WO1999046369A1 - Nouvelle dicarbonylreductase et gene la codant - Google Patents

Nouvelle dicarbonylreductase et gene la codant Download PDF

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WO1999046369A1
WO1999046369A1 PCT/JP1999/001194 JP9901194W WO9946369A1 WO 1999046369 A1 WO1999046369 A1 WO 1999046369A1 JP 9901194 W JP9901194 W JP 9901194W WO 9946369 A1 WO9946369 A1 WO 9946369A1
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WO
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protein
gene
sequence
activity
amino acid
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Application number
PCT/JP1999/001194
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English (en)
French (fr)
Inventor
Junichi Nakagawa
Makoto Yoshimoto
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Publication of WO1999046369A1 publication Critical patent/WO1999046369A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein having dicarbonyl reductase activity, and a gene encoding the same. Furthermore, the present invention relates to an antibody against the protein and an antisense oligonucleotide of the gene. Further, the present invention provides a method for detecting AGE production using the gene, a dicarbonate compound production inhibitor comprising the protein, an AGE production inhibitor, and an AGE comprising the antisense oligonucleotide. And a method for screening an AGE production regulator. Further, the present invention relates to a method for diagnosing diabetic complications, comprising using the gene, the protein, and the antibody. Background art
  • the reaction in which an amino acid and a reducing sugar react non-enzymatically to turn brown is generally called the Maillard reaction.
  • This reaction occurs predominantly in the body, especially when an amino group on a protein undergoes a Maillard reaction.
  • This reaction triggers a complex process such as dehydration and polymerization, resulting in a unique yellow-brown substance. Is reported to be formed.
  • This substance is called Advanced Glycation Endproduct (hereinafter referred to as AGE).
  • AGE is known to accumulate in high concentrations in diabetic patients and has the property of binding to hemoglobin II collagen, so that arteriosclerosis, a diabetic complication, fibrosis seen in renal failure, It is considered the cause of hardening.
  • the present invention provides (1) an effective means for effectively suppressing and treating renal insufficiency and arteriosclerosis of the above-mentioned diabetic complications by regulating and suppressing the above-mentioned AGE production; and (2) regulating AGE production.
  • a substance that can be controlled it is possible to develop a method for detecting diabetic complications due to AGE formation, to develop a diagnostic method and diagnostic reagent for the symptoms, and to develop a method and a therapeutic agent for treating the symptoms. It is an object of the present invention to provide a novel protein having an enzymatic activity capable of regulating the production of AGE, and a gene encoding the same, based on the idea that the protein can be produced.
  • protein DCR1 novel protein according to the present invention
  • protein DCR1 novel protein
  • hDCRl novel protein having the same activity as the protein DCR1
  • amino acid sequences of the mouse-derived protein DCR1 and the human-derived hDCRl obtained for the first time in the present invention show high homology (about 85%), and the amino acid sequences of these and known mouse lung specific carbonyl reductase (CR) are about 70 Has% homology.
  • the proteins DCR1 and hDCRl have a high reduction activity when diacetyl is used as a substrate. It has the activity of diacetyl reductase cloned for the first time in mammals.
  • the protein DCR1 is localized around the renal medulla papilla (mouse tissue antibody staining). In addition, its expression is sensible (Western plot for various organ extracts for organs other than the kidney), and its expression is significantly reduced in the kidney of a diabetic model mouse.
  • the present invention relates to a novel dicarbonyl reductase derived from mammals including mice and humans (particularly a diacetyl reductase having a high reducing activity against a poly-diketone having a linear alkyl group having 4 to 10 carbon atoms). And has a high reducing activity, especially for aromatic orthoquinone.
  • diketones include diacetyl, 2,3-pentanedione, and 2,3-hexanedione.
  • the present invention provides a gene encoding the following protein (a) or (b).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and which has dicarbyl reductase activity.
  • the present invention relates to a method for hybridizing the above-described gene under stringent conditions. It is intended to provide a gene encoding a protein which is soybean and has dicarbonyl reductase activity.
  • the present invention also provides the following protein (a) or (b).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and which has dicarbyl reductase activity;
  • the present invention also provides an antibody against the protein described above. Further, the present invention provides an antisense oligonucleotide having the entire or partial sequence of the antisense strand of any of the genes described above, and inhibiting the biosynthesis of the protein according to 3. .
  • the present invention also provides a dicarbonyl compound formation inhibitor comprising the protein described above.
  • the present invention provides an AGE production inhibitor comprising the protein described above.
  • the present invention also provides an AGE-producing modulator comprising the above-described antisense oligonucleotide.
  • the present invention provides a method for screening for the gene expression regulator using at least a part of the gene described above, and the gene expression regulator obtained by the method.
  • the present invention provides a method for screening the protein activity regulator using at least a part of the protein described above, and the protein activity regulator obtained by the method.
  • a gene refers to DNA obtained by reverse transcription from naturally occurring mRNA (including DNA obtained by amplifying the DNA), it is referred to as cDNA when its meaning is clarified.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence of the protein hDCRl (derived from human, above) and the protein DCR1
  • FIG. 4 is a view showing a comparison of amino acid sequences (from mouse, below).
  • FIG. 2 is a diagram showing the similarity (mouse) between the amino acid sequence of the protein DCR1 and the amino acid sequence of lung-specific carbonyl reductase (CR).
  • the upper part shows protein DCR1
  • the lower part shows carbonyl reductase.
  • the underlined part shows the peptide sequence used for preparing the antibody.
  • Fig. 3 shows the similarity of the amino acid sequences of the substrate recognition sites of the protein hDCRl (human, upper), the protein DCR1 (mouse, medium), and the mouse carbonyl reductase (CR, lower). . Arrows in the figure indicate amino acid residues essential for hydrophobic interaction with the substrate.
  • FIG. 4 is an electrophoresis photograph showing the result of affinity purification of the recombinant protein DCR1.
  • FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the result of measuring the expression level of the protein DCR1 in the main organs of normal mice by the Western plot method.
  • FIG. 6 is an electrophoretic photograph showing the result of Western blotting comparing the expression level of protein DCR1 between a kidney extract of a diseased model mouse and a normal mouse.
  • FIG. 7 is a diagram showing the pH dependence of dicarbonyl reductase activity by the protein DCR1 using diacetyl as a substrate.
  • the gene dcrl according to the present invention can be obtained by the following operations. That is, the gene (dcrl) can be isolated from a kidney-derived cDNA library as a cDNA fragment containing the gene.
  • the cDNA library used by the present inventors was prepared from a kidney tissue centered on the glomerulus of the kidney.
  • the method of Okubo et al. Okubo et al., Nature Genet., 2, 173 (1992)
  • a method of analyzing the frequency of occurrence of gene expression can be used.
  • cDNA synthesis was performed using kidney-derived mRNA as type I, a vector plasmid that had been opened with an appropriate restriction enzyme, and oligo dT ligated to one end of a vector plasmid. Cleavage with restriction enzymes Mbol and BamHI.
  • the vector Since the vector is prepared using dam methylase-positive Escherichia coli as a host, the A residue of "GATC", which is the Mbol recognition sequence, is methylated. Therefore, Mbol cuts only the newly synthesized cDNA portion. Since this vector has only one BamHI cleavage site near the end opposite to the end to which oligo dT is bound, this enzyme cuts the vector at one position and further synthesizes newly synthesized cDNA. If a BamHI recognition sequence is present in that part, the site is also cut. BamHI and Mbol consist of the sequence “GATC” and generate the same cohesive end. Plasmid can be closed by cutting with both enzymes and then using DNA ligase.
  • a cDNA library is constructed by transforming Escherichia coli using the plasmid thus prepared.
  • the library 1 includes a region from the poly A site at the 3 ′ end of each mRNA to the site where the base sequence GATC first appears in the 5 ′ side thereof.
  • the number of the cDNA fragments having the specific sequence determined in this manner among randomly selected recombinants can be determined by organ-specific genes and high-expression genes. Identify the child.
  • the total number of recombinants selected at random is about several hundred to 1,000, but if necessary, more recombinants are processed.
  • the base sequences of cDNA fragments in an appropriate number of recombinants were all determined, and from those values, the frequency of appearance as a cDNA having the same sequence was determined.
  • the cDNA fragments thus obtained were selected as candidates for DNA fragments having genes specifically expressed in kidney.
  • the above-mentioned cDNA fragment contains a partial region of the 3 ′ end of mRNA. Based on the base sequence information of the region (hereinafter, 3 ′ fragment), the entire cDNA fragment is as follows. Obtain a long cDNA. That is, the kidney cDNA library can be made into type III, oligonucleotides of an appropriate length each having the sequence within the above 3 ′ fragment can be synthesized, and can be amplified by PCR using these as primers.
  • the cDNA fragment amplified by the above method can be incorporated into an appropriate vector (for example, pT7BlueT—vector 1 commercially available from Novadin) according to a conventional method to determine the total base sequence.
  • an appropriate vector for example, pT7BlueT—vector 1 commercially available from Novadin
  • the sequence can be confirmed by independently obtaining two clones of the recombinant DNA and determining the base sequence of each cDNA fragment.
  • the nucleotide sequence of the resulting gene dcrl is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. (Cloning of gene hdcrl)
  • a gene encoding dicarbyl reductase having a similar effect can be obtained from a heterologous organism.
  • colony hybridization or Southern blot hybridization using a probe synthesized according to the amino acid sequence deduced from the sequence, or by polymerase chain reaction (PCR) using a primer synthesized based on the information. can be separated.
  • a cDNA library can be prepared using human kidney mRNA according to a usual method, subcloned into an appropriate plasmid, and the nucleotide sequence can be determined.
  • the nucleotide sequence of the resulting gene hdcrl is described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. Furthermore, the present invention provides a DNA sequence containing the above-obtained nucleotide sequence dcrl or hdcrl, a DNA sequence that hybridizes with the sequence or a fragment derived therefrom under standard conditions, and the reason that the gene code is degenerated. It also includes a DNA sequence that encodes a polypeptide that does not hybridize to the above DNA sequence under standard conditions but has the exact same amino acid sequence. As used herein, the term “standard conditions” for hybridization is generally used by those skilled in the art to detect specific hybridization signals, and is described, for example, in Sambrook et al.
  • Gent hybridization refers to stringent-non-stringent washing conditions, more preferably so-called stringent hybridization-stringent washing conditions.
  • the probe can be labeled by a known labeling means, and can be carried out by a known Northern blot method. Further, by using a specific standard, it is possible to quantify the gene expressed in a specific tissue.
  • the present invention also provides a method for confirming the effect of a AGE production regulating or suppressing agent by quantifying the expression of the above gene. In this case, it becomes possible by confirming the presence or absence of administration of an AGE production or inhibitor, or by confirming a change in the gene expression level within a specific time after the administration.
  • the gene considered to be present in the cDNA fragment selected by the above-described method was specifically expressed in kidney tissue, and the frequency of organ-specific expression of the cDNA sequence was determined by Western blotting. This can be done by confirming with the high predication. That is, a crude extract of each organ is prepared, SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) is performed, and the proteins on the gel are transferred to the membrane fill overnight, and then the anti-peptide antibody is used as a probe. The hybridization is carried out according to the usual method. As shown in the Examples below, the organ specificity of the cDNA sequence is examined using the method described here, and it can be confirmed that the cDNA sequence is specifically expressed in kidney tissue.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide electrophoresis
  • the genes dcrl and hdcrl can be obtained, and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene can be derived from the nucleotide sequence information of the gene. That is, the proteins encoded by the novel genes according to the present invention are each proteins containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 and 4 in the sequence listing.
  • the amino acid sequences of the DCR1 and hDCRl proteins show high homology (FIG. 1).
  • FIG. 2 shows the similarity between the amino acid sequence of the obtained protein DCR1 and the amino acid sequence of mouse lung carbonyl reductase (CR). A high similarity of about 70% is observed.
  • the underline indicates the sequence (# 731 at the top and # 733 at the bottom) used to generate the anti-peptide antibody described below.
  • FIG. 3 compares the amino acid sequences at the substrate recognition sites of mouse-derived DCR1, human-derived hDCRl, and mouse-derived carbonyl reductase.
  • the protein according to the present invention is not limited to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4 of the sequence listing, but is obtained by substituting, deleting or adding one or more amino acids thereof. And having dicarponyl reductase activity (mutant protein).
  • specific examples of the gene (polynucleotide) encoding the protein having dicarbonyl reductase activity according to the present invention include not only the polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing but also the natural polynucleotide.
  • a part of the structure of a polynucleotide that has been altered by artificial or artificial mutation without altering the dicarbyl reductase activity, which is the main function of the polypeptide encoded by the polynucleotide (mutant gene) Is also included.
  • Such an artificial mutation can be introduced by a conventional method.
  • a protein having the same amino acid sequence can be obtained by a gene obtained by substituting at least a part of the base sequence of the gene with another type of base. Therefore, the gene encoding the protein according to the present invention includes all degenerate patterns that can encode the protein according to the present invention and its mutant proteins.
  • the method for obtaining the protein (including the mutant protein) according to the present invention is not particularly limited. Specifically, an artificial peptide synthesis method using a protein synthesizer or the like, or various methods for expressing a protein by a genetic engineering method based on the nucleotide sequence information of the gene encoding the protein obtained in the present invention. Is mentioned.
  • the protein may be expressed alone or as a fusion protein with MBP (Maltose Binding Protein), or may be expressed by adding a tag such as a FLAG peptide.
  • the genetic engineering method enables preparation using bacteria such as Escherichia coli, yeast, or using animal cells or insect cells.
  • Specific examples include a method of selecting a suitable vector and host, and introducing a gene to obtain a transformant (eg, Molecular Cloning (Sambrook 'et al., Eds.) 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). It is possible by the method described in York). Furthermore, the obtained transformant can be cultured and the target protein can be expressed by amplifying and expressing the gene.
  • the protein of the present invention and its mutant protein can be obtained by collecting the culture and performing operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various chromatographies as necessary.
  • any of bacteria such as Escherichia coli, yeast, and animal cells can be used, and animal cells are particularly preferable.
  • a liposome method, an electoral poration method, or the like can be used.
  • Purification methods for purifying proteins from the resulting culture include immunoprecipitation, salting out, ultrafiltration, isoelectric point precipitation, gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography, and hydrophobicity.
  • Affinity chromatography such as affinity chromatography and antibody chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography There are one method, reverse phase chromatography, and the like, and it is easy for those skilled in the art to appropriately select and carry out.
