JP2011173916A - Therapeutic agent of amyotrophic lateral sclerosis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳ）治療剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor、肝細胞増殖因子）及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分とするＡＬＳ治療剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for amyotrophic lateral sclerosis (hereinafter ALS). More specifically, the present invention relates to an ALS therapeutic agent containing HGF (Hepatocyte Growth Factor) and / or HGF gene as an active ingredient.
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの進行性喪失および運動神経の軸索変性によって特徴づけられる深刻な神経変性疾患であり、結果として運動機能障害および寿命の短縮を導く。ALS患者の約15％は家族性のALS（FALS）であり、FALSの約15％から25％がCu2＋/Zn2＋スーパーオキシドジスムターゼ（SOD1）をコードしている遺伝子内に変異を有している。高レベルで変異SOD1タンパク質及びその活性を有するトランスジェニックマウスは、家族性および散発性ALS両方と同様の疾病の進行を示すため、ALSに対するモデルとして、この変異SOD1過剰発現トランスジェニックマウスが使用されている。そして、本発明においても、変異SOD1（G93A）過剰発現トランスジェニックマウスであるG93Aマウス(Science,264,1772-1775(1994))を使用した。 Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a serious neurodegenerative disease characterized by progressive loss of motor neurons and axonal degeneration of motor nerves, resulting in motor dysfunction and shortening of lifespan. About 15% of ALS patients have familial ALS (FALS), and about 15% to 25% of FALS have mutations in the gene encoding Cu2 + / Zn2 + superoxide dismutase (SOD1) Yes. Transgenic mice with high levels of mutant SOD1 protein and its activity show disease progression similar to both familial and sporadic ALS, so this mutant SOD1 overexpressing transgenic mouse was used as a model for ALS. Yes. In the present invention, G93A mice (Science, 264, 1772-1775 (1994)), which are transgenic mice that overexpress mutant SOD1 (G93A), were used.
運動ニューロンの変性は疾病の最初の事象と考えられているので、多くの試みが、運動ニューロンの生存を直接的に助けることに焦点を置いてきた。しかしながら、これらの試みはいずれも満足のいくものではなかった。一方、Brujinらは、星状細胞中に顕著なSOD1を含んでいる封入体が臨床兆候の前に現れ、疾病進行の間に目に見えて多量に増加することを報告し、変異SOD1(G85R)過剰発現トランスジェニックマウスにおいて変異-SOD1を介する損傷に対する第1の標的として、星状細胞を指し示している(Neuron,18,327-338(1997))。したがって、星状細胞の機能を回復させ、しかも運動ニューロンの細胞死を直接的に防ぐことができる二重機能性（bifunctional）物質は、ALSの処置により最適であると考えられる。しかしながら、そのような物質は未だ報告されていない。 Since motor neuron degeneration is considered the first event of disease, many attempts have focused on directly helping motor neurons survive. However, none of these attempts were satisfactory. On the other hand, Brujin et al. Reported that inclusion bodies containing prominent SOD1 in astrocytes appear before clinical signs and are visibly increased during disease progression, with mutant SOD1 (G85R ) Pointing to astrocytes as the primary target for mutation-SOD1 mediated damage in overexpressing transgenic mice (Neuron, 18, 327-338 (1997)). Therefore, a bifunctional substance that can restore the function of astrocytes and directly prevent cell death of motoneurons is considered optimal by treatment with ALS. However, no such substance has been reported yet.
肝細胞増殖因子（HGF）は、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトージェンとして同定され、1989年にその遺伝子クローニングがなされた(Biochem.Biophys.Res.Commun.,122,1450-1459(1984)、Nature,342,440-443(1989))。HGFは肝細胞増殖因子として発見されたが、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現および機能的解析における近年の多数の研究により、HGFは新規な神経栄養因子であることが明らかにされた(Ciba. Found. Symp.,212,198-211(1997)、Nat.Neurosci.,2,213-217(1999))。HGFは海馬、大脳皮質、ドーパミン作動性中脳、小脳顆粒、感覚、運動ニューロン、交感神経神経芽細胞に対して神経栄養因子活性を示す(Ciba. Found. Symp.,212,198-211(1997)、Brain Res.Mol.Brain Res.,32,197-210(1995))。とりわけHGFは、in vitroでグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）に匹敵する、運動ニューロンに対する最も強力な生存促進因子の一つとして知られている(Neuron,17,1157-1172(1996))。発生段階の胎児脊髄運動ニューロン、および舌下神経の軸索切断後の成熟運動ニューロンに対するHGFの神経栄養因子活性が、in vivoで示されている(J.Neurosci.,20,326-337(2000)、Eur.J.Neurosci.,11,4139-4144(1999))。しかしながら、HGFのALSへの関与や、HGFの発現が実際にALSに対して効果を示したといった報告は一切なされておらず、従ってHGFがALSの治療剤となり得るか否かは何ら明らかにされていない状況にあった。 Hepatocyte growth factor (HGF) was first identified as a potent mitogen for mature hepatocytes and its gene cloning was done in 1989 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 122, 1450-1459 (1984), Nature, 342, 440-443 (1989)). Although HGF was discovered as a hepatocyte growth factor, numerous recent studies in expression and functional analysis, including knockout / knock-in mouse techniques, revealed that HGF is a novel neurotrophic factor (Ciba Symp., 212, 198-211 (1997), Nat. Neurosci., 2, 213-217 (1999)). HGF exhibits neurotrophic factor activity on hippocampus, cerebral cortex, dopaminergic mesencephalon, cerebellar granule, sensory, motor neuron, sympathetic neuroblast (Ciba. Found. Symp., 212, 198-211 (1997), Brain Res. Mol. Brain Res., 32, 197-210 (1995)). In particular, HGF is known as one of the most potent survival promoting factors for motor neurons, comparable to glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in vitro (Neuron, 17, 1157-1172 (1996)) . HGF neurotrophic factor activity has been demonstrated in vivo on developing fetal spinal motoneurons and mature motor neurons after axotomy of the hypoglossal nerve (J. Neurosci., 20, 326-337 (2000), Eur. J. Neurosci., 11, 4139-4144 (1999)). However, there has been no report regarding the involvement of HGF in ALS, and the fact that HGF expression has actually shown an effect on ALS. Therefore, it has been clarified whether HGF can be a therapeutic agent for ALS. There was no situation.
本発明は、ＡＬＳに対する新規な治療剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分とするＡＬＳ治療剤に関する。 The present invention relates to a novel therapeutic agent for ALS. More specifically, the present invention relates to an ALS therapeutic agent containing HGF and / or HGF gene as an active ingredient.
本発明者らは、まずALSのモデルマウスであるG93Aトランスジェニックマウスを用いて、HGFのALSへの関与を検討した。その結果、c-Met/HGFレセプター様免疫応答性（c-Met-IR）が、野生型同腹子の運動ニューロンと同様にG93Aトランスジェニックマウスの運動ニューロンにも局在していることを見出した。さらに、G93AトランスジェニックマウスにおけるALSの進展に伴い、脊髄前角（運動ニューロンが局在）におけるc-metおよびHGF mRNAの発現レベルがマウスの成長に伴って増加することを見出した。これらの結果により、ALSの運動ニューロンにおいてHGFが何らかの役割を果たしていることが示唆された。 The present inventors first examined the involvement of HGF in ALS using G93A transgenic mice, which are ALS model mice. As a result, it was found that c-Met / HGF receptor-like immunoreactivity (c-Met-IR) is localized in motor neurons of G93A transgenic mice as well as wild-type littermates. . Furthermore, we found that the expression level of c-met and HGF mRNA in the anterior horn of spinal cord (motor neurons were localized) increased with the growth of the mouse as ALS progressed in G93A transgenic mice. These results suggest that HGF plays some role in ALS motor neurons.
次に本発明者らは、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（NSE）を用いてニューロン特異的にラットHGFを発現するトランスジェニックマウスを作製し、当該マウスを用いて、実際にHGFがALSに対して効果を示すかどうかを検討した。その結果、HGFにより運動ニューロン死が減ぜられること、また運動ニューロンの軸索変性が抑制されることを初めて見出した。またHGFは、運動ニューロンのみならずALS関連神経毒性に関するDRG感覚神経に対しても、神経保護効果を発揮することをも見出した。さらにHGFは、神経保護効果を通して、ALSにおける筋肉喪失を遅延させる効果を有することを明らかにした。
さらに本発明者らは、HGFにより実際にALSの進行を抑制（遅延）できるか否かを前記トランスジェニックマウスを用いて検討した。その結果、極めて少量（野生型マウス及びG93Aマウスの約２倍）のHGFの発現により、驚くべきことに麻痺の開始が遅延され、寿命が延び、また運動能力が改善されることが明らかとなった。以上の知見により、HGFの発現がALSに対して治療効果を有することが、初めて明らかとなった。
Next, the present inventors created a transgenic mouse that expresses rat HGF in a neuron-specific manner using a neuron-specific enolase promoter (NSE), and using that mouse, HGF actually had an effect on ALS. Whether to show. As a result, we found for the first time that HGF reduces motor neuron death and suppresses axonal degeneration of motor neurons. We also found that HGF exerts a neuroprotective effect not only on motor neurons but also on DRG sensory nerves related to ALS-related neurotoxicity. Furthermore, HGF has been shown to have the effect of delaying muscle loss in ALS through a neuroprotective effect.
Furthermore, the present inventors examined whether the progression of ALS can actually be suppressed (delayed) by HGF using the transgenic mice. The results show that very small amounts of HGF expression (approximately twice that of wild-type and G93A mice) surprisingly delays the onset of paralysis, extends life span, and improves exercise capacity. It was. The above findings revealed for the first time that the expression of HGF has a therapeutic effect on ALS.
次に本発明者らは、HGFによるALS進行抑制のメカニズムを検討した結果、少なくとも以下の３つの新たなメカニズムにより、HGFはALS改善効果をもたらすことが示された。 Next, as a result of examining the mechanism for suppressing ALS progression by HGF, the present inventors have shown that HGF brings about an ALS improvement effect by at least the following three new mechanisms.
(1)運動ニューロンにおけるカスパーゼ−１の誘導抑制作用ALSの中期において、カスパーゼ−1が、変異SOD1を過剰発現しているトランスジェニックマウスの運動ニューロンで活性化されそして／または誘導されることが示されており(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,95,15763-15768(1998)、Science,288,335-339(2000))、またカスパーゼ−1に対するドミナントネガティブインヒビターのG93Aマウスへの導入が、約2週間死亡率をうまく遅延させたこと(Nature,388,31(1997)、J.Exp.Med.,185,933-940(1997))から、カスパーゼ−1がこの疾病の進行に重要な役割を果たしていると考えられている。そこで本発明者らはHGFがカスパーゼ-1の誘導を変化させるかどうかを検討した結果、HGFはALS運動ニューロンにおけるカスパーゼ-１の誘導を抑制する効果を有することが明らかとなった。 (1) Inhibition of caspase-1 induction in motor neurons It is shown that caspase-1 is activated and / or induced in motor neurons of transgenic mice overexpressing mutant SOD1 in the middle stage of ALS (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1563-15768 (1998), Science, 288, 335-339 (2000)), and introduction of dominant negative inhibitors against caspase-1 into G93A mice is about Caspase-1 played an important role in the progression of the disease, as it successfully delayed mortality for 2 weeks (Nature, 388, 31 (1997), J. Exp. Med., 185, 933-940 (1997)). It is believed that Therefore, the present inventors examined whether HGF changes the induction of caspase-1, and as a result, it became clear that HGF has an effect of suppressing the induction of caspase-1 in ALS motoneurons.
