WO2002043757A2 - Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von durch humanen papillomavirus-typ 18-hervorgerufenem tumor - Google Patents

Arzneimittel zur vermeidung oder behandlung von durch humanen papillomavirus-typ 18-hervorgerufenem tumor Download PDF

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    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for avoiding or treating human papillomavirus type 18 (HPN-18) -specific tumor containing at least fusion protein from at least one L protein and at least one E protein of one or more HPN-18 and, if appropriate, suitable additives. and / or auxiliaries, the fusion protein being an Ll ⁇ CE7 x - y fusion protein, where x is an integer from 1 to 3 inclusive and y is an integer from 61 to 64, in particular 62 to 64, especially 62 or 64.
  • the papilloma viruses also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of about 8000 base pairs and an icosahedron-shaped capsid with a diameter of about 55 nm.
  • more than 100 different human papilloma virus types are known, some of which, e.g. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 or HPV-58, malignant tumors and others e.g. HPV-6, HPV-11, or HPV-42, can cause benign tumors.
  • the genome of the papillomaviruses can be divided into three areas:
  • the first area concerns a non-coding region that contains regulatory elements for the transcription and replication of the virus.
  • the second region known as the E (early) region, contains various protein-coding sections E1-E7, of which, for example, the E6 protein and the E7 protein are responsible for the transformation of epithelial cells and the E1 protein controls the DNA copy number .
  • the E6 and E7 regions are so-called oncogenes, which are also expressed in malignant cells.
  • HPV-6 and HPV-11 are among others blamed for genital warts, some types of papilloma virus such as HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 and HPV-58 are associated with malignant tumors of the anogenital tract.
  • HPV-18 is associated with cervical cancer (cervical carcinoma).
  • HPV-18 is therefore a strong risk factor for the formation of cervical neoplasia.
  • the immune system also plays an important role in the progress of the disease. Cellular immune responses and, in particular, antigen-specific T lymphocytes are probably important for the defense mechanism.
  • the E7 gene is constitutively expressed in all layers of the infected epithelium. Therefore, the E7 protein is regarded as a potential tumor antigen and as a target molecule for activated T cells (see, for example, WO93 / 20844).
  • the E7-induced cellular immune response in the patient does not appear to be strong enough to influence the course of the disease. The immune response may be boosted by appropriate vaccines.
  • VLPs virus-like particles
  • the VLPs could be used to generate neutralizing antibodies in various animal systems.
  • CTL cytotoxic T-cell
  • So-called chimeric papillomavirus-like particles (CVLPs) have therefore been developed which consist of a chimeric HPV-16 Ll-E7 protein (Müller, M. et al.
  • CVLPs induce E7 - Specific CTL response in mice, although experiments failed to induce antibodies by immunizing mice with CVLPs against E7 (Müller, M. et al. (1997), supra). Furthermore, neutralizing antibodies from HPV-associated diseases in patients seem to limit the immune response to administered L1 protein (Müller, M. et al. (1997), supra). However, CVLPs are still of interest for the development of a vaccine, since the E7 proteins of tumor cells presented via class I MHC molecules would represent target molecules of CTLs.
  • CVLPs consisting of HPV-16L1 plus HPV-16L2 fused with the full-length HPV-16E7 protein, which after immunization of C57Bl / 6 mice protect against the growth of epithelial E7-expressing tumor cells, although cytotoxic T- Cells have not been detected and the induction of the immune response appears to be less efficient.
  • VLPs or CVLPs are generally produced by genetic engineering by expression of the corresponding genes coding for one or more L proteins or L and E proteins in suitable expression systems.
  • the corresponding genes are described, for example, by Kirnbaum, R. et al. (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 or are available from the EMBL database.
  • the access numbers are e.g. for HPV18: PAPHPV18; for HPV31: PAPPPH31; for HPV33: PAPPPH33 or for HPV58: PAPPPH58.
  • Suitable expression systems are, for example, genetically modified yeasts, for example Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyveromyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) or Hansenula (polymorpha) (Carter, JJ et al. (1991), Virology, 182, 513) , Insect cells, such as, for example, Trichoplusia ni High Five and Spodoptera frugiperda Sf9 or SF + (see, for example, Müller et al. (1997), supra) or prokaryotic cells (see, for example, WO 96/11272).
  • the particles When the particles are produced in prokaryotic cells, they generally precipitate out in the cell and form so-called inclusion bodies, which then have to be renatured and brought into solution.
  • the so-called capsomers For the use of the genetically engineered particles or capsids or their Precursors, the so-called capsomers, require further purification steps after expression.
  • the object of the present invention was therefore to provide a medicament with which human papillomavirus-specific tumor can be effectively avoided or treated, which can be easily produced and which appears to be suitable for approval as a medicament.
  • the medicament according to the invention is suitable for triggering cellular immune responses against HPV18 fusion proteins in in vivo as well as in vitro test systems, so that these medicaments according to the invention are also effective against HPV-18-specific tumors.
  • An object of the present invention is therefore a medicament for the prevention or treatment of human papillomavirus type 18 (HPV-18) -specific tumor containing at least one fusion protein from at least one L-protein and at least one E-protein of one or more HPV-18 and optionally suitable additives and / or auxiliaries, the fusion protein being an Ll ⁇ CE7 x - y fusion protein, where x is an integer from 1 to 3 inclusive and y is an integer from 61 to 64, in particular 62 to 64, especially 62 or 64 means.
  • the fusion protein is preferably a CLVP.
  • This fusion protein preferably contains no papillomavirus-non-specific epitopes or papillomavirus-non-specific amino acid sequences.
  • PapiUomavirus-nonspecific epitopes in the sense of the present invention are generally understood to mean epitopes in the fusion protein which are caused by a foreign protein component, by post-translational modifications or by misfolding of the papillomavirus-specific proteins.
  • Foreign protein content is understood Amino acid sequences that are not due to papillomavirus-specific proteins.
  • the papillomavirus-unspecific epitopes can, for example, be a reason why neutralizing antibodies or CTL immune responses are induced, but a papillomavirus-specific tumor cannot be effectively avoided or combated because unspecific antibodies or CTLs weaken the immunological effect or immunological side effects interfere with the effect of the actual active ingredient.
  • a further preferred embodiment is a medicament for avoiding or treating human papillomavirus type 18 (HPV-18) -specific tumor containing at least one fusion protein from at least one L-protein and at least one E-protein of one or more HPV-18 and, if appropriate, suitable ones additives and / or auxiliaries, wherein the fusion protein x a Ll ⁇ CE7 - y fusion protein, wherein x is an integer from 1 to 3 inclusive, and y is an integer from 61 through 64 in particular, means 62 to 64, especially 62 or 64 ,
  • the fusion protein preferably contains at least one non-specific papillomavirus. It contains an epitope. This can, for example, at the respective fusion point between the L-
  • Epitope can be encoded by an HPV18- or HPV-foreign nucleic acid, whereby under
  • HPV 18 or non-HPV nucleic acid is understood as a nucleic acid that is not found in the natural genome of an HPV 18 or an HPV. Since such epitopes cannot be generated by HPV18-infected cells of a patient who may have become more or less tolerant to the HPV18 infection, such an additional epitope, in particular in the form of a cytotoxic T cell
  • the medicament according to the invention preferably acts to avoid or treat benign or malignant tumors, in particular larynx, cervix, penis, vulva or anal carcinoma, including their precursors, such as high-grade CIN (cervical intraepithelial neoplasia).
  • the medicament according to the invention contains no adjuvant, i.e. no substance that increases the immunity of the papillomavirus-specific protein, since in particular the presence of an L protein, especially of Ll, already sufficiently increases the immunity.
  • no adjuvant i.e. no substance that increases the immunity of the papillomavirus-specific protein, since in particular the presence of an L protein, especially of Ll, already sufficiently increases the immunity.
  • This property is particularly advantageous for approval as a pharmaceutical or diagnostic agent, since the only immunostimulating materials approved by the regulatory authorities are currently aluminum salts.
  • adjuvants and / or other auxiliaries or additives undesirable side effects are avoided.
  • capsids and capsomers As already mentioned above, another major problem with the use of capsids and capsomers as medicaments is their poor solubility. For example, capsids or capsomers of HPV-18 tend to aggregate, which significantly reduces solubility. The sometimes low solubility of the capsids or capsomers leads not only to a loss in yield, but also to difficult use as a medicament.
  • the medicament according to the invention therefore contains, as a suitable additive or auxiliary, about 0.1 to about 3 M, preferably about 0.15 to about 1 M, in particular about 0.2 of a salt with a pH from about 7 to about 8, preferably from about 7.3 to 7.4, in particular from 7.4.
  • the advantage of this salt solution is that the fusion protein preferably remains in solution as a capsid or capsomer or is finely divided as a suspension.
  • the salt is generally an alkali or alkaline earth salt, preferably a halide or phosphate, in particular an alkali halide, especially NaCl and / or KCl.
  • the use of NaCl is particularly preferred for the production of a pharmaceutical formulation.
  • the pH of the drug is generally adjusted with a suitable organic or inorganic buffer, such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2-hydroxyethyl ) - piperazino] -ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-l-propanesulfonic acid).
  • a suitable organic or inorganic buffer such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2-hydroxyethyl ) - piperazino] -ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-morpholino-l-propanesulfonic acid).
  • a suitable organic or inorganic buffer such as preferably with a phosphate buffer, Tris buffer (tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffer ([4- (2-hydroxyethyl ) - piperazin
  • Phosphate buffer is suitable for injection and infusion solutions, for example.
  • Detergents such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (polysorbates), such as polysorbate 80 (for example Tween), are suitable as further additives and / or auxiliaries, which are used, for example, to further stabilize the papillomavirus-specific protein in the medicament according to the invention 80 ® ), Polysorbate 60 (for example Tween 60 ® ) or Polysorbate 20 (for example Tween 20 ® ), polyoxyethylene alkyl ether (for example Brij 58 ® , Brij 35 ® ) or others such as Triton X-100 ® , Triton X-114 ® , NP40 ® , Span 85, Pluronic 121 or sodium deoxycholate.
  • polysorbates such as polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (polysorbates), such as polysorbate 80 (for example Tween)
  • polysorbate 80 for example Tween
  • Polysorbate 20 for example Tween 20 ®
  • polyols such as polyethylene glycol or glycerol
  • sugars such as. B.
  • zwitterionic compounds such as. B. amino acids such as glycine or in particular taurine or betaine and / or a protein such as. B. bovine or human serum albumin.
  • Detergents, polyols and / or zwitterionic compounds are preferred.
  • Other additives and / or auxiliaries are protease inhibitors, such as aprotinin, ⁇ -aminocaproic acid or pepstatin A. Those additives which do not induce any immunological side effects are preferred.
  • L-protein, L1-protein, L2-protein, L1 / L2-protein and E-protein mean for the purposes of the present invention both the full-length proteins and their mutants, such as. B. Deletion mutants.
  • the fusion protein according to the invention contains a deleted L protein, preferably a deleted L1 and possibly L2 protein.
  • the deletion has the advantage that other proteins, for example papillomavirus-specific E-, are particularly effective in the deleted area. Protein sequences can be inserted, which extends the scope of the composition according to the invention.
  • Particularly preferred is an L protein with a C-terminal deletion and in particular a C-terminal deleted Ll protein.
  • the C-terminal deletion has the advantage that the efficiency of the formation of virus-like particles can be increased, since the nuclear localization signal located at the C-terminus is deleted.
  • the C-terminal deletion is therefore preferably up to approximately 35 amino acids, preferably approximately 15 to approximately 35 amino acids, especially approximately 26 to 28 amino acids.
  • the E protein is also deleted, especially the E6 and / or E7 protein.
  • the C-terminal part of the E protein is deleted, preferably the C-terminal part of the E7 protein, since these constructs can preferably form capsomers and / or capsids in connection with deleted L protein.
  • Another preferred embodiment is when the N-terminus of an E protein is deleted in addition to or as an alternative to a C-terminal deletion, preferably the N-terminal part of the E7 protein, since such constructs pack more C-terminal amino acids allow in Capside.
  • HPV 16 LI ⁇ C fusion proteins had been shown that lost the ability to capsid depending on the length and specific sequence of the fused to HPV16 LI ⁇ C fusion partner is (Müller, M. et al., 1997 supra and DE 19812941). So with HPV16 Ll ⁇ c * E7 1 . 6 o the formation of capsid is reduced compared to HPV16 L1 ⁇ C * E7 1 .55 and in HPV16 L1 ⁇ C * E7 1 . 65 completely prevented. The reason for this may be that sequences in the region of amino acids 55 to 70 of HPV 16 interfere with the formation of the capsid.
