WO2002022162A1 - Remedies for amyotrophic lateral sclerosis - Google Patents

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WO2002022162A1
WO2002022162A1 PCT/JP2001/001539 JP0101539W WO0222162A1 WO 2002022162 A1 WO2002022162 A1 WO 2002022162A1 JP 0101539 W JP0101539 W JP 0101539W WO 0222162 A1 WO0222162 A1 WO 0222162A1
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WO
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hgf
als
mice
gene
transgenic mice
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/001539
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French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Toshikazu Nakamura
Hiroshi Funakoshi
Woong Sun
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (hereinafter, referred to as ALS). More specifically, the present invention relates to an ALS therapeutic agent that makes HGF (hepatocyte growth factor) and / or HGF gene effective.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • FALS familial ALS
  • S0D1 Cu 2+ / 3 ⁇ 4i 2+ superoxide dismutase
  • Hepatocyte growth factor was first identified as a potent mitogene for mature hepatocytes, and its gene was cloned in 1989 (Biochem. Biophys. Res. Commun •, 122, 1450 1459 ( 1984), Nature, 342, 440-443 (1989)). HGF was discovered as a hepatocyte growth factor.A number of recent studies on expression and functional keratoconi, including mosquito, knockout, and knock-in mouse techniques, have revealed that HGF is a novel neurotrophic factor. (Ciba. Found. Symp., 212, 198-211 (1997), Nat Neurosci., 2, 213-217 (1999)).
  • HGF exerts neurotrophic factor activity on hippocampus, cerebral cortex, dopaminergic midbrain, cerebellar granules, sensory, motor neurons, and sympathetic neuroblasts (Ciba.Found.Symp., 212, 198-211 (1 997), Brain Res. Mol. Brain Res., 32, 197-210 (1995)).
  • HGF de novo and trophic factor activity on mature motor neurons after developmental fetal movement motor neurons and axotomy of the hypoglossal nerve have been demonstrated in vivo (J. Neurosci., 20, 326-337). (2000), Eur. J. Neurosci., 11, 4139-4144 (1999)).
  • HGF de novo and trophic factor activity on mature motor neurons after developmental fetal movement motor neurons and axotomy of the hypoglossal nerve
  • the present inventors first examined the involvement of HGF in ALS using G93A transgenic mice, which are ALS model mice. The results showed that c-Met / HGF receptor homozygous immunoreactivity (c-Met-IR) was localized in G93A transgenic mice as well as in wild-type littermates. Was found. Furthermore, with the development of ALS in G93A transgenic mice, we found that c-me1: and TIGF mRNA expression levels in the circulatory horn (localization of motor neurons) increased with the growth of mice. Was. These results suggest that HGF plays a role in ALS motor exercise.
  • mice expressing rat HGF in a Ron-specific manner were prepared, and whether or not HGF actually had an effect on ALS was examined using the mice.
  • HGF neuron-specific enolase promoter-1
  • HGF reduces motor neuron death and suppresses motor neuron axon degeneration.
  • HGF exerts a neuroprotective effect not only on motor neurons but also on DRG sensory nerves related to ALS-related neurons.
  • HGF was shown to have a neuroprotective effect in delaying muscle loss in ALS.
  • HGF HGF could actually suppress (delay) the progress of ALS using the transgenic mice described above.
  • the results showed that the expression of HGF in very small amounts (about twice that of wild-type and G93A mice) surprisingly delayed the onset of paralysis, prolonged paralysis, and improved motor performance. It became.
  • HGF has an ALS improving effect.
  • caspase-1 In the metaphase of ALS, caspase-1 has been shown to be activated and / or induced by motor neurons in transgenic mice expressing the mutant S0D1; 13 ⁇ 4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15763-15768 (1998), Science, 288, 335-339 (2000), and the introduction of a dominant negative inhibitor of caspase-1 into G93A mice successfully delayed mortality for about two weeks. (Nature, 388, 31 (1997), J. Exp. Ed., 185, 933-940 (1997)), it is thought that caspase-1 plays an important role in the progression of this ⁇ . Thus, the present inventors examined whether HGF alters caspase-1 induction, and as a result, it has been clarified that HGF has an effect of suppressing caspase-1 induction in ALS motor neurons.
  • Akt phosphorylation is involved in HGF survival-promoting activity in cerebral cortical neurons and kidney epithelial cells HGF induces BoL-xL expression in the liver of a fulminant hepatitis model, and has been shown to block large amounts of apoptosis (Biochein. Biophys. Res. Commun. , 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 15 159 (1999)).
  • HGF induces BoL-xL expression in the liver of a fulminant hepatitis model, and has been shown to block large amounts of apoptosis (Biochein. Biophys. Res. Commun. , 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 15 159 (1999)).
  • the present inventors examined whether Akt phosphorylation occurs due to HGF expression. As a result, it was found that Akt phosphorylation was conspicuous in ALS.
  • HGF is responsible for at least three mechanisms: by preventing caspase-1 induction in motor neurons, by phosphorylating Akt, and by glial cell-specific glutamate transporters in reactive astrocytes ( It has been shown to improve ALS by preventing down-regulation of EAAT2 / GLT1).
  • HGF exerts both direct neurotrophic factor activity on motoneurons and indirect improvement of dalminic acid cytotoxicity on motoneurons by maintaining glutamate transporter levels in stellate cells.
  • ALS motor function and ⁇ It has the effect of improving.
  • bifunctional growth factors have not been previously known, and HGF is the first example. These functions of HGF indicate that HGF (gene or protein) can be used therapeutically in ALS and related motoneuron diseases. Disclosure of the invention
  • ALS therapeutic agent containing HGF and / or HGF gene as active ingredient
  • ALS progress inhibitor containing HGF and Z or HGF gene as active ingredient
  • HGF and / or an HGF gene-containing active ingredient an inhibitor of induction of cas or o-ze1 in motor neurons
  • an Akt phosphorylation promoter in the spinal cord comprising an HGF and HGF gene or an HGF gene as an active ingredient
  • Figure 1 shows immunohistological analysis of c-Met expression (c-Met-IR) in motoneurons of G93A transgenic mice (G93A in the figure) and wild-type littermates (wild dtype in the figure).
  • 6 is a micrograph showing the result of further examination. In the figure, 3 ⁇ 4 ⁇ is 2 months old, and 8mo is 8 months old.
  • FIG. 2 is a graph showing the results obtained by performing competitive RT-PCR on HGF and ciet A in the spinal cord in the progression of disease in G98A mice, and comparing the results with those of wild-type mice of the same age.
  • the horizontal axis indicates the age, and the vertical axis indicates the amount of c-met RNA (left graph) or the amount of HGF RNA (right graph).
  • the arrowhead indicates the c_met or HGF band, and the bar indicates the competition. This shows the band of the Italian.
  • FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the expression of exogenous HGF in each tissue of an HGF transgenic mouse prepared using a neuron-specific enolase promoter using an RNase protection assay.
  • the arrow indicates a band corresponding to exogenous HGF
  • the bar indicates a band corresponding to endogenous HGF.
  • Br is the brain
  • Lu is the lung
  • Ht is the heart
  • Li is the liver
  • Kd is the kidney
  • Sp is the spleen
  • St is the stomach
  • Sc is the spinal cord
  • Ts is the testis
  • In indicates intestine
  • Sk indicates skin.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analysis by ELISA of HGF content in whole litters of wild-type and transgenic mice at the postnatal development stage. In the figure, P2 indicates the second day after birth, P14 indicates the 14th day after birth, and lmo indicates 1 month old and 6mo indicates 6 months old. 4 is a photomicrograph showing the results of histological analysis of the number and morphology of.
  • wildtype shows the results of wild-type mice
  • HGF shows the results of HGF-only transgenic mice
  • G93A shows the results of G93A transgenic mice (ALS terminal stage)
  • G93A / HGF shows the results of double transgenic mice (ALS terminal stage).
  • FIG. 7 is a graph showing the results of quantitatively comparing the number of motoneurons in the lumbar spinal cord in each transgenic mouse.
  • ⁇ indicates wild-type
  • Hata indicates HGF-only transgenic mouse
  • A3 ⁇ 4G93A transgenic mouse indicates double transgenic mouse.
  • FIG. 8 is a graph showing the wet weight of the gastrocnemius muscle in each transgenic mouse.
  • ⁇ indicates wild-type
  • HGF indicates transgenic mice with HGF alone
  • ⁇ indicates double transgenic mice.
  • FIG. 9 is a photomicrograph showing the morphology of a section (lm) of the anterior root (V, upper panel) and dorsal root (D, lower panel) of each 8-month-old transgenic mouse.
  • FIG. 10 is a graph showing the results obtained by ELISA for circulating HGF levels of 2, 6 and 8 months old in each transgenic mouse.
  • Figure 15 shows transgenic mice with wild-type ((, ri-14) and HGF alone ( ⁇ ).
  • FIG. 16 is a micrograph showing the results of color-free analysis of the aggregation of mutant S0D1 in the lumbar spinal cord of G93A and G93A / HGF littermates during disease progression.
  • 4mo is 4 months old
  • 8mo is 8 months old.
  • Figure 17 shows the amount of mutant S0D1 in the lumbar spinal cord of wild-type (W), HGF alone (H), G93ACG), and double transgenic (G / H) mice.
  • 9 is an electrophoresis photograph showing the result of squaring by winging. In the figure, 2mo indicates 2 months old, 6mo indicates 6 months old, and 8mo indicates 8 months old.
  • FIG. 18 shows the phosphorylated Akt (8-month-old lumbar spinal cord) in wild-type (W), HGF alone (H), G93A (G), and double transgenic (G / H) mice.
  • 9 is an electrophoretic photograph showing the results of immunostaining of (p-Akt), Akt, Bcl-xL, and ⁇ cl-2.
  • Figure 19 shows the immunohistochemical analysis of the lumbar anterior horn at 8 months of age of the four mice using GFAP. It is a microscope picture which shows a result.
  • FIG. 20 is a graph showing the immunohistochemical analysis using the GFAP shown in FIG.
  • ⁇ indicates wild type
  • Hata indicates HGF-only transgenic
  • FIG. 21 is an electrophoretic photograph showing the results of immunoblotting of EAAT2, GFAP and c-Met in the spinal cord of the four mice at 2, 6 and 8 months.
  • W indicates wild-type
  • H indicates HGF-only transgenic
  • G indicates G93A transgenic
  • G / H indicates double transgenic.
  • FIG. 23 is an electrophotograph showing EAAT2 and c-Met immunoblotting in primary cultured astrocytes after HGF treatment.
  • H GF used in the present invention is a substance, and its base sequence and amino acid sequence are described in Nature, 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Biochera. Biophys. Res. Comraun.,
  • HGF human growth factor
  • those purified by various methods can be used as long as they are purified to the extent that they can be used as pharmaceuticals.
  • commercially available products for example, Toyobo Code No. HGF-101, etc. can be used.
  • the HGF can be obtained by culturing primary cultured cells or cell lines that produce HGF, and separating and purifying it from a culture supernatant or the like.
  • a gene encoding HGF is inserted into an appropriate vector by a genetic genetic technique, inserted into an appropriate host, and transformed, and the recombinant HGF of interest is obtained from the culture supernatant of the transformant.
  • the host cell is not particularly limited, Various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, such as Escherichia coli, yeast, or animal cells, can be used.
  • animal cells include CH0 cells, COS cells', and mouse C127 cells (all available from ATCC and the like).
  • the HGF thus obtained may have a structure similar to the natural HGF as long as it has substantially the same action as the natural HGF. That is, 1) a protein encoded by DNA that hybridizes with the HGF cDM under stringent conditions, and 2)
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more (preferably several) amino acids have been substituted, deleted and / or added to the amino acid sequence of GF; For example, it is included in the category of the HGF of the present invention.
  • code the evening protein of 1) and 2)! ) NA can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or ordinary hybridization, and specifically, Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) Etc. can be used as a reference.
  • HGF is a therapeutic agent for ALS, specifically, an ALS progress inhibitor.
  • HGF is a direct neurotrophic factor activity on motor neurons and an indirect effect of glutamate cytotoxicity on motor neurons by maintaining dalminic acid transporter levels in star cells. It has the effect of improving the motor function and lifespan of ALS through the two functions of the effective improvement.
  • Such bifunctional growth factors are not known before and are the first example of HGF. By exerting these two effects, HGF can slow or inhibit the progression of ALS and related motor neuron disease.
  • HGF is considered to exhibit ALS-improving effects by exerting at least the following three actions.
  • HGF HGF Is the first growth factor to be shown.
  • motor neuron diseases related to ALS include progressive spinal muscular atrophy, advanced '1 live bulb paralysis, primary lateral sclerosis, pediatric and juvenile muscular atrophy, fogio-Ronde's disease, and Charcoal's disease. 'Mary' disease is not limited to these.
  • the therapeutic agent of the present invention may be injectable with various forms of preparation (eg, liquid, solid, etc.), generally with only effective HGF alone or with a conventional carrier.
  • the injection can be prepared by a conventional method. For example, after dissolving HGF in an appropriate solvent (eg, sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc.), sterilize by filtration with a filter or the like, and then sterilely. It can be prepared by filling into a container.
  • the content of HGF in the preparation is usually adjusted to about 0.0002 to 0.2 (f / V%), preferably to about 0.001 to 0.1 (ff / V%).
  • a stabilizer is preferably added, and examples of the stabilizer include albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, and ethylene glycol.
  • the preparation of the present invention may contain additives necessary for preparation, for example, excipients, solubilizing agents, antioxidants, soothing agents, isotonic agents and the like.
  • excipients for example, excipients, solubilizing agents, antioxidants, soothing agents, isotonic agents and the like.
  • a liquid preparation it is desirable to store it after freezing or freezing it by freeze-drying. The freeze-dried preparation is used after reconstitution by adding distilled water for injection at the time of use.
  • the preparation of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the form of the preparation.
  • the administration route may be any administration route as long as HGF exerts an action and the progress of ALS can be suppressed.
  • examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, and intraspinal administration.
  • there is also a route of administration via a device implanted in the body Specifically, a method of continuously and gradually administering to the affected area using an osmotic pump or the like, or a sustained-release preparation (for example, a mini pellet) Formulation) near the affected area.
  • intraspinal administration is a preferred route of administration because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord.
  • the dosage is appropriately adjusted depending on the patient's condition, age, body weight, etc., but is usually 0.001 mg to 1000 mg, preferably 0.01 mg to 100 mg as HGF, and is administered once to several times a day. It is appropriate to administer it separately.
  • the HGF preparation of the present invention is preferably administered to an ALS patient in such an amount that the expression level of HGF in the spinal cord is at least twice as high as before HGF administration.
  • an ALS Jito U comprising administering such an amount that the expression level of HGF in the # 1 way becomes twice or more that before administration of HGF. .
  • the present invention includes not only the administration of the HGF protein as described above, but also an ALS gene therapy agent comprising the introduction of the HGF gene. The following describes gene therapy for HGF.
  • the “HGF gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing HGF (HGF protein). Specifically, Nature, 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), Biochem. Biophys. Res. Coramun., 172, 321 ( 1990), etc., into a suitable expression vector (non-viral vector, viral vector) as described below.
  • a suitable expression vector non-viral vector, viral vector
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding HGF is described in the Kasumi literature and also registered in databases such as Genbank.
  • an appropriate DNA portion is used as a primer for PCR, for example, by performing an RT-PCR reaction on mRNA derived from the liver or leukocytes, and the like. can do.
  • clonings can be performed by those skilled in the art, for example, according to a basic book such as "Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)". It can be done easily.
  • the HGF gene of the present invention is not limited to those described above, and can be used as the HGF gene of the present invention as long as the expressed protein has a gene substantially the same action as HGF. That is, 1) a DNA that hybridizes with the cDNA under stringent conditions, or 2) one or more (preferably several) amino acids substituted with the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA, Among the DNAs encoding a protein consisting of a deleted and / or added amino acid sequence, and the like, as long as they encode a protein having an action as an HGF, they are included in the category of the HGF gene of the present invention.
  • the DNAs of 1) and 2) can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or ordinary hybridization, and specifically, This can be done with reference to basic books such as.
  • the HGF gene of the present invention can be applied to the same diseases as the aforementioned HGF protein.
  • the HGF gene and the HGF protein can be used independently, or both can be used in combination.
  • the dosage form can be broadly divided into two types: using a non-viral vector and using a viral vector.
  • the methods of preparation and administration are described in detail in the experimental manuals. (Separate volume experimental medicine, Basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996, Separate volume experimental medicine, Gene transfer & expression analysis experiment method, Co., 1997, Gene Therapy Development Research Handbook, edited by The Japan Society for Gene Therapy, N.T.S., 1999). Hereinafter, a specific description will be given.
  • the target gene can be introduced into cells or tissues by the following method. Examples include lipofection method, monocalcium phosphate coprecipitation method, DEAE-dextran method, and direct DNA injection method using a micro glass tube.
  • lipofection method monocalcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE-dextran method direct DNA injection method using a micro glass tube.
  • gene transfer into tissues includes gene transfer using internal liposomes, gene transfer using electrostatic liposomes, HVJ-liposome method, and improved HV.
  • J-liposome method HVJ-AVE liposome method
  • receptor-mediated gene transfer method method of transferring DNA molecules into cells with carrier (metal particles) using protein, naked-DNA
  • the recombinant expression vector can be taken into cells by subjecting it to any of the methods such as direct introduction method and introduction method using positively charged polymer.
  • HVJ-ribosome is a fusion of ribosome and inactivated Sendai virus (Hemagglutinating virus of Japan: HVJ) that encapsulates DNA in ribosome made of lipid bilayer. It is.
  • the HVJ-liposome method is characterized by having a very high fusion activity with the cell membrane as compared with the conventional liposome method, and is a preferred introduction form.
  • HV J_ ribosome refer to the literature (Experimental Medicine Supplement, Basic Technology of Gene Therapy, Yodosha, 1996, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha, 1997, J. Clin. Invest. 93, 1458-1464 (1994), Am. J. Physiol. 271, R1212-1220C1996)), etc., please refer to them.
  • HV J strain Z (available from ATCC) is preferred, but basically other HV J strains (eg, ATCC VR-907 and ATCC VR-105) can also be used.
  • the direct introduction method of naked-DNA is the simplest method among the above methods, and is a preferable introduction method from this viewpoint.
  • the expression vector used here may be any expression vector as long as it is a vector capable of expressing the target gene in vivo.
  • pCAGGS Gene 108, 193-200 ( 1991)
  • pBK-CMV pcDNA3.1
  • pZeoSV Invitrogen, Stratagene
  • a typical example of a virus vector is a method using a vinoless vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus. More specifically, for example, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, Introducing a gene of interest into DNA or RNA viruses such as Nyavirus, Box virus, Poliovirus, Synvis virus, Sendai virus, SV40, and Immunodeficiency virus (HIV), and infecting cells with the recombinant virus. Thus, it is possible to introduce a gene into a cell.