(2)脊髄でのAktのリン酸化作用Aktのリン酸化が大脳皮質ニューロンと腎臓上皮細胞でのHGFの生存促進活性に関与することが示されており、またHGFは劇症肝炎モデルの肝臓でBcl-xL発現を誘導し、多量のアポトーシスを阻止することが示されている(Biochem.Biophys.Res.Commun.,244,683-690(1998)、Hepatology,30,151-159(1999))。そこで本発明者らはHGF発現によりAktのリン酸化が起こるか否かを調べた結果、ALSの脊髄において特異的に、Aktのリン酸化が認められた。 (2) Phosphorylation of Akt in the spinal cord Akt phosphorylation has been shown to be involved in HGF survival-promoting activity in cerebral cortical neurons and kidney epithelial cells. It has been shown to induce Bcl-xL expression and block large amounts of apoptosis (Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 151-159 (1999)). Thus, the present inventors examined whether or not Akt phosphorylation occurs by HGF expression, and as a result, Akt phosphorylation was specifically observed in the spinal cord of ALS.
(3)反応性星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（EAAT2/GLT1）のダウンレギュレーションの抑制グルタミン酸仲介興奮毒性が、グルタミン酸クリアランスの減少によってALSの運動ニューロン変性に関与することが指摘されている。この仮説と一致して、散発性ALSの患者の脊髄および運動皮質で、グルタミン酸輸送活性が明らかに減少し(N.Engl.J.Med.,326,1464-1468(1992))、星状細胞に局在し、グルタミン酸作動性神経毒性を抑制するための主要な輸送体であると考えられているグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（EAAT2/GLT-1）に対する免疫応答が選択的に消滅したこと(Ann.Neurol.,38,73-84(1995))が報告されている。また、ALSモデルであるG85R型トランスジェニックマウスでのEAAT2の減少や(Neuron,18,327-338(1997))、ALSでのSOD1変異（A4VおよびI113T）に関連したグリア細胞グルタミン酸輸送体の不活性化(Nat.Neurosci.,2,427-433(1999))も報告されている。以上のように、グルタミン酸作動性興奮毒性はALSの運動ニューロン変性において役割を果たしていると考えられているため、本発明者らはHGFの前記EAAT2への関与を検討した。その結果、HGFはALSにおけるEAAT2のダウンレギュレーションを抑制し、ALS末期においても機能的な星状細胞を保持する機能を有することが明らかとなった。 (3) Suppression of glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT1) down-regulation in reactive astrocytes It has been pointed out that glutamate-mediated excitotoxicity is involved in motor neuron degeneration of ALS by reducing glutamate clearance Yes. Consistent with this hypothesis, glutamate transport activity was clearly reduced in the spinal cord and motor cortex of patients with sporadic ALS (N. Engl. J. Med., 326, 1464-1468 (1992)) and astrocytes The immune response to the glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1), which is thought to be a major transporter to suppress glutamatergic neurotoxicity localized in (Ann. Neurol., 38, 73-84 (1995)) has been reported. In addition, EAAT2 decreased in G85R-type transgenic mice (Neuron, 18, 327-338 (1997)), and inactivation of glial glutamate transporter associated with SOD1 mutations (A4V and I113T) in ALS (Nat. Neurosci., 2,427-433 (1999)) has also been reported. As described above, since glutamatergic excitotoxicity is thought to play a role in ALS motor neuron degeneration, the present inventors examined the involvement of HGF in the EAAT2. As a result, it was clarified that HGF has a function of suppressing down-regulation of EAAT2 in ALS and retaining functional astrocytes even at the end of ALS.
このようにHGFは、少なくとも３つのメカニズム、すなわち、運動ニューロンにおけるカスパーゼ-1の誘導を防ぐことによって、またAktのリン酸化によって、そして反応性星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（EAAT2/GLT1）のダウンレギュレーションを防ぐことによって、ALSを改善することが示された。 Thus, HGF prevents glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 /) by preventing at least three mechanisms: caspase-1 induction in motor neurons, by phosphorylation of Akt, and in reactive astrocytes. It has been shown to improve ALS by preventing down-regulation of GLT1).
以上のようにHGFは、運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、星状細胞においてグルタミン酸輸送体のレベルを保つことによる運動ニューロンに対するグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用の２つの作用を通して、ALSの運動機能と寿命を改善する効果を有する。このような、二重機能性（bifunctional）の増殖因子は従来は知られておらず、HGFが最初の例である。HGFのこれらの機能は、ALSおよび関連した運動ニューロン疾患において、HGF（遺伝子又はタンパク質）が治療的に使用できることを示している。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。 As described above, HGF has two effects, ALS, through direct neurotrophic factor activity on motor neurons and indirect improvement of glutamate cytotoxicity on motor neurons by maintaining the level of glutamate transporter in astrocytes. It has the effect of improving the motor function and life expectancy. Such a bifunctional growth factor has not been known so far, and HGF is the first example. These functions of HGF indicate that HGF (gene or protein) can be used therapeutically in ALS and related motor neuron diseases. The present invention has been completed based on the above findings.
すなわち本発明は、（１） ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、ＡＬＳ治療剤、（２） ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、ＡＬＳの進行抑制剤、（３） ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、運動ニューロンにおけるカスパーゼ−１の誘導抑制剤、（４） ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、脊髄におけるＡｋｔのリン酸化促進剤、ならびに（５） ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子を有効成分として含有する、星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（ＥＡＡＴ２／ＧＬＴ−１）の減少抑制剤、に関する。 That is, the present invention includes (1) an ALS therapeutic agent containing HGF and / or HGF gene as an active ingredient, (2) an ALS progression inhibitor containing HGF and / or HGF gene as an active ingredient, (3) An inhibitor of caspase-1 induction in motor neurons, containing HGF and / or HGF gene as an active ingredient, (4) an Akt phosphorylation promoter in spinal cord containing HGF and / or HGF gene as an active ingredient, and (5) It relates to a decrease inhibitor of glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1) in astrocytes, which contains HGF and / or HGF gene as an active ingredient.
本発明により、HGF及び／又はHGF遺伝子を有効成分とするALSの治療剤（進行抑制剤）が提供される。HGFは、運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、星状細胞においてグルタミン酸輸送体のレベルを保つことによる運動ニューロンに対するグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用の２つの作用を通して、ALSの運動機能と寿命を改善する効果を有する。このような、二重機能性（bifunctional）の増殖因子は従来は知られておらず、従って、HGF及び／又はHGF遺伝子は従来にない効果的な治療剤として有効に用いられる。 The present invention provides a therapeutic agent (progression inhibitor) for ALS comprising HGF and / or HGF gene as an active ingredient. HGF has two functions: ALS, through direct neurotrophic factor activity on motor neurons and indirect improvement of glutamate cytotoxicity on motor neurons by maintaining glutamate transporter levels in astrocytes. Has the effect of improving life. Such a bifunctional growth factor has not been known so far, and therefore HGF and / or HGF gene can be effectively used as an unprecedented effective therapeutic agent.
本発明において使用されるＨＧＦは公知物質であり、その塩基配列及びアミノ酸配列は、Nature,342,440(1989)、特許第2777678号公報、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967(1989)、Biochem.Biophys.Res.Commun.,172,321(1990)などに記載されている。当該ＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。また既に市販されている製品（例えば、東洋紡Code No.HGF-101等）を使用することもできる。 HGF used in the present invention is a known substance, and its base sequence and amino acid sequence are Nature, 342, 440 (1989), Japanese Patent No. 2777678, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321 (1990). If the said HGF was refine | purified to the grade which can be used as a pharmaceutical, what was prepared by the various method can be used. In addition, products already available on the market (for example, Toyobo Code No. HGF-101) can be used.
ＨＧＦの製造法としては、例えば、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦを得ることができる。また、遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えHGFを得ることができる（例えば Nature,342,440(1989)、特開平5-111383号公報、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967(1989)など参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞などを用いることができる。ここで動物細胞としては、CHO細胞やCOS細胞、又はマウスC127細胞などが挙げられる（いずれもATCC等から入手可能）。このようにして得られたHGFは、天然型HGFと実質的に同じ作用を有する限り、天然型HGFに類似の構造を有するものであっても良い。すなわち、１）前記HGFのcDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質や、２）前記HGFのアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、などのうち、HGFとしての作用を有するタンパク質であれば、本発明のHGFの範疇に含まれる。ここで前記１）及び２）のタンパク質をコードするDNAは、例えば部位特異的突然変異誘発法、PCR法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的にはMolecular Cloning 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書を参考にして行うことができる。 As a method for producing HGF, for example, primary cultured cells or established cells that produce HGF can be cultured, separated from the culture supernatant, etc., and purified to obtain the HGF. In addition, the gene encoding HGF is incorporated into an appropriate vector by genetic engineering techniques, transformed into a suitable host, and the desired recombinant HGF is obtained from the culture supernatant of the transformant. (See, for example, Nature, 342, 440 (1989), Japanese Patent Laid-Open No. 5-111383, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), etc.). The host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques such as Escherichia coli, yeast or animal cells can be used. Examples of animal cells include CHO cells, COS cells, and mouse C127 cells (all available from ATCC, etc.). The HGF thus obtained may have a structure similar to that of natural HGF as long as it has substantially the same action as natural HGF. That is, 1) a protein encoded by DNA that hybridizes with the HGF cDNA under stringent conditions, or 2) one or more (preferably several) amino acids are substituted for the amino acid sequence of the HGF. Of the proteins composed of deleted and / or added amino acid sequences, and the like, any protein having an action as HGF is included in the category of HGF of the present invention. Here, the DNA encoding the proteins 1) and 2) can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or usual hybridization, and specifically, Molecular Cloning 2nd. This can be done with reference to basic books such as Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
本発明は、HGFがALSの治療剤、具体的にはALSの進行抑制剤となることを初めて明らかにしたものである。HGFは、運動ニューロンに対する直接的神経栄養因子活性と、星状細胞においてグルタミン酸輸送体のレベルを保つことによる運動ニューロンに対するグルタミン酸細胞毒性の間接的な改善作用の２つの作用を通して、ALSの運動機能と寿命を改善する効果を有する。このような、二重機能性（bifunctional）の増殖因子は従来は知られておらず、HGFが最初の例である。HGFはこれら２つの作用を発揮することにより、ALSおよび関連した運動ニューロン疾患の進行を遅延・抑制することができる。 The present invention is the first to clarify that HGF is a therapeutic agent for ALS, specifically, an ALS progression inhibitor. HGF has two functions: ALS, through direct neurotrophic factor activity on motor neurons and indirect improvement of glutamate cytotoxicity on motor neurons by maintaining glutamate transporter levels in astrocytes. Has the effect of improving life. Such a bifunctional growth factor has not been known so far, and HGF is the first example. By exerting these two actions, HGF can delay / suppress the progression of ALS and related motor neuron diseases.
HGFのALSに対する作用機序としては、HGFは、少なくとも以下の３つの作用を発揮することによって、ALS改善効果を示すと考えられる。
(1)運動ニューロンにおけるカスパーゼ−１の誘導抑制作用(2)脊髄でのAktのリン酸化作用(3)反応性星状細胞におけるグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（EAAT2/GLT1）のダウンレギュレーションの抑制作用
As a mechanism of action of HGF on ALS, it is considered that HGF exhibits an ALS improving effect by exerting at least the following three actions.
