CN109536468B

CN109536468B - 二羰基还原酶及其在他汀类药物中间体合成中的应用

Info

Publication number: CN109536468B
Application number: CN201910006752.1A
Authority: CN
Inventors: 梅光耀; 汪海波; 金辉; 胡磊; 于安生; 郑海成; 曾超
Original assignee: Zhejiang Hongyuan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Hongyuan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN109536468A

Abstract

本发明公开了一种二羰基还原酶，为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有羰基还原酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有羰基还原酶活性的蛋白质。

Description

二羰基还原酶及其在他汀类药物中间体合成中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体地指一种二羰基还原酶及其在他汀类药物中间体合成中的应用。

背景技术

目前，资源、能源和环境危机已经威胁到人类的生存与发展。生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等的有效手段。他汀类药物是HMG-CoA还原酶的选择性、竞争性抑制剂，通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶和胆固醇的合成从而降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平，并通过增加细胞表面的肝脏LDL受体以增强LDL的摄取和代谢。同时，他汀类药物还可以降低低密度脂蛋白和甘油三酯、升高高密度脂蛋白，从而对动脉粥样硬化和冠心病的防治有重要意义。瑞舒伐他汀、阿托伐他汀因其适应症更广、耐受性和安全性更好已经引起国内各制药企业的广泛关注。其中，瑞舒伐他汀钙已在全球30多个国家和地区获批上市，全球销售总额最高时达70多亿美金；阿托伐他汀在心血管方面的多个临床适应症在全球20多个国家和地区获批上市，全球年销售总额最高达130多亿美元。因此，开展瑞舒伐他汀、阿伐他汀及其中间体合成工艺的探索和改进具有重要意义。

瑞舒伐他汀、阿伐他汀的重要中间体(3R,5S)-6-取代二羟基己酸叔丁酯，化学结构为：

现有技术中，(3R,5S)-6-取代二羟基己酸叔丁酯的合成方法主要有以下两种：第一种方法是用脱氢酶一步还原，用硼氢化钠做另一步还原，反应式如下：

第二种方法是用两种脱氢酶分别还原，反应式如下：

第三种方法是用手性催化剂(R)-[RuCl₂(MeO-BIPHEP)]₂一步还原，反应式如下：

现有三种方法中前两种工艺复杂，第三种手性催化剂价格昂贵。所以，研发一种反应条件温和、工艺简便、成本低易于产业化的阿托伐他汀中间体的生物转化工艺显得很有必要。

发明内容

本发明所要解决的问题就是要提供一种他汀药物中间体的生物合成方法，该方法反应条件温和，能简化现有的生产工艺。

为解决上述技术问题，本发明所提供的二羰基还原酶，为氨基酸序列为SEQ IDNO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有二羰基还原酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有二羰基还原酶活性的蛋白质。

本发明还涉及二羰基还原酶的编码基因。

优选地，二羰基还原酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

进一步地，二羰基还原酶编码基因的重组表达载体。

进一步地，二羰基还原酶编码基因的转基因细胞系。

进一步地，二羰基还原酶编码基因的宿主菌。

更进一步地，本发明还涉及二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用。

具体而言，二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，包括以下步骤：式II化合物在二羰基还原酶的作用下反应生成式I化合物，反应式如下：

其中，R₁选自腈基、乙酰氧基、卤素、芳香基、烷基；R₂选自烷基、环烷基。

优选地，R₁选自腈基或乙酰氧基；R₂选自乙基或叔丁基。优选方案选自如下反应：

反应1：

反应2：

反应3：

反应4：

进一步地，本发明所述的瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述二羰基还原酶为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞，反应过程中，需添加辅酶，所述辅酶为NADP+或NADPH。

更进一步地，所述的瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体的生物合成方法，其特征在于，反应在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。

更进一步地，所述的阿托伐他汀中间体的生物合成方法，其特征在于，反应体系中所述具有羰基还原酶活性的工程化多肽为基因工程菌全细胞，其投入量控制为50-110g/L，反应转化温度控制为25-37℃，pH控制为6-9。

本发明所述的瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体的生物合成方法，其特征在于，所述反应在助溶剂存在的条件下进行，所述助溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。

本发明与现有技术相比的优点主要体现在如下几方面：

其一，本发明提供了一种全新的瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体的生物合成方法，反应条件温和，对设备无特殊要求；

其二，本发明对环境友好；

其三，本发明反应条件易控制，操作简便，工艺流程简单。

具体实施方式

下面具体实施例可以使本专业技术人员全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

在下列实施例中，除非另有指明，所有温度为摄氏温度；除非另有指明，所述的室温均为20～30℃；除非另有指明，各种起始原料和试剂均来自市售，均不经进一步纯化直接使用；除非另有指明，各种溶剂均为工业级溶剂，不经进一步处理直接使用；除非另有指明，市售厂家包括但不限于杭州化学试剂、国药试剂等。

