WO2001032705A1 - Polypeptides ligands du ghsr et leurs adn - Google Patents

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WO2001032705A1
WO2001032705A1 PCT/JP2000/007635 JP0007635W WO0132705A1 WO 2001032705 A1 WO2001032705 A1 WO 2001032705A1 JP 0007635 W JP0007635 W JP 0007635W WO 0132705 A1 WO0132705 A1 WO 0132705A1
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polypeptide
salt
seq
amino acid
ghsr
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PCT/JP2000/007635
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Shuji Hinuma
Yuji Kawamata
Shoji Fukusumi
Ryo Fujii
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel ligand polypeptide for growth hormone secretagogue receptor (GHSR), which is an orphan G protein-coupled receptor protein, and a DNA encoding the same.
  • GHSR growth hormone secretagogue receptor
  • G protein conjugated guanine nucleic acid protein
  • GHS Globally stable hormone secretagogue
  • GHRP-6 Growth hormone- releasing peptide-6
  • GHRH growth hormone-releasing hormone
  • GHRP_6 Greenth hormone secretagogue receptor, GH SR
  • GH SR Greenth hormone secretagogue receptor
  • An endogenous ligand for GHSR an orphan G protein-coupled receptor expressed in the central nervous system, circulatory system, reproductive system, immune system, digestive organs, etc. It is thought to be useful in screening for compounds that alter binding, but its structure and function have not been elucidated so far. Disclosure of the invention
  • the present inventors used cells expressing GHSR-encoding cDNA by an appropriate means, and measured the specific cell stimulating (signal transduction) activity as an index, using the receptor protein as a ligand. We succeeded in isolating and identifying a polypeptide that recognizes it.
  • the present inventors have found that a compound that changes the binding property between the ligand as the activator and the GHSR can be screened. That is, the present invention
  • polypeptide characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof;
  • polypeptide according to (1) above wherein the substantially identical amino acid sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, or an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof;
  • amino acid sequence described above which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 7.
  • a diagnostic agent comprising the DNA of (5) or the antibody of (6)
  • an antisense DNA having a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the DNA according to the above (5), and having an action capable of suppressing the expression of the DNA;
  • polypeptide according to the above (1), its amide or its ester or its salt, and the polypeptide containing the amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or (13) The above-mentioned (13), wherein the amide or its ester or its salt, or its partial peptide or its amide or its ester or its salt is used. Screening method,
  • a growth hormone secretion regulator comprising the compound according to (16) or a salt thereof,
  • a pituitary dwarfism which comprises administering the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof to a mammal, It relates to the prevention and treatment methods of Ichi Syndrome, Chronic Kidney Disease, Cartilage Dystrophy, Adult Pituitary Dysfunction, Down Syndrome, Silva Syndrome, Bone Dysplasia or Juvenile Chronic Joint Syndrome.
  • Fig. 1 shows the pattern of the active fraction in RESOURCE S derived from hypothalamus detected in Example 3 separated by Sephasil C 8 SC 2.1 / 10 and detection of CHO-GHSR-23-specific activity The results are shown.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence corresponding to the pesi-type gene sequence obtained in Example 5 (continued from FIG. 3).
  • FIG. 3 shows the amino acid sequence corresponding to the pesi-type gene sequence obtained in Example 5 (continuation of FIG. 2).
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence corresponding to the human gene sequence obtained in Example 6 (continued from FIG. 5).
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence corresponding to the human gene sequence obtained in Example 6 (continuation of FIG. 4).
  • FIG. 6 shows the amino acid sequence corresponding to the pesi-type gene sequence obtained in Example 5, the amino acid sequence corresponding to the human-type gene sequence obtained in Example 6, and the rat-type gene sequence obtained in Example 7. And comparison (alignment) of the corresponding amino acid sequences.
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence corresponding to the rat gene sequence obtained in Example 7 (continued from FIG. 8).
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence corresponding to the rat gene sequence obtained in Example 7 (continuation of FIG. 7).
  • GHSR for the polypeptide or its amide or its ester or its salt in the present invention
  • the above-mentioned known GHSR or in addition to the salt specifically, the above-mentioned known GHSR or In addition to the salt,
  • GHSR or a salt thereof according to the above (21) which is a protein containing an amino acid sequence in which one or more and ten or less amino acids are substituted with another amino acid, is mentioned.
  • the partial peptide of GHSR may be any of the above-mentioned partial peptides of GHSR.
  • GHSR protein molecules outside the cell membrane may be used. Sites that are exposed to the DNA and have ligand binding activity are used.
  • the partial peptide of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 24 is an extracellular region of GHSR (Hydrophilic site) It is a peptide that contains a portion that has been analyzed. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing multiple domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids in the partial peptide of GHSR is preferably a peptide having an amino acid sequence of at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the above-mentioned constituent amino acid sequences of GHSR.
  • a substantially identical amino acid sequence has a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with these amino acid sequences. 1 shows the amino acid sequence of the protein.
  • substantially the same means that the activities of the polypeptide or protein, for example, the binding activity between the ligand and the receptor (GHSR), the physiological characteristics, and the like are substantially the same.
  • Amino acid substitutions, deletions, additions or insertions often do not result in a significant change in the physiological or chemical properties of the polypeptide or protein, in which case the substitutions, deletions, additions or insertions are made.
  • the polypeptides made will be substantially identical to those without such substitutions, deletions, additions or insertions.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can be selected, for example, from other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • Non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tributophan, methionine and the like.
  • Polar (neutral) amino acids include dalysin, serine, threonine, cystine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • the positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine.
  • Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt is a ligand for GHSR, and specifically contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or its amide or its ester or its salt.
  • the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt (hereinafter sometimes simply referred to as the polypeptide of the present invention), its production method and The use is described in more detail below.
  • the polypeptide of the present invention includes human tissues from any warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, horse, monkey, etc.) (eg, pituitary gland, kidney, m, kidney, A polypeptide derived from the liver, gonads, thyroid gland, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.) or a cell, etc., which is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or Any polypeptide may be used as long as it has a substantially identical amino acid sequence.
  • warm-blooded animal eg, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, horse, monkey, etc.
  • human tissues eg, guinea pig, rat, mouse, bush, hidge, horse, monkey, etc.
  • the polypeptide of the present invention may be substantially the same as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in addition to the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Polypeptides having activity eg, polypeptides containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10
  • Substantially the same activity includes, for example, receptor (ligand) binding activity, signal transduction activity, and GH secretion promoting activity (action).
  • “Substantially the same quality” means that the receptor binding activity (ligand) binding activity and the like are the same in nature. Therefore, strength factors such as the strength of the receptor binding activity (Ligand), and quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • the polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes two amino acids from the N-terminal of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the third amino acid (V a1) is another amino acid (eg, Ala, Leu, lie, Thr, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gin, Arg, Lys, His , Asp, Glu) and the like.
  • an amino acid sequence in which the second amino acid (Val) from the N-terminus of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted by Thr (SEQ ID NO: 10) Preferred examples include polypeptides containing the same.
  • an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Specific examples of the contained polypeptide include a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7, and the like.
  • the polypeptide has an N-terminus at the left end (amino terminus) and a C-terminus at the right end (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide notation.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 2
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 The amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 4
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 The polypeptide containing the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is usually a carboxy group (-C00H) or is a Pokishireto (-C00-), C-terminal amide (- C0NH 2) or an ester (-C00R).
  • R of the ester for example methylation, Edjiru, n- propyl, C i _ 6 Al kill groups such as isopropyl or n- butyl, C 3 cyclopentyl, cyclohexylene, etc. cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, Hue alkenyl, alpha - C 6 _ 1 2 7 aryl group such as naphthyl, benzyl, phenethyl, phenylene Lou C i _ 2 alkyl, such as Benzuhi drill or ⁇ - naphthylmethyl Fei one naphthyl such as -. C 7 such as Bok 2 alkyl - Other 1 4 Ararukiru group, Viva Roy Ruo carboxymethyl group which is generally used as oral esters.
  • polypeptides of the present invention is a polypeptide as defined above, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., C i _ 6 Ashiru such formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Group), the N-terminal is cleaved in vivo, and the daryumil group generated is oxidized with lipamine, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule (for example, - ⁇ _H one SH, one C_ ⁇ _OH, Amino group, imidazole group, indole group, etc.
  • Mechionin residues of N-terminal e.g., C i _ 6 Ashiru such formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru Group
  • the N-terminal is cleaved in vivo
  • the daryumil group generated is oxidized with lipamine
  • Guanijino group if a suitable protecting group (eg, formyl group, C 2 such Asechiru - C i, such as 6 Arukanoiru group _ 6 those protected by Ashiru etc. group), or a sugar chain is bound as glycoproteins, etc. It also includes the complex evening protein.
  • a suitable protecting group eg, formyl group, C 2 such Asechiru - C i, such as 6 Arukanoiru group _ 6 those protected by Ashiru etc. group
  • a sugar chain is bound as glycoproteins, etc. It also includes the complex evening protein.
  • a salt with a physiologically acceptable base eg, an alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • Salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) , Tartaric acid, cunic acid, lignoic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Tartaric acid cunic acid, lignoic acid, oxalic acid
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a method for purifying a polypeptide from a tissue or cell of a human warm-blooded animal, or can be produced according to a polypeptide synthesis method described later. Alternatively, it can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the polypeptide described below.
  • the tissues or cells of the human warm-blooded animal are homogenized, and then extracted with an acid, an organic solvent, etc., and the extract is subjected to salting out, dialysis, Purification and isolation can be achieved by a combination of chromatography such as gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a known method for synthesizing a polypeptide, or by cleaving a polypeptide containing the polypeptide of the present invention with an appropriate peptide. it can.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide is produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the polypeptide of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protective group, removing the protective group to produce the desired peptide. can do.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 1.
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. be able to.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4_ (2', 4'-dimethoxyphenyl Fmocamino Ethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various condensation methods known per se.
  • the peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide.
  • lipodiimides examples include D (X, N, N'-diisopropylpropylcarpoimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carpoimide, and the like.
  • a protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H0Bt, HOOBt, etc.) or the activity of a pre-protected amino acid as a symmetric anhydride or HOBt ester or HOOBt ester It can be added to the resin after conversion.
  • a racemization inhibitor additive eg, H0Bt, HOOBt, etc.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetoamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, dimethyl Sulfoxides such as sulfoxide; tertiary amines such as pyridine; etyls such as dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; A mixture or the like is used.
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • alcohols such as trifluoroethanol
  • dimethyl Sulfoxides such as sulfoxide
  • tertiary amines such as pyridine
  • etyls such as dioxane and tetrahydrofuran
  • nitriles
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond forming reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 t: to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4 times excess.
  • Examples of the protecting group for the amino amino group of the starting amino acid include Z, Boc, Yuichi Shari-Pentyloxycarbonyl, Isopolnyoxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the protecting group of the carboxyl group for example E alkyl groups Flip above as R, C 3 - 8 cycloalkyl group, other C 7 _ aralkyl group, 2-Adamanchiru, 4 _ nitrobenzyl, 4- main Examples include toxic benzyl, 4-chloro benzyl, phenacyl group and benzyloxy carbonyl hydrazide, butyroxy carbonyl hydrazide, and trityl hydrazide.
  • E alkyl groups Flip above as R, C 3 - 8 cycloalkyl group, other C 7 _ aralkyl group, 2-Adamanchiru, 4 _ nitrobenzyl, 4- main Examples include toxic benzyl, 4-chloro benzyl, phenacyl group and benzyloxy carbonyl hydrazide, butyroxy carbonyl hydrazide, and trityl hydrazide.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydrobiranyl group, and a butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include zl, Cl 2 -Bz K 2
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydride, azide, and activated ester [alcohol (eg, phenol phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, ester with H0BO] etc.
  • Activated amino group of raw material examples include the corresponding phosphoric amide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as black or Pd carbon in a hydrogen stream, hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, Examples include acid treatment with trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • a catalyst such as black or Pd carbon in a hydrogen stream
  • hydrogen fluoride anhydride methanesulfonic acid
  • trifluoromethanesulfonic acid examples include acid treatment with trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally in the range of 20 to 4 Ot: Temperature, but acid treatment captures cations such as anisol, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol
  • acid treatment captures cations such as anisol, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol
  • the addition of an agent is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as the indole protecting group of tributofan is 1,2-enedithiol, 1,2
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia, etc.
  • Protection and protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, elimination of the protective groups, activation of the functional groups involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side.
  • a peptide in which only the protecting group of the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain was removed and a peptide (or amino acid) in which only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminal was removed were prepared. Condensation in such a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
  • the hydroxyl group of the carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the desired polypeptide is prepared in the same manner as the amide of the polypeptide. Can be obtained.
  • polypeptide of the present invention contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above.
  • Any polypeptide may be used as long as it has the same action as the peptide, for example, the activity of binding to GHSR, the activity of transmitting a signal to GHSR, and the activity of promoting GH secretion (action).
  • Examples of such polypeptides include the peptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 described above.
  • the polypeptide of the present invention can be further used as an antigen for preparing an antibody against the polypeptide.
  • Such polypeptides as antigens include, in addition to the polypeptides of the present invention described above, partial peptides such as the N-terminal peptide, C-terminal peptide, and central peptide of the polypeptide of the present invention. Used.
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide of the present invention include a DNA containing a DNA encoding a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Anything can be used as long as it is A.
  • genomic DNA genomic DNA library
  • cDNA library derived from the above-described tissue / cell
  • cDNA library derived from the above-described tissue / cell
  • synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the RNA fraction can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an RNA fraction prepared from the above-mentioned tissue / cell.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, as described above, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or Examples include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the DNA containing the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing the DNA encoding Examples thereof include DNA containing DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the like.
  • Examples of the DNA containing DNA include a DNA containing a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is encoded.
  • Examples of the DNA containing the DNA represented by SEQ ID NO: 8 include a DNA containing the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, and a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • Examples of the DNA containing the DNA encoding the DNA include DNA containing the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11.
  • Examples of a DNA containing a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 9 About 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, and more preferably about 98% or more.
  • Examples of the DNA containing a DNA encoding a polypeptide containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, 1) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 9 A base sequence in which one or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 or 2) bases in the base sequence are deleted, (2) SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 9 A base sequence to which one or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 or 2) bases have been added in the base sequence represented, 3 SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 9 A base sequence into which one or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 or 2) bases have been inserted in the base sequence represented, 4 SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 9 1 or 2 or more in the nucleotide sequence represented by (Preferably about 1 to 10, more preferably 1 or 2) A base sequence in which another base is substituted with another base, or a DNA containing a DNA having a base sequence combining them.
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
  • the present invention contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 due to the degeneracy of the genetic code.
  • DNA that does not hybridize with the sequence of DNA containing DNA encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1 and the sequence defined in (1) but encodes a polypeptide having the same amino acid sequence is used. Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Examples of the DNA that hybridizes with the sequence of the DNA containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, SEQ ID NO: : 2 or a nucleotide sequence having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9. DNA or the like is used.
  • a DNA fragment containing a partial nucleotide sequence of DNA encoding a polypeptide containing the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 ⁇ is also preferably used as a DNA detection probe.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention can also be produced by the following genetic engineering techniques.
  • a target DNA is amplified from the DNA library or the like by a PCR method known per se, or a suitable vector is used.
  • the integrated DNA can be selected, for example, by hybridization with a DNA fragment having a partial or entire region of the polypeptide of the present invention or labeled with a synthetic DNA.
  • the hybridization is performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et ah, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, perform the procedure described in the attached instruction manual.
  • the cloned DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the polypeptide of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by connecting it downstream of one of the promoters.
  • Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13) Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19 , pSH15), bacteriophage such as ⁇ phage, and animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19 , pSH15
  • bacteriophage such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • the promoter derived from SV40 First retrovirus promoters, metacholine protein promoters, heat shock promoters, cytomegalovirus promoters, and SR promoters can be used.
  • the host is Escherichia, the trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter overnight, 1 pp promoter, etc., and if the host is Bacillus, the SPO1 promoter 1.