  • the target protein to be produced may be produced in a transformant as a fusion peptide with another polypeptide. If necessary, in the purification step, a treatment with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as protease may be performed to cut out the target protein.
  • a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as protease
  • a method for obtaining antibodies against all or some of the proteins (including the mutant proteins described above) according to the present invention can be performed by a generally known method.
  • the antibody according to the present invention includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies as long as it reacts with the protein of the present invention (a mutant thereof). Also included are the active fragments thereof and chimeric antibodies containing the active fragments.
  • Antibodies, ie, immunoglobulins have heavy and light chains and are divided into five classes (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) based on their physicochemical and immunological properties. Of these, IgA and IgG are further divided into subclasses depending on the type of heavy chain.
  • the novel antibodies of the present invention include those belonging to all these classes and subclasses.
  • the antibody of the present invention does not necessarily need to use the entire antibody molecule, and can use a part of the molecule (active fraction) as long as it has activity.
  • the active fragment include F (ab,) 2, Fab, Fab, Fv, a recombinant Fv form, and a single-chain Fv.
  • digestion with pepsin yields F (ab,) 2, Fc
  • digestion with papain yields Fab, Fc.
  • Active fragments can be used alone or, if necessary, combined with a substance such as albumin or polyethylene glycol to be used as a new complex. In general, such a complex is most likely to exhibit its effect in vivo without being decomposed for a long time. Active fragments include albumin, A method for adding a substance such as polyethylene glycol is described in, for example, “Ant ibodi ⁇ s, AL ab or at ory Manua l” (Cold Sprin H ⁇ ber Labor or atry, 1 988), p. 77—81. , P129-137. In general, the use of a bivalent reagent such as SPDP (Pharmacia), SMP B (Pierce), EMCS (Doitit) makes it possible to easily bind the active fragment to albumin or the like. be able to.
  • the immunizing antigen is a part of the protein of the present invention, that is, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or a polypeptide consisting of eight or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of the mutant protein. I just need. Also, the method by which the protein was obtained is not limited as long as it has a purification degree that can be used for the production of an antibody.
  • the immunizing antigen is a polypeptide consisting of 8 to about 20 amino acids
  • it can be used as an antigen by binding it to a carrier such as mosquisin (KLH) to keyhole limpet.
  • KLH mosquisin
  • the animal to be immunized with the immunizing antigen may be any other than human, and it is preferable to select an animal species capable of producing the desired antibody from animals usually used by those skilled in the art and use the polyclonal antibody. Obtained by purifying the purified antiserum. Purification may be performed by a combination of methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • a monoclonal antibody can be obtained by obtaining a fusion cell by a method for preparing an ordinary hybridoma and then causing the cell to produce the antibody.
  • a method for preparing an ordinary hybridoma for cell fusion, techniques using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse, etc. can be used.
  • the monoclonal antibody can be obtained by using a genetic engineering method. For example, spleen cells of an animal immunized with the protein of the present invention or a part thereof, MRNA is collected from lymphocytes or a hybridoma producing the monoclonal antibody, and a cDNA library is prepared based on the mRNA. Next, an antibody is expressed by the cDNA library. A clone that produces an antibody that reacts with the antigen is obtained from the cDNA library by screening, and the obtained clone is cultured. The desired antibody is extracted from the culture mixture by salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. Purification can be performed by a combination of methods such as chromatography. In particular, when the material to be used is a pathological tissue, for example, an in situ hybridization method using the above probe can be used. Further, an ABC tissue staining method using the antibody according to the present invention can be used.
  • the antisense poly (or oligo) nucleotides based on the above genes obtained in the present invention include all nucleotides consisting of a plurality of nucleotides consisting of bases, phosphates and sugars, including those not naturally occurring. . Typical examples are DNA and mRNA.
  • the antisense polynucleotide derivative of the present invention includes all those whose tertiary structure and function are similar to those of the polynucleotide. For example, substitutions, deletions, and / or additions may occur at the 3'-end or 5'-end of a polynucleotide, or at least a portion of the base, sugar, or phosphate of a polynucleotide. Substances, bases, sugars, and phosphoric acids that do not exist in nature, and those having a skeleton other than the sugar-phosphate skeleton.
  • the antisense polynucleotide and its derivative may hybridize to any part of the gene of the present invention and its mutant gene. Further, the antisense polynucleotide and its derivative can be used as a research polynucleotide probe for examining the presence or expression status of a gene encoding the protein of the present invention or a mutant thereof in a tissue or a cell. Can be used. It can also be used as a polynucleotide probe for diagnosis. In addition, professional As the probe, those having 12 bases or more and a GC content of 30 to 70% are preferable, and those having 16 bases or more and a GC content of 30 to 70% are particularly preferable.
  • the expression of the protein of the present invention can be regulated using the antisense polynucleotide and its derivative. Since these are expected to hybridize to the gene encoding the above protein or mRNA and suppress the expression of the protein, they can be used as therapeutic agents for diseases in which the protein is involved. That is, it is possible to develop an antisense drug from the antisense polynucleotide or a derivative thereof.
  • an antisense method a method of regulating expression of a polypeptide using a polynucleotide containing a complementary nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding the polypeptide is called an antisense method.
  • Polynucleotides with complementary sequences include: (1) the stage of transcription from a gene to pre-mRNA, (2) the stage of processing of pre-mRNA to mature mRNA, (3) the stage of passage through the nuclear membrane, and (4) the stage of translation into protein.
  • stage of transcription from a gene to pre-mRNA
  • stage of processing of pre-mRNA to mature mRNA (3) the stage of passage through the nuclear membrane
  • stage of translation into protein (4) the stage of translation into protein.
  • the antisense polynucleotide and antisense polynucleotide derivative of the present invention also have a nucleotide sequence complementary to mRNA for the protein of the present invention and a mutant thereof, and include a nucleotide sequence consisting of 15 or more nucleotides. If so, it is presumed that it specifically binds to the gene of the present invention or mRNA of the gene of the present invention.
  • the antisense polynucleotide and the derivative thereof of the present invention may be of any length, but the antisense polynucleotide and the antisense polynucleotide derivative of the present invention are incorporated into cells, and In view of regulating the expression of proteins, the antisense polynucleotides and derivatives of these antisense polynucleotides are at least 15 bases and at most 30 bases, preferably at least 15 bases, which are complementary to mRNA for the gene dcrl. Those having a base sequence consisting of 25 bases or less, more preferably 18 bases or more and 22 bases or less are preferable.
  • antisense polynucleotide and antisense nucleotide derivative of the present invention various derivatives, that is, DNA or mRNA of interest, can be used to enhance the effect of the polynucleotide as a drug using known antisense technology.
  • Various polynucleotide derivatives having high binding strength, tissue selectivity, cell permeability, nuclease resistance, and high intracellular stability can be obtained.
  • a polynucleotide or a polynucleotide derivative having a base sequence complementary to the base sequence of the region forming the stem loop should be designed.
  • the polynucleotide of the present invention and the derivative thereof can form a stem loop as needed.
  • a polynucleotide having a sequence complementary to the sequence near the translation initiation codon, the ribosome binding site, the cabling site, and the splice site can be expected to have a high expression suppressing effect. Therefore, the polynucleotide or the polynucleotide derivative of the present invention, which is a gene encoding the protein of the present invention or a mutant thereof, or the vicinity of the translation initiation codon of mRNA for the gene, a ribosome binding site, a cabling site, a splice site Those containing the complementary sequence of are expected to have a high expression suppressing effect.
  • the currently generally known derivative is preferably a derivative in which at least one of nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and avidity is enhanced, and particularly preferably, the polynucleotide derivative is A derivative having a phosphorophosphate bond (see Ant 1 sense-From Technology to Therapy (Schl ingen siepen, et al., Eds) 1997 Black el Science, Berl in-Vienna) as a skeletal structure. Is shown.
  • the polynucleotides and derivatives thereof of the present invention also include derivatives having these functions or structures.
  • the antisense polynucleotide of the present invention can be synthesized using a chemical synthesizer or by a PCR method using the gene encoding the protein of the present invention as a ⁇ type. be able to.
  • Some derivatives such as methylphosphonate type and phosphorothioate type can be synthesized using a chemical synthesizer (for example, Model 394 manufactured by PerkinElmer Japan).
  • the desired product can also be obtained by performing the operation according to the instructions attached to the chemical synthesizer and purifying the obtained synthetic product by the HP LC method using reverse phase chromatography or the like.
  • a polynucleotide or a polynucleotide derivative can be obtained.
  • the method for measuring the enzyme activity is not particularly limited, but it can be carried out in accordance with the method for measuring mouse carbonyl reductase (CR) activity (Eur. J. Biochem. 228, 381-387 (1995)). .
  • the expressed recombinant enzyme was used as the enzyme.
  • Substrate specificity To examine substrate specificity, hydrocarbon-based or aromatic compounds having various ketone groups, aldehyde groups, and ester groups can be used. Particularly, in the present invention, the compounds shown in Table 1 below are preferably used for examining the substrate specificity. The table shows the results obtained for the substrate specificity of enzymes of rat and human origin. Here, C indicates the substrate concentration (M), RA indicates the relative activity (%) based on diacetyl as a reference 100, and Km indicates the result measured at pH 7.0 in mM. (Table 1) (Results of substrate screening) CRA (Km)
  • mouse CDR1 hamster liver diacetyl reductase (Hamster DR) were used as enzymes.
  • the dicarpinal reductase according to the present invention has the following characteristics.
  • the enzyme according to the present invention is similar in coenzyme specificity, pH dependence and substrate specificity to diacetyl reductase in mammalian (hamster) tissue.
  • Substrate specificity is similar to that of microbial diacetylreductase, but microbial enzymes are NADH-dependent.
  • H-diketones having a straight-chain alkyl group having 4 to 10 carbon atoms, especially diacetyl, 1,4-dibromo-2,3-butanedione, 1-phenyl-1,2-propanedione, 2,3 -Has strong reactivity with pennedionedion, 2,3-hexanedione, 3,4-hexanedione, and 2,3-heptanedione.
  • Optimum pH DCRl and hDCRl are considered to have peaks at pH 6 (or even 5) or lower from the pH profile.
  • NADPH one of the substrates, decomposes at pH 5 or lower, when NADPH is used, activity cannot be measured in that range, and peaks cannot be confirmed. Therefore, in the examples, the pH was around 7. However, the optimum pH is not limited to around 7.
  • pH stability For example, DCR1 and hDCRl are incubated at 25 ° C for 3 hours in buffers of various pH values, and their residual activities are measured, and are expressed as relative activities to the values without incubation at pH 8.0. Compare.
  • the diagnosis and treatment of diabetic complications and other treatments using the gene of the present invention, the protein encoded by the gene, and all or a part of the mutants thereof can be performed.
  • Various applications are possible, and some of the specific applications will be described in detail below.
  • the protein according to the present invention is capable of directly decomposing a dicarbonyl compound in a glycation, and a drug containing such an enzyme as a component suppresses the production of a dicarbonyl compound, and thus reduces the production of AGE. It is possible to provide a therapeutic agent that inhibits or suppresses and treats AGE-related diabetic complications.
  • the antisense oligonucleotide according to the present invention can control the activity of dicarbonyl reductase, and therefore can control the activity of decomposing a dicarbonyl compound in glycation to provide a regulator of AGE generation. Becomes possible.
  • the present invention provides a method for screening an AGE production regulator.
  • a cDNA library of a glomerular kidney was prepared by the method of Okubo et al. (Okubo et al., Nature Genet., 2, 173 (1992)).
  • an oligonucleotide consisting of a part of sequence-1 was synthesized by a DNA synthesizer (ABI 380B) manufactured by PE Applied Biosystems.
  • PCR was performed using the cDNA library prepared in (2-1) as type I, the oligonucleotide of sequence-2 and the oligonucleotide attached to the kit as primers.
  • a kit (Yukara LA PCR Kit Ver.2) manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used, and PCR Thermal Cycler-Mp manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used.
  • the reaction was carried out at 94 ° C for 30 seconds, cooled to 60 ° C at a rate of -l ° C / 2 seconds, kept at 60 ° C for 30 seconds, then heated to 72 ° C and kept for 4 minutes. This was repeated 30 times to amplify the target sequence.
  • the DNA fragment amplified in (2) was fractionated by agarose gel electrophoresis (gel concentration 1%) according to a conventional method. After the gel was stained with ethidium mould, the gel containing the target band was cut out by irradiating with ultraviolet light. Extraction and purification of DNA fragments from agarose gels were performed using the GENECLEAN II Kit (Bio 101).
  • the purified DNA fragment was subcloned into a base sequence determination vector, pT7Blue T-Vector (Novagen) by the following method.
  • the ligation solution was reacted at 16 ° C. for 16 hours using a kit (Takara DNA Ligation Kit Ver.2) manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Escherichia coli K12 strain DH5 was transformed by a conventional method. Transformation The recombinant was ampicillin (Amp) 50 jug / ml, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl- ⁇ -d-galactoside ( ⁇ -gal) 40 ⁇ g / ml ⁇ Isopropy ⁇ -d -Thio-Gal actopyranoside (IPTG) IOM was plated on LB agar medium and cultured overnight at 37 ° C.
  • ampicillin Amicillin
  • ⁇ -gal 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl- ⁇ -d-galactoside
  • IPTG Isopropy ⁇ -d -Thio-Gal actopyranoside
  • the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer manufactured by PE Applied Biosystems, Inc., using the Daiyuichi Mineichiyuichi method. Oligonucleotides were synthesized based on the determined base sequence, and the entire base sequence was determined by the primer walking method (SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing). The nucleotide sequences of both chains were determined, and the nucleotide sequences of the two independent clones were completely identical. Since the base sequence contained sequence-2 and the upstream region of sequence-2 of sequence-1, it was confirmed that the target gene (gene dcrl) was cloned. The following shows the entire nucleotide sequence including the above gene dcrl. TTGCTGCGAG AAGACGACAG AATGGGAGGA CCAGGCTCAA GCACCATGGA 50
  • TTCTCTTCCT GCTGAGCAAC CGGAGTGGCA TGACCACTGG CTCCACTTTG 750
  • CTGCTCAGCT CTCTGCTCAG GACACTGTGC CCTCCGCCCC TGCAATAAAG 850
  • CTCTCTGCTC AGCCTGTGTG CTGATTCTCC AGGAAA 886
  • the cDNA fragment containing the gene dcrl obtained in Example 1 was amplified by PCR using the following primers. PCR was performed under the conditions described in Example 1.
