WO2001027159A2 - Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen - Google Patents

Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen Download PDF

Info

Publication number
WO2001027159A2
WO2001027159A2 PCT/EP2000/009714 EP0009714W WO0127159A2 WO 2001027159 A2 WO2001027159 A2 WO 2001027159A2 EP 0009714 W EP0009714 W EP 0009714W WO 0127159 A2 WO0127159 A2 WO 0127159A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antigen
polypeptide
seq
polypeptide according
antibody
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/009714
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001027159A3 (de
Inventor
Hinrich Abken
Original Assignee
Hinrich Abken
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hinrich Abken filed Critical Hinrich Abken
Priority to EP00979484A priority Critical patent/EP1218414A2/de
Priority to JP2001530377A priority patent/JP2004507205A/ja
Publication of WO2001027159A2 publication Critical patent/WO2001027159A2/de
Publication of WO2001027159A3 publication Critical patent/WO2001027159A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to polypeptides which have binding specificity for the CA19-9 antigen, their production and use for the detection and elimination of CA19-9 antigen positive cells, i. H. for tumor diagnosis and therapy.
  • the invention further relates to radiolabeled derivatives of these polypeptides, their preparation and their use in radioimmunoassays, radio scintigraphy and radioimmunotherapy, and coupling products of these polypeptides with indicator substances or pharmacologically active substances.
  • Efforts to improve this situation are hampered by the lack of a reagent that can be used in vivo imaging techniques to detect and localize primary tumors and metastases.
  • a therapeutic approach is further complicated by the fact that a reagent for the specific see in vivo drug targeting of pancreatic and gastric carcinoma is not available.
  • the CA19-9 antigen is a monosialoganglioside which is detected in immunohistochemical analysis with the help of the antibody 1116-NS-19-9 (mouse IgG1) in numerous gastric and pancreatic carcinomas (Koprowski et al., Somatic Cell Genet. 5 , 957-971, 1979; Koprowski et al., U.S. Pat. 4,471,057; hybridoma clone ATCC HB-8059).
  • the multiple application of the anti-CA19-9 antibody for in vivo purposes is limited. Since the antibody 1116-NS-19-9 (ATCC HB-8059) is a mouse antibody, "HAMA” immune reactions ("human anti-mouse anti-bodies”) can be expected in repeated applications. Further attempts to make the antibody usable by modifications for diagnostic or therapeutic in vivo use have so far been unsuccessful.
  • the object of the invention was to provide reagents for the detection (in vivo targeting) of gastric and pancreatic carcinoma.
  • VH variable region of the heavy chain
  • (B) consisting of the variable region of the light chain (VL) of an anti-CA19-9 antibody or a fragment thereof with binding specificity for the CA19-9 antigen, wherein the oligopeptides (A) and (B) directly or through a bridge peptide (C) are linked together;
  • a radiolabeled polypeptide the polypeptide being as defined in (1)
  • a method for producing the radiolabeled polypeptide defined in (7) comprising reacting the polypeptide defined in (1) with the radioisotope;
  • FIG. 1 shows the DNA and the amino acid sequence (frame: one-letter code) of the CA19-9-binding polypeptide.
  • the VH and VL regions and the bridge peptide are labeled.
  • the integrated peptide (DNA bp 341-433) is a preferred bridge peptide and can be replaced by other bridge peptides.
  • a microtiter plate was coated with the monoclonal antibody NS19-9 (2 ⁇ g / ml) and then with lysates of the CA19-9 positive tumor cell line SW948 ( ⁇ ) or the CA19-9 negative tumor cell line H716 ( D) incubated. Dilutions of the SEQ ID NO: 2-scFv-M13 phage antibody were transferred to the antigen-coated plate and bound phage antibodies were measured photometrically at O.D. using a peroxidase-coupled anti-M13 antibody and indicator color reaction. 405 nm detected.
  • a microtiter plate was coated with anti-CA19-9 antibody NS19-9 (2 ⁇ g / ml NS19-9 mAb) and then incubated with 100 ⁇ l of supernatant from the CA19-9 secreting tumor cells H498.
  • the SEQ ID NO: 2-scFv-M13 phage antibody was incubated in the presence of various dilutions of the monoclonal anti-CA19-9 antibody NS19-9 ( ⁇ ) or an antibody of the same isotype (IgG) with irrelevant specificity (D) (maximum concentration) 10 ⁇ g / ml).
  • the photometric detection (OD 405 nm) of the bound phage antibody SEQ ID NO: 2-scFv-M13 was carried out using a peroxidase-coupled anti-M13 antibody and a color indicator reaction.
  • a microtiter plate was coated with the monoclonal antibody NS19-9 (2 ⁇ g / ml) and then with culture medium containing CA19-9 antigen from the CA19-9 positive tumor cell line H498 ( ⁇ ) or with the culture supernatant of CA19-9 negative tumor line HL60 (D) incubated.
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-scFv-CH2CH3 was added in dilutions to the antigen-coated plate, and the bound fusion protein was subsequently used with the aid of a biotin-coupled anti-human IgG (Fc) antibody which is directed against the CH2CH3 domain of the fusion protein , and a streptavidin-coupled peroxidase and color indicator reaction were detected photometrically (OD 405 nm).
  • Fc biotin-coupled anti-human IgG
  • OD 405 nm streptavidin-coupled peroxidase and color indicator reaction
  • the photometric detection (O.D. 405 nm) of the bound fusion protein SEQ ID NO: 2-scFv-CH2CH3 was carried out using a biotin-coupled anti-human IgG (Fc) antibody and a streptavidin-coupled peroxidase.
  • the data are mean values from two independent test approaches.
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-scFv-CH2CH3 was found on the indirectly immobilized CA19-9 antigen in the presence of dilutions of the culture medium of the CA19-9 positive tumor cell line H498 (•), which secreted large amounts of CA19-9 antigen, or the culture supernatant of the Incubated CA19-9 negative tumor line HL60 (o).
  • the photometric detection (OD 405 nm) of the bound fusion protein SEQ ID NO: 2-scFv-CH2CH3 was carried out using a biotin-coupled anti-human IgG (Fc) antibody and a streptavidin-coupled peroxidase. The results are averages from two independent experimental approaches. 5: FACS analysis of the binding of the fusion protein SEQ ID NO: 2-CH2CH3 on CA19-9 positive tumor cells
  • a microtiter plate was coated with the monoclonal antibody NS19-9 (2 ⁇ g / ml) and then with CA19-9 antigen-containing culture supernatant of the CA19-9 positive tumor cell line H498 ( «, s) or with the culture supernatant the CA19-9 negative tumor line H716 (D, ⁇ ).
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-CH2CH3-IL2 was incubated in the indicated dilutions on immobilized CA19-9 antigen.
  • Bound fusion protein was (a) photometrically detected using a biotin-coupled anti-human IgG (Fc) antibody that binds the CH2CH3 domain of the fusion protein, or (b) using a biotin-linked anti-human IL2 antibody and subsequent color indicator reaction ( OD 405 nm).
  • Fc biotin-coupled anti-human IgG
  • the two oligopeptides preferably originate from the same antibodies.
  • one or both of the oligopeptides be derived from the antibody 1116-NS-19-9.
  • the hybridoma cells that produce these antibodies can be obtained from the American Type Culture Collection, Rockville; MD, available under reference number ATCC HB-8059.
  • both the oligopeptide (A) and the oligopeptide (B) can be the N-terminal component of the polypeptide according to the invention.
  • the oligopeptides (A) and (B) are linked to one another via a bridge peptide (C) (hereinafter also referred to as "linker” or linker peptide ").
  • bridge peptide (C) All peptides which allow a folding and arrangement of the oligopeptides (A) and (B) with respect to one another can be used as the bridge peptide (C), so that efficient antigen binding is ensured.
  • Preferred bridge peptides consist of a short, flexible oligopeptide with 5 to 50, in particular with 20 to 50, amino acid residues.
  • Ser and Gly (SG) -rich bridge peptides which, for. B. store up to 10 amino acid residues.
  • These SG-rich bridge peptides are preferably modular and include SG-rich elements, e.g. T. separated by pro. The SG-rich elements are between 2 and 20 amino acids long. One SG element is sufficient to hold the above-mentioned. To perform functions.
  • a proline residue in the middle of the bridge peptide is used to create an angle in the polypeptide chain.
  • Other amino acids such as e.g. B. Gly, Ser, Asp and Asn can
  • bridge peptides preferably have the following structure
  • A, B, D, E are independently a bond, an amino acid residue or a polypeptide with up to 5 amino acid residues,
  • C is selected from Pro, Gly, Ser, Asp and Asn and in particular Pro is, n, m, o and p are independently integers from 0 to 10 and x and y are independently integers from 1 to 5.
  • a particularly preferred bridge peptide (C) is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide (1) according to the invention has the amino sequence of SEQ ID NO: 2, which consists of VH and VL of the 1116-NS-19-9 antibody in the arrangement VH linker peptide-VL.
  • scFv polypeptide chain in the arrangement VH-Iinker-VL or VL-Iinker-VH.
  • VH immunoglobulin heavy chain
  • VL cDNA for the of the light chain
  • This DNA can then be expressed in a suitable host organism / cell system.
  • Suitable systems in the sense of the present invention are bacterial expression systems, e.g. B. coli HB2151 using the vector pCANBAB 5E or eurkaryotic expression systems, e.g. B. 293T cells using the vector pRSV (with Ig kappa leader peptide).
  • polypeptide according to the invention shown here by way of example for the scFv molecule SEQ ID NO: 2, has retained the specificity of the parental antibody 1116-NS-19-9 for the CA19-9 antigen.
  • the molecule SEQ ID NO: 2 binds specifically to CA19-9 antigen (example 1), to CA19-9 antigen-bearing cells (example 2, FIG. 5), but not to other carbohydrate antigens and CA19-9 antigen tested. negative cells (example 1).
  • the molecule SEQ ID NO: 2 shows an unexpectedly good tissue penetration and accumulation on CA19-9 positive cells, preferably tumor cells in vivo. This is shown, for example, after intravenous application of the labeled molecule SEQ ID NO: 1 in mice which carry experimentally generated CA19-9 positive tumors (Example 6). However, there is no accumulation of healthy tissue.
  • the preferred use of the molecule according to the invention is the detection and localization of CA19-9 positive cells in vivo, in particular tumors, for example gastric and pancreatic carcinoma, in imaging diagnostics.
  • the molecule SEQ ID NO: 2 is not intemalized after binding to the antigen-carrying cell. This property is all the more surprising since the bound ligands are internalized in the vast majority of the receptor-ligand systems. This applies all the more to antibodies that bind to a molecule in the outer cell membrane.
  • the lack of internalization of the molecule SEQ ID NO: 2 also ensures a long residence time on the cell surface without degradation due to cytoplasmic proteases. This property proves to be particularly advantageous when using the SEQ ID NO: 2 molecule for drug targeting, pro-drug activation, radioactive / ⁇ -Vo labeling and other methods in which the molecule is used for targeting.
  • the molecule SEQ ID NO: 2 is free of constant proportions of the mouse immunoglobulin, so that no pronounced HAMA immune reaction is to be expected when the molecule is used repeatedly. This property, unlike the previously existing anti-CA19-9 antibodies, the use of the SEQ ID NO: 2 molecule in / ti-wVo methods in diagnostics and therapy.
  • NK cells natural killer cells
  • a preferred use of the molecule SEQ ID NO: 2 after coupling with Ig CH2CH3, CH2 or CH3 domains is the elimination of CA19-9 positive tumor cells in vivo and in vitro.
  • the preferred object of the invention is the covalent or non-covalent coupling of the anti-CA19-9 scFv molecule to a further large number of molecules in accordance with the desired use.
  • the following modifications of the polypeptide according to the invention and their uses should only be mentioned here by way of example.
  • the polypeptide according to the invention accumulates, e.g. B. the molecule SEQ ID NO: 2 at the location of the CA19-9 positive tumor and its metastases.
  • the tumors can be localized in vivo using scintigraphic methods.
  • the z. B. with a radioisotope labeled polypeptide administered to the patient and the binding to the CA19-9 carrying tissue is detected from outside the body.
  • Other indirect or direct methods for immunoscintigraphy can also be used for the detection of CA19-9 positive tumors in vivo, the molecules according to the invention, preferably SEQ ID NO: 2, mediating the specific binding to the tumor cells.