  • the host is an enzyme such as SPO2 promoter or pen P promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH1 promoter, GAL promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferred.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Anything can be used.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp), neomycin resistance Gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne0-, G418 resistant) and the like.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp ampicillin resistance gene
  • Ne0-, G418 resistant neomycin resistance Gene
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide or its partial peptide.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA-signal sequence, an OmpA signal sequence, etc., and when the host is a bacillus, a human amylase, a signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc., and when the host is a yeast, In some cases, mating factor (MFa) signal sequence, invertase, signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule ⁇ A signal sequence or the like can be used.
  • a transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the polypeptide thus constructed.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insects or insect cells, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli (Escherich a coli) K12 ⁇ DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the Sciences of the Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Volume 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], J J221 [Journal 'ob' Journal of Molecular Biology], 120 vol., 517 (1978)], ⁇ 101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C 600 [Genetics ), 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (198 4)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of a night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell) or Trichoplusia ni
  • Intestinal MG1 cells Trichoplusia ni egg-derived High Five cells, Mamestra A cell derived from brassicae or a cell derived from Estigmena acrea is used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) is used.
  • Sf cell examples include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell [Vaughn, JL et al., In Vitro, 13, 213-217 (1977)]. Are used.
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CH ⁇ , DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr-CH ⁇ cells), mouse L cells, mouse 3T3 cells, mouse myeloma cells, Human 293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, LB3T3 cells, S ⁇ _2 ⁇ cells and the like are used.
  • Transformation of insect cells or insects is performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, 52, 456 (1973).
  • Methods for introducing an expression vector into cells include, for example, the lipofection method [Feigner, PL et al. Processings of the National Academia. —'Ob 'Shengenjis' Ob 'The' U.S.A. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the -United States of America), 84, 7413 (1987)], Calcium phosphate method CGraham, FL and van der Eb , AJ Virology, 52, 456-467 (1973)], electroporation [Nuemann, E. et al. EMBO J., 1, 841-845 (1982) Year)]).
  • a method for stably expressing the polypeptide of the present invention using animal cells there is a method of selecting cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome by clone selection. Specifically, a transformant is selected using the above-mentioned selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having high expression ability of the polypeptide of the present invention can be obtained by repeatedly performing clonal selection on the animal cells obtained using the selection marker.
  • the MTX concentration is gradually increased, the cells are cultured, and a resistant strain is selected, whereby the polypeptide of the present invention or a partial peptide thereof is encoded together with the dhfr gene.
  • the resulting DNA can be amplified intracellularly to obtain even more highly expressed animal cell lines.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing the above transformant under conditions capable of expressing DNA encoding the polypeptide of the present invention, and producing and accumulating the polypeptide of the present invention. it can.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, zein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • Inorganic or organic substance, inorganic Examples of the substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid (Miller, Journal of Experiments in Molecular Millet, Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • the medium used was Grace's Insect Medium (Grace, T., Nature, 195,788 (1962)). And the like to which additives such as the above are appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • culturing a transformant in which the host is an animal cell for example, about 5
  • MEM medium containing ⁇ 20% fetal bovine serum (Science, 122, 501 (1952)), DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal o 'The' American 'Me: Ikare' Association (The Journal of the American Medical Association) Vol. 199, 519 (1967)], 199 Medium [Proceding of the Society. 'For the Biological ⁇ Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), Vol. 73, 1 (1950)] is used.
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30t: ⁇ 40 for about 15-60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • CHO (dhfr-) cells and the dhfr gene are used as selection markers, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal serum containing almost no thymidine.
  • polypeptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the polypeptide of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and then mixed with ultrasonic waves, lysozyme and Z or frozen. After the cells or cells are destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration may be used as appropriate.
  • Protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride, Triton
  • a surfactant such as X-100 (registered trademark, sometimes abbreviated as TM hereinafter) may be included.
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the polypeptide of the present invention contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. It can.
  • These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly for molecular weight analysis. Methods that use differences, methods that use differences in charges such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinities such as affinity chromatography, and methods that use differences in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography. A method utilizing the difference between isoelectric points, such as isoelectric focusing and chromatofocusing, is used.
  • the polypeptide of the present invention when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained in a salt, it is known per se. It can be converted to a free form or another salt by a method or a method analogous thereto.
  • the polypeptide of the present invention produced by the recombinant may be modified with an appropriate protein-modifying enzyme to arbitrarily modify or partially remove the polypeptide.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the polypeptide of the present invention thus produced can be measured by enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention includes (1) searching for the physiological action of the polypeptide of the present invention, (2) preparing a synthetic oligonucleotide probe or PCR primer, and (3) GH.
  • the receptor-binding assay system using the recombinant GHSR expression system described below can efficiently screen GHSR agonists or antagonists specific to warm-blooded animals such as humans,
  • the agonist or anginaist can be used as an agent for preventing or treating various diseases.
  • the polypeptide of the present invention or DNA encoding the same is useful as a safe and low-toxic drug because GHSR recognizes the polypeptide of the present invention as a ligand. Since the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the same are involved in the GH secretion promoting action and the like, for example, pituitary dwarfism, Turner syndrome, chronic kidney disease, chondrodystrophy, adult pituitary gland It can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as incomplete disease, Down's syndrome, Silver's syndrome, osteogenesis imperfecta or juvenile chronic joint syndrome.
  • the polypeptide of the present invention or a DNA encoding the same is used as the above-mentioned medicament, it can be carried out in a conventional manner.
  • parenteral use in the form of injections such as suspensions such as suspensions.
  • the compounds or salts thereof may be combined with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in generally accepted unit dosage forms required for pharmaceutical practice. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • the DNA may be used alone or as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector. After insertion into an appropriate vector, such as one, it can be performed according to conventional means.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a leavening agent such as magnesium stearate
  • a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin
  • a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cellulose
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be prepared according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil
  • Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (for example, ethanol), polyalcohols (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50) You may.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg mice, rats, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
  • the dosage of the polypeptide of the present invention or the DNA encoding it varies depending on the symptoms and the like. However, in the case of oral administration, generally, in adult patients with chronic kidney disease (with a body weight of 60 kg), the dose is one dose. It is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1.0 to about 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, administration method, etc.
  • adult patients with chronic kidney disease body weight 60 kg
  • About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day is administered by intravenous injection. It is convenient.
  • a dose converted per 6 O kg can be administered.
  • polypeptide of the present invention its production method and use are described in more detail below.
  • the use of the polypeptide of the present invention, DNA encoding the polypeptide and an antibody will be specifically described below.
  • the polypeptide of the present invention and DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used as a polypeptide or a preventive or therapeutic agent for GHSR deficiency. Can be used.
  • the polypeptide of the present invention when there is a patient in vivo who cannot expect a physiological action (such as a GH secretion promoting action) of a ligand due to a decrease in the polypeptide of the present invention or GHSR, (a) the polypeptide of the present invention or By administering and expressing the DNA encoding the polypeptide of the present invention to the patient, or (mouth) introducing and expressing the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the polypeptide of the present invention into brain cells or the like. After that, the amount of polypeptide in the brain cells of the patient can be increased, for example, by transplanting the brain cells into the patient, and the effect of the polypeptide can be sufficiently exerted.
  • a physiological action such as a GH secretion promoting action
  • the polypeptide of the present invention or the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used as a safe and low-toxicity agent for preventing or treating polypeptide deficiency.
  • the DNA may be used alone or after being inserted into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like. Can be carried out according to the same means as in the case of using DNA encoding the above polypeptide as a medicament. '
  • the polypeptide of the present invention has a binding property to GHSR or a salt thereof or a partial peptide of the receptor protein or a salt thereof, in vivo, GHSR or a salt thereof or a partial basis of the GHSR is used.
  • concentration of the peptide or its salt can be determined with high sensitivity.
  • This quantification method can be used, for example, in combination with a competition method. That is, by bringing the subject into contact with the polypeptide of the present invention,
  • the concentration of GHSR or a salt thereof, or a partial peptide of GHSR or a salt thereof can be measured.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by using GHSR or a salt thereof or a partial peptide thereof or a salt thereof, or by constructing an expression system for a recombinant GHSR and using a receptor binding system using the expression system. That alters the binding of GHSR to GHSR (eg, a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) (eg, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, etc.) or The salt can be screened.
  • GHSR eg, a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention
  • the salt can be screened.
  • Such compounds include GHS R-mediated cell stimulating activity (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c) a compound having an activity of promoting the activation of fos, lowering of pH, etc. (ie, GHSR agonist); a compound having no such cell stimulating activity (ie, GHSR antagonist); “Altering the binding to a ligand” includes both the case of inhibiting the binding to the ligand and the case of promoting the binding to the ligand.
  • GHS R-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c
  • the present invention relates to (i) a case where the polypeptide of the present invention is brought into contact with a GHSR or a salt thereof or a partial peptide or a salt thereof, and (ii) a GHSR or a salt thereof or a portion of the GHSR described above.
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof is provided.
  • the screening method of the present invention (i) when the polypeptide of the present invention is brought into contact with the GHSR or the partial peptide of the GHSR, and (ii) when the GHSR or the partial peptide of the GHSR is
  • the polypeptide of the present invention and a test compound are brought into contact with each other, for example, the amount of a ligand bound to the GHSR or a partial peptide of the GHSR, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the labeled polypeptide of the present invention When the labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with the above-mentioned GHSR or its salt or a partial peptide of GHSR or its salt, the labeled polypeptide of the present invention and the test compound are converted into GHSR or its compound. Measure and compare the amount of the labeled polypeptide of the present invention bound to the GHSR or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof when contacted with a salt or a partial peptide of the GHSR or a salt thereof.
  • the polypeptide of the present invention and GHSR A method for screening a compound that changes the binding property of a compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof,
  • a GHSR-activating compound (eg, the polypeptide of the present invention) is contacted with a GHSR-containing cell, and a GHSR-activating compound and a test compound are contacted with a GHSR-containing cell.
  • GHSR-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular Activity of promoting or inhibiting protein phosphorylation, activation of c-fos, lowering of pH, etc.
  • a GHSR-activating compound eg, the polypeptide of the present invention
  • a compound that activates GHSR and a test compound are brought into contact with GHSR expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding GHSR
  • the cell-stimulating activity via GHSR for example, , Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular cAMP production, intracellular c GMP product, Inoshito one Berlin acid production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c one fos
  • a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and GHSR which is characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing pH reduction etc.
  • the GHSR used in the screening method of the present invention may be any GHSR containing the above GHSR or the partial peptide of GHSR. Minutes and the like are preferred. However, since it is extremely difficult to obtain human-derived organs in particular, GHSR and the like, which are expressed in large quantities using recombinants, are suitable for screening.
  • GHSR-containing cells or the cell membrane fraction when used, the preparation method described later may be followed.
  • the cells When cells containing GHSR are used, the cells may be immobilized with dataraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • GHSR-containing cells refer to host cells that have expressed GHSR, Examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. In addition, host cells that have expressed GHSR include the same method as the above-mentioned method for producing a transformant transformed with the expression vector containing the polypeptide of the present invention.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by crushing cells and then using a method known per se.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, crushing with a Warlinda blender ⁇ Polytron (manufactured by Kinematica), crushing by ultrasonic waves, pressing the cells from a narrow nozzle while pressing with a French press, etc. Crushing by eruption is mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (1500 rpm to 30000 rpm). Centrifuge for 1 minute to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in expressed GHSR and membrane components such as cell-derived phospholipid / membrane proteins.
  • the amount of GHSR in cells containing the GHSR and in the membrane fraction is 10 per cell.
  • It is preferably from 10 to 10 molecules, and more preferably from 10 to 10 molecules.
  • an appropriate GHSR is used.
  • a fraction and a labeled polypeptide of the present invention are used.
  • the GHSR fraction a natural GHSR fraction or a recombinant GHSR fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • “equivalent activity” means equivalent ligand binding activity and the like.
  • Labeled ligands, labeled ligand analog compounds and the like are used. For example, ligands labeled with [H], [I], [C], [S] and the like can be used.
  • cells containing GHSR or a membrane fraction of the cells are first suspended in a buffer suitable for screening.
  • a buffer suitable for screening Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of tris-monohydrochloride.
  • the aim is to reduce non-specific binding.
  • surfactants such as CHAPS, Tween-80 (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), or peptide sutin is added for the purpose of suppressing receptor degradation by the protease and degradation of the polypeptide of the present invention. You can also. A fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of the labeled polypeptide of the present invention is added to 0.0 1 ml to 10 ml of the receptor overnight solution, and 10 to 10 M of the test compound is simultaneously allowed to coexist.
  • a reaction tube containing a large excess of the unlabeled polypeptide of the present invention is also prepared to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 50, preferably 4 to 37 t: for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an oven.
  • the count (B.-one NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B.) when there is no antagonistic substance is 100%, the specific binding amount (B-N
  • a test compound having an SB) of, for example, 50% or less can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
  • GHSR a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention
  • GHSR Cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-1 activity that promotes or suppresses fos activation, pH reduction, etc.
  • known methods or commercially available measurement kits can be measured using known methods or commercially available measurement kits.
  • cells containing GHSR are cultured in a multiwell plate or the like. Before performing screening, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add the test compound, etc., incubate for a certain period of time, extract the cells, or collect the supernatant. The product produced is quantified according to each method.
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activity such as inhibition of CAMP production can be detected as an activity of inhibiting production of cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • cells that express the appropriate GHSR are required.
  • Cells expressing the GHSR of the present invention include the aforementioned GH
  • An SR-expressing cell line is desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • a screening kit for a compound that changes the binding property of the polypeptide of the present invention or its precursor protein to GHSR (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof is provided by GHSR or a salt thereof, Partial peptide of or its salt, cells containing GHSR, or containing GHSR And the polypeptide of the present invention.
  • screening kit of the present invention examples include the following. 1. Screening reagent
  • the cells were subcultured in 5 ⁇ 10 holes on a 12-well plate and cultured for 2 days in 5% CO 2 and 95% air at 37.
  • polypeptide of the present invention labeled with [H], [I], [C], [S], etc.
  • polypeptide of the present invention is dissolved in PBS containing 0.1% Pserum serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and the resulting mixture is stored at 12.
  • NS B Non-specific Binding ⁇ B.
  • Maximum binding amount A compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that changes the binding between the polypeptide of the present invention and GHSR (inhibits or promotes the binding).
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention specifically, a compound having a cell stimulating activity via GHSR or a salt thereof (so-called GHSR agonist), or a compound having no such stimulating activity.
  • the so-called GHSR Anne Gonist examples of the compound include a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, and a fermentation product. These compounds may be a novel compound or a known compound.
  • the specific method of evaluating whether the above is a GHS R agonist or an evening gonist may follow the following (i) or (ii).
  • test compound is brought into contact with cells containing GHSR, and the GHSR-mediated cell stimulating activity is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is a GH SR agonist.
  • a GHSR-activating compound eg, a polypeptide of the present invention or a GHS R agonist
  • a GHSR-activating compound and a test compound contain GHSR.
  • GHSR-mediated cell stimulating activity when contacted with cells is measured and compared.
  • a compound or a salt thereof capable of decreasing the cell stimulating activity of a compound that activates GHSR is GHSR antagonist.
  • the GHSR agonist has an action similar to the physiological activity of the polypeptide of the present invention on GHSR, it is useful as a safe and low-toxic drug like the polypeptide of the present invention.
  • GHSR antagonists can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention against GHSR, and thus are useful as safe and low-toxic drugs for suppressing the receptor activity.
  • GHSR agonists are required to treat GH-deficient diseases such as pituitary dwarfism, Evening syndrome, chronic kidney disease, and cartilage dystrophy. It can be used as a treatment and prevention agent for diseases such as nutrition, adult pituitary failure, Down syndrome, Silver syndrome, osteogenesis imperfecta and juvenile chronic joint syndrome.
  • GHSR antagonists are diseases caused by excessive secretion of GH, such as acromegaly, TSH-producing tumors, nonsecretory (non-functional) pituitary tumors, ectopic ACTH (adrenocorticotropin) -producing tumors, It can be used as a therapeutic or prophylactic agent for diseases such as medullary thyroid cancer, VIP-producing tumor, glucagon-producing tumor, gastrin-producing tumor, insulinoma, carcinoid, and insulin-dependent and non-dependent diabetes.