  • cysteines in this area may form false disulfide bridges with one another or with cysteines in the Ll portion.
  • the E-protein partner fused at LI ⁇ C should contain as many epitopes as possible for the activation of cytotoxic T cells.
  • HPVl 8 Ll ⁇ c * E7 constructs starting with the methionine at amino acid position 1 of E7, have the advantage over constructs with an N-terminal deletion of E7, for example the methionine at position 1, that they contain a mouse T cell epitope that begins with the methionine at position 1 (contained in peptides Q43 and Q44 from Example 5).
  • HPV18 constructs therefore have the advantage that their triggering of a cellular immune response in corresponding mouse strains can be checked very easily, because vaccination of these mice triggers a specific T cell response which can be detected with the peptides Q43 and / or Q44. Without such an easy to perform immunological test one would have to draw conclusions from the share of the capsids on their immunological effectiveness, which undoubtedly leads to less precise results.
  • Preferred constructs are HPVl 8 L1 ⁇ C D I E7 1 . 53 D I and HPVl 8 L1 ⁇ CDIE7 1 . 6 ODI- In these constructs, the E7 portion at the DNA level is flanked by two EcoRV restriction sites for design reasons. As a result, the fusion protein contains the additional amino acids Asp and Ile (DI) before and after the E7 portion.
  • DI Asp and Ile
  • the present invention therefore also relates to the use of the constructs according to the invention for the production of a medicament on the one hand for the prevention of HPV-specific tumors and on the other hand for the regression of existing HPV-specific tumors.
  • the described papillomavirus-specific fusion protein is in the form of a capsid and / or capsomer, since the immune reaction is caused by the capsids and / or capsomers and in particular by the proportion of L-protein can still be increased significantly. Fusion proteins from deleted L1 and E7, E6 and or El are therefore preferred as fusion proteins which are suitable for the formation of capsid and / or capsomer.
  • capsids are viral or virus-like structures in a generally icosahedral form, which are generally composed of 72 capsomers.
  • capsomers are assembled proteins containing at least one papillomavirus structural protein, preferably L1 or deletions of L1.
  • 5 fusion proteins according to the invention can assemble into a capsomer, which in turn can assemble into a capsid.
  • HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPN-33, HPN-35 , HPV-39, HPV-45, HPV-52 and / or HPV-58 for example a combination of HPV-16 and HPV-18 or HPV-18, HPV-31, HPV-45 and HPV-58 in the case of z.
  • HPV-16 and HPV-18 or HPV-18, HPV-31, HPV-45 and HPV-58 in the case of z.
  • Another object of the present invention is a method for producing a medicament according to the invention, in which a suitable cell containing a suitable expression vector, which codes for the fusion protein mentioned, is cultivated under suitable conditions, the expression product is isolated and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries be added.
  • the expression vectors can be, for example, prokaryotic or eukaryotic expression vectors.
  • prokaryotic expression vectors are e.g. for expression in E. coli the vectors pGEM or pUC derivatives (see, for example, WO96 / 11272).
  • eukaryotic expression vectors are for expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. the vectors p426Met25 or p426GALl (Mumberg et al. (1994) ⁇ ucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J.J. et al. (1991) supra) and for expression in insect cells e.g. B.
  • Baculovirus vectors in particular the Autographa Californica virus, as disclosed in EP-B1-0 127 839 or EP-B1-0 549 721 (see, for example, also WO94 / 20137), and for expression in mammalian cells, for , B. the vectors Rc / CMV and Rc / RSV or SV40 vectors, all of which are generally available.
  • commercially available baculovirus expression systems such as e.g. B. the Baculo
  • the expression vectors also contain suitable promoters for the respective host cell, e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258 , 2674-2682), the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells (see for example EP-B1-0 127 839 or US 5,004,687) or the early SV40 promoter or LTR promoters e.g. B. from MMTV (mouse mammary tumor virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).
  • suitable promoters for the respective host cell e.g. B. the trp promoter for expression in E. coli (see, for example, EP-B1-0 154 133), the ADH2 promoter for expression in yeast (Radorel et al. (1983), J. Biol.
  • Suitable host cells are, for example, the E. coli strains DH5, HB101 or BL21, the yeast strains Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces or Hansenula (Carter, JJ et al. (1991), Virology, 182, 513), insect cell lines of the genus Lepidoptera, z. B. from Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou or Galleria Mellonela or the animal cells COS, C127, Vero, 293 and HeLa, all of which are generally available (see, for example, WO94 / 00152).
  • the coding nucleic acids for the individual papillomavirus-specific proteins were isolated from a gene bank, for example, by means of PCR (“polymerase chain reaction”) amplification and cloned.
  • the genome of HPVl 8 is generally available under GenBank Accession No. X05015 and was obtained from Cole and Danos (J Mol. Biol. 1987, 193 (4), 599-608).
  • the sequence used for the construction of the fusion proteins according to the invention had the following changes in the Ll gene: At positions 89, 848, 1013 and 1230 of the Ll gene, a C was replaced by a G at the DNA level. At the protein level, the first three changes result in an exchange from Pro to Arg, while the last mutation does not result in a change at the protein level.
  • HPVl 8 Ll The underlying protein sequence of HPVl 8 Ll is:
  • Ll ⁇ c * is understood to mean an Ll protein with amino acids 1-474 of HPV18L1.
  • L1 ⁇ CDI is an Ll protein with amino acids 1-472 and The amino acids AG underlined above are thus replaced by DI in the L1 ⁇ c D i constructs.
  • HPVl 8 E7 gene corresponds to the published DNA sequence and is 1 for E7. 64 :
  • HPV 18 E7 The underlying protein sequence of the HPV 18 E7 is:
  • Another method of obtaining the desired nucleic acids is to isolate the papillomavirus-specific genes directly from warts or tumors using PCR. Suitable primers for the E6 and E7 genes from HPV16 and HPV18 are e.g. in WO93 / 21958. Further references for the desired nucleic acids are, for example, Kirnbaum, R. et al. (1994), supra and the clones mentioned above in the EMBL database.
  • the expression vector is constructed in such a way that the expressed fusion protein is not extended by any further amino acids caused by the vector. This is achieved, for example, by removing unwanted nucleotides which code for additional amino acids by mutagenesis in a PCR reaction using suitable primer oligonucleotides (Ho et a. (1989) Gene, 77, 51-59). In this way, a fusion protein is obtained which is free of additional amino acids and thus free of any additional ones After the expression of the described fusion protein, it is preferred to further purify or renaturate it. Examples of chromatographic purification procedures can be found in Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol.
  • the drug can be administered orally, parenterally, e.g. Subcutaneously, intramuscularly or via the mucous membrane, in liquid or suspended form, in the form of an elixir or as capsules, preferably as a solution for injection or infusion.
  • An adjuvant can be dispensed with in the formulations according to the invention, which is particularly advantageous.
  • Another object of the present invention therefore relates to the use of the formulation according to the invention as a solution for injection or infusion.
  • Injection solutions are generally used when only relatively small amounts of a solution or suspension, for example about 1 to about 20 ml, are to be supplied to the organism.
  • Infusion solutions are generally used when a large amount of a solution or suspension, for example one or more liters, is to be applied. Since, in contrast to the infusion solution, only a few milliliters are administered with injection solutions, slight deviations from the pH value and from the osmotic pressure of the blood or tissue fluid are not noticeable or only insignificantly with regard to the sensation of pain during the injection. A dilution of the formulation according to the invention before use is therefore generally not necessary. When larger amounts are applied, however, the formulation according to the invention should be diluted to such an extent shortly before application that an at least approximately isotonic solution is obtained.
  • An example of an isotonic solution is a 0.9% sodium chloride solution.
  • the dilution can take place, for example, with sterile water during the application, for example via a so-called bypass.
  • Fig. 3A shows a graph of the absorbance at 280 and 260 respectively applied to to the time in minutes an HPLC chromatogram of the HPV18 Ll ⁇ c * E7 2 - 6 - fusion protein.
  • 3B shows the photograph of a silver coloration by SDS-PAGE analysis of the corresponding fractions of the chromatogram above it. With the arrow, the major band of HPVl 8 Ll ⁇ c is 2 * E7 - in 62 fusion protein.
  • FIG. 4 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific murine T cells with LKK cells which present different peptides.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, LKK cells without peptide were only incubated with buffer and served as a negative control.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 5 shows the graphical evaluation of two FACScan experiments after restimulation of specific murine T cells with LKK cells which present different peptides.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, LKK cells without peptide were only incubated with buffer and served as a negative control.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • 6 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present different HPVl 8 peptide pools.
  • the name of the respective peptide pool is indicated on the X axis, “without” stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer, L1 or E7 stands for BLCL incubated with HPV18 Ll or HPV18 E7 peptide pool (positive- The proportion of CD4-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • FIG. 7 shows the graphical evaluation of a FACScan experiment after restimulation of specific human T cells with donor-identical BLCL, which present the Q9 peptide.
  • the name of the respective peptide is indicated on the X axis, BLCL stands for BLCL (negative control) incubated only with buffer.
  • the proportion of CD8-positive T cells which were classified as reactive on the basis of IFN ⁇ expression in the FACScan experiment is plotted on the Y axis.
  • - Figure 10 shows the graphical analysis a FACScan experiment following restimulation of specific murine T-cells with JAWS II cells transfected with CVLPs (HPV18Ll ⁇ c D Ie7 2 - 62D i or HPV18Ll .DELTA.C E7 1 ⁇ g) or with peptides (Q43, 44 or 45) (see X-axis).
  • CVLPs HPV18Ll ⁇ c D Ie7 2 - 62D i or HPV18Ll .DELTA.C E7 1 ⁇ g
  • peptides Q43, 44 or 45
  • FIG. 11 shows the plot of a FACScan experiment following restimulation of specific murine T-cells with JAWS II cells transfected with CVLPs (HPV18Ll ⁇ CE7. 1 64, native or boiled ( "denatured") or with the E7-peptide pool had been loaded (see X-axis).
  • JAWS-II cells were only incubated as a negative control with buffer (“without”).
  • the proportion of CD 8 positive T cells is plotted on the Y axis IFN ⁇ expression were classified as reactive in the FACScan experiment.
  • the first primer has the sequence
  • the first primer 5 encodes an Xhol restriction enzyme site.
  • the second primer 5 'encodes an EcoRV restriction enzyme site.
  • a TAA translation stop codon follows the EcoRV site to delete the last 35 amino acids of the HPV18L1 ORF.
  • the PCR product was digested with XhoI / EcoRV and ligated into the vector pBluescript ®, also digested with XhoI / EcoRV.
  • HPV18Ll ⁇ c pKS obtained was used to clone the ORF of HPV18E7I.53DI and HPV18E7 1 - 60D ⁇ into the EcoRV site.
  • the PCR products were digested with EcoRV and inserted into the EcoRV site of the modified L 1 gene.
  • an HPVl 8 Ll ⁇ cE7 1 . 2 fragment made.
  • the 5 'primer 1801 encoded an Xhol interface followed by a BglII interface, the start codon and the first nucleotides of the HPVl 8 Ll gene.
  • the 3 'primer encoded the last nucleotide 1804 of HPVl 8 Ll ⁇ c gene followed by an Nsi I interface that represents the first six nucleotide of the HPV 18 E7 gene and an EcoRI site.
  • the resulting PCR fragment was cut with the enzymes XhoI / EcoRI and cloned into the vector pBluescript ® (Stratagene).
  • the resulting vector was named pBSK-18Ll ⁇ cE7i- 2 (see Fig. 1).
  • HPVl 8 E7 1-55, 1-57, 1-62 and 1-64 were also prepared by PCR reactions.
  • the same 5 'primer 1805 was used for all fragments, which encoded the first 24 nucleotides of the HPV18 E7 gene, the first six of which represent the Nsil site.
  • the 3 'primers 1806, 1807, 1808 and 1809 encoded the last 21 nucleotides of the respective HPV 18 E7 fragments followed by a stop codon and an EcoRI site.
  • the resulting PCR fragments were digested with NsiI / EcoRI and cut into the NsiI / EcoRI vector pBSK- 18L1 .DELTA.C E7 1 _ 2 ligated so that the fusion genes HPV18 Ll ⁇ CE7 1 - 55, HPV18 Ll ⁇ CE7 1 - S7, HPV18 L1 ⁇ C E7 1 . 62 , HPV18 Ll cE7i-6 in the vector pBluescript ® were obtained (see Fig.
  • the Nsil interface could not be used in the production of the fusion genes, the E7 portion of which only begins at amino acid 2 or 3.
  • Two PCR reactions were carried out to produce these constructs.
  • the product of the first reaction was the Ll ⁇ c * gene to which the beginning of the E7 gene (starting from amino acid 2 or 3) was fused.