  • polypeptide according to the invention is the radiotherapeutic elimination of CA19-9 positive cells after application in vivo.
  • Direct or indirect radioactive labels are possible. Examples include the direct labeling of the molecule SEQ ID NO: 2 with 188Re or the indirect labeling by sequential or simultaneous application of a tag-carrying fusion molecule SEQ ID NO: 2 -tag and a radioactively labeled anti-tag molecule.
  • tag is understood to mean a protein domain (short peptide sequence) which detects the detection of the protein, eg. B. with the help of antibodies and / or the purification of the protein z. B. with the help of Ni bond.
  • the preferred therapeutic use of the 188Re-labeled molecule SEQ ID NO: 2 is to achieve tumor reduction in vivo to eliminate metastases or to create the prerequisites for successful operative therapy.
  • a preferred accumulation of the 188Re-labeled molecule SEQ ID NO: 2 on the tumor results in an accumulation of the radiation on the tumor while at the same time reducing the haematopoietic toxicity, while when using other carrier molecules or using external radiation sources, there is often a pronounced toxicity for cells of the hematopoietic system (Iznaga-Escobar, Nucl. Med. Biol. 25, 441-447, 1998).
  • polypeptides according to the invention preferably of the molecule SEQ ID NO: 2
  • modified molecules with "designer" effector functions are produced, for example by conjugations to other polypeptides, by known processes (review by Neri et al., Engineering recombinant antibodies for immunotherapy, Cell. Biophys. 27: 47-61, 1995)
  • Sugar molecules, lipids or other synthetic or natural substances, chelators, or also the coupling with pharmacologically active substances for example Molecules with cytolytic activity (e.g. perforin) or pro-drug substances, proteins with signal functions (e.g.
  • cytokines examples 3
  • proteins with enzymatic activity e.g. metalloproteinase, endopeptidases.
  • Coupling with nucleic acids is also possible.
  • the polypeptide according to the invention in particular SEQ ID NO: 2, to achieve the accumulation of a desired substance at the site of CA19-9 expression, preferably at the site of the tumor, in vivo.
  • a further use is the coupling of the polypeptide according to the invention, in particular the molecule SEQ ID NO: 2, to binding domains of other molecules or Antibodies for the generation of bi- and multispecific hybrid molecules, eg bispecific antibodies.
  • a recombinant anti-CA19-9 / anti-CD3 (OKT3) bispecific scFv antibody may be mentioned for use in the immunotherapy of CA19-9 positive tumors.
  • the polypeptide according to the invention in particular the molecule SEQ ID NO: 2, can be fused with an intracellular signal chain and expressed in suitable host cells as a signal-transducing receptor molecule.
  • SEQ ID NO: 2 a binding of the CA19-9 antigen to SEQ ID NO: 2 triggered a biochemical signal on the fused heterologous signal peptide chain (Example 5).
  • Numerous signal chain combinations are available to the person skilled in the art, which cannot be mentioned comprehensively here.
  • polypeptides according to the invention are suitable for the localization and / or elimination of cells carrying CA 19-9 antigen.
  • the invention thus also relates to a method for activating cells carrying CA 19-9, comprising the administration of the (optionally derivatized or modified) polypeptide (1) to humans or animals.
  • Example 1 The single chain molecule SEQ ID NO: 2 has binding specificity for the CA19-9 antigen and binds to the CA19-9 antigen from CA19-9 positive tumor cells.
  • the molecule SEQ ID NO: 1 was generated using the phage display technique (McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990); Winter and Milstein, Nature 349: 293-299 (1991)) from the hybridoma 1116-NS-19-9 (ATCC HB- 8059), which expresses the 1116-NS-19-9 antibody specific for the CA19-9 antigen (Koprowski et al., Somatic Cell Genet. 5, 957-971, 1979).
  • PolyA + mRNA was obtained from the hybridoma cells by known methods (Sambrook et al., Molecular Clonig, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Poress, Cold Spring Harbor, NY, pp. 8.11 - 8.13, 1989) and with the aid of the reverse transcriptase and the "primed first-strand reaction mix" oligonucleotides (Pharmacia Biotech, Freiburg, Cat. No. 27-9400-01) were rewritten in cDNA.
  • the cDNA coding for the variable region of the heavy (VH) and light (V ⁇ _) immunoglobulin chain was determined with the help of immunoglobulin-specific oligonucleotides ("heavy primer 1", "heavy primer 2", "light primer mix", Pharmacia, Cat No.
  • scFv fragment is expressed in this phagemid as a fusion protein with the phage protein gp3 on the phage surface.
  • TG1 E. coli bacteria were transformed with the recombinant phagemid DNA and then infected with M13K07 helper phages.
  • the phages that can bind the CA19-9 antigen were selectively enriched.
  • the Recombinant scFv molecule (NS19-9-scFv) binding CA19-9 antigen has the DNA sequence shown in Fig. 1 and SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the phage antibody SEQ ID NO: 2-scFv-M13 is expressed on the surface of the phage as a fusion protein scFv-gp3 and specifically binds the CA19-9 antigen from CA19-9 positive tumor cells (FIG. 2).
  • the gp3 protein of the M13 phage has no binding specificity.
  • the binding of the SEQ ID NO: 2-scFv fragment is specific for the CA19-9 antigen, since the binding of the SEQ ID NO: 2-scFv to CA19-9 antigen by the monoclonal antibody NS19-9 (FIG. 3a) and by soluble CA19-9 antigen (Fig. 3b) is competed.
  • Example 2 The polypeptide SEQ ID NO: 2 retains the bundling specificity for the CA19-9 antigen even after fusion to the human immunoglobulin IgG1 CH 2 CH 3 domain.
  • the CA19-9 binding scFv molecule SEQ ID NO: 2 was linked to a second, independent protein domain while maintaining the binding specificity for the CA19-9 antigen to form a fusion protein.
  • the DNA SEQ ID NO: 1, which codes for the anti-CA19-9 scFv was ligated with the cDNA which codes for the human IgG1 CH 2 CH 3 domain.
  • the resulting cDNA, which codes for the scFv-CH 2 CH 3 fusion protein is inserted into the pRSV expression vector and, after transfection, is expressed in Ag8.653 cells.
  • the pRSV expression vector (Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-scFv-CH 2 CH 3 is isolated from the serum-free culture supernatant of transfected Ag8.653 cells with the aid of affinity chromatography by binding to agarose coupled to anti-human Fc antibodies.
  • the SEQ ID NO: 2 scFv domain has retained the binding specificity for the CA19-9 antigen in the fusion molecule.
  • the preserved bond specificity was determined by binding the SEQ ID NO: 2-scFv-CH 2 CH 3 fusion protein to CA19-9 antigen (FIG. 4a) and by competition for the binding by the monoclonal antibody NS19-9 (FIG. 4b) and soluble CA19- 9 antigen (Fig. 4c) detected.
  • the fusion molecule SEQ ID NO: 2-scFv CH 2 CH 3 binds specifically to CA19-9 positive tumor cells, but not to CA19-9 negative tumor cells (FIG. 5).
  • CA19-9 binding domain SEQ ID NO: 2 on the one hand has the same binding specificity for the CA19-9 antigen as the monoclonal NS19-9 antibody, but on the other hand maintains the binding specificity even if the SEQ ID NO: 2- scFv domain is part of a fusion protein with other functional domains.
  • Example 3 The fusion of the molecule SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 to human interleukin-2 (IL-2) generates a bifunctional protein with binding specificity for the CA19-9 antigen.
  • IL-2 human interleukin-2
  • a bifunctional fusion protein was generated by fusion of the molecule SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 (from Example 2) with interleukin-2 (IL-2), which expresses binding specificity for the CA19-9 antigen and at the same time the IL-2 protein wearing.
  • IL-2 interleukin-2
  • the DNA SEQ ID NO: 1-CH 2 CH 3 (from Example 2) was fused with the cDNA which codes for human IL-2 and inserted into the expression cassette of the expression vector pRSV.
  • the pRSV expression vector (Eshhar et al., Proc. Natl. Acad.
  • Sei USA 90: 720-714 (1993) is characterized by an RSV-LTR-controlled expression cassette with an immunoglobulin kappa light chain leader peptide, so that the ex - Primed fusion protein is secreted into the culture supernatant.
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 -IL-2 was extracted from the culture supernatant by affinity chromatography by binding to an anti-human Fc antibody which is CH 2 CH 3 - Domain binds, cleaned.
  • the fusion protein SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 -IL-2 is characterized by a pharmacologically active cytokine (IL-2), fused with the CA19-9 binding domain SEQ ID NO: 2, the binding specificity of the scFv for the CA19-9 antigen too has been preserved in this configuration of the fusion protein.
  • the binding of the fusion protein SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 -IL-2 to CA19-9 is documented in Fig. 6a, b.
  • Example 4 The molecule SEQ ID NO: 2 preserves the binding specificity for the CA19-9 antigen after denaturation and renaturation.
  • the soluble molecule SEQ ID NO: 2 (without phage fraction) is produced after transfection of the SEQ ID NO: 1 DNA in pCANTAB 5E vector in E. coli HB2151 bacteria and induction with IPTG and accumulates in the periplasm of the bacteria.
  • the SEQ ID NO: 2 protein is isolated from the periplasm of the bacteria by incubating the bacteria in 1/5 x (v / v) TES buffer (1 x TES: 200 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 500 mM sucrose, pH 8.0) for 30 min at 4 ° C and ammonium sulfate precipitation of the bacterial supernatant. The precipitate is renatured in PBS.
  • the renatured SEQ ID NO: 2 molecule was compared with the native SEQ ID NO: 2-gp3 phage molecule in terms of the specificity of binding to CA19-9 antigen. It was found that the SEQ ID NO: 2 molecule after denaturation and renaturation in the soluble form has the same binding specificity to the CA19-9 antigen as the SEQ ID NO: 2-gp3 phage body, the isolation of which does not require any denaturation and renaturation.
  • Example 5 The molecule SEQ ID NO: 2 as a domain is able to activate the fused signal domain through antigen binding.
  • a recombinant transmembrane molecule was generated whose extracellular domain is formed by the CA19-9 binding molecule SEQ ID NO: 2 and whose transmembrane and intracellular domain is formed by the ⁇ chain of the Fc ⁇ RI receptor.
  • This fusion molecule is intended for the specific cellular activation of immunocompetent cells (e.g. T cells) after contact with cells carrying CA19-9 antigen (e.g. tumor cells).
  • the DNA coding for SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 was inserted into the Snabl and BamHI site of the vector pRSV- ⁇ (Eshhar et al. Proc. Natl. Acad. Sei.
  • Receptor-bearing MD45 cells were tested for their ability to be specifically activated after contact with CA19-9 positive tumor cells.
  • receptor-bearing MD45 cells and, as a control, non-transfected MD45 cells (10 5 cells each) were co-cultivated in parallel batches with CA19-9 + H498 tumor cells and with CA19-9-H716 tumor cells (10 5 cells each). After 48 hours, the amount of IL-2 secreted in the culture supernatant was determined as a measure of the cellular activation. It was found that MD45 cells carrying SEQ ID NO: 2-CH 2 CH 3 - ⁇ receptor are activated by coculture with CA19-9-positive H498 tumor cells, but not by CA19-9-negative H716 tumor cells.
  • Non-transfected MD45 cells are not activated by either H498 or H716 cells. Furthermore, this result shows that the CA19-9 binding extracellular domain SEQ ID NO: 2, after binding of the cell-bound CA19-9 antigen, transmits a signal to the fused intracellular ⁇ signal chain, which in turn initiates cellular activation.
  • Example 6 The molecule SEQ ID NO: 2 accumulates in vivo on cells with CA19-9 expression.
  • the soluble protein SEQ UD NO: 2 (from Example 1) was radioactively labeled with 125 J using the Bolton-Hunter reagent and purified from unbound 125 J.
  • the binding specificity of the 125 J-SEQ ID NO: 2 molecule in vitro is the same as that of the unlabelled SEQ ID NO: 2 molecule.
  • CA19-9 positive H498 cells and, as a control, CA19-9-H716 cells were injected subcutaneously into nude mice (nu / nu) to generate tumors (approx. 10 6 cells per injection and animal). After 5 - 8 days, a subcutaneous tumor with a diameter of 2 - 4 mm developed.
  • 125 J-SEQ ID NO: 2 was administered intravenously into tumor-bearing mice (5 ⁇ g protein / mouse). After 24 hours, the distribution of radioactivity in the mouse was determined by whole body autoradiography. The radioactivity was found to be accumulated on the H498 cell tumor (CA19-9 +), but not on the H716 cell tumor (CA19-9-). The organs of the mice show low radioactivity in the same distribution in the H498 tumor as in the H716 tumor-bearing mouse.