  • a pharmaceutically acceptable salt or the like is used as a salt of a compound obtained by using the above-described screening method or screening kit. Examples include salts with inorganic bases, salts with organic bases, salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the salt with an inorganic base include an alkali metal salt such as a sodium salt and a potassium salt, an alkaline earth metal salt such as a calcium salt and a magnesium salt, and an aluminum salt and an ammonium salt.
  • salts with organic bases include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N'—Salts with dibenzylethylenediamine and the like.
  • salts with inorganic acids include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid And the like.
  • salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, and oltinine
  • salt with an acidic amino acid include, for example, aspartic acid, dalminic acid, and the like. Salt.
  • An antibody for example, polyclonal antibody, monoclonal antibody
  • antiserum against the polypeptide of the present invention can be produced by using the polypeptide of the present invention as an antigen according to a known method for producing an antibody or antiserum.
  • polyclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of polyclonal antibody]
  • a polyclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • a complex of an immunizing antigen (antigen such as a polypeptide) and a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal (eg, a mammal (eg, a heron, a sheep, a goat, Immunize rats, mice, guinea pigs, guinea pigs, pests, pests, and birds) and birds (eg, chickens, pigeons, ducks, geese, peas), and contain antibodies from the immunized animals to the polypeptides of the present invention. It can be produced by collecting the substance and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by cross-linking the carrier to the immunity.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced with respect to the hapten.
  • serum albumin, thyroglobulin, keyhole limpet-hemocyanin, etc. Is used in a weight ratio of about 0.:! To 20 and preferably about 1 to 5 with respect to 1 hapten.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to the above-mentioned warm-blooded animal at a site where antibody production is possible, or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance antibody production during administration.
  • administering is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody is preferably collected from blood, ascites, or the like of a mammal immunized by the above method.
  • the antibody titer against the polypeptide of the present invention in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer of the culture supernatant of the hybridoma described below. Separation and purification of antibodies are described later.
  • the immunoglobulin separation and purification can be carried out in the same manner as the monoclonal antibody separation and purification described above.
  • a monoclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of monoclonal antibody]
  • the polypeptide of the present invention may be a warm-blooded animal (eg, a mammal (eg, a heron, a sheep, a goat, a rat, a mouse, a guinea pig, a lion, a horse, a bush), a bird (eg, a chicken, a pigeon, (Duck, goose, quail, etc.) is administered by itself or together with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • an individual with an antibody titer was selected from the warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, a mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • the antibody-producing cells contained therein By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is performed, for example, by reacting the labeled polypeptide of the present invention described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Köhler and Mills [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP 2/0, AP-1, and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells to be used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG 1,000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the hybridoma is directly attached to a polypeptide antigen of the present invention or a solid phase (eg, a microplate) adsorbed with a carrier.
  • a polypeptide antigen of the present invention or a solid phase (eg, a microplate) adsorbed with a carrier.
  • a method for detecting a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed, and labeling with a radioactive substance, an enzyme, or the like To the polypeptide of the present invention bound to a solid phase.
  • a radioactive substance, an enzyme, or the like such as how to detect the clonal antibody, and the like.
  • Selection of a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto. It is usually performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 :, preferably about 37 :.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • Culture is usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer of the antiserum against the polypeptide of the present invention.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention can be carried out in the same manner as in the separation and purification of a normal monoclonal antibody.
  • Ion exchanger eg DEAE
  • Adsorption / desorption method ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody
  • the antibody against the polypeptide of the present invention produced according to the above-described methods (a) and (b) can specifically recognize the polypeptide of the present invention
  • the antibody of the present invention in the test solution can be used. It can be used for quantification of peptides, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
  • the present invention provides, for example,
  • An antibody that reacts with the polypeptide of the present invention is allowed to react competitively with the test solution and the labeled polypeptide of the present invention, and the ratio of the labeled polypeptide of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution comprising:
  • the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide of the present invention
  • the other antibody is the C-terminal of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention provides a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution, which is an antibody that reacts with the antibody.
  • the polypeptide of the present invention can be measured using a monoclonal antibody that recognizes the polypeptide of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (for example, the amount of the polypeptide) in the liquid to be measured is measured chemically.
  • any measuring method may be used as long as it is detected by physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, and a luminescent substance.
  • a radioisotope for example, [
  • the above-mentioned enzymes are preferably those which are stable and have a high specific activity.
  • 3-galactosidase 3-darcosidase, alkaline phosphatase, baroxidase, apple
  • acid dehydrogenase include fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiosinate
  • luminescent substances include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized anti-polypeptide antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled anti-polypeptide antibody (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized anti-polypeptide antibody
  • secondary reaction the labeled anti-polypeptide antibody
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the anti-polypeptide antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction have different binding sites to the polypeptide of the present invention. Used. That is, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention, for example, the antibody used in the primary reaction is preferably used. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the antibody against the polypeptide of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • a competition method an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to react competitively with an antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation Measure the amount of labeling in either B or F to determine the amount of antigen in the test wave.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody, etc. and an immobilized antibody is used as a first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • an antigen in a test wave and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of a labeled antibody, and then a solid phase and a liquid phase are separated.
  • the raw material is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test wave is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using an antibody against the polypeptide of the present invention.
  • a disease associated with the polypeptide of the present invention can be diagnosed.
  • Diseases involving the polypeptide of the present invention include diseases caused by GH deficiency, such as pituitary dwarfism, Turner's syndrome, chronic kidney disease, chondrodystrophy, and adult pituitary insufficiency And diseases such as Down's syndrome, Silva's syndrome, osteogenesis imperfecta or juvenile chronic joint syndrome.
  • the test wave can be prepared from a test mammal (eg, human, egret, sheep, goat, rat, mouse, guinea pig, pit, poma, pig) by a method known per se.
  • the test liquid includes, for example, blood, lymph, urine and the like.
  • the antisense DNA having a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to DNA encoding the polypeptide of the present invention includes a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention. Any antisense DNA may be used as long as it has the ability to suppress the expression of the DNA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA encoding the polypeptide of the present invention is, for example, a nucleotide sequence complementary to the DNA encoding the polypeptide of the present invention (that is, a complementary strand of the DNA of the present invention).
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the polypeptide of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon).
  • An antisense DNA having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the complementary strand is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like. .
  • the antisense DNA has an activity of suppressing the expression of the DNA encoding the polypeptide of the present invention, it can be used for diseases caused by excessive secretion of GH, such as acromegaly, TSH-producing tumor, and non-secretory tumor.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be used, for example, by using it as a probe in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, horseshoe, (DNA, mRNA, damage, mutation, etc.) of the DNA or mRNA, which can be detected in the DNA or mRNA of the present invention in a mouse, cat, dog, monkey, etc.).
  • it is useful as an agent for diagnosing a gene such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or excessive expression.
  • the above-described genetic diagnosis using DNA encoding the polypeptide of the present invention can be performed, for example, by For example, there are known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), Proceedings of Ob. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Volume 86, 276-62 Page 0 (1989, 9)).
  • GH deficiency a disease caused by GH deficiency, such as pituitary dwarfism, Turner syndrome, chronic kidney disease, chondrodystrophy, adult pituitary gland It is highly likely that the disease is insufficiency, Down's syndrome, Silver's syndrome, bone dysplasia or juvenile chronic joint syndrome.
  • a transgenic non-human expressing the polypeptide or the like of the present invention Animals can be made.
  • non-human animals include mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, sheep, bush, oysters, cats, dogs, monkeys, etc.) and the like (hereinafter abbreviated as animals).
  • the DNA in transferring the DNA encoding the polypeptide of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a small gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct in which the DNA of the present invention derived from an animal having high homology to the DNA is bound to a downstream of various promoters capable of expressing the same in animal cells may be used, for example.
  • the book by microinjection into mouse fertilized eggs It is possible to produce a DNA-transferred animal that highly produces the protein of the present invention.
  • a virus-derived promoter or a ubiquitous expression promoter such as meta-mouth thionein can be used, but an NGF gene promoter specifically expressed in the brain and a phenolase gene promoter are preferably used.
  • Transfer of the DNA encoding the polypeptide of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject animal.
  • the presence of the polypeptide or the like of the present invention in the germinal cells of the produced animal after the DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the polypeptide or the like of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • Means The progeny of this type of animal that has inherited the gene has the polypeptide of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal encoding the polypeptide of the present invention can be bred in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the gene is stably maintained by the cross. . Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, all progeny have the DNA. Can be bred and subcultured.
  • the animal into which the DNA encoding the polypeptide of the present invention has been transferred has a high level of expression of the polypeptide of the present invention, and thus is used for screening of an agonist or an agonist for the polypeptide of the present invention. It is useful as an animal.
  • a DNA-transferred animal encoding the polypeptide of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture. For example, directly analyzing DNA or RNA in the tissue of a DNA transgenic mouse encoding the polypeptide of the present invention, or analyzing the tissue in which the polypeptide of the present invention expressed by the gene is present Thus, the polypeptide of the present invention can be analyzed.
  • the cells of a tissue having the polypeptide or the like of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the functions of cells from tissues that are generally difficult to culture, such as those derived from brain or peripheral tissues. be able to.
  • tissue culture techniques for example, various groups It is also possible to select drugs that enhance the function of the weave.
  • the polypeptide of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • H is or H: histidine
  • Trp or W Tribute fan
  • HONB N-hydroxy-5-norporene-1,2,3-dicarboximide
  • Bz1 benzyl
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • [SEQ ID NO: 1] 3 shows an amino acid sequence encoding the ligand polypeptide of the present invention obtained in Example 3 described later.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ( ⁇ -type).
  • Example 7 shows an amino acid sequence encoding the oxypolypeptide obtained in Example 5 described later.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 ( ⁇ -type).
  • Example 6 shows an amino acid sequence encoding a human polypeptide obtained in Example 6 described later.
  • SEQ ID NO: 5 human type
  • Example 7 shows an amino acid sequence encoding a rat polypeptide obtained in Example 7 described later.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (rat type).
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (human type).
  • SEQ ID NO: 10 The amino acid sequence at the 2nd to 18th positions from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is shown.
  • GHSR (Pig lb) described in Howard et.al.Science, vol.273, p974-977, (1996). 1 shows the encoded amino acid sequence.
  • the transformant Escherichia co 1 i JM109 / phKW9 carrying the endogenous ligand gene of human GHSR (SEQ ID NO: 6, FIG. 4, FIG. 5) obtained in Example 6 described below was prepared on December 6, 1999. Deposited from the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) under the deposit number FERM BP-6963, and deposited at the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number I FO 16327 from October 27, 1999. It has been.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • IFO Fermentation Research Institute
  • Example 7 The transformant Escherichia coli JM109 / prKW4 carrying the endogenous rat GHSR ligand gene (SEQ ID NO: 8, FIG. 7, FIG. 8) obtained in Example 7 described below was obtained on December 6, 1999. Was deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) under the deposit number FERM BP-6962, and with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number I FO 16328 from October 27, 1999. ing.
  • NI BH National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • IFO Fermentation Research Institute
  • Example 1 Establishment of GHSR expressing CHO cells
  • the rat type GHSR (growth hormone secretagogue receptor) gene was obtained as follows. Based on the sequence of rat type GHSR type 1A reported in Molecular Endocrinology 11 (4), 415-423 (1997), the following two types of synthetic DNAs were synthesized.
  • GHCF 5'-GTCGACCATGTGGAACGCGACCCCCAGCGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • cDNA polymerase chain react ion
  • PCR reaction solution was 2 il l (derived from 0.2 ng poly (A) + RNA) of rat hypothalamus cDNA solution, GHCF l (10 zM), 1 l of GHR (10 M), 10x buffer solution attached and 5 dNTPs (Im), 1 Klen Taq (Clontech) and 351 distilled water were added to make a total of 501.
  • the reaction solution was subjected to a PCR reaction using ThermalCycler9600 (PerkinElmer). PCR conditions were 952 minutes denaturation followed by 35 cycles of 98 seconds at 10 seconds and 68 at 90 seconds.
  • the PCR product was subcloned using a TA cloning kit (Invitrogen). Plasmids were extracted from the E. coli obtained by subcloning using an automatic plasmid extractor (Kurabo Co., Ltd.), the base sequence of the inserted fragment was determined, and the sequence was the same as the GHSR cDNA reported in the above literature. Was confirmed. Next, the plasmid was digested with restriction enzymes Sa1I and NheI to obtain a GHSR cDNA fragment of about 1.1 kb.
  • PAKKO-111H an expression vector for animal cells
  • PAKKO-111H an expression vector for animal cells
  • electrophoresis was performed to recover the vector portion.
  • the rat GHS receptor cDNA fragment and the expression vector prepared by the above procedure were ligated by ligation, and E. coli JM109 was transformed to obtain E. coli JM109Zp AKKOGHSR.
  • the transformant E. coli JM109ZPAKKOGHSR was cultured to prepare a large amount of plasmid pAKKOGHSR DNA.
  • GHRP-6 an artificial peptide that acts on GHSR
  • Highly reactive clones were selected based on acid metabolite release activity.
  • CHO-GHSR-23 was established as a highly reactive clone thus obtained, and was used for searching for an endogenous ligand.
  • Extracts were prepared from the hypothalamus by the method described below and stored refrigerated, and used as samples for screening for cell stimulating activity.
  • the hypothalamus was boiled and crushed, extracted with 1M acetic acid, and added to a C18 column after adding 0.05% TFA (trifluoroacetic acid) to the centrifuged supernatant. It was eluted stepwise with acetonitrile (CH 3 CN) at a concentration of 50%. Each eluate was prepared in 2 OmM ammonium acetate (CH 3 CO ⁇ NH 4 ) -10% acetonitrile (pH 4.7), and then adsorbed on a CM Sepharose cation exchange column (HiPrep CM Sepharose FF, Pharmacia). , 10 OmM, 200 mM, 50 OmM, 100 OmM sodium chloride (NaCl).
  • each fraction was deproteinized by adding 3 volumes of acetone, concentrated, adsorbed to 3 ml of reversed-phase column RESOURCE RPC (Pharmacia), fractionated with a 10-30% acetonitrile concentration gradient, and each fraction was separated. Lyophilized.
  • the cell stimulating activity was measured using the arachidonic acid metabolite releasing activity from the cells as an index.
  • CHO-GHS R-23 cells or control cells were dispersed by trypsin digestion, and 0.5 ml each of l.OxlO 5 / ml diluted in a medium was dispensed into a 24-well plate. Cultured overnight. The medium was replaced with a medium containing 1/200 of [ 3 H] -arachidonic acid (NEN), and further cultured overnight, and then used for activity measurement.
  • a representative example of an active substance that specifically increases the release of arachidonic acid metabolites from CHO-GHSR-23 cells purified from the hypothalamus is described below. ⁇ ⁇ 2 kg of the hypothalamus was fragmented and boiled in 4.0 L of distilled water for 15 minutes. After quenching, 28 Om1 acetic acid was added to a final concentration of 1.0 M, and homogenized (12 kr pm, 6 min) with a Polytron. After the homogenate was stirred, the supernatant was obtained by centrifugation. The precipitate was suspended in 2.0 L of 1.0 M acetic acid, homogenized with a Polytron, and centrifuged to obtain a supernatant again.
  • CH_ ⁇ - GHSR- 23 specifically Arakidon acid metabolites from the cells A promoting activity was detected.
  • the obtained active fraction was added again to 3 ml of RESOURCE RPC, and eluted with a 14.0-18.0 CH 3 CN gradient. From the CHO-GH SR-23 cells, a 17.5% CH 3 CN fraction was added. Arachidonic acid metabolite releasing activity was detected.
  • the active fractions 20mMCH 3 COONH 4/10% CH 3 CN ZdH 2 0 pH4. 7 Dilute with, and added to a cation exchange column RESOURCE S lml (Pharmacia). .
  • Example 4 Amino acid sequencing of an active substance that specifically increases the arachidonic acid metabolite release activity from CH ⁇ -GHSR-23 cells purified from the hypothalamus purified from Example 3 The amino acid sequence of an active substance that specifically increases the arachidonic acid metabolite release activity from CHO-GHSR-23 cells was determined. The fraction of the peak corresponding to the activity on the reverse phase column Sephasil C8, 5 / zm SC2.1 / 10 was freeze-dried, and then amino acid sequence analysis was performed using a peptide sequencer (PE Applied Biosystems Procice 491cLC). As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • Example 5 Acquisition of endogenous ligand gene for GHSR
  • PCR was performed using the cDNA synthesized according to the attached manual as type III.