  • the amplified and purified cDNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI (both from Takara Shuzo). After the cleavage treatment, the DNA was fractionated again by agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 0.7 kb was purified (fragment-1).
  • pTrcHisA manufactured by Invitrogen
  • EcoRI and BamHI restriction enzymes EcoRI and BamHI
  • Fragment-1 and the ring-opening vector were mixed, transformed under the conditions described in Example 1 into ligation and Escherichia coli K12, and the transformants were further cultured and collected by centrifugation. Recombinant DNA was purified from the cells. The recombinant DNA thus constructed was named pHis-glB.
  • the medium (L + glucose) consists of the following components (in 11):
  • the pre-culture is performed by shaking overnight at 37 ° C using a medium obtained by adding 00 ig / ml Ampicilin to the above medium (8 ml).
  • the purity is checked by SDS PAGE and then by Coomassie-bleach staining method.
  • FIG. 4 shows the results of affinity purification of the recombinant protein DAR1.
  • the molecular weight was about 33 kDa, and the purity was estimated to be 95% or more (the yield was about 3 mg (E. coli 150 mL medium)).
  • the anti-DAR1 protein antibody was prepared using the following antigens in accordance with the method of Saide Biotechnology Inc.
  • Antibody 731 was immunized to egret in the form of a conjugate using Ac-NH-SRTREDLDDLVREC-C00H and antibody 733 using Ac-NH-QASQRALTNHTVYC-COOH as an antigen.
  • hemosyanin KLH
  • the rabbit was immunized once with 150 g six times, twice a month, to obtain an anti-peptide antibody.
  • the gel obtained after SDS PAGE of 0.1 ⁇ g of the recombinant obtained in Example 2 was transferred to Hybond-ECL nitrocellulose membrane (Amersham) using a mini-protein II blotting device (Bio-Rad). .
  • the membrane filter on which the protein was blotted was washed with distilled water, and then detected using the prepared various antibodies by an Amersham ECL western plotting detection system. As a result, it was found that detection was possible as a band having an apparent molecular weight of about 33 kDa. Therefore, an immunoassay can be performed using various cells using this antibody.
  • FIG. 3 the expression level of protein DCR1 in major organs of normal mice was shown by Western blotting.
  • the antibodies used are antibodies # 731 and # 733 created in Example 3.
  • Each organ extract contains 100 g of protein.
  • 0.1 zg of recombinant protein was used.
  • Antibody # 733 also reacts more specifically with the protein DCR1 and shows less cross-reactivity with isozymes. The results shown in FIGS. 5 and 6 are the results using antibody # 733.
  • FIG. 6 shows the results of comparison of the protein DCR1 expression level between the kidney extract of the diseased model mouse and the normal mouse by Western blotting.
  • the antibodies used are antibody # 731 and specific antibody # 733.
  • the mass of the extract of each organ was 150 g, and the recombinant protein DCR1 was 0.1.
  • the table shows the severity of the disease as a blood glucose level and shows the correlation with the tendency of the decrease in the protein DCR1.
  • the reaction mixture (total 2.0 ml) was made up of an 80 mM potassium phosphate solution (pH 7.0 or 6.0), O. lmM NADPH or NADH, a carbonyl substrate and an enzyme (50 z1) (10.1 g or 3.7 zg glomerin B).
  • the oxidation rate of NAD (P) H was measured at 340nm.
  • the enzyme activity limit is determined by oxidizing 1 zniol of NAD (P) H at 25 ° C for 1 minute.
  • Table 1 summarizes the substrate specificity of the protein DCR1 for carbonyl compounds.
  • the activity was measured using lOmM diacetyl, and the specific activity was calculated based on the protein concentration of the protein DCR1 sample (FIG. 7).
  • a cDNA library was prepared from human kidney mRNA.
  • the preparation was performed using a SMART TM PCR Library Construction Kit manufactured by Clontech according to the manual of the kit. Necessary primers, reagents, etc. were also used with the kit.
  • Single-stranded DNA was prepared according to the Kit. After the reaction, the mRNA used for type I was digested and removed with RnaseH (Gibco). Further, agarose gel electrophoresis was performed, and purified using a Sepiaglass band prep kit manufactured by Pharmacia to remove low molecular weight impurities and the like.
  • the LD-PCR was performed under the following conditions using Takara Thermal Cycler MP manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the protein was gradually reduced using phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), and the resulting DNA was recovered by ethanol precipitation. Further, agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1.0%) was performed, and the gel was stained with ethidium gel, and then irradiated with ultraviolet light to cut out a gel containing a target band. Extraction and purification of the DNA fragment from the agarose gel was performed using Sepaglas TM Band PrepKit manufactured by Pharmacia.
  • Primer # 1163 5 '-ccaagcttgaggtgtgtggagggagc-3'
  • the PCR was performed using Takara Thermal Cycler MP manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. under the following conditions.
  • the protein was gradually reduced using phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1), and the resulting DNA was recovered by ethanol precipitation. Furthermore, agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1.0%) was performed, and the gel was stained with ethidium gel. Then, the gel containing the target band was cut out by irradiation with ultraviolet light. Extraction and purification of DNA fragments from agarose gels were performed using the Sepaglas TM Band Prep Kit manufactured by Pharmacia.
  • JM109 strain was transformed by a conventional method. Transformants were used for ampicillin ( ⁇ ) 50 _ ⁇ / ⁇ 1,37. The cells were cultured in C. Create 50 colonies on another master plate, transfer them to a membrane (Amersham Hybond +), hybridize with DIG-labeled 3'-oligonucleotides, select positive clones, and convert them into single colonies. Purified. From there, 10 ml of LB liquid medium containing 50 / g / ml Amp was inoculated, cultured overnight at 37 ° C, and the cells were collected by centrifugation and the recombinant DNA was purified.
  • the nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer manufactured by PE Applied Biosystems, Inc., using the Daiyuichi Mineichiyuichi method. Since the fragment length was as short as about 750 bp, the primer could be used with the general-purpose primers SP6 and T7, so the nucleotide sequence was determined without using the primer-walking method.
  • a new 5 'primer was designed from a portion further upstream from a site corresponding to Metl at the 5' end of the open reading frame (0RF).
  • the purified cDNA was subcloned into a plasmid DNA (Promega, pGEM-T Easy Vector Systems manual (Promega, Printed in USA. Revised 7/79 Part 42 'TECHNICAL
  • transformation of JM109 strain was carried out by a conventional method. Transformants were plated on LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin (Amp) and cultured overnight at 37 ° C. Transfer 20 white colonies to another master plate, transfer them to a membrane, and hybridize with DIG-labeled 3 'oligonucleotides. A positive clone was selected and isolated as a single colony. From there,
  • the cDNA fragment containing the gene hdcrl obtained in Example 6 was amplified by PCR using the following primers. PCR was performed under the conditions described in Example 6.
  • the amplified and purified cDNA fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and BamHI (both from Takara Shuzo). After the cleavage treatment, the DNA was fractionated again by agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 0.75 kb was purified (fragment-1).
  • Fragment-1 and the above-described ring-opening vector were mixed, and the ligation and Escherichia coli K12 strain were transformed under the conditions described in Example 6, and the transformants were further cultured and collected by centrifugation.
  • the recombinant DNA thus constructed was named pTrcHisAhuglB.
  • the medium (L + glucose) consists of the following components (in 11):
  • the pre-culture was carried out by shaking at 37 ° C overnight using a medium obtained by adding 00 g / ml Ampicillin to the above medium (8 ml).
  • the purity is checked by SDS PAGE and then by the Coomassie-bleach method.
  • the amount of protein is determined by the HS Bradford method (Biorad).
  • the molecular weight is about 33kDa,
  • the purity was estimated to be 95% or higher (yield was about 3 mg (E. colil 50 mL medium)).
  • the reaction mixture (total 2.0 ml) was made up of 80 mM potassium phosphate solution (pH 7.0 or 6.0), O.lmM NADPH or NADH, carbyl substrate and enzyme (50 (1) (lOAjug or 3.7 ⁇ ghDCRl). Consists of
  • the oxidation rate of NAD (P) H was measured at 340nm.
  • the limit of the enzyme activity is that 1 mol of NAD (P) H is catalyzed by oxidation at 25 ° C for 1 minute.
  • the measured value is calculated by subtracting the value in the reaction system without adding enzyme for each substrate, and (Diacetyl) Shown as a relative activity to the reducing activity.
  • a dicarbonyl compound represented by diacetyl is an intermediate metabolite in a process in which AGE, which is a causative substance of diabetic complications, is produced from reducing sugars and proteins in the body, and is an extremely reactive compound.