(1) Inhibition of caspase-1 induction in motor neurons (2) Phosphorylation of Akt in the spinal cord (3) Inhibition of downregulation of glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT1) in reactive astrocytes Action
このような作用を有する内因性増殖因子は今まで知られておらず、HGFが、前記作用を有することを示した最初の増殖因子である。HGFは、これらの作用を発揮することにより、ALSおよび関連した運動ニューロン疾患の進行を遅延・抑制することができる。ここでALSに関連した運動ニューロン疾患としては、進行性棘筋（spinal muscular）萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化、小児性及び若年性筋萎縮、フォジオ-ロンデ症候群、シャルコー・マリー・ツース病などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 Endogenous growth factors having such an action have not been known so far, and HGF is the first growth factor which has been shown to have the above action. By exerting these actions, HGF can delay or suppress the progression of ALS and related motor neuron diseases. Here, motor neuron diseases related to ALS include progressive spinal muscular atrophy, progressive bulbar paralysis, primary lateral sclerosis, pediatric and juvenile muscular atrophy, Fogio-Ronde syndrome, Charcot-Marie Examples include, but are not limited to, tooth disease.
本発明の治療剤は種々の製剤形態（例えば液剤、固形剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるHGFのみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、HGFを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等でろ過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のHGFの含量としては、通常0.0002〜0.2（W/V%）程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。 The therapeutic agent of the present invention can take various preparation forms (for example, liquids, solids, etc.), but is generally an injection with only the active ingredient HGF or a conventional carrier. The injection can be prepared by a conventional method. For example, HGF is dissolved in an appropriate solvent (for example, sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc.), then sterilized by filtration with a filter or the like, and then sterile. It can be prepared by filling a container. The content of HGF in the injection is usually adjusted to about 0.0002 to 0.2 (W / V%), preferably about 0.001 to 0.1 (W / V%).
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいても良い。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。 In formulating, a stabilizer is preferably added, and examples of the stabilizer include albumin, globulin, gelatin, mannitol, glucose, dextran, ethylene glycol and the like. Furthermore, the preparation of the present invention may contain additives necessary for formulation, for example, excipients, solubilizers, antioxidants, soothing agents, tonicity agents and the like. In the case of a liquid preparation, it is desirable to store it after removing moisture by freeze storage or freeze drying. The freeze-dried preparation is used by re-dissolving and adding distilled water for injection at the time of use.
本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与される。投与経路としては、HGFが作用を発揮し、ALSの進行を抑制し得るような投与経路であれば、いかなる投与経路であっても良い。一般的には、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、局所注入、脳室内投与、脊髄内投与などが挙げられる。さらに、体内に埋め込まれた装置を介した投与経路も挙げられ、具体的には、オスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与する手法や、徐放性製剤（例えばミニペレット製剤）を患部近くに埋め込む手法などが挙げられる。このうち脊髄内投与は、脊髄内の運動ニューロンに本発明の製剤を直接到達させることが出来るため、好ましい投与経路である。 The preparation of the present invention is administered by an appropriate administration route according to the form of the preparation. The administration route may be any administration route as long as HGF exerts its action and can suppress the progression of ALS. In general, subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, intraspinal administration and the like can be mentioned. Furthermore, the administration route through a device implanted in the body is also mentioned. Specifically, a method of gradually and gradually administering to the affected area using an osmotic pump or the like, or a sustained-release preparation (for example, a mini-pellet preparation) ) Is embedded near the affected area. Among these, intrathecal administration is a preferable administration route because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord.
投与量としては、患者の症状、年齢、体重などにより適宜調節されるが、通常HGFとして0.001mg〜1000mg、好ましくは0.01mg〜100mgであり、これを１日１回〜数回に分けて投与するのが適当である。 The dosage is appropriately adjusted according to the patient's symptoms, age, weight, etc., but is usually 0.001 mg to 1000 mg, preferably 0.01 mg to 100 mg as HGF, and is administered once to several times a day. It is appropriate to do.
また、以下の実施例に記載されたように、極めて少量のHGFの発現により、ALSが改善されることが示された。すなわち、野生型マウス及びG93Aトランスジェニックマウスの脊髄でのHGF発現量の約２倍のHGF発現レベルにより、ALSの症状が認めはじめられる時期である6ヶ月時の運動機能を十分に改善し、またマウスにおいて1ヶ月の寿命を引き延ばしたことが示された。従って、本発明のHGF製剤は、ALS患者に対して、少なくとも脊髄中でのHGF発現レベルが、HGF投与前の2倍以上となるような量で、投与されることが好ましい。本発明においては、このような、脊髄におけるHGFの発現レベルが、HGF投与前の2倍以上となるような量を投与することからなる、ALSの治療剤をも提供するものである。 Moreover, as described in Examples below, it was shown that ALS is improved by the expression of a very small amount of HGF. That is, the HGF expression level approximately twice the HGF expression level in the spinal cord of wild-type mice and G93A transgenic mice sufficiently improved the motor function at 6 months, when ALS symptoms begin to appear, It was shown to prolong the life span of 1 month in mice. Therefore, the HGF preparation of the present invention is preferably administered to ALS patients in such an amount that the HGF expression level in the spinal cord is at least twice that before HGF administration. The present invention also provides a therapeutic agent for ALS comprising administering such an amount that the expression level of HGF in the spinal cord is twice or more that before administration of HGF.
さらに近年、HGF遺伝子を用いた遺伝子治療に関する報告がなされており（Circulation,96,No3459(1997)、Nature Medicine,5,226-230(1999)、Circulation,100,No.1672(1999)、Gene Therapy,7,417-427(2000）などを参照)、また技術的にも確立された技術となっている。本発明においては、前述のようなHGFタンパクの投与のみならず、HGF遺伝子を導入することからなるALSの遺伝子治療剤をも包含するものである。以下、HGFの遺伝子治療につき記述する。 In recent years, reports on gene therapy using the HGF gene have been made (Circulation, 96, No 3459 (1997), Nature Medicine, 5, 226-230 (1999), Circulation, 100, No. 1672 (1999), Gene Therapy, 7,417-427 (2000), etc.), and is also a technically established technology. The present invention includes not only the administration of the HGF protein as described above but also an ALS gene therapy agent consisting of introducing an HGF gene. The following describes HGF gene therapy.
本発明において使用される「HGF遺伝子」とは、HGF（HGFタンパク）を発現可能な遺伝子を指す。具体的には、Nature,342,440(1989)、特許第2777678号公報、Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967(1989)、Biochem.Biophys.Res.Commun.,172,321(1990)などに記載のHGFのcDNAを後述の如き適当な発現ベクター（非ウイルスベクター、ウイルスベクター）に組み込んだものが挙げられる。ここでHGFをコードするcDNAの塩基配列は、前記文献に記載されている他、Genbank 等のデータベースにも登録されている。従ってこれらの配列情報に基づき適当なDNA部分をPCRのプライマーとして用い、例えば肝臓や白血球由来のmRNAに対してRT-PCR反応を行うことなどにより、HGFのcDNAをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。 The “HGF gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing HGF (HGF protein). Specifically, HGF described in Nature, 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321 (1990), etc. In which the cDNA is incorporated into an appropriate expression vector (non-viral vector, viral vector) as described below. Here, the base sequence of cDNA encoding HGF is described in the above-mentioned document, and is also registered in databases such as Genbank. Therefore, HGF cDNA can be cloned by using an appropriate DNA portion as a PCR primer based on these sequence information and performing, for example, RT-PCR reaction on mRNA derived from liver or leukocytes. These clonings can be easily carried out by those skilled in the art according to basic books such as Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
さらに、本発明のHGF遺伝子は前述のものに限定されず、発現されるタンパク質がHGFと実質的に同じ作用を有する遺伝子である限り、本発明のHGF遺伝子として使用できる。すなわち、１）前記cDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAや、２）前記cDNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、などのうち、HGFとしての作用を有するタンパクをコードするものであれば、本発明のHGF遺伝子の範疇に含まれる。ここで前記１）及び２）のDNAは、例えば部位特異的突然変異誘発法、PCR法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Molecular Cloning等の基本書を参考にして行うことができる。 Furthermore, the HGF gene of the present invention is not limited to those described above, and can be used as the HGF gene of the present invention as long as the expressed protein is a gene having substantially the same action as HGF. That is, 1) DNA that hybridizes with the cDNA under stringent conditions, or 2) one or more (preferably several) amino acids are substituted or deleted from the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA. In addition, DNA encoding a protein having an added amino acid sequence, and the like encoding a protein having an action as HGF are included in the category of the HGF gene of the present invention. Here, the DNAs 1) and 2) can be easily obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR, or ordinary hybridization, and specifically, the basic documents such as Molecular Cloning. Can be done with reference to.
本発明のHGF遺伝子は、前述のHGFタンパクと同様の疾患に適用することができる。また、HGF遺伝子とHGFタンパクは独立して使用することもできれば、両者を併用して用いることも可能である。 The HGF gene of the present invention can be applied to the same diseases as the aforementioned HGF protein. Further, the HGF gene and the HGF protein can be used independently or both can be used in combination.
次に、本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、導入形態および導入量等について記述する。 Next, the gene introduction method, the introduction form, the introduction amount, etc. used in the gene therapy of the present invention will be described.
前記遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いた場合と、ウイルスベクターを用いた場合の二つに大別され、実験手引書などにその調製法、投与法が詳しく解説されている（別冊実験医学,遺伝子治療の基礎技術,羊土社,1996、別冊実験医学,遺伝子導入＆発現解析実験法,羊土社,1997、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス,1999）。以下、具体的に説明する。 When administering a gene therapy agent containing the above gene as an active ingredient to a patient, the administration form is roughly divided into two cases, using a non-viral vector and using a viral vector, and is described in an experiment manual, etc. The preparation method and administration method are explained in detail (separate volume experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996, separate volume experimental medicine, gene transfer & expression analysis experiment method, Yodosha, 1997, Japanese gene therapy Gene Therapy Development Research Handbook, NTS, 1999). This will be specifically described below.
Ａ．非ウイルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現ベクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。細胞への遺伝子導入法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。また、組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソーム（internal type liposome）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（electrostatic type liposome）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（HVJ-AVEリポソーム法）、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等のいずれかの方法に供することにより、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。
A. When a non-viral vector is used, a target gene can be introduced into a cell or tissue by the following method using a recombinant expression vector in which the target gene is incorporated into a conventional gene expression vector. Examples of the method for introducing a gene into a cell include a lipofection method, a phosphate-calcium coprecipitation method, a DEAE-dextran method, and a direct DNA injection method using a micro glass tube. In addition, gene transfer methods to tissues include gene transfer methods using internal type liposomes, gene transfer methods using electrostatic type liposomes, HVJ-liposome method, and improved HVJ-liposome method (HVJ). -AVE liposome method), receptor-mediated gene introduction method, method of transferring DNA molecules with cells (metal particles) with a particle gun, direct introduction of naked-DNA, introduction method using positively charged polymer, etc. By using the method, it is possible to incorporate the recombinant expression vector into cells.