  • the PCR reaction solution was attached to cDNA solution 41 (derived from 4 ng poly (A) + RNA), 1 ⁇ 1 dNTPs (10 mM), 0.5 // 1 Klen Taq DNA polymerase (Clontech), and 2.51 Klen Taq DNA polymerase.
  • cDNA solution 41 derived from 4 ng poly (A) + RNA
  • 1 ⁇ 1 dNTPs (10 mM
  • 0.5 // 1 Klen Taq DNA polymerase (Clontech) 0.5 // 1 Klen Taq DNA polymerase (Clontech), and 2.51 Klen Taq DNA polymerase.
  • 0.5 l each of 10x buffer, 161 distilled water, and synthetic DNAs 13 and 31 ⁇ (10 M each) were added to make a total of 251.
  • the reaction solution was subjected to PCR using ThermalCycler 9600.
  • the PCR conditions consisted of denaturation at 95 ° C for 2 minutes, and a cycle of 98 10 seconds and 68 ⁇ 60 seconds repeated 38 times.
  • the PCR product was directly sequenced using a PRISM model 377 DNA sequencer (PE Biosystems), and the gene sequence was determined. (SEQ ID NO: 4, Fig. 2 and Fig. 3) were obtained.
  • the amino acid sequence predicted from this DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 3, FIG. 2 and FIG.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) from the hypothalamus obtained from Example 4 is from the 2nd to the 18th of SEQ ID NO: 3, and this gene encodes the GHSR-type endogenous ligand gene of GHSR. It was confirmed that it was a gene.
  • Example 6 Acquisition of human GHSR endogenous ligand gene
  • hR 5'-CCGGTGGCCTAAAGTGTGGTCTCA-3 '(SEQ ID NO: 15)-Human whole brain poly (A) KitNAl g from Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech PCR was performed using cDNA synthesized in accordance with the attached manual. The PCR reaction solution and conditions were the same as in Example 5 except that hF and hR were used for the synthetic DNA. After confirming the amplification of a PCR product of about 1.3 kb by electrophoresis using a part of the PCR product, the PCR product was directly sequenced using the PRISM model 377 DNA sequencer (PE Biosystems), and The type gene sequence (SEQ ID NO: 6, Fig. 4, Fig. 5) was obtained.
  • PCR was performed from rat whole brain poly (A) + RNAlg using a Marathon DNA Amplification Kit (Clontech) with cDNA synthesized according to the attached manual as type III.
  • the PCR reaction solution and conditions were the same as in Example 5 except that rF and rR were used for the synthetic DNA.
  • the PCR product was directly sequenced using a PRISM model 377 DNA sequencer (PE Biosystems) and rat-type genes were analyzed.
  • the sequence SEQ ID NO: 8, Fig. 7, Fig. 8) was obtained.
  • the amino acid sequence predicted from this DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 7, FIGS. 7 and 8.
  • the obtained gene was a rat-type endogenous ligand gene of GHSR.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention can be used for (1) searching for the physiological action of the polypeptide of the present invention; Preparation of primers for probe or PCR, 3 acquisition of DNA encoding GHSR ligand, ⁇ ⁇ development of receptor binding assay system using recombinant receptor expression system and screening of drug candidate compounds, ⁇ Acquisition of antibodies and antisera, ⁇ ⁇ Development of diagnostics using DNA, RNA, antibodies or antisera, GH GH secretion preparation

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Description

明 細 書
GH S Rリガンドポリぺプチドおよびその D N A 技術分野
本発明は、 ォーファン G蛋白質共役型レセプター蛋白質である Growth hormone secretagogue receptor ( G H S R) に対する新規リガンドポリペプチド、 及び これをコードする D NAなどに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜に存在する特異的なレセプ夕一を通 じて生体の機能を調節している。 これらのレセプターの多くは共役している guanine nuc l eot i de-b i nd ing protein (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行い、 また 7個の膜貫通領域を有する 共通した構造をもっていることから、 G蛋白質共役型レセプ夕一あるいは 7回膜 貫通型レセプ夕一と総称される。
このようなホルモンや神経伝達物質と G蛋白質共役型レセプ夕一との相互作 用を通じて生体のホメォス夕シスの維持、 生殖、 個体の発達、 代謝、 成長、 神経 系、 循環器系、 免疫系、 消化器系、 代謝系の調節、 感覚受容などの生体にとって 重要な機能調節が行われている。 このように生体機能の調節には様々なホルモン や神経伝達物質に対するレセプター蛋白質が存在し、 その機能調節に重要な役割 を果たしていることがわかっているが、 未知の作用物質 （ホルモンや神経伝達物 質など） およびそれに対するレセプ夕一が存在するかどうかについては未だ不明 なことが多い。
近年、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質がその構造の一部にアミノ酸配列の類 似性を示すことを利用して、ポリメラーゼ'チェーン'リアクション (Po lymerase Chain Reac t i on：以下、 P C Rと略称する） 法によって新規レセプ夕一蛋白質を コードする DNAを探索する方法が行われるようになり、 数多くの、 リガンドが 不明ないわゆるォ一ファン G蛋白質共役型レセプター蛋白質がクロ一ニングさ れている（Libert, F.， et al. Science, 244, 569-572, 1989, Welch, S.K. , et aし, Biochem. Biophys. Res. Co腦亂, 209, 606-613, 1995, Marchese, A. , et al., Genomics, 23， 609-618, 1994, Marchese, A.， Genomics, 29, 335-344, 1995)。 また、 ゲノム DNAあるいは c DNAのランダムな配列決定によっても、 新規 G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質が次々と見出されている（Nomura, N. , et al., DNA Research 1巻、 27- 35頁、 1994年） 。 これらのォーファン G蛋白質共役型レ セプター蛋白質のリガンドを決定する一般的な手段としては、 G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質の一次構造上の類似性から推定するしかなかった。 しかし、 多く のォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質は既知のレセプ夕一とのホモ口 ジ一力低いものが多く、 実際は既知リガンドのレセプ夕一サブ夕イブである場合 を除いては一次構造上の類似性だけでそのリガンドを推定することは困難であ つた。 一方、 遺伝子解析から多くのォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一がみつ かっていることから対応する未知のリガンドがまだ数多く存在していることが 推定されているが、 これまで実際にォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一のリガ ンドを同定した例は数少ない。
これまで、 強力な成長ホルモン（GH)分泌促進作用を持つ人工のペプチドとし て GHRP— 6 (Growth hormone- releasing peptide- 6) など数種類の GHS (Growth hormone secretagogue)が開発されている。 これらの物質は in vitro、 in vivoで GH分泌促進活性を有し、 過去に同定されていた内因性のペプチドで ある GHRH (Growth hormone-releasing hormone)とは異なる作用機作を持つこ とが分かっていた。 しかも、 GHRP— 6などの GHSは GHRHとの同時投与 により、 相乗的に GH分泌を上昇させることなどから臨床的応用の面から有用視 されている（ホルモンと臨床 47 (5)， 33-43 (1999))。 GHRP_6などのGHS が作用する受容体（Growth hormone secretagogue receptor, GH S R)は 1 99 6年に Howardらによってクロ一ニングされ（Science 273, 974-977 (1996))、 G 蛋白質共役型レセプ夕一であることが分かった。 しかし、 GHSRの内因性リガ ンドはこれまで同定されていなかった。 GH分泌制御のメカニズムについては 不明な点も多く、 GHS Rの内因性リガンドの同定が待たれていた。
中枢神経系、 循環器系、 生殖器系、 免疫系、 消化器器官等で発現しているォ一 ファン G蛋白質共役型レセプ夕一である GHSRに対する内因性のリガンドは、 医薬として、 また GHSRとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行 なう上で有用であると考えられるが、 これまでにその構造および機能については 明らかにされていない。 発明の開示
本発明者らは、 GHS Rをコードする c DNAを適当な手段で発現させた細胞 を用い、 特異的な細胞刺激 （シグナル伝達） 活性の測定等を指標に、 該レセプ夕 一蛋白質がリガンドとして認識するポリぺプチドを単離、 同定することに成功し た。
さらに、 本発明者らは、 該活性因子であるリガンドと上記 GHSRとの結合性 を変化させる化合物のスクリ一ニングを行なうことができることを見いだした。 すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩、
(2) 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 10で表されるアミノ酸配列で ある上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩、
(3) 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記
(1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその (4) 上記 （1) 記載のポリペプチドをコードする DNAを含有する DNA、
(5) 配列番号： 2、 ffi列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表される塩基配列を有する上記 （4) 記載の DNA、
(6) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩に対する抗体、
(7) 上記 （5) 記載の DNAまたは上記 （6) 記載の抗体を含有してなる診断 剤、
(8)上記（ 5)記載の DN Aに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンス DNA、
(9) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩を含有してなる剤、
(10) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を含有してなる医薬、
(11) 成長ホルモンの不足に起因する疾患の予防 ·治療剤である上記 （10) 記載の医薬、
(12) 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性 下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全または若年性慢性関 節症候群の予防 ·治療剤である上記 （10) 記載の医薬、
(13) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載のポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する 化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(14) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩および配列番号： 18で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するするポリペプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩、 またはその部分ペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （13) 記載 のスクリーニング方法、
(15) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩および配列番号： 18で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するするポリペプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩、 またはその部分ペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる上記 （1) 記載のポリべプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または 阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(16) 上記 （13) 記載のスクリーニング方法または上記 （15) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られうる上記 （1) 記載のポリペプチドもしくは そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化 合物またはその塩、
(17) 上記 （16) 記載の化合物またはその塩を含有してなる成長ホルモンの 分泌調節剤、
(18) 上記 （16) 記載の化合物またはその塩を含有してなる①下垂体性小人 症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン 症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全もしくは若年性慢性関節症候群または②先 端巨大症、 TSH産生腫瘍、 非分泌性 （非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産生腫瘍、 髄様甲状腺癌、 V I P産生腫瘍、 グル 力ゴン産生腫瘍、 ガストリン産生腫瘍、 インスリノーマ、 カルチノイド、 インス リン依存性もしくは非依存性糖尿病の予防 ·治療剤、
(19) 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性 下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全または若年性慢性関 節症候群の予防 ·治療作用を有する医薬を製造するための上記 （1) 記載のポリ ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の使用、 および
(20) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を哺乳動物に投与することを特徴とする下垂体性小人症、 ターナ 一症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シ ルバ一症候群、 骨形成不全または若年性慢性関節症候群の予防 ·治療方法などに 関する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 3で検出されたゥシ視床下部由来の RESOURCE Sにおける活性画分を Sephas i l C8 SC 2. 1/10で分離したパターンと CHO-GHSR-23に特異的な活性の検出 結果を示す。
図 2は実施例 5で得られたゥシ型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列を示す （図 3に続く） 。
図 3は実施例 5で得られたゥシ型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列を示す （図 2の続き） 。
図 4は実施例 6で得られたヒト型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列を示す （図 5に続く） 。
図 5は実施例 6で得られたヒト型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列を示す （図 4の続き） 。
図 6は実施例 5で得られたゥシ型遺伝子配列と対応するァミノ酸配列、 実施例 6 で得られたヒト型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列および実施例 7で得られ たラット型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列の比較 (ァライメント）を示す。 図 7は実施例 7で得られたラット型遺伝子配列と対応するアミノ酸配列を示す (図 8に続く） 。
図 8は実施例 7で得られたラット型遺伝子配列と対応するァミノ酸配列を示す (図 7の続き） 。 発明を実施するための最良の形態
本発明におけるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩に対する GH S Rに関して、 具体的には、 上述の公知の GH S Rまたは その塩などがあげられるのみならず、
(21) 配列番号： 18で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有することを特徴とする GHSRまたはその塩、
(22) 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 19、 配列番号： 20、 配列 番号： 21または配列番号： 24で表されるアミノ酸配列である上記 （21) 記 載の GHSRまたはその塩、
(23) 配列番号： 18で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好 ましくは 1個以上 10個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 配列番号： 1 8で表わされるアミノ酸配列に 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以上 10個 以下のアミノ酸が付加した （または挿入された） アミノ酸配列、 あるいは配列番 号： 18で表わされるアミノ酸配列中の 1個以上 30個以下、 好ましくは 1個以 上 10個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含有する 蛋白質である上記 （21) 項記載の GHSRまたはその塩などがあげられる。
GHSRの部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場合がある） として は、 前記した GHSRの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、 例 えば、 GHSR蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 リ ガンド結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、 配列番号： 18、 配列番号： 19、 配列番号： 20、 配列番号： 21または配列番号： 24で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの部 分ペプチドとしては、 GHSRの細胞外領域 （親水性 （Hydrophilic) 部位） で あると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部 位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に 含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良 い。
GHSRの部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した GHSRの構成アミノ酸 配列のうち少なくとも 20個以上、 好ましくは 50個以上、 より好ましくは 10 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 後述と同意義を示す。 また、 GH S R およびその部分ペプチドの塩としては、 例えば、 後述の本発明のポリペプチドの 塩と同様のものなどがあげられる。
本明細書において、 「実質的に同一」 とはポリペプチドまたはタンパク質の活 性、 例えば、 リガンドと受容体 （GH S R) の結合活性、 生理的な特性などが、 実質的に同じことを意味する。 アミノ酸の置換、 欠失、 付加あるいは挿入はしば しばポリペプチドまたはタンパク質の生理的な特性や化学的な特性に大きな変 化をもたらさないが、 こうした場合その置換、 欠失、 付加あるいは挿入を施され たポリペプチドは、 そうした置換、 欠失、 付加あるいは挿入のされていないもの と実質的に同一であるとされるであろう。 該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的 に同一な置換物としては、 たとえばそのアミノ酸が属するところのクラスのうち 他のアミノ酸類から選ぶことができる。 非極性 （疎水性） アミノ酸としては、 ァ ラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 バリン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリ ブトファン、 メチォニンなどが挙げられる。 極性 （中性） アミノ酸としてはダリ シン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミン などが挙げられる。 陽電荷をもつ （塩基性） アミノ酸としてはアルギニン、 リジ ン、 ヒスチジンなどが挙げられる。 負電荷をもつ （酸性） アミノ酸としては、 ァ スパラギン酸、 グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩は、 GH S Rに対するリガンドであり、 具体的には、 配列番号： 1で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプ チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。 本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩 （以下、 単に本発明のポリペプチドと称する場合がある） 、 その製造法および 用途を以下にさらに詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラッ ト、 マウス、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる組織 （たとえば、 下垂 体、 塍臓、 m, 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、消化管、血管、心臓など）または細胞などに由来するポリペプチドであって、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有するポリペプチドであれば如何なるものであってもよい。 例えば、 本 発明のポリペプチドとしては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有す るポリペプチドなどの他に、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する ポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド （例えば、 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 1 0で表わされるアミノ酸配 列を含有するポリペプチドなど） などが挙げられる。 実質的に同質の活性として は、 例えばレセプター （リガンド） 結合活性、 シグナル伝達活性、 GH分泌促進 活性 （作用） などが挙げられる。 実質的に同質とは、 レセプ夕一 （リガンド） 結 合活性などが性質的に同質であることを示す。 したがって、 レセプ夕一 （リガン ド） 結合活性の強さなどの強弱、 ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なつ ていてもよい。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るポリペプチドとして具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドの N末端から 2番目のアミノ酸（V a 1 )が他のアミノ酸（例、 Ala, Leu, l ie, Thr, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser, Cys, Tyr, Asn, Gin, Arg, Lys, Hi s, Asp, Glu) に置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどが 挙げられる。 なかでも、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドの N末端から 2番目のアミノ酸 （V a l ) が T h rに置換されているアミ ノ酸配列 （配列番号： 1 0 ) を含有するポリペプチドなどが好ましい例として挙 け'られる。
また、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するポリペプチドの具体例としては、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配 列番号： 7で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドなどがあげられる。 本明細書におけるポリぺプチドはぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 （ァ ミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 ①配列番号： 1で表さ れるアミノ酸配列、 ②配列番号： 3で表されるアミノ酸配列、 ③配列番号： 5で 表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列、 ④配列番号： 7で表されるアミ ノ酸配列で表されるアミノ酸配列、 ⑤配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列で 表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドは C末端が通常カルボキシ ル基（- C00H)またはカルポキシレート（-C00— )であるが、 C末端がアミド （- C0NH 2)またはエステル (-C00R)であってもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチ ル、 エヂル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C i _ 6アル キル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 フエ ニル、 α—ナフチルなどの C 6 _ 1 27リール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒ ドリルなどのフエ二ルー C i _ 2アルキル、 もしくは α—ナフチルメチルなどのひ 一ナフチル—。卜 2アルキルなどの C 7— 1 4ァラルキル基のほか、経口用エステル として汎用されるビバロイルォキシメチル基などが挙げられる。
さらに、 本発明のポリペプチドには、 上記したポリペプチドにおいて、 N末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2 _ 6アルカノィル基などの C i _ 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側 が生体内で切断され生成じたダル夕ミル基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子 内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 —〇H、 一 S H、 一 C〇OH、 ァミノ 基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例え ば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アルカノィル基などの C i _ 6ァシル基な ど） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質など の複合夕ンパク質なども含まれる。
本発明のポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例えばアル カリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学 的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 （例え ば、塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、硫酸） との塩、 あるいは有機酸（例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩 などが用いられる。
本発明のポリペプチドは、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞からポリペプチド を精製する方法によって製造することもできるし、 後述のポリペプチド合成法に 準じ 製造することもできる。 また、 後述するポリペプチドをコードする D NA を含有する形質転換体を培養することによつても製造することができる。
ヒトゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ温血動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸、 有機溶媒などで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ 一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせ ることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリぺプチドは、 自体公知のポリぺプチドの合成法に 従って、 あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なぺプチ ダーゼで切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法として は、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明 のポリぺプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮 合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプ チドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
®M. Bodanszky および M. A. Ondet t i , ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , Intersc i ence Publ i shers, New York (1966年) ② Schroederおよび luebke、ザペプチド（The Pept ide)， Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 *カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポリべ プチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリぺプチドが遊離体 である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩 で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ポリペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を 用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒド ロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジ ルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM 樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアク リルアミド樹脂、 4— ( 2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエ ノキシ樹脂、 4 _ ( 2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキ シ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖 官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに、 自体公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチド を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジ スルフィド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力ルポ ジィミド類としては D(X、 N, N' -ジィソプロピルカルポジィミド、 N-ェチル -N' - (3 - ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドなどが挙げられる。 これらによる活性 化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0Bt、 HOOBtなど）とともに保護されたアミ ノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹 脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用い られる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒か ら適宜選択されうる。 たとえば N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチ ルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ 口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコー ル類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン 類、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエーチル類、 ァセトニトリル、 プロ ピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類ある いはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応 に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 t：〜 5 0 の範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5ない し 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十 分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分 な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときに は、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化 して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 夕一シャリ 一ペンチルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4—メトキシべ ンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br-Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが挙げられる。 カルボキシル基の保護基 としては、 たとえば Rとして上記したじェ アルキル基、 C 3— 8シクロアルキル 基、 C 7 _ アラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4 _ニトロベンジル、 4—メ トキシベンジル、 4—クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジルォキシカル ボニルヒドラジド、 夕ーシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒド ラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化に よって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチ ル基などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルボニル基、 エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げ られる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒ ドロビラニル基、 夕ーシャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば z l、 Cl 2 -Bz K 2