  • the dicarbonyl reductase of the present invention controls the amount of AGE produced by decomposing dicarbonyl compounds, which are intermediate metabolites, and plays an important role in the onset and progression of glycemic complications. It is a presumed enzyme. Therefore, the present invention is considered to be useful for the development of a therapeutic drug for the purpose of suppressing glucose metabolism in diabetic complications, renal failure, AGE generation and the onset of arteriosclerosis associated therewith. It may be used to detoxify dicarbonyl compounds that are precursors of AGE in blood.
  • a screening method for the gene expression regulator and the gene expression regulator can be obtained by the method.
  • a method for screening the protein activity regulator and the protein activity regulator can be obtained by the method.

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Description

明糸田
新規ジカルボニルリダクターゼ、 及びそれをコ一ドする遺伝子 技術分野
本発明は、 ジカルボ二ルリダク夕ーゼ活性を有する新規タンパク質、 及びそれ をコードする遺伝子に関する。 さらに、 本発明は、 該タンパク質に対する抗体、 該遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。 また、 本発明は、 該遺伝 子を用いた AGE生成検出方法、 該夕ンパク質を含むことを特徴とするジカルボ二 ル化合物生成抑制剤、 AGE 生成抑制剤、 該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含 む AGE生成調節剤、 AGE生成調節剤スクリーニング方法に関する。 さらに、 本発 明は、 該遺伝子、 該タンパク質、 該抗体を用いることを特徴とする糖尿病合併症 診断方法に関する。 背景技術
アミノ酸と還元糖が非酵素的に反応して褐変化する反応は、 一般にメイラード 反応と呼ばれる。 生体内でもこの反応は普偏的に生じており、 特に蛋白質上のァ ミノ基がメイラード反応を起こすと、 この反応を契機に脱水、 重合などの複雑な 過程を経て、 特有の黄褐色の物質が形成されることが報告されている。 この物質 は終末糖化物質（ Advanced Glycation Endproduct；以下本明細書中では AGE と する）と呼ばれている。
AGE は糖尿病患者で高濃度に蓄積されることが知られ、 またヘモグロビンゃコ ラーゲンと結合する性質を有していることから、糖尿病合併症である動脈硬化や、 腎不全に見られる線維化、 硬化の原因と考えられている。
また、 係る AGE の生成（グリケ一シヨン） において重要な中間体としてジカル ボニル化合物が示唆されている （Kato，H. ,Hayase，F.，et al : 3-Deoxyglucosone, and Intermediate Product of the Mai Hard Reaction. The Mai Hard Reaction in Aging, Diabetes and Nutrition. (Baynes J.W. , et al eds. )p58-83, Alan R.Liss, New York, 1989)。 発明の開示
本発明は、 （1 )上記糖尿病合併症状の腎不全や動脈硬化を有効に抑制、 治療す るには、 上記 AGE 生成を調節抑制することが有効な手段であり、 （2)AGE 生成を 調節制御し得る物質を見出すことにより、 AGE 生成による糖尿病合併症状を検出 する方法を開発し、 該症状の診断方法や診断試薬を開発し、 また該症状の治療方 法や治療剤を開発することが可能となるとの考えに基づき、 上記 AGEの生成を調 節抑制し得る酵素活性を有する新規タンパク質、 及びそれをコードする遺伝子を 提供するものである。
すなわち、 本発明者らは、 上記考えに基づき鋭意研究し、 マウス腎臓において 特異的に発現している遺伝子であり、 本発明に係る新規タンパク質 （以下、 タン パク質 DCR1という） をコードする遺伝子 （以下遺伝子 dcrlという） を単離し、 その塩基配列ならびにそれにコードされるタンパク質 DCR1 の推定アミノ酸配列 を決定することに成功した。 さらに、 該新規タンパク質 DCR1 が、 ジカルボニル レダク夕ーゼ活性を示すことを見出し本発明の完成に至った。
さらに、 前記遺伝子 dcrl の塩基配列情報に基づき、 ヒト腎臓に存在する同様 の機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を検索した結果、 前記タンパ ク質 DCR1 と同様の活性を示す新規タンパク質 （以下 hDCRl という） をコードす る新規遺伝子 （以下遺伝子 hdcrlという） を単離し、 それがコードされるタンパ ク質 hDCRlの推定ァミノ酸配列を決定することに成功した。
本発明において初めて得られたマウス由来のタンパク質 DCR1 およびヒト由来 の hDCRlのアミノ酸配列は高い相同性 （約 85%) を示し、 また、 これらと既知の マウス肺特異的カルボニルリダクターゼ（ CR )とも約 70%の相同性を有する。
また、 該タンパク質 DCR1、 hDCRlは、 ジァセチルを基質とした際に高い還元活 性を示し、 哺乳動物で初めてクローン化されたジァセチルレダク夕ーゼ活性を有 するものである。
また、 タンパク質 DCR1 は、 腎髄質乳頭部周辺に局在している （マウス組織抗 体染色法）。 また、 その発現は賢特異的 （腎以外の臓器について、 各種臓器抽出 液に対するウエスタンプロット） であり、 かつ糖尿病モデルマウス腎でその発現 が有意に低下するものである。
すなわち、 本発明は、 マウス、 ヒトを含む哺乳類動物由来の新規ジカルボニル レダクターゼ （特に炭素数が 4から 1 0の直鎖アルキル基を有するひ-ジケトン に対して高い還元活性を有するジァセチルレダク夕ーゼを提供するものであり、 また、 特に芳香族性オルトキノンに対して、 高い還元活性を有する。 ここでかか るひ-ジケトンとしては、 ジァセチル、 2、 3-ペンタンジオン、 2、 3-へキサンジ オン、 3、 4-へキサンジオン、 および 2、 3-ヘプタンジオン等が挙げられ、 また 前記芳香族性オルトキノンとしては、 ィサチン、 フエナンスレンキノン、 および ァセナフテンキノン等が挙げられる）、 それをコードする遺伝子、 その抗体、 ァ ンチセンスオリゴヌクレオチド、 また、 該ジカルボ二ルレダクタ一ゼを成分とし て含むジカルボニル化合物生成抑制剤、 AGE 生成抑制剤、 AGE 生成調節剤、 また は、 遺伝子発現調節因子のスクリーニング方法、 遺伝子発現調節因子、 タンパク 質活性調節剤のスクリーニング方法、 タンパク質活性調節剤を提供するものであ る。
また、 本発明は、 以下の（a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子を提供す るものである。
(a)配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつジカルボ二ルリ ダクタ一ゼ活性を有するタンパク質。
さらに、 本発明は、 前記記載の遺伝子とストリンジェン卜な条件下でハイプリ ダイズし、 かつジカルボニルリダクタ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子を提供するものである。
また、 本発明は以下の（a)又は（b)のタンパク質を提供するものである。
(a)配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつジカルボ二ルリ ダクタ一ゼ活性を有するタンパク質。
また、 本発明は前記に記載のタンパク質に対する抗体を提供するものである。 さらに、 本発明は前記いずれかに記載の遺伝子のアンチセンス鎖の全部又は一 部の配列を有し、 かつ 3.に記載のタンパク質の生合成を阻害するアンチセンス オリゴヌクレオチドを提供するものである。
また、 本発明は、 前記記載のタンパク質を含むことを特徴とするジカルボニル 化合物生成抑制剤を提供するものである。
また、 本発明は、 前記記載のタンパク質を含むことを特徴とする AGE生成抑制剤 を提供するものである。
また、 本発明は前記記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む AGE生成調 節剤を提供するものである。
さらに、 本発明は前記記載の遺伝子の少なくとも一部を用いた前記遺伝子発現 調節因子のスクリーニング方法、 及び該方法により得られる前記遺伝子発現調節 因子を提供するものである。
さらに、 本発明は前記記載の夕ンパク質の少なくとも一部を用いた前記夕ンパ ク質活性調節剤のスクリーニング方法、 および該方法により得られる前記タンパ ク質活性調節剤を提供するものである。
以下、 発明の実施の形態に即して詳しく説明する。 ここで、 遺伝子については、 天然に存在する mR N Aからの逆転写により得た D N A (該 D N Aを増幅して得 られる D N Aを含む） を表す場合、 その意味を明確するときは c D N Aと称す る
なお、 本明細書において、 以下の省略語を必要により使用する, 五
JJ IN A ァ； ¾ ヤンリ不核酸
A ,·ァニノ
し ン 卜ンノ
f
J クノ ノ
1 ナ^ン
A丄 £L (A; ノ フーノ
A r g (R) ノ7ノレ ——ノ
A s n (N) ァスノ ラ ン
As p (D ) ァスノヽフ ="ン酸
し y s (し）
丄 n (Q) クノレタ ノ
CJ丄 U ） クノレタ ノ酸
(CJ) ク リンノ
rl 1 S (H) ヒスナンノ
l i e (丄 ) イ ソ Dイ ンノ
L Θ 11 i-> ) 口つ ンノ
L y s 、）
リンノ
Me t (M) メチォニン
Phe (F) フエ二ルァラニン
Pr o (P) プロリン
S e r (S) セリン
Thr (T) スレオニン
T r p (W) トリプトファン T y r ( Y) チロシン
V a 1 (V ) パリン 図面の簡単な説明
図 1は、 タンパク質 hDCRl (ヒト由来、上）のアミノ酸配列と、 タンパク質 DCR1
(マウス由来、 下） のアミノ酸配列の比較を示す図である。
図 2は、 タンパク質 DCR1 のアミノ酸配列と肺特異的カルボ二ルリダク夕ーゼ (CR)のアミノ酸配列の類似性 （マウス） を示す図である。 ここで上段はタンパク 質 DCR1、 下段はカルボニルリダクタ一ゼを示す。 下線部は抗体作成に使用した ペプチド配列を示す。
図 3は、 タンパク質 hDCRl (ヒト由来、 上） と、 タンパク質 DCR1 (マウス由来、 中） と、 マウスカルボニルリダクタ一ゼ（CR、 下）の、 基質認識部位アミノ酸配列 の類似性を示す図である。 図中矢印は、 基質との疎水性相互作用に本質的なアミ ノ酸残基を示す。
図 4は、 組替えタンパク質 DCR1 のァフィ二ティー精製結果を示す電気泳動写 真である。
図 5は、 正常マウスの主要臓器中タンパク質 DCR1 発現量を、 ウエスタンプロ ット法で測定した結果を示す電気泳動写真である。
図 6は、 病態モデルマウス腎臓抽出液と正常マウスとのタンパク質 DCR1 発現 量の比較をウェスタンブロット法にて行った結果を示す電気泳動写真である。 図 7は、 ジァセチルを基質に用いたタンパク質 DCR1 によるジカルボニルリダ クターゼ活性の pH依存性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
(遺伝子 dcrlのクローニング）
本発明に係る遺伝子 dcrlは以下の操作により得る事が可能である。 すなわち、 遺伝子 （dcrl ) は、 腎由来の cDNA ライブラリーから、 該遺伝子を 含む cDNA断片として単離することができる。ここで、本発明者らが使用した cDNA ライブラリ一は、 腎臓の糸球体を中心とした腎組織から調製したものである。 上述の cDNA ライブラリーにおいて、 腎組織で特異的に発現している遺伝子を 有すると思われる cDNA を識別する方法として、 大久保らの方法（Okubo et al .， Nature Genet. , 2， 173( 1992) )に準じ、 遺伝子発現の出現頻度を解析する方法 を用いることができる。 具体的には、 （1 ) 腎由来の mRNAを铸型とし、 適当な制 限酵素で開環させたベクタープラスミ ドの一端にオリゴ dT を結合させたものを プライマ一として cDNA合成を行い、 後、 制限酵素 Mbol と制限酵素 BamHIで切断 する。
当該べクタ一は dam メチラ一ゼ陽性の大腸菌を宿主として調製されるため、 Mbol の認識配列である 「GATC」 の A残基がメチル化されている。 従って、 Mbol は新たに合成された cDNA部分のみを切断する。 当該べクタ一はオリゴ dTを結合 させた末端とは反対側の末端近傍に BamHI切断部位を 1箇所だけ有しているので 本酵素は当該ベクターを 1箇所切断し、 さらに新たに合成された cDNA部分にも し BamHI認識配列が存在すれば、 その部位も切断する。 BamHI と Mbolは 「GATC」 なる配列からなる、 同一の付着端を生ぜしめるため、 両酵素で切断した後、 DNA リガーゼを作用させれば、 プラスミ ドを閉環することができる。
(2) このようにして調製したプラスミ ドを用いて大腸菌を形質転換することに より cDNAライブラリーを構築する。
従って、 当該ライブラリ一は各 mRNAの 3'端のポリ A部位から、 その 5'側部分 のうち最初に GATCなる塩基配列が出現する部位までの領域を含んでいる。
(3 ) 得られた cDNAライブラリ一から無作為に適当個数の組換体を選択し、 各組 換体中の cDNAを抽出してその全塩基配列を決定する。
このようにして決定された特定配列を有する cDNA 断片が、 無作為に選択され た組換体の中から幾つ確認されるかをもって、 臓器特異的遺伝子及び高発現遺伝 子を識別する。
本法において、 組換体 cDNAの抽出並びに cDNAの塩基配列の決定は、 いずれも 当業者にとって自体公知の各種操作方法（Molecular Cloning, 2nd. ed.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 に記載の方法、 又はその他当業者にとって標 準的な方法を紹介した技術解説書に記載の方法、 以下常法とする）により行うこ とができる。
なお、 高発現遺伝子を識別する方法では、 無作為に選択する組換体の総数は数 百から千程度が適当であるが、 必要ならばそれ以上の個数の組換体を処理する。 具体的には、 以下の実施例で示したように、 適当な数の組換体中の cDNA 断片 の塩基配列を全て決定し、 その中から、 同一の配列を有する cDNA としての出現 頻度がある値以上であった cDNA 断片を、 腎で特異的に発現している遺伝子を有 する DNA断片の候補として選別した。
(4) 上記 cDNA断片は前述したとおり、 mRNAの 3'端の一部の領域を含むもので あり、当該領域（以下 3'断片）の塩基配列情報を元にして以下の様に、全鎖長 cDNA を取得する。 すなわち、 腎 cDNAライブラリーを铸型とし、 上記 3'断片内の配列 を有する適当な長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、 これらをプライマ —として PCR法を用いて、 増幅することができる。
これはまた、 上記 3'断片をプロ一ブとして、 上記腎 cDNAライブラリーをコロ ニーハイプリダイゼーシヨン又はプラークハイブリダイゼ一シヨンで、 常法に従 つてスクリ一ニングすることにより行うことができる。
上記方法により増幅した cDNA 断片は、 常法に従って適当なベクタ一 （例えば ノバジヱン社から市販されている pT7BlueT—ベクタ一） に組み込み、 全塩基配 列を決定することができる。
この際、 組換え DNAを独立に 2クローン取得して、 それぞれの cDNA断片の塩 基配列を決定することにより、 配列の確認を行うことが可能である。 得られる遺 伝子 dcrlの塩基配列は配列表の配列番号 1に記載されたものである。 (遺伝子 hdcrlのクロ一二ング）
前記マウスを用いて決定された塩基配列情報を （使用コドンを考慮して） 利用 することにより、 異種の生物からも、 同様の作用を有するジカルボ二ルリダク夕 ーゼをコードする遺伝子を、 該塩基配列から推定されるアミノ酸配列に従って合 成されたプローブを用いるコロニーハイブリダィゼーシヨンまたはサザンプロヅ トハイプリダイゼ一シヨンにより、 または該情報により合成されたプライマ一を 用いるポリメラ一ゼ連鎖反応 ( PCR )により、 単離可能である。
すなわち、 ヒト腎臓 mRNAを用いて、 通常の方法に従い、 cDNAライブラリを調 製し、 適当なプラスミ ドにサブクローニングし、 塩基配列を決定することができ る。
得られた遺伝子 hdcrlの塩基配列は配列表の配列番号 3に記載されたものである。 さらに本発明は、 上記得られた塩基配列 dcrl、 または hdcrlを含む DNA配列、 該配列またはそれらから誘導される断片と標準的条件下でハイブリダィズする DNA配列、 および遺伝子コ一ドの縮退という理由により上記 DNA配列と標準的条 件下でハイブリダイズはしないが全く同じアミノ酸配列を有するポリぺプチドを コードする DNA配列をも含むものである。ここで、ハイプリダイゼーシヨンの「標 準的条件」 とは、 特異的ハイブリダィゼーシヨンシグナルを検出するのに当業者 により一般的に使用され、 かつ例えばサムブルック（Sambrook)ら （分子クロー二 ング (MolecularCloning) , Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第 2版、 1989)により述べられている条件、 好ましくは、 当業者に公知のサムブ ルック（Sambrook)らにより述べられたいわゆるストリンジェントハイブリダイゼ —シヨン-非ストリンジェント洗浄条件、 より好ましくはいわゆるストリンジェ ントハイブリダィゼーシヨン-ストリンジェント洗浄条件を意味する。
(組織分布の検出）
上記得られた遺伝子の全部、 又はその一部の塩基配列を用いてプローブを調製 し、 該遺伝子が発現している組織分布を検出することが可能である。 例えば前記 プローブを通常公知の標識手段により標識し、 公知のノーザンブロット法により 実施することが可能である。 また、 特定の標準物を用いることにより、 特定の組 織に発現している遺伝子を定量することも可能となる。
従って、 該遺伝子の発現を検出することにより、 ジカルボ二ルリダク夕一ゼ活 性を確認することが可能となる。 また、 該活性が AGE生成調節、 抑制と関連する 場合には、 係る遺伝子を検出定量することは AGE生成調節、 抑制の検出方法を提 供することになる。
同様に、 上記遺伝子の発現の定量化により、 AGE 生成調節、 又は抑制剤の効果 を確認する方法をも提供するものである。 この場合、 AGE 生成調節、 又は抑制剤 の投与の有無、 または該投与後の特定の時間内の遺伝子発現量の変化を確認する ことで可能となる。
具体的には、 上記方法によって選別した cDNA 断片中に存在すると思われる遺 伝子が、 腎組織で特異的に発現していることの確認は、 該 cDNA配列の臓器特異 的な発現頻度をウエスタンハイプリダイゼーシヨンで確認することで行うことが できる。 すなわち、 各臓器の粗抽出液を調製し、 SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳 動（SDS- PAGE)を行って、 ゲル上のタンパク質をメンブレンフィル夕一に転写した 後、 抗ペプチド抗体をプローブとして、 常法に従ってハイブリダィゼーシヨンを 行うものである。以下の実施例で示すようにここで説明した方法を用い、 該 cDNA 配列の発現についての臓器特異性を調べ、 腎組織で特異的に発現していることを 確認可能である。
(タンパク質 DCR1、 および hDCRl )
上記の方法により、 遺伝子 dcrl、 および hdcrl を取得し、 係る遺伝子の塩基 配列情報からその遺伝子がコードするタンパク質のァミノ酸配列を導くことが可 能となる。すなわち、本発明に係る新規遺伝子によりコードされるタンパク質は、 それそれ配列表の配列番号 2および 4に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質で ある。夕ンパク質 DCR1および hDCRlのァミノ酸配列は高い相同性を示す（図 1 )。 図 2には、 得られたタンパク質 DCR1 のアミノ酸配列とマウス肺カルボ二ルリ ダクターゼ（CR)のアミノ酸配列の類似性を示す。 約 70%の高い類似性が認められ る。 また、 下線は以下で説明する抗ペプチド抗体を作成するために使用した配列 (上が #731で、 下が #733である） を示す。
さらに、 図 3には、 マウス由来 DCR1、 ヒト由来 hDCRl、 およびマウス由来カル ボニルリダク夕一ゼの基質認識部位におけるァミノ酸配列が比較されている。 また、 本発明に係るタンパク質は、 配列表の配列番号 2若しくは 4に記載のァ ミノ酸配列のみに限定されることはなく、その 1又は 2以上のアミノ酸を置換し、 欠失又は付加したものであって、 かつジカルポニルリダクターゼ活性を有するも の （変異体タンパク質） が含まれる。