  • a vinoless vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus. More specifically, for example, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, Introducing a gene of interest into DNA or RNA viruses such as Nyavirus, Box virus, Poliovirus, Synvis virus, Sendai virus, SV40, and Immunodeficiency virus
  • Adenovirus vector is used. I like that power.
  • Examples of the method for introducing the gene therapy agent of the present invention into a patient include an i ⁇ ⁇ i ⁇ ⁇ method in which the gene therapy agent is directly introduced into the body, and a method in which certain types of cells are removed from a human and the gene therapy agent is added outside the body.
  • There is an eXViV0 method that introduces the cells into the cells and returns the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994) ), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15), (1994), Handbook of Gene Therapy Development Research, edited by the Japanese Society of Gene Therapy, N'TIS, 1999).
  • the invivo method is preferred.
  • the administration site to the patient may be any administration route as long as HGF expressed in the living body exerts an action and can suppress the progress of ALS.
  • examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, and circulatory administration.
  • administration routes via devices implanted in the body include a method in which an osmotic pump or the like is used to continuously and gradually administer the disease to the affected area, and a sustained-release preparation (for example, a minipellet). Formulation) is implanted near the affected area.
  • intraspinal administration is a preferred route of administration because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord.
  • the formulation various formulations (for example, liquids, etc.) suitable for each of the above administration forms can be taken.
  • the drug in the case of a drug containing an effective ⁇ gene, the drug can be prepared by a conventional method.
  • it can be prepared in an appropriate solvent (buffer such as PBS, physiological food ⁇ ⁇ . Sterile water, etc.).
  • the mixture may be sterilized by filtration with a filter or the like, and then filled in a sterile container to prepare the composition.
  • Conventional carriers and the like may be added.
  • ribosomes such as HVJ-ribosomes, suspending agents,? It can be in the form of ribosome preparations such as east binding agent, centrifugal concentrated and jujube binding agent.
  • the DNA content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient.
  • the DNA of the present invention is preferably 0.0001 to 100 mg. It is recommended that the dose be 0.0 0.01 to 10 mg, administered once every few days or months.
  • the present invention provides a therapeutic agent for ALS comprising administering an amount such that the expression level of HGF in the spinal cord is twice or more that before administration of the HGF gene. Is also provided.
  • Transgenic G93A mice (SOD G93A) lGurdl) were purchased from Jackson Laboratory (Science, 264 1772-1775 (1994)). For maintenance, G93A mice were bred to female C57B6 mice and genotyped by PCR and dot-blot hybridization.
  • rat HGF cDNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3200-3204 (1990)) tagged with KT3 epitope was amplified by PCR, and the pNSE-Ex vector (Dr. Doherty) The DNA was inserted downstream of the neuron-specific enolase promoter (Neuron, 18, 231-241 (1997) :). For subcloning, a Not I site was introduced into the pNSE-Ex vector by adding a linker. Thereafter, the entire nucleotide sequence of the plasmid was confirmed.
  • HGF-KT3 showed the same activity as human recombinant HGF in the migration assay of DCK cells and the in vitro survival assay of primary culture of hippocampal neurons.
  • the method described previously J. Cell. Biol., 128, 185-199 (1995), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95, 5269-5274 (1998)) Transgenic mice were made with improvements and weighed for transgene incorporation. Briefly, the transgenic cassette was excised from the vector by treatment with Sal I restriction enzyme, and DNA was injected into C57B6 embryos whose genetic background was consistent with the G93A transgenic mouse. Transgene integration was confirmed by PCR and dot-blot using the SV40 poly (A) sequence in the transgene. Expression of exogenous HGF was determined by RNase protection assay using a probe covering the 3 'end of HGF-KT3 cDNA and the 5' region of the SV40 poly (A) signal sequence.
  • NSE-HGF transgenic mice Progeny of NSE-HGF transgenic mice were crossed with G93A transgenic mice. Offspring from one parent were kept in the same cage until the phenotype was destroyed. After the first signs of the phenotype, the animals were isolated. Food and water were placed at the bottom of the cage for easy access. This time was used as the death time when the animal could not stand its body within 30 seconds.
  • the RNase protection assay was performed as previously described (J. Cell. Biol., 123, 455-465 (1993), Science, 268, 1495-1499 (1995)), using the RPAII ribonuclease protection assay kit ( Ambion, Austin, TX).
  • a 326 bp fragment containing the polyA sequence from the HGF 3 'end of HGF-KT-3-polyA was inserted into the pGEM-T vector. . Plasmids were linearized, transcribed in the presence of a- [ 32 P] CTP, and prepared cRNA probes were used for hybridization.
  • Exogenous HGF RNA gave protected band of 326 bp
  • endogenous HGF RNA is KT - gives 3 and poly (A) because it lacks a sequence shorter protection band (251b P) o
  • Hind limb extension is usually observed when the mouse is hung in the air with its tail. Exercise two euron chiji mouse Hind limb retraction is commonly shown. The score corresponds to the number of hind limbs extended.
  • the mouse was placed on a rod rotating at 202 °. The duration of each mouse remaining on the rod was measured. If the animal was able to remain on the rod for 4 minutes, the test was completed in 4 minutes and recorded as 4 minutes. »Was collected by dipping the feet in black ink and then walking the mouse along a straight path. The stride length was measured in the area showing normal walking.
  • the spinal cord was fixed by a double-armed concentration of ethanol to count two eurons of exercise. After embedding in raffin, it was cut continuously from L5 to L4 (14 m). The number of interlocking neurons (in L4-L5) in the anterior horn was counted for every 7 slices for a total of 20 slices. Neurons whose clear nucleoli were clearly stained by Chris Biorelet in defined areas of the anterior horn were counted.
  • c-Met specific antibody (Santa Cruz, 1: 100), HGF specific antibody (Tokushu Meneki, 1: 1000), human SOD specific antibody (Sigma, 1: 200), GFAP specific antibody (Sigma, 1: 1000) and caspase-1 specific antibody (Santa Cruz, 1: 500) after blocking with 5% goat serum and mouse IgG blocking agent for 1 hour (M.O.M kit, Vector science).
  • the sections were added to the sections for 1 hour to 4 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. After washing, a biotinylated or fluorescently labeled secondary antibody was added and incubated for 15 minutes. Sections were counterstained here with Hoechst33342 for fluorescence immunization and observed under a fluorescence microscope.
  • the L5 route was dissociated, fixed with 4% paraformaldehyde (0.25% dartaraldehyde) for 1 hour, fixed on ice with osmium tetroxide for 2 hours, dehydrated, and embedded in ⁇ 812.
  • the embedded root was cut (1 ⁇ ) and stained with Tolu Zimble I. The morphology of the sample was examined under an optical microscope.
  • the tissue is crushed by aspirating with a pipette and the separated cells are plated on a poly-L-ornithine-coated dish at the indicated cell number in DF containing 10% fetal bovine serum (DF MEM / HamF12, 50:50) Plated in medium (GibCO BRL). Seven days after plating When cells become confluent, cells were washed twice with PBS and treated with the indicated concentrations of recombinant HGF. The purity of the star cyst was usually 95% or higher after 7 days of culture, and was examined by morphology or NSE / GFAP double staining.
  • Lumbar spinal cord extract was prepared in RIPA buffer. 50 ⁇ g of the lysate was run on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) in mm and transferred to a PVDF membrane. The membrane was incubated in PBS at 4 ° C. with 5% non-atmospheric skim milk and anti-EAAT2 antibody (1: 2,000, Chemicon) was added for 2 hours. After washing, the membrane was incubated with HRP-labeled anti-guinea pig IgG antibody (1: 3,000, Chemicon) and subjected to ECL chemifluorescence (Amersham, Buckinghamshire, UK).
  • SDS-PAGE 10% SDS-polyacrylamide gel
  • the membrane cap antibody was removed and reprobed with anti-GFAP (1: 3000, Sigma), anti-human SOD (1: 500, Sigma), and anti-c-Met (1: 400, Santa Curz) antibodies. 50 g of the lysate was subjected to 12% SDS-PAGE and phosphorylated Akt (Cell Signaling Tech.), Akt (Cell Signaling Tech.), Bcl-xL / S (Santa Cruz) and ⁇ cl-2 (Santa Cruz) antibody was added. Band intensities were measured on a Fluorchem imager instrument (IS-8 000).
  • HGF in plasma was measured using the anti-rat HGF polyclonal monoclonal antibody (Tokushu Meneki, Tokyo, Japan) by the ELISA method.
  • the rat HGF E LISA system specifically detects rat and mouse HGF with similar affinity.
  • c-Met-IR c-Met / HGF receptor uniform responsiveness
  • FIGS. 3, 4 and 5 show the characteristics of the HGF transgenic mouse strain. Exogenous HGF is restricted to the brain and spinal cord of the 12 lams tested by RNase Protection Technology It was shown that the gene was expressed (arrow in FIG. 3). During the organization of HGF transgenic mice, endogenous and total HGF levels in plasma did not differ from wild-type littermates, respectively (FIGS. 3 and 4). HGF protein levels, on the other hand, increased with mouse growth in the spinal cord only after the end of major postnatal 3 ⁇ 41 nerve differentiation (FIG. 5).
  • HGF transgenic mice could not be distinguished from wild-type transgenic mice without genotyping. That is, size, weight, morphology, is! /, Contains many motor neurons and astrocytes !; behaves in the motor nervous system, changes, examines, and muscles at a significant stage The difference in weight of t was not found. This suggests that HGF can be successfully introduced into the nervous system without the need to reach them (see FIGS. 6 to 10 and FIGS. 19 and 20). Difficult case 3
  • heterozygous (+/-) HGF transgenic mice were bred to heterozygous cells in G93A mice (//), thereby transducing ALS neurons.
  • Transgenic mice into which HGF was directly introduced were prepared. It should be noted that the cross resulted in four different groups of mice: wild type (ff), transgenic for only HGF (HGF), transgenic for G93A only (G93A), and double transgenic for both G93A and HGF.
  • Transgenic (G93A / HGF) power 'generated.
  • HGF transduction was demonstrated at the cervical level, as the survival-promoting activity of HGF on motoneurons has been shown to differ between lumbar and cervical levels in chick embryos. Was also tested for their ability to reduce their deaths.
  • G93A mice 55% of cervical motoneurons remained at 8 months of age. Less than at the waist level! The death of motorized mouths at the cervical level is characteristic of the present model mice.
  • a higher number (87.8 ⁇ 2.4%) of motoneurons remained at the cervical level in the double transgenic mice, indicating that HGF had lumbar and cervical motility. It is effective for both euros.
  • HGF was shown to exert neuroprotective effects not only on motor neurons but also on DRG sensory neurons for ALS-related neurotoxicity.
  • the protective effect of HGF on dementia was also demonstrated by a delayed effect on the reduction of gastrocnemius muscle weight (FIG. 8).
  • HGF-only transgenic mice did not show any significant differences in motor function from wild-type littermates.
  • G93A mice showed a progressive decrease in hind limb extension from 5 months of age, rotor-rod performance from 6 months of age, and stride length from 7 months of age.
  • the double transgenic mice showed much slower reductions than G93A in all functional parameters tested ( Figures 13-15).
  • FIG. 10 shows the HGF protein levels of 3 ⁇ 41 in four groups during ALS progression.
  • HGF levels were approximately twice as high in HGF transgenic mice and G93A / HGF littermates at 2 months and 6 months, indicating a significant improvement in motor function during the additional months of the addition of small amounts of HGF. Indicates that ⁇ is to be elongated.
  • the inadequate production of HGF in the G93A / HGF double transgenic at 8 months i.e., the HGF levels in HGF, G93A and G93A / HGF were terminally identical, suggesting that ALS Higher levels of HGF expression may be desirable as they may reflect incomplete improvements.
  • the total amount of mutant S0D1 in the circulating extract was determined by immunoblotting using an antibody specific for the human S0D1 antibody and thus recognizing only the mutant human S0D1, but not the endogenous mouse S0D1. Three independent animals from each group were tested. Mutation S0D1 was detected in both G93A and double transgenic mice from 2 months of age. And the total amount of mutant S0D1 increased in both G93A and double transgenic mice over a similar time course. The total amount of mutant S0D1 in G93A mice was not different from that of HGF littermates (FIG. 17). Next, SOW aggregation was examined.
  • Double transgenic mice at 6 months of age showed very weak caspase-11 IR in large tubulin III immunoreactive cells compared to G93A mice, indicating that HGF-induced It has been shown to reduce the level of caspase-1 induction in interlocking new mouths.
  • Akt Akt phosphorylation and regulation of the 3 ⁇ 4cl-2 family gene.
  • EAAT2 was reduced in G85R transgenic mice, an ALS model (Neuron, 18, 327-338 (1997)), and glial cell glutamate transporters associated with the S0D1 mutation (A4V and I113T) in ALS were also investigated. Glutamatergic excitotoxicity is thought to play a role in ALS motoneuron degeneration (Nat Neurosci., 2, 27-433 (1999)). Therefore, the involvement of HGF in ⁇ 2 was examined.
  • astrocytes were predominantly white matter and localized near the central canal, but slightly in the anterior horn (Figure 19). Reactive astrocytes in G93A mice progressively increased in the anterior horn at 6 months of age, when motor neuron death was not yet observed in G93A mice (FIG. 19). In contrast, double transgenic littermates had significantly lower numbers of reactive astrocytes in the anterior horn (FIG. 19). Quantification of the reactivity intensity of G FAP-IR showed that the immune response activity in the anterior horn was about 40% and 60% lower than that of 6 and 8 month old G93A mice, respectively ( (Fig.
  • EAAT2 EAAT2
  • GFAP GFAP
  • c-Met immunoblotting of the spinal cord of each mouse at 2, 6 and 8 months were performed, and as a result, GFAP of both G93A mice and G93A / HGF mice from 6 months was Guidance And specific down-regulation of EAAT2 in 8-month G93A mice and specific c-Met up-regulation in 8-month G93A and G93A / HGF mice. In G93A / HGF mice, the total level of EAAT2 was maintained at 8 months.
  • EAAT2 levels in G93A mice at 8 months of age were reduced by 40%, compared to those of wild-type or HGF-only transgenic littermates (FIG. 22).
  • double transgenic mice were wild-type or showed higher levels of EAAT2 (140%) in the lumbar spinal cord compared to littermates of transgenic mice with HGF alone (FIG. 22).
  • EAAT2 levels in individual astrocytes were divided by GFAP levels. Only 11% of EAAT2 remained in mosquito G93A mice, while 63% remained in EAAT2 double transgenic mice (FIG. 22). Although astrocytosis begins at six months, it is a worthwhile record that EAAT2 depletion and c-Met induction in astrocytes only occur in late stages in parallel.
  • HGS administration or HGF gene transfer suppresses ALS progression
  • an HGF protein preparation is administered daily at an appropriate frequency and at an appropriate site, such as in the spinal cord, at the age of 6 months when ALS symptoms begin to be observed.
  • a group to which a preparation containing no HGF protein was administered is used as a control group.
  • the effect of suppressing the progression of ALS as described in Examples 3 and 4 is examined in each of the HGF administration group and the control group. The effect of inhibiting ALS progression in the HGF administration group This confirms that HGF can cure ALS.
  • a therapeutic agent (progression inhibitor) for ALS comprising HGF and / or an HGF gene as an active ingredient
  • HGF exerts direct neurotrophic factor activity on motoneurons and an indirect amelioration of glutamate cytotoxin I production on motoneurons by retaining the dalminic acid transporter level in astrocytes. It has the effect of improving the motor function and lifespan of ALS through two actions.
  • Such bifunctional growth factors have not been known so far, and therefore, HGF and / or the HGF gene can be effectively used as an unprecedented effective treatment; ⁇ IJ.

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Abstract

Remedies (progression inhibitors) for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) which contain as the active ingredient HGF and/or HGF gene. HGF has two functions, i.e., a direct neurotrophic factor activity on motoneurons and an indirect effect of relieving glutamic acid cytotoxicity on motoneurons by maintaining the glutamic acid transporter level in astrocytes, thereby improving the motor function and prolonging the life of patients with ALS. Thus, HGF and/or HGF gene can be effectively used as efficacious remedies that have never been known hitherto.

Description

明 細 書 筋萎縮性側索硬化症治翻 技術分野  Description Amyotrophic lateral sclerosis translation Technical field
本発明は、 筋萎縮性側索硬化症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, 以下、 A L Sと いう） 治療剤に関する。 より詳細には、 H G F (Hepatocyte Growth Factor, 肝細胞 増殖因子）及び/又は H G F遺伝子を有効 とする A L S治療剤に関する。 背景技術  The present invention relates to a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (hereinafter, referred to as ALS). More specifically, the present invention relates to an ALS therapeutic agent that makes HGF (hepatocyte growth factor) and / or HGF gene effective. Background art
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は、運動ニューロンの進行性喪失および運動神経の軸索 変性によつて特徴づけられる深刻な神経変性疾患であり、 結果として運動機能障害お よび寿命の短縮を導く。 ALS患者の約 15%は家族性の ALS (FALS) であり、 FALSの約 15 %から 25%が Cu2+/¾i2+スーパーォキシドジスムタ一ゼ（S0D1) をコードしている遺伝 子内に変異を有している。 高レベルで変異 SOWタンパク質及びその活性を有するトラ ンスジエニックマウスは、 家族性および散発性 ALS両方と同様の；^の進行を示すため 、 ALSに対するモデルとして、 この変異 S0D1過剰発現トランスジエニックマウスが使用 されている。 そして、 本発明においても、変異 S0D1 (G93A)過剰発現トランスジェニ ックマウスである G93Aマウス (Science, 264, 1772- 1775(1994))を使用した。 Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a serious neurodegenerative disease characterized by progressive loss of motor neurons and axonal degeneration of motor nerves, resulting in motor dysfunction and shortened life span. Lead. About 15% of ALS patients have familial ALS (FALS), and about 15% to 25% of FALS are genes encoding Cu 2+ / ¾i 2+ superoxide dismutase (S0D1) Have mutations in Transgenic mice with high levels of mutant SOW protein and its activity are similar to both familial and sporadic ALS; because of the progression of ^, transgenic mice overexpressing this mutant S0D1 Is used. In the present invention, a G93A mouse (Science, 264, 1777-1775 (1994)), which is a transgenic mouse overexpressing the mutant S0D1 (G93A), was used.
運動ニューロンの変性は疾病の最初の事象と考えられているので、多くの試みが、 運動ニューロンの生存を直接的に助けることに焦点を置いてきた。 しかしながら、 こ れらの試みはいずれも満足のいくものではなかった。  Since motor neuron degeneration is considered the first event in disease, many attempts have focused on directly helping motor neurons survive. However, none of these attempts has been satisfactory.