  • the product of the second reaction is the E7 gene (starting from amino acid 2 or 3), before which the end of the Ll ⁇ c * gene was fused.
  • the resulting DNA fragments thus overlapped at the position of the L1 / E7 border ("Four Primer PCR", Ho, SN et al (1989) Gene 77, 51).
  • the primers did not contain any restriction enzyme sites.
  • Fragment 1 of the L1 ⁇ c * . 2 x E7 fusion genes was created using the primer combination 1801/1810 and fragment 2 with the primer combinations 1812/1807 (L1 .DELTA.C * E7 2 _ 57) or 1812/1814 (Ll * E7 .DELTA.C 2 - 6 o) or 1812/1808 (Ll c * E7 2 - 6 2)
  • the Ll ⁇ c * E7 3 - 64 fusion gene was produced according to the same method
  • Primer combination 1801/1811 and fragment 2 were prepared with the primer combination 1813/1809 (see FIG. 2).
  • AAA TTT-3 '1812 5' -AAA TTT TTG GTT CAG GCT GGA CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA-3 '1813: 5' -AAA TTT TTG GTT CAG GCT GGA GGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA GAC-3 '
  • HPVl 8Ll ⁇ c * E7 x - y constructs therefore differ from the clones HPVISLI ⁇ CDI and HPV18L1 ⁇ CDI by the loss of the two internal EcoRV restriction enzyme interfaces and the corresponding non-HPV amino acids Asp and He between the Ll ORF and E7 and downstream of E7.
  • the first EcoRV site was replaced by the original Ll amino acids at this position (AlaGly).
  • the second EcoRV site was replaced by a translation stop signal.
  • the clones were analyzed by DNA sequencing. Then the
  • Sf9 Spodoptera frugiperda
  • TNM-FH insect medium Life Technologies, Düsseldorf
  • Recombinant baculoviruses were generated by cotransfection of 5 ug of the recombinant plasmids and 1 ug of linearized Baculo-Gold ® DNA (Pharmingen, San Diego, CA) into Sf9 cells.
  • Recombinant viruses were purified by end point dilution and / or plaque separation.
  • 10 6 Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus and a moi (“multiplicity of infection”) of 0.5 and 1 for 48 h and.
  • the homogenate was clarified by centrifugation at 10,000 rpm in the Sorvall SS34 rotor.
  • the L1E7 protein was purified from the clarified crude extract for the immunological assays by ammonium sulfate precipitation with 35-40% saturation and subsequent anion exchange chromatography on Fractogel ® TMAE (Merck, Darmstadt), the CVLPs in the linear salt gradient at 300-400mM NaCl be eluted.
  • the protein content of the purified fractions was determined by the Bradford method using bovine serum albumin as the standard. 4. Detection of capsid in purified HPVl 8 L17 fractions
  • HPV18 L1 peptide pools mean the mixture of peptides Q1 to Q43
  • HPV18 E7 peptide pools mean the mixture of peptides Q44 to Q52.
  • monensin 300 ⁇ M, Sigma, Deisenhofen
  • the cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C.
  • the cells were then fixed and permeabilized, coupled with ⁇ -mouse CD8 / PE (monoclonal rat antibody against the extracellular part of murine CD8 with fluorescence marker phycoerithrin, Phamiingen, Heidelberg), with ⁇ -mouse CD4 / Cychrome (monoclonal rat antibody, Pharmingen, Heidelberg) and stained with ⁇ -mouse IFN ⁇ / FITC (monoclonal rat antibody against murine interferon ⁇ coupled with FITC, Caltag, Hamburg).
  • the cells were examined for their labeling in a FACScan calibur (fluorescens activated cell sorter, Becton Dickenson, Hamburg) and the measurement results were analyzed using Cellquest software (Becton Dickenson, Hamburg).
  • FIG. 4 shows for peptides Q22, Q23, Q51, Q43 and Q44 and FIG. 5 for peptides Q41 and Q5 that the LKK cells incubated with these peptides restimulate peptide-stimulated murine CD8-positive T Cells. This means that those with the HPVl 8 L1 ⁇ CDIE7I.
  • Human T cells (4x10 5 ) from a non-HLA-typed blood donor were treated with HPV18 L1 ⁇ CDIE7I for 1 week.
  • 5 3DI CVLPS and HPV18 L1ACDIE7 W ODI CVLPs 800 U / ml human GM-CSF (Leukomax, Novartis Pharma GmbH, Nuremberg) and 500 U / ml human IL4 (Becton Dickenson, Hamburg) and for another 5 weeks with HPV 18 L1 ⁇ CDI E7 1 .
  • the T cells were then in 100 ul medium at 37 ° C with the peptide pools and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL, each transformed with the help of the Ebstein-Barr virus B-cell line, which was produced individually for each blood donor was obtained from Dr. A. Kaufmann, Jena) in the presence of 10 IU / ml IL2 (Becton Dickenson).
  • the amounts of the peptide pools used were such that 1 ⁇ g / ml was added for each individual peptide. Only cells incubated with buffer served as negative controls, and cells incubated with HPVl 8 Ll or HPVl 8 E7 peptide pools as positive controls.
  • FIG. 6 shows that in particular the cells incubated with peptide pools Ll, F and 1 BLCL positive CD4 restimulation of human T cells induced associated with HPV18 Ll .DELTA.C DiE7 1 - 53D ⁇ CVLPs and HPV18 L1 .DELTA.C DIE7 W ODI CVLPS had been stimulated. Furthermore, peptide pools A and 6 showed a restimulation that was clearly above the negative control. The BLCL incubated with the other peptide pools or the negative control or the BLCL incubated with the E7 peptide pool, on the other hand, had a small proportion of reactive CD4-positive T cells.
  • HPV18 constructs of this type are able, after vaccination, to trigger a cellular immune response against L1 and E7 mediated by T helper cells.
  • the cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml of the HPVl 8 L1 peptide Q9 and 10 5 antigen-presenting cells (donor-identical BLCL) in the presence of 10 IU / ml IL2. Only cells incubated with buffer served as a negative control. After one hour, 1 ⁇ l of monensin (300 ⁇ M) was added. The cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C. The cells were then fixed and permeabilized, stained with ⁇ -human CD8 / APC, with ⁇ -human CD4 / PerCP and with ⁇ -human IFN ⁇ / FITC. The cells were examined for their labeling in a FACScan calibur and the measurement results were analyzed using Cellquest software.
  • FIG. 7 shows that the BLCL cells incubated with the peptide Q9 brought about a restimulation of HPVl 8 L1 peptide pool-stimulated CD8-positive T cells.
  • the peptide IYNPETQRL is responsible for the restimulation of the T cells by the BLCL cells incubated with the Q9 peptide. This means that it was possible to incubate HPVl 8 L1 ⁇ C D I E7 1 . 53 DI CVLPS and HPVl 8 L1A G D.E7I.6 O DI CVLPS and human T cells HPVl 8 Ll -specific cytotoxic
  • HPV18 constructs of this type are able, after vaccination, to trigger a cellular immune response against L1 and E7 mediated by cytotoxic T cells.
  • mice were 2 times with 20 .mu.g of HPV 18L1 ⁇ C D IE7 2 - immunized 6 2 DI CVLPs and control with buffer.
  • the removal of the spleens, the extraction of the splenocytes and their cultivation and restimulation as part of the FACScan analysis were carried out in accordance with Examples 5, 6 and 7.
  • E7 peptide pools and the irradiated splenocytes obtained from the mice were stimulated and harvested. Subsequently, the cells were incubated with the on the X-axis of Figure 10 indicated CVLPs.
  • FIG. 10 shows that in the intracellular IFN- ⁇ assay JAWS-II cells which were treated with HPV18Ll ⁇ cE7i- 64 CVLPs in contrast to the HPV18Ll ⁇ C DiE7 2 -62Di CVLPs a restimulation of peptide-stimulated murine CD8-positive T Cells. Similar restimulation was observed for peptides Q43 and Q44, but not for peptide Q45.
  • the peptides Q43 and Q44 together comprise the amino acids MHGPKATL, which correspond to the N-terminal amino acids of E7.

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Abstract

Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischen Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L1-Protein und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer HPV-18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein ein L1Δc-E7x-y-Fusionsprotein ist, wobei x eine ganze Wahl von 1 bis einschließlich 3 und y eine ganze Zahl von 61 bis 64, insbesondere 62 bis 64, vor allem 62 oder 64 bedeutet.

Description

Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von durch humanen Papillomavirus-Typ 18-hervorgerufenem Tumor
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomaviren-Typ 18 (HPN-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer HPN-18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, wobei das Fusionsprotein ein LlΔCE7x-y-Fusionsprotein ist, wobei x eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 und y eine ganze Zahl von 61 bis 64, insbesondere 62 bis 64, vor allem 62 oder 64 bedeutet.
Die Papillomaviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA- Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder-förmigen Capsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirustypen bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42, gutartige Tumore verursachen können.
Elektronenmikroskopische Analysen von BPV-1 und HPV-1 ergaben, dass die Viren aus 72 pentameren Capsomeren aufgebaut sind, die wiederum aus fünf Ll -Molekülen bestehen (Baker, T. et al. (1991) Biophys. J., 60, 1445).
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6-Protein und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich ist und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte 90% im viralen Capsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L1:L2 im allgemeinen 30:1 ist.
HPV-6 und HPV-11 werden u.a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, einige Papillomavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In ca. 10%- 20% der Fälle wird HPV-18 mit dem Gebärmutterhalskrebs (Cervixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV-18 ist daher ein starker Risikofaktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Daneben spielt das Immunsystem eine wichtige Rolle beim Fortschritt der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezifische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, dass in hochgradigen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalem Tumor das E7-Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z. B. WO93/20844). Die E7- induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden.
Es konnte nun gezeigt werden, dass die Expression des Ll-Gens bzw. die Coexpression des Ll- und L2-Gens Virus-ähnliche Partikel (VLPs) bildet. Die VLPs konnten zur Bildung von neutralisierenden Antikörpern in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikörpern ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen eine virus-spezifische zytotoxische T-Zell(CTL)- Antwort notwendig zu sein scheint. Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus- ähnliche Partikel (CVLPs) entwickelt, die aus einem chimären HPV-16 Ll-E7-Protein bestehen (Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93): Einige CVLPs induzieren eine E7- spezifische CTL- Antwort in Mäusen, obwohl Experimente fehlschlugen, Antikörper durch Immunisieren von Mäusen mit CVLPs gegen E7 zu induzieren (Müller, M. et al. (1997), supra). Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV-assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantwort auf verabreichtes Ll -Protein zu limitieren (Müller, M. et al. (1997), supra). CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7- Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs darstellen würden.
Peng et al. (1998) Virology, 240, 147 beschreiben nun CVLPs bestehend aus C-terminal verkürztem Ll des Rinderpapillomvirus (BPV) und HPV-16E749-5 , welche nach Impfung von C57Bl/6-Mäusen E7-spezifϊsche zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 1800 beschreiben CVLPs bestehend aus HPV-16L1 plus HPV-16L2 fusioniert mit dem Vollängen HPV-16E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57Bl/6-Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wobei jedoch zytotoxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der Immunantwort weniger effizient erscheint.
Die Herstellung von VLPs bzw. CVLPs erfolgt im allgemeinen gentechnisch durch Expression der entsprechenden Gene kodierend für ein oder mehrere L-Proteine bzw. L- und E-Proteine in geeigneten Expressionssystemen. Die entsprechenden Gene sind beispielsweise bei Kirnbaum, R. et al. (1994) J. Virol., 67, 6929-6936 beschrieben bzw. über die EMBL-Datenbank erhältlich. Die Zugangsnummern lauten z.B. für HPV18: PAPHPV18; für HPV31 : PAPPPH31; für HPV33: PAPPPH33 oder für HPV58: PAPPPH58.
Geeignete Expressionssysteme sind beispielsweise gentechnisch veränderte Hefen, z.B. Saccharomyces (cerevisiae), Pichia (pastoris), Kluyveromyces (lactis), Schizosaccharomyces (pombe) oder Hansenula (polymorpha) (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellen, wie z.B. Trichoplusia ni High Five und Spodoptera frugiperda Sf9 bzw. SF+ (siehe z.B. Müller et al. (1997), supra) oder prokaryotische Zellen (siehe z.B. WO 96/11272). Bei der Herstellung der Partikel in prokaryotischen Zellen fallen diese im allgemeinen in der Zelle aus und bilden sogenannte Einschlußkörperchen (Inclusion Bodies), die anschließend renaturiert und in Lösung gebracht werden müssen. Für die Verwendung der gentechnisch hergestellten Partikel bzw. Capside oder deren Vorstufen, den sogenannten Capsomeren, sind nach der Expression weitere Reinigungsschritte notwendig.
