WO2001046218A2 - Fragments of pf4 and pharmaceutical compositions containing the same - Google Patents

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WO2001046218A2
WO2001046218A2 PCT/FR2000/003532 FR0003532W WO0146218A2 WO 2001046218 A2 WO2001046218 A2 WO 2001046218A2 FR 0003532 W FR0003532 W FR 0003532W WO 0146218 A2 WO0146218 A2 WO 0146218A2
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cys
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acid residue
leu
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PCT/FR2000/003532
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Inventor
Monica Alemany
Jacques Philippe Caen
Zhong Chao Han
Original Assignee
Institut Des Vaisseaux Et Du Sang
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates, as new industrial products, to the peptides of formula II, III and IV below. It also relates to the therapeutic use of these peptides, as well as the pharmaceutical compositions containing them.
  • PRIOR ART The closest prior art is constituted by WO-A-99/41283
  • Xoi is Pro, Gly or Ala, the preferred amino acid residues being Pro and Ala,
  • X 02 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents His or Glx, the preferred residue being His,
  • X 04 is Pro, Gly, Thr, Ala, Ile or Leu
  • the preferred amino acid residues being Pro, Ala and Leu
  • Xos is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Thr, Glx, Asx or Ala
  • X 06 represents Ala, Val, Gin, Leu, Ile or Thr
  • X 07 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Ala or Glx
  • X 0 g is any different amino acid residue Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val
  • X 09 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, the preferred residue being Ile,
  • Xio is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Val
  • X ⁇ is a Lys, Ser or Thr residue, any amino acid other than
  • X 12 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu or Ile
  • the preferred residue being Leu is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Ser
  • X ] 4 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Asx or Glx
  • X ] 5 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Gly
  • X 17 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Gin
  • X 18 is Leu, Ile, Val, Ala or Tyr
  • X 20 is Leu, Ile or Val
  • X 2 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala, Asx, Glx or Ser
  • Y 25 is a residue Pro, Pro-X 26 or Pro-X 26 -Tyr, the preferred residue being the monoamino acid residue Pro
  • X 26 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg, Ile, Leu, Val, Met or Trp, the preferred residue being Leu; and, their non-toxic addition salts.
  • the peptides of formula I according to WO-A-99/41283 cited above can exhibit up to seven essential activities (1-7) divided into three functional classes (A-C), namely that they are useful - class A (hematopoietic function)
  • virustatic agents in particular with regard to viruses and retroviruses with a lipid capsid
  • products were obtained (ie the eicosapeptides of formula II below) devoid of the DLQ sequence (ie Asp-Leu-Gln) in position 21-23 of formula I and which act as antagonists, and (ii) products (ie tricosapeptides of formula III and peptides of formula IV which contain from 25 to 27 amino acids) in which said DLQ sequence of peptides of formula I is replaced by ELR (ie Glu-Leu-Arg) and which present an unexpected new hematopoietic activity, namely a stimulating effect on the proliferation of hematopoietic progenitors after chemotherapy or radiotherapy.
  • ELR ie Glu-Leu-Arg
  • a product characterized in that it is chosen from the group consisting of: (a) peptides corresponding to the formula, as a new peptide compound II: X ⁇ l ⁇ 2 Ser X04 X ⁇ 5 X ⁇ 6 ⁇ 07 ⁇ 8 ⁇ 09 XlO Xll Xl2 ⁇ 13 X__4 Xl5 ⁇ 16 X 17 X ⁇ 8 Ser X 20 (II)
  • Xoi is Pro, Gly or Ala, the preferred amino acid residues being Pro and Ala
  • X 02 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents His or Glx
  • X 04 is Pro, Gly, Thr, Ala , Ile or Leu
  • X 05 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Thr, Glx, Asx or Ala, the preferred residue being Thr,
  • X 06 represents Ala, Val, Gln, Leu, Ile or Thr, the preferred amino acid residue being Ala
  • X 07 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Glx
  • X 08 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val
  • X 09 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, the preferred residue being Ile
  • Xio is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Val
  • X ⁇ is a Lys, Ser or Thr residue, any amino acid other than
  • X 12 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu or Ile
  • the preferred residue being Leu is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Ser
  • X 14 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Asx or Glx
  • the preferred residue being Asn is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Gly,
  • X 16 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg or Glx, the preferred residues being Gin and Arg
  • X 17 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Lys or Gin
  • Xig is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Leu, Ile, Val, Ala or Tyr
  • X 20 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu, Ile or Val
  • X 24 is a residue any amino acid different from Cys and advantageously represents Ala, Asx, Glx or Ser, the preferred residues being Ala and Glu
  • Y 25 is a Pro, Pro-X 26 or Pro-X 26 -Tyr residue, the preferred residue being the monoamino acid residue Pro
  • X 26 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg, Ile, Leu, Val, Met or Trp, the preferred residue being Leu; and, (d) their non-toxic
  • the use of the products according to the invention is recommended, which is characterized in that use is made of a peptide compound chosen from the group consisting of (a) the peptides of formula II, (b) the peptides of formula III, (c) the peptides of formula IV and (d) their non-toxic acid addition salts for the preparation of a medicament, as indicated below.
  • a therapeutic composition which is characterized in that it contains, in association with a physiologically acceptable excipient, at least (a) a peptide of formula II, (b) a peptide of formula III, (c) a peptide of formula IV and (d) one of their non-toxic acid addition salts.
  • a physiologically acceptable excipient at least (a) a peptide of formula II, (b) a peptide of formula III, (c) a peptide of formula IV and (d) one of their non-toxic acid addition salts.
  • the peptide compounds according to the invention comprise:
  • X 16 represents, as indicated above, Arg, Gln or Glu.
  • the preferred groups for X 16 having regard to the biological properties of the peptides of formulas II, III and IV, are Arg and especially Gln.
  • the peptides according to the invention can be used as such or in the form of addition salts with a mineral or organic acid, in particular hydrochloric acid, hydrobromic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid or the paratoluenesulfonic acid.
  • a mineral or organic acid in particular hydrochloric acid, hydrobromic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid or the paratoluenesulfonic acid.
  • the peptides of formula II and their non-toxic acid addition salts are antagonistic substances. They block the action of the peptides of formulas I, III and IV below, on the one hand, and having regard to the results of the tests which have been undertaken, they exert an antagonistic activity vis-à-vis chemokines of the CXC type.
  • the ELR subfamily such as notably IL8, NAP2, groa, gro and groy, on the other hand.
  • the peptides of formulas III and IV as well as their non-toxic acid addition salts have the same activities as the previous peptides of formula I. They nevertheless have a stimulating effect on the proliferation of hematopoietic stem cells after chemotherapy or radiotherapy which is particularly interesting according to the invention.
  • the peptides of formula III, the peptides of formula IV and their non-toxic acid addition salts are useful in therapeutics with respect to the harmful effects of chemo- and radiotherapy on hematopoietic lines.
  • the peptides of formulas III and IV can exhibit chemotactic activities for leukocytes.
  • the biological and pharmacological properties of the compounds according to the invention are largely due to their ability to organize into one or more secondary structures ( ⁇ helix, ⁇ sheets and ⁇ elbows) allowing them to adopt particular conformations.
  • the concepts of ⁇ helix, ⁇ sheets and ⁇ elbows appear in the literature and are well known to those skilled in the art. See in particular S. MARQUSEE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86, pages 5286-5290, on the one hand, and CR MATTHEWS et al, Annu. Rev. Biochem., 1993; 62, pages 653-683, on the other hand.
  • the peptides according to the invention have in their S segment a maximum ⁇ helicity located at the amino acid residues 7 to 11
  • this maximum ⁇ helicity which is determined using the "AGADIR” software (this is a predictive value), is greater than or equal to 0.12 (ie greater than or equal to 12%). (In practice, this threshold value of 0.12 units corresponds to 1.12 times the helicity ⁇ of the amino acid sequence 34-58 of PF4.)
  • the "AGADIR” software which has been available since 1997 in its latest version, is an algorithm for calculating a predictive value for the helicity of each of the amino acid residues of a peptide. See to this effect the article by V. MUNOZ et al., Nature: Struct.
  • At least one of the amino acid residues of the S segment of the peptides of formulas II, III and IV has an ⁇ helicity greater than or equal to 12%.
  • the sequence of the amino acid residues from position 16 approximately to position 20-25 has an influence on the activities of the peptides of formula I according to the invention. Beyond position 25, the insertion of a few additional amino acid residues (in particular 1 to 5) practically does not modify the activities of the peptides of formulas III and IV.
  • Tyr residue in the amino acid sequence peptides of formula II, III or IV.
  • the Tyr residue which is in particular more easily detectable or labeling (by means of a radioisotope) than the other natural amino acid residues, can be located in one of the positions 2, 5, 7 to 15, 17, 24 or 27 in the peptide of formula II, III or IV.
  • the Tyr residue if present, will preferably be located at position 27 in formula IV.
  • the eicosapeptides of formula II are interesting with regard to their action as antagonists of the peptides of formulas I, III and IV, that is to say (i) that they contain in their structure the receptor or receptors of the peptides of formulas I, III and IV, or (ii) that they preferentially bind to said receptors thereby inhibiting the action of said peptides of formulas I, III and IV.
  • Eicosapeptides are of analytical interest with regard to the study of said receptors and that of the substances which bind to them.
  • the tricosapeptides of formula III and the peptides of formula IV are distinguished from the previous peptides of formula I by the fact that they have no action on the S phase of mitosis, whereas the peptides of formula I presented, according to WO- A-99/41283 cited above, a beneficial effect on the cell cycle by prolonging the S phase occurring during mitosis.
  • Said peptides of formulas III and IV can exhibit up to eight essential activities (1-8) divided into three functional classes (A-C), namely that they are useful - class A (hematopoietic function)
  • virustatic agents in particular with regard to viruses and retroviruses with a lipid capsid
  • the myeloproliferative syndromes mentioned above include in particular: (1 °) essential thrombocythaemia, (2 °) polycythemia vera, (3 °) myelofibrosis and (4 °) chronic myeloid leukemia.
  • hematopoietic blowing agent a product which acts at the level of hematopoietic cells by promoting or stimulating the growth of stem cells such as those which are at the origin of granulocytes, platelets and erythrocytes .