一方、 Brujinらは、 星状細胞中に顕著な S0D1を含んでいる封入体が臨床兆候の前に 現れ、 ； ^進行の間に目に見えて多量に増加することを報告し、変異 S0DKG85R)過剰 発現トランスジエニックマウスにおいて変異- S0D1を介する損傷に対する第 1の標的と して、星 钿胞を指し示している (Neuron, 18, 327-338(1997))。 したがって、星状細胞 の機能を回復させ、 しかも連動二-ュ一口ンの細胞死を直接的に防ぐことができる二重 機能性 (bifunctional)物質は、 ALSの処置により最適であると考えられる。 しかしな がら、 そのような物質は未だ報告されていない。 Brujin et al., On the other hand, reported that inclusions containing prominent S0D1 in astrocytes appeared before clinical signs; ^ abundantly increased during progression; mutation S0DKG85R) It points to stellate cells as the primary target for mutation-S0D1-mediated damage in overexpressing transgenic mice (Neuron, 18, 327-338 (1997)). Therefore, a bifunctional substance that can restore astrocyte function and directly prevent interlocked cell death can be considered more optimal for treating ALS. But However, such substances have not yet been reported.
肝細胞増殖因子（HGF) は、 最初に成熟肝細胞に対する強力なマイト一ジヱンとして 同定され、 1989年にその遺伝子クロ一ニングがなされた (Biochem. Biophys. Res. Commun •， 122, 1450 1459(1984)、 Nature, 342, 440-443(1989))。 HGFは肝細胞増殖因子として発 見されたカ、 ノックァゥト,ノックインマウスの手法を含む発現および機能的角科斤に おける近年の多数の研究により、 HGFは新規な神経栄養因子であることが明らかにされ た (Ciba. Found. Symp.， 212， 198- 211(1997)、 Nat Neurosci.， 2， 213-217(1999))。 HGF は海馬、 大脳皮質、 ドーパミン作動性中脳、小脳顆粒、感覚、運動ニューロン、 交感 神経神経芽細胞に対して神経栄養因子活性を示す (Ciba. Found. Symp. , 212, 198-211(1 997)、 Brain Res. Mol. Brain Res. , 32, 197-210(1995))。 とりわけ HGFは、 in vitroでグ リア細胞株由来神経栄養因子 (GDNF) に匹敵する、運動ニューロンに対する最も強力 な生存促進因子の一つとして知られている (Neuron, 17, 1157-1172(1996))。 発生段階の 胎児観運動ニューロ および舌下神経の軸索切断後の成熟運動ニューロンに対す る HGFの神, 養因子活性が、 in vivoで示されている（J. Neurosci. , 20, 326-337(2000) 、 Eur. J. Neurosci.， 11, 4139-4144(1999))。 しかしながら、 HGFの ALSへの関与や、 HGF の が実際に ALSに対して効果を示したといつた報告は一切なされておらず、 従って HGFが ALSの治療剤となり得るか否かは何ら明らかにされてし、ない状況にあつた。  Hepatocyte growth factor (HGF) was first identified as a potent mitogene for mature hepatocytes, and its gene was cloned in 1989 (Biochem. Biophys. Res. Commun •, 122, 1450 1459 ( 1984), Nature, 342, 440-443 (1989)). HGF was discovered as a hepatocyte growth factor.A number of recent studies on expression and functional keratoconi, including mosquito, knockout, and knock-in mouse techniques, have revealed that HGF is a novel neurotrophic factor. (Ciba. Found. Symp., 212, 198-211 (1997), Nat Neurosci., 2, 213-217 (1999)). HGF exerts neurotrophic factor activity on hippocampus, cerebral cortex, dopaminergic midbrain, cerebellar granules, sensory, motor neurons, and sympathetic neuroblasts (Ciba.Found.Symp., 212, 198-211 (1 997), Brain Res. Mol. Brain Res., 32, 197-210 (1995)). In particular, HGF is known to be one of the most potent pro-survival factors for motor neurons in vitro, comparable to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) (Neuron, 17, 1157-1172 (1996)). ). In vivo, HGF de novo and trophic factor activity on mature motor neurons after developmental fetal movement motor neurons and axotomy of the hypoglossal nerve have been demonstrated in vivo (J. Neurosci., 20, 326-337). (2000), Eur. J. Neurosci., 11, 4139-4144 (1999)). However, no report has been made regarding the involvement of HGF in ALS or the fact that HGF has actually shown an effect on ALS, and it is not clear whether HGF could be a therapeutic agent for ALS. And then there was no situation.
このような状況下、 A L Sに対する新規な治療剤を提供するために、本発明者らは H GF力" ?ALSの治歸 IJとなり得るか否かを検討した。  Under such circumstances, in order to provide a novel therapeutic agent for ALS, the present inventors examined whether or not HGF could be a return IJ of ALS.
本発明者らは、 まず ALSのモデルマウスである G93Aトランスジヱニックマウスを用い て、 HGFの ALSへの関与を検討した。 その結果、 c- Met/HGFレセプ夕一様免疫応答性（c- Met-IR) が、 野生型同腹子の運動ニューロンと同様に G93Aトランスジエニックマウス の運動ニューロンにも局在していることを見出した。 さらに、 G93Aトランスジヱニッ クマウスにおける ALSの進展に伴い、 循前角 （運動ニューロンが局在） における c - me 1:およひ TIGF mRNAの発現レべノレがマウスの成長に伴って増加することを見出した。 これ らの結果により、 ALSの運動ニュー口ンにおいて HGFが何らかの役割を果たしてし、るこ とが示唆された。  The present inventors first examined the involvement of HGF in ALS using G93A transgenic mice, which are ALS model mice. The results showed that c-Met / HGF receptor homozygous immunoreactivity (c-Met-IR) was localized in G93A transgenic mice as well as in wild-type littermates. Was found. Furthermore, with the development of ALS in G93A transgenic mice, we found that c-me1: and TIGF mRNA expression levels in the circulatory horn (localization of motor neurons) increased with the growth of mice. Was. These results suggest that HGF plays a role in ALS motor exercise.
次に本発明者らは、 ニューロン特異的エノラ一ゼプロモータ一 （NSE) を用いてニュ —ロン特異的にラット HGFを発現するトランスジエニックマウスを作製し、 当該マウス を用いて、 実際に HGFが ALSに対して効果を示すかどうかを検討した。 その結果、 HGFに より運動ニューロン死が減ぜられること、 また運動ニューロンの軸索変性が抑制され ることを初めて見出した。 また HGFは、運動ニューロンのみならず ALS関 ϋ#経 111生に 関する DRG感覚神経に対しても、神経保護効果を発揮することをも見出した。 さらに HG Fは、 神経保護効果を通して、 ALSにおける筋肉喪失を遅延させる効果を有することを 明らかにした。 Next, we used the neuron-specific enolase promoter-1 (NSE) to —Transgenic mice expressing rat HGF in a Ron-specific manner were prepared, and whether or not HGF actually had an effect on ALS was examined using the mice. As a result, we have found for the first time that HGF reduces motor neuron death and suppresses motor neuron axon degeneration. We also found that HGF exerts a neuroprotective effect not only on motor neurons but also on DRG sensory nerves related to ALS-related neurons. In addition, HGF was shown to have a neuroprotective effect in delaying muscle loss in ALS.
さらに本発明者らは、 HGFにより実際に ALSの進行を抑制 （遅延） できるか否かを前 記トランスジヱニックマウスを用いて検討した。 その結果、極めて少量（野生型マウ ス及び G93Aマウスの約 2倍） の HGFの発現により、 驚くべきことに麻痺の開始が遅延さ れ、 が延び、 また運動能力カヾ改善されることが明らかとなった。  Furthermore, the present inventors examined whether or not HGF could actually suppress (delay) the progress of ALS using the transgenic mice described above. The results showed that the expression of HGF in very small amounts (about twice that of wild-type and G93A mice) surprisingly delayed the onset of paralysis, prolonged paralysis, and improved motor performance. It became.
以上の知見により、 HGFの発現が ALSに対して治療効果を有することが、初めて明ら かとなつた。  These findings have made it clear for the first time that HGF expression has a therapeutic effect on ALS.
次に本発明者らは、 HGFによる ALS進行抑制のメカニズムを検討した結果、少なくと も以下の 3つの新たなメカニズムにより、 HGFは ALS改善効果をもたらすこと力、 '示され た。  Next, the present inventors have studied the mechanism of suppression of ALS progression by HGF. As a result, at least the following three new mechanisms have shown that HGF has an ALS improving effect.
(1)運動ニューロンにおけるカスパーゼ一 1の誘導抑制作用  (1) Inhibitory effect of caspase-11 in motor neurons
ALSの中期において、 カスパーゼー 1が、 変異 S0D1を; 1¾発現している卜ランスジェ ニックマウスの運動二ユーロンで活性化されそして/または誘導されることが示され ており（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.， 95， 15763-15768(1998)、 Science, 288， 335-339(20 00))、 またカスパーゼ—1に対するドミナントネガティブインヒビターの G93Aマウスへ の導入が、約 2週間死亡率をうまく遅延させたこと（Nature, 388, 31(1997)、 J. Exp. ed. , 185， 933- 940(1997))から、 カスパーゼー 1がこの麵の進行に重要な役割を果たして いると考えられている。 そこで本発明者らは HGFがカスパーゼ -1の誘導を変化させるか どうかを検討した結果、 HGFは ALS運動ニューロンにおけるカスパーゼ- 1の誘導を抑制 する効果を有することが明らかとなつた。  In the metaphase of ALS, caspase-1 has been shown to be activated and / or induced by motor neurons in transgenic mice expressing the mutant S0D1; 1¾ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15763-15768 (1998), Science, 288, 335-339 (2000), and the introduction of a dominant negative inhibitor of caspase-1 into G93A mice successfully delayed mortality for about two weeks. (Nature, 388, 31 (1997), J. Exp. Ed., 185, 933-940 (1997)), it is thought that caspase-1 plays an important role in the progression of this 麵. Thus, the present inventors examined whether HGF alters caspase-1 induction, and as a result, it has been clarified that HGF has an effect of suppressing caspase-1 induction in ALS motor neurons.
(2)脊髄での Aktのリン酸化作用  (2) Akt phosphorylation in the spinal cord
Aktのリン酸化が大脳皮質ニューロンと腎臓上皮細胞での HGFの生存促進活性に関与 することが示されており、 また HGFは劇症肝炎モデルの肝臓で BoL- xL発現を誘導し、 多 量のアポト一シスを阻止することが示されている（Biochein. Biophys. Res. Commun.， 244, 683-690(1998)、 Hepatology, 30, 15卜 159(1999))。 そこで本発明者らは HGF発現により A ktのリン酸化が起こるカヽ否かを調べた結果、 ALSの «においてキ寺異的に、 Aktのリン 酸化か 1忍められた。 Akt phosphorylation is involved in HGF survival-promoting activity in cerebral cortical neurons and kidney epithelial cells HGF induces BoL-xL expression in the liver of a fulminant hepatitis model, and has been shown to block large amounts of apoptosis (Biochein. Biophys. Res. Commun. , 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 15 159 (1999)). Thus, the present inventors examined whether Akt phosphorylation occurs due to HGF expression. As a result, it was found that Akt phosphorylation was conspicuous in ALS.
(3)反応'醒状細胞におけるグリア細胞特異的グノレ夕ミン酸輸送体 (EAAT2/GLT1) の ダウンレギユレ一ションの抑制  (3) Response: Inhibition of down-regulation of glial cell-specific gnoremate transporter (EAAT2 / GLT1) in awake cells
グノレ夕ミン酸仲介興奮毒性が、 グルタミン酸クリァランスの減少によって ALSの運動 ニューロン変性に関与すること力指摘されている。 この仮説と一致して、 散発性 ALSの 患者の脊髄および運動皮質で、 グノレ夕ミン酸輸送活性が明らかに減少し (N. Engl. J. Med . , 326, 1464-1468(1992)).星状細胞に局在し、 グルタミン酸作動性神経毒性を抑制す るための主要な輸送体であると考えられているグリァ細胞特異的グルタミン酸輸送体 (EAAT2/GLT-1) に対する免疫応答が選択的に消滅したこと (Arm. Neurol. , 38, 73-84(19 95))が報告されている。 また、 ALSモデルである G85R型トランスジヱニックマウスでの ΕΑΑΤ2の減少や (Neuron, 18, 327-338(1997))、 ALSでの S0D1変異（A4Vおよび I113T) に関 連したグリァ細胞グル夕ミン酸輸送体の不活性化 (Nat. Neurosci.， 2, 27-433(1999))も 報告されている。 以上のように、 グルタミン酸作動性興奮毒性は ALSの運動ニューロン 変性にお！/ヽて役割を果たしていると考えられているため、 本発明者らは HGFの ΙίΠ己 EAAT 2への関与を検討した。 その結果、 HGFは ALSにおける ΕΑΑΤ2のダウンレギュレーション を抑制し、 ALS末期におしヽても機能的な星状細胞を保持する機能を有することが明らか となった。  It has been pointed out that gnoremic acid-mediated excitotoxicity is involved in motor neuron degeneration in ALS by reducing glutamate clearance. Consistent with this hypothesis, there is a clear decrease in gnoremic acid transport activity in the spinal cord and motor cortex of patients with sporadic ALS (N. Engl. J. Med., 326, 1464-1468 (1992)). Selective immune response to glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1), which is localized in astrocytes and is considered to be the major transporter for suppressing glutamatergic neurotoxicity (Arm. Neurol., 38, 73-84 (1995)). In addition, a decrease in で 2 in the ALS model G85R transgenic mice (Neuron, 18, 327-338 (1997)) and a glial cell cluster associated with the S0D1 mutation (A4V and I113T) in ALS. Inactivation of the formate transporter (Nat. Neurosci., 2, 27-433 (1999)) has also been reported. As described above, glutamatergic excitotoxicity can cause ALS motor neuron degeneration! / Since it is thought to play a role, we examined the involvement of HGF in self-EAAT2. As a result, it was revealed that HGF has a function of suppressing the down-regulation of ΕΑΑΤ2 in ALS and retaining functional astrocytes even in the late stage of ALS.
このように HGFは、少なくとも 3つのメカニズム、 すなわち、 運動ニューロンにおけ るカスパーゼ- 1の誘導を防ぐことによって、 また Aktのリン酸化によって、 そして反応 性星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体 (EAAT2/GLT1) のダウンレ ギユレ一シヨンを防ぐことによって、 ALSを改善すること力示された。  Thus, HGF is responsible for at least three mechanisms: by preventing caspase-1 induction in motor neurons, by phosphorylating Akt, and by glial cell-specific glutamate transporters in reactive astrocytes ( It has been shown to improve ALS by preventing down-regulation of EAAT2 / GLT1).
以上のように HGFは、 運動ニューロンに対する直接的神^^養因子活性と、 星 钿胞 においてグルタミン酸輸送体のレベルを保つことによる運動ニューロンに対するダル 夕ミン酸細胞毒性の間接的な改善作用の 2つの作用を通して、 ALSの運動機能と^^を 改善する効果を有する。 このような、二重機能性 (bifunctional) の増殖因子は従来 は知られておらず、 HGFが最初の例である。 HGFのこれらの機能は、 ALSおよび関連した 運動ニューロン疾患において、 HGF (遺伝子又はタンパク質） が治療的に麵できるこ とを示している。 発明の開示 As described above, HGF exerts both direct neurotrophic factor activity on motoneurons and indirect improvement of dalminic acid cytotoxicity on motoneurons by maintaining glutamate transporter levels in stellate cells. ALS motor function and ^^ It has the effect of improving. Such bifunctional growth factors have not been previously known, and HGF is the first example. These functions of HGF indicate that HGF (gene or protein) can be used therapeutically in ALS and related motoneuron diseases. Disclosure of the invention
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。すなわち本発 明は、  The present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention
( 1 ) HG F及び/又は H G F遺伝子を有効成分として含有する、 A L S治療剤、 (2) HGF及び Z又は HGF遺伝子を有効成分として含有する、 ALSの進行抑 制剤、  (1) ALS therapeutic agent containing HGF and / or HGF gene as active ingredient, (2) ALS progress inhibitor containing HGF and Z or HGF gene as active ingredient,
(3) HGF及び/又は HGF遺伝子を有効成分として含有する、運動ニューロン におけるカス、°—ゼー 1の誘導抑制剤、  (3) HGF and / or an HGF gene-containing active ingredient, an inhibitor of induction of cas or o-ze1 in motor neurons,
(4) HG F及ぴン又は H G F遺伝子を有効成分として含有する、 脊髄における A k tのリン酸化促進剤、及び  (4) an Akt phosphorylation promoter in the spinal cord, comprising an HGF and HGF gene or an HGF gene as an active ingredient; and
(5) H G F及び/又は H G F遺伝子を有効成分として含有する、星状細胞におけ るグリァ細胞特異的グル夕ミン酸輸送体 (EAAT2/GLT- 1)の減少抑制剤、 を 共する。 図面の簡単な説明  (5) An inhibitor of decrease of glial cell-specific glumic acid transporter (EAAT2 / GLT-1) in astrocytes, which comprises HGF and / or the HGF gene as an active ingredient. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 G93Aトランスジヱニックマウス （図中 G93A)および野生型同腹子（図中 wil dtype)の運動ニューロンにおける c- Metの発現 (c-Met-IR)を、 免疫組織学的解析に より調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図中、 ¾ιοは 2ヶ月齢を、 また 8moは 8ヶ月齢 を示す。  Figure 1 shows immunohistological analysis of c-Met expression (c-Met-IR) in motoneurons of G93A transgenic mice (G93A in the figure) and wild-type littermates (wild dtype in the figure). 6 is a micrograph showing the result of further examination. In the figure, ¾ιο is 2 months old, and 8mo is 8 months old.
図 2は、 G98Aマウスの疾病の進行における、 脊髄での HGFおよび ciet Aの を コンペティティブ RT- PCRにより行い、 同齢の野生型マウスのそれと比較した結果を示 すグラフである。横軸は月齢を、縦軸は c-met RNA量（左グラフ） あるいは HGF RNA量 (右グラフ） を示す。 図中、 矢頭は c_metあるいは HGFのバンドを、 また棒はコンペテ イタ一のバンドを示す。 FIG. 2 is a graph showing the results obtained by performing competitive RT-PCR on HGF and ciet A in the spinal cord in the progression of disease in G98A mice, and comparing the results with those of wild-type mice of the same age. The horizontal axis indicates the age, and the vertical axis indicates the amount of c-met RNA (left graph) or the amount of HGF RNA (right graph). In the figure, the arrowhead indicates the c_met or HGF band, and the bar indicates the competition. This shows the band of the Italian.
図 3は、 ニューロン特異的エノラーゼプロモータ一を用いて作製した HGFトランスジ ヱニックマウスの各組織における外来性 HGFの発現を、 RNaseプロテクションァッセィ により解析した結果を示す、 電気泳動写真である。 図中、 矢印は外来性 HGFに相当する バンドを、 また棒は内在性 HGFに相当するバンドを示す。 また図中、 Brは脳を、 Luは肺 を、 Htは心臓を、 Liは肝臓を、 Kdは腎臓を、 Spは脾臓を、 Stは胃を、 Scは脊髄を、 Ts は精巣を、 Msは筋肉を、 Inは腸を、 Skは皮膚を指す。  FIG. 3 is an electrophoresis photograph showing the results of analyzing the expression of exogenous HGF in each tissue of an HGF transgenic mouse prepared using a neuron-specific enolase promoter using an RNase protection assay. In the figure, the arrow indicates a band corresponding to exogenous HGF, and the bar indicates a band corresponding to endogenous HGF. In the figure, Br is the brain, Lu is the lung, Ht is the heart, Li is the liver, Kd is the kidney, Sp is the spleen, St is the stomach, Sc is the spinal cord, Ts is the testis, Ms Indicates muscle, In indicates intestine, and Sk indicates skin.