Ein entscheidender Nachteil der in der Literatur beschriebenen Wirkstoffe gegen HPV ist jedoch, dass sie zum einen nur eine geringe Wirkung zeigen und zum anderen bis heute keine wirksame Immuntherapie von HPV-18-spezifischem Tumor gezeigt werden konnte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Arzneimittel bereitzustellen, mit dem wirksam humaner Papillomavirus-spezifischer Tumor vermieden bzw. behandelt werden kann, das einfach hergestellt werden kann und das für die Zulassung als Arzneimittel geeignet erscheint.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass das erfindungsgemäße Arzneimittel geeignet ist, in in vivo als auch in in vitro Testsystemen zelluläre Immunantworten gegen HPV18 Fusionsproteine auszulösen, so dass diese erfindungsgemäßen Arzneimittel auch gegen HPV-18-spezifischen Tumor wirksam sind.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer HPV- 18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, wobei das Fusionsprotein ein LlΔCE7x-y-Fusionsprotein ist, wobei x eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 und y eine ganze Zahl von 61 bis 64, insbesondere 62 bis 64, vor allem 62 oder 64 bedeutet. Bevorzugt handelt es sich bei dem Fusionsprotein um ein CLVP.
Bevorzugt enthält dieses Fusionsprotein keine Papillomavirus-unspezifischen Epitope oder Papillomavirus-unspezifischen Aminosäuresequenzen.
Unter PapiUomavirus-unspezifische Epitope im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man im allgemeinen Epitope im Fusionsprotein, die durch einen Fremdproteinanteil, durch post-translationale Modifikationen oder durch eine Fehlfaltung der Papillomavirus- spezifischen Proteine verursacht werden. Unter Fremdproteinanteil versteht man Aminosäuresequenzen, die nicht auf Papillomavirus-spezifische Proteine zurückzuführen sind.
Die Papillomavirus-unspezifischen Epitope können beispielsweise eine Ursache dafür sein, dass zwar neutralisierende Antikörper oder CTL-Immunantworten induziert werden, jedoch ein Papillomavirus-spezifischer Tumor nicht wirksam vermieden bzw. bekämpft werden kann, da durch unspezifische Antikörper oder CTLs die immunologische Wirkung abgeschwächt wird oder immunologische Nebenwirkungen die Wirkung des eigentlichen Wirkstoffes stören.
Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform ist ein Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer HPV- 18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, wobei das Fusionsprotein ein LlΔCE7x-y-Fusionsprotein ist, wobei x eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 und y eine ganze Zahl von 61 bis 64, insbesondere 62 bis 64, vor allem 62 oder 64 bedeutet.
Bevorzugt enthält das Fusionsprotein mindestens ein Papillomavirus-unspezifisch.es Epitop enthält. Dieses kann beispielsweise an der jeweiligen Fusionsstelle zwischen den L-
Proteinen, den E-Proteinen oder einem L- und einem E-Protein liegen. Ferner kann dieses
Epitop durch eine HPV18- oder HPV-fremde Nukleinsäure codiert sein, wobei unter
HPV 18- oder HPV-fremde Nukleinsäure eine Nukleinsäure verstanden wird, die nicht im natürlichen Genom eines HPV 18 bzw. eines HPV zu finden ist. Da derartige Epitope nicht von HPV18-infizierten Zellen eines Patienten generiert werden können, der möglicherweise mehr oder minder tolerant gegenüber der HPV18-Infektion geworden ist, kann ein derartiges zusätzliches Epitop, insbesondere in Form eines zytotoxischen T-Zell-
Epitops, dazu fuhren, die Immuntoleranz gegenüber den HPV18 Ll- und E-Proteinen zu durchbrechen. Derartige Effekte sind beispielsweise beschrieben durch Lehmann PV et al. (1993, Immuno. Today 14(5), 203-8), worin eine Immunantwort abhängig ist von einem ersten immunogenen Peptid. Das erfindungsgemäße Arzneimittel wirkt vorzugsweise zur Vermeidung oder Behandlung von gutartigem oder bösartigem Tumor, insbesondere von Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom, einschließlich deren Vorstufen, wie z.B. hochgradige CIN (cervikale intraepitheliale Neoplasie).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel kein Adjuvans, d.h. keine Substanz, die die Immunität des Papillomavirus- spezifischen Proteins verstärkt, da insbesondere die Anwesenheit eines L-Proteins vor allem von Ll die Immunität bereits ausreichend verstärkt. Diese Eigenschaft ist insbesondere bei der Zulassung als Arzneimittel oder Diagnostikum von Vorteil, da die einzigen von den Zulassungsbehörden zugelassenen immunstimulierenden Materialien zur Zeit Aluminiumsalze sind. Zudem werden durch das Weglassen von Adjuvantien und/oder anderen Hilfs- bzw. Zusatzstoffen nicht erwünschte Nebenwirkungen vermieden.
Wie bereits oben erwähnt, ist ein weiteres wesentliches Problem bei der Verwendung von Capsiden und Capsomeren als Arzneimittel deren schlechte Löslichkeit. So neigen beispielsweise Capside oder Capsomere von HPV- 18 zur Aggregation, wodurch die Löslichkeit wesentlich verringert wird. Die zum Teil geringe Löslichkeit der Capside bzw. Capsomere führt nicht nur zu einem Verlust an Ausbeute, sondern auch zu einer erschwerten Anwendung als Arzneimittel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Arzneimittel daher als einen geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoff ca. 0,1 bis ca. 3 M, vorzugsweise ca. 0,15 bis ca. 1 M, insbesondere ca. 0,2 eines Salzes mit einem pH- Wert von ca. 7 bis ca. 8, vorzugsweise von ca. 7,3 bis 7,4, insbesondere von 7,4.
Der Vorteil dieser Salzlösung ist, dass das Fusionsprotein vorzugsweise als Capsid oder Capsomer in Lösung bleibt bzw. fein verteilt als Suspension vorliegt. Das Salz ist im allgemeinen ein Alkali- oder Erdalkalisalz, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl. Die Verwendung von NaCl ist insbesondere für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung bevorzugt. Der pH- Wert des Arzneimittels wird im allgemeinen mit einem geeigneten organischen oder anorganischen Puffer eingestellt, wie z.B. vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)- piperazino]-ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-l-propansulfonsäure). Die Auswahl des jeweiligen Puffers richtet sich im allgemeinen nach der gewünschten
Puffermolarität. Phosphatpuffer ist beispielsweise für Injektions- und Infusionslösungen geeignet.
Als weitere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, die beispielsweise zur weiteren Stabilisierung des Papillomavirus-spezifischen Proteins in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel dienen, eignen sich beispielsweise Detergentien, wie beispielsweise Polyoxyehtylen-Sorbitan- Fettsäureester (Polysorbate), wie zum Beispiel Polysorbat 80 (zum Beispiel Tween 80®), Polysorbat 60 (zum Beispiel Tween 60®) oder Polysorbat 20 (zum Beispiel Tween 20®), Polyoxyethylen-Alkyl-Ether (zum Beispiel Brij 58®, Brij 35®) oder andere wie zum Beispiel Triton X-100®, Triton X-114®, NP40®, Span 85, Pluronic 121 oder Natriumdesoxycholat. Ferner sind auch Polyole, wie zum Beispiel Polyethylenglykol oder Glycerin, Zucker, wie z. B.) Saccharose oder Glukose, zwitterionische Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder ein Protein, wie z. B. bovines oder humanes Serumalbumin. Bevorzugt sind Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen. Andere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind Proteaseinhibitoren, wie z.B. Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Pepstatin A. Bevorzugt sind solche Zusatzstoffe, die keine immunologischen Nebenwirkungen induzieren.
Unter den Begriffen L-Protein, Ll -Protein, L2-Protein, Ll/L2-Protein und E-Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Vollängen-Proteine wie auch deren Mutanten, wie z. B. Deletionsmutanten.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform enthält das erfindungsgemäße Fusionsprotein ein deletiertes L-Protein, vorzugsweise ein deletiertes Ll- und gegebenenfalls L2-Protein. Die Deletion hat den Vorteil, dass in den deletierten Bereich besonders wirksam andere Proteine, beispielsweise Papillomavirus-spezifische E- Proteinsequenzen eingefügt werden können, wodurch sich der Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erweitern, läßt. Insbesondere bevorzugt ist ein L- Protein mit einer C-terminalen Deletion und insbesondere ein C-terminal deletiertes Ll- Protein. Die C-terminale Deletion hat den Vorteil, dass die Effizienz der Bildung virus- ähnlicher Partikel gesteigert werden kann, da das am C-Terminus lokalisierte nukleare Lokalisationssignal deletiert ist. Die C-terminale Deletion beträgt daher vorzugsweise bis zu ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 15 bis ca. 35 Aminosäuren, vor allem ca. 26 bis 28 Aminosäuren.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist auch das E-Protein deletiert, vor allem das E6- und/oder E7 -Protein. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn der C-terminale Teil des E-Proteins deletiert ist, vorzugsweise der C-terminale Teil des E7-Proteins, da diese Konstrukte in Verbindung mit deletiertem L-Protein bevorzugt Capsomere und/oder Capside ausbilden können. Insbesondere bevorzugt sind Deletionen bis zu 55 Aminosäuren, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 40 bis ca. 51 Aminosäuren, vor allem ca. 41 bis ca. 45 Aminosäuren. Eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform ist, wenn der N-Terminus eines E-Proteins zusätzlich oder alternativ zu einer C-terminalen Deletion, deletiert ist, vorzugsweise der N-terminale Teil des E7- Proteins, da derartige Konstrukte eine Verpackung von mehr C-terminalen Aminosäuren in Capside erlauben.
Bei der Konstruktion von HPV 16 LIΔC Fusionsproteinen hatte sich gezeigt, dass abhängig von der Länge und der spezifischen Sequenz des an HPV16 LIΔC fusionierten Fusionspartners die Fähigkeit zur Capsidbildung verloren geht (Müller, M. et al. 1997 supra sowie DE 19812941). So ist bei HPV16 LlΔc*E71.6o die Capsidbildung gegenüber HPV16 L1ΛC*E71.55 vermindert und bei HPV16 L1ΛC*E71.65 komplett verhindert. Der Grund dafür dürfte sein, dass Sequenzen im Bereich der Aminosäuren 55 bis 70 von HPV 16 mit der Capsidbildung interferieren. Möglicherweise formen die in diesem Bereich liegenden Cysteine falsche Disulfidbrücken untereinander oder mit Cysteinen des Ll Anteils. Gleichzeitig soll aber der am LIΛC fusionierte E-Proteinpartner möglichst viele Epitope zur Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen enthalten. Überraschenderweise wurde nun für HPV 18 gefunden, dass im Gegensatz zu HPV 16 auch Konstrukte mit einem E7-Anteil von mehr als 55 Aminosäuren Capside bilden.
Ebenfalls überraschend, gerade im Hinblick auf die Analogie zu HPVl 6, konnte festgestellt werden, dass die Capsidbildung in diesen HPV18-Konstrukten auch nicht durch das Vorhandensein eines Cysteins im C-terminalen Bereich gehindert wurde. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass das Konstrukt HPVl 8 L1ΛC*E71-64, welches eines dieser Cysteine enthält, ebenso effizient Capside bildet wie das wesentlich kürzere Konstrukt HPVl 8 L1ΔC*E71.55.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass HPVl 8 LlΛc*E7-Konstrukte beginnend mit dem Methionin an Aminosäure-Position 1 von E7 gegenüber Konstrukten mit einer N-terminalen Deletion des E7, beispielsweise des Methionins an Position 1, den Vorteil bergen, dass sie ein Maus T-Zellepitop enthalten, welches mit dem Methionin an Position 1 beginnt (enthalten in den Peptiden Q43 und Q44 aus Beispiel 5).
Dieses Epitop ist deshalb so überraschend, weil es durch das sogenannte Peptid-Prediction Program von Parker et al. (1994), J. Immunol. 152:163, unter http://www- bimas.dcrt.nih/gov/molbio hla bind/ nicht vorhergesagt wird.
Diese HPV18-Konstrukte haben somit den Vorteil, dass deren Auslösung einer zellulären Immunantwort in entsprechenden Mausstämmen sehr einfach überprüft werden kann, weil eine Impfung dieser Mäuse eine spezifische T-Zellantwort auslöst, die mit den Peptiden Q43 und/oder Q44 nachweisbar ist. Ohne einen derartigen, einfach durchführbaren immunologischen Test müsste man von dem Anteil der Capside auf deren immunologische Wirksamkeit zurückschließen, was zweifelsohne zu ungenaueren Ergebnissen führt.