  • heparinic substances in particular the usual heparin used as an anticoagulant product and heparins of low molecular weight
  • the peptides of formulas II, III and IV can be prepared according to a method known per se by application of conventional chemical or biological reaction mechanisms, namely by peptide synthesis or by genetic engineering.
  • each compound of formulas II, III or IV according to the invention has, at its amino acid residues 7 to 11, (i) a maximum ⁇ helicity which is greater than or equal to 0.12 (ie 12%, which is determined using the "AGADIR” software) and (ii) an R ratio greater than or equal to 1.5.
  • peptide chosen from the group consisting of (a) the peptides of formulas III and IV and (b) their non-toxic acid addition salts, for the preparation of a medicament:
  • hematopoiesis inhibitor intended for therapeutic use with respect to myeloproliferative syndromes
  • anti-angiogenesis intended for therapeutic use with respect to pathological angiogenesis
  • anti-inflammatory intended for therapeutic use against inflammations.
  • the invention also relates to the raised polyclonal and better monoclonal antibodies. against peptides of formulas II, III and IV; monoclonal antibodies are particularly useful in the analytical field for assessing the structure of analogs of the compounds of formulas II, III and IV, on the one hand, and in the field of purification when formulas II, III and IV, on the one hand, and in the field of purification when it is a question of isolating peptides comprising the sequence of the compounds of formula II, III or IV, on the other hand.
  • the invention further relates, as new industrial products, to the DNA fragments which code for the peptides of formulas II, III or IV. Examples 1-90
  • NMR tests were carried out in order to correlate the predictive results of the "AGADIR” software. These NMR tests were undertaken according to the method described by K. WUTRICH in "NMR of proteins and nucleic acids” (Wiley-Interscience 1986) and adapted to PF4 by E. Ilyina et al., Biochemistry, 1994; 34, pages 13436-13444 and by VA DARAGAN et al., Protein Science 1997; 6, pages 355-363. This method includes the determination of the variation of the secondary chemical displacements at the level of each residue of said peptide.

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Abstract

The invention relates to the following novel industrial product: (a) peptides of formula (I). X01 X02 Ser X04 X05 X06 X07 X08 X09 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 Ser X20 formula (II); X01 X02 Ser X04 X05 X06 X07 X08 X09 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 Ser X20 Glu Leu Arg formula (III); X01 X02 Ser X04 X05 X06 X07 X08 X09 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 Ser X20 Glu Leu Arg X24 Y25 formula (IV), wherein X01, X02, X04, X05, X06, X08, X09, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X18, X20, X24 and X25 have the meanings given in the description; and (b) their non-toxic acid addition salts. The novel products can be used in therapy.

Description

NOUVEAUX PEPTIDES, UTILISATION EN THERAPEUTIQUE ET COMPOSITIONS PHARMARCEUTIQUES LES RENFERMANT NOVEL PEPTIDES, USE IN THERAPEUTICS AND PHARMARCEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM
Domaine de l'invention La présente invention concerne, en tant que produits industriels nouveaux, les peptides de formule II, III et IV ci-après. Elle concerne également l'utilisation en thérapeutique de ces peptides, ainsi que les compositions pharmaceutiques les renfermant. Art antérieur L'art antérieur le plus proche est constitué par WO-A-99/41283Field of the Invention The present invention relates, as new industrial products, to the peptides of formula II, III and IV below. It also relates to the therapeutic use of these peptides, as well as the pharmaceutical compositions containing them. PRIOR ART The closest prior art is constituted by WO-A-99/41283
(date de publication : 19 août 1999) qui propose en tant que produits industriels les peptides de formule I :(publication date: August 19, 1999) which offers as industrial products the peptides of formula I:
Xθl Xθ2 Ser X04 Xθ5 Xθ6 Xθ Xθ8 Xθ9 XlO X_Ll l2 Xï3 l4 Xl5 Gin X: Xie Ser X20 Asp Leu Gin X24 Y25 ( I )Xθl Xθ2 Ser X 04 Xθ5 Xθ6 Xθ Xθ8 Xθ9 XlO X_Ll l2 Xï3 l4 Xl5 Gin X : Xie Ser X 20 Asp Leu Gin X 24 Y 25 (I)
dans laquelle,in which,
Xoi est Pro, Gly ou Ala, les résidus aminoacides préférés étant Pro et Ala,Xoi is Pro, Gly or Ala, the preferred amino acid residues being Pro and Ala,
X02 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement His ou Glx, le résidu préféré étant His,X 02 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents His or Glx, the preferred residue being His,
X04 est Pro, Gly, Thr, Ala, Ile ou Leu, les résidus aminoacides préférés étant Pro, Ala et Leu, Xos est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Thr, Glx, Asx ou Ala, le résidu préféré étant Thr, X06 représente Ala, Val, Gin, Leu, Ile ou Thr, le résidu aminoacide préféré étant Ala, X07 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Glx, X0g est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val,X 04 is Pro, Gly, Thr, Ala, Ile or Leu, the preferred amino acid residues being Pro, Ala and Leu, Xos is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Thr, Glx, Asx or Ala, the preferred residue being Thr, X 06 represents Ala, Val, Gin, Leu, Ile or Thr, the preferred amino acid residue being Ala, X 07 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Ala or Glx, X 0 g is any different amino acid residue Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val,
X09 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val, le résidu préféré étant Ile,X 09 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, the preferred residue being Ile,
Xio est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Val, Xπ est un résidu Lys, Ser ou Thr, l'aminoacide quelconque différent deXio is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Val, X π is a Lys, Ser or Thr residue, any amino acid other than
Cys et représente avantageusement le résidu préféré étant Thr, X12 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu ou Ile, le résidu préféré étant Leu, X13 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Ser, X]4 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Asx ou Glx, le résidu préféré étant Asn, X]5 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Gly,Cys and advantageously represents the preferred residue being Thr, X 12 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu or Ile, the preferred residue being Leu, X 13 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Ser, X ] 4 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Asx or Glx, the preferred residue being Asn, X ] 5 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Gly,
X17 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Gin, X18 est Leu, Ile, Val, Ala ou Tyr, le résidu préféré étant Ile, X20 est Leu, Ile ou Val, le résidu préféré étant Leu, X2 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala, Asx, Glx ou Ser, les résidus préférés étant Ala et Glu, Y25 est un résidu Pro, Pro-X26 ou Pro-X26-Tyr, le résidu préféré étant le résidu monoamino acide Pro, X26 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Arg, Ile, Leu, Val, Met ou Trp, le résidu préféré étant Leu ; et, leurs sels d'addition non toxiques.X 17 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Gin, X 18 is Leu, Ile, Val, Ala or Tyr, the preferred residue being Ile, X 20 is Leu, Ile or Val, the preferred residue being Leu , X 2 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala, Asx, Glx or Ser, the preferred residues being Ala and Glu, Y 25 is a residue Pro, Pro-X 26 or Pro-X 26 -Tyr, the preferred residue being the monoamino acid residue Pro, X 26 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg, Ile, Leu, Val, Met or Trp, the preferred residue being Leu; and, their non-toxic addition salts.
Les peptides de formule I selon WO-A-99/41283 précité peuvent présenter jusqu'à sept activités essentielles (1-7) réparties en trois classes fonctionnelles (A-C), à savoir qu'ils sont utiles - classe A (fonction hématopoïétique)The peptides of formula I according to WO-A-99/41283 cited above can exhibit up to seven essential activities (1-7) divided into three functional classes (A-C), namely that they are useful - class A (hematopoietic function)
(1) en tant qu'inhibiteurs de l'hématopoïèse, et plus précisément en tant qu'inhibiteurs de la prolifération hématopoïétique (effet intéressant vis-à-vis des syndromes myéloprolifératifs ;(1) as inhibitors of hematopoiesis, and more specifically as inhibitors of hematopoietic proliferation (interesting effect with respect to myeloproliferative syndromes;
(2) en tant qu'agents cytoprotecteurs, et en particulier dans la cytoprotection anti-apoptotique de cellules souches hématopoïétiques ;(2) as cytoprotective agents, and in particular in the anti-apoptotic cytoprotection of hematopoietic stem cells;
(3) en tant que produits ayant un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules hématopoïétiques ; (4) en tant qu'agents d'expansion hématopoïétiques et/ou purge médullaire ;(3) as products having an inhibitory effect on the differentiation of hematopoietic cells; (4) as hematopoietic blowing agents and / or medullary bleed;
- classe B (fonction angiogénique)- class B (angiogenic function)
(5) en tant qu'agents anti-angiogénèse ; et/ou, - classe C (fonction anti-inflammatoire)(5) as anti-angiogenesis agents; and / or, - class C (anti-inflammatory function)
(6) en tant qu'agents virustatiques, notamment vis-à-vis des virus et rétrovirus à capside lipidique ;(6) as virustatic agents, in particular with regard to viruses and retroviruses with a lipid capsid;
(7) en tant qu'agents anti-inflammatoires. But de l'invention Les peptides de formule I présentant des activités antiinflammatoires, on se proposait d'augmenter l'effet de ces activités antiinflammatoires par des modifications de structure, car il existe un besoin en substances anti-inflammatoires qu'il convient de satisfaire.(7) as anti-inflammatory agents. OBJECT OF THE INVENTION The peptides of formula I having anti-inflammatory activities, it was proposed to increase the effect of these anti-inflammatory activities by structural modifications, because there is a need for anti-inflammatory substances which must be satisfied. .
En procédant ainsi, on a obtenu de façon surprenante (i) des produits (i.e. les eicosapeptides de formule II ci-après) dépourvus de la séquence DLQ (i.e. Asp-Leu-Gln) en position 21-23 de la formule I et qui agissent en tant qu'antagonistes, et (ii) des produits (i.e. les tricosapeptides de formule III et les peptides de formule IV qui comportent de 25 à 27 aminoacides) dans lesquels ladite séquence DLQ des peptides de formule I est remplacée par ELR (i.e. Glu-Leu-Arg) et qui présentent une nouvelle activité hématopoïétique inattendue, à savoir un effet stimulant sur la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques après chimio- ou radiothérapies.By proceeding in this way, surprisingly (i) products were obtained (ie the eicosapeptides of formula II below) devoid of the DLQ sequence (ie Asp-Leu-Gln) in position 21-23 of formula I and which act as antagonists, and (ii) products (ie tricosapeptides of formula III and peptides of formula IV which contain from 25 to 27 amino acids) in which said DLQ sequence of peptides of formula I is replaced by ELR (ie Glu-Leu-Arg) and which present an unexpected new hematopoietic activity, namely a stimulating effect on the proliferation of hematopoietic progenitors after chemotherapy or radiotherapy.