図 4は、 2ヶ月齢の野生型および HGFトランスジエニックマウス同腹子 (n=6) での 血節 GFのレべノレを示すグラフである。 結^ ¾疫測定法 (ELISA) で角?！斤した。 図 5は、 出生後発達段階での野生型および トランスジエニックマウス同腹子での 全穩における HGF含量を、 ELISAによって解析した結果を示すグラフである。 図中、 P 2は出生後 2日目を、 P14は出生後 14日目を、 また lmoは 1ヶ月齢を、 6moは 6ヶ月齢を示す 図 6は、 腰髄前角の運動ニュ一ロンの数及び形態を、 組織学的に解析した結果を示 す顕微鏡写真である。 図中、 wildtypeは野生型マウス、 HGFは HGF単独トランスジェニ ックマウス、 G93Aは G93Aトランスジエニックマウス （ALS末期） 、 G93A/HGFは二重トラ ンスジエニックマウス （ALS末期） の結果を示す。  FIG. 4 is a graph showing the level of blood GF in two-month-old littermates of wild-type and HGF transgenic mice (n = 6). Conclusion ^ 角 In the Epidemiological Assay (ELISA)? Loafed. FIG. 5 is a graph showing the results of analysis by ELISA of HGF content in whole litters of wild-type and transgenic mice at the postnatal development stage. In the figure, P2 indicates the second day after birth, P14 indicates the 14th day after birth, and lmo indicates 1 month old and 6mo indicates 6 months old. 4 is a photomicrograph showing the results of histological analysis of the number and morphology of. In the figure, wildtype shows the results of wild-type mice, HGF shows the results of HGF-only transgenic mice, G93A shows the results of G93A transgenic mice (ALS terminal stage), and G93A / HGF shows the results of double transgenic mice (ALS terminal stage).
図 7は、 各トランスジエニックマウスにおける腰髄の運動ニューロン数を、 定量的 に比較した結果を示すグラフである。 図中、 〇は野生型を、 秦は HGF単独トランスジヱ ニックマウスを、 A¾G93A卜ランスジヱニックマウスを、 また▲は二重トランスジェ ニックマウスを示す。  FIG. 7 is a graph showing the results of quantitatively comparing the number of motoneurons in the lumbar spinal cord in each transgenic mouse. In the figure, 〇 indicates wild-type, Hata indicates HGF-only transgenic mouse, A¾G93A transgenic mouse, and ▲ indicates double transgenic mouse.
図 8は、 各トランスジヱニックマウスにおける腓腹筋の湿重量を示すグラフである 。 図中、 〇は野生型を、 きは HGF単独トランスジエニックマウスを、 厶は693 トランス ジヱニックマウスを、 また▲は二重トランスジエニックマウスを示す。  FIG. 8 is a graph showing the wet weight of the gastrocnemius muscle in each transgenic mouse. In the figure, 〇 indicates wild-type, HGF indicates transgenic mice with HGF alone, indicates 693 transgenic mice, and ▲ indicates double transgenic mice.
図 9は、 8ヶ月齢の各トランスジエニックマウスの前根（V、 上パネル） と後根（D、 下パネル） の切片 （l m) の形態を示す顕微鏡写真である。  FIG. 9 is a photomicrograph showing the morphology of a section (lm) of the anterior root (V, upper panel) and dorsal root (D, lower panel) of each 8-month-old transgenic mouse.
図 1 0は、各トランスジヱニックマウスでの、 2、 6および 8ヶ月齢の循の HGFレべ ノレを ELISAにより麟斤した結果を示すグラフである。 図 1 1は、 G93Aトランスジヱニックマウス （図中△、 n= ） および G93A/HGF二重ト ランスジエニックマウス （図中▲、 n=16) における麻痺の開始を比較した結果を示す グラフである。 FIG. 10 is a graph showing the results obtained by ELISA for circulating HGF levels of 2, 6 and 8 months old in each transgenic mouse. Fig. 11 shows the results of comparing the onset of paralysis in G93A transgenic mice (△, n = in the figure) and G93A / HGF double transgenic mice (▲, n = 16 in the figure). It is.
図 1 2は、 G93Aトランスジヱニックマウス （図中△、 n= ） および G93A/HGF二重ト ランスジヱニックマウス （図中▲、 n = 16) における死亡の開始を比較した結果を示す グラフである。  Figure 12 shows the results of comparing the onset of death in G93A transgenic mice (△, n = in the figure) and G93A / HGF double transgenic mice (▲, n = 16 in the figure). It is a graph.
図 1 3は、 野生型 （図中〇、 n=14)、 HGF単独トランスジヱニックマウス （図中 · 、 n=15)、 G93Aトランスジヱニックマウス （図中△、 n=15) 、 および二重トランス ジヱニックマウス （図中▲、 n= 16) の後肢伸長反射を測定した結果を示すグラフであ る。  Figure 13 shows wild-type (〇, n = 14 in the figure), HGF-only transgenic mouse (·, n = 15 in the figure), G93A transgenic mouse (△, n = 15), 3 is a graph showing the results of measuring the hind limb extension reflex of double transgenic mice (▲, n = 16 in the figure).
図 1 4は、 野生型 （図中〇、 n=14)、 HGF単独トランスジエニックマウス （図中書 、 n= 15)、 G93Aトランスジエニックマウス （図中△、 n=15) 、 および二重トランス ジエニックマウス （図中▲、 n=16) のロータ一ロッド上での保持時間を測定した結果 を示すグラフである。  Figure 14 shows wild-type (〇 in the figure, n = 14), transgenic mice with HGF alone (in the figure, n = 15), G93A transgenic mice (△ in the figure, n = 15), and It is a graph which shows the result of having measured the retention time on the rotor rod of the double transgenic mouse (▲, n = 16 in the figure).
図 1 5は、 野生型 （図中〇、 ri- 14)、 HGF単独トランスジヱニックマウス （図中誊 Figure 15 shows transgenic mice with wild-type (（, ri-14) and HGF alone (誊).
、 n= 15)、 G93Aトランスジエニックマウス （図中△、 n= 15) 、 および二重トランス ジエニックマウス （図中▲、 n=16) の歩幅を測定した結果を示すグラフである。 , N = 15), G93A transgenic mice (△, n = 15 in the figure), and double transgenic mice (▲, n = 16 in the figure).
図 1 6は、疾病進行中の G93A及び G93A/HGF同腹子の腰髄における変異 S0D1の凝集を 、 免 色により解析した結果を示す顕微鏡写真である。 図中 4moは 4ヶ月齢を、 また 8 moは 8ヶ月齢を示す。  FIG. 16 is a micrograph showing the results of color-free analysis of the aggregation of mutant S0D1 in the lumbar spinal cord of G93A and G93A / HGF littermates during disease progression. In the figure, 4mo is 4 months old, and 8mo is 8 months old.
図 1 7は、 野生型 (W)、 HGF単独 (H)、 G93ACG) 、 および二重トランスジヱニック (G/H) の各マウスの腰髄での変異 S0D1の量を、 ィムノブロッテイングによって角 斤し た結果を示す電気泳動写真である。 図中、 2moは 2ヶ月齢を、 6moは 6ヶ月齢を、 8moは 8 ヶ月齢を示す。  Figure 17 shows the amount of mutant S0D1 in the lumbar spinal cord of wild-type (W), HGF alone (H), G93ACG), and double transgenic (G / H) mice. 9 is an electrophoresis photograph showing the result of squaring by winging. In the figure, 2mo indicates 2 months old, 6mo indicates 6 months old, and 8mo indicates 8 months old.
図 1 8は、 野生型 (W)、 HGF単独 (H)、 G93A(G) 、 および二重トランスジヱニック (G/H) の各マウスの 8ヶ月齢の腰髄における、 リン酸化 Akt (p-Akt)、 Akt、 Bcl-xL、 及び ¾cl- 2の免疫染色の結果を示す電気泳動写真である。  FIG. 18 shows the phosphorylated Akt (8-month-old lumbar spinal cord) in wild-type (W), HGF alone (H), G93A (G), and double transgenic (G / H) mice. 9 is an electrophoretic photograph showing the results of immunostaining of (p-Akt), Akt, Bcl-xL, and Δcl-2.
図 1 9は、 4種のマウスの 8ヶ月齢の腰髄前角を、 GFAPにより免疫組織化学解析した 結果を示す顕微鏡写真である。 Figure 19 shows the immunohistochemical analysis of the lumbar anterior horn at 8 months of age of the four mice using GFAP. It is a microscope picture which shows a result.
図 2 0は、 図 1 9の GFAPによる免疫組織化学解析を ^的に示したグラフである。 図中、 〇は野生型、 秦は HGF単独トランスジエニック、 AttG93Aトランスジヱニック、 ▲は二重トランスジヱニックを示す （それぞれの群ごとに n=3)。  FIG. 20 is a graph showing the immunohistochemical analysis using the GFAP shown in FIG. In the figure, 〇 indicates wild type, Hata indicates HGF-only transgenic, AttG93A transgenic, and indicates double transgenic (n = 3 for each group).
図 2 1は、 4種のマウスの 2、 6および 8ヶ月時の脊髄の EAAT2、 GFAPおよび c- Metの免 疫ブロッテイングの結果を示す 泳動写真である。 図中 Wは野生型、 Hは HGF単独トラ ンスジエニック、 Gは G93Aトランスジエニック、 G/Hは二重トランスジエニックを示す 図 2 2は、 標準化後の EAAT2の相対的レベル（標準化のために EAAT2レべノレを GFAPレ ベルで割る） を示したグラフである （それぞれの群毎に n = マウス） 。  FIG. 21 is an electrophoretic photograph showing the results of immunoblotting of EAAT2, GFAP and c-Met in the spinal cord of the four mice at 2, 6 and 8 months. In the figure, W indicates wild-type, H indicates HGF-only transgenic, G indicates G93A transgenic, and G / H indicates double transgenic. Figure 22 shows the relative levels of EAAT2 after standardization (for standardization). EAAT2 level divided by GFAP level (n = mouse for each group).
図 2 3は、 HGF処理後の初代培養星状細胞における EAAT2および c-Metの免疫プロッテ ィングを示す電気 写真である。  FIG. 23 is an electrophotograph showing EAAT2 and c-Met immunoblotting in primary cultured astrocytes after HGF treatment.
図 2 4は、 図 2 3の免疫ブロッテイングの結果を定量的に示したグラフである （そ れぞれの群で n= 2)。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 24 is a graph quantitatively showing the results of the immunoblotting of FIG. 23 (n = 2 in each group). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明において使用される H G Fは ロ物質であり、 その塩基配列及びアミノ酸配 列は、 Nature, 342, 440(1989)、特許第 2777678号公報、 Biochera. Biophys. Res. Comraun. , H GF used in the present invention is a substance, and its base sequence and amino acid sequence are described in Nature, 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Biochera. Biophys. Res. Comraun.,
163, 967(1989)、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 172, 321(1990)などに記載されている 。 当該 H G Fは、 医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、 種々の方法 で調製されたものを用いることができる。 また既に市販されている製品 （例えば、 東 洋紡 Code No. HGF- 101等） を使用することもできる。 163, 967 (1989) and Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321 (1990). As the HGF, those purified by various methods can be used as long as they are purified to the extent that they can be used as pharmaceuticals. Also, commercially available products (for example, Toyobo Code No. HGF-101, etc.) can be used.
H G Fの製造法としては、 例えば、 H G Fを産生する初代培養細胞や株化細胞を培 養し、 培養上清等から分離、 精製して該 H G Fを得ることができる。 また、 遺伝子ェ 学的手法により H G Fをコードする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、 これを適当 な宿主に挿入して形質転換し、 この形質転換体の培養上清から目的とする組換え HGFを 得ることができる （例えば Nature, 342, 440(1989)、特開平 5- 111383号公報、 Biochem. As a method for producing HGF, for example, the HGF can be obtained by culturing primary cultured cells or cell lines that produce HGF, and separating and purifying it from a culture supernatant or the like. In addition, a gene encoding HGF is inserted into an appropriate vector by a genetic genetic technique, inserted into an appropriate host, and transformed, and the recombinant HGF of interest is obtained from the culture supernatant of the transformant. (For example, Nature, 342, 440 (1989), JP-A-5-111383, Biochem.
Biophys. Res. Commun. , 163, 967(1989)など参照） 。 上記の宿主細胞は特に限定されず、 従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主钿胞、例えば大腸菌、 酵母又 は動物細胞などを用いることができる。 ここで動物細胞としては、 CH0細胞や COS細胞 '、又はマウス C127細胞などが挙げられる （いずれも ATCC等から入手可能） 。 このよう にして得られた HGFは、 天然型 HGFと実質的に同じ作用を有する限り、 天然型 HGFに類似 の構造を有するものであつても良い。 すなわち、 1 )前記 HGFの cDMとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする D N Aによりコードされるタンパク質や、 2 )Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), etc.). The host cell is not particularly limited, Various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, such as Escherichia coli, yeast, or animal cells, can be used. Here, animal cells include CH0 cells, COS cells', and mouse C127 cells (all available from ATCC and the like). The HGF thus obtained may have a structure similar to the natural HGF as long as it has substantially the same action as the natural HGF. That is, 1) a protein encoded by DNA that hybridizes with the HGF cDM under stringent conditions, and 2)
GFのァミノ酸配列に対して 1若しくは複数（好ましくは数個） のァミノ酸が置換、 欠 失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、 などのうち、 HGFとしての 作用を有するタンパク質であれば、 本発明の HGFの範疇に含まれる。 ここで前記 1 ) 及 び 2 ) の夕ンパク質をコ一ドする！) NAは、例えば部位特異的突然変異誘発法、 PCR法、 又は通常のハイブリダィゼ一シヨン法などにより容易に得ること力でき、具体的には M olecular Cloning 2nd Edt.， Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書 を参考にして行うことができる。 A protein comprising an amino acid sequence in which one or more (preferably several) amino acids have been substituted, deleted and / or added to the amino acid sequence of GF; For example, it is included in the category of the HGF of the present invention. Here, code the evening protein of 1) and 2)! ) NA can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or ordinary hybridization, and specifically, Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) Etc. can be used as a reference.
本発明は、 HGFが ALSの治療剤、具体的には ALSの進行抑制剤となることを初めて明ら かにしたものである。 HGFは、 運動ニューロンに対する直接的神^^養因子活性と、 星 ；!え細胞にお 、てダル夕ミン酸輸送体のレベルを保つことによる運動ニュー口ンに文 るグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用の 2つの作用を通して、 ALSの運動機能と 寿命を改善する効果を有する。 このような、二重機能性 (bifunctional) の増殖因子 は従来は知られておらず、 HGFカ最初の例である。 HGFはこれら 2つの作用を発揮する ことにより、 ALSおよび関連した運動ニューロン疾患の進行を遅延 ·抑制することがで さる。  The present invention has revealed for the first time that HGF is a therapeutic agent for ALS, specifically, an ALS progress inhibitor. HGF is a direct neurotrophic factor activity on motor neurons and an indirect effect of glutamate cytotoxicity on motor neurons by maintaining dalminic acid transporter levels in star cells. It has the effect of improving the motor function and lifespan of ALS through the two functions of the effective improvement. Such bifunctional growth factors are not known before and are the first example of HGF. By exerting these two effects, HGF can slow or inhibit the progression of ALS and related motor neuron disease.
HGFの ALSに対する作用機序としては、 HGFは、 少なくとも以下の 3つの作用を発揮す ることによって、 ALS改善効果を示すと考えられる。  Regarding the mechanism of action of HGF on ALS, HGF is considered to exhibit ALS-improving effects by exerting at least the following three actions.
(1)運動ニューロンにおけるカスパーゼー 1の誘導抑制作用  (1) Inhibitory effect of caspase-1 on motor neurons
(2)脊髄での Aktのリン酸化作用  (2) Akt phosphorylation in the spinal cord
(3)反応性星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体 (EAAT2/GLT1) のダ ゥンレギュレ一ションの抑制作用  (3) Inhibitory effect of glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT1) down-regulation on reactive astrocytes
このような作用を有する内因性増殖因子は今まで知られておらず、 HGFが、 if己作用 を有することを示した最初の増殖因子である。 HGFは、 これらの作用を発揮することに より、 ALSおよび関連した運動ニューロン疾患の進行を遅延 ·抑制することができる。 ここで ALSに関連した運動ニューロン疾患としては、 進行性棘筋 (spinal muscular )萎縮、 進行' 1生球麻痺、原発性側索硬化、 小児性及び若年性筋萎縮、 フォジオ-ロンデ 症 、 シャルコ一 'マリ一 'ッ一ス病などが挙げられるカ^ これらに限定されるも のではない。 No endogenous growth factor having such an action has been known so far, and HGF Is the first growth factor to be shown. By exerting these effects, HGF can delay and suppress the progression of ALS and related motoneuron diseases. Here, motor neuron diseases related to ALS include progressive spinal muscular atrophy, advanced '1 live bulb paralysis, primary lateral sclerosis, pediatric and juvenile muscular atrophy, fogio-Ronde's disease, and Charcoal's disease. 'Mary' disease is not limited to these.
本発明の治療剤は種々の製剤形態 （例えば液剤、 固形剤など） をとりうるカ、一般 的には有効 である HGFのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤とされる。 当該注射 剤は常法により調製することができ、 例えば、 HGFを適切な溶剤 （例えば、 滅菌水、 緩 衝液、 生理食塩水等） に溶解した後、 フィルタ一等でろ過滅菌し、次いで無菌的な容 器に充填することにより調製することができる。 ¾ォ剤中の HGFの含量としては、 通常 0. 0002〜0. 2 (f/V%)程度、好ましくは 0. 001〜0. l(ff/V%)程度に調整される。  The therapeutic agent of the present invention may be injectable with various forms of preparation (eg, liquid, solid, etc.), generally with only effective HGF alone or with a conventional carrier. The injection can be prepared by a conventional method. For example, after dissolving HGF in an appropriate solvent (eg, sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc.), sterilize by filtration with a filter or the like, and then sterilely. It can be prepared by filling into a container. The content of HGF in the preparation is usually adjusted to about 0.0002 to 0.2 (f / V%), preferably to about 0.001 to 0.1 (ff / V%).