Darüberhinaus konnte überraschenderweise nachgewiesen werden, dass das HPV 18
LlΔc*E71-64-Konstrukt im Mausmodell eine zytotoxische Immunantwort auslöst, das HPV 18 LlΔcE72.62-Konstrukt hingegen nicht. Daraus kann geschlossen werden, dass das Konstrukt HPVl 8 LlΔc*E7!-64 immunogener als das Konstrukt HPVl 8 L1ΔCE72.62 ist, so dass auch bei humanen Vakzinierungen für das HPVl 8 LlΔc*E71.6 -Konstrukt eine weitaus größere Erfolgswahrscheinlichkeit besteht.
Bevorzugte Konstrukte sind HPVl 8 L1ΔCDIE71.53DI und HPVl 8 L1ΛCDIE71.6ODI- Bei diesen Konstrukten wird der E7-Anteil auf DNA-Ebene aus Konstruktionsgründen von zwei EcoRV Restriktionsschnittstellen flankiert. Dadurch enthält das Fusionsprotein vor und hinter dem E7 Anteil die zusätzlichen Aminosäuren Asp und Ile (DI).
Weitere bevorzugte Konstrukte sind HPV18 LlΔC*E72-s7, HPV18 L1ΔC*E72.60, HPV18 L1ΔC*E7 .62 und HPVl 8 L1ΔC*E73.64. Diese mit einem * gekennzeichneten Konstrukte enthalten keine HPV-fremden Sequenzen.
Besonders bevorzugte Konstrukte sind HPV18 LlΔc*E71-55, HPV18 LlΔC*E71-57, HPV18 L1ΔC*E71.62 und HPVl 8 LlΔc*E71-64. Diese mit einem * gekennzeichneten Konstrukte enthalten keine HPV-fremden Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Konstrukte zur Herstellung eines Arzneimittels einerseits zur Verhinderung von HPV-spezifischen Tumoren und andererseits zur Regression von bereits bestehenden HPV-spezifischen Tumoren.
Zur Herstellung eines sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch wirksamen Arzneimittels ist es bevorzugt, wenn das beschriebene Papillomavirus-spezifische Fusionsprotein in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegt, da durch die Capside und/oder Capsomere und insbesondere durch den Anteil von L-Protein die Immunreaktion noch deutlich gesteigert werden kann. Als Fusionsproteine, die zur Capsid- und/oder Capsomerbildung geeignet sind, sind daher beispielsweise Fusionsproteine aus deletiertem Ll und E7, E6 und oder El bevorzugt.
Capside sind im Sinne der vorliegenden Erfindung virale oder virus-ähnliche Strukturen in einer im allgemeinen ikosaedrischen Form, die im allgemeinen aus 72 Capsomeren aufgebaut sind. Capsomere sind im Sinne der vorliegenden Erfindung assemblierte Proteine enthaltend mindestens ein Papillomaviras-Slxukturprotein, vorzugsweise Ll oder Deletionen von Ll. Beispielsweise können 5 erfindungsgemäße Fusionsproteine zu einem Capsomer assemblieren, die wiederum zu einem Capsid assemblieren können.
Für die Herstellung einer Kombinationsvakzine ist es vorteilhaft, Proteine bzw. Peptide aus verschiedenen HPV-Typen zu kombinieren, vorzugsweise von HPV-6, HPV-11, HPV- 16, HPV-18, HPV-31, HPN-33, HPN-35, HPV-39, HPV-45, HPV-52 und/oder HPV-58, beispielsweise eine Kombination von HPV-16 und HPV-18 bzw. HPV-18, HPV-31, HPV- 45 und HPV-58 im Falle von z. B. Cervixcarcinom oder HPV6 und HPV-11 im Fall von z. B. Condylomen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, bei dem eine geeignete Zelle enthaltend einen geeigneten Expressionsvektor, der für das genannte Fusionsprotein kodiert, unter geeigneten Bedingungen kultiviert, das Expressionsprodukt isoliert wird und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe zugesetzt werden.
Die Expressionsvektoren können beispielsweise prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren sein. Beispiele für prokaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in E. coli z.B. die Vektoren pGEM oder pUC-Derviate (siehe z. B. WO96/11272). Beispiele für eukaryotische Expressionsvektoren sind für die Expression in Saccharomyces cerevisiae z. B. die Vektoren p426Met25 oder p426GALl (Mumberg et al. (1994) Νucl. Acids Res., 22, 5767-5768, Carter, J. J. et al. (1991) supra) und für die Expression in Insektenzellen z. B. Baculovirus-Vektoren, insbesondere das Autographa Californica-Virus, wie in EP-B1-0 127 839 oder EP-B1-0 549 721 offenbart (siehe z. B. auch WO94/20137), und für die Expression in Säugerzellen z. B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle allgemein erhältlich sind. Es eignen sich jedoch auch kommerziell erhältliche Baculovirus Expressionssysteme wie z. B. der Baculo
Gold Transfection Kit von Pharmingen oder das Bac-to-Bac Baculovirus
Expressionsystems von Gibco BRL. Weitere geeignete Expressionssysteme sind Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die jeweilige Wirtszelle geeignete Promotoren, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in E. coli (siehe z.B. EP-B1-0 154 133), den ADH2-Promotor für die Expression in Hefen (Rüssel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682), den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen (siehe z.B. EP-B1-0 127 839 oder U.S. 5,004,687) oder den frühen SV40 Promotor oder LTR-Promotoren z. B. von MMTV (mouse mammary tumour virus; Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232).
Als Wirtszellen eignen sich beispielsweise die E. coli Stämme DH5, HB101 oder BL21, die Hefestämme Saccharomyces, Pichia, Kluyvermyces, Schizosaccharomyces oder Hansenula (Carter, J. J. et al. (1991), Virology, 182, 513), Insektenzellinien der Gattung Lepidoptera, z. B. von Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Rachiplusia ou oder Galleria Mellonela oder die tierischen Zellen COS, C127, Vero, 293 und HeLa, die alle allgemein erhältlich sind (siehe z. B. WO94/00152).
Die kodierenden Nukleinsäuren für die einzelnen Papillomavirus-spezifischen Proteine wurden beispielsweise über eine PCR („polymerase chain reaction")-Amplifizierung aus einer Genbank isoliert und kloniert. Das Genom von HPVl 8 ist unter der GenBank Accession No. X05015 allgemein erhältlich und wurde von Cole und Danos publiziert (J Mol. Biol. 1987, 193 (4), 599-608).
Die für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Fusionsproteine zugrunde gelegte Sequenz besaß dazu folgende Änderungen im Ll Gen: An den Positionen 89, 848, 1013 und 1230 des Ll-Gens wurde auf DNA-Ebene ein C gegen ein G ausgetauscht. Auf Protein-Ebene führen die ersten drei Änderungen zu einem Austausch von Pro nach Arg, während die letzte Mutation keine Änderung auf Protein-Ebene zur Folge hat.
Somit lautet die zugrunde gelegte DNA-Sequenz des HPVl8 LlΔc*:
atggctttgtggcggcctagtgacaataccgtatatcttccacctccttctgtggcaagagt tgtaaataccgatgattatgtgactcgcacaagcatattttatcatgctggcagctctagat tattaactgttggtaatccatattttagggttcctgcaggtggtggcaataagcaggatatt cctaaggtttctgcataccaatatagagtatttagggtgcagttacctgacccaaataaatt tggtttacctgatactagtattta aatcctgaaacacaacgtttagtgtgggcctgtgctg gagtggaaattggccgtggtcagcctttaggtgttggccttagtgggcatccattttataat aaattagatgacactgaaagttcccatgccgccacgtctaatgtttctgaggacgttaggga caatgtgtctgtagattataagcagacacagttatgtattttgggctgtgcccctgctattg gggaacactgggctaaaggcactgcttgtaaatcgcgtcctttatcacagggcgattgcccc cctttagaacttaaaaacacagttttggaagatggtgatatggtagatactggatatggtgc catggactttagtacattgcaagatactaaatgtgaggtaccattggatatttgtcagtcta tttgtaaatatcctgattatttacaaatgtctgcagatccttatggggattccatgtttttt tgcttacggcgtgagcagctttttgctaggcatttttggaatagagcaggtactatgggtga cactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtg tgtattctccctctccaagtggctctattgttacctctgactcccagttgtttaataaacca tattggttacataaggcacagggtcataacaatggtgtttgctggcataatcaattatttgt tactgtggtagataccactcgcagtaccaatttaacaatatgtgcttctacacagtctcctg tacctgggcaatatgatgctaccaaatttaagcagtatagcagacatgttgaggaatatgat ttgcagtttatttttcagttgtgtactattactttaactgcagatgttatgtcctatattca tagtatgaatagcagtattttagaggattggaactttggtgttccccccccgccaactacta gtttggtggatacatatcgttttgtacaatctgttgctattacctgtcaaaaggatgctgca ccggctgaaaataaggatccctatgataagttaaagttttggaatgtggatttaaaggaaag ttttctttagacttagatcaatatccccttggacgtaaatttttggttcaggctgga
Die zugrunde gelegte Protein-Sequenz des HPVl 8 Ll lautet:
1 MALWRPSDNT VYLPPPSVAR VVNTDDYVTR TSIFYHAGSS RLLTVGNPYF 51 RVPAGGGNKQ DIPKVSAYQY RVFRVQLPDP NKFGLPDTSI YNPETQRLVW
101 ACAGVEIGRG QPLGVGLSGH PFYNKLDDTE SSHAATSNVS EDVRDNVSVD
151 YKQTQLCILG CAPAIGEHWA KGTACKSRPL SQGDCPPLEL KNTVLEDGDM
201 VDTGYGAMDF STLQDTKCEV PLDICQSICK YPDYLQMSAD PYGDS FFCL
251 RREQLFARHF WNRAGTMGDT VPQSLYIKGT GMRASPGSCV YSPSPSGSIV 301 TSDSQ FNKP Y LHKAQGHN NGVCWHNQLF VTVVDTTRST NLTICASTQS
351 PVPGQYDATK FKQYSRHVEE YDLQFIFQLC TITLTADVMS YIHSMNSSIL
401 EDWNFGVPPP PTTSLVDTYR FVQSVAITCQ KDAAPAENKD PYDKLKFWNV
451 DLKEKFSLDL DQYPLGRKFL VQAGLRRKPT IGPRKRSAPS ATTSSKPAKR 500
Dabei wird unter LlΔc* ein Ll-Protein mit den Aminosäuren 1-474 von HPV18L1 verstanden. Unter L1ΔCDI wird ein Ll-Protein mit den Aminosäuren 1-472 und den Sequenz oben unterstrichenen Aminosäuren AG sind somit in den LlΔcDi-Konstrukten durch DI ersetzt.
Das HPVl 8 E7-Gen entspricht der publizierten DNA-Sequenz und lautet für E71.64:
atgcatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagccccaaaatgaaat tccggttgaccttctatgtcacgagcaattaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatag atggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttg taa
Die zugrunde gelegte Protein-Sequenz des HPV 18 E7 lautet:
1 MHGPKATLQD IVLHLEPQNE IPVDLLCHEQ LSDSEEENDE IDGVNHQHLP 51 ARRAEPQRHT MLCMCCKCEA RIKLVVESSA DDLRAFQQLF LNTLSFVCPW 101 CASQQ
Eine andere Methode, die gewünschten Nukleinsäuren zu erhalten, ist, die Papillomavirus- spezifischen Gene direkt aus Warzen oder Tumore mittels PCR zu isolieren. Geeignete Primer für die E6- und E7-Gene aus HPV16 und HPV18 sind z.B. in WO93/21958 offenbart. Weitere Literaturstellen für die gewünschten Nukleinsäuren sind beispielsweise Kirnbaum, R. et al. (1994), supra bzw. die oben bereits erwähnten in der EMBL- Datenbank hinterlegten Klone.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Expressionsvektor so konstruiert, dass das exprimierte Fusionsprotein um keine weiteren, durch den Vektor verursachte Aminosäuren verlängert ist. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, dass durch Mutagenese in einer PCR-Reaktion mittels geeigneter Primer-Oligonucleotide unerwünschte Nucleotide, die für zusätzliche Aminosäuren kodieren, entfernt werden (Ho et a. (1989) Gene, 77, 51-59). Auf diese Weise erhält man ein Fusionsprotein, welches frei von zusätzlichen Aminosäuren und somit frei von möglicherweise zusätzlichen Nach der Expression des beschriebenen Fusionsproteins ist es bevorzugt, dieses weiter zu reinigen bzw. zu renaturieren. Beispiele von chromatographischen Reinigungsverfahren finden sich Hjorth, R. & Moreno-Lopez, L. (1982) J. Virol. Meth., 5, 151; Nakai, Y. et al. (1987) J. Gen. Virol, 68, 1891; Hofmann, K. J. et al. (1995) Virology, 209, 506; Rose, R. C. et al. (1993) J. Virol., 67, 1936, Sasagawa, T. et al. (1995) Virology, 206, 126 oder WO 95/31532..