Abstract

Die Erfindung betrifft Polypeptide, die Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen aufweisen, deren Herstellung und Verwendung zur Detektion und Elimination CA19-9 Antigen positiver Zellen, d. h. zur Tumordiagnostik und -therapie. Die Erfindung betrifft weiterhin radiomarkierte Derivate dieser Polypeptide, deren Herstellung sowie deren Verwendung in Radioimmunoassays, Radioscintigraphie und Radioimmunotherapie sowie Kopplungsprodukte dieser Polypeptide mit Indikatorsubstanzen oder pharmakologisch wirksamen Substanzen.

Description

Polypeptide zur Detektion und Elimination CA19-9 Antigen positiver Zellen
Die Erfindung betrifft Polypeptide, die Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen aufweisen, deren Herstellung und Verwendung zur Detektion und Elimination CA19- 9 Antigen positiver Zellen, d. h. zur Tumordiagnostik und -therapie. Die Erfindung betrifft weiterhin radiomarkierte Derivate dieser Polypeptide, deren Herstellung sowie deren Verwendung in Radioimmunoassays, Radioscintigraphie und Radioimmunotherapie sowie Koppiungsprodukte dieser Polypeptide mit Indikatorsubstanzen oder pharmakologisch wirksamen Substanzen.
Magen- und Pankreas-Carcinome haben eine Inzidenz von 24.000 bzw. 28.000 in USA mit einer jährlichen Todesrate beim Pankreas-Carcinom von annähernd 28.000, beim Magen-Carcinom von 14.000. Für Europa gelten ähnliche Zahlen. Die mittlere Überlebenszeit nach Diagnosestellung eines Pankreas-Carcinoms liegt bei ca. 6 Monaten. Diese infauste Prognose ist insbesondere dadurch bedingt, daß sich die meisten Pankreas-Tumore bei Diagnosestellung in einem nicht mehr operablen Stadium befinden, so daß ein therapeutischer Ansatz ohne Einfluß auf den Krankheitsverlauf bleibt. Diese Situation verdeutlicht zwei gravierende Mängel, die eine erfolgreiche Therapie in der überwiegenden Mehrzahl verhindern: (1) effektive Verfahren, den Tumor in vivo frühzeitig aufspüren, und (2) Verfahren, bei fortgeschrittenem Tumor-Stadien eine ausreichende Tumorregression zu erzeugen, die ein operatives Vorgehen ermöglicht.
Anstrengungen zur Verbesserung dieser Situation werden durch das Fehlen eines Reagenz erschwert, das in bildgebenden Verfahren in vivo zum Nachweis und zur Lokalisation von Primärtumor und Metastasen eingesetzt werden kann. Ein therapeutischer Ansatz wird weiterhin dadruch erschwert, daß ein Reagenz zum spezifi- sehen in vivo drug-targeting des Pankreas- und Magen-Carcinoms nicht zur Verfügung steht.
Das CA19-9 Antigen ist ein Monosialogangliosid, das in der immunhistochemischen Analyse mit Hilfe des Antikörpers 1116-NS-19-9 (Maus lgG1) bei zahlreichen Magen- und Pankreas-Carcinomen detektiert wird (Koprowski et al., Somatic Cell Genet. 5, 957-971 , 1979; Koprowski et al., U.S. Pat. 4,471 ,057; Hybridomklon ATCC HB-8059).
Obwohl der Antikörper seit über 20 Jahren bekannnt und verfügbar ist und in der in vitro Diagnostik erfolgreich verwendet wird, sind Versuche, den Antikörper 1116-NS- 19-9 für die in vivo Diagnostik einsetzbar zu machen, bisher mit begrenztem Erfolg geblieben. Es zeigte sich, daß die Gewebspenetration des Antikörpers bei soliden Tumoren zu gering ist, um Tumore zuverlässig in vivo zu detektieren (Kazumoto et al., Ann. Nucl. Med. 7, 39 - 44, 1993). Ein Einsatz des Antikörpers konnte deswegen bisher nicht empfohlen werden (Allum, Baillieres Clin. Gastroenterol. 4, 853 - 867, 1990). Um die Gewebemarkierung durch den Antikörper zu verbessern, wurde vorgeschlagen, cobra-venom-factor (CVF) Konjugate des CA19-9 Antikörpers zur Vorbehandlung einzusetzen (Juhl et al., Cancer Res. 55(23suppl), 5749s-5755s, 1995). Jedoch konnte lediglich eine zweifache Verbesserung der Tumormarkierung durch den Antikörper erzielt werden. Die Verwendung eines anti-CA19-9 F(ab')2 Antikörpers führte nur in 1 von 7 Patienten zur zuverlässigen Detektion des primären Tumors in vivo (Naruki et al., Ann. Nucl. Med. 8, 163-169, 1994).
Die mehrfache Applikation des anti-CA19-9 Antikörpers für in vivo Zwecke ist begrenzt. Da es sich bei dem Antikörper 1116-NS-19-9 (ATCC HB-8059) um einen Maus-Antikörper handelt, sind "HAMA" Immunreaktionen ("human anti-mouse anti- bodies") bei wiederholten Applikationen zu erwarten. Weitere Versuche, den Antikörper durch Modifikationen für einen diagnostischen oder therapeutischen in-vivo- Einsatz verwendbar zu machen, sind bisher erfolglos geblieben. Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, Reagentien zum Nachweis (in vivo targe- ting) des Magen- und Pankreas-Carcinoms zur Verfügung zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein spezielles Fragment eines Antikörpers gegen das CA19-9 Antigen, nämlich ein rekombinantes, antikörperähnliches Molekül, das die variable Region der schweren Kette (VH) und der leichten Kette (VL) eines anti-CA19-9 Antikörpers umfaßt (d. h. ein sogenanntes "Single chain fragment of variable regions", scFv), mehrere überraschend vorteilhafte Eigenschaften vereint, die zusammen einen in vivo Einsatz ermöglichen.
Gegenstand der Erfindung ist somit
(1) ein Polypeptid, umfassend die Oligopeptide
(A) bestehend aus der variablen Region der schweren Kette (VH) eines anti-CA19-9- Antikörpers oder eines Fragments desselben mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen und
(B) bestehend aus der variablen Region der leichten Kette (VL) eines anti-CA19-9- Antikörpers oder eines Fragments desselben mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen, wobei die Oligopeptide (A) und (B) direkt oder durch ein Brückenpeptid (C) miteinander verknüpft sind;
(2) eine DNA, kodierend für das in (1 ) definierte Polypeptid;
(3) ein Vektor, enthaltend die in (2) definierte DNA;
(4) ein Wirtsorganismus der mit dem in (3) definierten Vektor transformiert ist;
(5) ein Verfahren zur Herstellung des in (1) definierten Polypeptids, umfassend das Kultivieren des transformierten Wirtsorganismus, wie in (4) definiert;
(6) die Verwendung des in (1) definierten Polypeptids zur Herstellung von Arzneimittel und Diagnostika, die zum Nachweis, zur Lokalisierung und/oder zur Eliminierung von CA19-9 Antigen tragenden Zellen, insbesondere Tumorzellen geeignet sind;
(7) ein Radiomarkiertes Polypeptid, wobei das Polypeptid wie in (1 ) definiert ist; (8) ein Verfahren zur Herstellung des in (7) definierten radiomarkierten Polypeptids, umfassend das Umsetzen des in (1) definierten Polypeptids mit dem Radioisotop;
(9) die Verwendung des in (7) definierten radiomarkierten Polypeptids zur Herstellung von Arzneimittel und Diagnostika, insbesondere für die Herstellung von Arzneimitteln für die Tumortherapie und für die Herstellung von Mitteln, die für bildgebenden diagnostischen in vitro und in vivo Verfahren geeignet sind; und
(10) Arzneimittel oder Diagnostika, umfassend das in (1 ) definierte Polypeptid und/oder das in (7) definierte radiomarkierte Polypeptid.
Fiqurenbeschreibunq
Fig. 1 zeigt die DNA- und die Aminosäure-Sequenz (frame: one-letter-code) des CA19-9-bindenden Polypeptids. Die VH- und VL-Regionen und das Brückenpeptid sind gekennzeichnet. Das integrierte Peptid (DNA bp 341-433) ist ein bevorzugtes Brückenpeptid und kann durch andere Brückenpeptide ersetzt werden.
Fig. 2: Bindung des Phagenantikörpers SEQ ID NO:2-scFv an indirekt immobilisiertes CA19-9 Antigen aus Tumorzellen
Zur indirekten Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit dem monoklonalen Antikörper NS19-9 (2 μg/ml) beschichtet und anschließend mit Lysaten der CA19-9-positiven Tumorzellinie SW948 (■) oder der CA19-9-negativen Tumorzellinie H716 (D) inkubiert. Verdünnungen des SEQ ID NO:2-scFv-M13-Pha- genantikörpers wurden auf die Antigen-beschichtete Platte überführt und gebundene Phagenantikörper mit Hilfe eines Peroxidase-gekoppelten anti-M13 Antikörpers und Indikatorfarbreaktion photometrisch bei O.D. 405 nm nachgewiesen.