このうちＨＶＪ−リポソームは、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan : ＨＶＪ）とを融合させたものである。当該ＨＶＪ−リポソーム法は従来のリポソーム法と比較して、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とするものであり、好ましい導入形態である。ＨＶＪ−リポソームの調製法については文献（実験医学別冊,遺伝子治療の基礎技術,羊土社,1996、遺伝子導入＆発現解析実験法,羊土社,1997、J.Clin.Invest.93,1458-1464(1994)、Am.J.Physiol.271,R1212-1220(1996)）などに詳しく述べられているため、それらを参照されたい。なおＨＶＪとしてはＺ株（ATCCより入手可能）が好ましいが、基本的には他のＨＶＪ株（例えば ATCC VR-907や ATCC VR-105など）も用いることができる。さらに、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法は、上記手法のうち最も簡便な手法であり、この観点から好ましい導入法である。 Among them, HVJ-liposomes are obtained by encapsulating DNA in liposomes made of a lipid bilayer, and further fusing the liposomes with inactivated Sendai virus (Hemagglutinating virus of Japan: HVJ). The HVJ-liposome method is characterized by a very high fusion activity with the cell membrane as compared with the conventional liposome method, and is a preferable introduction form. For the preparation method of HVJ-liposomes, refer to the literature (Experimental Medicine separate volume, Basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996, Gene transfer & expression analysis experiment method, Yodosha, 1997, J.Clin.Invest.93,1458- 1464 (1994), Am. J. Physiol. 271, R1212-1220 (1996)) and the like. The HVJ is preferably a Z strain (available from ATCC), but basically other HVJ strains (eg, ATCC VR-907 and ATCC VR-105) can also be used. Furthermore, the direct introduction method of naked-DNA is the simplest method among the above methods, and is a preferable introduction method from this viewpoint.
ここで用いられる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Gene 108,193-200(1991)）や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）などの発現ベクターが挙げられる。 The expression vector used here may be any expression vector as long as it can express the target gene in vivo. For example, pCAGGS (Gene 108,193-200 (1991)) or pBK-CMV , PcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene) and the like.
Ｂ．ウイルスベクターを用いる場合
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。前記ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
B. When using a viral vector, a typical method using a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus is used as the viral vector. More specifically, for example, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, shinbis virus, Sendai virus, SV40, immunodeficiency virus (HIV), etc. It is possible to introduce a gene into a cell by introducing the gene of interest into a DNA virus or RNA virus of the above and infecting the cell with a recombinant virus. Among the viral vectors, it is known that adenovirus infection efficiency is much higher than when other viral vectors are used. From this viewpoint, it is preferable to use an adenoviral vector system.
本発明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁、月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）、日本遺伝子治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。 As a method for introducing the gene therapy agent of the present invention into a patient, an in vivo method in which the gene therapy agent is directly introduced into the body, or a certain cell is taken out from a human and introduced into the cell outside the body. There is an ex vivo method for returning the cells to the body (Nikkei Science, April 1994, 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine Extra Number, 12 (15) (1994), Gene Therapy Society of Japan, Gene Therapy Development Research Handbook, NTS, 1999). In the present invention, the in vivo method is preferable.
患者への投与部位としては、生体内で発現したHGFが作用を発揮し、ALSの進行を抑制し得るような投与経路であれば、いかなる投与経路であっても良い。一般的には、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、局所注入、脳室内投与、脊髄内投与などが挙げられる。さらに、体内に埋め込まれた装置を介した投与経路も挙げられ、具体的には、オスモチックポンプなどを用いて患部に連続的に徐々に投与する手法や、徐放性製剤（例えばミニペレット製剤）を患部近くに埋め込む手法などが挙げられる。このうち脊髄内投与は、脊髄内の運動ニューロンに本発明の製剤を直接到達させることが出来るため、好ましい投与経路である。 The administration site to the patient may be any administration route as long as HGF expressed in vivo exerts an action and can suppress the progression of ALS. In general, subcutaneous administration, intradermal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, local injection, intraventricular administration, intraspinal administration and the like can be mentioned. Furthermore, the administration route through a device implanted in the body is also mentioned. Specifically, a method of gradually and gradually administering to the affected area using an osmotic pump or the like, or a sustained-release preparation (for example, a mini-pellet preparation) ) Is embedded near the affected area. Among these, intrathecal administration is a preferable administration route because the preparation of the present invention can directly reach motor neurons in the spinal cord.
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態（例えば液剤など）をとり得る。例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、当該注射剤は常法により調製することができ、例えば適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。当該注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。また、ＨＶＪ−リポソーム等のリポソームにおいては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤の形態とすることができる。 As a preparation form, various preparation forms (for example, a liquid agent etc.) suitable for each of the above administration forms can be taken. For example, when an injection containing a gene which is an active ingredient is used, the injection can be prepared by a conventional method, for example, dissolved in an appropriate solvent (buffer solution such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.). Then, if necessary, it can be prepared by sterilizing by filtration with a filter or the like and then filling into an aseptic container. A conventional carrier or the like may be added to the injection as necessary. Liposomes such as HVJ-liposomes can be in the form of liposome preparations such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated freezing agent.
製剤中のＤＮＡの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常、本発明のＤＮＡとして０．０００１−１００ｍｇ、好ましくは０．００１−１０ｍｇであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。さらに、前述のHGFタンパクの場合と同様に、本発明においては、脊髄におけるHGFの発現レベルが、HGF遺伝子投与前の2倍以上となるような量を投与することからなる、ALSの治療剤をも提供するものである。 The DNA content in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age, weight, etc. of the patient, but is usually 0.0001-100 mg, preferably 0.001-10 mg as the DNA of the present invention. This is preferably administered once every several days to several months. Further, as in the case of the aforementioned HGF protein, in the present invention, an ALS therapeutic agent comprising administering an amount such that the expression level of HGF in the spinal cord is twice or more that before administration of the HGF gene. Is also provided.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
材料及び方法
(1)トランスジェニックマウストランスジェニックG93Aマウス(（SOD1-G93A）1Gurdl）をJackson Laboratoryから購入した(Science, 264, 1772-1775(1994))。維持のために、オスG93AマウスをメスC57B6マウスと交配し、PCRおよびドット−ブロットハイブリダイゼーションによって遺伝子型を決定した。
Materials and methods
(1) Transgenic mice Transgenic G93A mice ((SOD1-G93A) 1Gurdl) were purchased from Jackson Laboratory (Science, 264, 1772-1775 (1994)). For maintenance, male G93A mice were mated with female C57B6 mice and genotyped by PCR and dot-blot hybridization.
KT3エピトープでタグ化した全長ラットHGF cDNA（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87, 3200-3204(1990)）をPCRによって増幅し、pNSE-Exベクター（Doherty博士により提供）内のニューロン特異的エノラーゼプロモーター（Neuron, 18, 231-241(1997）)の下流に挿入した。サブクローニングのために、リンカーの付加によってNot IサイトをpNSE-Exベクターに導入した。その後、プラスミドの全塩基配列を確認した。HGF-KT3は、MDCK細胞の遊走アッセイおよび海馬ニューロン初代培養のin vitro生存アッセイにおいて、ヒト組換え体HGFと同様の活性を示した。すでに記述した手法(J.Cell.Biol.,128,185-199(1995)、Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,95,5269-5274(1998))にわずかな改良を加えてトランスジェニックマウスを作製し、トランスジーンの組み込みについて解析した。簡単に記すと、トランスジェニックカセットをSal I制限酵素処理によってベクターから切り取り、DNAを、遺伝的背景がG93Aトランスジェニックマウスと一致しているC57B6の胚に注入した。トランスジーンの組み込みを、トランスジーン中のSV40 ポリ（A）配列を用いたPCRおよびドット−ブロットにより確認した。外来HGFの発現は、HGF-KT3 cDNAの3’末端およびSV40ポリ（A）シグナル配列の5’領域をカバーするプローブを用いて、RNaseプロテクションアッセイによって調べた。 A full-length rat HGF cDNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3200-3204 (1990)) tagged with the KT3 epitope is amplified by PCR and is neuron specific in the pNSE-Ex vector (provided by Dr. Doherty) It was inserted downstream of the enolase promoter (Neuron, 18, 231-241 (1997)). For subcloning, a Not I site was introduced into the pNSE-Ex vector by addition of a linker. Thereafter, the entire nucleotide sequence of the plasmid was confirmed. HGF-KT3 showed similar activity to human recombinant HGF in MDCK cell migration assay and in vitro survival assay of primary culture of hippocampal neurons. Transgenic mice can be obtained by making slight improvements to the methods already described (J. Cell. Biol., 128, 185-199 (1995), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95, 5269-5274 (1998)). Were prepared and analyzed for transgene incorporation. Briefly, the transgenic cassette was excised from the vector by Sal I restriction enzyme treatment and the DNA was injected into C57B6 embryos whose genetic background was consistent with G93A transgenic mice. Transgene integration was confirmed by PCR and dot-blot using SV40 poly (A) sequences in the transgene. The expression of exogenous HGF was examined by RNase protection assay using a probe covering the 3 'end of HGF-KT3 cDNA and the 5' region of SV40 poly (A) signal sequence.
NSE-HGFトランスジェニックマウスの子孫をG93Aトランスジェニックマウスと交配した。1つの親からの子を表現型が表れるまで同じケージで飼育した。表現型の最初の兆候の後、動物を分離しておいた。エサと水は摂取しやすくするため、ケージの底部に置いた。動物がその体を30秒以内で立てられない時、この時間を死亡時間として使用した。 Offspring of NSE-HGF transgenic mice were crossed with G93A transgenic mice. Children from one parent were kept in the same cage until the phenotype appeared. After the first sign of phenotype, the animals were kept isolated. Food and water were placed at the bottom of the cage for easy consumption. This time was used as death time when the animal could not stand its body within 30 seconds.
(2)前角でのHGFおよびc−met RNAの定量脊髄の前角に対する定量的なコンペティティブRT−PCR を、すでに報告された手法(Brain Res.Brain Res.Protoc.,5,190-197(2000))に従って行った。 (2) Quantification of HGF and c-met RNA in the anterior horn Quantitative competitive RT-PCR for the anterior horn of the spinal cord was performed using a previously reported method (Brain Res. Brain Res. Protoc., 5, 190-197 (2000) ).
(3)RNaseプロテクションアッセイRNaseプロテクションアッセイを、すでに記載したように(J.Cell.Biol.,123,455-465(1993)、Science,268,1495-1499(1995))、RPAIIリボヌクレアーゼプロテクションアッセイキット（Ambion，Austin，TX）を用いて行った。HGF mRNAに特異的なアンチセンスcRNAプローブを調製するために、HGF-KT-3-polyAのHGF3'末端からpolyA配列の部分を含む326bp断片を、pGEM-Tベクター内に挿入した。プラスミドを直線化し、α-［32P］CTPの存在下で転写し、調製されたcRNAプローブをハイブリダイゼーションのために使用した。外来性HGF RNAは326bpのプロテクトバンドを与え、内在性HGF RNAはKT-3およびポリ（A）配列を欠いているのでより短いプロテクトバンド（251bp）を与える。 (3) RNase protection assay RNase protection assay was performed as described previously (J. Cell. Biol., 123, 455-465 (1993), Science, 268, 1495-1499 (1995)), RPAII ribonuclease protection assay kit (Ambion , Austin, TX). In order to prepare an antisense cRNA probe specific for HGF mRNA, a 326 bp fragment containing a portion of the polyA sequence from the HGF 3 ′ end of HGF-KT-3-polyA was inserted into the pGEM-T vector. The plasmid was linearized and transcribed in the presence of α- [ 32 P] CTP, and the prepared cRNA probe was used for hybridization. Exogenous HGF RNA gives a 326 bp protection band and endogenous HGF RNA gives a shorter protection band (251 bp) because it lacks the KT-3 and poly (A) sequences.