従って、 本発明に係るジカルボニルリダクターゼ活性を有するタンパク質をコ —ドする遺伝子 （ポリヌクレオチド） の具体例としては、 配列表の配列番号の 1 に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、 自然、 又は人工の変異 によりポリヌクレオチドの構造の一部を、 該ポリヌクレオチドがコードするポリ ペプチドの主たる機能であるジカルボ二ルリダク夕一ゼ活性に変化を与えること なく変化させたもの （変異体遺伝子） も含まれる。
係る人工変異の導入は、 常法により行うことができる。
また、 遺伝暗号の縮重により、 該遺伝子の塩基配列の少なくとも一部の塩基を 他の種類の塩基に置換して得られる遺伝子によっても同一のアミノ酸配列を有す るタンパク質を得ることができる。 したがって、 本発明に係るタンパク質をコー ドする遺伝子とは、 本発明に係るタンパク質及びその変異体タンパク質をコード しうる全ての縮重のパターンを含むものである。
本発明に係るタンパク質 （変異体タンパク質も含む） を得る方法は特に制限は ない。 具体的には、 蛋白合成装置等による人工的なペプチド合成方法、 または本 発明で得られた該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて遺伝 子工学的方法によりタンパク質を発現させる種々の方法が挙げられる。 この際該 タンパク質は単独でもまた MBP(Maltose Binding Protein)等との融合タンパク 質として発現してもよいし、 FLAG ペプチドのような Tag を付加して発現させて もよい。 また遺伝子工学的方法は、 大腸菌などの細菌によって、 あるいは酵母に よってあるいは動物細胞や昆虫細胞を用いて調製することを可能とするものであ る。
具体例として、 適当なベクター及び宿主を選択し、 遺伝子を導入して形質転換 体を得る方法が挙げられる （例えば、 Molecular Cloning (Sambrook' et al .， eds. )1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York に記載の方法に より可能である）。 さらに、 得られた形質転換体を培養し、 遺伝子の増幅、 発現 を行い目的タンパク質を発現させることが可能である。
次に培養物を回収し、 必要に応じて濃縮、 可溶化、 透析、 各種クロマトグラフ ィ一等の操作を行うことにより、 本発明のタンパク質及びその変異体タンパク質 を得ることが可能である。
形質転換体の培養については、各種の教科書があり、例えば、 Molecular Cloning (Sambrook, et al . , eds. )1989 Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York に記載の方法で行うことが可能である。 本発明に記載の塩基配列に基づいて目的 とするタンパク質 （変異体タンパク質を含む） を発現させることも、 公知の方法 により可能である。
このとき、 宿主としては、 大腸菌等の細菌、 酵母、 動物細胞のいずれも使用可能 であるが、 特には動物細胞が好ましい。 細胞に遺伝子を導入するには、 リポソ一 ム法、 エレクト口ポーレーシヨン法等を用いることができる。 特に、 D E A E— デキストラン法 （フアルマシア社製） を用いることが好ましい。
得られた培養物からタンパク質を精製する精製方法には、免疫沈降法、塩析法、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲル濾過法、 電気泳動法、 イオン交換クロマトグラ フィ一、 疎水性クロマトグラフィ一や抗体クロマトグラフィ一等の各種ァフィ二 ティークロマトグラフィー、 クロマトフォーカシング法、 吸着クロマトグラフィ 一法及び逆相クロマトグラフィ一等があり、 適宜選択して行うことは当業者にと り容易である。
また、 製造段階において、 製造する目的タンパク質は、 他のポリペプチドとの 融合ペプチドとして形質転換体に生産させてもよい。 必要に応じて、 精製工程に おいて、 ブロムシアン等の化学物質やプロテア一ゼ等の酵素で処理して、 該目的 夕ンパク質を切り出す操作を行えばよい。
(抗体）
本発明に係るタンパク質 （上で説明した変異体タンパク質を含む） の全部又は 一部のタンパク質に対する抗体を得る方法は、通常公知の方法により可能である。 また、 本発明に係る抗体とは、 本発明のタンパク質 （その変異体） と反応する限 り、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれも含むものである。 また、 その活性フラグメント及びその活性フラグメントを含むキメラ抗体も含まれる。 抗体、 すなわち免疫グロブリンは、 H鎖と L鎖を持ち、 物理化学的性質や免疫 学的性質から 5つのクラス （IgA、 IgD、 IgE、 IgG、 IgM) に分けられる。 このう ち、 IgA、 IgG は H鎖のタイプによってさらにサブクラスに分けられる。 本発明 の新規抗体は、 これらの全てのクラス、 サブクラスに属するものを含む。
さらに、 本発明の抗体は、 必ずしも抗体分子全体を用いる必要はなく、 活性を 有する限り、 分子の一部 （活性フラクメント） を用いることができる。 活性フラ グメントとしては、 具体的には F ( a b，） 2 、 F a b，、 F a b , F v、 組み 換え F v体及び一本鎖 F vを挙げることができる。 例えば、 ペプシンで分解する と F ( a b，） 2、 F c，が得られ、 パパインで分解すると F a b、 F cが得られ る。
これらの活性フラグメントは、 単独でも用いられるが、 必要に応じて、 アルブ ミン、 ポリエチレングリコール等の物質と結合させ、 新たな複合物として用いる ことができる。 このような複合物は、 一般に、 生体内では、 長時間分解されずに その効果を最大限まで発揮することが多い。 活性フラグメントに、 アルブミン、 ポリエチレングリコール等の物質を付加する方法は、 例えば、 『Ant i b o d i Θ s , A L ab o r at o r y Manua l』 (C o l d S p r i n H Θ r b e r Lab o r at o ry, 1 988) p. 77— 8 1、 p 1 29 - 1 37に記載されている。 一般的には、 SPDP (フアルマシア社製）、 SMP B (ピアス社製)、 EMCS (ド一タイ ト社製）等の 2価反応性試薬を用いれば、 活性フラグメントをアルブミン等と容易に結合させることができる。
本発明の抗体作成方法としては、 例えば、 「免疫実験操作法」（日本免疫学会編、 日本免疫学会発行） を参考にすることができる。 免疫抗原としては本発明のタン パク質の一部、 すなわち配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 又は変異体 タンパク質のアミノ酸配列のうちの連続する 8個以上のアミノ酸からなるポリぺ プチドであればよい。 また、 それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであれ ば、 該タンパク質が得られた方法は問わない。
また、 免疫抗原が、 8ないし約 20個のアミノ酸からなるポリペプチドである 場合には、 それをキ一ホールリンペットへモシァニン （KLH) 等のキャリアと 結合させて抗原として使用すればよい。
該免疫抗原を免疫する動物はヒト以外のいずれでもよく、 通常当業者で使用さ れる動物から目的の抗体を産生し得る動物種を選択して使用することが好ましい ポリクロ一ナル抗体は、 得られた抗血清を精製することによって得られる。 精 製は、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ 一等の方法を組み合わせて行えばよい。
モノクローナル抗体は、 通常のハイプリ ドーマを作製する方法によって融合細 胞を得た後、 該細胞に抗体を産生させることにより得られる。 細胞融合には、 ポ リエチレングリコール、 センダイウィルス、 電気パルス等を用いる手法が使用可 能である。
また、 上記以外に、 遺伝子工学的な方法を用いても該モノクローナル抗体が得 られうる。 例えば、 本発明のタンパク質又はその一部で免疫した動物の脾細胞、 リンパ球又は該モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマから m R N Aを採 取し、 これをもとに c D N Aライブラリーを作製する。 次に、 該 c D N Aライブ ラリーにより抗体を発現させる。 抗原と反応する抗体を産生するクローンをスク リーニングにより c D N Aライブラリ一から得、 得られたクローンを培養し、 培 養混合物から目的とする抗体を、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ 二ティーク口マトグラフィ一等の方法を組み合わせて精製することができる。 特に用いる材料が病理組織の場合には、 例えば上記プロ一ブを用いた in situ hybridization法を用いることができる。 また本発明に係わる抗体を用いた A B C組織染色法を用いることができる。
(アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明にて得られる上記遺伝子に基づくアンチセンスポリ （又はオリゴ） ヌク レオチドには、 塩基、 リン酸、 糖からなるヌクレオチドが複数結合したものが、 天然には存在しないものを含めて全て含まれる。 その代表的なものは、 D N Aと m R N Aである。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘導体には、 その立体構造や機 能がポリヌクレオチドと類似するものが全て含まれる。 例えば、 ポリヌクレオチ ドの 3 '末端もしくは 5 '末端に他の物質が結合したものやポリヌクレオチドの塩 基、 糖、 リン酸の少なくともいずれか一部において、 置換や欠失や付加の修飾が 生じた物質、 天然に存在しないような塩基、 糖、 リン酸を有するものや、 糖—リ ン酸骨格以外の骨格を有するものである。
該アンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、 本発明に係る遺伝子及び その変異体遺伝子のいかなる部分にハイブリダィズするものであってもよい。 また、 該アンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体は、 組織や細胞におけ る本発明に係るタンパク質又はその変異体をコ一ドする遺伝子の存在やその発現 状況を調べるための研究用ポリヌクレオチドプローブとして、 使用可能である。 また、 診断用ポリヌクレオチドプローブとしても使用可能である。 なお、 プロ一 ブとしては、 12塩基以上且つ GC含有率が 30ないし 70%であるものが好ま しく、 16塩基以上且つ GC含有率が 30ないし 70%であるものが、 特に好ま しい。
また、 該アンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体を使用して、 本発明に 係るタンパク質 （その変異体を含む） の発現を調節することが可能である。 これ らは上記タンパク質をコ一ドする遺伝子もしくは mRN Aにハイブリダィズして 係るタンパク質の発現を抑制することが期待されるので、 係るタンパク質が関与 する疾患の治療薬として使用可能である。 すなわち、 該アンチセンスポリヌクレ ォチドやその誘導体よりアンチセンス医薬品を開発することが可能である。 一般に、 ポリペプチドをコードする DNAや mRNAの相補的な塩基配列を含 むポリヌクレオチドを使用して、 該ポリペプチドの発現を調節する方法は、 アン チセンス法と呼ばれている。 相補的な配列を有するポリヌクレオチドは、 ①遺伝 子から p r e一 mRNAへの転写段階、 ② p r e—mRN Aから成熟 mRN Aへ のプロセッシング段階、 ③核膜通過段階、 ④蛋白への翻訳段階のいずれかで、 遺 伝情報を担う DN A又は mRN Aに結合し、 遺伝情報の伝達の正常な流れに影響 を与えてポリぺプチドの発現を調節すると考えられている。
一般的には、 15塩基以上の塩基を含む塩基配列であれば特異性のある配列で あると考えられている。 従って、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びァ ンチセンスポリヌクレオチド誘導体も、 本発明に係るタンパク質及びその変異体 に対する mRNAに相補的な塩基配列であって 15塩基以上からなる塩基配列を 含むものであれば、 本発明に係る遺伝子もしくは本発明に係る遺伝子に対する m RN Aに特異的に結合することが推定される。
一方、 ポリヌクレオチドを細胞内に取り込ませるには、 その長さはあまりに長 すぎても不適当である。 本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びその誘導体 は、 いかなる長さのものであってもよいが、 本発明のアンチセンスポリヌクレオ チドおよびアンチセンスポリヌクレオチド誘導体を細胞内に取り込ませ、 夕ンパ ク質の発現を調節させることを考慮すると、 前記アンチセンスポリヌクレオチド 及びこれらアンチセンスポリヌクレオチドの誘導体は遺伝子 dcrl に対する m R N Aに相補的な 1 5塩基以上 3 0塩基以下、 好ましくは 1 5塩基以上 2 5塩基以 下、 より好ましくは 1 8塩基以上 2 2塩基以下の塩基数から成る塩基配列を有す るものが好ましい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド及びアンチセンスヌクレオチド誘導体 においても、 公知のアンチセンス技術を用いて、 ポリヌクレオチドの医薬品とし ての効果を高めることを目的として様々な誘導体、 即ち、 目的の D N Aや m R N Aとの結合力、 組織選択性、 細胞透過性、 ヌクレアーゼ耐性、 細胞内安定性の高 い様々なポリヌクレオチド誘導体が得られうる。
ハイブリダィズのし易さの点では、 一般的には、 ステムループを形成している 領域の塩基配列に相補的な塩基配列を持つポリヌクレオチド又はポリヌクレオチ ド誘導体を設計するとよいとされている。 本発明のポリヌクレオチド及びその誘 導体は、 必要に応じ、 ステムループを形成することが可能である。
また、 翻訳開始コドン付近、 リボソーム結合部位、 キヤッビング部位、 スプラ イス部位の配列に相補的な配列を有するようなポリヌクレオチドは、 一般に高い 発現抑制効果が期待できる。 したがって、 本発明のポリヌクレオチド又はポリヌ クレオチド誘導体であって、 本発明に係るタンパク質又はその変異体をコードす る遺伝子又は該遺伝子に対する m R N Aの翻訳開始コドン付近、 リボソーム結合 部位、 キヤッビング部位、 スプライス部位の相補的な配列を含むものは、 高い発 現抑制効果が期待される。
現在一般に知られている誘導体は、 ヌクレア一ゼ耐性、 組織選択性、 細胞透過 性、 結合力の少なくとも 1つが高められた誘導体であることが好ましく、 特に好 ましくは、 当該ポリヌクレオチド誘導体は、 フォスフォロチォェ一ト結合 (Ant 1 sense- From Technology to Therapy (Schl ingen siepen, et al . , eds) 1997 Black el l Science, Berl in-Vienna 参照） を骨格構造として有する誘導体であ ることが示されている。 本発明のポリヌクレオチド及びその誘導体についても、 これらの機能又は構造を有する誘導体が含まれる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド誘導体の製造方法については、例えば、
『土： Q Ant l s ens e Re s e ar ch and App l i c at i ons』 （Michael J. GAIT, p290- 299， CRC出版， フロリダ， 1993年） に記載の 方法を用いることが可能である。
例えば、天然型の DNAや RNAであれば、化学合成機を使用して合成したり、 本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子を铸型とする P CR法により本発明 のアンチセンスポリヌクレオチドを得ることができる。 また、 メチルフォスフォ ネート型やフォスフォロチォエート型等、 誘導体の中には、 化学合成機（例えば、 パーキンエルマ一ジャパン社製 394型） を使用して合成できるものもある。 こ の場合には、 化学合成機に添付されている説明書にしたがって操作を行い、 得ら れた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いた HP L C法により精製するこ とによっても、 目的のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を得ること ができる。
(ジ力ルポニルリダク夕ーゼ活性）
酵素活性測定方法は、 特に制限されないが、 マウスのカルボ二ルリダク夕ーゼ (CR)活性測定方法に準じて行うことが可能である（Eur.J.Biochem. 228, 381- 387(1995))。 酵素は、 発現させたリコンビナント酵素を使用した。
(a)基質特異性：基質特異性を調べるためには、 種々のケトン基、 アルデヒド基、 エステル基を有する、 炭化水素系、 または芳香族性の化合物が使用可能である。 特に本発明において、 基質特異性を検討するために好ましく使用され得るものと しては下表 1に示した化合物が挙げられる。 表には、 ラットおよびヒト由来の酵 素の基質特異性につき得られた結果を示す。 ここで、 Cは基質濃度 （ M) を、 RA はジァセチルを基準 100 とした場合の相対活性 (％)を、 Kmは、 pH7.0で測定した 結果を mMでそれぞれ示す。 (表 1 ) (基質スクリーニング結果） マウス ヒ 卜 し C RA (Km) 首哲 (o/\
S負 (/ M) (%) (m ) lEi^s /T - "~h II 十'― II ：宙ル
ひ ンノ〕ノレ 一ノレ 口
-com pounds
Acetoal dehyae 0, uuu
Glycol aldehyde jUUU u.y 未測定
Gl yoxal 0 , uuu U 未測定
Co-compounds
Methylglyoxal 0, UUU / .y 5,000 20
Methylglyoxal 1 , UUU .o 未測定
Phenyl gl yxoal 1 UUU 1,000 35
Acetol I UUU U. o 未測定
Di hydroxyacetone UUU I 未測定
Pyruvic acid 0 UUU υ 未測定
Pyruvi c aci d methyl ester I , UUU Δ . 1,000 46 ryruvi c aci α e tny ι ester I , UUU Οϋ . L 1,000 33
Phenylpyruvic acid 1,000 0.5 未測定
1-Propanal 5 000 0.5 未測定
DL-Glyceraldehyde 5,000 40 5,000 25
DL-Glyceraldehyde 1,000 10.4 未測定
D-Lactoaldehyde 1,000 0.6 未測定
C4 - compounds
Di acetyl ( 2 3-butanedione) 1,000 100 1,000 100 (0.25) 1 , 4-di bromo-2， 3-butanedione 未測定 1,000 133 (0.016)
1- Phenyl-1 ,2-propanedione 1,000 148 1,000 65
Acetoin 5,000 7.4 5,000 13
2- Butanone 5,000 0 未測定
Propiophenone 1,000 0 未測定
Methyl acetoacetate 1,000 0.2 未測定
Ethyl acetoacetate 1,000 0 未測定
Ethyl benzoyl acetoacetate 1,000 0 未測定
C5 - compounds
2,3-Pentanedione 1,000 163 1.000 167 (0.26) 2,4-Pentanedione 1,000 0 1,000 0
Dimethyl -2-oxoglutarate 未測定 2,000 63
Phenyl -2-butanone 1,000 0.2 未測定
Phenyl -1 , 3-butanedione 1,000 0 未測定
C6 - compounds
2.3- Hexanedione 1,000 108 1.000 168 (0.24)
3.4- Hexanedione 1,000 232 1,000 170 (0.12)
2.5- Hexanedione 1,000 0 未測定
C7以上
2,3-Heptanedione 1,000 134 1,000 174
Benzil 100 0 未測定
その他のジカルボニル化合物及びカルボニル化合物
Qui nones
1,2-Naphtoquinone* 20 47 未測定
Isatin 400 106.7 500 252 simpnorqu ι nunc u
rnenan^nrene u one 0 on 101
1 .0 IOI
ACBiidpn tnenequ 1 none 1 A 1 1 I O Q1 nenaai one Λ
I xanii I\ J \ UU u . t i 1n unu Λ u
0 Ketones
1 2 - Cycl ohexanedione 1 UUU 1
I UUU Li
1 4- Cycl ohexanecl i one 1 uuu u ： 禾 /則定
2 - Cycl ohexen-1 -one 1 , UUU 1. 术》則定
Daunorubicin OUU 1.1 oUU U
ID 1 -Pneny 1 - Ί -i ndanedione 4UU U.