Fig. 3 a: Kompetition der Bindung des Phagenantikörpers SEQ ID NO:2-scFv-M13 an indirekt immobilisiertes CA19-9 Antigen durch den monoklonalen Antikörper
NS19-9
Zur indirekten Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit anti-CA19-9 Antikörper NS19-9 beschichtet (2 μg/ml NS19-9 mAk) und anschließend mit 100 μl Überstand der CA19-9 sezernierenden Tumorzellen H498 inkubiert. Die Inkubation des SEQ ID NO:2-scFv-M13 Phagenantikörpers erfolgte in Gegenwart verschiedener Verdünnungen des monoklonalen anti-CA19-9 Antikörpers NS19-9 (■) oder eines Antikörpers gleichen Isotyps (IgG) mit irrelevanter Spezifität (D) (max. Konzentration 10 μg/ml). Die photometrische Detektion (O.D. 405 nm) des gebundenen Phagenantikörpers SEQ ID NO:2-scFv-M13 erfolgte mit Hilfe eines Peroxidase- gekoppelten anti-M13 Antikörpers und Farbindikatorreaktion.
Fig. 3b: Kompetition der Bindung des Phagenantikörpers SEQ ID NO:2-scFv-M13 an indirekt immobilisiertes CA19-9 Antigen durch lösliches CA19-9 Antigen CA19-9 Antigen aus dem Kulturüberstand der CA19-9 positiven Tumorlinie H489 wurde auf NS19-9 Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten immobilisiert (2 μg/ml NS19-9 Antikörper, 100 μl H498-Überstand). Die Inkubation des SEQ ID NO:2-scFv- M13 Antikörpers erfolgte in Gegenwart von Verdünnungen des CA19-9-haltigen Kulturüberstandes der CA19-9-positiven Tumorzellinie H498 (s) oder der CA19-9- negativen Tumorzellinie HRS4 (Δ). Die photometrische Detektion (O.D. 405 nm) des gebundenen Phagenantikörpers SEQ ID NO:2-scFv-M13 erfolgt mit Hilfe eines Per- oxidase gekoppelten anti-M13 Antikörpers und Farbindikatorreaktion.
Fig. 4a: Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-scFv-CH2CH3 an immobilisiertes CA19-9 Antigen
Zur indirekten Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit dem monoklonalen Antikörper NS19-9 (2 μg/ml) beschichtet und anschließend mit CA19-9 Antigen-haltigem Kulturmedium der CA19-9 positiven Tumorzellinie H498 (■) oder mit dem Kulturüberstand der CA19-9 negativen Tumorlinie HL60 (D) inkubiert. Das Fusionsprotein SEQ ID NO:2-scFv-CH2CH3 wurde in Verdünnungen auf die Antigen-beschichtete Platte gegeben und das gebundene Fusionsprotein anschließend mit Hilfe eines Biotin-gekoppelten anti-human IgG(Fc) Antikörpers, der gegen die CH2CH3 Domäne des Fusionsproteins gerichtet ist, und einer Streptavi- din-gekoppelten Peroxidase und Farbindikatorreaktion photometrisch detektiert (O.D. 405 nm). Die Daten sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchsansätzen.
Fig. 4b: Kompetition der Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-scFv-CH2CH3 an immobilisiertes CA19-9 Antigen durch den monoklonalen Antikörper NS19-9 Zur Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit dem anti- CA19-9 monoklonalen Antikörper NS19-9 beschichtet (2 μg/ml NS19-9 Antikörper) und anschließend mit CA19-9 Antigen aus H498 Zellkulturüberstand inkubiert. Die Inkubation des SEQ ID NO:2-scFv-CH2CH3 Fusionsproteins erfolgte in Gegenwart von Verdünnungen des monoklonalen Antikörpers NS19-9 (■) oder eines Kontrol- Antikörpers gleichen Isotyps (lgG1) mit irrelevanter Spezifität (D). Die photometrische Detektion (O.D. 405 nm) des gebundenen Fusionsproteins SEQ ID NO:2-scFv- CH2CH3 erfolgte mit Hilfe eines Biotin-gekoppelten anti-human IgG(Fc) Antikörpers und einer Streptavidin-gekoppelten Peroxidase. Die Daten sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchsansätzen.
Fig. 4c: Kompetition der Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-scFv-CH2CH3 an immobilisiertes CA19-9 Antigen durch lösliches CA19-9 Antigen Zur Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit dem anti- CA19-9 Antikörper NS19-9 beschichtet (2 μg/ml NS19-9 Antikörper) und anschließend mit CA19-9 Antigen aus H498 Zellkulturüberstand inkubiert. Auf dem indirekt immobilisierten CA19-9 Antigen wurde das Fusionsprotein SEQ ID NO:2-scFv- CH2CH3 in Gegenwart von Verdünnungen des Kulturmediums der CA19-9 positiven Tumorzellinie H498 (•), die große Mengen CA19-9 Antigen sezerniert, oder des Kulturüberstandes der CA19-9-negativen Tumorlinie HL60 (o) inkubiert. Die photometrische Detektion (O.D. 405 nm) des gebundenen Fusionsproteins SEQ ID NO:2- scFv-CH2CH3 erfolgte mit Hilfe eines Biotin-gekoppelten anti-human IgG(Fc) Antikörpers und einer Streptavidin-gekoppelten Peroxidase. Die Ergebnisse sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchsansätzen. Fig. 5: FACS-Analyse der Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-CH2CH3 auf CA19-9-positiven Tumorzellen
Zellen der CA19-9-positiven Tumorzellinie LoVo5176 sowie der CA19-9-negativen Tumorzellinie H716 wurden mit dem monoklonalen Antikörper NS19-9 (A) und dem Fusionsprotein SEQ ID NO:2-CH2CH3 (B) inkubiert (durchgezogene Linien). Als Kontrollen diente der monoklonale Antikörper HRS3 (mit Spezifität für das CD30 Antigen) bzw. das Fusionsprotein HRS3-scFv-CH2CH3 (gepunktete Linien). Die Detektion gebundener Fusionsproteine erfolgte mit einem FITC-gekoppelten anti-murin IgG(Fc) Antikörper (A) bzw. einem anti-human IgG(Fc) Antikörper (B) und der Durchflußzytometrie (FACS).
Fig. 6a, b: Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-CH2CH3-IL2 an immobilisiertes CA19-9 Antigen
Zur Immobilisierung des CA19-9 Antigens wurde eine Mikrotiterplatte mit dem monoklonalen Antikörper NS19-9 (2 μg/ml) beschichtet und anschließend mit CA19- 9 Antigen-haltigem Kulturüberstand der CA19-9 positiven Tumorzellinie H498 («,s) oder mit dem Kulturüberstand der CA19-9-negativen Tumorlinie H716 (D, Δ) inkubiert. Das Fusionsprotein SEQ ID NO:2-CH2CH3-IL2 wurde in den angegebenen Verdünnungen auf immobilisiertem CA19-9 Antigen inkubiert. Gebundenes Fusionsprotein wurde (a) mit Hilfe eines Biotin-gekoppelten anti-human IgG(Fc) Antikörpers, der die CH2CH3 Domäne des Fusionsproteins bindet, oder (b) mit Hilfe eines Biotin- gekoppelten anti-human IL2 Antikörpers und anschließender Farbindikatorreaktion photometrisch detektiert (O.D. 405 nm).
Das vorstehend unter (1 ) definierte Polypeptid wird nachfolgend näher beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die beiden Oligopeptide vorzugsweise von gleichen Antikörpern. Andererseits ist es bevorzugt, daß eines oder beide Oligopeptide von dem Antikörper 1116-NS-19-9 stammen. Die Hybridomzellen, die diese Antikörper produzieren, können von der American Type Culture Collection, Rockville; MD, unter der Bezugsnummer ATCC HB-8059 erworben werden kann. Bei der Verknüpfung der Oligopeptide (A) und (B) kann sowohl das Oligopeptid (A) als auch das Oligopeptid (B) das N-terminale Bestandteil des erfindungsgemäßen Polypeptids sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligopeptide (A) und (B) über ein Brückenpeptid (C) (nachfolgend auch "Linker" oder Linkerpeptid" genannt) miteinander verknüpft.
Als Brückenpeptid (C) können alle Peptide eingesetzt werden, die eine Faltung und Anordnung der Oligopeptide (A) und (B) zueinander erlauben, daß eine effiziente Antigenbindung gewährleistet ist. Bevorzugte Brückenpeptide bestehen aus einem kurzem, flexiblen Oligopeptid mit 5 bis 50, insbesondere mit 20 bis 50 Aminosäureresten. Besonders bevorzugt sind Ser und Gly (SG)-reiche Brückenpeptide, die z. B. bis 10 Aminosäurereste lagern. Diese SG-reichen Brückenpeptide sind vorzugsweise modular aufgebaut und umfassen SG-reiche Elemente, z. T. durch Pro getrennt. Die SG-reichen Elemente sind zwischen 2 und 20 Aminosäuren lang. Es reicht dabei ein SG-Element aus, um die o. g. Funktionen zu erfüllen. Ein Prolinrest in der Mitte des Brückenpeptids dient der Erzeugung eines Winkels in der Polypeptid kette. An der Stelle des Prolins können auch andere Aminosäuren wie z. B. Gly, Ser, Asp und Asn verwendet werden.
Diese Brückenpeptide weisen vorzugsweise die folgende Struktur