Im allgemeinen kann das Arzneimittel oral, parenteral, wie z.B. subcutan, intramuskulär oder über die Schleimhaut, in flüssiger oder suspendierter Form, in Form eines Elixiers oder als Kapseln verabreicht werden, vorzugsweise als Injektions- bzw. Infusionslösung. Bei den erfindungsgemäßen Formulierungen kann auf ein Adjuvans verzichtet werden, was besonders vorteilhaft ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierung als Injektions- oder Infusionslösung.
Injektionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn nur relativ geringe Mengen einer Lösung bzw. Suspension, beispielsweise ca. 1 bis ca. 20 ml, dem Organismus zugeführt werden soll. Infusionslösungen werden im allgemeinen dann verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehre Liter, appliziert werden sollen. Da im Gegensatz zur Infusionslösung bei Injektionslösungen nur wenige Milliliter verabreicht werden, machen sich geringe Abweichungen vom pH-Wert und vom osmotischen Druck des Blutes bzw. der Gewebsflüssigkeit bei der Injektion nicht oder nur unwesentlich im Hinblick auf die Schmerzempfindung bemerkbar. Eine Verdünnung der erfindungsgemäßen Formulierung vor der Anwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich. Bei der Applikation größerer Mengen sollte hingegen kurz vor der Applikation die erfindungsgemäße Formulierung so weit verdünnt werden, dass eine zumindest annähernd isotonische Lösung erhalten wird. Ein Beispiel einer isotonischen Lösung ist eine 0,9%-ige Natriumchloridlösung. Bei der Infusion kann die Verdünnung beispielsweise mit sterilem Wasser während der Applikation z.B. über einen sog. Bypaß erfolgen. Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt einen schematische Darstellung der Klonierung der HPVl 8 LlΔc*E71-χ Konstrukte, wobei X = 55, 57, 62 oder 64.
Fig. 2 zeigt einen schematische Darstellung der Klonierung der HPV 18 L1ΔC*E7Y.Z Konstrukte, wobei Y= 2 oder 3, sowie Z= 57, 60, 62 oder 64.
Fig. 3A zeigt eine graphische Darstellung der Absorption bei 280 bzw. 260 um aufgetragen gegen die Zeit in Minuten eines HPLC-Chromatogramms des HPV18 LlΔc*E72-6 - Fusionsproteins. Fig. 3B zeigt die Photographie einer Silberfarbung einer SDS-PAGE-Analyse der entsprechenden Fraktionen des darüber befindlichen Chromatogramms. Mit dem Pfeil ist die Hauptbande des HPVl 8 LlΔc*E72-62-Fusionsproteins gekennzeichnet.
Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK-Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK- Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ- Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 5 zeigt die graphische Auswertung von zwei FACScan-Experimenten nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit LKK -Zellen, die unterschiedliche Peptide präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, LKK- Zellen ohne Peptid wurden lediglich mit Puffer inkubiert und dienten als Negativ- Kontrolle. Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden. Fig. 6 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die unterschiedliche HPVl 8 Peptidpools präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptidpools angegeben, „ohne" steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle), Ll bzw. E7 steht für mit HPV18 Ll- bzw. HPV18 E7-Peptidpool inkubierte BLCL (Positiv- Kontrollen). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD4-positiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 7 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer humaner T-Zellen mit donor-identischen BLCL, die das Q9 Peptid präsentieren. Auf der X-Achse ist der Name des jeweiligen Peptids angegeben, BLCL steht für lediglich mit Puffer inkubierte BLCL (Negativ-Kontrolle). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-ρositiven T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Fig. 8 zeigt die graphische Auswertung der Absorption in mAU bei 280 bzw. 260 nm aufgetragen gegen die Zeit in Minuten eines HPLC-Chromatogramms des HPVl 8 L1ΔC*E71.55 Fusionsproteins.
Fig. 9 zeigt die graphische Auswertung der Absorption in mAU bei 280 bzw. 260 nm aufgetragen gegen die Zeit in Minuten eines HPLC-Chromatogramms des HPV 18
L1ΔC*E71.64 Fusionsproteins.
Fig. 10 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit JAWS-II-Zellen, die mit CVLPs (HPV18LlΔcDiE72-62Di oder HPV18LlΔCE71-64, jeweils 10 oder 40 μg) oder mit Peptiden (Q43, 44 oder 45) beladen worden waren (siehe X-Achse). JAWS-II-Zellen wurde als Negativ-Kontrolle lediglich mit Puffer inkubiert („ohne"). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD8-positive T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktv klassifiziert wurden. Fig. 11 zeigt die graphische Auswertung eines FACScan-Experiments nach Restimulation spezifischer muriner T-Zellen mit JAWS-II-Zellen, die mit CVLPs (HPV18LlΔcE71.64, nativ oder gekocht („denaturiert") oder mit dem E7-Peptidpool beladen worden waren (siehe X-Achse). JAWS-II-Zellen wurde als Negativ-Kontrolle lediglich mit Puffer inkubiert („ohne"). Auf der Y-Achse ist der Anteil der CD 8 -positive T-Zellen aufgetragen, die anhand von IFNγ-Expression im FACScan-Experiment als reaktiv klassifiziert wurden.
Beispiele
1. Herstellung von chimären Genen kodierend für HPVl 8L1E7 -Fusionsproteine
Zur Herstellung von HPV18L1ΔCDI wurden zwei Primer konstruiert, die zu HPV18L1 ORF komplementär sind. Der erste Primer hat die Sequenz
5'-ACC AGA CTC GAG ATG GCT TTG TGG CGG CCT AGT GAC-3 '
und der zweite Primer
5' -ATA GCC AAG CTT AAT GAT ATC CTG AAC CAA AAA TTT ACG TCC-3'
Der erste Primer kodiert 5' eine Xhol Restriktionsenzymschnittstelle. Der zweite Primer kodiert 5' eine EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle. Auf die EcoRV Stelle folgt ein TAA Translationsstopkodon, um die letzten 35 Aminosäuren des HPV18L1 ORF zu deletieren. Das PCR-Produkt wurde mit XhoI/EcoRV gespalten und in den ebenfalls XhoI/EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript® ligiert. Das erhaltene Konstrukt HPV18LlΔc pKS wurde benutzt, um den ORF von HPV18E7I.53DI und HPV18E71-60Dι in die EcoRV Stelle zu klonieren.
Zur Klonierung der HPV 18 E7 Fragmente wurden Primer mit einer 5 'EcoRV Restriktionsenzymschnittstelle verwendet. Es wurde folgende Primerpaare verwendet: 5' -GGC CAT GAT ATC ATG CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG-3' (5'-Ende des E7 Gens)
und
5 ' -GGC CAT GAT ATC TCG TCG GGC TGG TAA ATG TTG ATG-3 ' (3 '-Ende des E7Ϊ-SSDI Fragments)
bzw.
5 ' -GGC CAT GAT ATC TGT GTG ACG TTG TGG TTC GGC TC-3 ' (3 '-Ende des £7^0001 Fragments).
Die PCR Produkte wurden mit EcoRV gespalten und in die EcoRV Stelle des modifizierten L 1 -Gens insertiert.
Zur Eliminierung der EcoRV Stellen bei den HPV18LlΔcE71.x wurde die Tatsache genutzt, dass die ersten beiden Aminosäuren des E7 Proteins (Met-His) auf DNA-Ebene der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Nsil (ATG CAT) entsprechen.
Zuerst wurde durch eine PCR-Reaktion ein HPVl 8 LlΔcE71.2 Fragment hergestellt. Der 5 '-Primer 1801 kodierte eine Xhol Schnittstelle gefolgt von einer Bglll Schnittstelle, dem Startkodon sowie den ersten Nukleotiden des HPVl 8 Ll Gens. Der 3 '-Primer 1804 kodierte für die letzten Nukleotides des HPVl 8 LlΔc Gens gefolgt von einer Nsil Schnittstelle, die die ersten sechs Nukleotides des HPV 18 E7 Gens darstellt, sowie einer EcoRI Schnittstelle. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit den Enzymen XhoI/EcoRI geschnitten und in den Vektor pBluescript® (Stratagene) kloniert. Der resultierende Vektor wurde als pBSK-18LlΔcE7i-2 bezeichnet (siehe Fig. 1).
1801: 5'-CGC CGC CTC GAG AGA TCT ATG GCT TTG TGG CGG CCT-3'
1804: 5'-CCG GAA TTC CCA CCA ATG CAT TCC AGC CTG AAC CAA AAA TTT-3' Die Fragmente für HPVl 8 E7 1-55, 1-57, 1-62 und 1-64 wurden ebenfalls durch PCR- Reaktionen hergestellt. Dabei wurde für alle Fragmente derselbe 5 '-Primer 1805 benutzt, der für die ersten 24 Nukleotide des HPVl 8 E7-Gens kodierte, wobei die ersten sechs davon die Nsil-Schnittstelle darstellen. Die 3 '-Primer 1806, 1807, 1808 und 1809 kodierten für die letzten 21 Nukleotide der jeweiligen HPV 18 E7 Fragmente gefolgt von einem Stop-Codon und einer EcoRI-Schnittstelle. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden mit Nsil/EcoRI gespalten und in den Nsil/EcoRI aufgeschnittenen Vektor pBSK- 18L1ΔCE71_2 ligiert, so dass die Fusionsgene HPV18 LlΔcE71-55, HPV18 LlΔcE71-S7, HPV18 L1ΔCE71.62, HPV18 Ll cE7i-6 im Vektor pBluescript® erhalten wurden (siehe Fig.
1805 5'-CGC GGA TCC ATG CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG-3 1806 5'-CCG GAA TTC TTA TTC GGC TCG TCG GGC TGG TAA-3' 1807 5'-CCG GAA TTC TTA TTG TGG TTC GGC TCG TCG GGC-3' 1808 5'-CCG GAA TTC TTA CAA CAT TGT GTG ACG TTG TGG-3' 1809 5'-CCG GAA TTC TTA CAT ACA CAA CAT TGT GTG ACG-3'
Bei der Herstellung der Fusionsgene, deren E7 Anteil erst bei Aminosäure 2 bzw. 3 beginnt, konnte die Nsil-Schnittstelle nicht benutzt werden. Zur Herstellung dieser Konstrukte wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt. Bei dem Produkt der ersten Reaktion handelte es sich um das LlΔc* Gen, an das der Beginn des E7 Gens (beginnend ab Aminosäure 2 bzw. 3) fusioniert war. Beim Produkt der zweiten Reaktion handelt es sich um das E7 Gen (beginnend ab Aminosäure 2 bzw. 3), vor das das Ende des LlΔc* Gens fusioniert war. Die resultierenden DNA-Fragmente überlappten also an der Position der L1/E7 Grenze („Four Primer PCR", Ho, S. N. et al (1989) Gene 77, 51). Jedoch enthielten die Primer keine Restriktionsenzymschnittstellen. Fragment 1 der LlΔc*E72.x Fusionsgene wurde mit der Primerkombination 1801/1810 und Fragment 2 mit den Primerkombinationen 1812/1807 (L1ΔC*E72_57) bzw. 1812/1814 (LlΔC*E72-6o) bzw. 1812/1808 (Ll c*E72-62) hergestellt. Die Herstellung des LlΔc*E73-64 Fusionsgens erfolgte nach der gleichen Methode. Bei diesem Konstrukt wurde Fragment 1 mit der Primerkombination 1801/1811 und Fragment 2 mit der Primerkombination 1813/1809 hergestellt (siehe Fig. 2).
1810: 5' -TTG CAA TGT TGC CTT AGG TCC ATG TCC AGC CTG AAC CAA AAA TTT-3'
1811: 5'-GTC TTG CAA TGT TGC CTT AGG TCC TCC AGC CTG AAC CAA
AAA TTT-3' 1812: 5' -AAA TTT TTG GTT CAG GCT GGA CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA-3' 1813: 5' -AAA TTT TTG GTT CAG GCT GGA GGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA GAC-3'
Ein Zehntel der jeweiligen gereinigten Produkte wurde gemischt und als Matrize in der PCR-Reaktion mit ausschließlich den Primerkombinationen 1801/1807 (LlΔc*E72-5 ) bzw. 1801/1814 (LlΔc*E72-6o), 1801/1808 (LlΔc*E72-62) und 1801/1809 (LlΔC*E73-64) benutzt. Die resultierenden Produkte wurde mit Xhol (stromaufwärts vom Startcodon) und EcoRI (stromabwärts vom Stopkodon) gespalten und in den XhoI/EcoRI aufgeschnittenen Vektor pBluescript® ligiert.