On se propose donc de fournir à présent de nouveaux composés peptidiques qui soient particulièrement intéressants en thérapeutique eu égard (i) aux nouvelles propriétés et/ou (ii) aux propriétés améliorées qu'ils manifestent par rapport aux peptides de formule I selon le document WO-A- 99/41283 précité. Objet de l'invention Selon un premier aspect de l'invention, on préconise, en tant que nouveau composé peptidique, un produit caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par : (a) les peptides répondant à la formule II : Xθl θ2 Ser X04 Xθ5 Xθ6 ^07 θ8 ^09 XlO Xll Xl2 ^13 X__4 Xl5 ^16 X17 Xι8 Ser X20 ( I I )It is therefore proposed to now provide new peptide compounds which are particularly advantageous in therapy with regard to (i) the new properties and / or (ii) the improved properties which they manifest compared to the peptides of formula I according to the document WO -A- 99/41283 cited above. Object of the invention According to a first aspect of the invention, a product characterized in that it is chosen from the group consisting of: (a) peptides corresponding to the formula, as a new peptide compound II: Xθl θ2 Ser X04 Xθ5 Xθ6 ^ 07 θ8 ^ 09 XlO Xll Xl2 ^ 13 X__4 Xl5 ^ 16 X 17 Xι 8 Ser X 20 (II)
(voir aminoacides 1-20 de SEQ ID No. 1)(see amino acids 1-20 of SEQ ID No. 1)
(b) les peptides répondant à la formule III :(b) the peptides corresponding to formula III:
Xθl X02 Ser X04 Xθ5 ^06 Xθ7 X08 Xθ9 lO Xll l2 l3 Xl4 Xl5 ^ 16 X17 X18 Ser X20 Glu Leu Arg ( I I I ) (voir aminoacides 1-23 de SEQ ID No. 1)Xθl X 02 Ser X04 Xθ5 ^ 06 Xθ7 X 0 8 Xθ9 lO Xll l2 l3 Xl4 Xl5 ^ 16 X 17 X 18 Ser X 20 Glu Leu Arg (III) (see amino acids 1-23 of SEQ ID No. 1)
(c) les peptides répondant à la formule IV :(c) the peptides corresponding to formula IV:
Xθl X02 Ser X04 Xθ5 ^06 X07 Xθ8 θ9 XlO Xll ^12 Xl3 ^14 Xl5 X-16 X17 Xis Ser X20 Glu Leu Arg X2 4 Y25 ( IV )Xθl X 02 Ser X04 Xθ5 ^ 06 X 0 7 Xθ8 θ9 XlO Xll ^ 12 Xl3 ^ 14 Xl5 X-16 X17 Xis Ser X 20 Glu Leu Arg X 2 4 Y 25 (IV)
(voir SEQ ID No. 1)(see SEQ ID No. 1)
dans lesquellesin which
Xoi est Pro, Gly ou Ala, les résidus aminoacides préférés étant Pro et Ala, X02 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement His ou Glx, le résidu préféré étant His, X04 est Pro, Gly, Thr, Ala, Ile ou Leu, les résidus aminoacides préférés étant Pro, Ala et Leu, X05 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Thr, Glx, Asx ou Ala, le résidu préféré étant Thr,Xoi is Pro, Gly or Ala, the preferred amino acid residues being Pro and Ala, X 02 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents His or Glx, the preferred residue being His, X 04 is Pro, Gly, Thr, Ala , Ile or Leu, the preferred amino acid residues being Pro, Ala and Leu, X 05 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Thr, Glx, Asx or Ala, the preferred residue being Thr,
X06 représente Ala, Val, Gin, Leu, Ile ou Thr, le résidu aminoacide préféré étant Ala, X07 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Glx, X08 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val, X09 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val, le résidu préféré étant Ile, Xio est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Val, Xπ est un résidu Lys, Ser ou Thr, l'aminoacide quelconque différent deX 06 represents Ala, Val, Gln, Leu, Ile or Thr, the preferred amino acid residue being Ala, X 07 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Glx, X 08 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, X 09 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, the preferred residue being Ile, Xio is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Val, Xπ is a Lys, Ser or Thr residue, any amino acid other than
Cys et représente avantageusement le résidu préféré étant Thr, X12 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu ou Ile, le résidu préféré étant Leu, X13 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Ser, X14 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Asx ou Glx, le résidu préféré étant Asn, X15 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Gly,Cys and advantageously represents the preferred residue being Thr, X 12 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu or Ile, the preferred residue being Leu, X 13 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Ser, X 14 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Asx or Glx, the preferred residue being Asn, X 15 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Gly,
X16 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Arg ou Glx, les résidus préférés étant Gin et Arg, X17 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Gin, Xig est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu, Ile, Val, Ala ou Tyr, le résidu préféré étant Ile, X20 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu, Ile ou Val, le résidu préféré étant Leu, X24 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala, Asx, Glx ou Ser, les résidus préférés étant Ala et Glu, Y25 est un résidu Pro, Pro-X26 ou Pro-X26-Tyr, le résidu préféré étant le résidu monoaminoacide Pro, X26 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Arg, Ile, Leu, Val, Met ou Trp, le résidu préféré étant Leu ; et, (d) leurs sels d'addition d'acide non toxiques ; et en ce que le segment peptidique (S), qu'il comporte, commençant à X04 et se terminant à X15 forme une hélice α stable. Selon un second aspect de l'invention, l'on préconise une utilisation des produits selon l'invention, qui est caractérisée en ce que l'on fait appel à un composé peptidique choisi parmi l'ensemble constitué parmi (a) les peptides de formule II, (b) les peptides de formule III, (c) les peptides de formule IV et (d) leurs sels d'addition d'acide non toxiques pour la préparation d'un médicament, comme indiqué plus loin. Enfin, selon un troisième aspect de l'invention, on préconise une composition thérapeutique qui est caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, au moins (a) un peptide de formule II, (b) un peptide de formule III, (c) un peptide de formule IV et (d) l'un de leurs sels d'addition d'acide non toxiques. AbréviationsX 16 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg or Glx, the preferred residues being Gin and Arg, X 17 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Lys or Gin, Xig is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Leu, Ile, Val, Ala or Tyr, the preferred residue being Ile, X 20 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu, Ile or Val, the preferred residue being Leu, X 24 is a residue any amino acid different from Cys and advantageously represents Ala, Asx, Glx or Ser, the preferred residues being Ala and Glu, Y 25 is a Pro, Pro-X 26 or Pro-X 26 -Tyr residue, the preferred residue being the monoamino acid residue Pro, X 26 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg, Ile, Leu, Val, Met or Trp, the preferred residue being Leu; and, (d) their non-toxic acid addition salts; and in that the peptide segment (S), which it comprises, starting at X 04 and ending at X 15 forms a stable α helix. According to a second aspect of the invention, the use of the products according to the invention is recommended, which is characterized in that use is made of a peptide compound chosen from the group consisting of (a) the peptides of formula II, (b) the peptides of formula III, (c) the peptides of formula IV and (d) their non-toxic acid addition salts for the preparation of a medicament, as indicated below. Finally, according to a third aspect of the invention, a therapeutic composition is recommended which is characterized in that it contains, in association with a physiologically acceptable excipient, at least (a) a peptide of formula II, (b) a peptide of formula III, (c) a peptide of formula IV and (d) one of their non-toxic acid addition salts. Abbreviations
Dans la présente description on a utilisé, par commodité, un nombre important d'abréviations. Pour les résidus aminoacides classiques on a fait appel (i) au code à une lettre et (ii) au code à trois lettres, tels que recommandés par l'IUPAC ; dans cette optique B (Asx) représente N (Asn) ou D (Asp), d'une part, et Z (Glx) représente Q (Gin) ou E (Glu), d'autre part. Les autres abréviations et acronymes utilisés sont les suivants : 5FU 5-fluorouracile, produit cytotoxique de référence gro ensemble de protéines exprimées notamment dans les cellules tumorigènes ; on distingue plus précisément gro qui est une protéine mature de 73 aminoacides découverte dans les fibroblastes d'embryon d'hamster chinois, gro$ (ou MIP-2α) et groy (ou MIP- 2β) ; par rapport à la séquence des aminoacides de groa, groβ et groy présentent une homologie de 90 % et respectivement 86 % HPLC chromatographie liquide de haute performance IL 8 interleukine 8 MIP protéine inflammatoire de macrophage (de l'anglais : "macrophage inflammatory protein") PB S tampon phosphate salin Description détaillée de l'inventionIn the present description, a large number of abbreviations have been used for convenience. For conventional amino acid residues, use was made of (i) the one-letter code and (ii) the three-letter code, as recommended by IUPAC; in this perspective B (Asx) represents N (Asn) or D (Asp), on the one hand, and Z (Glx) represents Q (Gln) or E (Glu), on the other hand. The other abbreviations and acronyms used are as follows: 5FU 5-fluorouracil, cytotoxic reference product gro set of proteins expressed in particular in tumorigenic cells; we distinguish more precisely gro which is a mature protein of 73 amino acids discovered in the fibroblasts of Chinese hamster embryos, gro $ (or MIP-2α) and groy (or MIP-2β); compared to the amino acid sequence of groa, groβ and groy have a homology of 90% and 86% respectively HPLC high performance liquid chromatography IL 8 interleukin 8 MIP macrophage inflammatory protein (from English: "macrophage inflammatory protein") PB S saline phosphate buffer Detailed description of the invention
Les composés peptidiques selon l'invention comprennent :The peptide compounds according to the invention comprise:
- les eicosapeptides de formule II qui sont constitués par les aminoacides 1-20 des peptides antérieurs de formule I ;- the eicosapeptides of formula II which consist of amino acids 1-20 of the previous peptides of formula I;
- les tricosapeptides de formule III, qui se distinguent sur le plan de la structure desdits peptides de formule I par (i) la présence en position 21-- the tricosapeptides of formula III, which differ in terms of the structure of said peptides of formula I by (i) the presence in position 21-
23 de la séquence aminoacide ELR (i.e. Glu-Leu-Arg) au lieu de la séquence DLQ (i.e. Asp-Leu-Gln) et (ii) l'absence de la séquence Y25-
Figure imgf000007_0001
23 of the amino acid sequence ELR (ie Glu-Leu-Arg) instead of the sequence DLQ (ie Asp-Leu-Gln) and (ii) the absence of the sequence Y 25 -
Figure imgf000007_0001
- les peptides de formule IV, qui comportent de 25 à 27 restes aminoacides et se différencient du point de vue de la structure desdits peptides de formule I par la présence en position 21-23 de la séquence ELR au lieu de DLQ.- the peptides of formula IV, which contain from 25 to 27 amino acid residues and are different from the point of view of the structure of said peptides of formula I by the presence in position 21-23 of the sequence ELR instead of DLQ.