-A-(GlymSern)x-B-C-D-(Gly0Serp)y-E und insbesondere die Struktur -(GlyrnSern)x-Pro-(Gly0Serp)y-
auf, wobei
A, B, D, E unabhängig voneinander eine Bindung, ein Aminosäurerest oder ein Polypeptid mit bis zu 5 Aminosäureresten sind,
C ausgewählt ist aus Pro, Gly, Ser, Asp und Asn und insbesondere Pro ist, n, m, o und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 10 sind und x und y unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 5 sind. Ein besonders bevorzugtes Brückenpeptid (C) ist in SEQ ID NO:3 gezeigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das erfindungsgemäße Polypeptid (1 ) die Aminosequenz des SEQ ID NO:2 auf, das aus VH und VL des 1116-NS-19-9 Antikörpers in der Anordnung VH-Linkerpeptid-VL besteht.
Zur Generierung eines scFv Moleküls stehen dem Fachmann mehrere Verfahren zur Verfügung, deren Gemeinsamkeit darin besteht, ausgehend von einem Antikörper produzierenden Hybridom oder einer geeigneten rekombinanten Bibliothek, die cDNA kodierend für die variable Region der schweren Immunglobulin-Kette (VH) und die cDNA für die der leichten Kette (VL) so zu rekombinieren, daß die rekombinante DNA für eine scFv Polypetid-Kette in der Anordnung VH-Iinker-VL oder VL-Iinker-VH kodiert. Diese DNA kann dann in einen geeigneten Wirtsorganismus/Zellsystem ex- primiert werden. Geeignete Systeme im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bakterielle Expressionssysteme, z. B. E. coli HB2151 unter Verwendung des Vektors pCANBAB 5E oder eurkaryonte Expressionssysteme , z. B. 293T Zellen unter Verwendung des Vektors pRSV (mit Ig kappa-Leader-Peptid).
Es zeigte sich überraschenderweise, daß das erfindungsgemäße Polypeptid, hier exemplarisch für das scFv Molekül SEQ ID NO:2 gezeigt, die Spezifität des paren- talen Antikörpers 1116-NS-19-9 für das CA19-9 Antigen bewahrt hat. Das Molekül SEQ ID NO:2 bindet spezifisch an CA19-9 Antigen (Beispiel 1 ), an CA19-9 Antigen- tragende Zellen (Beispiel 2, Fig. 5), jedoch nicht an andere getestete Karbohydrat- Antigene und CA19-9 Antigen-negative Zellen (Beispiel 1 ).
Weiterhin zeigte sich überraschenderweise, daß die Spezifität des anti-CA19-9 scFv auch dann erhalten bleibt, wenn eine weitere Polypeptidkette an das SEQ ID NO:2 Polypeptid gekoppelt wurde. Exemplarisch ist die Kopplung der humanen lgG1 Im- munglobulin CH2CH3 Domänen an die scFv Domäne in Beispiel 2 gezeigt. Entgegen der häufigen Beobachtung, daß Moleküle der Konstruktion VH-Iinker-VL oder VL-Iinker-VH in wässrigen Lösungen schlecht löslich sind und zur Präzipitation neigen, zeigt das Molekül SEQ ID NO:2 eine sehr gute Löslichkeit. Weiterhin zeichnet sich das Molekül SEQ ID NO:2 nach Denaturierung durch eine sehr effiziente Renaturierung in eine bindungsaktive Konfiguration aus (Beispiel 4).
Weiterhin zeigt das Molekül SEQ ID NO:2 eine unerwartet gute Gewebspenetration und Akkumulation an CA19-9 positive Zellen, bevorzugt Tumorzellen in vivo. Dieses zeigt sich beispielsweise nach intravenöser Applikation des markierten Moleküls SEQ ID NO:1 in Mäuse, die experimentell erzeugte CA19-9 positive Tumore tragen (Beispiel 6). Eine Akkumulation an gesundem Gewebe erfolgt jedoch nicht. Bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Moleküls ist die Detektion und Lokalisierung von CA19-9 positiven Zellen in vivo, insbesondere Tumore, beispielsweise Magen- und Pankreas-Carcinom, in der bildgebenden Diagnostik.
Weiterhin zeigte sich, daß das Molekül SEQ ID NO:2 nach Bindung an die Antigen- tragende Zelle nicht intemalisiert wird. Diese Eigenschaft ist um so überraschender, da in der überwiegenden Mehrzahl der Rezeptor-Ligand Systeme die gebundenen Liganden intemalisiert werden. Dieses gilt um so mehr für Antikörper, die an ein Molekül der äußeren Zellmembran binden. Die fehlende Intemalisierung des Moleküls SEQ ID NO:2 gewährleistet außerdem eine lange Verweildauer auf der Zelloberfläche ohne Degradation durch zytoplasmatische Proteasen. Diese Eigenschaft erweist sich besonders vorteilhaft in der Verwendung des SEQ ID NO:2 Moleküls für das drug targeting, pro-drug activation, radioaktive /π- Vo-Markierung und anderen Verfahren, in denen das Molekül zum targeting verwendet wird.
Das Molekül SEQ ID NO:2 ist frei von konstanten Anteilen der Maus-Immunglobuli- ne, so daß keine ausgeprägte HAMA-Immunreaktion bei wiederholten Applikationen des Moleküls zu erwarten ist. Diese Eigenschaft ermöglicht, im Gegensatz zu den bisher vorhandenen anti-CA19-9 Antikörpern, die Verwendung des SEQ ID NO:2 Moleküls bei /ti-wVo-Verfahren in der Diagnostik und Therapie.
Nach Kopplung des Moleküls SEQ ID NO:2 mit den humanen CH2CH3 Immunglo- bulin-Domänen zeigte sich weiterhin, daß nach Bindung an CA19-9 positive Tumorzellen eine spezifische Tumor-Lyse durch natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen) und Complement vermittelt wird. Gesundes Gewebe oder Tumore, die dieses Antigen nicht tragen, werden nicht lysiert. Eine bevorzugte Verwendung des Moleküls SEQ ID NO:2 nach Kopplung mit Ig CH2CH3, CH2 oder CH3 Domänen ist die Elimination von CA19-9 positiven Tumorzellen in vivo und in vitro.
Bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung des anti-CA19-9 scFv Moleküls an eine weitere Vielzahl von Molekülen entsprechend der gewünschten Verwendung. Folgende Modifikationen des erfindungsgemäßen Polypeptids und ihre Verwendungen sollen hier nur beispielhaft genannt werden.
1. Markierung des Polypeptids und insbesondere des Moleküls SEQ ID NO:2 mit Radioisotopen, z.B. 125J, 131J, 99mTc, 188Re, 186Re, 32P, für die Verwendung in vitro und in vivo, z.B. im Radioimmunassay oder in der Radioimmunscintigraphie und Radioimmuntherapie. Etablierte Verfahren zur radioaktiven Markierung des Moleküls umfassen die Einführung von Metall-Chelat Gruppen, Peptidsequenzen, die eine radioaktive Markierung erleichtern, C- oder N-terminales Cystein, oder Metallothionin (Dean et al., Technetium and Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine, Raven Press, New York, pp 605-608,1990; Liberatore et al., Europ. J. Nucl. Med. 22: 1326- 1329, 1995; Ram u. Buchsbbaum, Cancer 73(suppl3), 769-773, 1994; Zhao et al., Biocnjug. Chem. 10, 424-430, 1999). Beispielhaft sei weiterhin genannt die Kopplung des Moleküls mit Calmodulin und die Beladung mit Calmodulin-bindenden, radioaktiv markierten Molekülen zum Einsatz in der Mehrschritt-Immunscintigraphie (VanEldik und Lukas, Methods Enzymol. 139, 393 - 4055, 1987; Török und Trent- ham, Biochemistry 33, 12807 - 12820, 1994). Jedoch erfordern zahlreiche Markie- rungsreaktionen stark reduzierende Reaktionsbedingungen, z.B. bei Markierung mit 186Re, was häufig zur Denaturierung des Antikörpers führt und eine Verwendung des Antikörpers in der Immunscintigraphie oder Radioimmuntherapie unmöglich macht.
Die unerwartet hohe Stabilität der erfindungsgemäßen Moleküle, insbesondere SEQ ID NO:2, gegenüber denaturierenden Reaktionsbedingungen sowie die ungewöhnlich gute Renaturierung nach Denaturierung ermöglicht den Einsatz von Markierungsreaktionen ohne Verlust der Bindungsspezifität. Zur Reinigung bindungsaktiver renaturierter Molekül erweist sich eine Affinitätschromatographie vorteilhaft durch Bindung an das CA19-9 Antigen oder, bei einem Fusionsmolekül bestehend aus SEQ ID NO:2 und einer Detektionsdomäne, beispielhaft der humanen lgG1 CH2CH3 Domäne, durch Bindung an Domänen-spezifische Antikörper.
Nach in vivo Applikation akkumuliert das erfindungsgemäße Polypeptid, so z. B. das Molekül SEQ ID NO:2 am Ort des CA19-9 positiven Tumors und seiner Metastasen. Bei Verwendung eines radioaktiv markierten Moleküls können mit Hilfe scintigraphi- scher Verfahren die Tumore in vivo lokalisiert werden. Bei der in vivo Detektion im Sinne der vorliegenden Erfindung wird das z. B. mit einem Radioisotop markierte Polypeptid dem Patienten verabreicht und die Bindung an das CA19-9 tragende Gewebe von außerhalb des Körpers detektiert. Auch können andere indirekte oder direkte Verfahren zur Immunscintigraphie eingesetzt werden für den Nachweis von CA19-9 positiven Tumoren in vivo, wobei die erfindungsgemäßen Moleküle, bevorzugt SEQ ID NO:2, die spezifische Bindung an den Tumorzellen vermittelt.