Die resultierenden HPVl 8LlΔc*E7x-y Konstrukte unterscheiden sich daher von den Klonen HPVISLIΔCDI
Figure imgf000022_0001
und HPV18L1ΔCDI
Figure imgf000022_0002
durch den Verlust der zwei internen EcoRV Restriktionsenzymschnittstellen und der korrespondierenden nicht-HPV Aminosäuren Asp und He zwischen dem Ll ORF und E7 und stromabwärts von E7. Die erste EcoRV Stelle wurde durch die ursprünglichen Ll Aminosäuren an dieser Position ersetzt (AlaGly). Die zweite EcoRV Stelle wurde durch ein Translationsstopsignal ersetzt.
Die Klone wurden durch DNA-Sequenzierung analysiert. Anschließend wurden die
HPV18LlΔc*E7x.y Fusionsgene durch Bglll/EcoRI Restriktionsverdau aus dem Vektor pBluescript® herausgeschnitten und in den Bglll/EcoRI gespaltenen Baculovirus Transfervektor pVL 1392 ligiert, um rekombinante Baculoviren herzustellen. 2. Herstellung von rekombinanten Baculoviren
Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen wurden als Monolayer oder in Suspensionskultur in TNM-FH Insektenmedium (Life Technologies, Karlsruhe) mit 10% fötalem Kälberserum und herangezogen. Rekombinante Baculoviren wurden durch Cotransfektion von 5 μg der rekombinanten Plasmide und 1 μg von linearisiertem Baculo-Gold® DNA (Pharmingen, San Diego, CA) in Sf9 Zellen hergestellt. Rekombinante Viren wurden durch Endpunktverdünnung und/oder Plaque-Vereinzelung gereinigt. Um die Expression zu testen, wurden 106 Sf9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus und einer m.o.i. („multiplicity of infection") von 0,5 und 1 für 48h und infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM Kcl, 8,1 mM Na2PO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden dann durch FACS-Messung untersucht oder in SDS-Probenpuffer lysiert und durch SDS-Gelchromatographie und Immunoblotassay getestet.
3. Reinigung von virusähnlichen Partikeln
Für die Herstellung von CVLPs wurden Sf9 oder SF+-Zellen bei 27°C bis zu einer Dichte von 1,5-2 x 106 Zellen pro ml in den serumfreien Medien InsectXPress (Biowhittaker, Verviers, Belgien) oder Sf 900II (Life Technologies, Karlsruhe) gezüchtet. Eine 200 ml Kultur wurde mit einer m.o.i. von 1 bis 2 mit rekombinanten Baculoviren für 48h infiziert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und bei -80°C eingefroren. Frier-Tau Lyse erfolgte durch Zugabe von 4 Vol. Extraktionspuffer (200 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,5). Die Klärung des Homogenats erfolgte durch Zentrifugation bei 10.000 rpm im Sorvall SS34 Rotor. Die Aufreinigung des L1E7 Proteins aus dem geklärten Rohextrakt für die immunologischen Assays erfolgte durch Ammoniumsulfat-Fällung bei 35-40% Sättigung und anschließende Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel® TMAE (Merck, Darmstadt), wobei die CVLPs im liearen Salzgradienten bei 300-400mM NaCl eluiert werden. Die Bestimmung des Proteingehalts der gereinigten Fraktionen erfolgte nach der Bradford-Methode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard. 4. Capsidnachweis in gereinigten HPVl 8 L17-Fraktionen
Es konnte bereits zuvor für HPV16 L1ΔCE71.55 CVLPS durch Kombination mit Saccharose- Dichtegradienten-Zentrifugation und Transmissions-Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass für entsprechende Capside nach einer Größenaustausch-Chromatographie an einer TSKgel G6000PWXL Säule (Tosoh Haas, Stuttgart) auf einer System 1100 HPLC der Fa. Agilent eine Retentionszeit von ca. 10 "V. 0,5 min (Flußrate 0,8 ml / min) spezifisch ist.
Bei der Analyse des HPVl 8 L1ΔC*E72-62 Fusionsproteins zeigte sich nun, dass die nach Beispiel 3 aufgereinigten Proteine nach einer Größenaustausch-Chromatographie unter identischen Bedingungen wie bei den HPV16-Capsiden mit einer Retentionszeit von 10,366 min eluierten (siehe Fig. 3A). Das Vorhandensein der HPVl 8 L1E7 Fusionsproteine in den Fraktionen konnte durch SDS-PAGE Analyse (siehe Fig. 3B) und Immunblot (Daten nicht gezeigt) bestätigt werden. Ein zweiter Gipfel bei 12,407 min enthält noch immer einen Teil des Konstrukts sowie eine Reihe von Verunreinigungen. Fig. 3 zeigt somit, dass das Konstrukt HPV 18 L1ΔC*E72.62 unter diesen Bedingungen zu einem erheblichen Anteil in Capsiden vorliegt.
Partikelbildung konnte ebenso für folgende Konstrukte nachgewiesen werden: LlΔC*E71-55 (siehe Fig. 8), LlΔC*E71-57, LlΔc*E71-62, LlΔC*E71-64 (siehe Fig. 9), LlΔC*E73-64,
Figure imgf000024_0001
und L1 CDIE71.6ODI-
Überraschend ist dabei, dass das Konstrukt HPVl 8 Ll c*E71-64 ebenso effizient wie das wesentlich kürzere Konstrukt HPVl 8 LlΔC*E71-55 (s. Fig. 8 und 9) Capside bildet, da aufgrund der bekannten Daten für HPV16-Capsidbildung (siehe Müller M. et al. 1997, supra) keine Partikelbildung für derartig lange E7-Anteile mit C-terminalen Cysteinen zu erwarten wäre.
Figure imgf000024_0002
CVLPs in Mäusen Mehrere C3H-Mäuse wurden 2 mal mit je 20 μg eines 1:1 Gemisch aus HPVl 8 LlΔcDiE7i- 53Di CVLPs und HPVl 8 L1ΔCDIE71.6ODI CVLPS bzw. zur Kontrolle mit Puffer immunisiert. Nach 2 Wochen wurden die Milzzellen nach Standardmethoden gewonnen ( urine T- Zellen).
Es wurden nun um jeweils 9 Aminosäuren überlappende 20mer-Peptide synthetisiert, welche die Sequenz des Ll und des E7 Proteins von HPV 18 umfassen. Die Peptide wurden von 1 bis 52 durchnummeriert. Ihr Name und ihre Sequenz sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Tabelle 1: Synthetische überlappende 20mer Peptide von HPV 18 Ll und E7
Peptid Nr. Sequenz relative Position
HPV18 L1 Peptide
Ql MALWRPSDNTVYLPPPSVAR 1 -20
Q2 YLPPPSVARVVNTDDYVTRT 12-31
Q3 NTDDYVTRTSIFYHAGSSRL 23-42
Q4 FYHAGSSRLLTVGNPYFRVP 34 -53
Q5 VGNPYFRVPAGGGNKQDIPK 45-64
Q6 GGNKQDIPKVSAYQYRVFRV 56-75
Q7 AYQYRVFRVQLPDPNKFGLP 67 -86
Q8 PDPNKFGLPDTSIYNPETQR 78 -97
Q9 SIYNPETQRLVWACAGVEIG 89 -108
Q10 WACAGVEIGRGQPLGVGLSG 100-119
Qll QPLGVGLSGHPFYNKLDDTE 111-130
Q12 FYNKLDDTESSHAATSNVSE 122 -141
Q13 HAATSNVSEDVRDNVSVDYK 133 -152
Q14 RDNVSVDYKQTQLCILGCAP 144 -163
Q15 QLCI GCAPAIGEHWAKGTA 155 -174 Q16 GEH AKGTACKSRPLSQGDC 166 -185
Q17 SRPLSQGDCPP ELKNTV E 177 -196
Q18 LELKNTVLEDGDMVDTGYGA 188 -207
Q19 DMVDTGYGAMDFSTLQDTKC 199 -218
Q20 FSTLQDTKCEVPLDICQS IC 210 -229
Q21 PLDICQSICKYPDYLQMSAD 221 -240
Q22 PDYLQMSADPYGDSMFFCLR 232 -251
Q23 GDSMFFCLRREQLFARHF N 243 -262
Q24 QLFARHF NRAGTMGDTVPQ 254 -273
Q25 GTMGDTVPQSLYIKGTGMRA 265 -284
Q26 YIKGTGMRASPGSCVYSPSP 276 -295
Q27 GSCVYSPSPSGSIVTSDSQL 287 -306
Q28 SIVTSDSQLFNKPYWLHKAQ 298 -317
Q29 KPYWLHKAQGHNNGVCWHNQ 309 -328
Q30 NNGVC HNQLFVTVVDTTRS 320 -339
Q31 VTVVDTTRSTNLTICASTQS 331 -350
Q32 LTICASTQSPVPGQYDATKF 342 -361
Q33 PGQYDATKFKQYSRHVEEYD 353 -372
Q34 YSRHVEEYDLQFIFQLCTIT * 364 -383
Q35 FI FQLCTITLTADVMSYIHS 375 -394
Q36 ADVMSYIHSMNSS ILEDWNF 386 -405
Q37 SSILEDWNFGVPPPPTTSLV 397 -416
Q38 PPPPTTSLVDTYRFVQSVAI 408 -427
Q39 YRFVQSVAITCQKDAAPAEN 419 -438
Q40 QKDAAPAENKDPYDKLKFWN 430 -449
Q41 PYDKLKFWNVDLKEKFSLDL 441 -460
Q42 LKEKFSLDLDQYPLGRKFLV 452 -471
Q43 YPLGRKFLVQAGMHGPKATL 463 -474 und
E7 1-8 HPV18 E7 Peptide
Q44 MHGPKATLQDIVLHLEPQNE 1 -20
Q45 VLHLEPQNEIPVDLLCHEQL 12-31
Q46 VDLLCHEQLSDSEEENDEID 23 -42
Q47 SΞEENDEIDGVNHQHLPARR 34-53
Q48 NHQHLPARRAEPQRHTMLCM 45 -64
Q49 PQRHTMLCMCCKCEARIKLV 56 -75
Q50 KCEARIKLVVESSADDLRAF 67 -86
Q51 SSADDLRAFQQLFLNTLSFV 78 -97
Q52 LFLNTLSFVCP CASQQ 89 -104
Unter HPV18 Ll -Peptidpools wird das Gemisch der Peptide Ql bis Q43, unter HPV18 E7- Peptidpools das Gemisch der Peptide Q44 bis Q52 verstanden.
Die murinen T-Zellen (4xl05) von HPVl 8 L1ΔCDIE7I.53DI CVLP- und HPVl 8 L1ΔCDIE7I- 60DI CVLP-geimpften C3H-Mäusen wurden für 5 Wochen mit HPV 18 Ll- oder E7- Peptidpools bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml je einzelnes Peptid sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte Splenozyten, gewonnen nach Standardmethoden aus der Milz von nicht geimpften Mäusen) stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 1 μg/ml der auf der X- Achse der Fig. 3 angegebenen Peptide sowie 105 Antigen-präsentierende Zellen (LKK, von ATCC, Nummer CCL-1) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 (Becton Dickenson, Hamburg) restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurden 1 μl Monensin (300 μM, Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-mouse CD8/PE (monoklonaler Ratten-Antikörper gegen den extrazellulären Teil des murinen CD8 mit Fluoreszenzmarker Phycoerithrin gekoppelt, Phamiingen, Heidelberg), mit α-mouse CD4/Cychrome (monoklonaler Ratten-Antikörper, Pharmingen, Heidelberg) und mit α-mouse IFNγ/FITC (monoklonaler Ratten-Antikörper gegen das murine Interferon γ mit FITC gekoppelt, Caltag, Hamburg) gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur (fluorescens activated cell sorter, Becton Dickenson, Hamburg) untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software (Becton Dickenson, Hamburg) analysiert.
Ergebnis: Fig. 4 zeigt für die Peptide Q22, Q23, Q51, Q43 und Q44 bzw. Fig. 5 für die Peptide Q41 und Q5, dass die mit diesen Peptiden inkubierten LKK-Zellen eine Restimulation von Peptid-stimulierten murinen CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Dies bedeutet, dass die mit den HPVl 8 L1ΔCDIE7I.53DI CVLPS und HPVl 8 L1ΔCDIE7I-6ODI CVLPs geimpften Mäuse zytotoxische T-Zellen ausgebildet haben, die sowohl gegen Peptide aus Ll (Q5, Q22, Q23, Q41, Q43) als auch Peptide aus E7 (Q44, Q51) gerichtet sind. Dies ist somit der Nachweis einer von zytotoxischen T-Zellen vermittelten zellulären Immunantwort nach Impfung mit den HPV18-Konstrukten in Mäusen.