—二.トロベンジル、 Br-Z、 ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メトキシ -2, 3， 6-トリ メチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc、 Tr t、 Fmoc などが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペン夕クロ口フエノール、 2, 4, 5-トリクロ口フエノール、 2, 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコー ル、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフ夕 ルイミド、 H0B O とのエステル] などが挙げられる。 原料のァミノ基の活性化さ れたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば 黒あるいは Pd炭素などの触媒 の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホ ン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合 液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺ リジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによ る還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 〜 4 O t: の温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオア二ソー ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1, 4 -ブタンジチォ ール、 1 , 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2， 4-ジニトロフエ二ル基は チォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として 用いられるホルミル基は上記の 1 , 2-ェ夕ンジチオール、 1， 4-ブ夕ンジチオールな どの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアな どによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段か ら適宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル末端ァ ミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望 の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基のみを除 いたべプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （または アミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させ る。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護ぺプ チドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ポリぺプ チドを得ることができる。 この粗ポリぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得るこ とができる。
ポリぺプチドのエステル体を得るにはカルポキシ末端アミノ酸のひ—力ルポ キシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリべプチ ドのアミド体と同様にして所望のポリぺプチドのエステル体を得ることができ る。
本発明のポリペプチドとしては、 上述のとおり、 上記した配列番号： 1で表さ れるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 該ポリ ペプチドと同様の作用、 例えば GHSRとの結合活性、 GHSRへのシグナル伝 達活性、 GH分泌促進活性 （作用） を有しているものであれば、 どのようなポリ ペプチドであってもよい。 このようなポリペプチドとしてはたとえば、 上記した 配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 10で表されるァ ミノ酸配列を有するぺプチドなどを挙げることができる。
本発明のポリぺプチドはさらに該ポリぺプチドに対する抗体の調製のための 抗原として用いることができる。 このような抗原としてのポリペプチドは上記し た本発明のポリペプチドの他に、 上記本発明のポリペプチドの N末端べプチド、 C末端べプチド、 中央部分のぺプチドなどの部分べプチドなどが用いられる。 本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 1で表わされ るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺ プチドをコードする DN Aを含有する DN Aであればいかなるものであっても よい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した組織 ·細胞由 来の cDNA、 前記した組織 ·細胞由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAの いずれでもよい。 ライブラリーに使用するべクタ一はバクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した組 織 ·細胞より RNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-P C R法と略称する）によって増幅す ることもできる。
ここで、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、上述のとおり、配列番号： 3、 配列番号： 5、 配列番号： 7または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列など があげられるが、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド をコードする DNAを含有する DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表され る塩基配列を有する DNAを含有する DNAまたは配列番号： 9で表される塩基 配列を有する DNAを含有する DNAなどがあげられ、 配列番号： 3で表される アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAと しては、 例えば、 配列番号： 4で表される塩基配列を有する DNAを含有する D NAなどがあげられ、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプ チドをコードする DNAを含有する DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 6で表 される塩基配列を有する DNAを含有する DNAなどがあげられ、 配列番号： 7 で表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする D N Aを含有す る DNAとしては、 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列を有する DN Aを 含有する DNAなどがあげられ、 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 11で表される塩基配列を有する DNAを含有する DNAなどがあげられ る。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 2または配列番号： 9で表される塩基配列と約 80%以上、 好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相 同性を有する塩基配列を有する DN Aを含有する DN Aなどがあげられる。
また、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するポリペプチドをコードする DNAを含有する DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 2または配列番号： 9で表される塩基配列中の 1または 2個以上（好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1または 2個） の塩基が欠失した 塩基配列、 ②配列番号： 2または配列番号： 9で表される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1または 2個） の塩 基が付加した塩基配列、 ③配列番号： 2または配列番号： 9で表される塩基配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1また は 2個） の塩基が挿入された塩基配列、 ④配列番号： 2または配列番号： 9で表 される塩基配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個程度、 さらに好 ましくは 1または 2個） の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、 または⑤それ らを組み合わせた塩基配列を有する D N Aを含有する DNAなども含まれる。 よ り具体的には、 （1)ストリンジェントな条件下で配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のポリ ペプチドをコードする D N Aを含有する D N Aの有する配列とハイブリダイズ する哺乳動物由来の DNA、 （2)遺伝コードの縮重のため配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発 明のポリペプチドをコードする DN Aを含有する DN Aの有する配列および（1) に定められている配列とハイブリツド形成しないが、 同一アミノ酸配列をもつポ リペプチドをコードする D N Aなどが用いられる。 ハイブリダイゼーションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。 上記スト リンジェン卜な条件としては、 例えば 42 ：、 50%ホルムアミド、 4XSSP E(l X S S PE = 150mM NaCl, lOmM NaH2P04 ·Η20, lmM EDTA pH7.4)、 5 Xデン ハート溶液、 0. 1%SDSである。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する本発明のポリペプチドをコードする D N Aを含有する D N A の有する配列とハイブリダィズする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2また は配列番号： 9で表される塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性を有する 塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
また、 本発明の①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列、 ③配列番号： 5で表されるアミノ酸配列、 ④配列番号： 7 で表されるアミノ酸配列、 ⑤配列番号： 10·で表されるアミノ酸配列などを含有 するポリペプチドをコードする DNAの部分塩基配列を含有する DNA断片は DN A検出プローブとしても好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドをコードする DN Aは以下の遺伝子工学的手法によつ ても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードする DN Aのクローニングの手段とし ては、 本発明のポリべプチドの部分塩基配列を有する合成 DN Aプライマーを用 いて自体公知の PC R法によって前記 DN Aライブラリ一等から目的とする D N Aを増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ D N Aを例えば本発明の ポリペプチドの一部あるいは全領域を有する DN A断片もしくは合成 DN Aを 用いて標識したものとのハイブリダィゼーシヨンによつて選別することができ る。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et aし， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法な どに従って行われる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説 明書に記載の方法に従って行う。
クローン化された本発明のポリペプチドをコードする DN Aは目的によりそ のまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使 用することができる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての T A A、 TGAまたは T AGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な 合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のポリべプチ ドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現べクタ一中のプロモータ一の下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， pBR 32 5, pUC 12, pUC 13) 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110, pTP 5, pC 194)、酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 15)、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 S V 40由来のプロモー夕 一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートシ ョックプロモーター、 サイトメガロウィルスプロモー夕一、 SRひプロモーター などが利用できる。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 T 7プロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモ 一夕一、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPO 1プロモータ一、 SPO 2プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵 母である場合は、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモー ター、 ADH1プロモータ一、 GALプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫 細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモー夕一などが好ま しい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne 0—と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特 に、 CH〇 （dh f r— ) 細胞を用いて DHF R遺伝子を選択マ一カーとして使 用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはその 部分ペプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA -シグナル配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である 場合は、 ひ一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 メイティングファクターひ（MFa) ·シグナル配列、 インベル夕一ゼ，シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばィ ンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたポリペプチドをコードする DN Aを含有するべク 夕一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、ェシエリヒア 'コリ （Escherich a col i) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエ ンシィズ 'ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60 巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック 'ァシッズ · リサーチ， (Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J Α221 〔ジャー ナル 'ォブ 'モレキュラー'バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 , 120卷， 517 (1978)〕， ΗΒ 101 〔ジャーナル'ォブ ·モレキュラー · バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェネティックス (Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕， 207 - 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (198 4)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22 R ， NA87 - 11 A, DKD— 5D， 20 B
- 12などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中
Τ
腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five 細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 〔以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン 'ヴィトロ （in Vitro) ， 13巻， 213— 217頁 （1977年） 〕 などが用いられる。
動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞， Vero細胞， チャイニーズ ハムスター細胞 CH〇， DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (d h f r— CH〇細胞） ， マウス L細胞， マウス 3 T 3細胞、 マウスミエローマ 細胞， ヒト ΗΕΚ293細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞、 ΒΑ LB3T3細胞、 S ρ_ 2ΖΟ細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ 'ォブ 'ザ- ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー（Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) , 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、 たとえばモレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル ·ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 111 (1
979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ 'サイェンシィズ ·ォブ ·ザ'ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978)に記載の方法に従って行なわれる。 昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイオ Zテクノロジー (Bio/Technology) , 6巻， 47— 55頁 （1988年） などに記載の方法に従 つて行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴイロロジ一 （Virology) , 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法 [Feigner, P.L. et al. プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ力デミ —'ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ 'ザ 'ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the -United States of America) ， 84 , 741 3 頁 （1987年） 〕 、 リン酸カルシウム法 CGraham, F. L. and van der Eb， A. J.ヴィロロジー （Virology) , 52巻， 456— 467頁 （1973年） 〕 、 電 気穿孔法 〔Nuemann， E. et al. ェンボ ·ジャーナル （EMBO J.) , 1巻， 841 一 845頁 （1982年） 〕 等が挙げられる。
このようにして、 本発明のポリペプチドをコードする DN Αを含有する発現べ クタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法とし ては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞を クローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカ一を 指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選択マーカーを用いて得 られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポ リペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 d h f r遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、 MTX濃度を徐々に上げて培養 し、 耐性株を選択することにより、 dh f r遺伝子とともに、 本発明のポリぺプ チドまたはその部分べプチド等をコードする DN Aを細胞内で増幅させて、 さら に高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチドをコードする DN Aが発現可能な 条件下で培養し、 本発明のポリペプチドを生成、 蓄積せしめることによって、 本 発明のポリぺプチドを製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、 たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、 たとえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシゥ ムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加しても よい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル ·ォブ'ェクスペリメンッ · ィン ·モレキュラー ·ジェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431—433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19 72〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 たとえば 3 一インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43でで約 3〜24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバークホ 一ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 「プロシージングズ. ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 「プロシージング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ —エスエー （Pro Natl. Acad. Sci. US A) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0t：〜 35 で約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. ，ネイチヤー (Nature) , 195,788(1962)) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 で約 3〜 5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5
〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 122巻， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ'ザ'アメリカン ' メ： イカ レ ' アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング · ォブ ·ザ.ソサイエティ 'フォー ·ザ'バイオロジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73卷， 1 (1950)〕 など が用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30t：〜 4 0 で約 15〜 60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に CHO (dhfr— ) 細胞および dhfr遺伝子を選択マ一カーとして用いる場合 には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む DMEM培地を用い るのが好ましい。
上記培養物から本発明のポリぺプチドを分離精製するには、 例えば下記の方法 により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し たのち、 遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用 い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク変性剤や、 トリトン
X— 100 (登録商標。 以下、 TMと省略することがある。 ） などの界面活性剤 が含まれていてもよい。
培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 自体公知の方法 で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリ ぺプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことが できる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度 を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S —ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換 クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグ ラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロマトフォーカシング などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 自体公 知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で 得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体また は他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のポリペプチドに、 精製前または精製後に適 当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリべプチ ドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシ ン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グ リコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたェンザィ ムィムノアッセィなどにより測定することができる。
本発明のポリぺプチドをコ一ドする D N Aまたは本発明のポリぺプチドは、 ① 本発明のポリペプチドの有する生理作用の探索、②合成オリゴヌクレオチドプロ —ブあるいは P C Rのプライマーの作成、 ③ GH S Rの前駆体蛋白質をコードす る D NAの入手、 ④組換え型レセプ夕一蛋白質の発現系を用いたレセプ夕一結合 アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤抗体および抗血清の 入手、 ⑥ D NA、 R NA、 抗体または抗血清を用いた診断薬の開発、 ⑦ GH (成 長ホルモン） 分泌調節剤 （GHの不足に起因する疾患または GHの分泌過剰に起 因する疾患の予防 ·治療剤） 、 ⑧ (a) 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性 腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全もしくは若年性慢性関節症候群または (b)先端巨大症、 T S H産生腫 瘍、 非分泌性 （非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 A C TH (アドレノコルチコトロ ピン） 産生腫瘍、 髄様甲状腺癌、 V I P産生腫瘍、 グルカゴン産生腫瘍、 ガスト リン産生腫瘍、 インスリノーマ、 カルチノイド、 インスリン依存性もしくは非依 存性糖尿病などの予防 ·治療剤の開発、 ⑨遺伝子治療等に用いることができる。 特に、 後述の組換え型 G H S Rの発現系を用いたレセプタ一結合ァッセィ系に よって、 ヒトなどの温血動物に特異的な GH S Rァゴニストまたはアンタゴニス トを効率よくスクリ一二ングすることができ、 該ァゴニストまたはァン夕ゴニス トを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができる。
さらに、 上記⑦、 ⑧に関し、 本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aは、 G H S Rが本発明のポリぺプチドをリガンドとして認識するものである ので、 安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のポリペプチドまたはそれ をコードする D NAは GH分泌促進作用などに関与していることから、 たとえば 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不 全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全もしくは若年性慢性関節症候 群などの疾病の治療 ·予防剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドまたはそれをコードする D N Aを上述の医薬として使 用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 必要に応じて糖 衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤 などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との 無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単 位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における 有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 本発明の D NAを用いる場合は、 該 D NAを単独またはレトロウイルスベクタ 一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシェ一テッドウィルスベクタ 一などの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従がつて実施することができ る。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料 にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばェ夕ノ ール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ —ル） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 (™) 、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトゃ哺乳動 物（例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 本発明のポリペプチドまたはそれをコードする DN Aの投与量は、 症状などに より差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の慢性腎疾患患者 （体重 60 k gとして） においては、一日につき約 0.1から 100mg、好ましくは約 1. 0力 ^ら 50mg、 より好ましくは約 1. 0から 20mgである。 非経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の慢性腎疾患患者 （体重 60 kgと して） への投与においては、 一日につき約 0. 01から 30mg程度、 好ましく は約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1から 10mg程度を静脈 注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換 算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチド、 その製造法および用途を以下にさらに詳細に説明する。 本発明のポリぺプチド、 該ポリぺプチドをコードする D N Aおよび抗体などの 用途について、 以下に具体的に説明する。
(1) ポリペプチド欠乏症の予防 ·治療剤
GHSRに対する本発明のポリペプチドが有する作用に応じて、 本発明のポリ ぺプチドおよび本発明のポリぺプチドをコ一ドする DN Aをポリべプチドまた は GH S R欠乏症の予防 ·治療剤としても使用することができる。
例えば、 生体内において、 本発明のポリペプチドまたは GHSRが減少してい るためにリガンドの生理作用 （GH分泌促進作用など） が期待できない患者がい る場合に、 （ィ） 本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドをコードす る DNAを該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 脳細胞など に本発明のポリべプチドまたは本発明のポリペプチドをコードする D N Aを揷 入し発現させた後に、 該脳細胞を該患者に移植することなどによって、 該患者の 脳細胞におけるポリぺプチドの量を増加させ、 ポリぺプチドの作用を充分に発揮 させることができる。 したがって、 本発明のポリペプチドまたは本発明のポリべ プチドをコードする DNAは、 安全で低毒性なポリペプチドの欠乏症の予防 ·治 療剤などとして用いることができる。 上記 DNAを上記治療剤として使用する場合は、 該 DNAを単独あるいはレト ロウィルスべクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 上記した本発明のポリ ペプチドをコードする DN Aを医薬として使用する場合と同様の手段に従って 実施することができる。 '
(2) ポリペプチドに対する GHSRの定量法
本発明のポリペプチドは GHSRまたはその塩や該レセプ夕ー蛋白質の部分 ペプチドまたはその塩に対して結合性を有しているので、 生体内における GHS Rもしくはその塩、 または該 GH S Rの部分べプチドまたはその塩の濃度を感度 良く定量することができる。
この定量法は、 例えば競合法と組み合わせることによって用いることができる。 すなわち、 被検体を本発明のポリぺプチドと接触させることによつて被検体中の
GH S Rもしくはその塩、 または GH S Rの部分べプチドもしくはその塩の濃度 を測定することができる。
具体的には、 例えば、 以下の①または②などに記載の自体公知の方法あるいは それに準じる方法に従って用いることができる。
①入江寛編 「ラジオイムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(3) GHSRと本発明のポリぺプチドとの結合性を変化させる化合物またはそ の塩 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） のスクリー二 ング方法
GHSRまたはその塩やその部分べプチドもしくはその塩を用いるか、 または 組換え型 GHSRの発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ 系を用いることによって、 本発明のポリペプチドと GHSRとの結合性を変化さ せる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） （例え ば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） ま たはその塩をスクリーニングすることができる。 このような化合物には、 GHS Rを介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 Ca 遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pH の低下などを促進する活性など） を有する化合物 （即ち GHSRァゴニスト） と 該細胞刺激活性を有しない化合物 （即ち GHSRアン夕ゴニスト） などが含まれ る。 「リガンドとの結合性を変化させる」 とは、 リガンドとの結合を阻害する場 合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