Eine weitere Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids ist die strahlentherapeutische Elimination von CA19-9 positiven Zellen nach Applikation in vivo. Dabei sind direkte oder indirekte radioaktive Markierungen möglich. Beispielhaft sei die direkte Markierung des Moleküls SEQ ID NO:2 mit 188Re oder die indirekte Markierung durch sequentielle oder simultane Applikation eines tag-tragenden Fusionsmoleküls SEQ ID NO:2 -tag und eines radioaktiv markierten anti-tag Moleküls genannt. Unter "tag" wird in diesem Zusammenhang eine Proteindomäne (kurze Peptidse- quenz) verstanden, die den Nachweis des Proteins z. B. mit Hilfe von Antikörpern und/oder die Reinigung des Proteins z. B. mit Hilfe von Ni-Bindung erleichtert. Bevorzugte therapeutische Verwendung des 188Re-markierten Moleküls SEQ ID NO:2 ist die Erzielung einer Tumorreduktion in vivo zur Elimination von Metastasen oder zur Schaffung der Vorraussetzungen für eine erfolgreiche operative Therapie. Durch eine bevorzugte Akkumulation des 188Re-markierten Moleküls SEQ ID NO:2 am Tumor wird eine Akkumulation der Strahlung am Tumor bei gleichzeitiger Minderung der hämatopoietischen Toxizität erzielt, während bei der Verwendung anderer Trägermoleküle oder der Verwendung von externen Strahlenquellen ist häufig eine ausgeprägte Toxizität für Zellen des blutbildenden Systems zu finden (Iznaga- Escobar, Nucl. Med. Biol. 25, 441-447, 1998).
2. Eine weitere Verwendung der erfϊndungsgemäßen Polypeptide, bevorzugt des Moleküls SEQ ID NO:2, liegt in der Herstellung von modifizierten Molekülen mit "Designer" Effektor Funktionen. Beispielsweise können nach bekannten Verfahren (Übersicht bei Neri et al., Engineering recombinant antibodies for immunotherapy, Cell. Biophys. 27:47-61 ,1995) verschiedene chimäre, stöchiometrisch definierte Fusions-Moleküle hergestellt werden, beispielhaft durch Konjugationen an andere Polypeptide, an Zuckermoleküle, Lipide oder andere synthetische oder natürliche Substanzen, Chelatoren, oder auch die Kopplung mit pharmakologisch wirksamen Substanzen, z.B. Molekülen mit zytolytischer Aktivität (z.B. Perforin) oder pro-drug Substanzen, Proteine mit Signalfunktionen (z.B. Zytokine) (Beispiel 3), Proteinen mit en- zymatischer Aktivität (z.B. Metalloproteinase, Endopeptidasen). Auch ist eine Kopplung mit Nukleinsäuren möglich. Gemeinsam ist diesen Ausführungsformen die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids, insbesondere des SEQ ID NO:2, zur Erzielung der Akkumulation einer gewünschten Substanz am Ort der CA19-9 Expression, bevorzugt am Ort des Tumors, in vivo.
3. Eine weitere Verwendung ist die Kopplung des erfindungsgemäßen Polypeptids, insbesondere des Moleküls SEQ ID NO:2, an Bindedomänen anderer Moleküle oder Antikörper zur Generierung bi- und multispezifischer Hybridmoleküle, z.B. bispezifische Antikörper. Beispielhaft sei ein rekombinanter anti-CA19-9/anti-CD3 (OKT3) bispezifischer scFv Antikörper genannt zum Einsatz in der Immuntherapie CA19-9 positiver Tumore.
4. In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Polypeptid, insbesondere das Molekül SEQ ID NO:2, mit einer intrazellulären Signalkette fusioniert und in geeigneten Wirtszellen als Signal-transduzierendes Rezeptormolekül expri- miert werden. Überraschend zeigte sich dabei, daß ein durch Bindung des CA19-9 Antigens an SEQ ID NO:2 ein biochemisches Signal auf der fusionierten heterologen Signalpeptidkette ausgelöst wird (Beispiel 5). Dem Fachmann stehen zahlreiche Signalketten-Kombinationen offen, die hier nicht umfassend genannt werden können.
Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide zur Lokalisierung und/oder Eliminierung von CA 19-9 Antigen tragenden Zellen geeignet ist. Die Erfindung betrifft somit ebenfalls ein Verfahren zur Aktivierung CA 19-9 tragender Zellen, umfassend die Verabreichung des (gegebenenfalls derivatisierten oder modifizierten) Polypeptids (1 ) an Mensch oder Tier.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 : Das Einzelkettenmolekül SEQ ID NO:2 hat Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen und bindet an das CA19-9 Antigen aus CA19-9 positiven Tumorzellen.
Die Generierung des Moleküls SEQ ID NO:1 erfolgte mit Hilfe der Phage-Display- Technik (McCafferty et al., Nature 348: 552 - 554 (1990); Winter und Milstein, Nature 349: 293 - 299 (1991)), ausgehend von dem Hybridom 1116-NS-19-9 (ATCC HB- 8059), der den 1116-NS-19-9 Antikörper mit Spezifität für das CA19-9 Antigen ex- primiert (Koprowski et al., Somatic Cell Genet. 5, 957 - 971 , 1979).
Aus den Hybridom-Zellen wurde polyA+ mRNS nach bekannten Verfahren gewonnen (Sambrook et al., Molecular Clonig, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Poress, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 8.11 - 8.13, 1989) und mit Hilfe der reversen Transkriptase und der "primed first-strand reaction mix" Oligonukleotide (Pharmacia Biotech, Freiburg, Cat. No. 27-9400-01) in cDNS umgeschrieben. Die cDNS, kodierend für die variable Region der schweren (VH) und leichten (Vι_) Immunglobulin Kette, wurde mit Hilfe Immunglobulin-spezifischer Oligonukleotide ("heavy primer 1", "heavy primer 2", "light primer mix", Pharmacia, Cat.Nr. 27-1583-01 , 27-1586-01) in einer PCR Reaktion amplifiziert. In einer zweiten PCR-Reaktion wurde die VH- (ca. 340 bp) und V|_- cDNS (ca. 325 bp) mit Hilfe einer Verbindungssequenz, kodierend für ein (Gly4Ser)3-Peptid (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879 - 5883, 1988) und der "linker-primer-mix" (Pharmacia, Cat.Nr. 27-1588-01) in einer PCR-Reaktion zu einem Molekül verbunden. Das VH-Hnker-VL Fragment (scFv) (ca. 750 bp) wurde reamplifiziert, wobei Oligonukleotide ("RS-primer-mix", Pharmacia, Cat.No. 27-1589-01) benutzt wurden, welche die Enden der PCR Produkte mit flankierenden Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Sfi I (5' VH-Ende) und Not I (3' VL- Ende) ausstatten. Nach Spaltung dieser Restriktionsstellen erlauben die so generierten DNS-Enden eine gerichtete Integration in die Sfi I/Not I linearisierte pCANTAB 5E Phagemid DNS (Pharmacia, Cat.Nr. 29-9401-01). Das scFv-Fragment wird in diesem Phagemid als Fusionsprotein mit dem Phagen Protein gp3 auf der Phagenoberfläche exprimiert.
Zur Produktion der M13 Phagen mit dem CA19-9-bindenden scFv Molekül SEQ ID NO:2 wurden TG1 E.coli Bakterien mit der rekombinanten Phagemid-DNS transformiert und anschließend mit M13K07 Helferphagen infiziert. Mit Hilfe der Panning- Technik (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879 - 5883, 1988) wurden selektiv die Phagen angereichert, die das CA19-9 Antigen zu binden vermögen. Das CA19-9 Antigen bindende, rekombinante scFv Molekül (NS19-9-scFv) hat die in Fig. 1 und SEQ ID NO:1 gezeigte DNS- und die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz. Der Phagen-Antikörper SEQ ID NO:2-scFv-M13 wird auf der Oberfläche der Phagen als Fusionsprotein scFv-gp3 exprimiert und bindet spezifisch das CA19- 9 Antigen aus CA19-9 positiven Tumorzellen (Fig. 2). Das gp3 Protein des M13 Phagen hat keine Bindungsspezifität.
Die Bindung des SEQ ID NO:2-scFv Fragments ist spezifisch für das CA19-9 Antigen, da die Bindung des SEQ ID NO:2-scFv an CA19-9 Antigen durch den monoklonalen Antikörper NS19-9 (Fig. 3a) und durch lösliches CA19-9 Antigen (Fig. 3b) kompetitiert wird.
Beispiel 2: Das Polypeptid SEQ ID NO:2 bewahrt auch nach Fusion an die humane Immunglobulin lgG1 CH2CH3-Domäne die Bundungsspezifität für das CA19-9 Antigen.