(4)行動試験行動試験を6家系からのそれぞれの表現型の15動物で行った。マウスをそのしっぽで空中に吊したときに後肢の伸張が通常観察される。運動ニューロン疾病のマウスは、後肢の退縮を共通して示す。スコアは伸張後肢の数に対応する。ローターロッド試験のために、マウスを20rpmで回転しているロッドにおいた。ロッドに残ったそれぞれのマウスの持続時間を測定した。動物がロッド上に4分間残ることができた場合、試験を4分で終了し、4分として記録した。足跡を、その後足を黒色インクに浸した後、マウスを直線経路上で歩かせることで収集した。歩幅を通常歩行を示している領域内で測定した。 (4) Behavioral testing Behavioral testing was performed on 15 animals of each phenotype from 6 families. Extension of the hind limb is usually observed when the mouse is hung in the air with its tail. Motor neuron disease mice commonly show regression of the hind limbs. The score corresponds to the number of stretched hind limbs. For the rotor rod test, the mouse was placed on a rotating rod at 20 rpm. The duration of each mouse remaining on the rod was measured. If the animal could remain on the rod for 4 minutes, the study was terminated in 4 minutes and recorded as 4 minutes. Footprints were collected by allowing the mouse to walk on a straight path after the foot was then dipped in black ink. The stride was measured in the area showing normal walking.
(5)組織学的解析運動ニューロンを計数するために、脊髄を連続した濃度のエタノールによって固定し、パラフィン内に包埋した後、L5からL4まで連続的に切断した（14μm）。前角における（L4-L5内の）運動ニューロンの数を7切片毎に計20切片について計測した。前角の定義した領域で明らかな核小体がクリスタルバイオレットによって濃く染色されたニューロンを計数した。 (5) Histological analysis In order to count motor neurons, the spinal cord was fixed with a continuous concentration of ethanol, embedded in paraffin, and then continuously cut from L5 to L4 (14 μm). The number of motor neurons (within L4-L5) in the anterior horn was measured for a total of 20 sections every 7 sections. Neurons with distinct nucleoli stained strongly with crystal violet in the defined area of the anterior horn were counted.
c-Met特異的抗体（Santa Cruz， 1：100）、HGF特異的抗体（Tokushu Meneki， 1：1000）、ヒトSOD特異的抗体（Sigma，1：200）、GFAP特異的抗体（Sigma， 1：1000）、およびカスパーゼ−1特異的抗体（Santa Cruz， 1：500）を、5％ヤギ血清およびマウスIgGブロッキング剤で1時間（M．O．M キット、Vector science）ブロッキングした後、室温で1時間−4時間、あるいは4℃で一晩切片に添加した。洗浄後、ビオチン化あるいは蛍光標識化2次抗体を添加し、15分間インキュベートした。蛍光免疫染色のために、切片をここでHoechst33342で対比染色後、蛍光顕微鏡下で観察した。CCDカメラ（Hamamatsu）で蛍光画像を取り込み、デジタル化し、蛍光レベルをAdobe PhotoShopを用いて測定した。ビオチン化2次抗体によって認識されるシグナルを視覚化するために、ABC溶液を10分間添加し、DAB溶液内で現像した。それぞれの染色の特異性を、すでに報告された手法（Sun et al．，1999）により試験した。 c-Met specific antibody (Santa Cruz, 1: 100), HGF specific antibody (Tokushu Meneki, 1: 1000), human SOD specific antibody (Sigma, 1: 200), GFAP specific antibody (Sigma, 1: 1000), and caspase-1 specific antibody (Santa Cruz, 1: 500) with 1% at room temperature after blocking with 5% goat serum and mouse IgG blocking agent for 1 hour (MOM kit, Vector science) Time-4 hours, or added to sections at 4 ° C overnight. After washing, a biotinylated or fluorescently labeled secondary antibody was added and incubated for 15 minutes. For fluorescent immunostaining, sections were now observed under a fluorescence microscope after counterstaining with Hoechst33342. Fluorescence images were captured with a CCD camera (Hamamatsu), digitized, and fluorescence levels were measured using Adobe PhotoShop. In order to visualize the signal recognized by the biotinylated secondary antibody, ABC solution was added for 10 minutes and developed in DAB solution. The specificity of each staining was tested by the previously reported technique (Sun et al., 1999).
L5ルートを解離し、4％パラホルムアルデヒド／0．25％グルタルアルデヒドにて一晩固定し、四酸化オスミウムによる氷上2時間の後固定し、ルートを脱水させ、Epon812に包埋した。包埋したルートを切断し（1μm）、トルイジンブルーで染色した。試料の形態を光学顕微鏡下で調べた。 The L5 root was dissociated and fixed overnight with 4% paraformaldehyde / 0.25% glutaraldehyde, post-fixed for 2 hours on ice with osmium tetroxide, the root was dehydrated and embedded in Epon812. The embedded route was cut (1 μm) and stained with toluidine blue. The sample morphology was examined under an optical microscope.
(6)細胞培養初代星状細胞を、すでに記述した手法(Brain Res.Mol.Brain Res.,41,259-268(1996))にわずかな改良を加えて培養した。生後2日のG93Aマウスあるいは野生型同腹子の大脳皮質を解剖し、小さな断片にした。組織ブロックを37℃水浴内に振とうしながら12分間、0．25％トリプシンおよび100μg/ml DNase Iとインキュベートすることで分解した。組織をピペットで吸引することで粉砕し、分離した細胞を、示された細胞数でポリ−L−オルニチンコートディッシュ上に、10％胎児ウシ血清を含むDF（高グルコースDMEM/HamF12， 50：50）培地（GibCO BRL）中にプレートした。プレートした7日後細胞がコンフレントになる時、細胞をPBSで2回洗浄し、示された濃度の組換えHGFで処理した。星状細胞の純度は7日間培養後には通常95％以上であり、形態学あるいはNSE/GFAP二重染色で調べた。 (6) Cell culture Primary astrocytes were cultured with a slight modification to the method already described (Brain Res. Mol. Brain Res., 41, 259-268 (1996)). Two-day-old G93A mice or wild-type littermates of the cerebral cortex were dissected into small pieces. Tissue blocks were degraded by incubating with 0.25% trypsin and 100 μg / ml DNase I for 12 minutes while shaking in a 37 ° C. water bath. Tissue was pulverized by aspiration with a pipette, and the separated cells were DF (high glucose DMEM / HamF12, 50:50 containing 10% fetal bovine serum on poly-L-ornithine coated dishes in the indicated number of cells. ) Plated in medium (GibCO BRL). When the cells became confluent 7 days after plating, the cells were washed twice with PBS and treated with the indicated concentrations of recombinant HGF. The astrocyte purity was usually over 95% after 7 days of culture and was examined by morphology or NSE / GFAP double staining.
(7)ウエスタンブロッティング腰髄抽出液をRIPA緩衝液内で調製した。50μｇの可溶化物を10％SDS−ポリアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）上で電気泳動し、PVDF膜に移した。膜をPBS内で一晩、5％ノンファットスキムミルクとともに4℃でインキュベートし、抗−EAAT2抗体（1：2，000， Chemicon）を2時間添加した。洗浄後、膜をHRP標識化抗モルモットIgG抗体（1：3，000， Chemicon）とともにインキュベートし、ECL化学蛍光反応を行った（Amersham， Buckinghamshire， UK）。膜から抗体をはずし、抗GFAP（1：3000， Sigma）、抗ヒトSOD（1：500， Sigma）、抗c-Met（1：400， Santa Curz）抗体で再プローブ化した。50μｇの可溶化物を12％SDS−PAGEに供し、上述したように、リン酸化Akt（Cell Signaling Tech.）、Akt（Cell Signaling Tech.）、Bcl-xL/S（Santa Cruz）およびBcl-2（Santa Cruz）抗体を添加した。バンド強度をFluorchemイメージ解析装置（IS-8000）によって測定した。 (7) Western blotting lumbar spinal extract was prepared in RIPA buffer. 50 μg of lysate was electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and transferred to a PVDF membrane. Membranes were incubated overnight at 4 ° C. with 5% non-fat skim milk in PBS and anti-EAAT2 antibody (1: 2,000, Chemicon) was added for 2 hours. After washing, the membrane was incubated with HRP-labeled anti-guinea pig IgG antibody (1: 3,000, Chemicon) and subjected to ECL chemifluorescence reaction (Amersham, Buckinghamshire, UK). The antibody was removed from the membrane and reprobed with anti-GFAP (1: 3000, Sigma), anti-human SOD (1: 500, Sigma), and anti-c-Met (1: 400, Santa Curz) antibodies. 50 μg of lysate was subjected to 12% SDS-PAGE and phosphorylated Akt (Cell Signaling Tech.), Akt (Cell Signaling Tech.), Bcl-xL / S (Santa Cruz) and Bcl-2 as described above. (Santa Cruz) antibody was added. Band intensity was measured with a Fluorchem image analyzer (IS-8000).
(8)HGF濃度の検出組織あるいは血漿中のHGFを抗ラットHGFポリクローナル抗体（Tokushu Meneki， Tokyo， Japan）を用いて酵素結合免疫測定法（ELISA）の方法で測定した。ラットHGF ELISA系は同様の親和性で、ラットとマウスHGFを特異的に検出する。 (8) Detection of HGF concentration HGF in tissue or plasma was measured by enzyme-linked immunoassay (ELISA) using anti-rat HGF polyclonal antibody (Tokushu Meneki, Tokyo, Japan). The rat HGF ELISA system specifically detects rat and mouse HGF with similar affinity.
(9)統計学的解析統計学的比較をステューデントt−検定で行った。生存試験のために、統計学的有意差（p＜0．05）はログ順位検定によって評価した。 (9) Statistical analysis Statistical comparison was performed by Student's t-test. For the survival test, statistical significance (p <0.05) was assessed by log rank test.
実施例１
G93AトランスジェニックマウスにおけるHGF及びc-Metの発現と調節
G93Aトランスジェニックマウスの運動ニューロンにおいてｃ-Met/HGFレセプター様免疫反応性（c-Met-IR）が示されるか否かを、免疫組織学的解析により調べた。その結果、野生型同腹子の運動ニューロンと同様に、2ヶ月齢のG93Aマウスの運動ニューロンにおいてc-Met-IRが局在していることを発見した（図１）。またG93Aマウスが末期に達した8ヶ月の時点で、c-Met-IRが前角の多くの細胞で観察され、一方同齢の野生型同腹子は2ヶ月齢と同程度のc-Met-IRを示した（図１）。
Example 1
Expression and regulation of HGF and c-Met in G93A transgenic mice
Whether or not c-Met / HGF receptor-like immunoreactivity (c-Met-IR) was shown in motor neurons of G93A transgenic mice was examined by immunohistological analysis. As a result, c-Met-IR was found to be localized in the motor neurons of 2-month-old G93A mice, similar to those of wild-type littermates (Fig. 1). In addition, c-Met-IR was observed in many cells in the anterior horn at 8 months when the G93A mouse reached the end stage, while the wild-type littermates of the same age were c-Met- IR was shown (Figure 1).