すなわち、 本発明は、 （i) GHSRもしくはその塩または該 GHSRの部分 ペプチドもしくはその塩に、 本発明のポリペプチドを接触させた場合と （ii) 上 記した G H S Rもしくはその塩または該 G H S Rの部分べプチドもしくはその 塩に、 本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行な うことを特徴とする本発明のポリペプチドと上記した GHSRとの結合性を変 化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) 上記した GHSRまたは該 G HSRの部分ペプチドに、 本発明のポリペプチドを接触させた場合と （ii) 上記 した GH S Rまたは該 GH S Rの部分べプチドに、 本発明のポリぺプチドおよび 試験化合物を接触させた場合における、 例えば該 GHSRまたは該 GHSRの部 分べプチドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。 本発明のスクリーニング方法は具体的には、
①標識した本発明のポリぺプチドを、 上記した GH S Rもしくはその塩または G HSRの部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 標識した本発明のポリ ぺプチドおよび試験化合物を GH S Rもしくはその塩または GH S Rの部分べ プチドもしくはその塩に接触させた場合における、 標識した本発明のポリぺプチ ドの該 GHSRもしくはその塩、 または該部分ペプチドもしくはその塩に対する 結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリぺプチドと GH S Rと の結合性を変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害す る化合物） またはその塩のスクリーニング方法、
②標識した本発明のポリぺプチドを、 GH S Rを含有する細胞または該細胞の膜 画分に接触させた場合と、 標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を G HSRを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識し た本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較 することを特徴とする本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合性を変化させ る化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはそ の塩のスクリーニング方法、 .
③標識した本発明のポリペプチドを、 GHSRをコードするDNAを含有する形 質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した GH S Rに接触させた場 合と、 標識した本発明のポリペプチドおよび試験化合物を GHSRをコードする DN Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した GH SRに接触させた場合における、 標識した本発明のポリペプチドの GHSRに対 する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと GHS Rとの結合性を変化させる化合物 （本発明のポリぺプチドの活性を促進または阻 害する化合物） またはその塩のスクリーニング方法、
④ GHSRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチド） を GHSRを 含有する細胞に接触させた場合と、 GHS Rを活性化する化合物および試験化 合物を GHSRを含有する細胞に接触させた場合における、 GHSRを介した細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca 遊 離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを 促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする本 発明のポリペプチドと GHSRとの結合性を変化させる化合物 （本発明のポリべ プチドの活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤ GHSRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドなど） を GHS Rをコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上 に発現した GHSRに接触させた場合と、 GHSRを活性化する化合物および試 験化合物を、 GHSRをコードする DNAを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した GHSRに接触させた場合における、 GHSRを介 する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、細胞内 cAMP生成、細胞内 c G M P生成、イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下な どを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とす る本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合性を変化させる化合物 （本発明のポ リぺプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリ一二ング 方法などである。
本発明のスクリ一ニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる GHSRとしては、 上記の GHS Rまたは GHS Rの部分ペプチドを含有するものであれば何れのものであって もよいが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特にヒト 由来の臓器は入手が極めて困難なことから、 スクリ一二ングに用いられるものと しては、 組換え体を用いて大量発現させた GHSRなどが適している。
GHSRを製造するには、 Science 273， 974- 977 (1996)に記載の方法または 前述の本発明のポリペプチドの製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 GHSRを含有する細胞あるいは該細 胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
GHSRを含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマ リンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うこ とができる。
GHSRを含有する細胞としては、 GHSRを発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが 挙げられる。 また、 GHSRを発現した宿主細胞は、 前述の本発明のポリべプチ ドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方 法などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が 多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Potter—Elvehjem型 ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン (Kinematica社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧 しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細 胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画 法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （150 00 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を 膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した GHSRと細胞由来のリン脂質ゃ膜蛋 白質などの膜成分が多く含まれる。
該 GHSRを含有する細胞や膜画分中の GHSRの量は、 1細胞当たり 10
〜10 分子であるのが好ましく、 10 〜10 分子であるのが好適である。 な お、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量 の試料を測定できるようになる。
本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合性を変化させる化合物 （本発明のポ リペプチドの活性を促進または阻害する化合物） をスクリーニングする前記の① 〜③を実施するためには、 適当な GHSR画分と、 標識した本発明のポリべプチ ドなどが用いられる。 GHSR画分としては、 天然型の GHSR画分か、 または それと同等の活性を有する組換え型 GHSR画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。 例えば 〔 H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 〔 S〕 などで標識されたリガンドなどを利 用することができる。
具体的には、 本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合性を変化させる化合物 のスクリーニングを行うには、 まず GHSRを含有する細胞または細胞の膜画分 を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を 調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ ッファー、 トリス一塩酸バッファ一などのリガンドとレセプ夕一との結合を阻害 しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させる目
TM
的で、 CHAPS、 Twe en— 80 (花王—アトラス社） 、 ジギトニン、 デ ォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるレセプ夕一や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどの プロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.0 lml〜l Omlの該レセプ 夕一溶液に、 一定量 （5000 c pm〜500000 c pm) の標識した本発明 のポリペプチドを添加し、 同時に 10 〜10 Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチド を加えた反応チューブも用意する。 反応は 0でから 50 、 望ましくは 4 から 37t:で 20分から 24時間、 望ましくは 30分から 3時間行う。 反応後、 ガラ ス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残 存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはァーカウン夕一で計 測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B。）から非特異的結合量（NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— N
SB) が例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質とし て選択することができる。 本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合性を変化させる化合物 （本発明のポ リペプチドの活性を促進または阻害する化合物） をスクリーニングする前記の④ 〜⑤の方法を実施するためには、 GHSRを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca 遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下などを促進する活性または抑制す る活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することがで きる。 具体的には、 まず、 GHSRを含有する細胞をマルチウエルプレート等に 培養する。 スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞 に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添加して一定時 間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物 をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合 は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 C AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生 量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。 細胞刺激活性を測定してスクリ一ニングを行なうには、 適当な GH S Rを発現 した細胞が必要である。 本発明の GHSRを発現した細胞としては、 前述の GH
S R発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ る。
本発明のポリペプチドまたはその前駆体タンパク質と GHSRとの結合性を 変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーニング用キットは、 GHSRまたはその塩、 GHSRの 部分ペプチドまたはその塩、 GHSRを含有する細胞、 あるいは GHSRを含有 する細胞の膜画分、 および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
② GHSR標品
0113尺を発現させた（：1"[〇細胞を、 12穴プレートに 5X 10 個 穴で継 代し、 37で、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
〔 H〕 、 〔 I〕 、 〔 C〕 、 〔 S〕 などで標識した本発明のポリぺプ チド
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4T:あるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のポリペプチドを 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P BSで ImMとなるように溶解し、 一 2 で保存する。
2. 測定法
① 1.2穴組織培養用プレートにて培養した GHS Rを発現させた細胞を、 測定用 緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
② 10 〜 10 Mの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明のぺ プチドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るために は試験化合物のかわりに 10 Mの本発明のポリぺプチドを 5 Z 1加えておく。 ③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 された本発明のポリペプチドを 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [ (B-NS B) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量） · B。 ：最大結合量 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 本発明のポリぺプチドと GH S Rとの結合を変化させ る （結合を阻害あるいは促進する） 化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進 または阻害する化合物） であり、 具体的には GHSRを介して細胞刺激活性を有 する化合物またはその塩 （いわゆる GHSRァゴニスト） 、 あるいは該刺激活性 を有しない化合物 （いわゆる GHSRアン夕ゴニスト） である。 該化合物として は、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
上記 GHS Rァゴニス卜であるかアン夕ゴニス卜であるかの具体的な評価方 法は以下の （i) または （ii) に従えばよい。
(i) 前記①〜③のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィを 行い、 本発明のポリペプチドと GHSRとの結合性を変化させる （特に、 結合を 阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した GHSRを介する細胞刺激活性 を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は G HSRァゴニストであり、 該活性を有しない化合物またはその塩は GHSRアン 夕ゴニストである。
(ii) (a)試験化合物を GHSRを含有する細胞に接触させ、 上記 GHSRを介 した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は GH SRァゴニストである。
(b) GHSRを活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたは GHS Rァゴニストなど） を GHSRを含有する細胞に接触させた場合と、 GHSRを 活性化する化合物および試験化合物を GHSRを含有する細胞に接触させた場 合における、 GHSRを介した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 GHSRを活 性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は G H SRアン夕ゴニス卜である。
該 GHSRァゴニストは、 GHSRに対する本発明のポリペプチドが有する生 理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のポリペプチドと同様に安全で低 毒性な医薬として有用である。
逆に、 GHSRアン夕ゴニストは、 GHSRに対する本発明のポリペプチドが 有する生理活性を抑制することができるので、 該レセプター活性を抑制する安全 で低毒性な医薬として有用である。
本発明のポリペプチドは GH分泌促進作用などに関与していることから、 G HSRァゴニストは、 GHの不足に起因する疾患、 たとえば下垂体性小人症、 夕 ーナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、成人性下垂体不全症、ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全および若年性慢性関節症候群などの疾病の治療 ·予 防剤として用いることができる。 一方、 GHSRアンタゴニストは、 GHの分 泌過剰に起因する疾患、 たとえば先端巨大症、 TSH産生腫瘍、 非分泌性 （非機 能性） 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産生腫瘍、 髄 様甲状腺癌、 V I P産生腫瘍、 グルカゴン産生腫瘍、 ガストリン産生腫瘍、 イン スリノーマ、 カルチノイド、 インスリン依存性および非依存性糖尿病などの疾病 の治療 ·予防剤として用いることができる。 上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または 酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などの アルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 な らびにアルミニウム塩、 アンモニゥム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばトリメチルァミン、 トリェチルァ ミン、 ピリジン、 ピコリン、 2， 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジエタノー ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァ ミン、 N, N ' —ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンス ルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 オル チニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好適な例としては、 例えばァス パラギン酸、 ダル夕ミン酸などとの塩があげられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、 上記の本発明のポリべ プチドを医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
( 4 ) 本発明のポリぺプチドに対する抗体または抗血清の製造
本発明のポリペプチドに対する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体、 モノクロ ーナル抗体） または抗血清は、 本発明のポリペプチドを抗原として用い、 自体公 知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 後述の方法に従って製造することができる。 [ポリクローナル抗体の作製]
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいは それに準じる方法にしたがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリ ペプチド等抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 後述のモノクローナ ル抗体の製造法と同様に温血動物 （例えば、 哺乳動物 （例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャ ギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ハト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） に免疫を行ない、 該免疫動物から本発 明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうこと により製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複合 体に関し、 キャリア一蛋白質の種類およびキャリア一とハプテン （本発明のポリ ペプチド） との混合比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗 体が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例 えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール ·リンペット - へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 .：!〜 2 0、 好ましくは約 1 〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 上記温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体ある いは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ レ^ 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取される。
抗血清中の本発明のポリペプチドに対する抗体価の測定は、 後述のハイプリド —マ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。 抗体の分離精製は、 後述 のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従つ て行なうことができる。
また、 モノクローナル抗体は、 後述の方法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕
(a) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、温血動物（例えば、哺乳動物（例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕） 、 鳥類 （例、 ニヮトリ、 ハト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ） など） に対して投与により抗体産生が可能な 部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産 生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行わ れる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された上記の温血 動物、 たとえばマウスなどから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫 細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製す ることができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識化した本発明の ポリぺプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定 することによりなされる。 融合操作は既知の方法、 たとえばケ一ラーとミルス夕 インの方法 〔ネィチヤ一 （Nature), 256、 495 (1975)] 等に従い実施できる。 融 合促進剤としてはポリエチレングリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが 挙げられるが、 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としてはたとえば NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1など があげられるが、 P3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾 臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 P EG (好ましくは PEG 1,000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度 で添加され、 20〜 40で、 好ましくは 30〜37tで 1〜10分間インキュべ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明のポリペプチドに対する抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングに は種々の方法が使用できるが、 たとえば本発明のポリペプチド抗原を直接あるい は担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養 上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細 胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いら れる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した本発明のポリペプチドに対す るモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素など で標識した本発明のポリペプチドを加え、 固相に結合した本発明のポリペプチド に対するモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
本発明のポリぺプチドに対するモノク口一ナル抗体の選別は、 自体公知あるい はそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なわれる。 選別およ び育種用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地 を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を 含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光 純薬工業 （株） ） あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 ：、 好ましくは約 3 7 :である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間 〜2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なわれる。 ハイプリドーマ培 養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の本発明のポリぺプチドに対する抗体価の測 定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナール抗体の精製
本発明のポリぺプチドに対するモノクローナル抗体の分離精製は通常のポリ クローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあ るいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させ て抗体を得る特異的精製法〕 に従って行われる。
上記の （a ) および （b ) の方法に従って製造させる本発明のポリペプチドに 対する抗体は、 それぞれ本発明のポリペプチドを特異的に認識することができる ので、 被検液中の本発明のポリペプチドの定量、 特にサンドイッチ免疫測定法に よる定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、 例えば、
( i ) 本発明のポリペプチドに反応する抗体と、 被検液および標識した本発明 のポリペプチドとを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識した本発明のポリ ぺプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチド の定量法、
(i i) 被検波と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時ある いは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特 徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法において、 一方の抗体が、 本 発明のポリぺプチドの N端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のポリぺプ チドの C端部に反応する抗体であることを特徴とする被検液中の本発明のポリ ぺプチドの定量法を提供する。
本発明のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリ ペプチドの測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明の抗体を用いる 測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えばポ リペプチド量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的ま たは物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製し た標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例え ば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適 に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特 に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、 蛍光物質、 発光物質などが挙げられる。 放射性同位元素としては、 例えば 〔
I〕 、 〔 I〕 、 〔 H〕 、 〔 C〕 などが、 上記酵素としては、 安定で比活 性の大きなものが好ましく、例えば 3—ガラクトシダーゼ、 ）3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 バーオキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素等が、 蛍光 物質としては、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが、 発光物質としては、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン などがそれぞれ挙げられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオ チン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常蛋 白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法 でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性 多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいは ガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗ポリペプチド抗体に被検液を反応さ せ （1次反応） 、 さらに標識化抗ポリペプチド抗体を反応させ （2次反応） たの ち、 不溶化担体上の標識剤 活性を測定することにより被検液中のポリペプチド 量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サ ンドィツチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用い られる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的 で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドイッチ法による本発明のポリべプチドの測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる抗ポリぺプチド抗体は本発明のポリぺプチドの 結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2次 反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のポリ ペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C 末端部以外、 例えば N末端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のポリべプチドに対する抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例 えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることが できる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応 させたのち、 未反応の標識抗原と（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分 離し （BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定 量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレ ングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、.および、 第 1抗 体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2 抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検波中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検波中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を 構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書など を参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談 社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」 （医学書院、昭和 53年発行）、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石 川栄治ら編「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、昭和 62年発行）、 rMethods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) , 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0)、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)) , 同書 Voし 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）など参照〕 。
以上のように、 本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることによって、 本 発明のポリぺプチドを感度良く定量することができる。
被検液中の本発明のポリぺプチドを定量することによって、 本発明のポリぺプ チドまが関与する疾患を診断することができる。 本発明のポリぺプチドが関与す る疾患としては、 GHの不足に起因する疾患、 例えば、 下垂体性小人症、 ターナ 一症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シ ルバ一症候群、 骨形成不全もしくは若年性慢性関節症候群などの疾病があげられ る。被検波は被検哺乳動物（例、 ヒト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ） から自体公知の方法によって調製できる。 被検 液としては、 例えば、 血液、 リンパ液、 尿などが挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードする DN Aに相補的な、 または実質的に相補的 な塩基配列を有するアンチセンス DNAとしては、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を有 するものであれば、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。 本発明のポリペプチドをコードする DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明のポリペプチドをコードする DNAに相補的な塩基配列 （すなわ ち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約 70%以 上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。 特に、 本発明のポリべ プチドをコードする D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のポリぺプチドの N末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列な ど）の相補鎖と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90% 以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス DN Aが好適 である。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DNA合成装置などを用いて製 造することができる。 .