Figure imgf000023_0001
Benzal acetone oUU U 未/則定
Naloxone 1 UUU U 禾 /則定
Acetohexamide 1 1 UUU U ι ι 禾 /則疋 l-Indanone I , UUU U
丄 4 - Benzoyl pyridi ne ί l , uuu y
4 - Ni troacetophenone 1 U 1 UUU U
Al edehydes
4- Ni trobenzal dehyde I UUU 0.0 I , uuu oy
3 - Ni trobenzal dehyde , UUU O. 禾 /則 on 2 - Ni trobenzal dehyde I , OUU o y I uuu yy ryndi ne-o-a 1 dehyde 1 UUU 4 1 , UUU H
Pyn ai ne- 4 - dehyde 0, UUU I o. / I , UUU L I
Indol ecarboal dehyde 1,000 0 未測定
1-Nonanal 50 0.005 未測定
25 1-Nonenal 50 0.01 未測定
4-Hydroxynonenal 50 0.01 未測定 Suger deri atives
2- Ketogulonate 1,000 0 未測定 Dehydroascorbic acid 500 0 未測定 α-Ketoglutaric acid 1,000 0 未測定
3- Deoxygl ucosone** 2,000 0.4 2,000 5 D-Glucuronate 1,000 0 未測定 D-Gl ucose 200,000 0 未測定
Steroids, prostagl andi nes
17 a -hydroxyprogesterone 20 0.0 50
5 yS -Androstane-3, 17-di one 20 0.0
5 β - Pregnane - 3 , 20 - di one 20 0.0
5 a -Androstane-3, 17-di one 20 0.0 50 0 Tetrahydrocorticosterine 20 0.0
5 -DHT 未測定 50
5 β -di hydrocorti sone 未測定 20 Cortisol -21 -al 20 0.0
Corticosterone-21 -al 20 0.0
Corticosterone 未測定 50 PGE2 1,000 0.0
さらに、 マウスの酵素であって主な基質に対する速度定数を以下の表 2に示し †こ。 3,4-HExanedione 1-phenyl-l , 2-propanedione は、 最も小さな Km値で高レヽ 触媒効率 (Vmax/Km)を与える良好な基質である。
(表 2 )
Figure imgf000025_0001
さらに、 マウス CDR1 の場合の酵素反応への阻害物の評価を行い以下表 3に示 す結果を得た。 ここで、 使用した酵素はマウス CDR1と、 hamster l iver diacetyl reductase(Hamster DR) とを用いた。
：表 3 )
Figure imgf000026_0001
得られた基質の反応性 （表 1、 表 2、 および表 3 ) から、 本発明にかかるジカ ルポ二ルリダクテアーゼは以下の特徴を有するものと認められる。
( 1 )本発明にかかる酵素は、 その補酵素特異性、 pH依存性および基質特異性は哺 乳動物 （ハムスター） 組織の diacetyl reductase と類似する。 微生物の diacetylreductase とも基質特異性が類似しているが、 微生物の酵素は NADH依 存である。
(2)炭素数が 4から 1 0の直鎖アルキル基を有するひ-ジケトン、特にジァセチル、 1，4-ジブロモ- 2，3 -ブタンジオン、 1-フエニル- 1, 2-プロパンジオン、 2，3-ペン夕 ンジオン、 2, 3-へキサンジオン、 3，4-へキサンジオン、 および 2，3-ヘプタンジ オンに対して強い反応性を有する。
(3)芳香族性オルトキノン、 特にィサチン、 フエナンスレンキノン、 およびァセ ナフテンキノンに対して強い反応性を有する。
(4)ピルビン酸エステル （メチル、 ェチル）、 DL-グリセルアルデヒド、 ジメチル- 2-ォキソグル夕レートに対しても反応性を有する。
(5)その他、 多くの基質が弱いが反応性を示す。 (6 ) 至適 pH : DCRl、 hDCRl は、 pHプロファイルからは pH 6 (さらには 5) 以下 にピークがあると考えられる。 ただし、 基質の 1つである NADPHが pH5以下では 分解することから、 NADPH を用いた場合にはその範囲では活性測定ができず、 ピ —クの確認ができない。 従って、 実施例においては pH7付近で行ったが、 至適 pH としては 7付近に限られることはない。
(7) pH安定性：例えば DCR1、 hDCRlを様々な pH値の緩衝液中 3時間、 25°Cでィ ンキュペートした後にその残存活性を測定し、 pH 8.0 でインキュベートしなか つた値に対する相対活性として比較する。
(8) 金属イオンおよび阻害剤の影響：種々の金属及び阻害剤により酵素を処理 した後の残存活性により評価した。 MgCl 2 と CaCl 2はほぼ酵素に対して無影響 であった。 また、 マウスへ水銀やシスブラチンを与えた場合、 DCR1 の発現量が 増加した。
( 9) 分子量とサブユニット ：精製された DCR1、 および hDCRl ((His)-tag付き） は、 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（SDS-PAGE)での計 測によると、 ともに分子量約 33kDaあった。
(応用例）
上で一般的に説明したように、 本発明に係る遺伝子及びそれがコードするタン パク質、 また、 それらの変異体の全部又は一部を利用して、 糖尿病合併症の診断、 治療、 その他の種々の応用が可能となるが、 以下にその具体的応用例のいくつか を詳細に説明する。
( 1 )本発明に係る遺伝子を検出し、 その量を定量することで、 グリケ一シヨンに おけるジカルポニル化合物の分解の活性を推定可能となる。
(2)本発明に係るタンパク質は、 グリケ一シヨンにおいてジカルボニル化合物を 直接に分解可能であり、 係る酵素を成分として含む医薬品は、 ジカルボニル化合 物の生成を抑制し、 従って、 AGE の生成を阻害若しくは抑制し、 AGE 由来の糖尿 病合併症を治療する治療剤を提供することが可能となる。 (3)本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ジカルボ二ルリダク夕一 ゼの活性を制御可能とし、 従って、 グリケーシヨンにおいてジカルボニル化合物 の分解活性を制御可能とし、 AGE 生成の調節剤を提供することが可能となる。 同 様に、 AGE生成調節剤のスクリーニング方法を提供するものである。
(4)また、 本発明にかかる遺伝子を検出し、 正常な発現量と比較等することによ り、 ジカルボ二ルリダク夕ーゼ活性を測定し、 その値により、 AGE 由来の糖尿病 合併症を診断する方法、また診断医薬を提供可能とする。同様に、タンパク質 DCR1 を検出することを特徴とする AGE由来の糖尿病合併症を診断する方法、 また診断 医薬を提供可能とする。
(5 )さらに、 本発明に係る抗体を用いることを特徴とする AGE 由来の糖尿病合併 症を診断する方法、 また診断医薬を提供可能とする。
以下、 本発明を実施例に従い説明するが、 本発明はこれに制限されることはな い。
【実施例】
(実施例 1 ) 遺伝子 dcrlのクローニング
( 1 ) マウス腎糸球体特異的遺伝子の部分配列の決定
マウス（C57BL/6 )より Grant らの方法 (Grant 等、 Eur. J. Biochem. , 54、 531-
540( 1975 ) ) に準じて腎糸球体画分を精製し、 TRI zol (ギブコ BRL 社） を用いて 全 RNAを抽出した。この MAを铸型として、大久保らの方法（Okubo et al . , Nature Genet. , 2， 173( 1992) )により、 腎糸球体の cDNAライブラリ一を作成した。
次いで、 当該ライブラリーから無作為に 985個の組換え体を選択し、 常法に従 い、 組換え DNAを抽出し、 cDNA部分の 3'側の塩基配列を決定した。 配列決定に は PE アプライ ドバイオシステム社製の DNA シークェンサ一（ABI PRISM 377)と 同社製反応キットを用いた。
985個の組換え体中の各 DNA断片の発現頻度を解析した結果、配列- 1(238残基） を有する遺伝子の発現頻度が 3/958であった。 配列 - 1
GATCGTATCC CACTGGGCAA GTTCGNTGAG GTGGAGAACG TCGTGGACAC CATTCTCTTC 60 CTGCTGAGCA ACCGGAGTGG CATGACCACT GGCTCCACTT TGCCAGTGGA TGGGGGCTTC 120 CTGGCTACCT GAGCCCCCTG CCCACCGACA CTCTGCTCAG CTCTCTGCTC AGGACACTGT 180 GCCCTCCGCC CCTGCAATAA AGCTCTCTGC TCAGCCTGTG TGCTGATTCT CCAGGAAA 238 (2) 配列- 1を含む DNA断片の取得
配列- 1を含む MA断片を以下の方法により取得した。
(2-1 ) cDNAライブラリーの調製
実施例 1 の（1 )で調製した全 RNAを铸型として、 CapFinder PCR cDNAライブラ リー作製キヅト （クロンテックラボラトリーズ社製） を用いて cDNAを合成した。 (2-2) 配列- 1を含む DNA断片の増幅
まず、 配列- 1 の一部分よりなるオリゴヌクレオチド （配列- 2) を、 PE アプライ ドバイォシステム社製の DNA合成機 (ABI 380B)合成した。
配列- 2 5， CAGTGTCCTGAGCAGAGAGCTGAG3'
次いで、 （2-1 )で作製した cDNA ライブラリ一を铸型とし、 配列- 2 のオリゴヌク レオチドとキットに付属しているオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを 行った。 当該反応には宝酒造 （株） 製のキット （夕カラ LA PCR Kit Ver.2) を 用い、 宝酒造 （株） 製の PCRサ一マルサイクラ一Mpを使用した。
反応組成液
cDNAライブラリー 5 z l
lOxPCR緩衝液 (25raM Mg 2' +含有） 5 / 1
Figure imgf000029_0001
10〃M オリゴヌクレオチド （配列 - 2) 2j l
キット付属オリゴヌクレオチド Ζ μ. 1
水 34.5^ 1
LA Taqポリメラ一ゼ 0.5 1 50 / 1
反応条件
94°Cで 30秒間反応させ、 60°Cまで- l°C/2秒の速度で冷却し、 60°Cで 30秒間保 持し、 次いで 72°Cまで加温して 4分間保持した。 これを 30回繰返して、 目的配 列を増幅させた。
上記方法により、 配列- 1の一部を有する DNA断片 （約 0.8kb) を特異的に増幅 させた。
(3) 塩基配列決定用ベクターへのサブクロ一ニング
(2)で増幅した DNA 断片を、 常法に従って、 ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃 度 1%)で分画した。 ゲルをェチジゥムブ口マイ ドで染色した後、 紫外光照射して 目的とするバンドを含むゲルを切出した。 ァガロースゲルからの DNA断片の抽出 と精製は、 GENECLEAN I I Kit (バイオ 101社製） を用いて行った。
この精製 DNA 断片を、 以下の方法により塩基配列決定用ベクター、 pT7Blue T-Vector (ノバジェン社製） にサブクロ一ニングした。 Ligation 溶液は、 宝酒 造 （株） 製のキヅ ト （タカラ DNA Ligation Kit Ver.2) を用いて、 16°Cで 16 時間反応させた。
反応組成液
PCR産物 1 1 (50ng)
T7 Blue T-Vector I j 1
水 3j 1
Ligation溶液 5 j 1
10 上記反応溶液を用いて常法により大腸菌 K12株 DH5の形質転換を行つた。 形質転 換体をア ン ピシ リ ン（Amp)50 ju g/ml、 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl- β -d- galactoside( β -gal )40 μ. g/ml ヽ Isopropyト β -d-Th i o-Gal actopyranos i de ( IPTG ) IOO Mを含有する LB寒天培地にプレーティングし、 37°Cで一晩培養した。 白色コロニーを 50〃 g/mlの Ampを含む LB液体培地 10mlに接種して 37°Cでー晚 培養し、 遠心分離により菌体を集めた後、 QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit (キ ァゲン社製） で組換え DNAを精製した。
(4) DNA断片の塩基配列の決定
塩基配列決定には PEアプライ ドバイオシステム社製の DNAシークェンサ一を 用い、 ダイ夕一ミネ一夕一法を用いた。 決定された塩基配列を元にしてオリゴヌ クレオチドを合成し、 プライマーウォーキング法で全塩基配列を決定した （配列 表配列番号 1 )。 両鎖の塩基配列を決定し、 また独立した 2クローンの塩基配列 は全く同一であった。 当該塩基配列が配列- 2、 および配列- 1 のうち配列- 2 の上 流領域を含んでいたことから、 目的とする遺伝子（遺伝子 dcrl )がクロ一ニング されたことを確認した。 以下に、 上記遺伝子 dcrlを含む全塩基配列を示す。 TTGCTGCGAG AAGACGACAG AATGGGAGGA CCAGGCTCAA GCACCATGGA 50
CCTGGGGCTT GCAGGTCGGC GGGCGCTGGT CACCGGCGCG GGCAAAGGCA 100
TCGGGCGCAG CACTGTGCTG GCGTTGAAGG CGGCTGGTGC ACAGGTTGTG 150
GCGGTGAGTC GGACGCGAGA GGACCTGGAC GACCTGGTCC GCGAGTGTCC 200
TGGTGTGGAG CCTGTGTGTG TGGACCTGGC CGACTGGGAG GCCACAGAGC 250
AGGCCCTAAG CAATGTGGGA CCCGTGGACC TTCTGGTGAA CAATGCTGCT 300