製剤化に際して、好ましくは安定化剤カヾ添加され、安定化剤としては、 例えばアル ブミン、 グロブリン、 ゼラチン、 マンニトール、 グルコース、 デキストラン、 ェチレ ングリコールなどが挙げられる。 さらに、 本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例 えば、 賦形剤、 溶解補助剤、 酸化防止剤、 無痛化剤、 等張化剤等を含んでいても良い 。 液状製剤とした場合は凍結保存、 又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するの が望ましい。 凍結乾'燥製剤は、 用時に注射用蒸留水などを加え、 再溶解して使用され る。  At the time of formulation, a stabilizer is preferably added, and examples of the stabilizer include albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, and ethylene glycol. Further, the preparation of the present invention may contain additives necessary for preparation, for example, excipients, solubilizing agents, antioxidants, soothing agents, isotonic agents and the like. In the case of a liquid preparation, it is desirable to store it after freezing or freezing it by freeze-drying. The freeze-dried preparation is used after reconstitution by adding distilled water for injection at the time of use.
本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与される。 投与経 路としては、 HGFが作用を発揮し、 ALSの進行を抑制し得るような投与経路であれば、 いかなる投与経路であっても良い。一般的には、 皮下投与、皮内投与、 静脈内投与、 動脈内投与、 筋肉内投与、局所注入、脳室内投与、脊髓内投与などが挙げられる。 さ らに、体内に埋め込まれた装置を介した投与経路も挙げられ、具体的には、 ォスモチ ックポンプなどを用 ヽて患部に連続的に徐々に投与する手法や、 徐放性製剤 （例えば ミニペレツト製剤） を患部近くに埋め込む手法などが挙げられる。  The preparation of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the form of the preparation. The administration route may be any administration route as long as HGF exerts an action and the progress of ALS can be suppressed. In general, examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, and intraspinal administration. In addition, there is also a route of administration via a device implanted in the body. Specifically, a method of continuously and gradually administering to the affected area using an osmotic pump or the like, or a sustained-release preparation (for example, a mini pellet) Formulation) near the affected area.
このうち脊髄内投与は、 脊髄内の運動ニューロンに本発明の製剤を直接到達させる ことが出来るため、好ましい投与経路である。 . 投与量としては、 患者の症状、年齢、 体重などにより適宜調節されるが、 通常 HGFと して 0. 001mg〜1000mg、 好ましくは 0. 01mg〜100mgであり、 これを 1日 1回〜数回に分 けて投与するのが適当である。 Of these, intraspinal administration is a preferred route of administration because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord. . The dosage is appropriately adjusted depending on the patient's condition, age, body weight, etc., but is usually 0.001 mg to 1000 mg, preferably 0.01 mg to 100 mg as HGF, and is administered once to several times a day. It is appropriate to administer it separately.
また、 以下の実施例に記載されたように、極めて少量の HGFの発現により、 ALSが改 善されることが示された。 すなわち、 野生型マウス及び G93Aトランスジヱニックマウ スの での HGF発 の約 2倍の HGF発現レベルにより、 ALSの症状が認めはじめられ る時期である 6ケ月時の運動機能を十分に改善し、 またマウスにおいて 1ヶ月の寿命を 引き延ばしたことが示された。従って、本発明の HGF製剤は、 ALS患者に対して、 少な くとも脊髄中での HGF発現レベルが、 HGF投与前の 2倍以上となるような量で、 投与され ることカヾ好ましい。 本発明においては、 このような、 #1道における HGFの発現レベルが 、 HGF投与前の 2倍以上となるような量を投与することからなる、 ALSの治藤 Uをも提供 するものである。  Also, as described in the Examples below, it was shown that ALS was improved by the expression of very small amounts of HGF. That is, the HGF expression level in wild-type mice and G93A transgenic mice, which is about twice as high as that of HGF development, sufficiently improved motor function at 6 months, when ALS symptoms began to be observed. In addition, it was shown that the life span of one month was prolonged in mice. Therefore, the HGF preparation of the present invention is preferably administered to an ALS patient in such an amount that the expression level of HGF in the spinal cord is at least twice as high as before HGF administration. In the present invention, there is also provided an ALS Jito U comprising administering such an amount that the expression level of HGF in the # 1 way becomes twice or more that before administration of HGF. .
さらに近年、 HGF遺伝子を用いた遺伝子治療に関する報告がなされており （Circulat ion, 96, No3459(1997)、 Nature Medicine, 5, 226-230(1999). Circulation, 100, No. 1672 (1999)、 Gene Therapy, 7, 417-427(2000) などを参照)、 また技術的にも確立された技 術となっている。 本発明においては、 前述のような HGFタンパクの投与のみならず、 HG F遺伝子を導入することからなる ALSの遺伝子治療剤をも包含するものである。 以下、 H GFの遺伝子治療につき記述する。  In recent years, reports on gene therapy using the HGF gene have been made (Circulat ion, 96, No3459 (1997), Nature Medicine, 5, 226-230 (1999). Circulation, 100, No. 1672 (1999), Gene Therapy, 7, 417-427 (2000), etc.), and it is also a technically established technology. The present invention includes not only the administration of the HGF protein as described above, but also an ALS gene therapy agent comprising the introduction of the HGF gene. The following describes gene therapy for HGF.
本発明において使用される 「HGF遺伝子」 とは、 HGF (HGFタンパク） を発現可能な遺 伝子を指す。具体的には、 Nature, 342， 440(1989)、 特許第 2777678号公報、 Biochem. Bi ophys. Res. Commun. , 163, 967(1989)、 Biochem. Biophys. Res. Coramun. , 172, 321(1990)な どに記載の HGFの cDNAを後述の如き適当な発現べクタ一 （非ウィルスベクタ一、 ウィル スベクター） に組み込んだもの力挙げられる。 ここで HGFをコードする cDNAの塩基配列 は、 霞己文献に記載されている他、 Genbank等のデータべ一スにも登録されている。 従ってこれらの配列情報に基づき適当な DNA部分を PCRのプライマ一として用い、 例え ば肝臓や白血球由来の mRNAに対して RT-PCR反応を行うことなどにより、 HGFの cDNAをク 口一ニンク、'することができる。 これらのクロ一ニングは、 例えは "Molecular Cloning 2 nd Edt , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に従い、 当業者な らば容易に行うことができる。 The “HGF gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing HGF (HGF protein). Specifically, Nature, 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), Biochem. Biophys. Res. Coramun., 172, 321 ( 1990), etc., into a suitable expression vector (non-viral vector, viral vector) as described below. Here, the nucleotide sequence of the cDNA encoding HGF is described in the Kasumi literature and also registered in databases such as Genbank. Therefore, based on these sequence information, an appropriate DNA portion is used as a primer for PCR, for example, by performing an RT-PCR reaction on mRNA derived from the liver or leukocytes, and the like. can do. These clonings can be performed by those skilled in the art, for example, according to a basic book such as "Molecular Cloning 2nd Edt, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)". It can be done easily.
さらに、本発明の HGF遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンハ°ク質が HG Fと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、 本発明の HGF遺伝子として使用でき る。 すなわち、 1 )前記 cDNAとストリンジヱン卜な条件下でハイプリダイズする DNAや 、 2 )前記 cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して 1若しくは複 数（好ましくは数個） のァミノ酸が置換、 欠失及び/又は付加されたァミノ酸配列か らなるタンパク質をコードする DNA、 などのうち、 HGFとしての作用を有するタンパク をコードするものであれば、 本発明の HGF遺伝子の範疇に含まれる。 ここで前記 1 )及 び 2 ) の DNAは、 例えば部位特異的突然変異誘発法、 PCR法、又は通常のハイブリダィ ゼ一ション法などにより容易に得ることができ、 具体的には嫌己 Molecular Cloning等 の基本書を参考にして行うことができる。  Furthermore, the HGF gene of the present invention is not limited to those described above, and can be used as the HGF gene of the present invention as long as the expressed protein has a gene substantially the same action as HGF. That is, 1) a DNA that hybridizes with the cDNA under stringent conditions, or 2) one or more (preferably several) amino acids substituted with the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA, Among the DNAs encoding a protein consisting of a deleted and / or added amino acid sequence, and the like, as long as they encode a protein having an action as an HGF, they are included in the category of the HGF gene of the present invention. Here, the DNAs of 1) and 2) can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or ordinary hybridization, and specifically, This can be done with reference to basic books such as.
本発明の HGF遺伝子は、前述の HGF夕ンパクと同様の疾患に適用することができる。 また、 HGF遺伝子と HGFタンパクは独立して使用することもできれば、 両者を併用して 用いることも可能である。  The HGF gene of the present invention can be applied to the same diseases as the aforementioned HGF protein. The HGF gene and the HGF protein can be used independently, or both can be used in combination.
次に、 本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、 導入形態および導 入量等について記述する。  Next, the gene transfer method used in the gene therapy of the present invention, the transfer form, the amount introduced, and the like are described.
mi己遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、 その投与形態と しては非ウィルスベクタ一を用 、た場合と、 ウィルスベクタ一を用 、た場合の二つに 大別され、実験手引書などにその調製法、 投与法力ヾ詳しく解説されている （別冊実験 医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社， 1996、 別冊実験医学,遺伝子導入 &発現解析実験 法,羊土社， 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、 ェヌ .テ ィ一 ·エス， 1999) 。 以下、具体的に説明する。  When a gene therapy agent containing the mi gene as an active ingredient is administered to a patient, the dosage form can be broadly divided into two types: using a non-viral vector and using a viral vector. The methods of preparation and administration are described in detail in the experimental manuals. (Separate volume experimental medicine, Basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996, Separate volume experimental medicine, Gene transfer & expression analysis experiment method, Co., 1997, Gene Therapy Development Research Handbook, edited by The Japan Society for Gene Therapy, N.T.S., 1999). Hereinafter, a specific description will be given.
A. 非ウィルスベクタ一を用いる場合 A. When using non-viral vectors
慣用の遺伝子発現べクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現べク夕― を用いて、 以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる 細胞への遺伝子導入法としては、 リポフエクション法、 リン酸一カルシウム共沈法 、 D E A E—デキストラン法、微小ガラス管を用いた D N Aの直接注入法などが挙げ られる。 Using a recombinant expression vector in which the target gene is incorporated into a conventional gene expression vector, the target gene can be introduced into cells or tissues by the following method. Examples include lipofection method, monocalcium phosphate coprecipitation method, DEAE-dextran method, and direct DNA injection method using a micro glass tube. Can be
また、 組織への遺伝子導入法としては、 内包型リボソーム （internal type liposom e) による遺伝子導入法、 静電気型リボソーム （electrostatic type liposome) によ る遺伝子導入法、 H V J —リポソ一ム法、 改良型 HV J -リポソ一ム法（HVJ- AVEリポ ソ一ム法）、 レセプ夕一介在性遺伝子導入法、パ一テイクノ で担体（金属粒子） と ともに D N A分子を細胞に移入する方法、 n a k e d— D N Aの直接導入法、正電荷 ポリマ一による導入法等の 、ずれかの方法に供することにより、 組換え発現べクタ一 を細胞内に取り込ませることが可能である。  In addition, gene transfer into tissues includes gene transfer using internal liposomes, gene transfer using electrostatic liposomes, HVJ-liposome method, and improved HV. J-liposome method (HVJ-AVE liposome method), receptor-mediated gene transfer method, method of transferring DNA molecules into cells with carrier (metal particles) using protein, naked-DNA The recombinant expression vector can be taken into cells by subjecting it to any of the methods such as direct introduction method and introduction method using positively charged polymer.
このうち HV J—リボソームは、 脂質二重膜で作られたリボソーム中に D N Aを封 入し、 さらにこのリボソームと不活化したセンダイウィルス （Hemagglutinating viru s of Japan ： HV J ) とを融合させたものである。 当該 H V J―リポソ一ム法は従来 のリポソ一ム法と比較して、 細胞膜との融合活性カヾ非常に高いことを特徴とするもの であり、 好ましい導入形態である。 HV J _リボソームの調製法については文献（実 験医学別冊,遺伝子治療の基礎技術,羊土社， 1996、 遺伝子導入 &発現解析実験法，羊土 社， 1997、 J. Clin. Invest. 93, 1458-1464(1994), Am. J. Physiol. 271, R1212-1220C1996) ) などに詳しく述べられているため、 それらを参照されたい。 なお HV Jとしては Z 株（ATCCより入手可能） が好ましいが、基本的には他の HV J株（例えば ATCC VR-90 7や ATCC VR - 105など) も用いることができる。  Among them, HVJ-ribosome is a fusion of ribosome and inactivated Sendai virus (Hemagglutinating virus of Japan: HVJ) that encapsulates DNA in ribosome made of lipid bilayer. It is. The HVJ-liposome method is characterized by having a very high fusion activity with the cell membrane as compared with the conventional liposome method, and is a preferred introduction form. For the preparation method of HV J_ ribosome, refer to the literature (Experimental Medicine Supplement, Basic Technology of Gene Therapy, Yodosha, 1996, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha, 1997, J. Clin. Invest. 93, 1458-1464 (1994), Am. J. Physiol. 271, R1212-1220C1996)), etc., please refer to them. As HV J, strain Z (available from ATCC) is preferred, but basically other HV J strains (eg, ATCC VR-907 and ATCC VR-105) can also be used.
さらに、 n a k e d— D N Aの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であ り、 この観点から好ましい導入法である。  Furthermore, the direct introduction method of naked-DNA is the simplest method among the above methods, and is a preferable introduction method from this viewpoint.
ここで用いられる発現べクタ一としては、 生体内で目的遺伝子を発現させることの できるベクタ一であれば如何なる発現べクタ一であっても良いが、 例えば p C A G G S (Gene 108， 193-200(1991)) や、 p B K— CMV、 p c D NA 3. 1、 p Z e o S V (インビトロゲン社、 ストラタジーン社） などの発現べクタ一力挙げられる。  The expression vector used here may be any expression vector as long as it is a vector capable of expressing the target gene in vivo. For example, pCAGGS (Gene 108, 193-200 ( 1991)), pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene) and the like.
B . ウィルスべクタ一を用いる場合 B. When using a virus vector
ウィルスベクタ一としては、組換えアデノウイルス、 レトロウイルス等のウイノレス ベクタ一を用いた方法が代表的なものである。 より具体的には、 例えば、 無毒化した レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ヮクシ ニァウィルス、 ボックスウィルス、 ポリオゥイノレス、 シンビスウィルス、 センダイゥ ィルス、 SV40、 免疫不全症ウィルス （HI V)等の DNAウィルスまたは RNA ウィルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによ つて、 細胞内に遺伝子を導入することが可能である。A typical example of a virus vector is a method using a vinoless vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus. More specifically, for example, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, Introducing a gene of interest into DNA or RNA viruses such as Nyavirus, Box virus, Poliovirus, Synvis virus, Sendai virus, SV40, and Immunodeficiency virus (HIV), and infecting cells with the recombinant virus. Thus, it is possible to introduce a gene into a cell.
if己ウィルスベクタ一のうち、 アデノウイルスの感^ ίί率が他のウィルスベクター を用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、 この観点からは、 アデノウィ ルスべク夕一系を用いること力好ましし、。  It is known that the adenovirus susceptibility of if virus vectors is much higher than when other virus vectors are used. From this viewpoint, Adenovirus vector is used. I like that power.
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入 する i η ν i ν ο法、及び、 ヒ卜からある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療 剤を該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻す e X V i V 0法がある （日経サイェン ス、 1994年 4月号、 20— 45頁、 月刊薬事、 36 (1) , 23 -48 (199 4)、 実験医学増刊、 12 (15) 、 （1994) 、 日本遺伝子治療学会編 遺伝子 治療開発研究ハンドブック、 ェヌ 'ティ一 'エス、 1999)。 本発明では、 i n v i v o法が好ましい。  Examples of the method for introducing the gene therapy agent of the present invention into a patient include an i η ν i ν ο method in which the gene therapy agent is directly introduced into the body, and a method in which certain types of cells are removed from a human and the gene therapy agent is added outside the body. There is an eXViV0 method that introduces the cells into the cells and returns the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994) ), Experimental Medicine Special Edition, 12 (15), (1994), Handbook of Gene Therapy Development Research, edited by the Japanese Society of Gene Therapy, N'TIS, 1999). In the present invention, the invivo method is preferred.
患者への投与部位としては、 生体内で発現した HGFが作用を発揮し、 ALSの進行を抑 制し得るような投与経路であれば、 いかなる投与経路であっても良い。一般的には、 皮下投与、皮内投与、 静脈内投与、 動脈内投与、 筋肉内投与、 局所注入、 脳室内投与 、 循内投与などが挙げられる。 さらに、 体内に埋め込まれた装置を介した投与経路 も挙げられ、具体的には、 ォスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投 与する手法や、 徐放性製剤 （例えばミニペレツト製剤） を患部近くに埋め込む手法な どが挙げられる。  The administration site to the patient may be any administration route as long as HGF expressed in the living body exerts an action and can suppress the progress of ALS. In general, examples include subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, and circulatory administration. In addition, there are also administration routes via devices implanted in the body. Specific examples include a method in which an osmotic pump or the like is used to continuously and gradually administer the disease to the affected area, and a sustained-release preparation (for example, a minipellet). Formulation) is implanted near the affected area.
このうち脊髄内投与は、 脊髄内の運動ニューロンに本発明の製剤を直接到達させる ことが出来るため、 好ましい投与経路である。  Of these, intraspinal administration is a preferred route of administration because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord.
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態 （例えば液剤など） をとり得る。 例えば有効^^である遺伝子を含有する 剤とされた場合、 当該 ¾t 剤は常法により調製すること力でき、例えば適切な溶剤（PBS等の緩衝液、 生理食 ^ΤΚ.滅菌水等） に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、 次いで無 菌的な容器に充填することにより調製することができる。 当該注射剤には に応じ て慣用の担体等を加えても良い。 また、 H V J—リボソーム等のリボソームにおいて は、懸濁剤、 ？東結剤、遠心分離濃縮?棗結剤などのリボソーム製剤の形態とすることが できる。 As the formulation, various formulations (for example, liquids, etc.) suitable for each of the above administration forms can be taken. For example, in the case of a drug containing an effective ^^ gene, the drug can be prepared by a conventional method. For example, it can be prepared in an appropriate solvent (buffer such as PBS, physiological food ^ ΤΚ. Sterile water, etc.). After dissolution, if necessary, the mixture may be sterilized by filtration with a filter or the like, and then filled in a sterile container to prepare the composition. Depending on the injection Conventional carriers and the like may be added. For ribosomes such as HVJ-ribosomes, suspending agents,? It can be in the form of ribosome preparations such as east binding agent, centrifugal concentrated and jujube binding agent.
製剤中の D N Aの含量は、 治療目的の疾患、 患者の年齢、体重等により適宜調節す ることができる力 通常、 本発明の D NAとして 0. 0 0 0 1— 1 0 O m g、 好まし くは 0. 0 0 1— 1 0 m gでぁり、 これを数日ないし数ケ月に 1回投与するの力好ま しい。  The DNA content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient. Usually, the DNA of the present invention is preferably 0.0001 to 100 mg. It is recommended that the dose be 0.0 0.01 to 10 mg, administered once every few days or months.