X16 représente, comme indiqué plus haut, Arg, Gin ou Glu. Les groupes préférés pour X16, eu égard aux propriétés biologiques des peptides de formules II, III et IV, sont Arg et surtout Gin.X 16 represents, as indicated above, Arg, Gln or Glu. The preferred groups for X 16 , having regard to the biological properties of the peptides of formulas II, III and IV, are Arg and especially Gln.
Les peptides selon l'invention peuvent être utilisés tels quels ou sous la forme de sels d'addition avec un acide minéral ou organique, notamment l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide trifluoroacétique, l'acide méthanesulfonique ou l'acide paratoluène- sulfonique.The peptides according to the invention can be used as such or in the form of addition salts with a mineral or organic acid, in particular hydrochloric acid, hydrobromic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid or the paratoluenesulfonic acid.
Les peptides de formule II et leurs sels d'addition d'acide non toxiques sont des substances antagonistes. Ils bloquent l'action des peptides de formules I, III et IV ci-dessous, d'une part, et eu égard aux résultats des essais qui ont été entrepris ils exercent une activité antagoniste vis-à-vis des chemokines de type CXC de la sous-famille ELR, telles que notamment IL8, NAP2, groa, gro et groy, d'autre part.The peptides of formula II and their non-toxic acid addition salts are antagonistic substances. They block the action of the peptides of formulas I, III and IV below, on the one hand, and having regard to the results of the tests which have been undertaken, they exert an antagonistic activity vis-à-vis chemokines of the CXC type. the ELR subfamily, such as notably IL8, NAP2, groa, gro and groy, on the other hand.
Les peptides de formules III et IV ainsi que leurs sels d'addition d'acide non toxiques ont les mêmes activités que les peptides antérieurs de formule I. Ils présentent toutefois un effet stimulant sur la prolifération des cellules souches hématopïétiques après chimio- ou radiothérapies qui est particulièrement intéressant selon l'invention. Ainsi, les peptides de formule III, les peptides de formule IV et leurs sels d'addition d'acide non toxiques sont utiles en thérapeutiques vis-à-vis des effets néfastes des chimio- et radiothérapies sur les lignées hématopoïétiques. En outre, à la différence desdits peptides de formule I. les peptides de formules III et IV peuvent présenter des activités chimio- tactiques pour les leucocytes.The peptides of formulas III and IV as well as their non-toxic acid addition salts have the same activities as the previous peptides of formula I. They nevertheless have a stimulating effect on the proliferation of hematopoietic stem cells after chemotherapy or radiotherapy which is particularly interesting according to the invention. Thus, the peptides of formula III, the peptides of formula IV and their non-toxic acid addition salts are useful in therapeutics with respect to the harmful effects of chemo- and radiotherapy on hematopoietic lines. In addition, unlike said peptides of formula I. the peptides of formulas III and IV can exhibit chemotactic activities for leukocytes.
Les propriétés biologiques et pharmacologiques des composés selon l'invention sont en grande partie dues à leur capacité à s'organiser en une ou plusieurs structures secondaires (hélice α, feuillets β et coudes β) leur permettant d'adopter des conformations particulières. Les notions d'hélice α, de feuillets β et de coudes β figurent dans la littérature et sont bien connues de l'homme de l'art. Voir notamment S. MARQUSEE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989 ; 86, pages 5286-5290, d'une part, et C.R. MATTHEWS et al, Annu. Rev. Biochem., 1993 ; 62, pages 653-683, d'autre part.The biological and pharmacological properties of the compounds according to the invention are largely due to their ability to organize into one or more secondary structures (α helix, β sheets and β elbows) allowing them to adopt particular conformations. The concepts of α helix, β sheets and β elbows appear in the literature and are well known to those skilled in the art. See in particular S. MARQUSEE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86, pages 5286-5290, on the one hand, and CR MATTHEWS et al, Annu. Rev. Biochem., 1993; 62, pages 653-683, on the other hand.
Pour les peptides de formule II, III et IV, le segment peptidiqueFor peptides of formula II, III and IV, the peptide segment
(S) commençant à X04 et se terminant vers X]5 possède la propriété de former une hélice α stable. L'hélicité de ce segment S et du peptide le contenant est importante voire essentielle à la manifestation des propriétés biologiques et pharmacologiques des produits de l'invention ;(S) starting at X 04 and ending at X ] 5 has the property of forming a stable α helix. The helicity of this segment S and of the peptide containing it is important or even essential for the manifestation of the biological and pharmacological properties of the products of the invention;
1) le maintien et la stabilité de l'hélicité α dudit segment exigent, selon les expérimentations du Déposant, la présence à l'extrémité N- terminale de X04 des résidus 1 à 3 de la séquence X01-Xo -Ser03 ; la délétion partielle ou totale de ladite séquence en amont de X04 a pour conséquence :1) the maintenance and stability of the α helicity of said segment require, according to the experiments of the Applicant, the presence at the N-terminal end of X 04 of residues 1 to 3 of the sequence X 01 -Xo -Ser 03 ; the partial or total deletion of said sequence upstream of X 04 results in:
(i) de réduire l'hélicité α des peptides de formule II, III et IV calculée au moyen d'une banque de données (voir V. MUNOZ et al, Nature : Struct. BioL, 1994 ; 1, pages 399-409) et mesurée par dichroïsme circulaire, RMN et infra-rouge en Transformée de Fourier,(i) to reduce the α helicity of the peptides of formula II, III and IV calculated by means of a database (see V. MUNOZ et al, Nature: Struct. BioL, 1994; 1, pages 399-409) and measured by circular dichroism, NMR and infrared in Fourier Transform,
(ii) d'inverser le rapport R (hélice α/structures β), et (iii) de réduire de façon importante les propriétés biologiques des peptides résultant de ladite délétion par rapport aux peptides de formules II, III et IV selon l'invention ; 2) selon le Déposant, le choix des résidus des positions 4 et 6 du peptide de formules II, III et IV, à savoir X04 et X06, est important en ce qui concerne l'hélicité α et le rapport R ; aussi pour avoir un pourcentage d'hélicité α maximal et augmenter ledit rapport R, l'on recommande selon l'invention de faire appel : (i) à un résidu X04 qui soit Pro et mieux Ala ou Leu, et(ii) invert the R ratio (α helix / β structures), and (iii) significantly reduce the biological properties of the peptides resulting from said deletion compared to the peptides of formulas II, III and IV according to the invention ; 2) according to the Applicant, the choice of the residues of positions 4 and 6 of the peptide of formulas II, III and IV, namely X 04 and X 06 , is important as regards the helicity α and the ratio R; also in order to have a maximum helicity percentage α and to increase said ratio R, it is recommended according to the invention to use: (i) a residue X 04 which is Pro and better Ala or Leu, and
(ii) à un résidu X06 qui soit avantageusement Ala, Leu ou Ile ; par exemple un résidu X06=Pro diminue considérablement le pourcentage d'hélice α du segment S et des peptides contenant ledit segment S, d'une part, et réduit d'un facteur 50 à 100 les activités biologiques et pharmacologiques desdits peptides résultant de la substitution X06 =Pro, d'autre part ; et,(ii) to a residue X 06 which is advantageously Ala, Leu or Ile; for example a residue X 06 = Pro considerably decreases the percentage of α helix of the S segment and of the peptides containing said S segment, on the one hand, and reduces by a factor of 50 to 100 the biological and pharmacological activities of said peptides resulting from the substitution X 06 = Pro, on the other hand; and,
3) les peptides selon l'invention présentent dans leur segment S une hélicité α maximale se situant au niveau des résidus aminoacides 7 à 113) the peptides according to the invention have in their S segment a maximum α helicity located at the amino acid residues 7 to 11
(plus principalement au niveau du résidu 9) de la séquence de formule II, III ou IV. Pour ces peptides, cette hélicité α maximale, qui est déterminée au moyen du logiciel "AGADIR" (il s'agit d'une valeur prédictive), est supérieure ou égale à 0,12 (i.e. supérieure ou égale à 12 %). (En pratique, cette valeur seuil de 0,12 unité correspond à 1,12 fois l'hélicité α de la séquence des aminoacides 34-58 du PF4.) Le logiciel "AGADIR", qui est disponible depuis 1997 dans sa dernière version, est un algorithme permettant de calculer une valeur prédictive de l'hélicité de chacun des résidus aminoacides d'un peptide. Voir à cet effet l'article de V. MUNOZ et al., Nature : Struct. Biol., 1994 ; 1, pages 399-409 précité, d'une part, et les articles suivants : (i) V. MUNOZ et al, J. Mol. Biol., 1995 ; 245, pages 275-296-, (ii) V. MUNOZ et al., J. Mol. Biol., 1995 ; 245, pages 297-308 ; et (iii) V. MUNOZ et al, Biopolymers, 1997 ; 41, pages 495-509, d'autre part.(more mainly at the level of residue 9) of the sequence of formula II, III or IV. For these peptides, this maximum α helicity, which is determined using the "AGADIR" software (this is a predictive value), is greater than or equal to 0.12 (ie greater than or equal to 12%). (In practice, this threshold value of 0.12 units corresponds to 1.12 times the helicity α of the amino acid sequence 34-58 of PF4.) The "AGADIR" software, which has been available since 1997 in its latest version, is an algorithm for calculating a predictive value for the helicity of each of the amino acid residues of a peptide. See to this effect the article by V. MUNOZ et al., Nature: Struct. Biol., 1994; 1, pages 399-409 cited above, on the one hand, and the following articles: (i) V. MUNOZ et al, J. Mol. Biol., 1995; 245, pages 275-296-, (ii) V. MUNOZ et al., J. Mol. Biol., 1995; 245, pages 297-308; and (iii) V. MUNOZ et al, Biopolymers, 1997; 41, pages 495-509, on the other hand.