GTGGCTCTGT TGCAGCCCTT CCTGGAGGTC ACCAAGGAGG CCTGTGACAC 350
ATCCTTCAAT GTGAATCTTC GGGCTGTCAT CCAGGTGTCT CAGATTGTGG 400
CCAAGGGCAT GATAGCTCGG GGAGTTCCAG GAGCCATTGT GAATGTCTCC 450
AGCCAGGCCT CCCAACGTGC ACTGACCAAC CATACTGTCT ACTGTTCCAC 500
CAAGGGTGCT CTGGACATGT TGACCAAGAT GATGGCCCTA GAGCTTGGGC 550
CCCACAAGAT CCGTGTGAAT GCAGTAAACC CCACAGTAGT GATGACACCC 600 ATGGGCCGGA CCAACTGGAG TGACCCCCAC AAAGCTAAGG CCATGCTGGA 650
TCGTATCCCA CTGGGCAAGT TCGCTGAGGT GGAGAACGTC GTGGACACCA 700
TTCTCTTCCT GCTGAGCAAC CGGAGTGGCA TGACCACTGG CTCCACTTTG 750
CCAGTGGATG GGGGCTTCCT GGCTACCTGA GCCCCCTGCC CACCGACACT 800
CTGCTCAGCT CTCTGCTCAG GACACTGTGC CCTCCGCCCC TGCAATAAAG 850
CTCTCTGCTC AGCCTGTGTG CTGATTCTCC AGGAAA 886
(実施例 2 ) タンパク質 DCR1の生産
( 1 ) 発現ベクター、 pHis- glBの構築
実施例 1で取得した、 遺伝子 dcrlを含む cDNA断片を以下に示すプライマ一を用 レ、、 PCR法により増幅した。 PCRは実施例 1に記載した条件で行った。
配列- 3 5， TAATGGATCCATGGACCTGGGGCTTGCAGGTCGG 3，
配列- 4 5' ATTAGAATTCAGGTAGCCAGGAAGCCCCCATCC 3，
該増幅し精製した cDNA断片を、 制限酵素 EcoRI と BamHI (共に宝酒造製） で 切断した。 切断処理後、 ふたたびァガロースゲル電気泳動で分画し、 約 0.7kbの DNA断片を精製した （断片- 1)。
タンパク質生産用ベクター、 pTrcHisA (インビトロジェン社製） を、 上記と同 様に制限酵素 EcoRI と BamHIで切断し、 開環ベクターを精製した。
断片- 1 と前記開環ベクターとを混合し、 実施例 1に記載した条件下で、 ライ ゲ一シヨンならびに大腸菌 K12株の形質転換を行い、 さらに該形質転換体を培養 して遠心によって集めた菌体から、 組換え DNAを精製した。 このようにして構築 した組換え DNAを pHis-glBと命名した。
発現条件と精製操作を以下に説明する。
培地 （L +glucose) は以下の成分からなる （ 1 1中）。
Tripticase peptone 10 g
NaCl 5 gr Yeast Extract 5 gr
D - glucose 2 gr
また、 pre- culture は、 上記培地 (8ml ) に 00 ig/ml Ampici l l in を加えた培 地を用いて 37°C で一晩振盪培養する。
本培養は、上記培地（150ml)に 200〃g/ml Ampici l l inを加えた培地を用いて 37 °C で行い、 0D=0.6 になったところで lOOmgの IPTG (約 3mM) を加えて更に 3時間 培養する。
氷冷した後、 集菌し、 10ml の以下のカラムバッファーに懸濁して- 20°Cにて凍結 する。
カラムバッファ一： lOfflMTris-Cl pH8.0
200mM NaCl
O. lmM PMSF
これを融解後、 20mgのリゾチーム、 5〃1の DNasel (5mg/ml )、 RNaseA(5mg/ml )N
100 1の 10% TritonX-100を加え 37°C、 15分で溶菌する。
9000rpmで、 4°C、 10分間遠心分離して上清をとり、 この上清に 10mlの fresh力 ラムノ ッファーを加え、 さらに 1ml の bed volume の Nickel- NTA-agarose gel(Qiagen社） を加え、 室温で 15分緩やかに振盪する。
これを、 ガラスカラムに充填し、 以下の条件で精製する。
洗浄 カラムバッファ一 （50ml ) ：
カラムバッファー + 10mM imidazole 50ml
カラムバッファー + 30raM imidazole 10ml
溶出 カラムバッファ一 + 500mM imidazole
透析 カラムバッファ一（4°C)
これに 15vol/vol%glycerolを加え、 -20°C保存する。
純度チェックは SDS PAGEした後、 クマシ一ブル一染色法による。
また、 蛋白量は H Sブラッドフォード法 （Biorad社） による。 図 4には、 組替えタンパク質 DAR1のァフィ二ティー精製結果を示す。
分子量は、 約 33kDaであり、 95%以上の純度と推定された （収量は約 3mg (E. col i 150mL 培地））。
(実施例 3 ) 抗体作成
抗 DAR1 タンパク質抗体は以下の抗原を用いて、 サヮデ一バイオテクノロジ一 社の方法に従い行った。
抗体 731 は、 Ac- NH- SRTREDLDDLVREC- C00H、 また抗体 733 は、 Ac-NH - QASQRALTNHTVYC-COOHを抗原とし、 conjugateの形でゥサギに免疫した。
すなわち、 上記抗原をキャリア蛋白として、 へモシァニン （K L H ) を結合し、 ゥサギに 1回 1 5 0 gを 6回、 2力月免疫して抗ペプチド抗体を得た。
実施例 2で得た組換え体 0.1〃gを S D S P A G Eした後のゲルから Hybond- ECL ニトロセルロースメンブレン （アマ一シャム社） にミニプロテイン I I のブ ロヅティング装置 （バイオラッド社） を用いてトランスファ一した。
蛋白質をブロットした膜フィルタ一は、 蒸留水で洗浄した後、 作製した各種抗 体を用いて、 アマシャム社製 E C Lウエスタンプロティング検出システムにより 検出した。 その結果、 見かけの分子量が約 33kDaのバンドとして検出が可能であ ることがわかった。 従って、 本抗体を用いて、 各種細胞を用いて免疫測定法が 可能である。
(実施例 4 ) タンパク質 DCR1発現
( 1 ) 図 3には、 正常マウスの主要臓器中タンパク質 DCR1発現量を、 ウエスタン ブロット法で示した。 使用した抗体は実施例 3で作成した抗体 #731 と #733 で ある。 各臓器抽出液は 100 g のタンパク質を含むものである。 また、 組替え夕 ンパク質は 0.1 zgを用いた。
臓器抽出液の作成は、 マウス 5匹分の腎臓の 4mlの緩衝液 (0.2%TritonX- 100、 O. lmM PMSF、 0.15M NaCl、 ImM MgCl 2、 0.5mM EDTA/EGTAを含む Tris塩酸緩衝 液 pH8.0)を加え、 SONIC BLENDER(HITACHI HG30)で 30秒間の超音波処理を 4, 5 回繰返した。
その後、 100，000xg、 1.5時間遠心した上清を分画し、 これを更に 30分遠心した 際の沈殿を- 80°Cで凍結保存し、 各種実験に供した。
2種類の抗体とも、 該タンパク質が腎臓に特異的に発現していることを示して いる。 また、 抗体 #733 は、 より特異的にタンパク質 DCR1 に反応し、 アイソザ ィムとのクロスリアクトが少ないことを示す。 図 5および 6に示す結果は抗体 # 733を用いた結果である。
(2 ) 図 6には、 病態モデルマウス腎臓抽出液と正常マウスとのタンパク質 DCR1 発現量の比較をウエスタンプロット法にて行った結果を示すものである。
用いた抗体は、 抗体 # 731 と、 特異的抗体 #733 である。 各臓器の抽出液の夕 ンパク質量は 150 gであり、 組替えタンパク質 DCR1は 0, 1 であった。
さらに、 表には、 病態の重さを血糖値であらわし、 タンパク質 DCR1 の減少傾 向との相関を示す。
5匹の平均 ob/ob 対照 db/db 対照
体重（g) 45.6 20.3 42.5 20.6
血糖値 (fflg/dl ) 335 195 512 168 この結果は、 病態の重さ （血糖値） に逆相関してタンパク質 DCR1 の減少傾向 を示すものである。
(実施例 5 ) 酵素活性
( 1 ) 以下の条件で行った。
反応混合液（全 2.0ml )は、 80mMリン酸カリゥム溶液 (pH7.0又は 6.0 )と、 O. lmM NADPH又は NADHと、 カルボ二ル基質及び酵素（50 z 1 )( 10. 1〃g又は 3.7 zgグロ メリン B )とからなる。
NAD(P)Hの酸化速度は 340nmで測定。 酵素活性の limitは、 1 zniolの NAD(P)Hを 25°Cで 1分間に酸化触媒することで
(2) カルボニル化合物へのタンパク質 DCR1の基質特異性を表 1にまとめた。
(3) タンパク質 DCR1によるジァセチルリダクタ一ゼ活性の pH依存性
該活性は、 lOmM ジァセチルを用いて測定された、 比活性は、 タンパク質 DCR1 試料のタンパク質濃度に基づいて計算された（図 7 )。
なお、 活性が認められなかった化合物は、 2-シクロへキセン- 1 -オール、 S-ィ ンダン- 1 -オール、 4-二トロアセトフェノン、 メナジオン （ビ夕ミン K3) である。 (実施例 6 )ヒト型ホモログのクローニング
( l )cDNAの調製
ヒト腎臓 mRNAから cDNAラィブラリを調製した。
ヒト腎臓 mRNAは、 Clontech社製、 CATAL0G#6538-1の Human Kidney Poly A+ RNAを用いた（Chomczynski，等、 Anal .Biochem.162 : 156-159( 1987), Sambrook, J. , 等、 ( 1989) Molecular Cloning: A LAboratory Manual , nd ed. (Cold Spring Harbor LAboratory, Cold Spring Harbor, NY) , pp.6.22- 6.34) )。
調製には、 Clontech社製 SMART T M PCR Library Construction Kitを用い、 当該 Kitのマニュアルに従い行った。 必要なプライマ、 試薬等も当該 Kitの添付 のものを用いた。
一本鎖 DNAの調製を前記 Ki tの従い行った。反応後、铸型に用いた mRNAを RnaseH (Gibco 社製） により消化 除去した。 さらにァガロースゲル電気泳動し、 ファ ルマシア社製 Sepaglass band prep kit を用いて低分子量の不純物等を除き精 製した。
得られた一本鎖 MAを含む溶液を最終的に 25 1 とした。
(2)二本鎖 cDNA断片の調製
調製には、 前記 Clontech社製 SMART L ίΛ PCR Library Construction Kitを 用い、 当該 Kitのマニュアルに従い、 cap siteを含む二本鎖 cDNA断片を LD- PCR により行った。 この際 3'側プライマとして、 前記マウスから得られた EST情報 を利用して、以下のように、停止コドンより下流の配列を持ったものを設計した。 プライマ #1162： 5' -ccaagcttgtaggatgagcacggcatgg-3' (28mer)
前記 LD- PCR は、 寶酒造社製 Takara Thermal Cycler MP を用い、 以下の条件で 行った。
1 cycle 95 1 min
20 cycles 95 30 sec
55 2 min
72 3 min
1 cycle 95 1 min
55 3 min
72 10 min 反応終了後、 フエノール： クロロフオルム ： ィソァミルアルコール（25 : 24: 1 )を 用いて徐蛋白質し、 さらにエタノール沈殿によって生成 DNAを回収した。 さらに ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1.0%)し、 ゲルをェチジゥムブ口マイ ドで染 色した後、 紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切出した。 ァガロース ゲルからの DNA断片の抽出と精製は、フアルマシア社製 Sepaglas™ Band PrepKit を用いて精製した。
(3)前記（2)で得られた cDNA断片を 3，側のみ nested PCR用のプライマを用いて 再び PCR により増幅する。 用いた 3'側プライマは以下の配列を有するものであ つた。
プライマ #1163： 5' -ccaagcttgaggtgtgtggagggagc-3' 前記 PCRは、 寶酒造社製 Takara Thermal Cycler MPを用い、 以下の条件で行つ た。
1 cycle 95 1 mm
20 cycles 95 30 sec
55 2 rain
72 3 min
1 cycle 95 1 min
55 3 min
72 10 min 反応終了後、 フエノール ： クロロフオルム ： ィソァミルアルコール（25 : 24: 1 ) を用いて徐蛋白質し、 さらにエタノール沈殿によって生成 DNAを回収した。 さら にァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1.0%)し、 ゲルをェチジゥムブ口マイ ドで 染色した後、 紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切出した。 ァガ口一 スゲルからの DNA断片の抽出と精製は、 フアルマシア社製 SepaglasTM Band Prep Kitを用いて精製した。
(4)前記（3)で得た cDNA断片を、 以下のようにプラスミ ド DNAにサブクロ一ニン グした。 用いた方法は、 Promega社製 pGEMR - T Easy Vector Systems のマニュ アル (Promega, Printed in USA. Revised 7/79 Part#TM042, TECHNICAL MANUAL pGEM-T and pGEM-T Easy Vecotr Systems, INSTRCTI0NS FOR USE OF PRODUCTS A160,
A1380, A3600, AND A3610)に従い、 材料は添付のものを用いた。