次に、G93Aトランスジェニックマウスの疾病の進行における脊髄前角内でのHGFおよびc-met mRNAの定量を、前述のコンペティティブRT-PCRにより行い、同齢の野生型マウスのそれと比較した。その結果、運動ニューロンが局在している脊髄の前角内におけるc-metおよびHGF mRNAの発現レベルは、G93AトランスジェニックマウスでのALSの進展の間に進行的に増加することが明らかになった（図２）。以上の結果により、HGFのALS運動ニューロンでの役割が示唆された。c-Met-IRは、末期において、残っている運動ニューロンのみでなく、周辺の星状様細胞内でも発現され、このような運動ニューロン以外の細胞でのHGFの役割も示唆された。これらの結果により、HGFが疾病の進展を遅らせる内因性因子の一つである可能性がもたらされた。 Next, the quantification of HGF and c-met mRNA within the anterior horn of the spinal cord during disease progression of G93A transgenic mice was performed by the above-mentioned competitive RT-PCR and compared with that of wild-type mice of the same age. The results revealed that c-met and HGF mRNA expression levels within the anterior horn of the spinal cord, where motor neurons are localized, progressively increased during the development of ALS in G93A transgenic mice. (FIG. 2). These results suggest the role of HGF in ALS motoneurons. c-Met-IR was expressed not only in the remaining motor neurons but also in the surrounding astroid cells at the end stage, suggesting a role for HGF in cells other than these motor neurons. These results raised the possibility that HGF may be one of the intrinsic factors that slows disease progression.
実施例２
ニューロン特異的にHGFを過剰発現するトランスジェニックマウスの作製及び特性化
HGFのALSでの効果を検討するために、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（NSE）を用いて、ニューロン特異的にラットHGFを発現するトランスジェニックマウスを作製した。8つの独立したHGFトランスジェニックマウス系統の中から、神経系に特異的にしかし比較的低レベルで外来性HGFを特異的に発現している1つの系統を選択した。図３、図４及び図５に、HGFトランスジェニックマウス系統の特性を示す。RNaseプロテクションアッセイにより、外在性HGFは、試験した12の組織のうち、脳と脊髄に限定して発現していることが示された（図３の矢印）。HGFトランスジェニックマウスの組織中、血漿中の内在性および全HGFレベルは、それぞれ野生型同腹子のレベルと異ならなかった（図３及び図４）。一方、HGFタンパク質のレベルは、出生後の脊髄神経の主要な分化が終了した後においてのみ、脊髄においてマウスの成長に伴って増加した（図５）。
Example 2
Generation and characterization of transgenic mice that overexpress HGF specifically in neurons
In order to examine the effect of HGF on ALS, transgenic mice expressing rat HGF in a neuron-specific manner were generated using a neuron-specific enolase promoter (NSE). From eight independent HGF transgenic mouse strains, one strain was selected that specifically expressed foreign HGF specifically at the nervous system but at a relatively low level. Figures 3, 4 and 5 show the characteristics of the HGF transgenic mouse strain. The RNase protection assay showed that exogenous HGF was expressed exclusively in the brain and spinal cord among the 12 tissues tested (arrows in FIG. 3). In tissues of HGF transgenic mice, plasma endogenous and total HGF levels were not different from those of wild-type littermates, respectively (FIGS. 3 and 4). On the other hand, the level of HGF protein increased with the growth of mice in the spinal cord only after the major differentiation of postnatal spinal nerves was completed (FIG. 5).
HGFトランスジェニックマウスは外見上からは遺伝子型決定を行わないと、野生型トランスジェニックマウスと見分けることができなかった。すなわち、サイズ、体重、形態、あるいは多くの運動ニューロンおよび星状細胞を含んでいる運動神経系での振る舞いや変化、調べたいかなる発達段階での筋肉の重さの違いは見出されなかった。このことは、発達に影響することなしに、神経系特異的にHGFの導入が成功していることを示している（図６〜図10および 図19、図20参照）。 HGF transgenic mice could not be distinguished from wild type transgenic mice unless genotyping was performed. That is, no differences were found in size, weight, morphology, or behavior or changes in the motor nervous system containing many motor neurons and astrocytes, and muscle weight at any developmental stage examined. This indicates that the introduction of HGF has been successful in a nervous system-specific manner without affecting development (see FIGS. 6 to 10, and FIGS. 19 and 20).
実施例３
ALSに対するHGFの効果の検討(1)
ALSでのHGFの役割を検討するために、HGFトランスジェニックマウスのヘテロザイゴート(+/-)をG93Aマウスのヘテロザイゴート(+/-)と交配し、これによってALSのニューロンへ直接的にHGFを導入したトランスジェニックマウスを作製した。なお前記交配により、4つの異なったマウスの群、すなわち野生型（W）、HGFのみに対するトランスジェニック（HGF）、G93Aのみに対するトランスジェニック（G93A）、およびG93AおよびHGF両方に対する二重トランスジェニック（G93A/HGF）が生成される。
Example 3
Effect of HGF on ALS (1)
In order to investigate the role of HGF in ALS, the heterozygote (+/-) of HGF transgenic mice was crossed with the heterozygote (+/-) of G93A mice, thereby directly transferring HGF to neurons in ALS. An introduced transgenic mouse was prepared. Note that the crossing resulted in four different groups of mice: wild type (W), transgenic for HGF only (HGF), transgenic for G93A only (G93A), and double transgenic for both G93A and HGF (G93A / HGF) is generated.
まず、HGFの発現が運動ニューロンに対する神経保護効果を発揮するかどうかを、組織学的解析により検討した。結果を図６及び図７に示す。クリスタルバイオレットによって染色された末期の腰髄の前角のパラフィン切片（14μm）は、G93Aマウス（G93A）の運動ニューロンの数が明らかに減少しており、残っている運動ニューロンも萎縮した形態を示していた（図6）。一方、二重トランスジェニック同腹子（G93A/HGF）は、G93Aマウスのそれよりも明らかに多くの健康的な形態を持つ脊髄運動ニューロンを保持した（図6）。野生型およびHGF単独トランスジェニックマウスは、同様の数の健康な運動ニューロンを示した（図6)。 First, we examined whether HGF expression exerts a neuroprotective effect on motor neurons by histological analysis. The results are shown in FIGS. A paraffin section (14μm) in the anterior horn of the lumbar spinal cord stained with crystal violet clearly shows a decrease in the number of motor neurons in G93A mice (G93A), and the remaining motor neurons are also atrophied. (Figure 6). On the other hand, double transgenic littermates (G93A / HGF) retained spinal motor neurons with clearly more healthy morphology than that of G93A mice (Figure 6). Wild-type and HGF-only transgenic mice showed a similar number of healthy motor neurons (FIG. 6).
次に、各マウスそれぞれの群毎6匹の独立した動物を用いて、腰髄の運動ニューロン数を定量的に比較した。その結果、G93Aマウスは6ヶ月齢で腰髄の運動ニューロンを欠失し始め、そして8ヶ月齢で、野生型あるいはHGF単独トランスジェニック同腹子の運動ニューロンと比較して、G93Aマウスの運動ニューロンは40％しか残っていなかった（図7）。対照的に二重トランスジェニック同腹子は、G93Aトランスジェニックマウスと比較して、運動ニューロンの数が明らかに改善されることが示された（図7）。 Next, the number of motor neurons in the lumbar spinal cord was quantitatively compared using 6 independent animals per group for each mouse. As a result, G93A mice began to lose lumbar motoneurons at 6 months of age, and at 8 months of age, G93A mice motoneurons compared to wild-type or HGF-only transgenic littermates. Only 40% remained (Figure 7). In contrast, double transgenic littermates showed a marked improvement in the number of motor neurons compared to G93A transgenic mice (FIG. 7).
HGFの運動ニューロンに対する生存促進活性が、ニワトリ胚において腰部レベルと頸部レベル間で異なることが示されているので、次に、HGFの導入が頸部レベルで運動ニューロンの死を減ずることができるかどうかも試験した。その結果、G93Aマウスにおいて、頸部運動ニューロンの55％が8ヶ月齢で残っていた。腰部のレベルでのものよりもより少ない数の頸部レベルでの運動ニューロンの死は、本モデルマウスの特徴である。二重トランスジェニックマウスでは頸部レベルにおいてもあきらかにより多い数（87．8±2．4％）の運動ニューロンが残っており、このことはHGFが腰部および頸部運動ニューロン両方に効果的であることを示している。 Since it has been shown that the pro-survival activity of HGF on motor neurons differs between lumbar and cervical levels in chick embryos, the introduction of HGF can then reduce motor neuron death at the cervical level Whether it was also tested. As a result, in G93A mice, 55% of cervical motor neurons remained at 8 months of age. The death of motor neurons at a lower number of cervical levels than at the lumbar level is characteristic of this model mouse. The double transgenic mice still have a greater number (87.8 ± 2.4%) of motor neurons at the cervical level, indicating that HGF is effective for both lumbar and cervical motor neurons. It is shown that.
次に、各マウスそれぞれの群毎に少なくとも3匹の独立したマウスを用いて、軸索変性に対するHGFの効果を組織学的解析により検討した。前根の大口径軸索の変性が8ヶ月齢のG93Aマウスで見られ（図９）、一方、二重トランスジェニック同腹子では前根の軸索変性は穏やかであり、前根のほとんどが悪化していない形態を示した。また後根は、G93Aマウスでは中程度の変性を示したのに対し、二重トランスジェニック同腹子での形態は視覚的に正常であった（図９）。これらはHGFが前根および後根の両方の変性を効果的に防ぐことを示している。さらに、末期の二重トランスジェニックマウスでは、前根が悪い場合でも、後根の同様な健康な形態を示した。したがって、HGFは運動ニューロンのみに対してではなく、ALS関連神経毒性に関するDRG感覚神経に対しても神経保護効果を発揮することが示された。さらに、HGFの神経保護効果はまた、腓腹筋重量の減少の遅延効果からも示された（図８）。 Next, the effect of HGF on axonal degeneration was examined by histological analysis using at least 3 independent mice for each group. Degeneration of the large root axon of the anterior root was seen in 8-month-old G93A mice (Fig. 9), whereas in the double transgenic littermates, the anterior degeneration of the anterior root was mild and most of the anterior root deteriorated The form which has not been shown. The dorsal root showed moderate degeneration in G93A mice, whereas the morphology in double transgenic littermates was visually normal (FIG. 9). These indicate that HGF effectively prevents both anterior and dorsal root degeneration. Furthermore, the terminal double transgenic mice showed similar healthy morphology of the dorsal roots even when the anterior roots were poor. Therefore, it was shown that HGF exerts a neuroprotective effect not only on motor neurons but also on DRG sensory nerves related to ALS-related neurotoxicity. Furthermore, the neuroprotective effect of HGF was also shown from the delayed effect of reducing gastrocnemius muscle weight (FIG. 8).