さらに、 前述の HGFタンパクの場合と同様に、本発明においては、 脊髄における HGF の発現レベルが、 HGF遺伝子投与前の 2倍以上となるような量を投与することからなる 、 ALSの治療剤をも提供するものである。 実施例  Further, as in the case of the above-described HGF protein, the present invention provides a therapeutic agent for ALS comprising administering an amount such that the expression level of HGF in the spinal cord is twice or more that before administration of the HGF gene. Is also provided. Example
以下、 例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの 例により なんら限定されるものではない。  Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.
材料及び方法 Materials and methods
(1)トランスジエニックマウス  (1) Transgenic mouse
トランスジヱニック G93Aマウス（ （SOD G93A) lGurdl) を Jackson Laboratoryから 購入した (Science, 264 1772-1775(1994))。維持のために、 才ス G93Aマウスをメス C5 7B6マウスと交配し、 PCRおよびドット—ブロットハイブリダイゼ一シヨンによって遺 伝子型を決定した。  Transgenic G93A mice ((SOD G93A) lGurdl) were purchased from Jackson Laboratory (Science, 264 1772-1775 (1994)). For maintenance, G93A mice were bred to female C57B6 mice and genotyped by PCR and dot-blot hybridization.
KT3ェピ卜ープでタグ化した全長ラッ卜 HGF cDNA (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 8 7, 3200-3204(1990)) を PCRによって増幅し、 pNSE- Exベクタ一 （Doherty博士により提 供） 内のニューロン特異的エノラ一ゼプロモータ一 （Neuron, 18, 231-241(1997) ：)の 下流に挿入した。 サブクロ一ニングのために、 リンカ一の付加によって Not Iサイトを pNSE- Exベクタ一に導入した。 その後、 プラスミ ドの全塩基配列を確認した。 HGF- KT3 は、 DCK細胞の遊走ァッセィおよび海馬ニューロン初代培養の in vitro生存ァッセィ において、 ヒト組換え体 HGFと同様の活性を示した。すでに記述した手法 (J. Cell. Biol .， 128, 185 - 199(1995)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A.， 95， 5269- 5274(1998))にわずかな 改良を加えてトランスジヱニックマウスを作製し、 トランスジーンの組み込みについ て 斤した。 簡単に記すと、 トランスジエニックカセットを Sal I制限酵素処理によつ てべクタ一から切り取り、 DNAを、遺伝的背景が G93Aトランスジヱニックマウスと一致 している C57B6の胚に注入した。 トランスジーンの組み込みを、 トランスジーン中の SV 40 ポリ （A)配列を用いた PCRおよびドット—ブロットにより確認した。外来 HGFの発 現は、 HGF-KT3 cDNAの 3' 末端および SV40ポリ （A) シグナル配列の 5' 領域をカバーす るプローブを用いて、 RNaseプロテクションアツセィによって調べた。 A full-length rat HGF cDNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3200-3204 (1990)) tagged with KT3 epitope was amplified by PCR, and the pNSE-Ex vector (Dr. Doherty) The DNA was inserted downstream of the neuron-specific enolase promoter (Neuron, 18, 231-241 (1997) :). For subcloning, a Not I site was introduced into the pNSE-Ex vector by adding a linker. Thereafter, the entire nucleotide sequence of the plasmid was confirmed. HGF-KT3 showed the same activity as human recombinant HGF in the migration assay of DCK cells and the in vitro survival assay of primary culture of hippocampal neurons. The method described previously (J. Cell. Biol., 128, 185-199 (1995), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95, 5269-5274 (1998)) Transgenic mice were made with improvements and weighed for transgene incorporation. Briefly, the transgenic cassette was excised from the vector by treatment with Sal I restriction enzyme, and DNA was injected into C57B6 embryos whose genetic background was consistent with the G93A transgenic mouse. Transgene integration was confirmed by PCR and dot-blot using the SV40 poly (A) sequence in the transgene. Expression of exogenous HGF was determined by RNase protection assay using a probe covering the 3 'end of HGF-KT3 cDNA and the 5' region of the SV40 poly (A) signal sequence.
NSE-HGFトランスジエニックマウスの子孫を G93Aトランスジエニックマウスと交配し た。 1つの親からの子を表現型カ壞れるまで同じケージで飼育した。 表現型の最初の兆 候の後、 動物を分離しておいた。 エサと水は摂取しやすくするため、 ケージの底部に 置いた。動物がその体を 30秒以内で立てられない時、 この時間を死亡時間として使用 した。  Progeny of NSE-HGF transgenic mice were crossed with G93A transgenic mice. Offspring from one parent were kept in the same cage until the phenotype was destroyed. After the first signs of the phenotype, the animals were isolated. Food and water were placed at the bottom of the cage for easy access. This time was used as the death time when the animal could not stand its body within 30 seconds.
(2)前角での HGFおよび c一 met RNAの  (2) HGF and c-met RNA at the anterior horn
«の前角に対する定量的なコンペティティブ" RT— PCRを、 すでに報告された手法（ Brain Res. Brain Res. Protoc. , 5, 190- 197(2000))に従って行つた。  «Quantitative Competitive for Anterior Horns> RT—PCR was performed according to the previously reported procedure (Brain Res. Brain Res. Protoc., 5, 190-197 (2000)).
(3) RNaseプロテクションァッセィ  (3) RNase protection assay
RNaseプロテクシヨンアツセィを、 すでに記載したように (J. Cell. Biol.， 123, 455-46 5(1993)、 Science, 268, 1495-1499(1995))、 RPAIIリボヌクレア一ゼプロテクションァ ッセィキット （Ambion, Austin, TX) を用いて行った。 HGF mRNAに特異的なアンチセ ンス cRMプロ一ブを調製するために、 HGF- KT- 3- polyAの HGF3'末端から polyA配列の部 分を含む 326bp断片を、 pGEM-Tベクタ一内に挿入した。 プラスミ ドを直線化し、 a - [32 P] CTPの存在下で転写し、 調製された cRNAプローブをハイブリダィゼ一シヨンのため に使用した。 外来性 HGF RNAは 326bpのプロテクトバンドを与え、 内在性 HGF RNAは KT - 3 およびポリ （A) 配列を欠いているのでより短いプロテクトバンド （251bP) を与える o The RNase protection assay was performed as previously described (J. Cell. Biol., 123, 455-465 (1993), Science, 268, 1495-1499 (1995)), using the RPAII ribonuclease protection assay kit ( Ambion, Austin, TX). To prepare an antisense crM probe specific for HGF mRNA, a 326 bp fragment containing the polyA sequence from the HGF 3 'end of HGF-KT-3-polyA was inserted into the pGEM-T vector. . Plasmids were linearized, transcribed in the presence of a- [ 32 P] CTP, and prepared cRNA probes were used for hybridization. Exogenous HGF RNA gave protected band of 326 bp, endogenous HGF RNA is KT - gives 3 and poly (A) because it lacks a sequence shorter protection band (251b P) o
(4)行動試験  (4) Behavior test
行動試験を 6家系からのそれぞれの表現型の 15動物で行った。 マウスをそのしっぽで 空中に吊したときに後肢の伸張が通常観察される。運動二ユーロン痴齊のマウスは、 後肢の退縮を共通して示す。 スコアは伸張後肢の数に対応する。 ロータ一ロッド試験 のために、 マウスを 202ΓΡΙΠで回転しているロッドにおいた。 ロッドに残ったそれぞれの マウスの持続時間を測定した。動物がロッド上に 4分間残ることができた場合、試験を 4分で終了し、 4分として記録した。 »を、 その後足を黒色インクに浸した後、 マウ スを直線経路上で歩かせることで収集した。歩幅を通常歩行を示している領域内で測 した。 Behavioral tests were performed on 15 animals of each phenotype from 6 families. Hind limb extension is usually observed when the mouse is hung in the air with its tail. Exercise two euron chiji mouse Hind limb retraction is commonly shown. The score corresponds to the number of hind limbs extended. For the rotor-rod test, the mouse was placed on a rod rotating at 202 °. The duration of each mouse remaining on the rod was measured. If the animal was able to remain on the rod for 4 minutes, the test was completed in 4 minutes and recorded as 4 minutes. »Was collected by dipping the feet in black ink and then walking the mouse along a straight path. The stride length was measured in the area showing normal walking.
(5)繊学的漸  (5) Sensitivity
運動二ユーロンを計数するために、 脊髄を連銃した濃度のエタノ一ルによって固定 し、ノ、。ラフィン内に包埋した後、 L5から L4まで連続的に切断した （14 m) 。 前角にお ける （L4- L5内の）連動ニューロンの数を 7切片毎に計 20切片について計測した。前角 の定義した領域で明らかな核小体がクリス夕ルバイオレツ卜によって濃く染色された ニューロンを計数した。  The spinal cord was fixed by a double-armed concentration of ethanol to count two eurons of exercise. After embedding in raffin, it was cut continuously from L5 to L4 (14 m). The number of interlocking neurons (in L4-L5) in the anterior horn was counted for every 7 slices for a total of 20 slices. Neurons whose clear nucleoli were clearly stained by Chris Biorelet in defined areas of the anterior horn were counted.
c-Met特異的抗体 (Santa Cruz, 1： 100) 、 HGF特異的抗体 (Tokushu Meneki, 1： 1000) 、 ヒト SOD特異的抗体 (Sigma, 1： 200) 、 GFAP特異的抗体 (Sigma, 1： 1000) 、 およびカスパーゼー 1特異的抗体 (Santa Cruz, 1： 500) を、 5%ャギ血清およびマ ウス IgGブロッキング剤で 1時間 （M. 0. Mキッ卜、 Vector science) ブロッキングし た後、 室温で 1時間一 4時間、 あるいは 4°Cで一晩切片に添加した。 洗浄後、 ビォチン化 あるいは蛍光標識化 2次抗体を添加し、 15分間インキュベートした。 蛍光免疫^ のた めに、 切片をここで Hoechst33342で対比染色後、 蛍光顕微鏡下で観察した。 CCDカメラ (Haraamatsu) で蛍光画像を取り込み、 デジ夕ノレ化し、 蛍光レベルを Adobe PhotoShop を用 ヽて測定した。 ビォチン化 27欠抗体によつて認識されるシグナルを視覚化するため に、 ABC溶液を 10分間添加し、 DAB溶液内で現像した。 それぞれの ¾feの特異性を、 す でに報告された手法 (Sun et al. , 1999) により試験した。  c-Met specific antibody (Santa Cruz, 1: 100), HGF specific antibody (Tokushu Meneki, 1: 1000), human SOD specific antibody (Sigma, 1: 200), GFAP specific antibody (Sigma, 1: 1000) and caspase-1 specific antibody (Santa Cruz, 1: 500) after blocking with 5% goat serum and mouse IgG blocking agent for 1 hour (M.O.M kit, Vector science). The sections were added to the sections for 1 hour to 4 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. After washing, a biotinylated or fluorescently labeled secondary antibody was added and incubated for 15 minutes. Sections were counterstained here with Hoechst33342 for fluorescence immunization and observed under a fluorescence microscope. The fluorescence image was captured with a CCD camera (Haraamatsu), digitized, and the fluorescence level was measured using Adobe PhotoShop. To visualize the signal recognized by the biotinylated 27-deficient antibody, ABC solution was added for 10 minutes and developed in DAB solution. The specificity of each ¾fe was tested by a previously reported procedure (Sun et al., 1999).
L5ルートを解離し、 4%パラホルムアルデヒド Ζ0. 25%ダルタルアルデヒドにて一 晚固定し、 四酸化オスミウムによる氷上 2時間の後固定し、 ルートを脱水させ、 Εροη81 2に包埋した。包埋したルートを切断し （1 πι) 、 トルイジンブル一で染色した。試料 の形態を光学顕微鏡下で調べた。  The L5 route was dissociated, fixed with 4% paraformaldehyde (0.25% dartaraldehyde) for 1 hour, fixed on ice with osmium tetroxide for 2 hours, dehydrated, and embedded in Εροη812. The embedded root was cut (1πι) and stained with Tolu Zimble I. The morphology of the sample was examined under an optical microscope.
(6)細胞培養 初代星； 钿胞を、 すでに記述した手法 (Brain Res. Mol. Brain Res.， 41， 259- 268(1996 ))にわずかな改良を加えて培養した。 生後 2日の G93Aマウスあるいは野生型同腹子の大 脳皮質を解剖し、 小さな断片にした。組織ブロックを 37°C水浴内に振とうしながら 12 分間、 0. 25%卜リプシンおよび 100〃g/ml DNase Iとィンキュベートすることで分解 した。 組織をピぺッ卜で吸引することで粉砕し、 分離した細胞を、 示された細胞数で ポリ— L—オル二チンコートディッシュ上に、 10%胎児ゥシ血清を含む DF (高ダルコ一 ス MEM/HamF12, 50： 50)培地（GibCO BRL) 中にプレートした。 プレートした 7日後 細胞がコンフレントになる時、細胞を PBSで 2回洗浄し、 示された濃度の組換え HGFで処 理した。 星忱钿胞の純度は 7日間培養後には通常 95%以上であり、 形態学あるいは NSE/ GFAP二重染色で調べた。 (6) Cell culture Primary stars; cells were cultured with the previously described procedure (Brain Res. Mol. Brain Res., 41, 259-268 (1996)) with minor modifications. The cerebral cortex of G93A mice or wild-type littermates at 2 days of age was dissected into small fragments. The tissue block was degraded by incubating with 0.25% trypsin and 100 μg / ml DNase I for 12 minutes while shaking in a 37 ° C. water bath. The tissue is crushed by aspirating with a pipette and the separated cells are plated on a poly-L-ornithine-coated dish at the indicated cell number in DF containing 10% fetal bovine serum (DF MEM / HamF12, 50:50) Plated in medium (GibCO BRL). Seven days after plating When cells become confluent, cells were washed twice with PBS and treated with the indicated concentrations of recombinant HGF. The purity of the star cyst was usually 95% or higher after 7 days of culture, and was examined by morphology or NSE / GFAP double staining.
(7)ウェスタンブロッティング  (7) Western blotting
腰髄抽出液を RIPA緩衝液内で調製した。 50 ^ gの可溶化物を 10%SDS—ポリアクリル アミ ドゲル（SDS— PAGE)上で mm泳動し、 PVDF膜に移した。膜を PBS内でー晚、 5%ノ ンフアツトスキムミルクとともに 4°Cでインキュベートし、 抗ー EAAT2抗体 (1 : 2, 000 , Chemicon) を 2時間添加した。 洗浄後、 膜を HRP標識化抗モルモット IgG抗体 (1： 3 ， 000, Chemicon) とともにインキュベートし、 ECL化学蛍贩応を行った （Amersham , Buckinghamshire, UK) 。膜カヽら抗体をはずし、抗 GFAP (1： 3000, Sigma) 、抗 ヒト SOD (1： 500， Sigma) 、抗 c- Met (1： 400, Santa Curz)抗体で再プローブ化し た。 50 gの可溶化物を 12%SDS— PAGEに供し、上述したように、 リン酸化 Akt (Cell Signaling Tech. ) 、 Akt (Cell Signaling Tech. ) 、 Bcl-xL/S (Santa Cruz) およひ Έ cl-2 (Santa Cruz)抗体を添加した。バンド強度を Fluorchemイメージ科斤装置（IS - 8 000) によって測定した。  Lumbar spinal cord extract was prepared in RIPA buffer. 50 ^ g of the lysate was run on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) in mm and transferred to a PVDF membrane. The membrane was incubated in PBS at 4 ° C. with 5% non-atmospheric skim milk and anti-EAAT2 antibody (1: 2,000, Chemicon) was added for 2 hours. After washing, the membrane was incubated with HRP-labeled anti-guinea pig IgG antibody (1: 3,000, Chemicon) and subjected to ECL chemifluorescence (Amersham, Buckinghamshire, UK). The membrane cap antibody was removed and reprobed with anti-GFAP (1: 3000, Sigma), anti-human SOD (1: 500, Sigma), and anti-c-Met (1: 400, Santa Curz) antibodies. 50 g of the lysate was subjected to 12% SDS-PAGE and phosphorylated Akt (Cell Signaling Tech.), Akt (Cell Signaling Tech.), Bcl-xL / S (Santa Cruz) and Έ cl-2 (Santa Cruz) antibody was added. Band intensities were measured on a Fluorchem imager instrument (IS-8 000).
(8) HGF濃度の検出 ( 8) Detection of HGF concentration
組織あるし、は血漿中の HGFを抗ラット HGFポリク口一ナル抗体 (Tokushu Meneki, To kyo, Japan) を用いて隱結 ^^疫測定法（ELISA) の方法で測定した。 ラット HGF E LISA系は同様の親和性で、 ラッ卜とマウス HGFを特異的に検出する。  HGF in plasma was measured using the anti-rat HGF polyclonal monoclonal antibody (Tokushu Meneki, Tokyo, Japan) by the ELISA method. The rat HGF E LISA system specifically detects rat and mouse HGF with similar affinity.
(9)統計学的騰  (9) Statistical rise
統計学的比較をステューデント t一検定で行った。 生存試験のために、統計学的有意 差（pく 0. 05) はログ順位検定によって評価した。 実施例 1 Statistical comparisons were made with the Student's t-test. Statistical significance for survival test Differences (p <0.05) were evaluated by the log rank test. Example 1
G93Aトランスジエニックマウスにおける HGF及び c-Metの発現と調節  Expression and regulation of HGF and c-Met in G93A transgenic mice
G93Aトランスジエニックマウスの連動二ユーロンにおいて c - Met/HGFレセプタ一様 免^応性（c- Met - IR) 力示されるか否かを、 免疫組織学的!^斤により調べた。 その 結果、 野生型同腹子の運動ニューロンと同様に、 2ヶ月齢の G93Aマウスの運動ニューロ ンにおいて c_Met- IRが局在していることを発見した （図 1 ) 。 また G93Aマウスが末期 に達した 8ヶ月の時点で、 c- Met_IRが前角の多くの細胞で観察され、一方同齢の野生型 同腹子は 2ヶ月齢と同程度の C- Met- IRを示した （図 1 ) 。  The immunohistochemistry of the G93A transgenic mouse was examined for the presence or absence of c-Met / HGF receptor uniform responsiveness (c-Met-IR) in the paired eurones. As a result, we found that c_Met-IR was localized in the motor neurons of 2-month-old G93A mice, as in the case of wild-type littermates (Fig. 1). Eight months after G93A mice reached the terminal stage, c-Met_IR was observed in many cells in the anterior horn, while wild-type littermates of the same age had C-Met-IR comparable to those at 2 months of age. (Figure 1).
