeln mit Eizelle war die Leptinkonzentration in der Follikelflüssigkeit höher als in großen Follikeln ohne Eizelle (10,12 +/- 5,67 ng/ml v.s. 7,84 +/- 4,28 ng/ml, p = 0,07) (Fig. 2) . Im Serum der Patientinnen war Leptin am Tag der Follikelpunktion etwa doppelt so hoch wie die üblicherweise für unstimulierte Frauen angegebenen Normwerte (12,68 +/- 8,98 ng/ml v.s. 5,5 ng/ml, siehe C. Schubring et al . , J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1997, 82, 1480-1483). Im Vergleich von Leptin im Serum mit Leptin in der Follikelflüssigkeit wurde eine statistisch hoch signifikante Korrelation (r = 0,74, p <0,0001) zwischen beiden Parametern (Fig. 3) gefunden. Um festzustellen, ob der Leptingehalt in der Follikelflüssigkeit möglicherweise mit einer allgemein vermehrten Proteinbiosynthese in Zusammenhang steht, wurde der Gesamtproteingehalt der Follikel- flüssigkeiten bestimmt. Hierbei konnte keinerlei Korrelation zwischen Leptin und Proteinspiegel gefunden werden (r = 0,168, p = 0,165) (Fig. 4). Um eine mögliche hormoneile Regulation der Lep- tinproduktion unter Stimulationsbehandlung aufzudecken, wurde in einer Studie die applizierte Menge an rekombinantem FSH mit dem Leptinspiegel sowohl im Serum als auch in der Follikelflüssigkeit verglichen. Dabei zeigte sich, dass keinerlei Korrelation zwischen diesen beiden Parametern herzustellen war (Fig. 5) . Weiters wurde Ostradiol, Progesteron und Prolactin im Serum und in den Follikelflüssigkeiten bestimmt. Es wurde ein Anstieg der Konzentrationen dieser drei Hormone mit steigendem Durchmesser der Follikel (Tabelle 1) festgestellt. Desweiteren wurde gefunden, dass in Follikeln mit Eizelle in der punktierten Follikelflüssigkeit die jeweiligen Hormonwerte höher lagen als in jenen ohne Eizelle (Tabelle 1) . Die in den individuellen Follikelflüssigkeiten gemessenen Hormonwerte korrelierten jedoch nicht mit den entsprechenden Leptinkonzentrationen (Fig. 5). Ebenfalls konnte keine Korrelation zwischen Ostradiol (r = 0,063, p = 0,60), Progesteron (r = 0,058, p = 0,63) und Prolactin (r = 0,172, p = 0,15) im Serum und den jeweiligen Leptinwerten in den Follikelflüssigkeiten gefunden werden.
Es konnte daher eindeutig gezeigt werden, dass Leptin in humaner Follikelflüssigkeit vorkommt und von Granulosazellen des Ovars produziert wird (J.A. Cioffi et al . , Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 467-472) . Es wird angenommen, dass ein des Leptins von der Follikelflüssigkeit in die reifende Oozyte gelangt und dort peripher und polarisiert in das Cytoplasma eingelagert wird (M. Antczak et al., Mol. Hum. Reprod. 1997, 3, 1067-1086). Patientinnen während einer kontrollierten hormoneilen Ovarialstimulation zeigen einen signifikanten Anstieg von Leptin im Serum von Tag drei bis neun des Stimulationszyklus, der bis zum Zeitpunkt der Ovulationsaus- lösung konstant erhöht bleibt (T. Strowitzki et al . , Gynecol . Endocrinol. 1998, 12(3), 167-169). Deutliche Schwankungen der Leptinmenge im Serum von Patientinnen während des normalen Mens- truationszyklus sowie Leptinmangel bei Oligo- und Amenorrhoe signalisieren eine weitere mögliche physiologische Rolle des Leptins für die humane Reproduktion (D. Macut et al . , Gynecol. Endocrinol. 1998, 12(5), 321-326). < Φ Hi o l_J. rr < P o p: M « M P1 tr cn cn N 3 > 3 iQ cn iQ p, f 0- rt s: rt 3 ^ W o P. < Φ P- φ < P P- O cn yo Φ rt P>: s: 0 - P- o Φ P; φ Φ φ tr Φ o P- P- O P- O cn
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Es konnte eine deutliche Tendenz zu höheren Leptin-, Ostradiol-, Progesteron- und Prolactinwerten in Follikeln mit Eizelle in der punktierten Follikelflüssigkeit beobachtet werden. Weiters ist für alle untersuchten Hormone eine kontinuierliche Zunahme der Konzentration mit dem Follikeldurchmesser erkennbar. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass sowohl Leptin, als auch Ostradiol, Progesteron und Prolactin für Wachstum und Differenzierung von Ovarialfollikeln von Bedeutung sind. Es ist jedoch kein direkter Einfluß von Ostradiol, Progesteron oder Prolactin auf die Leptinsynthese zu erkennen. Tatsache ist, dass unter hor- moneller Stimulation die Leptinsynthese im Körper deutlich ist, jedoch einem anderen oder zusätzlichen Regulationsmechanismus unterliegt als im Spontanzyklus . Die erfindungsgemäße Methodologie ist somit als weiteres, unabhängiges und zuverlässiges Instrument zur Fertilitätsbestimmung universell einsetzbar.
T a b e l l e 1 FOLLIKELDURCHMESSER
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Verfahren zur Fertilitätsbestimmung von Säugetieren, insbesondere von Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass
einem Säugetier Körper- oder Organflüssigkeit entnommen wird, der Leptingehalt in dieser Körper- oder Organflussigkeit bestimmt wird und der ermittelte Leptingehalt mit einem Referenzwert zur Bestimmung der Fertilität verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Körper- oder Organflussigkeit Serum, Follikel- oder Samenflüssigkeit ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert der Leptingehalt in der entsprechenden Körper- oder Organflüssigkeit eines Normalpatienten ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert parallel zur Fertilitätsbestimmung ermittelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Leptingehalt mittels immunologischer Methoden, insbesondere unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, ermittelt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an freiem Leptin bestimmt wird.
7. Kit zur Bestimmung der Fertilität von Säugetieren, umfassend
eine Probe einer Körper- oder Organflussigkeit eines Säugetieres oder ein Gefäß zur Aufnahme der Körper- oder Organ flüssigkeit ein Reagens zur Detektion des Leptingehaltes in der Probe, - ein Leptin-Referenzmittel .
8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens zur Detektion des Leptingehaltes einen Antikörper, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, umfasst.
9. Kit nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Leptin-Referenzmittel eine standardisierte Menge an Leptin umfaßt.
10. Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Leptin-Referenzmittel eine Reihe von standardisierten Leptin-Proben ist.
11. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Überwachung von Patienten im Rahmen von Fertilisierungsverfahren, insbesondere bei in vitro-Fertilisierung und intrazytoplasmischer Spermien-Injektion.
12. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Bestimmung des Reifegrades von Oozyten oder Spermien.
13. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Untersuchung von Fertilitäts- und Reproduktionsstörungen.
14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Bestimmung der Fertilität in Spontanzyklen oder bei unregelmäßigen Zyklen.
15. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis
6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Kontrolle der Einnistung eines Embryos im Rahmen eines assistierten reproduktionsmedizinischen Verfahrens .
16. Verwendung von Leptin zur Herstellung eines Mittels zur Verbesserung der Fertilität.
17. Verfahren zur Verbesserung der Fertilität, welches die Verabreichung einer effektiven Menge an Leptin an einen Menschen oder ein Säugetier umfasst.
18. Leptin als Arzneimittel zur Verbesserung der Fertilität.
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