Le fait que le segment peptidique S comporte une hélice α stable a pour conséquence que chacun des résidus aminoacides X05 à X1 ne doit pas être un groupe destructeur d'hélicité (en anglais : " hélix breaking residue") tel que Pro et Gly. Ainsi chacun des X05 et X07 à Xî4 sera différent de Pro et Gly.The fact that the peptide segment S comprises a stable α helix has the consequence that each of the amino acid residues X 05 to X 1 must not be a group for destroying helicity (in English: "helix breaking residue") such as Pro and Gly . Thus each of X 05 and X 07 to X î4 will be different from Pro and Gly.
En bref, un au moins des résidus aminoacides du segment S des peptides de formules II, III et IV présente une hélicité α supérieure ou égale à 12%.In short, at least one of the amino acid residues of the S segment of the peptides of formulas II, III and IV has an α helicity greater than or equal to 12%.
Outre le segment S, la séquence des résidus aminoacides de la position 16 environ à la position 20-25 a une influence sur les activités des peptides de formule I selon l'invention. Au-delà de la position 25, l'insertion de quelques résidus aminoacides supplémentaires (notamment 1 à 5) ne modifie pratiquement pas les activités des peptides de formules III et IV. En conséquence (i) l'extrémité C-terminale des peptides selon l'invention peut être arrêtée à la position 20 (eicosapeptides de formule II actifs en tant qu'antagonistes des peptides I, III et IV), à la position 23 (tricosapeptides de formule III) ou à la position Y25 = Pro (composés pentacosapeptides), et (ii) on peut poursuivre la séquence jusqu'à la position 27 pour y introduire in fine un résidu Tyr afin de disposer de peptides convenant comme réactifs biologiques pour diagnostic notamment in vitro.In addition to the S segment, the sequence of the amino acid residues from position 16 approximately to position 20-25 has an influence on the activities of the peptides of formula I according to the invention. Beyond position 25, the insertion of a few additional amino acid residues (in particular 1 to 5) practically does not modify the activities of the peptides of formulas III and IV. Consequently (i) the C-terminal end of the peptides according to the invention can be stopped at position 20 (eicosapeptides of formula II active as antagonists of peptides I, III and IV), at position 23 (tricosapeptides of formula III) or at position Y 25 = Pro (pentacosapeptide compounds), and (ii) the sequence can be continued up to position 27 to ultimately introduce a Tyr residue therein in order to have peptides suitable as biological reagents for diagnosis in particular in vitro.
Il peut être recommandé, d'un point de vue analytique (notamment dans le domaine du diagnostic et celui de l'expérimentation pharmaco- logique), d'avoir au moins un résidu Tyr dans la séquence des aminoacides des peptides de formule II, III ou IV. Le résidu Tyr, qui est notamment plus facilement détectable ou marquable (au moyen d'un radio-isotope) que les autres résidus aminoacides naturels, peut être situé sur l'une des positions 2, 5, 7 à 15, 17, 24 ou 27 dans le peptide de formule II, III ou IV. Expérimentalement on a trouvé qu'il est plus pratique du point de vue analytique que Tyr soit le dernier résidu aminoacide de l'extrémité C-terminale. En d'autres termes, le résidu Tyr, s'il est présent, sera de préférence localisé en position 27 dans la formule IV.It can be recommended, from an analytical point of view (especially in the field of diagnosis and that of pharmacological experimentation), to have at least one Tyr residue in the amino acid sequence peptides of formula II, III or IV. The Tyr residue, which is in particular more easily detectable or labeling (by means of a radioisotope) than the other natural amino acid residues, can be located in one of the positions 2, 5, 7 to 15, 17, 24 or 27 in the peptide of formula II, III or IV. Experimentally it has been found that it is more analytically practical for Tyr to be the last amino acid residue of the C-terminus. In other words, the Tyr residue, if present, will preferably be located at position 27 in formula IV.
Les eicosapeptides de formule II sont intéressants eu égard à leur action en tant qu'antagonistes des peptides de formules I, III et IV, c'est-à- dire (i) qu'ils comportent dans leur structure le ou les récepteurs des peptides de formules I, III et IV, ou (ii) qu'ils se fixent préférentiellement sur lesdits récepteurs en inhibant ainsi l'action desdits peptides de formules I, III et IV. Les eicosapeptides présentent un intérêt sur le plan analytique en ce qui concerne l'étude desdits récepteurs et celle des substances qui s'y fixent.The eicosapeptides of formula II are interesting with regard to their action as antagonists of the peptides of formulas I, III and IV, that is to say (i) that they contain in their structure the receptor or receptors of the peptides of formulas I, III and IV, or (ii) that they preferentially bind to said receptors thereby inhibiting the action of said peptides of formulas I, III and IV. Eicosapeptides are of analytical interest with regard to the study of said receptors and that of the substances which bind to them.
Les tricosapeptides de formule III et les peptides de formule IV se distinguent des peptides antérieurs de formule I par le fait qu'il n'ont aucune action sur la phase S de la mitose, alors que les peptides de formule I présentaient, selon WO-A-99/41283 précité, un effet bénéfique sur le cycle cellulaire en prolongeant la phase S intervenant lors de la mitose. Lesdits peptides de fonnules III et IV peuvent présenter jusqu'à huit activités essentielles (1-8) réparties en trois classes fonctionnelles (A-C), à savoir qu'ils sont utiles - classe A (fonction hématopoïétique)The tricosapeptides of formula III and the peptides of formula IV are distinguished from the previous peptides of formula I by the fact that they have no action on the S phase of mitosis, whereas the peptides of formula I presented, according to WO- A-99/41283 cited above, a beneficial effect on the cell cycle by prolonging the S phase occurring during mitosis. Said peptides of formulas III and IV can exhibit up to eight essential activities (1-8) divided into three functional classes (A-C), namely that they are useful - class A (hematopoietic function)
(1) en tant qu'inhibiteurs de l'hématopoïèse, et plus précisément en tant qu'inhibiteurs de la prolifération hématopoïétique (effet intéressant vis-à-vis des syndromes myéloprolifératifs) ;(1) as inhibitors of hematopoiesis, and more specifically as inhibitors of hematopoietic proliferation (interesting effect with respect to myeloproliferative syndromes);
(2) en tant qu'agents stimulants sur la prolifération des cellules souches hématopoïétiques après chimio- ou radiothérapies ;(2) as stimulating agents on the proliferation of hematopoietic stem cells after chemotherapy or radiotherapy;
(3) en tant qu'agents cytoprotecteurs, et en particulier dans la cytoprotection anti-apoptotique de cellules souches hématopoïétiques ;(3) as cytoprotective agents, and in particular in the anti-apoptotic cytoprotection of hematopoietic stem cells;
(4) en tant que produits ayant un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules hématopoïétiques ; (5) en tant qu'agents d'expansion hématopoïétique et/ou purge médullaire ; - classe B (fonction angiogénique)(4) as products having an inhibitory effect on the differentiation of hematopoietic cells; (5) as hematopoietic expanding agents and / or medullary bleeding; - class B (angiogenic function)
(6) en tant qu'agents anti-angiogénèse ; et/ou,(6) as anti-angiogenesis agents; and or,
- classe C (fonction anti-inflammatoire)- class C (anti-inflammatory function)
(7) en tant qu'agents virustatiques, notamment vis-à-vis des virus et rétrovirus à capside lipidique ;(7) as virustatic agents, in particular with regard to viruses and retroviruses with a lipid capsid;
(8) en tant qu'agents anti-inflammatoires.(8) as anti-inflammatory agents.
Comme indiqué dans O-A-99/41283, il est rappelé ce qui suit. Les syndromes myéloprolifératifs mentionnés ci-dessus comprennent en particulier : (1°) la thrombocytémie essentielle, (2°) la polyglobulie de VAQUEZ, (3°) la myélofibrose et (4°) la leucémie myéloïde chronique.As indicated in O-A-99/41283, the following is recalled. The myeloproliferative syndromes mentioned above include in particular: (1 °) essential thrombocythaemia, (2 °) polycythemia vera, (3 °) myelofibrosis and (4 °) chronic myeloid leukemia.
Par l'expression "agent d'expansion hématopoïétique", on entend ici un produit qui agit au niveau des cellules hématopoïétiques en favorisant ou stimulant la croissance des cellules souches telles que celles qui sont à l'origine des granulocytes, des plaquettes et des érythrocytes.By the term "hematopoietic blowing agent" is meant here a product which acts at the level of hematopoietic cells by promoting or stimulating the growth of stem cells such as those which are at the origin of granulocytes, platelets and erythrocytes .
La purge médullaire intervient souvent après l'expansion médullaire. Elle est nécessaire en cas de greffe de moelle osseuse.Spinal bleeding often occurs after spinal cord expansion. It is necessary in the event of a bone marrow transplant.
On a également constaté que les substances hépariniques (notamment l'héparine usuelle utilisée en tant que produit anticoagulant et les héparines de faible poids moléculaire) n'inhibent pas l'activité des peptides de formules II, III et IV selon l'invention.It has also been found that heparinic substances (in particular the usual heparin used as an anticoagulant product and heparins of low molecular weight) do not inhibit the activity of the peptides of formulas II, III and IV according to the invention.
Les peptides de fonnules II, III et IV peuvent être préparés suivant une méthode connue en soi par application de mécanismes réactionnels chimiques ou biologiques classiques, à savoir par synthèse peptidique ou par génie génétique.The peptides of formulas II, III and IV can be prepared according to a method known per se by application of conventional chemical or biological reaction mechanisms, namely by peptide synthesis or by genetic engineering.