該アンチセンス DNAは本発明のポリペプチドをコードする DNAの発現を 抑制し得る作用を有するものであるので、 GHの分泌過剰に起因する疾患、 た とえば先端巨大症、 TSH産生腫瘍、 非分泌性 （非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産生腫瘍、 髄様甲状腺癌、 VI P産生腫 瘍、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、インスリノーマ、カルチノィド、 ィンスリン依存性および非依存性糖尿病などの疾病の治療 ·予防剤として用いる ことができる。
(5) 遺伝子診断剤
本発明のポリペプチドをコードする DN Aは、 例えば、 プローブとして使用す ることにより、 ヒトまたは温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥ サギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本 発明のポリペプチドをコードする DN Aまたは mRN Aの異常 （遺伝子異常） を 検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異 あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺 伝子診断剤として有用である。
本発明のポリペプチドをコードする D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例え ば、 自体公知のノーザンハイブリダィゼーシヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミ ックス （Genomi cs) ， 第 5巻， 8 7 4〜8 7 9頁 （1 9 8 9年） 、 プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユー エスエー (Proceed ings of the Nat ional Academy of Sc iences of the Uni ted States of Amer ica) ， 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （1 9 8 ,9年） ） など により実施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダィゼーションにより発現低下が検出された場合は、 GHの不足に起因する疾患、 例えば、 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎 疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨 形成不全もしくは若年性慢性関節症候群などである可能性が高いと考えられる。 一方、 ノーザンハイブリダィゼ一シヨンにより発現増加が検出された場合は、 G Hの分泌過剰に起因する疾患、 たとえば先端巨大症、 T S H産生腫瘍、 非分泌性 (非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 A C TH (アドレノコルチコトロピン） 産生腫 瘍、髄様甲状腺癌、 V I P産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、 ィンスリノーマ、 カルチノィド、 ィンスリン依存性および非依存性糖尿病などな どである可能性が高いと考えられる。
( 6 ) 本発明のポリペプチドをコードする D N Aを有する非ヒト動物の作製 本発明のポリぺプチドをコ一ドする D N Aを用いて、 本発明のポリぺプチド等 を発現するトランスジエニック非ヒト動物を作製することができる。 非ヒト動物 としては、 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する） が挙げ れる。
本発明のポリペプチドをコードする D N Aを対象動物に転移させるにあたつ ては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子 コンストラク小として用いるのが一般に有利である。 例えば、 マウス由来の本発 明の D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D NAを 動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラ クトを、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本 発明の蛋白質等を高産生する D NA転移動物を作出できる。 このプロモーターと しては、 例えば、 ウィルス由来プロモーター、 メタ口チォネイン等のュビキアス な発現プロモーターも使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺 伝子プロモーターゃェノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明のポリペプチドをコードする D NAの転移は、 対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D NA転 移後の作出動物の胚芽細胞において本発明のポリぺプチド等が存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のポリぺプチド 等を有することを意味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明のポリペプチド等を有する。
本発明のポリぺプチドをコ一ドする D N A転移動物は、 交配により遺伝子を安 定に保持することを確認して、 該 D NA保有動物として通常の飼育環境で飼育継 代を行うことができる。 さらに、 目的 D N Aを保有する雌雄の動物を交配するこ とにより、 導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを有するように 繁殖継代することができる。
本発明のポリペプチドをコードする D NAが転移された動物は、 本発明のポリ ペプチド等が高発現させられているので、 本発明のポリペプチド等に対するァゴ ニス卜またはアン夕ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。 本発明のポリペプチドをコードする D NA転移動物を、 組織培養のための細胞 源として使用することもできる。 例えば、 本発明のポリペプチドをコードする D N A転移マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直接分析するか、 あるいは遺 伝子により発現された本発明のポリぺプチドが存在する組織を分析することに より、 本発明のポリペプチド等について分析することができる。 本発明のポリべ プチド等を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能 を研究することができる。 また、 その細胞を用いることにより、 例えば、 各種組 織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のポリぺプチド等を単離精製することも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C
Y チミンまたはシトシン
N チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァニン
R アデニンまたはグァニン
M シトシンまたはアデニン
W チミンまたはアデニン
S シトシンまたはグァニン
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
TFA ： 卜リフリレ才□酢酸
E I A ：ェンザィムィムノアッセィ
G 1 yまたは G ：グリシン
A 1 aまたは A ：ァラニン
V a 1または V ：パリン
L e uまたは L ： ロイシン
I 1 eまたは I ：イソロイシン
S e rまたは S ：セリン
Th rまたは T ：スレオニン
Cy sまたは C ：システィン
Me tまたは M ：メチォニン
G 1 uまたは E ：グルタミン酸
A s pまたは D ：ァスパラギン酸
Ly sまたは K ： リジン
A r gまたは R ：アルギニン
H i sまたは H ： ヒスチジン
Ph eまたは F ：フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y ：チロシン
T r pまたは W ： 卜リブ卜ファン
P r oまたは P ：プロリン
A s nまたは N ：ァスパラギン
G 1 nまたは Q ：グルタミン
pG 1 u ： ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
Bu ：ブチル基 Ph ： フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミド基
Bom ：ベンジルォキシメチル
NMP ： N—メチルピロリドン
PAM ： フエ二ルァセトアミドメチル
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
To s ： p—トルエンスルフォニル
HONB： N—ヒドロキシ— 5—ノルポルネン一 2， 3—ジカルボキシイミド B z 1 ：ベンジル
Z ：ベンジルォキシカルボニル
B r -Z ： 2 _ブロモベンジルォキシカルポニル
C 1 -Z ： 2—クロルべンジルォキシカルポニル
Boc ： t _ブチルォキシカルポニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
DCC： Ν、 Ν'—ジシクロへキシルカルポジイミド
TFA： トリフルォロ酢酸
Fmo c ： N— 9一フルォレニルメトキシカルポニル
DNP：ジニトロフエニル
Bum：夕一シャリ一ブトキシメチル
T r t ： 卜リチル
Me B z 1 ： 4一メチルベンジル
CHO:ホルミル
NMP： N—メチルピロリドン
〇 c H e X ：シク口へキシルエステル
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕 後述の実施例 3で得られた本発明のリガンドボリペプチドをコードするアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す (ゥシ型） 。
〔配列番号： 3〕
後述の実施例 5で得られたゥシ型ポリぺプチドをコ一ドするアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 3で表されるアミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す (ゥシ型） 。
〔配列番号： 5〕
後述の実施例 6で得られたヒト型ポリペプチドをコードするァミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 5で表されるアミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す (ヒ卜型） 。
〔配列番号： 7〕
後述の実施例 7で得られたラット型ポリペプチドをコードするァミノ酸配列 を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す (ラッ卜型） 。
〔配列番号： 9〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする D N Aの塩基配列を示す (ヒト型） 。
〔配列番号： 1 0〕 配列番号： 7で表されるァミノ酸配列の N末端から 2ないし 18番目のァミノ 酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 12〕
後述の実施例 5で用いられたプライマー b Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
後述の実施例 5で用いられたプライマー bRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
後述の実施例 6で用いられたプライマ一 h Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
後述の実施例 6で用いられたプライマー hRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
後述の実施例 7で用いられたプライマー r Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
後述の実施例 7で用いられたプライマー r Rの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
Howard et.al. Science, vol.273, p974-977, (1996)に記載の GHSROium la)を コードするァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 19〕
Howard et.al. Science, vol.273, p974-977, (1996)に記載の GHSR (Pig la)を コードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 20〕
Howard et.al. Science, vol.273, p974-977, (1996)に記載の GHSR (Hum lb)を コードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
Howard et.al. Science, vol.273, p974-977, (1996)に記載の GHSR (Pig lb)を コードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー GH C Fの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
後述の実施例 1で用いられたプライマー GHRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
ラット型 GHSRをコードするアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕
配列番号： 24で表されるアミノ酸配列をコ一ドする DNAの塩基配列を示す。 後述の実施例 5で得られたゥシ型 GHSRの内因性リガンド遺伝子 （配列番 号： 4、 図 2、 図 3) を保持する形質転換体 Escherichia col i JM109/pbKWlは、 1999年 12月 6日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6961として、 財団法人発酵研究所 （I F O) に 1999年 10月 27日から寄託番号 I F〇 16326として寄託され ている。
後述の実施例 6で得られたヒト型 G H S Rの内因性リガンド遺伝子 （配列番 号： 6、 図 4、 図 5) を保持する形質転換体 Escherichia co 1 i JM109/phKW9は、 1999年 12月 6日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6963として、 財団法人発酵研究所 （I F O) に 1999年 10月 27日から寄託番号 I FO 16327として寄託され ている。
後述の実施例 7で得られたラット型 GHSRの内因性リガンド遺伝子 （配列番 号： 8、 図 7、 図 8) を保持する形質転換体 Escherichia col i JM109/prKW4は、 1999年 12月 6日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6962として、 財団法人発酵研究所 （I F O) に 1999年 10月 27日から寄託番号 I FO 16328として寄託され ている。 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 実施例 1 GH S R発現 CHO細胞の樹立
ラット型 GHSR (growth hormone secretagogue receptor) 遺伝子の取得は 以下のように行った。 Molecular Endocrinology 11 (4), 415-423 (1997)に報告 されているラット型 GH S R type 1 Aの配列に基づき以下の 2種類の合成 DN A を合成した。
GHCF： 5'-GTCGACCATGTGGAACGCGACCCCCAGCGAGGAG-3' (配列番号： 22)
GHR ： 5'-GCTAGCGGAGAGATGGGATGTGCTGTCATGT-3' (配列番号： 23)
これらの合成 DN Aを用いてラット視床下部由来 c DNAより P C R (polymerase chain react ion)にて取得した。 P C Rの反応液はラット視床下部 c DNA溶液 2 il l (0.2 ng poly(A)+RNA由来） 、 GHCF l (10 zM) 、 GHR 1 l (10 M) 、 添付の 10 xバッファー溶液 5 し dNTPs (Im ) 、 1 Klen Taq (クロンテック社） 、 35 1蒸留水を加えて合計 50 1にした。 反応液を ThermalCycler9600 (パーキンエルマ一社）を用いて P C R反応を行った。 PCR の条件は 95 2 分の変性の後、 98で10秒、 68で 90秒のサイクルを 3 5回繰 り返した。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 1.1 kbの PC R産物の増幅を 確認した後、 PCR産物を TAクローニングキット （Invitrogen社) を用いてサ ブクローニングした。 サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドを自動 プラスミド抽出装置 （クラボウ社） を用いて抽出し、 挿入断片の塩基配列を決定 し、 その配列が上記の文献に報告されているものと同一の GHSR c DNAで あることを確認した。 次にそのプラスミドを制限酵素 S a 1 Iおよび Nh e Iに よって消化後、 約 1.1 kbの GHSR c DNA断片を得た。 さらに、 動物細胞用 の発現ベクターである P AKKO— 1 1 1Hを、 マルチクローニングサイト部分 に存在する制限酵素認識部位 S a 1 Iおよび N he Iによって消化後、 電気泳動 を行い、 ベクター部分を回収した。 以上の操作によって調製したラット GHS受 容体 c DNAの断片および発現ベクターをライゲ一ションによって連結し、 大腸 菌 JM109を形質転換して E. coli JM109Zp AKKOGHS Rを得た。 さらに、 形質転換体 E. coli J M 109ZPAKKOGHS Rを培養し、 プラス ミド pAKKOGHSRの DNAを大量に調製した。
そのプラスミド DNAのうちの 20 gを lmlの生理的食塩水 （PBS) に溶 解後、 ジーントランスファー （和光純薬） のバイアルに注入し、 ポルテックスミ キサーを用いて激しく撹拌して DN Aを含有するリボソームを形成させた。 CH Odh f r—細胞 ίないし 2 X 10 個を直径 35匪の細胞培養用シャーレに播 種し、 20時間培養した後に培養液を新鮮なものに交換した。 各シャーレに対し て 0.5 xgの DNAに相当する量 （25 1 ) のリボソーム液を滴下し、 16時 間インキュベーションを行ってプラスミド DN Aの導入を行った。 さらに新鮮な 培地に交換して 1日間培養した後、 選択培地に交換して 3日間培養を続け、 最後 に ト リ プシン消化を行って分散させた細胞を低密度で選択培地 (deoxyribonucleosides <i^ribonucleosides L^l^miniinuni essential medium, alpha mediumに 10 %透析ゥシ血清を加えたもの） 中に播種し、 形質転 換体の選択を行つた。 形質転換体のみが選択培地中で増殖することが可能であり、 継代を繰り返すことによつて選択を重ね、 C H〇 _ GH S R細胞を樹立した。 こうして得られた CH〇— GHS R細胞の中には細胞上に発現している GH SR受容体の数に差が生じている可能性が考えられた。 そのような集団の中から 受容体の高産生細胞をクローニングすれば、 高感度で安定的なアツセィが行える ことが期待できるため、 G H S Rに作動する人工ペプチドである GHRP— 6を 標準サンプルとし、 ァラキドン酸代謝物放出活性を指標に高反応性クローンを選 択した。 そうして得られた高反応性クローンとして CHO— GHSR—23を榭 立し、 内因性リガンドの探索に用いることとした。 実施例 2 組識抽出物中に含まれる C H〇一 GH S R-23細胞を特異的に刺 激する活性の検出