実施例４
ALSに対するHGFの効果の検討(2)
HGFの導入により、麻痺の開始、寿命およびALSの運動能力を改善することができるかどうかを、先の4種のマウスを用いて試験した。麻痺の開始は、ヘテロザイゴート(+/-)G93Aマウスで平均年齢243．8±4．7日（平均±標準偏差、中央値＝242±14日）で観察され、一方、二重トランスジェニックマウス（G93A/HGF）では、この開始は明らかに遅く、年齢271．9±5．6日（中央値282．5±9．5日、p＝0．004）から起こった（図11）。また死亡の開始としては、G93Aマウスの平均生存日数は259．5±5．0日（中央値＝259±11日）であった。一方二重トランスジェニックマウスでは286．8±6．5日まで引き延ばされ、平均寿命で27．3日の延命が示された（中央値＝294±14．5日、p＝0．003、図12）。
Example 4
Effect of HGF on ALS (2)
Whether the introduction of HGF can improve the onset of paralysis, longevity and ALS motor ability was tested using the above four mice. The onset of paralysis was observed in heterozygote (+/-) G93A mice at an average age of 243.8 ± 4.7 days (mean ± standard deviation, median = 242 ± 14 days), whereas double transgenic mice In (G93A / HGF), this onset was apparently late and occurred at an age of 271.9 ± 5.6 days (median 282.5 ± 9.5 days, p = 0.004) (FIG. 11). As for the start of death, the average survival time of G93A mice was 259.5 ± 5.0 days (median = 259 ± 11 days). On the other hand, double transgenic mice were prolonged to 286.8 ± 6.5 days, and the life expectancy was 27.3 days (median = 294 ± 14.5 days, p = 0.003). , Figure 12).
さらに後肢伸張反射、ローターロッド上での保持時間、歩幅の測定によって運動能力を試験した。HGF単独トランスジェニックマウスは運動機能において野生型同腹子と明らかな違いは示さなかった。一方G93Aマウスは5ヶ月齢から後肢伸張度の、6ヶ月齢からローターロッド能力の、そして7ヶ月齢から歩幅の進行性の減少を示した。一方、二重トランスジェニックマウスでは試験したすべての機能的なパラメータにおいて、G93Aよりも非常にゆっくりとした減少を示した（図13〜図15）。 In addition, exercise ability was tested by measuring the hindlimb stretch reflex, holding time on the rotor rod, and stride length. HGF-only transgenic mice showed no obvious difference in motor function from wild-type littermates. G93A mice, on the other hand, showed a progressive decrease in hindlimb stretch from 5 months of age, from 6 months of age to rotarod ability, and from 7 months of age to stride. On the other hand, double transgenic mice showed a much slower decrease in all functional parameters tested than G93A (FIGS. 13-15).
図10は、ALS進行の間の4つの群での脊髄のHGFタンパク質レベルを示したものである。HGFレベルはHGFトランスジェニックマウスおよびG93A/HGF同腹子で2ヶ月と6ヶ月で約2倍高く、このことは少量のHGFの追加が6ヶ月時の運動機能を十分に改善し、1ヶ月の寿命を引き延ばすことを示している。しかし8ヶ月時のG93A/HGF二重トランスジェニックでのHGFの十分でない産出、すなわちHGF、G93AおよびG93A/HGFでのHGFのレベルは末期で同一であることは、その後のALSの不完全な改善を反映する可能性があり、より高いレベルでのHGFの発現が望まれる。以上のように、HGF遺伝子のALSニューロンでの発現により、ALSでの寿命および運動機能を明らかに改善することが示された。 FIG. 10 shows spinal HGF protein levels in four groups during ALS progression. HGF levels were approximately twice as high at 2 months and 6 months in HGF transgenic mice and G93A / HGF littermates, indicating that the addition of a small amount of HGF sufficiently improved motor function at 6 months and a one month life span Indicates that the However, inadequate production of HGF in the G93A / HGF double transgenic at 8 months, that is, the level of HGF in HGF, G93A and G93A / HGF is the same at the end stage, indicating that the subsequent improvement of ALS is incomplete HGF expression at a higher level is desired. As described above, it was shown that the expression of HGF gene in ALS neurons clearly improved the life span and motor function in ALS.
実施例５
ALSに対するHGFの作用メカニズムの検討(1)
二重トランスジェニックマウスにおける運動ニューロン死の減少、運動および感覚軸索の変性の減少、および運動機能のゆっくりとした減少に対する可能性のあるメカニズムを検討するため、すなわち、導入されたHGFがALSの最初の事象を変化させるのか、後期の事象を変化させるのか、又は特定の事象に影響することなく疾病進行の速さを改善させるのかを検討するために、まず疾病のもっとも早期の兆候の1つを試験した。変異SOD1の凝集が動物モデルでもっとも早期の事象であると報告されており、またSOD1の凝集が家族性ALS患者で観察されている。
Example 5
Study of action mechanism of HGF on ALS (1)
To investigate possible mechanisms for decreased motor neuron death, decreased motor and sensory axon degeneration, and slow decrease in motor function in double transgenic mice: One of the earliest signs of illness is to consider whether to change the first event, later events, or improve the speed of disease progression without affecting specific events. Was tested. Mutant SOD1 aggregation has been reported to be the earliest event in animal models, and SOD1 aggregation has been observed in familial ALS patients.
脊髄抽出液中の変異SOD1の総量を、ヒトSOD1抗体に対して特異的な、したがって内在性のマウスSOD1ではなく変異ヒトSOD1のみを認識する抗体を用いて、イムノブロッティングによって調べた。それぞれの群毎3匹の独立した動物を試験した。G93Aと二重トランスジェニックマウス両方において変異SOD1を2ヶ月齢から検出した。そして変異SOD1の総量は、同様の時間経過で、G93Aと二重トランスジェニックマウス両方で増加した。G93Aマウスでの変異SOD1の総量はHGF同腹子のそれとは異ならなかった（図17）。 The total amount of mutant SOD1 in the spinal cord extract was examined by immunoblotting using an antibody specific for human SOD1 antibody and thus recognizing only mutant human SOD1 and not endogenous mouse SOD1. Three independent animals were tested for each group. Mutant SOD1 was detected from 2 months of age in both G93A and double transgenic mice. And the total amount of mutant SOD1 increased in both G93A and double transgenic mice over the same time course. The total amount of mutant SOD1 in G93A mice was not different from that of HGF littermates (FIG. 17).
次に、SOD1の凝集について検討した。脊髄での変異SOD1の凝集が、G93Aマウスにおいて4ヶ月齢程度の初期段階で優先的に前角にて検出され、また凝集の量は動物が末期となった8ヶ月齢で明らかに増加した（図16）。二重トランスジェニックマウスでの変異SOD1の凝集は4ヶ月齢でG93A同腹子での凝集に匹敵し（図16）、特異的免疫応答性は野生型あるいはHGF単独トランスジェニック同腹子では検出されなかった。二重トランスジェニックマウスでの変異SOD1の凝集は8ヶ月で明らかに増加し（図16）、量はG93A同腹子と比較してわずかに少ないように見え、しかしながら違いはとても小さかった。これらの結果は、HGFはこのモデルでの神経毒性の起源と疾病の最初の事象を改善しないことを示した。 Next, SOD1 aggregation was examined. Aggregation of mutant SOD1 in the spinal cord was preferentially detected in the anterior horn at an early stage of about 4 months of age in G93A mice, and the amount of aggregation was clearly increased at 8 months of age when the animals were at the end ( Figure 16). Aggregation of mutant SOD1 in double transgenic mice is comparable to that of G93A littermates at 4 months of age (Figure 16), and no specific immune response was detected in wild type or HGF-only transgenic littermates . Aggregation of mutant SOD1 in double transgenic mice clearly increased at 8 months (FIG. 16), and the amount appeared to be slightly less compared to G93A littermates, but the differences were very small. These results indicated that HGF did not improve the origin of neurotoxicity and the first event of disease in this model.
カスパーゼ-1がALSの進行に重要な役割を果たしていると考えられている（Nature,388,31(1997)、J.Exp.Med.,185,933-940(1997)）。従ってHGFがカスパーゼ−1の誘導を改善できるかどうかを、抗−カスパーゼ−1抗体、および成熟ニューロンを染色する抗−チューブリンIII抗体を用いた二重ラベル免疫組織化学法により調べた。カスパーゼ−1−免疫応答性（カスパーゼ−1−IR）は、試験したいかなる時間においても野生型とHGF同腹子両方で検出限界以下であった。G93Aマウスでは、カスパーゼ−1−IRは6ヶ月時に大チューブリンIII免疫染色細胞で特異的に誘導され、また共局在した。このことは運動ニューロンでのカスパーゼ−1の誘導を示している。G93Aでのカスパーゼ−1のレベルは8ヶ月時に減少し、かすかなカスパーゼ−1−IRのみが検出された。二重トランスジェニックマウスでは、6ヶ月齢で、大チューブリンIII免疫応答性細胞において、G93Aマウスと比較して非常に弱いカスパーゼ−1−IRを示し、このことはHGFがALSの中期において運動ニューロンでのカスパーゼ−1の誘導のレベルを減少させることを示している。 Caspase-1 is thought to play an important role in the progression of ALS (Nature, 388, 31 (1997), J. Exp. Med., 185, 933-940 (1997)). Therefore, whether HGF could improve the induction of caspase-1 was examined by double-label immunohistochemistry using anti-caspase-1 antibody and anti-tubulin III antibody staining mature neurons. Caspase-1-immunoresponsiveness (caspase-1-IR) was below the limit of detection in both wild type and HGF littermates at any time tested. In G93A mice, caspase-1-IR was specifically induced and colocalized in large tubulin III immunostained cells at 6 months. This indicates the induction of caspase-1 in motor neurons. The level of caspase-1 in G93A decreased at 8 months and only faint caspase-1-IR was detected. Double transgenic mice show very weak caspase-1-IR in large tubulin III immunoreactive cells at 6 months of age compared to G93A mice, indicating that HGF is a motor neuron in the middle phase of ALS. It has been shown to reduce the level of induction of caspase-1 at.
Aktのリン酸化が大脳皮質ニューロンと腎臓上皮細胞でのHGFの生存促進活性に関与することが示され、そしてHGFは劇症肝炎モデルの肝臓でBcl-xL発現を誘導し、多量のアポトーシスを阻止することが示されている(Biochem.Biophys.Res.Commun.,244,683-690(1998)、Hepatology,30,151-159(1999))。そこでアポトーシスを減少させるHGFのメカニズムをさらに解明するために、Aktのリン酸化およびBcl-2ファミリー遺伝子の調節を調べた。 Akt phosphorylation has been shown to be involved in HGF survival-promoting activity in cerebral cortical neurons and kidney epithelial cells, and HGF induces Bcl-xL expression in the liver of fulminant hepatitis models and blocks massive apoptosis (Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 683-690 (1998), Hepatology, 30, 151-159 (1999)). To further elucidate the mechanism of HGF that reduces apoptosis, we investigated phosphorylation of Akt and regulation of Bcl-2 family genes.
ウエスタンブロットにおいて、Aktそれ自身の量はいかなる同腹子においても変化せず、対照的にAktは、8ヶ月時のG93A/HGFマウスの脊髄で特異的に、明らかにリン酸化されていることが示された（図18）。HGFマウスの脊髄でのかなり低いレベルのAktリン酸化は、二重トランスジェニックマウスのレベルよりも低いHGFマウスでのc-Metのレベルを反映している可能性がある（図21）。これらの結果は、HGFが部分的にAktの活性化を通して生存促進活性を示すことを示している。 Western blot shows that the amount of Akt itself does not change in any litter, in contrast, Akt is clearly clearly phosphorylated in the spinal cord of G93A / HGF mice at 8 months. (Figure 18). The rather low level of Akt phosphorylation in the spinal cord of HGF mice may reflect a lower level of c-Met in HGF mice than that in double transgenic mice (FIG. 21). These results indicate that HGF exhibits survival promoting activity partially through activation of Akt.