6. Generierung von HPVl 8-spezifischen humanen T-Helferzellen
Humane T-Zellen (4x105) eines nicht-HLA-typisierten Blutspenders wurden für 1 Woche mit HPV18 L1ΔCDIE7I.53DI CVLPS und HPV18 L1ACDIE7WODI CVLPs, 800 U/ml humanem GM-CSF (Leukomax, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) und 500 U/ml humanem IL4 (Becton Dickenson, Hamburg) sowie für weitere 5 Wochen mit HPV 18 L1ΔCDIE71.53DI CVLPs und HPVl 8 L1ΔCDIE7WODI CVLPS bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml des CVLPs-Gemisches (Verhältnis 1:1 der beiden Konstrukte) sowie 105 Antigen- präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC, periphere Blutmononukleäre Zellen, isoliert nach Rudolf M.P. et al (1990), Biol. Chem. 380, 335-40)) stimuliert und geerntet. Die 20mer-Peptide Ql bis 52 aus Beispiel 5 wurden gemäß der Matrix
Figure imgf000029_0001
in Peptidpools A bis H bzw. 1 bis 7 zusammengefaßt.
Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit den Peptidpools sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL, jeweils mit Hilfe des Ebstein-Barr-Virus transformierte B-Zellinie, die für jeden Blutspender individuell hergestellt wurde, erhalten von Dr. A. Kaufmann, Jena) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 (Becton Dickenson) restimuliert. Dabei wurden derartige Mengen der Peptidpools eingesetzt, dass für jedes einzelne Peptid 1 μg/ml zugegeben wurde. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen, als Positiv-Kontrollen mit HPVl 8 Ll- bzw. HPVl 8 E7-Peptidpool inkubierte Zellen.
Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-human CD8/APC (monoklonaler Maus-Antikörper, gerichtet gegen den extrazellulären Teil des humanen CD8, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker APC, Caltag, Hamburg), mit α-human CD4/PerCP (monoklonaler Maus-Antikörper, gerichtet gegen den extrazellulären Teil des humanen CD4, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker PercP, Becton Dickenson, Hamburg) und mit α-human IFNγ/FITC (monoklonaler Maus- Antikörper, gerichtet gegen humanes Interferon γ, gekoppelt an den Fluoreszenz-Marker FITC, Caltag, Hamburg) gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 6 zeigt, dass insbesondere die mit den Peptidpools Ll, F und 1 inkubierten BLCL eine Restimulation von humanen CD4-positiven T-Zellen bewirkten, die mit HPV18 LlΔCDiE71-53Dι CVLPs und HPV18 L1ΔCDIE7WODI CVLPS stimuliert worden waren. Des weiteren zeigten die Peptidpools A und 6 eine deutlich über der Negativkontrolle liegende Restimulation. Die mit den übrigen Peptidpools inkubierten BLCL bzw. die Negativkontrolle oder die mit dem E7-Peptidpool inkubierten BLCL wiesen hingegen einen geringen Anteil an reaktiven CD4-positiven T-Zellen auf. Die Peptidpools F und 1 enthalten gemeinsam das Peptid Q6, das somit aller Voraussicht nach für die Restimulation der CVLP-stimulierten T-Zellen verantwortlich ist. Dies bedeutet, dass es gelungen ist, durch Inkubation von HPV18 LIΔCD^-SSDI CVLPs, HPV18 L1ΔCDIE71.6ODI CVLPs und humanen T-Zellen HPVl 8 Ll -spezifische T-Helferzellen auszubilden, die - in diesem Fall - gegen das Ll -Peptid Q6 gerichtet sind. Derartige HPV18-Konstrukte sind in der Lage, nach Impfung eine von T-Helferzellen vermittelte zelluläre Immunantwort gegen Ll und E7 auszulösen.
7. Generierung von HPVl 8-spezifischen humanen zytotoxischen T-Zellen
Analog zu Beispiel 6 wurden humane T-Zellen (4xl05) eines HLA A24-positiven Spenders für 3 Wochen mit dem HPV 18 Ll-Peptidpool bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe 1 μg/ml je einzelnes Peptid sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (bestrahlte PMBC) stimuliert und geerntet.
Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml des HPVl 8 Ll- Peptids Q9 sowie 105 Antigen-präsentierenden Zellen (donor-identische BLCL) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen. Nach einer Stunde wurden 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit α-human CD8/APC, mit α-human CD4/PerCP und mit α-human IFNγ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Ergebnis: Fig. 7 zeigt, dass die mit dem Peptid Q9 inkubierten BLCL-Zellen eine Restimulation von HPVl 8 Ll-Peptidpool-stimulierten CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Anhand des Algorithmus für potentielle HLA A24-bindende Peptide (Parker, KC et al., (1994) J. Immunol. 152:163), durchgeführt in dem sogenannten Peptid-Prediction Program von Parker unter http://www-bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/, wurde festgestellt, dass das Peptid IYNPETQRL an MHC-Klasse I Moleküle des Haplotyps HLA A24 bindet. Somit kann man davon ausgehen kann, dass das Peptid IYNPETQRL für die Restimulation der T-Zellen durch die mit dem Q9-Peptid inkubierten BLCL-Zellen verantwortlich ist. Dies bedeutet, dass es gelungen ist, durch Inkubation von HPVl 8 L1ΔCDIE71.53DI CVLPS und HPVl 8 L1AGD.E7I.6ODI CVLPS und humanen T-Zellen HPVl 8 Ll -spezifische zytotoxische
T-Zellen auszubilden, die - in diesem Fall - gegen das Ll -Peptid Q9 gerichtet sind. Derartige HPV18-Konstrukte sind in der Lage, nach Impfung eine von zytotoxischen T- Zellen vermittelte zelluläre Immunantwort gegen Ll und E7 auszulösen.
8. Nachweis einer CTL-Immunantwort nach Impfung von Black6 Mäusen mit HPVl 8 Konstrukten
Mehrere C57/BL/6-Mäuse wurden 2 mal mit je 20μg HPV 18L1ΔCDIE72-62DI CVLPs und zur Kontrolle mit Puffer immunisiert. Die Entnahme der Milzen, die Gewinnung der Splenozyten sowie deren Kultivierung und Restimulierung im Rahmen der FACScan- Analyse wurden gemäß der Beispiele 5, 6 und 7 durchgeführt. E7-Peptidpools sowie den aus den Mäusen gewonnenen, bestrahlten Splenozyten stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen mit den auf der X-Achse der Fig. 10 angegebenen CVLPs (HPV18LlΔcDiE72-62Di oder HPV18LlΔCE71-64, jeweils 10 oder 40 μg) bzw. Peptiden (Q43, Q44 oder Q45) wie in Beispiel 5 beschrieben über Nacht bei 37°C restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten lediglich mit Puffer inkubierte Zellen.
Die Auswertung des Versuchs erfolgte wie in Beispiel 5 über die Messung des CD 8 sowie des ENEF-γ. Ergebnis: Fig. 10 zeigt, dass im intrazellulären IFN-γ Assay JAWS-II-Zellen, die mit HPV18LlΔcE7i-64 CVLPs im Gegensatz zu den HPV18LlΔCDiE72-62Di CVLPs eine Restimulation von Peptid-stimulierten murinen CD8-positiven T-Zellen bewirkten. Eine ähnliche Restimulation konnte für die Peptide Q43 und Q44, nicht hingegen für das Peptid Q45 beobachtet werden. Die Peptide Q43 und Q44 umfassen gemeinsam die Aminosäuren MHGPKATL, die den N-terminalen Aminosäuren von E7 entsprechen. Somit weist dieser Versuch darauf hin, dass es sich bei den Aminsosäuren MHGPKATL um ein H2 b restringiertes zytotoxische T-Zellepitop handelt, das ebenfalls in den HPV18LlΔcE7!-6 CVLPs erkannt wird. Dies bedeutet, dass vermutlich allein der Wegfall des M (Position 1 von E7) dazu führt, dass die HPV18L1ΔCDIE72.62DI CVLPs nicht mehr in der Lage sind, unter den gegebenen Versuchsbedingungen eine zytotoxische T-Zellantwort auszulösen. Dies ist umso überraschender, als die Vorhersage durch das sogenannte Peptid-Prediction Program von Parker et al., (1994), J. Immunol. 152:163, unter http://www- bimas.dcrt.nih/gov/molbio/hla bind/ kein murines T-Zell Epitop beginnend mit diesem M vorhersagt.
Ferner gelang es nachzuweisen, dass die gemessene T-Zell-Aktivierung für die CVLPs spezifisch war, da unter gleichen Versuchsbedingungen im Vergleich zwischen CVLPs des Typs HPV18LlΔcE71.64 die Aktivierung der T-Zellen durch Denaturierung der CVLPs durch Kochen verloren ging (siehe Fig. 11).

Claims

Patentansprüche
1. Arzneimittel zur Vermeidung oder Behandlung von humanem Papillomavirus-Typ 18 (HPV-18)-spezifischem Tumor, enthaltend mindestens ein Fusionsprotein aus mindestens einem L-Protein und mindestens einem E-Protein eines oder mehrerer HPV- 18 und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein ein LlΔCE7x.y-Fusionsprotein ist, wobei x eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 3 und y eine ganze Zahl von 61 bis 64, insbesondere 62 bis 64, vor allem 62 oder 64 bedeutet.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionprotein ein CLVP ist.
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein keinen Fremdproteinanteil oder PapiUomavirus-unspezifische Epitope enthält.
4. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein einen Fremdproteinanteil oder PapiUomavirus-unspezifische Epitope enthält.
5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Larynx-, Cervix-, Penis-, Vulva- oder Analcarcinom ist.
6. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel kein Adjuvans enthält.
7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Zusatzoder Hilfsstoff ca. 0,1 bis ca. 3 M, vorzugsweise ca. 0,15 bis ca. 1 M, insbesondere ca. 0,2
8. Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz ein Alkali- oder Erdalkalisalz ist, vorzugsweise ein Halogenid oder Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenid, vor allem NaCl und/oder KCl.
9. Arzneimittel nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der pH- Wert mit einem Puffer eingestellt wird, vorzugsweise mit einem Phosphat-Puffer, Tris-Puffer, HEPES-Puffer oder MOPS-Puffer.
10. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das L- Protein ein deletiertes L-Protein ist, vorzugsweise ein deletiertes Ll- und/oder L2-Protein.
11. Arzneimittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Protein ein C- terminal deletiertes L-Protein ist, insbesondere ein C-terminal deletiertes Ll-Protein.
12. Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu ca. 35 Aminosäuren vom L-Protein deletiert sind, vorzugsweise ca. 15 bis ca. 35 Aminosäuren, insbesondere ca. 26 - 28 Aminosäuren.
13. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das E- Protein ein deletiertes E-Protein ist, vor allem ein deletiertes E6- und/oder E7-Protein.
14. Arzneimittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das deletierte E-Protein ein C-terminal deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise ein C-terminal deletiertes E7-Protein.
15. Arzneimittel nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass bis zu ca. 55 Aminosäuren deletiert sind, vorzugsweise ca. 5 bis ca. 55 Aminosäuren, insbesondere ca. 40 bis ca. 51 Aminosäuren, vor allem ca.41 bis 45 Aminosäuren.
16. Arzneimittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das deletierte E-Protein ein N-terminal deletiertes E-Protein ist, vorzugsweise einN-terminal deletiertes E7-Protein.
17. Arzneimittel nach Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass bis ca. 10 Aminosäuren deletiert sind, vorzugsweise 1 bis 2 Aminosäuren.
18. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein in Form eines Capsids und/oder Capsomers vorliegt.
19. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 18 in Form einer Injektions- oder Infusionslösung.
20. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle enthaltend einen Expressionsvektor, der für das genannte Fusionsprotein kodiert, unter geeigneten Bedingungen kultiviert, das Expressionsprodukt isoliert wird und gegebenenfalls geeignete Zusatz- und Hilfsstoffe zugesetzt werden.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor keine Nukleinsäuresequenzen enthält, die das genannte Fusionsprotein bei der Expression um weitere Aminosäuren verlängern.
22. Verwendung eines Fusionsproteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels einerseits zur Nerhinderung von HPV-spezifischen Tumoren und andererseits zur Regression von bereits bestehenden HPV-spezifischen Tumoren.
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