Ligation 溶液および条件は以下の通りであり、 40°Cで 3日間（60 時間）反応さ せた。 反応組成液
PCR産物 μΛ ( 140ng)
T4 DNA Ligase lOxBuffer 1〃 1
pGEMR -T Easy Vector 1 1 (50ng)
T4 DNA Ligase i ju 1
水 5〃 1
10 1 上記反応溶液を用いて常法により JM109株の形質転換を行った。 形質転換体をァ ンピシリン（Απιρ)50 _^/ιη1、 37。Cでー晚培養した。 コロニー 50株を別のマスター プレートに作成して、 メンプレン（Amersham製 Hybond+)に転写し、 DIGラベルし た 3'側のォリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてポジティブクローンを選び、 これをシングルコロニーにして精製した。 そこから、 50 /g/ml の Ampを含む LB 液体培地 10ml に接種して 37°Cで一晩培養し、 遠心分離により菌体を集めた後で 組換え DNAを精製した。
(5 ) DNA断片の塩基配列の決定
塩基配列決定には PEアプライ ドバイオシステム社製の DNAシークェンサ一を 用い、 ダイ夕一ミネ一夕一法を用いた。 断片長が約 750bpと短いことから、 ブラ イマは汎用プライマである SP6、 および T7 を用いることができたためプライマ 一ウォーキング法を用いず塩基配列を決定した。
(6 )前記（5 )で得られた配列情報にうち、 オープンリーディングフレーム（0RF )の 5'末端の Metl に相当する部位より更に上流の部分から、 新たに 5'プライマを設 計した。
プライマ #1446： 5， - ggaattcgattccaagcttgt - 3， (21mer)
このプライマと、 すでに EST情報から設計した 0RFの 3'末端の停止コドンより 下流の部分の配列からなる 3'プライマ、 #1162 を組み合わせて、 前記（1 )で得た もとの一本鎖 cDNAを錶型とした PCRを低いサイクル数で行い、 標準クローンを 取得した。 この場合、 5，、 3'側両方ともユニークプライマであるため、 20 サイ クル 1回の PCRで誤反応のないクローンが得られた。
反応条件 cDNA 2.5^ 1
水 36 1
lOxPCR緩衝液 5 / l (Perkin Elmer)
2mM dNTP mix 5 z l (Perkin Elmer)
5'プライマ： #1446
3，プライマ： #1162
Ampl iTaqPolyraerase 0.5〃1 (ΡθΓΐίίη Elmer) 前記 PCRは、 寶酒造社製 Takara Thermal Cycler MPを用い、 以下の条件で行つ た。
1 cycle 95 1 min 20 cycles 95 30 sec
55 2 min
72 3 min
1 cycle 95 1 min
55 3 min
72 10 min 反応終了後、 フエノール： クロロフオルム ： ィソァミルアルコール（25 : 24 : 1 )を 用いて徐蛋白質し、 さらにエタノール沈殿によって生成 DNAを回収した。 さらに ァガロースゲル電気泳動 （ゲル濃度 1%)し、 ゲルをェチジゥムブ口マイ ドで染色 した後、 紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切出した。 ァガロースゲ ルからの DNAの抽出と精製は、 フアルマシア社製 Sepaglas丄 M Band Prep Kit を用いて精製した。
前記 (4)および（3)で使用した同様の方法を用いて、 前記精製した cDNA を、 ブラ スミ ド DNAにサブクローニングした（Promega社製 pGEM - T Easy Vector Systems のマニュアル (Promega, Printed in USA. Revised 7/79 Part画 42 ' TECHNICAL
MANUAL pGEM-T and pGEM-T Easy Vecotr Systems, INSTRCTIONS FOR USE OF PRODUCTS
A160, A1380, A3600, AND A3610) )。
Ligation溶液および条件は以下の通りであり、 4°Cで 60時間反応させた。 反応組成液
PCR産物 3〃1 (150ng)
T4 DNA Ligase lOxBuffer Ι μ. 1
pGEMR -T Easy Vector l j 1 (50ng)
T4 DNA Ligase l j 1
水 4〃 1
10
上記反応溶液を用いて常法により JM109株の形質転換を行った。 形質転換体をァ ンピシリン（Amp)50〃g/ml を含有する LB 寒天培地にプレーティングし、 37°Cで 一晩培養した。 白色コロニーを 20株を別のマスタープレートに植え直し、 メン プレンに転写し、 DIGラベルした 3'ォリゴヌクレオチドとハイプリダイズしてポ ジティブクローンを選び、 これをシングルコロニーとして単離した。 そこから、
50 zg/mlの Ampを含む LB液体培地 10ml に接種して 37°Cで一晩培養し、 遠心分 離により菌体を集めた後で組換え DNAを精製した。
塩基配列決定は複数のクローンについて行った。 シークェンス プライマには、 前記 #1446 と #1162 を用いた。 装置は、 PEアプライ ドバイオシステム社製の DNA シークェンサ一により、 ダイ夕一ミネ一夕一法を用いた。 0RF の部分は全てブラ イマの内側に収まっていた。決定された塩基配列を配列表の配列番号 3に示した。 (実施例 7 ) タンパク質 hDCRlの生産
( 1 ) 発現ベクター、 pHis- glBの構築
実施例 6で取得した、 遺伝子 hdcrl を含む cDNA断片を以下に示すプライマ一を 用い、 PCR法により増幅した。 PCRは実施例 6に記載した条件で行った。
配歹 |J#1448： caggatccatggsgctgttcctcgcgggc
配歹 []#1449： cagaattctcagcaggcccagaagcccccttc
該増幅し精製した cDNA断片を、 制限酵素 EcoRI と BamHI (共に宝酒造製） で 切断した。 切断処理後、 ふたたびァガロースゲル電気泳動で分画し、 約 0.75kb の DNA断片を精製した （断片- 1)。
タンパク質生産用べクタ一、 pTrcHisA (インビトロジヱン社製） を、 上記と同 様に制限酵素 EcoRIと BamHIで切断し、 開環ベクターを精製した。
断片- 1 と前記開環ベクターとを混合し、 実施例 6に記載した条件下で、 ライ ゲーシヨンならびに大腸菌 K12株の形質転換を行い、 さらに該形質転換体を培養 して遠心によって集めた菌体から、 組換え DNAを精製した。 このようにして構築 した組換え DNAを pTrcHisAhuglBと命名した。
発現条件と精製操作を以下に説明する。
培地 （L +glucose) は以下の成分からなる （ 1 1中）。
Tripticase peptone 10 g
NaCl 5 gr Yeast Extract 5 gr
D - glucose 2 gr
また、 pre- culture は、 上記培地 (8ml ) に 00 g/ml Ampicill in を加えた培 地を用いて 37°C で一晩振盪培養した。
本培養は、 上記培地 （150ml ) に 200〃g/ml Ampicil l in を加えた培地を用い て 37°Cで行い、 0D=0.6になったところで lOOmgの IPTG (約 3mM) を加えて更に 3時間培養した。
氷冷した後、 集菌し、 10ml の以下のカラムバッファーに懸濁して- 20°Cにて凍 結する。
カラムバッファー： lOmMTris-Cl pH8.0
200mM NaCl
O. lmM PMSF
これを融解後、 20mgのリゾチーム、 5 1の DNasel (5mg/ml )、 RNaseA(5mg/ml )、 100 i lの 10% TritonX-100を加え 37°C、 15分で溶菌する。
9000rpmで、 4°C、 10分間遠心分離して上清をとり、 この上清に 10mlの fresh力 ラムノ ッファーを加え、 さらに 1ml の bed volume の Nickel-NTA- agarose gel(Qiagen社） を加え、 室温で 15分緩やかに振盪する。
これを、 ガラスカラムに充填し、 以下の条件で精製する。
洗浄 カラムバッファ一 （50ml)：
カラムノ ッファ一 + 10mM imidazole 50ml
カラムバッファ一 + 30mM imidazole 10ml
溶出 カラムバッファー + 500mM imidazole
透析 カラムバッファ一（4。C)
これに 15vol/vol%glycerolを加え、 - 20°C保存する。
純度チェックは SDS PAGE した後、 クマシ一ブル一染色法による。 また、 蛋白 量は H Sブラヅドフォード法 （Biorad社） による。 分子量は、 約 33kDaであり、 95%以上の純度と推定された （収量は約 3mg (E.colil50mL 培地））。
(実施例 8) 酵素活性
(1) 以下の条件で行った。
反応混合液 （全 2.0ml) は、 80mM リン酸カリウム溶液 (pH7.0 又は 6.0)と、 O.lmMNADPH又は NADHと、 カルボ二ル基質及び酵素（50〃 1 )(lOAjug又は 3.7〃 ghDCRl)とからなる。
NAD(P)Hの酸化速度は 340nmで測定。
酵素活性の limitは、 l〃molの NAD(P)Hを 25°Cで 1分間に酸化触媒すること 測定値は、 各基質で酵素を加えない反応系での値を減じて求め、 diacetyl (ジ ァセチル） 還元活性に対する相対活性で示す。
(2) 種々のカルボニル化合物へのタンパク質 hDCRl の基質特異性を調べた結果 を表 1に示した。 産業上の利用可能性
ジァセチルに代表されるジカルボニル化合物は、 糖尿病合併症の原因物質であ る AGEが体内で還元糖と蛋白質から生成される過程の中間代謝産物であり、 極め て反応性に富む化合物である。 本発明であるジカルボニルリダクタ一ゼは、 中間 代謝産物であるジカルボニル化合物を分解することで AGEの生成量を制御し、 糖 尿病合併症の発症、 進行に重要な役割を有していると推定される酵素である。 従 つて、 本発明は、 糖尿病合併症、 腎不全における糖代謝、 AGE の生成とそれに伴 う動脈硬化の発症の抑制を目的とした治療薬の開発に有用と考えられ、 また組み 替え蛋白質自体が、 血中の AGE生成前駆体であるジカルボニル化合物の解毒に使 用される可能性もある。
また、 本発明にかかる遺伝子を用いることで、 該遺伝子発現調節因子のスクリ —二ング方法とそれにより該遺伝子発現調節因子が得られる。 また、 本発明にかかるタンパク質を用いることで、 該タンパク質活性調節剤の スクリーニング方法とそれにより該夕ンパク質活性調節剤が得られる。
また、 糖尿病合併症として知られる腎不全等の予防薬または治療薬として、 ま たは、 これらの薬物の創出に用いることができる。

Claims

言青求の範囲
1 . 炭素数が 4から 1 0の直鎖アルキル基を有するひ-ジケトン、 およ び、 芳香族性オルトキノンに対して、 高い還元活性を有するジカルボ二ルリダク 夕一ゼ。
2 . 請求項 1に記載のジァセチルレダク夕一ゼであって、 前記ひ-ジケ トンが、 ジァセチル、 2, 3-ペン夕ンジオン、 2, 3-へキサンジオン、 3，4-へキサン ジオン、 および 2 , 3-ヘプ夕ンジオンからなる群より選択される 1つ又は 2以上 のジケトンであり、 かつ前記芳香族性オルトキノンが、 ィサチン、 フエナンスレ ンキノン、 およびァセナフテンキノンからなる群より選択される 1つ又は 2以上 のキノンであることを特徴とする、 ジカルボ二ルリダク夕一ゼ。
3 . 以下の（a)又は（b)の夕ンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列表の配列番号 2又は 4のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパ ク質
(b)配列表の配列番号 2又は 4のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1若し くは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か っジカルボニルリダクターゼ活性を有するタンパク質。
4 . 請求項 3に記載の遺伝子とストリンジヱントな条件下でハイブリ ダイズし、 かつジカルボニルリダク夕ーゼ活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子。
5 . 以下の（a)又は（b)のタンパク質。
(a)配列表の配列番号 2又は 4のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパ ク質
(b)配列表の配列番号 2又は 4のいずれかに記載のァミノ酸配列において 1若し くは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か っジカルボニルリダクタ一ゼ活性を有するタンパク質。
6 . 請求項 5に記載の夕ンパク質に対する抗体。
7 . 請求項 3又は 4のいずれか 1項に記載の遺伝子のアンチセンス鎖 の全部又は一部の配列を有し、 かつ請求項 5に記載のタンパク質の生合成を阻害 するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8 . 請求項 5に記載の夕ンパク質を含むことを特徴とするジカルボ二 ル化合物生成抑制剤。
9 . 請求項 5に記載のタンパク質を含むことを特徴とする AGE 生成抑 制剤。
1 0 . 請求項 7に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む AGE 生成調節剤。
1 1 . 請求項 3に記載の遺伝子の少なくとも一部を用いた前記遺伝子 発現調節因子のスクリーニング方法。
1 2 . 請求項 1 1に記載の方法により得られる前記遺伝子発現調節因 子。
1 3 . 請求項 5に記載のタンパク質の少なくとも一部を用いて前記夕 ンパク質活性調節剤のスクリーニング方法。
1 4 . 請求項 1 3に記載の方法により得られる前記タンパク質活性調 節剤。
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