ゥシ視床下部から、 基本的に以下に述べる方法によって抽出物を調製し冷蔵保 存したものを細胞刺激活性のスクリ一ニング用のサンプルとした。
ゥシ視床下部を煮沸、 破砕したものを 1M酢酸を用いて抽出し、 遠心分離した 上清に 0. 05 %TF A (トリフルォロ酢酸）を添加した後に C18カラムに吸着さ せ、 10%、 30%、 50%濃度のァセトニトリル（CH3CN)によって段階的 に溶出した。それぞれの溶出液を 2 OmM酢酸アンモニゥム（CH3CO〇NH4) _ 10%ァセトニトリル (pH4.7)に調製後、 CMセファロ一ス陽イオン交換カラ ム（HiPrep CM Sepharose FF，フアルマシア）に吸着させ、 10 OmM、 200m M， 50 OmM, 100 OmM塩化ナトリウム（NaC 1)で溶出した。 それぞれ の画分に 3倍量のアセトンを添加して除蛋白した後、濃縮し、逆相カラム RESOURCE RPC 3ml (フアルマシア）に吸着させ、 10— 30 %ァセトニトリル濃度勾配で分 画し、 各フラクションを凍結乾燥した。
細胞刺激活性は細胞からのァラキドン酸代謝物放出活性を指標に測定した。 C HO-GHS R- 23細胞あるいはコントロールの細胞をトリプシン消化によ つて分散させ、 培地にて l.OxlO5個/ m 1に希釈したものを 24ゥエルプレートに 0.5mlずつ分注し、 一晩培養した。 [3H] —ァラキドン酸 (NEN)を 200分の 1量含 む培地に交換してさらに一晩培養した後、 活性測定に使用した。 細胞をアツセィ ノ^ツファー 、aeoxyribonucleosidesおよび ribonucleosides 含有しなレ ^ minimum essential, medium, alpha mediumに 0. 1 %ゥシ血†言アレブミン、 15 mMHEPES pH7.3を添加したもの）にて 3回洗浄後 37t:で 30分間プレイ ンキュベーシヨンした。 さらに 2回洗浄した後、 各ゥエルに 0. 5mlのサンプ ルを加えて 37 で 30分間インキュベーションし、その上清中に放出された [3 H] —ァラキドン酸代謝物の放射活性をシンチレ一シヨンカウン夕一にて測定し た。 ゥシ視床下部より上記の方法で調製したサンプルを少量の DM S〇（ジメチル スルホキシド）に溶解したのちアツセィバッファーにて希釈したものをサンプル とし、 CH〇— GHSR—23細胞からのァラキドン酸代謝物放出活性を測定 した。 その結果、 コントロール細胞に比べ、 CHO— GHSR— 23細胞を特 異的に刺激する活性をフラクション 8に見出した。 実施例 3 ゥシ視床下部を用いた、 CH〇_GHSR_23細胞から特異的に ァラキドン酸代謝物放出を上昇させる活性の精製
CHO-GHSR- 23細胞から特異的にァラキドン酸代謝物の放出を上昇 させる活性物質についてゥシ視床下部から精製した代表例を以下に述べる。 ゥシ 視床下部 2 kgを小片化し、蒸留水 4. 0 L中で 15分間煮沸した。急冷した後、 終濃度 1. 0Mとなるように酢酸 28 Om 1を加え、 ポリトロンにてホモジナイ ズ（12 k r pm、 6m i n)した。 ホモジェネートをー晚攪拌した後、 遠心にて 上清を得た。 沈殿物は 1. 0M酢酸 2. 0 Lに懸濁し、 ポリトロンにてホモジナ ィズし遠心にて再度上清を得た。 上清をまとめ、 終濃度 0. 05%となるよう T FAを加え、 平衡化した逆相 C18カラム（Preparative C18 125A 100 g； ゥォ —ターズ）に添加した。 添加後、 0. 05%TFA/dH2O (以下 dH2〇は蒸 留水を示す） 60 Omlでカラムを洗浄後、 10%、 30%、 50%CH3CN / 0. l TFAZd ^O で 3段階に溶出した。 30% CH3CN /0. 1 %T FAZdH20 溶出画分に 2倍量の 2 OmMCHgCOONH ZdHzO pH4. 7を加え、 陽イオン交換カラム HiPrep CM Sepharose FF (20m l) (フアルマ シァ）に添加した。 20mMCH3COONH4/l 0% CH3CN ZdH20 p H4. 7でカラムを洗浄後、 100mM、 20 OmM, 50 OmM, 1000m MNaC 1/20mMCH3COONH4/l 0% CH3CN ZdH2〇 pH4. 7で 4段階に溶出した。 50 OmMN a C 1ノ 20mMCH3C〇〇NH4Z 1 0 % CH3CN /dU20 pH4. 7溶出画分を 50 OmMNaC 1/2 Om MCH3COONH4/ 10 % CH3CN /d 0 pH4. 7で 5倍に希釈し た後 3倍量のアセトンを加え、 除蛋白質およびエバポレーシヨンによる濃縮を行 つた。 濃縮された画分に TF A (終濃度 0. 05%)を加え、 逆相カラム RESOURCE RPC 3ml (フアルマシア）に添加した。 12. 0- 19. 0%CH3CN濃度勾配 による溶出で、 16. 5- 17. 0%CH3CN画分に CH〇— GHSR— 23 細胞から特異的にァラキドン酸代謝物の放出反応を促進する活性が検出された。 得られた活性画分を再度 RESOURCE RPC 3mlに添加し、 14. 0- 18. 0 CH 3CN濃度勾配により溶出したところ、 17. 5%CH3CN画分に CHO— GH SR-23細胞からのァラキドン酸代謝物放出活性が検出された。 この活性画分 を 20mMCH3COONH4/ 10% CH3CN ZdH20 pH4. 7にて希 釈し、 陽イオン交換カラム RESOURCE S lml (フアルマシア）に添加した。 300— 80 OmMN a C 1 20 mMCH3 C OONH4/ 10 % CH3CN /dH2 O pH4. 7の濃度勾配により分画したフラクションを SepPakC18カラム（ゥォ —夕一ズ）により脱塩したサンプルの活性を測定したところ、 600— 640m MNa C 1溶出画分に CHO— GHSR— 23細胞からのァラキドン酸代謝物 放出活性が検出された。 これらの活性画分を逆相カラム Sephasil C8， b m SC2.1/10に添加し、 21. 4-22. 4 %CH3CN濃度勾配により溶出したと ころ、 21. 7%CH3CNに溶出されるピークに CHO— GHSR— 23細胞 からの特異的なァラキドン酸代謝物放出活性が検出された。 （図 1 ) 実施例 4 ゥシ視床下部から精製された CH〇— GHSR— 23細胞からのァ ラキドン酸代謝物放出活性を特異的に上昇させる活性物質のアミノ酸配列決定 実施例 3で精製された CHO— GHSR— 23細胞からのァラキドン酸代謝 物放出活性を特異的に上昇させる活性物質のアミノ酸配列の決定を行った。 逆相 カラム Sephasil C8, 5 /zm SC2.1/10で活性と一致したピークの画分を凍結乾燥後、 ペプチドシークェンサ一（PE Applied Biosystems Procice 491cLC)によるァミノ 酸配列分析を行った。 その結果、 配列番号： 1に示すアミノ酸配列が得られた。 実施例 5 ゥシ型の G H S Rの内因性リガンド遺伝子の取得
ゥシ型 G H S Rの内因性リガンド遺伝子全長をコードする断片取得のために 以下の 2種類の DN Aを合成した。
bF： 5'-CAGCCGTGCAAATCCCTAAGAGAAGATGAC-3' (配列番号： 12)
bR： 5'-GCGGGGGACAGAGGAGGCCTTGGTTC-3' (配列番号： 13)
ゥシ視床下部 poly(A)+RNA 1 gより Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech社）を使用して、 添付のマニュアルに従って合成した c DNAを铸型とし て PCRを行った。 PCRの反応液は cDNA溶液 4 1 (4 ngpoly(A)+RNA由来）、 1 β 1 dNTPs (lOmM) 、 0.5//1 Klen Taq DNA polymerase (Clontech社） 、 2.5 1 Klen Taq DNA polymeraseに添付されている 10 xバッファ一、 16 1蒸留水、 さ らに合成 DNA 13 と 31^ (各10 M)を 0.5 lずつ加え、合計 25 1とした。 反応液は ThermalCycler9600を用いて PCR反応にかけた。 PCRの条件は 95 °C2分の 変性の後、 98 10 秒、 68 ^60秒のサイクルを 38回繰り返した。 PCR産物の一 部を用いて電気泳動で約 1.4kbの PCR産物の増幅を確認した後、 PRISM model 377 DNAシーケンサー （PE Biosystems社） を用いて、 PCR産物を直接配列決定しゥシ 型遺伝子配列 （配列番号： 4、 図 2、 図 3) を得た。 この DNA配列から予測され るアミノ酸配列を配列番号： 3、 図 2および図 3に示した。 実施例 4で得られた ゥシ視床下部由来のアミノ酸配列 （配列番号： 1) は配列番号： 3の 2番目から 18番目であり、 この遺伝子は GHSRのゥシ型内因性リガンド遺伝子をコード する遺伝子であることが確認できた。 実施例 6 ヒト型の GHSRの内因性リガンド遺伝子の取得
ヒト型 GH S Rの内因性リガンド遺伝子全長をコードする断片取得のために 以下の 2種類の DN Aを合成した。
hF： 5'-TGGACCAGCCGTGCAAATCTCTA-3' (配列番号： 14)
hR： 5'-CCGGTGGCCTAAAGTGTGGTCTCA-3' (配列番号： 15) - ヒト全脳 poly(A)¾NAl gより Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech 社）を使用して、 添付のマニュアルに従って合成した c DNAを铸型として PCRを行 つた。 PCRの反応液、 条件は合成 DNAに hF， hRを使用した以外は実施例 5と同 様とした。 PCR産物の一部を用レゝて'電気泳動で約 1.3kbの PCR産物の増幅を確認し た後、 PRISM model 377 DNAシーケンサー （PE Biosystems社） を用いて、 PCR 産物を直接配列決定しヒト型遺伝子配列 （配列番号： 6、 図 4、 図 5) を得た。 この DNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号： 5、 図 4、図 5に示した。 またゥシ型との比較 （図 6) から、 取得された遺伝子は GHSRのヒト型内因性 リガンド遺伝子であることが確認できた。 実施例 7 ラット型の GHSRの内因性リガンド遺伝子の取得
ラット型 GHSRの内因性リガンド遺伝子全長をコードする断片取得のため に以下の 2種類の DN Aを合成した。
rF： 5'-AGCGGCGGGCAGCGGAGAAGAT-3' (配列番号： 16)
rR: 5'-TGACACTGGGCCAGAAGCACAC-3' (配列番号： 17)
ラット全脳 poly(A)+RNAl gより Marathon DNAAmplification Kit (Clontech 社）を使用して、 添付のマニュアルに従って合成した c DNAを铸型として PCRを行 つた。 PCRの反応液、 条件は合成 DNAに rF, rRを使用した以外は実施例 5と同 様とした。 PCR産物の一部を用いて電気泳動で約 1.4kbの PCR産物の増幅を確認し た後、 PRISM model 377 DNAシーケンサー （PE Biosystems社） を用いて、 PCR産 物を直接配列決定しラット型遺伝子配列 （配列番号： 8、 図 7、 図 8) を得た。 この DNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号： 7、 図 7、図 8に示した。 またゥシ型との比較 （図 6) から、 取得された遺伝子は GHSRのラット型内因 性リガンド遺伝子であることが確認できた。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドをコードする D N Aまたは本発明のポリぺプチドは、① 本発明のポリべプチドの有する生理作用の探索、②合成オリゴヌクレオチドプロ ーブあるいは PC Rのプライマーの作成、 ③ GHSRのリガンドをコードする D NAの入手、 ④組換え型レセプ夕一蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アツ セィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤抗体および抗血清の入手、 ⑥ DNA、 RNA、 抗体または抗血清を用いた診断薬の開発、 ⑦ GH分泌調製剤
(具体的には、①下垂体性小人症、ターナー症候群、慢性腎疾患、軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全もしくは若年 性慢性関節症候群または②先端巨大症、 TSH産生腫瘍、 非分泌性 （非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産生腫瘍、 髄様甲状 腺癌、 V I P産生腫瘍、 グルカゴン産生腫瘍、 ガストリン産生腫瘍、 インスリノ 一マ、 カルチノイド、 インスリン依存性もしくは非依存性糖尿病の予防 ·治療剤 など） などの医薬の開発、 ⑧遺伝子治療等に用いることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有することを特徴とするポリぺプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩。
2 . 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列であ る請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩。
3 . 配列番号： 3、 配列番号： 5または配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
4. 請求項 1記載のポリペプチドをコードする D N Aを含有する D NA。
5 . 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8、 配列番号： 9 または配列番号： 1 1で表される塩基配列を有する請求項 4記載の D NA。
6 . 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩に対する抗体。
7 . 請求項 5記載の D N Aまたは請求項 6記載の抗体を含有してなる診断剤。
8 . 請求項 5記載の D NAに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンス D NA。
9 . 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる剤。
1 0 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩を含有してなる医薬。
1 1 . 成長ホルモンの不足に起因する疾患の予防 ·治療剤である請求項 1 0記載 の医薬。
1 2 . 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下 垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全または若年性慢性関節 症候群の予防 ·治療剤である請求項 1 0記載の医薬。
1 3 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載のポリペプチドもしくはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法。
1 4. 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩および配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するするポリペプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩、 またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩を用いることを特徵とする請求項 1 3記載のス クリーニング方法。
1 5 . 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩および配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するするポリペプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩、 またはその部分ペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩を含有してなる請求項 1記載のポリぺプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害 する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 6 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 5記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られうる請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物ま たはその塩。
1 7 . 請求項 1 6記載の化合物またはその塩を含有してなる成長ホルモンの分泌 調節剤。
1 8 . 請求項 1 6記載の化合物またはその塩を含有してなる①下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候 群、 シルバー症候群、 骨形成不全もしくは若年性慢性関節症候群または②先端巨 大症、 T S H産生腫瘍、 非分泌性 （非機能性） 下垂体腫瘍、 異所性 A C TH (ァ ドレノコルチコトロピン） 産生腫瘍、 髄様甲状腺癌、 V I P産生腫瘍、 グルカゴ ン産生腫瘍、 ガストリン産生腫瘍、 インスリノーマ、 カルチノイド、 インスリン 依存性もしくは非依存性糖尿病の予防 ·治療剤。
1 9 . 下垂体性小人症、 ターナー症候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下 垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバー症候群、 骨形成不全または若年性慢性関節 症候群の予防 ·治療作用を有する医薬を製造するための請求項 1記載のポリぺプ チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の使用。
2 0 . 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩を哺乳動物に投与することを特徴とする下垂体性小人症、 ターナ一症 候群、 慢性腎疾患、 軟骨異栄養症、 成人性下垂体不全症、 ダウン症候群、 シルバ 一症候群、 骨形成不全または若年性慢性関節症候群の予防 ·治療方法。
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HAWARD A.D. ET AL.: "A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release", SCIENCE, vol. 273, no. 5277, 1996, pages 974 - 977, XP002935894 *
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