En bref, chaque composé de fonnules II, III ou IV selon l'invention présente, au niveau de ses résidus aminoacides 7 à 11, (i) une hélicité α maximale qui est supérieure ou égale à 0,12 (i.e. 12 %, qui est déterminée au moyen du logiciel "AGADIR") et (ii) un rapport R supérieur ou égal à 1,5.In short, each compound of formulas II, III or IV according to the invention has, at its amino acid residues 7 to 11, (i) a maximum α helicity which is greater than or equal to 0.12 (ie 12%, which is determined using the "AGADIR" software) and (ii) an R ratio greater than or equal to 1.5.
On a fourni ci-après un certain nombre d'exemples selon l'invention et de résultats d'essais pharmacologiques. L'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration.A number of examples according to the invention and results of pharmacological tests have been provided below. All of these elements are in no way limiting but are given by way of illustration.
On préconise une utilisation des produits de formules III et IV selon l'invention, qui est caractérisée en ce que l'on fait appel à un composé peptidique choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les peptides de formules III et IV et (b) leurs sels d'addition d'acide non toxiques, pour la préparation d'un médicament :The use of the products of formulas III and IV according to the invention is recommended, which is characterized in that a compound is used. peptide chosen from the group consisting of (a) the peptides of formulas III and IV and (b) their non-toxic acid addition salts, for the preparation of a medicament:
(1) inhibiteur de l'hématopoïèse, destiné à un usage en thérapeutique vis- à-vis des syndromes myéloprolifératifs ;(1) hematopoiesis inhibitor, intended for therapeutic use with respect to myeloproliferative syndromes;
(2) stimulant la prolifération des cellules souches hématopoïétiques, destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des effets néfastes sur les cellules hématopoïétiques suivant les chimio- et radiothérapies ;(2) stimulating the proliferation of hematopoietic stem cells, intended for use in therapy vis-à-vis the harmful effects on hematopoietic cells following chemotherapy and radiotherapy;
(3) cytoprotecteur, destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des agressions cytotoxiques ;(3) cytoprotective, intended for use in therapy with respect to cytotoxic aggressions;
(4) stimulant l'expansion des cellules hématopoïétiques et/ou la purge médullaire, destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une insuffisance médullaire ou en cas de greffe médullaire ;(4) stimulating the expansion of hematopoietic cells and / or spinal bleeding, intended for use in therapy with regard to spinal cord insufficiency or in the event of a spinal transplant;
(5) ayant un effet inhibiteur sur la différenciation des cellules hémato- poïétiques permettant l'expansion des cellules hématopoïétiques les moins différenciées au cours des protocoles d'expansion ex vivo des cellules hématopoïétiques ;(5) having an inhibitory effect on the differentiation of hematopoietic cells allowing the expansion of the least differentiated hematopoietic cells during the ex vivo expansion protocols of hematopoietic cells;
(6) anti-angiogénèse, destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une angiogénèse pathologique ; et/ou, (7) anti-inflammatoire, destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des inflammations.(6) anti-angiogenesis, intended for therapeutic use with respect to pathological angiogenesis; and / or, (7) anti-inflammatory, intended for therapeutic use against inflammations.
Les effets bénéfiques indiqués aux points 1 et 3-4 ci-dessus se manifestent spécifiquement sur les cellules normales (i.e. saines) mais ne sont pas observés sur les cellules anoπnales en particulier les cellules leucémiques et cancéreuses. Les peptides de formules III et IV sont donc utiles pour différencier les cellules saines des cellules anormales.The beneficial effects indicated in points 1 and 3-4 above manifest themselves specifically on normal (i.e. healthy) cells but are not observed on anoπnal cells, in particular leukemia and cancer cells. The peptides of formulas III and IV are therefore useful for differentiating healthy cells from abnormal cells.
Dans la liste de séquence fournie ci-après, on a donné à titre d'illustration la structure d'un fragment d'ADN codant pour le produit de l'exemple 1. L'invention concerne en outre les anticorps polyclonaux et mieux monoclonaux levés contre les peptides de formules II, III et IV ; les anticorps monoclonaux sont particulièrement utiles dans le domaine analytique pour apprécier la structure des analogues des composés de formules II, III et IV, d'une part, et dans le domaine de la purification quand formules II, III et IV, d'une part, et dans le domaine de la purification quand il s'agit d'isoler des peptides comprenant la séquence des composés de formule II, III ou IV, d'autre part.In the sequence list provided below, the structure of a DNA fragment coding for the product of Example 1 has been given by way of illustration. The invention also relates to the raised polyclonal and better monoclonal antibodies. against peptides of formulas II, III and IV; monoclonal antibodies are particularly useful in the analytical field for assessing the structure of analogs of the compounds of formulas II, III and IV, on the one hand, and in the field of purification when formulas II, III and IV, on the one hand, and in the field of purification when it is a question of isolating peptides comprising the sequence of the compounds of formula II, III or IV, on the other hand.
L'invention concerne de plus, en tant que produits industriels nouveaux, les fragments d'ADN qui codent pour les peptides de formules II, III ou IV. Exemples 1-90The invention further relates, as new industrial products, to the DNA fragments which code for the peptides of formulas II, III or IV. Examples 1-90
Des exemples représentatifs de l'invention ont été consignés dans les tableaux I, II et III ci-après. Ils ont été préparés par synthèse peptidique selon la technique classique en phase solide puis purifiés par HPLC sur colonne. Si nécessaire, ces peptides peuvent être préparés par génie génétique à partir des fragments d'ADN qui les codent. La structure des exemples comparatifs (CP1-CP4) est donné dans le tableau III, CP4 étant le produit de l'exemple 1 de O-A-99/41283 précité. Representative examples of the invention have been given in Tables I, II and III below. They were prepared by peptide synthesis according to the conventional solid phase technique and then purified by HPLC on a column. If necessary, these peptides can be prepared by genetic engineering from the DNA fragments which encode them. The structure of the comparative examples (CP1-CP4) is given in Table III, CP4 being the product of Example 1 of OA-99/41283 cited above.
TABLEAU I Eicosapeptides de formule IITABLE I Eicosapeptides of formula II
Produit StructureProduct Structure
Ex 1 PHSPTAQLIA TLKNGQKISLEx 1 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL
Ex 2 PHSPTVQLIA TLKNGQKISLEx 2 PHSPTVQLIA TLKNGQKISL
Ex 3 PYSPTAQLIA TLKNGQKISLEx 3 PYSPTAQLIA TLKNGQKISL
Ex 4 PHSPQTELIV KLKNGQKISLEx 4 PHSPQTELIV KLKNGQKISL
Ex 5 PHSPTAQLIA TLKNGQKISVEx 5 PHSPTAQLIA TLKNGQKISV
Ex 6 AHSPTAQLIA TLKNGQKISLEx 6 AHSPTAQLIA TLKNGQKISL
Ex 7 AHSPTVQLIA TLKNGQQISLEx 7 AHSPTVQLIA TLKNGQQISL
Ex 8 AYSPTAQLIA TLKNGQKISLEx 8 AYSPTAQLIA TLKNGQKISL
Ex 9 AHSPQTELIV KLKNGQKISLEx 9 AHSPQTELIV KLKNGQKISL
Ex 10 AHSPTAQLIA TLKNGQKISVEx 10 AHSPTAQLIA TLKNGQKISV
Ex 11 PHSATAQLIA TLKNGQKISLEx 11 PHSATAQLIA TLKNGQKISL
Ex 12 PHSATVQLIA TLKNGQKISLEx 12 PHSATVQLIA TLKNGQKISL
Ex 13 PYSATAQLIA TLKNGQKISLEx 13 PYSATAQLIA TLKNGQKISL
Ex 14 PHSAQTELIV KLKNGQKISLEx 14 PHSAQTELIV KLKNGQKISL
Ex 15 PHSATAQLIA TLKNGQKISVEx 15 PHSATAQLIA TLKNGQKISV
Ex 16 AHSATAQLIA TLKNGQKISLEx 16 AHSATAQLIA TLKNGQKISL
Ex 17 AHSATVQLIA TLKNGQQISLEx 17 AHSATVQLIA TLKNGQQISL
Ex 18 AYSATAQLIA TLKNGQKISLEx 18 AYSATAQLIA TLKNGQKISL
Ex 19 AHSAQTELIV KLKNGQKISLEx 19 AHSAQTELIV KLKNGQKISL
Ex 20 AHSATAQLIA TLKNGQKISVEx 20 AHSATAQLIA TLKNGQKISV
Ex 21 PHSPTAQLIA TLKNGRKISLEx 21 PHSPTAQLIA TLKNGRKISL
Ex 22 PHSPTVQLIA TLKNGRKISLEx 22 PHSPTVQLIA TLKNGRKISL
Ex 23 PYSPTAQLIA TLKNGRKISLEx 23 PYSPTAQLIA TLKNGRKISL
Ex 24 PHSPQTELIV KLKNGRKISLEx 24 PHSPQTELIV KLKNGRKISL
Ex 25 PHSPTAQLIA TLKNGRKISVEx 25 PHSPTAQLIA TLKNGRKISV
Ex 26 AHSPTAQLIA TLKNGRKISLEx 26 AHSPTAQLIA TLKNGRKISL
Ex 27 AHSPTVQLIA TLKNGRQISLEx 27 AHSPTVQLIA TLKNGRQISL
Ex 28 AYSPTAQLIA TLKNGRKISLEx 28 AYSPTAQLIA TLKNGRKISL
Ex 29 AHSPQTELIV KLKNGRKISLEx 29 AHSPQTELIV KLKNGRKISL
Ex 30 AHSPTAQLIA TLKNGRKISVEx 30 AHSPTAQLIA TLKNGRKISV
Ex 31 PHSATAQLIA TLKNGRKISLEx 31 PHSATAQLIA TLKNGRKISL
Ex 32 PHSATVQLIA TLKNGRKISLEx 32 PHSATVQLIA TLKNGRKISL
Ex 33 PYSATAQLIA TLKNGRKISLEx 33 PYSATAQLIA TLKNGRKISL
Ex 34 PHSAQTELIV KLKNGRKISLEx 34 PHSAQTELIV KLKNGRKISL
Ex 35 PHSATAQLIA TLKNGRKISVEx 35 PHSATAQLIA TLKNGRKISV
Ex 36 AHSATAQLIA TLKNGRKISLEx 36 AHSATAQLIA TLKNGRKISL
Ex 37 AHSATVQLIA TLKNGRQISLEx 37 AHSATVQLIA TLKNGRQISL
Ex 38 AYSATAQLIA TLKNGRKISLEx 38 AYSATAQLIA TLKNGRKISL
Ex 39 AHSAQTELIV KLKNGRKISLEx 39 AHSAQTELIV KLKNGRKISL
Ex 40 AHSATAQLIA TLKNGRKISV TABLEAU II Tricosapeptides de formule IIIEx 40 AHSATAQLIA TLKNGRKISV TABLE II Tricosapeptides of formula III
Produit StructureProduct Structure
Ex 41 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELREx 41 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 42 PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELREx 42 PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 43 PYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELREx 43 PYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 44 PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELREx 44 PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELR
Ex 45 PHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELREx 45 PHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELR
Ex 46 AHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELREx 46 AHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 47 AHSPTVQLIA TLKNGQQISL ELREx 47 AHSPTVQLIA TLKNGQQISL ELR
Ex 48 AYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELREx 48 AYSPTAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 49 AHSPQTELIV KLKNGQKISL ELREx 49 AHSPQTELIV KLKNGQKISL ELR
Ex 50 AHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELREx 50 AHSPTAQLIA TLKNGQKISV ELR
Ex 51 PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELREx 51 PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELR
E 52 PHSATVQLIA TLKNGQKISL ELRE 52 PHSATVQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 53 PYSATAQLIA TLKNGQKISL ELREx 53 PYSATAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 54 PHSAQTELIV KLKNGQKISL ELREx 54 PHSAQTELIV KLKNGQKISL ELR
Ex 55 PHSATAQLIA TLKNGQKISV ELREx 55 PHSATAQLIA TLKNGQKISV ELR
Ex 56 AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELREx 56 AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 57 AHSATVQLIA TLKNGQQISL ELREx 57 AHSATVQLIA TLKNGQQISL ELR
Ex 58 AYSATAQLIA TLKNGQKISL ELREx 58 AYSATAQLIA TLKNGQKISL ELR
Ex 59 AHSAQTELIV KLKNGQKISL ELREx 59 AHSAQTELIV KLKNGQKISL ELR
Ex 60 AHSATAQLIA TLKNGQKISV ELREx 60 AHSATAQLIA TLKNGQKISV ELR
Ex 61 PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELREx 61 PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 62 PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELREx 62 PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 63 PYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELREx 63 PYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 64 PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELREx 64 PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELR
Ex 65 PHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELREx 65 PHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELR
Ex 66 AHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELREx 66 AHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 67 AHSPTVQLIA TLKNGRQISL ELREx 67 AHSPTVQLIA TLKNGRQISL ELR
Ex 68 AYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELREx 68 AYSPTAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 69 AHSPQTELIV KLKNGRKISL ELREx 69 AHSPQTELIV KLKNGRKISL ELR
Ex 70 AHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELREx 70 AHSPTAQLIA TLKNGRKISV ELR
Ex 71 PHSATAQLIA TLKNGRKISL ELREx 71 PHSATAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 72 PHSATVQLIA TLKNGRKISL ELREx 72 PHSATVQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 73 PYSATAQLIA TLKNGRKISL ELREx 73 PYSATAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 74 PHSAQTELIV KLKNGRKISL ELREx 74 PHSAQTELIV KLKNGRKISL ELR
Ex 75 PHSATAQLIA TLKNGRKISV ELREx 75 PHSATAQLIA TLKNGRKISV ELR
Ex 76 AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELREx 76 AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 77 AHSATVQLIA TLKNGRQISL ELREx 77 AHSATVQLIA TLKNGRQISL ELR
Ex 78 AYSATAQLIA TLKNGRKISL ELREx 78 AYSATAQLIA TLKNGRKISL ELR
Ex 79 AHSAQTELIV KLKNGRKISL ELREx 79 AHSAQTELIV KLKNGRKISL ELR
Ex 80 AHSATAQLIA TLKNGRKISV ELR TABLEAU III Peptides de formule IVEx 80 AHSATAQLIA TLKNGRKISV ELR TABLE III Peptides of formula IV
Produit StructureProduct Structure
Ex 81 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLYEx 81 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY
Ex 82 PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELRAPLYEx 82 PHSPTVQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY
Ex 83 AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLYEx 83 AHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY
Ex 84 PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELRAPRYEx 84 PHSPQTELIV KLKNGQKISL ELRAPRY
Ex 85 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPRYEx 85 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL ELRAPRY
Ex 86 PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLYEx 86 PHSATAQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY
Ex 87 PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLYEx 87 PHSPTAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY
Ex 88 PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELRAPLYEx 88 PHSPTVQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY
Ex 89 AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLYEx 89 AHSATAQLIA TLKNGRKISL ELRAPLY
Ex 90 PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELRAPRYEx 90 PHSPQTELIV KLKNGRKISL ELRAPRY
CP 1 PHCPTAQLIA TLKNGRKICL DLQAPCP 1 PHCPTAQLIA TLKNGRKICL DLQAP
CP 2 PHΞPTPQLIA TLKNGQKISL DLQAPCP 2 PHΞPTPQLIA TLKNGQKISL DLQAP
CP 3 PHSTAPQLIA TLKNGQKISL ELRAPLYCP 3 PHSTAPQLIA TLKNGQKISL ELRAPLY
CP 4 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAP CP 4 PHSPTAQLIA TLKNGQKISL DLQAP
Essais pharmacologiquesPharmacological trials
On a résumé ci-après une partie des essais pharmacologiques qui ont été entrepris avec les peptides selon l'invention. Les essais qui suivent concernent plus précisément l'évaluation de l'effet radioprotecteur des peptides de formules III et IV selon l'invention.A summary of the pharmacological tests which have been undertaken with the peptides according to the invention is summarized below. The tests which follow relate more precisely to the evaluation of the radioprotective effect of the peptides of formulas III and IV according to the invention.
Deux protocoles ont été utilisés.Two protocols were used.
Selon le premier protocole, on a procédé comme suit :According to the first protocol, the procedure was as follows:
1. incubation pendant 48h de cellules de moelle de souris avec PBS (lot contrôle) ou PBS + 1 μg/ml de peptide à tester ;1. incubation for 48 hours of mouse marrow cells with PBS (control batch) or PBS + 1 μg / ml of peptide to be tested;
2. irradiation à 750 cGy ;2. irradiation at 750 cGy;
3. mesure de la viabilité (en %) par coloration (MTT) 24h après irradiation.3. measurement of viability (in%) by staining (MTT) 24 hours after irradiation.
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau IV.The results obtained are reported in Table IV.
TABLEAU IVTABLE IV
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0001
Selon le second protocole, on a procédé comme suit :According to the second protocol, the procedure was as follows:
1. incubation pendant 48h de cellules de moelle de souris avec PBS (lot contrôle) ou PBS + 50 ng/ml de peptide à tester ;1. incubation for 48 hours of mouse marrow cells with PBS (control batch) or PBS + 50 ng / ml of peptide to be tested;
2. irradiation à 750 cGy ;2. irradiation at 750 cGy;
3. culture des cellules sur une couche de cellules stromales irradiées ; 4. évaluation clonogénique à partir des cellules non adhérentes après 7, 21 ou 35 jours de culture.3. culturing the cells on a layer of irradiated stromal cells; 4. clonogenic evaluation from non-adherent cells after 7, 21 or 35 days of culture.
Les résultats obtenus (nombre de colonies) sont consignés dans le tableau V.The results obtained (number of colonies) are recorded in Table V.
TABLEAU VTABLE V
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0001
Il résulte des valeurs consignées dans les tableaux IV et V que les peptides de formules III et IV selon l'invention protègent les cellules souches hématopoïétiques des effets de l'irradiation. Essais cytoprotecteursIt follows from the values recorded in Tables IV and V that the peptides of formulas III and IV according to the invention protect hematopoietic stem cells from the effects of irradiation. Cytoprotective tests
Les essais entrepris avec les peptides de l'invention montrent qu'ils inhibent les effets "cytotoxiques" de 5FU. Essais RMNThe tests undertaken with the peptides of the invention show that they inhibit the "cytotoxic" effects of 5FU. NMR tests
Des essais RMN ont été réalisés en vue de corréler les résultats prédictifs du logiciel "AGADIR". Ces essais RMN ont été entrepris selon la méthode décrite par K. WUTRICH dans "NMR of proteins and nucleic acids" (Wiley-Interscience 1986) et adaptée au PF4 par E. Ilyina et al., Biochemistry, 1994 ; 34, pages 13436-13444 et par V.A. DARAGAN et al., Protein Science 1997 ; 6, pages 355-363. Cette méthode comprend la détermination de la variation des déplacements chimiques secondaires au niveau de chaque résidu dudit peptide.NMR tests were carried out in order to correlate the predictive results of the "AGADIR" software. These NMR tests were undertaken according to the method described by K. WUTRICH in "NMR of proteins and nucleic acids" (Wiley-Interscience 1986) and adapted to PF4 by E. Ilyina et al., Biochemistry, 1994; 34, pages 13436-13444 and by VA DARAGAN et al., Protein Science 1997; 6, pages 355-363. This method includes the determination of the variation of the secondary chemical displacements at the level of each residue of said peptide.
Les résultats obtenus pour les peptides selon l'invention Ex 21,The results obtained for the peptides according to the invention Ex 21,
Ex 41 et Ex 76, d'une part, et les peptides de comparaison CP 2 (4-25) [i.e. dépourvu des aminoacides 1-3] et CP 2 (4-23) [i.e. dépourvu des aminoacides 1-3 et 24-25], d'autre part, sont consignés dans les figures 1 à 5 ci-après. Ils confirment la stabilité de l'hélice α du segment S.Ex 41 and Ex 76, on the one hand, and the comparison peptides CP 2 (4-25) [i.e. free of amino acids 1-3] and CP 2 (4-23) [i.e. free of amino acids 1-3 and 24-25], on the other hand, are shown in Figures 1 to 5 below. They confirm the stability of the α helix of the S segment.