次に、 G93Aトランスジエニックマウスの^ の進行における脊髄前角内での HGFおよ び c- met mRNAの定量を、 前述のコンペティティブ T- PCRにより行い、 同齢の野生型マ ウスのそれと比較した。 その結果、 連動ニューロンが局在している脊髄の前角内にお ける c_nietおよび HGF mRNAの発現レベルは、 G93Aトランスジエニックマウスでの ALSの 進展の間に進行的に増加することが明らかになつた （図 2 )。以上の結果により、 HGF の ALS運動ニューロンでの役割力示唆された。 c Met- は、末期において、残っている 運動ニューロンのみでなく、 周辺の星状様細胞内でも発現され、 このような運動ニュ —ロン以外の細胞での HGFの役割も示唆された。 これらの結果により、 HGFが疾病の進 展を遅らせる内因性因子の一つである可能性がもたらされた。 麵例 2  Next, quantification of HGF and c-met mRNA in the anterior horn of the spinal cord in the progression of ^ in G93A transgenic mice was performed by competitive T-PCR as described above and compared with that of wild-type mice of the same age. did. The results clearly show that expression levels of c_niet and HGF mRNA in the anterior horn of the spinal cord, where the interlocking neurons are located, progressively increase during ALS development in G93A transgenic mice. Natsuta (Fig. 2). These results suggest that HGF plays a role in ALS motoneurons. c Met- is expressed not only in the remaining motoneurons but also in peripheral astrocytes at the end stage, suggesting a role for HGF in cells other than these motoneurons. These results raise the possibility that HGF may be one of the intrinsic factors slowing disease progression.麵 Example 2
ニューロン特異的に HGFを過剰発現する卜ランスジェニックマウスの作製及び特性化Generation and characterization of transgenic mice that overexpress HGF in a neuron-specific manner
HGFの ALSでの効果を検討するために、 ニューロン特異的エノラ一ゼプロモーター （N SE) を用いて、 ニューロン特異的にラット HGFを発現するトランスジヱニックマウスを 作製した。 8つの独立した HGFトランスジヱニックマウス系統の中から、神経系に特異 的にしかし比較的低レベルで外来性 HGFを特異的に発現している 1つの系統を選択した 。 図 3、図 4及び図 5に、 HGFトランスジヱニックマウス系統の特性を示す。 RNaseプロ テクシヨンアツセィにより、 外在性 HGFは、 試験した 12の lamのうち、脳と脊髄に限定 して発現していること力示された （図 3の矢印） 。 HGFトランスジヱニックマウスの組 織中、血漿中の内在性および全 HGFレベルは、 それぞれ野生型同腹子のレベルと異なら なかった （図 3及び図 4 ) 。一方、 HGFタンパク質のレベルは、 出生後の ¾1神経の主 要な分化が終了した後においてのみ、 脊髄においてマウスの成長に伴って増加した （ 図 5 ) 。 To investigate the effect of HGF on ALS, transgenic mice expressing rat HGF in a neuron-specific manner were produced using the neuron-specific enolase promoter (NSE). From eight independent HGF transgenic mouse lines, one line was selected that specifically expressed exogenous HGF at the nervous system but at relatively low levels. FIGS. 3, 4 and 5 show the characteristics of the HGF transgenic mouse strain. Exogenous HGF is restricted to the brain and spinal cord of the 12 lams tested by RNase Protection Technology It was shown that the gene was expressed (arrow in FIG. 3). During the organization of HGF transgenic mice, endogenous and total HGF levels in plasma did not differ from wild-type littermates, respectively (FIGS. 3 and 4). HGF protein levels, on the other hand, increased with mouse growth in the spinal cord only after the end of major postnatal ¾1 nerve differentiation (FIG. 5).
HGFトランスジヱニックマウスは外見上からは遺伝子型決定を行わないと、 野生型ト ランスジヱニックマウスと見分けることができなかった。 すなわち、 サイズ、 体重、 形態、 ある !/、は多くの運動二ユーロンおよび星状細胞を含んで!;、る運動神経系での振 る舞 、や変化、 調べた 、かなる 段階での筋肉の重さの違 t、は見出されなかつた。こ のことは、 達に^ #することなしに、 神経系特異的に HGFの導入が成功してしヽること を示している （図 6〜図 10および図 19、 図 20参照） 。 難例 3  HGF transgenic mice could not be distinguished from wild-type transgenic mice without genotyping. That is, size, weight, morphology, is! /, Contains many motor neurons and astrocytes !; behaves in the motor nervous system, changes, examines, and muscles at a significant stage The difference in weight of t was not found. This suggests that HGF can be successfully introduced into the nervous system without the need to reach them (see FIGS. 6 to 10 and FIGS. 19 and 20). Difficult case 3
ALSに対する HGFの効果の検討 (1)  Examination of the effect of HGF on ALS (1)
ALSでの HGFの役割を検討するために、 HGFトランスジエニックマウスのヘテロザィゴ ―ト（+/- )を G93Aマウスのヘテロザィゴ一トひ/-)と交配し、 これによつて ALSのニュー ロンへ直接的に HGFを導入したトランスジエニックマウスを作製した。 なお前記交配に より、 4つの異なったマウスの群、 すなわち野生型 （ff) 、 HGFのみに対するトランスジ ヱニック （HGF) 、 G93Aのみに対するトランスジヱニック （G93A) 、 および G93Aおよび HGF両方に対する二重卜ランスジヱニック （G93A/HGF) 力、'生成される。  To examine the role of HGF in ALS, heterozygous (+/-) HGF transgenic mice were bred to heterozygous cells in G93A mice (//), thereby transducing ALS neurons. Transgenic mice into which HGF was directly introduced were prepared. It should be noted that the cross resulted in four different groups of mice: wild type (ff), transgenic for only HGF (HGF), transgenic for G93A only (G93A), and double transgenic for both G93A and HGF. Transgenic (G93A / HGF) power, 'generated.
まず、 HGFの発現が運動ニューロンに対する神経保護効果を発揮するかどうかを、 組 織学的解析により検討した。結果を図 6及び図 7に示す。 クリスタルバイオレツ卜に よって染色された末期の腰髄の前角のパラフィン切片 （14〃m) は、 G93Aマウス （G93A ) の運動ニューロンの数が明らかに減少しており、残っている運動ニューロンも萎縮 した形態を示していた （図 6) 。一方、二重トランスジエニック同腹子 (G93A/HGF) は 、 G93Aマウスのそれよりも明らかに多くの健康的な形態を持つ脊髄運動ニューロンを 保持した （図 6) 。 野生型および HGF単独トランスジエニックマウスは、 同様の数の健 康な運動ニューロンを示した （図 6)。 次に、 各マウスそれぞれの群毎 6匹の独立した動物を用いて、 腰髄の運動ニュ一ロン 数を 的に比較した。 その結果、 G93Aマウスは 6ヶ月齢で腰髄の運動ニューロンを欠 失し始め、 そして 8ヶ月齢で、 野生型あるいは HGF単独トランスジエニック同腹子の運 動ニューロンと比較して、 G93Aマウスの運動二ユーロンは 40 %しか残って ヽなかつた (図 7) 。 対照的に二重トランスジエニック同腹子は、 G93Aトランスジエニックマウス と比較して、運動ニューロンの数が明らかに改善されることカヾ示された （図 7) 。 First, whether HGF expression exerted a neuroprotective effect on motor neurons was examined by histological analysis. The results are shown in FIGS. A paraffin section (14 m) of the anterior horn of the late lumbar spinal cord stained with crystal violet shows a clear decrease in the number of motoneurons in G93A mice (G93A), as well as the remaining motoneurons. It showed a shrunken form (Fig. 6). On the other hand, double transgenic littermates (G93A / HGF) retained spinal motoneurons with clearly more healthy morphology than those of G93A mice (FIG. 6). Wild-type and HGF-only transgenic mice showed similar numbers of healthy motor neurons (Figure 6). Next, the number of motor neurons in the lumbar spinal cord was compared with each other using 6 independent animals in each group of each mouse. As a result, G93A mice began to lack lumbar spinal motoneurons at 6 months of age, and at 8 months of age, G93A mice motility compared to that of wild-type or HGF-only transgenic littermates. Two euros were left with only 40% (Figure 7). In contrast, double transgenic littermates were shown to have significantly improved motor neuron numbers compared to G93A transgenic mice (FIG. 7).
HGFの運動ニューロンに対する生存促進活性が、 ニヮトリ胚において腰部レべノレと頸 部レべノレ間で異なることが示されているので、次に、 HGFの導入が頸部レベルで運動二 ュ一ロンの死を減ずることができるかどうかも試験した。 その結果、 G93Aマウスにお いて、頸部運動ニューロンの 55%力 8ヶ月齢で残っていた。腰部のレベルでのものより もより少な！;、数の頸部レベルでの運動ニュー口ンの死は、 本モデノレマウスの特徴であ る。二重卜ランスジェニックマウスでは頸部レベルにおし、てもあきらカ、により多い数 (87. 8±2. 4%) の運動ニューロンが残っており、 このことは HGFが腰部および頸部 運動二ユーロン両方に効果的であることを示している。  Second, HGF transduction was demonstrated at the cervical level, as the survival-promoting activity of HGF on motoneurons has been shown to differ between lumbar and cervical levels in chick embryos. Was also tested for their ability to reduce their deaths. As a result, in G93A mice, 55% of cervical motoneurons remained at 8 months of age. Less than at the waist level! The death of motorized mouths at the cervical level is characteristic of the present model mice. At the cervical level, a higher number (87.8 ± 2.4%) of motoneurons remained at the cervical level in the double transgenic mice, indicating that HGF had lumbar and cervical motility. It is effective for both euros.
次に、 各マウスそれぞれの群毎に少なくとも 3匹の独立したマウスを用いて、 軸索変 性に対する HGFの効果を |¾織学的解析により検討した。 前根の大口径軸索の変性が 8ケ 月齢の G93Aマウスで見られ（図 9 ) 、一方、二重トランスジヱニック同腹子では前根 の軸索変性は穏やかであり、 前根のほとんどが悪ィ匕していない形態を示した。 また後 根は、 G93Aマウスでは中程度の変性を示したのに対し、二重トランスジヱニック同腹 子での形態は視覚的に正常であった （図 9 ) 。 これらは HGFが前根および後根の両方の 変性を効果的に防ぐことを示している。 さらに、 末期の二重トランスジヱニックマウ スでは、 前根が悪い場合でも、後根の同様な健康な形態を示した。 したがって、 HGFは 運動ニューロンのみに対してではなく、 ALS関連神経毒性に関する DRG感覚神経に対し ても神経保護効果を発揮することが示された。 さらに、 HGFの神鎮呆護効果はまた、 腓 腹筋重量の減少の遅延効果からも示された （図 8 ) 。 実施例 4  Next, the effect of HGF on axonal degeneration was examined by histological analysis using at least three independent mice in each group of each mouse. Degeneration of the large caliber axons of the anterior root was observed in 8-month-old G93A mice (Fig. 9), while the axon degeneration of the anterior root was mild in double transgenic littermates, and most of the anterior root Showed the form which did not evil. The dorsal root showed moderate degeneration in G93A mice, whereas the morphology of double transgenic littermates was visually normal (FIG. 9). These indicate that HGF effectively prevents both frontal and dorsal root degeneration. In addition, late-stage transgenic mice showed a similar healthy form of the dorsal root, even when the anterior root was bad. Thus, HGF was shown to exert neuroprotective effects not only on motor neurons but also on DRG sensory neurons for ALS-related neurotoxicity. In addition, the protective effect of HGF on dementia was also demonstrated by a delayed effect on the reduction of gastrocnemius muscle weight (FIG. 8). Example 4
ALSに対する HGFの効果の検討 (2) HGFの導入により、 麻痺の開始、寿命および ALSの運動能力を改善することができる かどうかを、先の 4種のマウスを用いて試験した。 Examination of the effect of HGF on ALS (2) The introduction of HGF was tested in the above four mice to determine whether it could improve the onset of paralysis, longevity and the motor performance of ALS.
麻痺の開始は、 ヘテロザィゴ一ト（+/- )G93Aマウスで平均年齢 243. 8±4. 7日 （平均 土標準偏差、 中央値 =242±14日） で観察され、 一方、二重トランスジエニックマウス (G93A/HGF)では、 この開始は明らかに遅く、年齢 271. 9±5. 6日 （中 直 282. 5±9 . 5日、 p=0. 004) から起こった （図 11) 。  Onset of paralysis was observed in heterozygous (+/-) G93A mice at an average age of 243.8 ± 4.7 days (mean S.D., median = 242 ± 14 days), while double transgenes In nick mice (G93A / HGF), this onset was apparently later, occurring at an age of 271.9 ± 5.6 days (middle: 282.5 ± 9.5 days, p = 0.004) (FIG. 11). .
また死亡の開始としては、 G93Aマウスの平均生存日数は 259. 5±5. 0日 （中：^直=2 59±11日） であった。一方二重トランスジエニックマウスでは 286. 8±6. 5日まで引 き延ばされ、平均練で 27. 3日の延命が示された （中央値 =294±14. 5日、 p=0. 00 3、 図 12) o  As for the onset of death, the average survival time of G93A mice was 259.5 ± 5.0 days (middle: ^ direct = 259 ± 11 days). On the other hand, double transgenic mice were prolonged to 286.8 ± 6.5 days and showed a mean survival of 27.3 days (median = 294 ± 14.5 days, p = 0 00 00, Fig. 12) o
さらに後肢伸張 寸、 口一夕一ロッド上での保持時間、歩幅の測定によって運動能 力を試験した。 HGF単独トランスジエニックマウスは運動機能において野生型同腹子と 明らかな違いは示さなかった。一方 G93Aマウスは 5ヶ月齢から後肢伸張度の、 6ヶ月齢 からロータ一ロッド能力の、 そして 7ヶ月齢から歩幅の進行性の減少を示した。一方、 二重トランスジエニックマウスでは試験したすべての機能的なパラメ一夕において、 G 93Aよりも非常にゆつくりとした減少を示した （図 13〜図 15) 。  In addition, motor ability was tested by measuring hind limb extension, mouth-to-mouth retention time on rod, and stride length. HGF-only transgenic mice did not show any significant differences in motor function from wild-type littermates. G93A mice, on the other hand, showed a progressive decrease in hind limb extension from 5 months of age, rotor-rod performance from 6 months of age, and stride length from 7 months of age. On the other hand, the double transgenic mice showed much slower reductions than G93A in all functional parameters tested (Figures 13-15).
図 10は、 ALS進行の間の 4つの群での ¾1の HGFタンパク質レべノレを示したものである 。 HGFレベルは HGFトランスジエニックマウスおよび G93A/HGF同腹子で 2ヶ月と 6ヶ月で 約 2倍高く、 このことは少量の HGFの追加カ^ケ月時の運動機能を十分に改善し、 1ヶ月 の ^を引き延ばすことを示している。 しかし 8ヶ月時の G93A/HGF二重トランスジェニ ックでの HGFの十分でない産出、 すなわち HGF、 G93Aおよび G93A/HGFでの HGFのレべノレは 末期で同一であることは、 その後の ALSの不完全な改善を反映する可能性があり、 より 高 ヽレベルでの HGFの発現が望まれる。  FIG. 10 shows the HGF protein levels of ¾1 in four groups during ALS progression. HGF levels were approximately twice as high in HGF transgenic mice and G93A / HGF littermates at 2 months and 6 months, indicating a significant improvement in motor function during the additional months of the addition of small amounts of HGF. Indicates that ^ is to be elongated. However, the inadequate production of HGF in the G93A / HGF double transgenic at 8 months, i.e., the HGF levels in HGF, G93A and G93A / HGF were terminally identical, suggesting that ALS Higher levels of HGF expression may be desirable as they may reflect incomplete improvements.
以上のように、 HGF遺伝子の ALS二ユーロンでの発現により、 ALSでの寿命および運動 機能を明らかに改善することが示された。 例 5  As described above, it was shown that the expression of the HGF gene in ALS two euron significantly improved the lifespan and motor function in ALS. Example 5
ALSに対する HGFの作用メカニズムの検討 (1) 二重トランスジエニックマウスにおける運動二ユーロン死の減少、運動および感覚 軸索の変性の減少、 および運動機能のゆつくりとした減少に対する可能性のあるメカ 二ズムを検討するため、 すなわち、 導入された HGFが ALSの最初の事象を変化させるの か、後期の事象を変化させるのか、 又は特定の事象に することなく；^進行の速 さを改善させるのかを検討するために、 まず疾病のもっとも早期の兆候の 1つを試験し た。 変異 S0D1の凝集が動物モデルでもっとも早期の事象であると報告されており、 ま た SOD 1の凝集が家族性 ALS患者で観察されている。 Examination of the mechanism of action of HGF on ALS (1) To investigate possible mechanisms for reduced motor diuron death, reduced motor and sensory axon degeneration, and a slower decrease in motor function in double transgenic mice, i.e. To determine whether HGF alters the first, late, or specific events of ALS; One of the early signs was tested. Aggregation of mutant S0D1 has been reported to be the earliest event in animal models, and aggregation of SOD1 has been observed in familial ALS patients.
循抽出液中の変異 S0D1の総量を、 ヒト S0D1抗体に対して特異的な、 したがって内 在性のマウス S0D1ではなく変異ヒト S0D1のみを認識する抗体を用いて、 ィムノブロッ ティングによって調べた。 それぞれの群毎 3匹の独立した動物を試験した。 G93Aと二重 トランスジエニックマウス両方において変異 S0D1を 2ヶ月齢から検出した。 そして変異 S0D1の総量は、 同様の時間経過で、 G93Aと二重卜ランスジエニックマウス両方で増加 した。 G93Aマウスでの変異 S0D1の総量は HGF同腹子のそれとは異ならなかった （図 17) 次に、 SOWの凝集について検討した。 脊髄での変異 S0D1の凝集が、 G93Aマウスにお いて 4ヶ月齢程度の初期段階で優先的に前角にて検出され、 また凝集の量は動物か末期 となった 8ヶ月齢で明らかに増加した （図 16) 。二重トランスジエニックマウスでの変 異 S0D1の凝集は 4ヶ月齢で G93A同腹子での凝集に匹敵し （図 16) 、 特異的免疫応答性は 野生型ある ヽは HGF単独トランスジヱニック同腹子では検出されなかつた。 二重トラン スジヱニックマウスでの変異 S0D1の凝集は 8ヶ月で明らかに増加し （図 16) 、 量は G93A 同腹子と比較してわずかに少ないように見え、 しかしながら違いはとても小さかった o これらの結果は、 HGFはこのモデルでの神経毒性の起源と の最初の事象を改善し ないことを示した。  The total amount of mutant S0D1 in the circulating extract was determined by immunoblotting using an antibody specific for the human S0D1 antibody and thus recognizing only the mutant human S0D1, but not the endogenous mouse S0D1. Three independent animals from each group were tested. Mutation S0D1 was detected in both G93A and double transgenic mice from 2 months of age. And the total amount of mutant S0D1 increased in both G93A and double transgenic mice over a similar time course. The total amount of mutant S0D1 in G93A mice was not different from that of HGF littermates (FIG. 17). Next, SOW aggregation was examined. Aggregation of mutant S0D1 in the spinal cord is preferentially detected in the anterior horn at an early stage of about 4 months in G93A mice, and the amount of aggregation clearly increases at 8 months of age, when the animal is at the end of life (Fig. 16). Aggregation of mutant S0D1 in double transgenic mice was comparable to that of G93A littermates at 4 months of age (Figure 16), with specific immunoreactivity wild-type. Not detected in child. Aggregation of mutant S0D1 in double transgenic mice clearly increased at 8 months (Figure 16), and the amount appeared to be slightly less than in G93A littermates, but the difference was very small. The results showed that HGF did not improve the first event with a source of neurotoxicity in this model.