Bcl-xLおよびBcl-2タンパク質は8ヶ月齢での脊髄では誘導されなかった（図18）。以上の実験により、HGFは、運動ニューロンでのカスパーゼ−1誘導を防止することで、また脊髄でのAktのリン酸化によって、ALSの進行を減少させることが示された。 Bcl-xL and Bcl-2 proteins were not induced in the spinal cord at 8 months of age ( FIG. 18 ). These experiments indicate that HGF reduces the progression of ALS by preventing caspase-1 induction in motor neurons and by phosphorylating Akt in the spinal cord.
実施例６
ALSに対するHGFの作用メカニズムの検討(2)
グルタミン酸仲介興奮毒性が、グルタミン酸クリアランスの減少によってALSの運動ニューロン変性に関与することが指摘されている。この仮説と一致して、散発性ALSの患者の脊髄および運動皮質で、グルタミン酸輸送活性が明らかに減少し(N.Engl.J.Med.,326,1464-1468(1992))、星状細胞に局在し、グルタミン酸作動性神経毒性を抑制するための主要な輸送体であると考えられているグリア細胞特異的グルタミン酸輸送体（EAAT2/GLT-1）に対する免疫応答が選択的に消滅したこと(Ann.Neurol.,38,73-84(1995))が報告されている。また、ALSモデルであるG85R型トランスジェニックマウスでのEAAT2の減少や(Neuron,18,327-338(1997)、ALSでのSOD1変異（A4VおよびI113T）に関連したグリア細胞グルタミン酸輸送体の不活性化(Nat.Neurosci.,2,427-433(1999))も報告されている。このように、グルタミン酸作動性興奮毒性はALSの運動ニューロン変性において役割を果たしていると考えられているため、HGFの前記EAAT2への関与を検討した。
Example 6
Study of action mechanism of HGF on ALS (2)
It has been pointed out that glutamate-mediated excitotoxicity is involved in motor neuron degeneration of ALS by reducing glutamate clearance. Consistent with this hypothesis, glutamate transport activity was clearly reduced in the spinal cord and motor cortex of patients with sporadic ALS (N. Engl. J. Med., 326, 1464-1468 (1992)) and astrocytes The immune response to the glial cell-specific glutamate transporter (EAAT2 / GLT-1), which is thought to be a major transporter to suppress glutamatergic neurotoxicity localized in (Ann. Neurol., 38, 73-84 (1995)) has been reported. In addition, inactivation of the glial glutamate transporter associated with a decrease in EAAT2 in the ALS model G85R-type transgenic mice (Neuron, 18, 327-338 (1997), SOD1 mutations (A4V and I113T) in ALS ( Nat.Neurosci., 2,427-433 (1999)) As described above, it is thought that glutamatergic excitotoxicity plays a role in motor neuron degeneration of ALS. The involvement of was examined.
まず、c-Met-IRが反応性星状細胞に局在するかどうか、HGFが星状細胞の病原性（pathogenesis）及び反応性星状細胞のグルタミン酸輸送体のレベルを変化させるかどうかを調べた。抗GFAPおよび抗c-Met抗体を用いた脊髄の二重染色により、c-Met-IRは、残っている大ニューロンとGFAP陽性反応性星状細胞に局在することを明らかにした。免疫組織化学的な結果と矛盾することなしに、G93Aマウスおよび二重トランスジェニックマウスでのc-Metのレベルが特に8ヶ月時に増加し（図21、下パネル）、運動ニューロンだけでなく星状細胞も8ヶ月時（末期）のALSで、HGFに対する標的でありうることが示唆された。 First, we investigated whether c-Met-IR is localized in reactive astrocytes and whether HGF alters astrocyte pathogenesis and reactive astrocyte glutamate transporter levels It was. Double staining of the spinal cord with anti-GFAP and anti-c-Met antibodies revealed that c-Met-IR was localized in the remaining large neurons and GFAP-positive reactive astrocytes. Consistent with immunohistochemical results, c-Met levels increased in G93A and double transgenic mice, especially at 8 months (Figure 21, lower panel), not only motor neurons but also stars The cells were also ALS at 8 months (late stage), suggesting that they could be targets for HGF.
野生型あるいはHGF単独トランスジェニックマウスにおいて、星状細胞は主に白質で中心管近くに局在し、しかしわずかに前角に局在していた（図19）。G93Aマウスにおける反応性星状細胞は、運動ニューロン死がまだG93Aマウスで認められない時である6ヶ月齢時に、前角において進行的に増加した（図19）。対照的に、二重トランスジェニック同腹子では、前角における反応性星状細胞の数は著しく少なかった（図19）。GFAP-IRの反応性強度の定量により、6および8ヶ月齢のG93Aマウスのそれと比較して、それぞれ前角での免疫応答活性量が約40％および60％少ないことが示された（図20）。次に2、6及び8ヶ月時の各マウス脊髄のEAAT2、GFAPおよびc-Metの免疫ブロッティングを行った結果、G93AマウスおよびG93A/HGFマウス両方での6ヶ月時からのGFAPの誘導と、8ヶ月のG93Aマウスでの特異的なEAAT2のダウンレギュレーション、そして8ヶ月のG93AおよびG93A/HGFマウスでの特異的なc-Metのアップレギュレーションが示された。またG93A/HGFマウスにおいてはEAAT2の総レベルが8ヶ月時において保たれていた。 In wild-type or HGF-only transgenic mice, astrocytes were predominantly white matter and localized near the central canal, but only slightly in the anterior horn (Figure 19). Reactive astrocytes in G93A mice progressively increased in the anterior horn at 6 months of age, when motoneuron death was not yet observed in G93A mice (Figure 19). In contrast, double transgenic littermates had significantly fewer reactive astrocytes in the anterior horn (FIG. 19). Quantification of the reactivity intensity of GFAP-IR showed about 40% and 60% less immune response activity at the anterior horn compared to that of 6 and 8 month old G93A mice, respectively (FIG. 20). ). Next, as a result of immunoblotting of EAAT2, GFAP and c-Met of each mouse spinal cord at 2, 6 and 8 months, induction of GFAP from 6 months in both G93A mice and G93A / HGF mice, Specific EAAT2 down-regulation in months G93A mice and specific c-Met up-regulation in 8 months G93A and G93A / HGF mice were shown. In G93A / HGF mice, the total level of EAAT2 was maintained at 8 months.
8ヶ月齢でのG93AマウスでのEAAT2のレベルは、野生型あるいはHGF単独トランスジェニック同腹子のそれと比較して、40％明らかに減少していた（図22）。対照的に、二重トランスジェニックマウスは野生型あるいはHGF単独トランスジェニックマウス同腹子と比較して、腰髄でより高いレベルのEAAT2（140％）を示した（図22）。個々の星状細胞でのEAAT2のレベルを評価するために、EAAT2のレベルをGFAPのレベルで割った。EAAT2の11％のみがG93Aマウスで残っており、一方63％のEAAT2が二重トランスジェニックマウスで残っていた（図22）。星状細胞増加は6ヶ月で始まるにもかかわらず、星状細胞でのEAAT2の減少およびc-Metの誘導は末期にのみパラレルに起こることは、価値のある記録である。 The level of EAAT2 in G93A mice at 8 months of age was clearly reduced by 40% compared to that of wild-type or HGF-only transgenic littermates (Figure 22). In contrast, double transgenic mice showed higher levels of EAAT2 (140%) in the lumbar spinal cord compared to littermates of wild type or HGF alone transgenic mice (FIG. 22). To assess the level of EAAT2 in individual astrocytes, the level of EAAT2 was divided by the level of GFAP. Only 11% of EAAT2 remained in G93A mice, while 63% of EAAT2 remained in double transgenic mice (Figure 22). It is a valuable record that astrocytosis begins in 6 months, but EAAT2 reduction and c-Met induction in astrocytes occurs only in parallel only at the end stage.
次に、初代培養星状細胞に対するHGFの作用を検討した結果、HGF処理によりG93Aマウスおよび野生型同腹子両方からの初代培養星状細胞でのEAAT2レベルが増加することが明らかとなった（図23及び図24）。このことは星状細胞でのEAAT2の減少の防止は、直接的に星状細胞でのHGFの活性によることを示している。以上のように、二重トランスジェニックマウスが末期でさらに機能的な星状細胞を保持する一方、G93Aマウスがグルタミン酸クリアランスの観点において、非機能的星状細胞を過剰産出することが示された。 Next, as a result of examining the effect of HGF on primary cultured astrocytes, it became clear that EAAT2 levels in primary cultured astrocytes from both G93A mice and wild-type littermates increased by HGF treatment (Fig. 23 and Fig. 24). This indicates that the prevention of EAAT2 depletion in astrocytes is directly due to HGF activity in astrocytes. As described above, it was shown that double transgenic mice retain more functional astrocytes at the end stage, while G93A mice overproduce nonfunctional astrocytes in terms of glutamate clearance.
実施例７
ＨＧＦ投与又はＨＧＦ遺伝子導入によるＡＬＳの進行抑制効果
ALSのモデルマウスであるG93Aマウスにおいて、ALSの症状が認められ始めた6ヶ月齢時より、HGFタンパク製剤を適当な投与回数、脊髄内などの適当な部位へ連日投与する。その際、HGFタンパクを含まない製剤を投与した群を対照群として用いる。さらに投与量、投与回数などを評価する場合、適宜投与量、投与回数を変えた群を用いる。その後、HGF投与群と対照群のそれぞれにおいて、実施例3及び４に記載されたようなALSの進行抑制効果等を検討する。HGF投与群においてALS進行抑制効果が認められることにより、HGFがALSの治療剤となることが確認される。さらに、HGFの代わりにHGF遺伝子を用いて同様の実験を行うことにより、HGF遺伝子がALSの治療剤となることが確認される。
Example 7
Inhibition of ALS progression by HGF administration or HGF gene introduction
In G93A mice, which are ALS model mice, from the age of 6 months when ALS symptoms began to be observed, the HGF protein preparation is administered daily to an appropriate site such as the spinal cord at an appropriate frequency. At that time, a group to which a preparation containing no HGF protein is administered is used as a control group. Further, when evaluating the dose, the number of administrations, etc., groups in which the dose and the number of administrations are appropriately changed are used. Thereafter, in each of the HGF administration group and the control group, the ALS progression inhibitory effect and the like as described in Examples 3 and 4 are examined. The presence of an ALS progression inhibitory effect in the HGF administration group confirms that HGF is a therapeutic agent for ALS. Furthermore, by conducting the same experiment using the HGF gene instead of HGF, it is confirmed that the HGF gene is a therapeutic agent for ALS.
製剤例１
生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
Formulation Example 1
A solution containing 1 mg of HGF, 1 g of mannitol and 10 mg of polysorbate 80 in 100 ml of physiological saline was prepared aseptically, dispensed into vials in 1 ml portions, freeze-dried and sealed to obtain a freeze-dried preparation.
製剤例２
０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ及びヒト血清アルブミン１００ｍｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。
Formulation Example 2
An aqueous solution containing 1 mg of HGF and 100 mg of human serum albumin in 100 ml of 0.02 M phosphate buffer (containing 0.15 M NaCl and 0.01% polysorbate 80, pH 7.4) is aseptically prepared, and 1 ml is dispensed into vials. After that, freeze-dried and sealed to obtain a freeze-dried preparation.
ＨＧＦ及び／又はＨＧＦ遺伝子は、従来にない効果的なＡＬＳ治療剤である。 HGF and / or HGF gene is an unprecedented effective ALS therapeutic agent.
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