Das CA19-9 bindende scFv-Molekül SEQ ID NO:2 wurde mit einer zweiten, unabhängigen Proteindomäne unter Beibehaltung der Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen zu einem Fusionsprotein verbunden. Dazu wurde die DNA SEQ ID NO:1 , die für das anti-CA19-9 scFv, mit der cDNA kodiert, die für die humane lgG1 CH2CH3-Domäne kodiert, ligiert. Die resultierende cDNA, die für das scFv- CH2CH3- Fusionsprotein kodiert, wird in den pRSV Expressionsvektor inseriert und nach Transfektion in Ag8.653 Zellen exprimiert. Der pRSV Expressionsvektor (Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 720 - 724 (1993)) ist gekennzeichnet durch eine RSV-LTR gesteuerte Expressionskassette mit einem Immunoglobulin kappa-Leicht- ketten-Leader-Peptid. Dieses gewährleistet, daß das exprimierte Fusionsprotein in den Kulturüberstand sezerniert wird. Das Fusionsprotein SEQ ID NO:2-scFv- CH2CH3 wird aus dem serumfreien Kulturüberstand transfizierter Ag8.653-Zellen mit Hilfe der Affinitätschromatographie durch Bindung an anti-human Fc-Antikörper gekoppelte Agarose isoliert. Die SEQ ID NO:2-scFv-Domäne hat im Fusionsmolekül die Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen bewahrt. Die konservierte Bindungs- spezifität wurde durch Bindung des SEQ ID N0:2-scFv- CH2CH3-Fusionsproteins an CA19-9 Antigen (Fig. 4a) und durch Kompetition der Bindung durch den monoklonalen Antikörper NS19-9 (Fig. 4b) und lösliches CA19-9 Antigen (Fig. 4c) nachgewiesen. Das Fusionsmolekül SEQ ID NO:2-scFv CH2CH3 bindet spezifisch an CA19- 9 positive Tumorzellen, nicht jedoch an CA19-9 negative Tumorzellen (Fig. 5). Diese Daten zeigen, daß die CA19-9 bindende Domäne SEQ ID NO:2 einersetis die gleiche Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen hat wie der monoklonale NS19-9 Antikörper, andererseits auch dann die Bindungsspezifität beibehält, wenn die SEQ ID NO:2-scFv-Domäne Teil eines Fusionsproteins mit anderen funktionellen Domänen ist.
Beispiel 3: Die Fusion der Moleküls SEQ ID NO:2-CH2CH3 an humanes lnterleukin-2 (IL-2) generiert ein bifunktionales Protein mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen.
Durch Fusion des Moleküls SEQ ID NO:2-CH2CH3 (aus Beispiel 2) mit lnterleukin-2 (IL-2) wurde ein bifunktionales Fusionsprotein generiert, das Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen ausprägt und zugleich das IL-2 Protein trägt. Hierzu wurde die DNA SEQ ID NO:1-CH2CH3 (aus Beispiel 2) mit der cDNA, die für humanes IL-2 kodiert, fusioniert und in die Expressionskassette des Expressionsvektors pRSV inseriert. Der pRSV Expressionsvektor (Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 90: 720 - 714 (1993)) ist gekennzeichnet durch eine RSV-LTR gesteuerte Expressionskassette mit einem Immunoglobulin kappa-Leichtketten-Leader-Peptid, so daß das ex- primierte Fusionsprotein in den Kulturüberstand sezerniert wird. Nach Transfektion der Expressionskassette in Ag8.653 Zellen wurde das Fusionsprotein SEQ ID NO:2- CH2CH3-IL-2 aus dem Kulturübersand durch Affinitätschromatographie durch Bindung an einem anti-human-Fc-Antikörper, der die CH2CH3-Domäne bindet, gereinigt.
Das Fusionsprotein SEQ ID NO:2-CH2CH3-IL-2 ist gekennzeichnet durch ein phar- makologisch wirksames Zytokin (IL-2), fusioniert mit der CA19-9 bindenden Domäne SEQ ID NO:2, wobei die Bindungsspezifität des scFv für das CA19-9 Antigen auch in dieser Konfiguration des Fusionsproteins erhalten geblieben ist. Die Bindung des Fusionsproteins SEQ ID NO:2-CH2CH3-IL-2 an CA19-9 ist in Fig. 6a, b dokumentiert.
Beispiel 4: Das Molekül SEQ ID NO:2 bewahrt nach Denέturierung und Renaturierung die Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen.
Das lösliche Molekül SEQ ID NO:2 (ohne Phagenanteil) wird nach Transfektion der SEQ ID NO:1 DNA in pCANTAB 5E Vektor in E. coli HB2151 Bakterien und Induktion mit IPTG produziert und akkumuliert im Periplasma der Bakterien. Die Isolierung des SEQ ID NO:2-Proteins aus dem Periplasma der Bakterien erfolgt durch Inkubation der Bakterien in 1/5 x (v/v) TES Puffer (1 x TES: 200 mM Tris-HCI, 0,5 mM EDTA, 500 mM Sucrose, pH 8,0) für 30 min bei 4 °C und Ammoniumsulfatfällung des Bakterienüberstandes. Das Präzipitat wird in PBS renaturiert. Das renaturierte SEQ ID NO:2-Molekül wurde hinsichtlich der Spezifität der Bindung an CA19-9 Antigen mit dem nativen SEQ ID NO:2-gp3 Phagenmolekül verglichen. Hierbei zeigte sich, daß das SEQ ID NO:2-Molekül nach Denaturierung und Renaturierung in der löslichen Form dieselbe Bindungsspezifität zu dem CA19-9 Antigen aufweist wie der SEQ ID NO:2-gp3 Phagenkörper, dessen Isolierung keine De- und Renaturierung erfordert.
Beispiel 5: Das Molekül SEQ ID NO:2 als Domäne vermag durch Antigenbindung die fusionierte Signaldomäne zu aktivieren.
Es wurde ein rekombinantes Transmembranmolekül generiert, dessen extrazelluläre Domäne durch das CA19-9 bindenden Molekül SEQ ID NO:2 und dessen Transmembran- und intrazelluläre Domäne durch die γ-Kette des FcεRI Rezeptors gebildet wird. Dieses Fusionsmolekül soll dienen zur spezifischen zellulären Aktivierung von immunokompetenten Zellen (z. B. T-Zellen) nach Kontakt mit CA19-9 Antigen trangenden Zellen (z. B. Tumorzellen). Die DNA, kodierend für SEQ ID NO:2-CH2CH3 (aus Beispiel 2) wurde in die Snabl und BamHI Stelle des Vektors pRSV-γ (Eshhar et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 720 - 724 (1993)), inseriert unter Deletion der SP6 scFv-Domäne des Vektors. Die neu rekombinierte Vektor-DNA wurde in Maus-MD45-T-Zellen mit Hilfe der Elektro- poration transfiziert und stabile Zellklone isoliert, die den gewünschten SEQ ID NO:2-CH2CH3-γ-Rezeptor auf der Oberfläche exprimieren.
Rezeptor tragende MD45 Zellen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaft, nach Kontakt mit CA19-9 positiven Tumorzellen spezifisch aktiviert zu werden, geprüft. Dazu wurden rezeptortragende MD45-Zellen und als Kontrolle nicht-transfizierte MD45-Zellen (je 105 Zellen) in parallelen Ansätzen mit CA19-9+ H498 Tumorzellen und mit CA19- 9-H716-Tumorzellen (je 105 Zellen) kokultiviert. Nach 48 Stunden wurde die Menge sezerniertes IL-2 im Kulturüberstand als Maß für die zelluläre Aktivierung bestimmt. Es zeigte sich, daß SEQ ID NO:2-CH2CH3-γ-Rezeptor tragende MD45-Zellen durch Kokultur mit CA19-9-positiven H498 Tumorzellen aktiviert werden, nicht jedoch durch CA19-9-negative H716-Tumorzellen. Nicht-transfizierte MD45-Zellen werden weder durch H498 noch durch H716-Zellen aktiviert. Weiterhin zeigt dieses Ergebnis, daß die CA19-9 bindende extrazelluläre Domäne SEQ ID NO:2 nach Bindung des zellgebundenen CA19-9 Antigens ein Signal an die fusionierte intrazelluläre γ- Signalkette weiterleitet, die ihrerseits die zelluläre Aktivierung einleitet.
Beispiel 6: Das Molekül SEQ ID NO:2 akkumuliert in vivo an Zellen mit CA19-9 Expression.
Das lösliche Protein SEQ UD NO:2 (aus Beispiel 1) wurde mit 125J unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenz radioaktiv markiert und von ungebundenem 125J gereinigt. Die Bindungsspezifiät des 125J-SEQ ID NO:2-Moleküls in vitro ist gleich der des nichtmarkierten SEQ ID NO:2-Moleküls. Zur Erzeugung von Tumoren wurden CA19- 9 positive H498-Zellen und als Kontrolle CA19-9-H716-Zellen subkutan in Nacktmäuse (nu/nu) injiziert (ca. 106 Zellen pro Injektion und Tier). Nach 5 - 8 Tagen bildete sich jeweils ein subkutaner Tumor von 2 - 4 mm Durchmesser. Am Tag 7 nach Injektion der Tumorzellen wurde 125J-SEQ ID NO:2 intravenös in tumortragende Mäuse appliziert (5 μg Protein/Maus). Nach 24 Stunden wurde die Verteilung der Radioaktivität in der Maus durch Ganzkörper-Autoradiographie bestimmt. Es zeigte sich, daß die Radioaktivität am H498 Zelltumor (CA19-9+) akkumuliert ist, nicht jedoch am H716-Zelltumor (CA19-9-). Die Organe der Mäuse zeigen geringe Radioaktivität in gleicher Verteilung bei H498-Tumor wie bei H716-Tumor tragenden Mäusen.