Pour Ex 21, Ex 41, Ex 76, CP 2 (4-25) et respectivement CP 2 (4-23), les Δδ sont de -0,50, -0,49, -0,50, -0,29 et respectivement -0,20 pour le résidu aminoacide en position 9 (ici Ile). For Ex 21, Ex 41, Ex 76, CP 2 (4-25) and respectively CP 2 (4-23), the Δδ are -0.50, -0.49, -0.50, -0.29 and respectively -0.20 for the amino acid residue in position 9 (here Ile).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé peptidique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par :1. Peptide compound, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
(a) les peptides répondant à la formule II :(a) the peptides corresponding to formula II:
Xθl Xθ2 Sεr X04 Xθ5 Xθ6 Xθ Xθ8 Xθ9 lO Xll Xl2 Xl3 Xl4 Xl5 Xl6 X17 X18 Ser X20 (II) (voir aminoacides 1-20 de SEQ ID No.1)Xθl Xθ2 Sεr X04 Xθ5 Xθ6 Xθ Xθ8 Xθ9 lO Xll Xl2 Xl3 Xl4 Xl5 Xl6 X 17 X 18 Ser X 20 (II) (see amino acids 1-20 of SEQ ID No.1)
(b) les peptides répondant à la formule III :(b) the peptides corresponding to formula III:
Xθl Xθ2 Ser Xθ4 Xθ5 θ6 Xθ Xθ8 θ9 lO Xll Xl2 Xl3 Xl4 Xl5 Xl6 X17 Xis Ser X20 Glu Leu Arg (III)Xθl Xθ2 Ser Xθ4 Xθ5 θ6 Xθ Xθ8 θ9 lO Xll Xl2 Xl3 Xl4 Xl5 Xl6 X 17 Xis Ser X 20 Glu Leu Arg (III)
(voir aminoacides 1-23 de SEQ ID No.1)(see amino acids 1-23 of SEQ ID No.1)
(c) les peptides répondant à la formule IV :(c) the peptides corresponding to formula IV:
Xoi Xθ2 Ser X04 XQ5 Xθ6 Xθ7 Xθ8 Xθ9 XlO Xll Xl2 Xl3 Xl4 l5 l6 Xl7 Xl8 Ser X o Glu Leu Arg X 4 Y 5 (IV)Xoi Xθ2 Ser X04 XQ5 Xθ6 Xθ7 Xθ8 Xθ9 XlO Xll Xl2 Xl3 Xl4 l5 l6 Xl7 Xl8 Ser X o Glu Leu Arg X 4 Y 5 (IV)
(voir SEQ ID No.1)(see SEQ ID No.1)
dans lesquelles X0ι est Pro, Gly ou Ala, les résidus aminoacides préférés étant Pro et Ala,in which X 0 ι is Pro, Gly or Ala, the preferred amino acid residues being Pro and Ala,
X0 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement His ou Glx, le résidu préféré étant His, X0 est Pro, Gly, Thr, Ala, Ile ou Leu, les résidus aminoacides préférés étant Pro, Ala et Leu, X05 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Thr, Glx, Asx ou Ala, le résidu préféré étant Thr, X06 représente Ala, Val, Gin, Leu, Ile ou Thr, le résidu aminoacide préféré étant Ala, X07 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Glx, X08 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val, X09 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ile, Leu ou Val, le résidu préféré étant Ile, Xio est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala ou Val, Xn est un résidu Lys, Ser ou Thr, l'aminoacide quelconque différent deX 0 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents His or Glx, the preferred residue being His, X 0 is Pro, Gly, Thr, Ala, Ile or Leu, the preferred amino acid residues being Pro, Ala and Leu, X 05 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Thr, Glx, Asx or Ala, the preferred residue being Thr, X 06 represents Ala, Val, Gin, Leu, Ile or Thr, the preferred amino acid residue being Ala, X 07 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala or Glx, X 08 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, X 09 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Ile, Leu or Val, the preferred residue being Ile, Xio is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Ala or Val, X n is a Lys, Ser or Thr residue, any amino acid different from
Cys et représente avantageusement le résidu préféré étant Thr, X12 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu ou Ile, le résidu préféré étant Leu,Cys and advantageously represents the preferred residue being Thr, X 12 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu or Ile, the preferred residue being Leu,
X13 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Ser, X14 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Asx ou Glx, le résidu préféré étant Asn, X15 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Gly, X16 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Arg ou Glx, Xι7 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Lys ou Gin,X 13 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Ser, X 14 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Asx or Glx, the preferred residue being Asn, X 15 is any amino acid residue different from Cys and advantageously represents Gly, X 16 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg or Glx, Xι 7 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Lys or Gin,
X18 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu, Ile, Val, Ala ou Tyr, le résidu préféré étant Ile, X2o est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Leu, Ile ou Val, le résidu préféré étant Leu, X2 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Ala, Asx, Glx ou Ser, les résidus préférés étant Ala et Glu, Y25 est un résidu Pro, Pro-X26 ou Pro-X26-Tyr, le résidu préféré étant le résidu monoaminoacide Pro, X26 est un résidu aminoacide quelconque différent de Cys et représente avantageusement Arg, Ile, Leu, Val, Met ou Trp, le résidu préféré étant Leu ; et, (d) leurs sels d'addition d'acide non toxiques ; et en ce que le segment peptidique (S), qu'il comporte, commençant à X04 et se terminant à X15 forme une hélice α stable. X 18 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu, Ile, Val, Ala or Tyr, the preferred residue being Ile, X 2 o is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Leu, Ile or Val, the preferred residue being Leu, X 2 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Ala, Asx, Glx or Ser, the preferred residues being Ala and Glu, Y 25 is a Pro, Pro-X 26 or Pro-X 26 residue -Tyr, the preferred residue being the monoamino acid residue Pro, X 26 is any amino acid residue other than Cys and advantageously represents Arg, Ile, Leu, Val, Met or Trp, the preferred residue being Leu; and, (d) their non-toxic acid addition salts; and in that the peptide segment (S), which it comprises, starting at X 04 and ending at X 15 forms a stable α helix.
2. Composé peptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par les eicosapeptides de formule2. Peptide compound according to claim 1, characterized in that it is chosen from the group consisting of eicosapeptides of formula
II et leurs sels d'addition non toxiques.II and their non-toxic addition salts.
3. Composé peptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi l'ensemble constitué par les tricosapeptides de formule3. Peptide compound according to claim 1, characterized in that it is chosen from the group consisting of tricosapeptides of formula
III et leurs sels d'addition non toxiques.III and their non-toxic addition salts.
4. Fragment d'ADN caractérisé en ce qu'il code pour un peptide de formules II, III ou IV selon la revendication 1.4. DNA fragment characterized in that it codes for a peptide of formulas II, III or IV according to claim 1.
5. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il est dirigé contre un peptide de formules II, III ou IV selon la revendication 1.5. Monoclonal antibody characterized in that it is directed against a peptide of formulas II, III or IV according to claim 1.
6. Utilisation d'un peptide choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les tricosapeptides de formule III, (b) les peptides de formule IV et (c) leurs sels d'addition d'acide non toxiques selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des effets néfastes des chimio- et radiothérapies sur les lignées hématopoïétiques .6. Use of a peptide chosen from the group consisting of (a) the tricosapeptides of formula III, (b) the peptides of formula IV and (c) their non-toxic acid addition salts according to claim 1, for the preparation of a medicament intended for use in therapy with regard to the harmful effects of chemo and radiotherapy on hematopoietic lines.
7. Utilisation d'un peptide choisi parmi l'ensemble constitué par (a) les tricosapeptides de formule III, (b) les peptides de formule IV et (c) leurs sels d'addition d'acide non toxiques selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament7. Use of a peptide chosen from the group consisting of (a) the tricosapeptides of formula III, (b) the peptides of formula IV and (c) their non-toxic acid addition salts according to claim 1, for the preparation of a drug
(a) inhibiteur de la prolifération hématopoïétique destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis des syndromes myéloprolifératifs,(a) hematopoietic proliferation inhibitor intended for therapeutic use with respect to myeloproliferative syndromes,
(b) stimulant la prolifération des cellules souches hématopoïétiques après chimio- ou radiothérapies, (c) cytoprotecteur destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une agression cytotoxique, notamment pour la protection anti-apoptotique de cellules hématopoïétiques,(b) stimulating the proliferation of hematopoietic stem cells after chemotherapy or radiotherapy, (c) cytoprotector intended for use in therapy with respect to cytotoxic aggression, in particular for the anti-apoptotic protection of hematopoietic cells,
(d) d'expansion et/ou purge médullaire destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une insuffisance médullaire ou en cas de greffe médullaire,(d) spinal cord expansion and / or purging intended for use in therapy for spinal cord insufficiency or in the event of a spinal cord transplant,
(e) anti-inflammatoire destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une inflammation,(e) anti-inflammatory intended for therapeutic use against inflammation,
(f) anti-angiogénèse destiné à un usage en thérapeutique vis-à-vis d'une angiogénèse pathologique, ou (g) différenciant les cellules saines des cellules anormales. (f) anti-angiogenesis intended for therapeutic use vis-à-vis pathological angiogenesis, or (g) differentiating healthy cells from abnormal cells.
8. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle renferme, en association avec un excipient physiologiquement acceptable, au moins un peptide de formules II, III ou IV selon la revendication 1 ou l'un de ses sels d'addition non toxiques. 8. Therapeutic composition, characterized in that it contains, in association with a physiologically acceptable excipient, at least one peptide of formulas II, III or IV according to claim 1 or one of its non-toxic addition salts.
9. Composé peptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente, au niveau de ses résidus 7 à 11, une valeur maximale d'hélicité α qui est supérieure ou égale à 0,12.9. A peptide compound according to claim 1, characterized in that it has, at its residues 7 to 11, a maximum value of helicity α which is greater than or equal to 0.12.
10. Composé peptidique suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente un rapport R = hélice α/structures β, qui est supérieur ou égal à 1,5. 10. Peptide compound according to claim 1, characterized in that it has a ratio R = α helix / β structures, which is greater than or equal to 1.5.
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