力スノ、°—ゼ- 1が ALSの進行に重要な役割を果たしていると考えられている （Nature, 3 88, 31(1997)、 J. Exp. Med.， 185, 933-940(1997)) 。 従って HGFがカスパーゼ - 1の誘導を 改善できるかどうかを、抗—カスパーゼー 1抗体、 および成熟ニューロンを染色する抗 一チューブリン I II抗体を用いた二重ラベル免疫組織化学法により調べた。  It is thought that force snow and ° -ze-1 play an important role in the progression of ALS (Nature, 388, 31 (1997), J. Exp. Med., 185, 933-940 (1997) ). Therefore, the ability of HGF to improve caspase-1 induction was examined by a dual-label immunohistochemistry method using an anti-caspase-1 antibody and an anti-tubulin I II antibody that stains mature neurons.
カスパーゼ一 1—免疫応答性（カスパーゼー 1— IR) は、試験したいかなる時間にお いても野生型と HGF同腹子両方で検出限界以下であった。 G93Aマウスでは、 カスパーゼ 一 1一 IRは 6ヶ月時に大チューブリン III免疫 ¾fe細胞で特異的に誘導され、 また共局在 した。 このことは運動ニューロンでのカスパーゼ— 1の誘導を示している。 G93Aでの力 スパ一ゼー 1のレベルは 8ヶ月時に減少し、 かすかなカスパーゼ— 1― IRのみが検出され た。二重トランスジヱニックマウスでは、 6ヶ月齢で、 大チューブリン III免疫応答性 細胞において、 G93Aマウスと比較して非常に弱いカスパーゼー 1一 IRを示し、 このこと は HGF力 ALSの中期にお 、て連動ニュー口ンでのカスパーゼー 1の誘導のレベルを減少さ せることを示している。 Caspase 1—Immune responsiveness (Caspase 1—IR) was measured at any time tested. However, in both wild-type and HGF littermates, it was below the detection limit. In G93A mice, caspase-111 IR was specifically induced and co-localized at 6 months by large tubulin III immunized fe cells. This indicates induction of caspase-1 in motor neurons. Force at G93A Spaspase 1 levels decreased at 8 months, and only faint caspase-1-IR was detected. Double transgenic mice at 6 months of age showed very weak caspase-11 IR in large tubulin III immunoreactive cells compared to G93A mice, indicating that HGF-induced It has been shown to reduce the level of caspase-1 induction in interlocking new mouths.
Aktのリン酸化が大脳皮質ニューロンと腎臓上皮細胞での HGFの生存促進活性に関与 することが示され、 そして HGFは劇症肝炎モデルの肝臓で Be xL発現を誘導し、 多量の アポト一シスを阻止すること力示されている（Biochem. Biophys. Res. Commun. , 244, 683- 690(1998)、 Hepatology，30, 15 9(1999))。 そこでアポトーシスを減少させる HGFの メ力二ズムをさらに解明するために、 Aktのリン酸化およひ ¾cl- 2ファミリ一遺伝子の 調節を調べた。  Phosphorylation of Akt has been shown to be involved in HGF survival-promoting activity in cerebral cortical neurons and renal epithelial cells, and HGF induces BexL expression in the liver of fulminant hepatitis models, resulting in abundant apoptosis. It has been shown to block (Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 159 (1999)). To further elucidate the mechanism of HGF that reduces apoptosis, we investigated Akt phosphorylation and regulation of the ¾cl-2 family gene.
ウェスタンブロッ卜において、 Aktそれ自身の量はいかなる同腹子においても変化せ ず、 対照的に Aktは、 8ヶ月時の G93A/HGFマウスの で特異的に、 明らかにリン酸化 されていることが示された （図 18)。 HGFマウスの «でのかなり低いレべノレの Aktリ ン酸化は、二重トランスジヱニックマウスのレベルよりも低い HGFマウスでの c- Metの レベルを反映している可能性がある （図 21) 。 これらの結果は、 HGFが部分的に Aktの 活性化を通して生存促進活性を示すことを示している。  In Western blots, the amount of Akt itself did not change in any littermates, in contrast, indicating that Akt was clearly phosphorylated specifically in G93A / HGF mice at 8 months. (Figure 18). Significantly lower levels of Akt phosphorylation in HGF mice may reflect lower levels of c-Met in HGF mice than in double transgenic mice (Figure twenty one) . These results indicate that HGF exhibits pro-survival activity, in part, through activation of Akt.
Beト xLおよび 1-2タンパク質は 8ヶ月齢での脊髄では誘導されなかった （図 18)。 以上の実験により、 HGFは、運動ニューロンでのカスパーゼー 1誘導を防止すること で、 また ¾1での Aktのリン酸化によって、 ALSの進行を減少させることが示された。 麵例 6  Beto xL and 1-2 proteins were not induced in the spinal cord at 8 months of age (Figure 18). These experiments indicate that HGF reduces ALS progression by preventing caspase-1 induction in motor neurons and by phosphorylating Akt at ¾1.麵 Example 6
ALSに対する HGFの作用メ力二ズムの検討 (2)  Examination of mechanism of action of HGF on ALS (2)
ダル夕ミン酸仲介興奮毒性が、 グルタミン酸クリアランスの減少によって ALSの運動 ニューロン変性に関与することカヾ指摘されている。 この仮説と一致して、散発性 ALSの 患者の脊髄および運動皮質で、 グルタミン酸輸送活性が明らかに減少し (N. Engl. J. Med . , 326, 1464-1468(1992))、星怃钿胞に局在し、 グル夕ミン酸作動性神経毒性を抑制す るための主要な輸送体であると考えられているグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体 (EAAT2/GLT-1) に対する免疫応答が選択的に消滅したこと (Ann. Neurol.， 38, 73-84(19 95))が報告されている。 また、 ALSモデルである G85R型トランスジヱニックマウスでの EAAT2の減少や (Neuron, 18， 327-338(1997)、 ALSでの S0D1変異（A4Vおよび I113T) に関 連したグリァ細胞グルタミン酸輸送体の不活性化 (Nat Neurosci. , 2, 27-433(1999))も 報告されている。 このように、 グルタミン酸作動性興奮毒性は ALSの運動ニューロン変 性にお ヽて役割を果たしていると考えられているため、 HGFの前記 ΕΑΑΤ2への関与を検 討した。 It has been pointed out that dalminic acid-mediated excitotoxicity is involved in motor neuron degeneration in ALS by reducing glutamate clearance. Consistent with this hypothesis, sporadic ALS Glutamate transport activity is clearly reduced in the spinal cord and motor cortex of the patient (N. Engl. J. Med., 326, 1464-1468 (1992)), localized in stellate cells, and glutamate-activated Selective extinction of the immune response to the glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1), which is considered to be the primary transporter of sexual neurotoxicity (Ann. Neurol. 38, 73-84 (1995)). In addition, EAAT2 was reduced in G85R transgenic mice, an ALS model (Neuron, 18, 327-338 (1997)), and glial cell glutamate transporters associated with the S0D1 mutation (A4V and I113T) in ALS were also investigated. Glutamatergic excitotoxicity is thought to play a role in ALS motoneuron degeneration (Nat Neurosci., 2, 27-433 (1999)). Therefore, the involvement of HGF in ΕΑΑΤ2 was examined.
まず、 c_Met- IRか'反応性星状細胞に局在するかどうか、 HGFが星 钿胞の病原性 (pa thogenesis)及び反応性星状細胞のグルタミン酸輸送体のレベルを変化させるかどう かを調べた。抗 GFAPおよび抗 c- Met抗体を用いた脊髄の二重染色により、 c_Met_IRは、 残っている大ニューロンと GFAP陽性反応性星状細胞に局在することを明らかにした。 免疫組織化学的な結果と矛盾することなしに、 G93Aマウスおよび二重トランスジェニ ックマウスでの c-Metのレベルが特に 8ヶ月時に増加し （図 21、 下ハ。ネル） 、運動ニュ —ロンだけでなく星状細胞も 8ヶ月時（末期） の ALSで、 HGFに対する標的でありうるこ とが示唆された。  First, whether c_Met-IR or 'reactive astrocytes are localized, and whether HGF alters the pathogenicity of astrocytes and the level of glutamate transporters in reactive astrocytes. Examined. Double staining of the spinal cord with anti-GFAP and anti-c-Met antibodies revealed that c_Met_IR was localized to the remaining large neurons and GFAP-positive reactive astrocytes. Consistent with immunohistochemical results, c-Met levels in G93A and double transgenic mice increased, especially at 8 months (Figure 21, lower panel), and only motor neurons. However, it was suggested that astrocytes but not astrocytes could be targets for HGF in ALS at 8 months (late stage).
野生型あるいは HGF単独トランスジエニックマウスにおいて、 星状細胞は主に白質で 中心管近くに局在し、 しかしわずかに前角に局在していた （図 19)。 G93Aマウスにお ける反応性星状細胞は、運動ニューロン死がまだ G93Aマウスで認められない時である 6 ヶ月齢時に、前角において進行的に増加した （図 19) 。 対照的に、二重トランスジヱ ニック同腹子では、前角における反応性星状細胞の数は著しく少なかった （図 19)。 G FAP- IRの反応性強度の定量により、 6および 8ヶ月齢の G93Aマウスのそれと比較して、 それぞれ前角での免疫応答活¾*力約 40%および 60%少ないことが示された （図 20) 次に 2、 6及び 8ヶ月時の各マウス脊髄の EAAT2、 GFAPおよび c- Metの免疫プロッティン グを行つた結果、 G93Aマウスおよび G93A/HGFマウス両方での 6ヶ月時からの GFAPの誘導 と、 8ヶ月の G93Aマウスでの特異的な EAAT2のダウンレギュレーション、 そして 8ヶ月の G93Aおよび G93A/HGFマウスでの特異的な c- Metのァップレギュレーションが示された。 また G93A/HGFマウスにお 、ては EAAT2の総レベルが 8ケ月時におしヽて保たれて 、た。 In wild-type or HGF-only transgenic mice, astrocytes were predominantly white matter and localized near the central canal, but slightly in the anterior horn (Figure 19). Reactive astrocytes in G93A mice progressively increased in the anterior horn at 6 months of age, when motor neuron death was not yet observed in G93A mice (FIG. 19). In contrast, double transgenic littermates had significantly lower numbers of reactive astrocytes in the anterior horn (FIG. 19). Quantification of the reactivity intensity of G FAP-IR showed that the immune response activity in the anterior horn was about 40% and 60% lower than that of 6 and 8 month old G93A mice, respectively ( (Fig. 20) Next, EAAT2, GFAP and c-Met immunoblotting of the spinal cord of each mouse at 2, 6 and 8 months were performed, and as a result, GFAP of both G93A mice and G93A / HGF mice from 6 months was Guidance And specific down-regulation of EAAT2 in 8-month G93A mice and specific c-Met up-regulation in 8-month G93A and G93A / HGF mice. In G93A / HGF mice, the total level of EAAT2 was maintained at 8 months.
8ヶ月齢での G93Aマウスでの EAAT2のレベルは、 野生型あるいは HGF単独トランスジェ ニック同腹子のそれと比較して、 40%明ら力、に減少していた （図 22) 。対照的に、 二 重トランスジエニックマウスは野生型ある 、は HGF単独トランスジエニックマウス同腹 子と比較して、 腰髄でより高いレベルの EAAT2 (140%) を示した （図 22) 。 個々の星 状細胞での EAAT2のレベルを評価するために、 EAAT2のレベルを GFAPのレベルで割つた 。 EAAT2の 11%のみカ G93Aマウスで残っており、一方 63%の EAAT2力二重トランスジヱ ニックマウスで残っていた （図 22) 。星状細胞増加は 6ヶ月で始まるにもかかわらず、 星状細胞での EAAT2の減少および c-Metの誘導は末期にのみパラレルに起こることは、 価値のある記録である。  EAAT2 levels in G93A mice at 8 months of age were reduced by 40%, compared to those of wild-type or HGF-only transgenic littermates (FIG. 22). In contrast, double transgenic mice were wild-type or showed higher levels of EAAT2 (140%) in the lumbar spinal cord compared to littermates of transgenic mice with HGF alone (FIG. 22). To assess EAAT2 levels in individual astrocytes, EAAT2 levels were divided by GFAP levels. Only 11% of EAAT2 remained in mosquito G93A mice, while 63% remained in EAAT2 double transgenic mice (FIG. 22). Although astrocytosis begins at six months, it is a worthwhile record that EAAT2 depletion and c-Met induction in astrocytes only occur in late stages in parallel.
次に、 初代培養星状細胞に対する HGFの作用を検討した結果、 HGF処理により G93Aマ ウスおよび野生型同腹子両方からの初代培養星状細胞での EAAT2レベルが増加すること が明らかとなった （図 23及び図 24) 。 このことは星状細胞での EAAT2の減少の防止は、 直接的に星状細胞での HGFの活性によることを示している。  Next, a study of the effects of HGF on primary cultured astrocytes revealed that HGF treatment increased EAAT2 levels in primary cultured astrocytes from both G93A mice and wild-type littermates ( Figures 23 and 24). This indicates that prevention of EAAT2 loss in astrocytes is directly due to HGF activity in astrocytes.
以上のように、二重トランスジエニックマウスが末期でさらに機能的な星状細胞を 保持する一方、 G93Aマウスがグノレ夕ミン酸クリアランスの観点において、 能的星 状細胞を過剰産出することが示された。 実施例 7  As described above, it is shown that the G93A mouse overproduces active astrocytes from the viewpoint of guanolemic acid clearance while the double transgenic mice retain more functional astrocytes at the end stage. Was done. Example 7
H G F投与又は H G F遺伝子導入による A L Sの進行抑制効果  HGS administration or HGF gene transfer suppresses ALS progression
ALSのモデルマゥスである G93Aマウスにおし、て、 ALSの症状が認められ始めた 6ヶ月齢 時より、 HGFタンパク製剤を適当な投与回数、脊髄内などの適当な部位へ連日投与する 。 その際、 HGFタンパクを含まない製剤を投与した群を対照群として用いる。 さらに投 与量、投与回数などを評価する場合、適宜投与量、投与回数を変えた群を用いる。 そ の後、 HGF投与群と対照群のそれぞれにおいて、実施例 3及び 4に記載されたような ALS の進行抑制効果等を検討する。 HGF投与群におし、て ALS進行抑制効果か 、められること により、 HGFが ALSの治^^となることが確認される。 In a G93A mouse, which is a model mouse for ALS, an HGF protein preparation is administered daily at an appropriate frequency and at an appropriate site, such as in the spinal cord, at the age of 6 months when ALS symptoms begin to be observed. At that time, a group to which a preparation containing no HGF protein was administered is used as a control group. Further, when evaluating the dose and the number of administrations, use a group in which the dose and the number of administrations are appropriately changed. Thereafter, the effect of suppressing the progression of ALS as described in Examples 3 and 4 is examined in each of the HGF administration group and the control group. The effect of inhibiting ALS progression in the HGF administration group This confirms that HGF can cure ALS.
さらに、 HGFの代わりに HGF遺伝子を用いて同様の実験を行うことにより、 HGF遺伝子 が ALSの治¾¾となること力 雀言忍される。 製剤例 1 Furthermore, by performing a similar experiment using the HGF gene instead of the HGF, the ability of the HGF gene to cure ALS can be reduced. Formulation Example 1
Figure imgf000029_0001
0 Oml中に HGFlmg、 マンニトール 1 g及びポリソルベート 8 0 1 Omgを含む溶液を無菌的に調製し、 1 m 1ずつバイアルに分注した後、 ？泉結 乾燥して密封することにより凍結乾'廳剤を得た。 製剤例 2
Figure imgf000029_0001
A solution containing 1 mg of HGF, 1 g of mannitol and 81 mg of polysorbate in 0 Oml was aseptically prepared, and dispensed into vials in 1 ml portions. Izumi Yuzuki was dried and sealed to obtain a freeze-dried preparation. Formulation Example 2
0. 02Mリン酸緩衝液（0. 15M NaC l及び0. 01%ポリソルべ一ト 80 含有、 H7. 4) 10 Om 1中に HGF lmg及びヒト血清アルブミン 10 Omg を含む水溶液を無菌的に調製し、 1mlずつバイアルに分注した後、 凍結乾燥して密 封することにより 結乾^ ¾剤を得た。 産 の利用可能性  0.02M phosphate buffer (containing 0.15M NaCl and 0.01% polysorbate 80, H7.4) Aseptically prepare an aqueous solution containing 1 mg of HGF and 10 Omg of human serum albumin in 10 Om1 Then, 1 ml of the solution was dispensed into vials, lyophilized, and sealed to obtain a dry agent. Availability
本発明により、 HGF及び/又は HGF遺伝子を有効成分とする ALSの治療剤 （進行抑制剤 )が提供される。 HGFは、運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、星状細 胞においてダル夕ミン酸輸送体のレべノレを保つことによる運動ニューロンに対するグ ルタミン酸細胞毒 I生の間接的な改善作用の 2つの作用を通して、 ALSの運動機能と寿命 を改善する効果を有する。 このような、二重機能性 (bifunctional) の増殖因子は従 来は知られておらず、 従って、 HGF及び/又は HGF遺伝子は従来にない効果的な治；^ IJ として有効に用いられる。  According to the present invention, a therapeutic agent (progression inhibitor) for ALS comprising HGF and / or an HGF gene as an active ingredient is provided. HGF exerts direct neurotrophic factor activity on motoneurons and an indirect amelioration of glutamate cytotoxin I production on motoneurons by retaining the dalminic acid transporter level in astrocytes. It has the effect of improving the motor function and lifespan of ALS through two actions. Such bifunctional growth factors have not been known so far, and therefore, HGF and / or the HGF gene can be effectively used as an unprecedented effective treatment; ^ IJ.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1. HG F及び Z又は H G F遺伝子を有効 として含有する、 筋萎縮性側索硬化 症（ALS)治翻。 1. Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) translation containing the HGF and Z or HGF genes as effective.
2. HGF及び/又は HGF遺伝子を有効 として含有する、 A LSの進行抑制 剤。 2. An ALS progress inhibitor containing HGF and / or HGF gene as effective.
3. H GF及び/又は H G F遺伝子を有効成分として含有する、運動ニューロンに おけるカスパーゼー 1の誘導抑制剤。  3. An inhibitor of caspase-1 induction in motor neurons, comprising an HGF and / or HGF gene as an active ingredient.
4. HGF及び/又は HGF遺伝子を有効 として含有する、 種における Ak tのリン酸化促進剤。  4. An Akt phosphorylation promoter in a species, which effectively contains HGF and / or the HGF gene.
5. HG F及び/又は H G F遺伝子を有効成分として含有する、星状細胞における グリァ細胞特異的グルタミン酸輸送体 (EAAT2/GLT-1)の減少抑制剤。  5. An agent for suppressing reduction of glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1) in astrocytes, comprising an HGF and / or HGF gene as an active ingredient.
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