Claims

Patentanprüche
1. Polypeptid, umfassend die Oligopeptide
(A) bestehend aus der variablen Region der schweren Kette (VH) eines anti-CA19-9- Antikörpers oder eines Fragments desselben mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen und
(B) bestehend aus der variablen Region der leichten Kette (VL) eines anti-CA19-9- Antikörpers oder eines Fragments desselben mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen, wobei die Oligopeptide (A) und (B) direkt oder durch ein Brückenpeptid (C) miteinander verknüpft sind.
2. Polypeptid nach Anspruch 1 , wobei die Oligopeptide (A) und (B) durch ein Brük- kenpeptid (C) miteinander verknüpft sind und das Brückenpeptid (C) vorzugsweise aus 5 bis 50, insbesondere aus 20 bis 50 Aminosäureresten besteht und besonders bevorzugt eine Ser-Gly-reiche Teilsequenz, insbesondere mit 5 bis 10 Aminosäureresten, ist.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Brückenpeptid (C) eine Teilsequenz mit der Struktur
-(GlymSern)x-Pro-(Gly0Serp)y- umfaßt, wobei n, m, o und p unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 10 und x und y unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, oder wobei das Brückenpeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 aufweist.
4. Polypeptid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligopeptide (A) und (B) vom gleichen Antikörper stammen.
5. Polypeptid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei eines oder beide Oligopeptide (A) und (B) von dem Antiköper 1116-NS-19-9 (ATCC HB-8059) stammen.
6. Polypeptid nach Anspruch 1 , das die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist oder ein Fragment desselben mit Bindungsspezifität für das CA19-9 Antigen.
7. Polypeptid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid mit weiteren funktioneilen Substanzen, insbesondere weiteren Peptiden, Zytiko- nen, Enzymen, Indikatorsubstanzen, pharmakologisch wirksame Substanzen, radioaktiven Isotopen, Toxinen und/oder Farbstoffen verknüpft ist.
8. DNA, die für das in Ansprüchen 1 bis 7 definierte Polypeptid kodiert.
9. Vektor, enthaltend die in Anspruch 8 definierte DNA.
10. Wirtsorganismus, der mit dem in Anspruch 9 definierten Vektor transformiert ist.
11. Verfahren zur Herstellung des in Ansprüchen 1 bis 6 definierten Polypeptids, umfassend das Kultivieren des transformierten Wirtsorganismus gemäß Anspruch 10.
12. Verwendung des Polypeptids nach Ansprüchen 1 bis 7 zur Herstellung von Arzneimitteln und Diagnostika, die zum Nachweis, zur Lokalisierung und/oder zur Eliminierung von CA19-9 Antigen tragenden Zellen, insbesondere Tumorzellen geeignet sind.
13. Radiomarkiertes Polypeptid, wobei das Polypeptid wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert ist.
14. Radiomarkiertes Polypeptid gemäß Anspruch 13, wobei das Radioisotop direkt oder mittels einer Chelatormoleküls an das Polypeptid gebunden ist.
15. Radiomarkiertes Polypeptid gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das Radioisotop ausgewählt ist aus 125J, 131 J, 99mTc, 188Re, 186Re und 32P.
16. Verfahren zur Herstellung des radiomarkierten Polypeptids gemäß Ansprüchen 13 bis 15, umfassend das Umsetzen des Polypeptids gemäß Ansprüchen 1 bis 6 mit dem Radioisotop.
17. Verwendung des radiomarkierten Polypeptids gemäß Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung von Arzneimitteln für die Tumortherapie oder von Diagnostika.
18. Arzneimittel oder Diagnostika, umfassend das Polypeptid gemäß Ansprüchen 1 bis 7 und/oder das radiomarkierte Polypeptid gemäß Anspruch 13 bis 15.
PCT/EP2000/009714 1999-10-08 2000-10-05 Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen WO2001027159A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00979484A EP1218414A2 (de) 1999-10-08 2000-10-05 Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen
JP2001530377A JP2004507205A (ja) 1999-10-08 2000-10-05 Ｃａ１９−９抗原陽性細胞の検出および除去のためのポリペプチド

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99120119A EP1090927A1 (de) 1999-10-08 1999-10-08 Polypeptide (scFv) zur Detektion und Elimination CA19-9 antigen positiver Zellen
EP99120119.5 1999-10-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2001027159A2 true WO2001027159A2 (de) 2001-04-19
WO2001027159A3 WO2001027159A3 (de) 2001-10-25

Family

ID=8239158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/009714 WO2001027159A2 (de) 1999-10-08 2000-10-05 Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen

Country Status (3)

Country Link
EP (2) EP1090927A1 (de)
JP (1) JP2004507205A (de)
WO (1) WO2001027159A2 (de)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6949629B2 (en) 2002-03-13 2005-09-27 Aspenbio, Inc. Methods for purifying selected CEA family member proteins
WO2021105989A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Chimeric antigen receptor to carbohydrate antigens
WO2021105988A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
WO2022113066A1 (en) * 2020-11-24 2022-06-02 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Humanized antibodies and fragments thereof binding to carbohydrate antigens and uses thereof
WO2022121415A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7981628B2 (en) 2006-04-28 2011-07-19 Oregon Health & Science University Monoclonal antibodies and their use
CN114573700B (zh) * 2022-02-18 2023-05-26 河北渤腾医药技术有限公司 糖类抗原ca19-9的检测试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARENDS J W ET AL: "Monoclonal antibody (1116 NS 19-9) defined monosialoganglioside (GICA) in colorectal carcinoma in relation to stage, histopathology and DNA flow cytometry." INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, (1983 SEP 15) 32 (3) 289-93., XP002132329 *
JUHL H ET AL: "A monoclonal antibody-cobra venom factor conjugate increases the tumor-specific uptake of a 99mTc-labeled anti-carcinoembryonic antigen antibody by a two-step approach." CANCER RESEARCH, (1995 DEC 1) 55 (23 SUPPL) 5749S-5755S., XP000872898 in der Anmeldung erw{hnt *
KOPROWSKI H ET AL: "Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies." SOMATIC CELL GENETICS, (1979 NOV) 5 (6) 957-71., XP002132330 in der Anmeldung erw{hnt *
NARUKI Y ET AL: "Radioimmunodetection of cancer of gastrointestinal tract and liver-- metastasis with I-131 anti-CEA and I-131 anti-CA19-9 monoclonal antibody cocktail (IMACIS-1)." ANNALS OF NUCLEAR MEDICINE, (1994 AUG) 8 (3) 163-9., XP002132327 in der Anmeldung erw{hnt *
SAFI F ET AL: "The clinical relevance of the tumor marker CA 19-9 in the diagnosing and monitoring of pancreatic carcinoma." BULLETIN DU CANCER, (1990) 77 (1) 83-91. REF: 29, XP002132328 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6949629B2 (en) 2002-03-13 2005-09-27 Aspenbio, Inc. Methods for purifying selected CEA family member proteins
WO2021105989A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Chimeric antigen receptor to carbohydrate antigens
WO2021105988A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Antibodies to carbohydrate antigens
WO2022113066A1 (en) * 2020-11-24 2022-06-02 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Humanized antibodies and fragments thereof binding to carbohydrate antigens and uses thereof
WO2022121415A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 东莞市朋志生物科技有限公司 抗ca19-9的抗体、其应用和检测ca19-9的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
EP1218414A2 (de) 2002-07-03
WO2001027159A3 (de) 2001-10-25
EP1090927A1 (de) 2001-04-11
JP2004507205A (ja) 2004-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69333807T2 (de) Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
Nicholson et al. Construction and characterisation of a functional CD19 specific single chain Fv fragment for immunotherapy of B lineage leukaemia and lymphoma
DE60127143T2 (de) Bispezifische Antikörper gegen CD19 und CD16 und deren Verwendung
JP4056543B2 (ja) 非抗原性即素複合体およびインターナライジング受容体システムの融合タンパク
EP1975183B1 (de) Tumorspezifische Erkennungsmoleküle
DE60124912T2 (de) Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
DE60220719T2 (de) Antikörper gegen das muc18-antigen
DE69605181T3 (de) Antikörper gegen cd30, die proteolytische spaltung und abgabe des membrangebundenen cd30 antigens verhindern
DE69632333T2 (de) Monoklonaler antikörper br110 und dessen anwendung
AU6084694A (en) Methods of delivering agents to target cells
JP2004523205A (ja) 多価標的結合タンパク質
DE3920358A1 (de) Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE10156482A1 (de) Bispezifisches Antikörper-Molekül
DE69927268T2 (de) Spezifische antikörper enthaltende bindungsproteine die das nekrotische tumorzentrum binden und deren verwendung
Sharifi et al. Characterization of a phage display-derived human monoclonal antibody (NHS76) counterpart to chimeric TNT-1 directed against necrotic regions of solid tumors
EP2726507B1 (de) Antikörper gegen das prostata-spezifische stammzellantigen und dessen verwendung
EP2600889B1 (de) Anti-la antikörper und ihre anwendung zum immunotargeting
WO2001027159A2 (de) Polypeptide zur detektion und elimination ca19-9 antigen positiver zellen
DE10021678A1 (de) Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
de Sutter et al. A bifunctional murine:: Human chimeric antibody with one antigen-binding arm replaced by bacterial β-lactamase
Hozumi et al. Recombinant antibody technology: its advent and advances
DE69822779T2 (de) Peptid aus humanem Interleukin-2 zur Steigerung der Vasopermeabilität und dessen Immunkonjugate
DE19744531A1 (de) Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe
Helfrich et al. Recent Developments in the Construction of Bispecific Antibodies
US20050058638A1 (en) Biosynthetic binding proteins for immuno-targeting

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 530377

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000979484

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000979484

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000979484

Country of ref document: EP