实施例1

具有二羰基还原酶活性的基因工程菌全细胞的制备：

重组二羰基还原酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Acinetobacter sp的二羰基还原酶的氨基酸序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.col i BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.col i BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组二羰基还原酶的重组二羰基还原酶基因工程菌。

将重组二羰基还原酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Acinetobacter sp的二羰基还原酶基因工程菌全细胞。二羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。二羰基还原酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明实施例中所使用的葡萄糖脱氢酶均为购自于sigma-aldrich的商品酶。

实施例2

式Ⅲ化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸叔丁酯在生物催化剂的作用下反应生成式Ⅳ化合物(3R,5S)-6-乙酰氧基二羟基己酸叔丁酯，即为(3R,5S)-6-乙酰氧基二羟基己酸叔丁酯，反应式如下：

具体反应过程如下：将式Ⅲ化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸叔丁酯(11.0g，42.7mmol)溶于40mL DMSO，在1L摇瓶中控制反应体系为300mL，用220mL灭菌后的磷酸盐缓冲溶液悬浮具有二羰基还原酶活性的基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2.5mol/L的葡萄糖20mL，0.26g的NADP+，将溶有式Ⅲ化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸叔丁酯的DMSO溶液缓慢倒入摇瓶中，投入二羰基还原酶基因工程菌全细胞的量为110g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为30℃，pH为7；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，纯化，得到式Ⅳ化合物(3R,5S)-6-乙酰氧基二羟基己酸叔丁酯(9.05g，34.5mmol)，de值为97.7％。ESI-MS：m/z 263.21[M+H]⁺；¹H-NMR(CD₃Cl,400MHz)：δ4.36-4.33(m,1H),4.10-4.08(m,1H),3.88-3.85(m,1H),3.58(br s,1.5H),3.54-3.51(m,1H),2.54-2.50(m,1H),2.29-2.26(m,2H),2.21(s,3H),1.59-1.57(m,1H),1.38(s,9H)；¹³C-NMR(CD₃Cl,125MHz)：δ173.2,170.3,83.1,66.5,64.1,42.7,40.6,28.7,28.6,28.6,20.7。

实施例3

式V化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸乙酯在生物催化剂的作用下反应生成式VI化合物(3R,5R)-6-腈基二羟基己酸乙酯，反应式如下：

具体反应过程如下：将式V化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸乙酯(100.0g，0.51mol)溶于400mL乙酸乙酯，在5L烧杯中控制反应体系为2L，用1.3L灭菌后的Tri-HCl缓冲溶液悬浮具有羰基还原酶活性的基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2.5mol/L的葡萄糖200mL，3.5g的NADP+，将溶有式V化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸乙酯的乙酸乙酯溶液缓慢倒入摇瓶中，投入羰基还原酶基因工程菌全细胞的量为90g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为35℃，pH为8；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，纯化，得到式VI化合物(3R,5R)-6-腈基二羟基己酸乙酯(73.2g，0.36mol)，de值为96.5％。ESI-MS：m/z 202.30[M+H]⁺；¹H-NMR(CD₃Cl,400MHz)：δ4.12(q,J＝13.6Hz,2H),3.85-3.83(m,1H),3.63-3.60(m,1H),3.55(br s,2H),2.69-2.66(m,1H),2.54-2.51(m,1H),2.46-2.42(m,1H),2.29-2.26(m,2H),1.58-1.56(m,1H),1.27(t,J＝13.6Hz,3H)；¹³C-NMR(CD₃Cl,125MHz)：δ173.2,117.3,63.5,61.1,60.3,42.7,41.6,25.6,14.3。

实施例4

式VII化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸乙酯在生物催化剂的作用下反应生成式VIII化合物(3R,5S)-6-乙酰氧基二羟基己酸乙酯，反应式如下：

将式VII化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸乙酯(11.2g，48.5mmol)溶于40mL乙酸乙烯酯，在1L摇瓶中控制反应体系为300mL，用230mL灭菌后的碳酸盐缓冲溶液悬浮具有羰基还原酶活性的基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2.5mol/L的葡萄糖20mL，0.26g的NADP+，将溶有式VII化合物3,5-二氧代-6-乙酰氧基己酸乙酯的乙酸乙烯酯溶液缓慢倒入摇瓶中，投入羰基还原酶基因工程菌全细胞的量为75g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为28℃，pH为9；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，纯化，得到式VI I I化合物(3R,5S)-6-乙酰氧基二羟基己酸乙酯(7.65g，32.7mmol)，de值为95.1％。ESI-MS：m/z 235.23[M+H]⁺；¹H-NMR(CD₃Cl,400MHz)：δ4.36-4.33(m,1H),4.15(q,J＝13.6Hz,2H),4.10-4.08(m,1H),3.86-3.84(m,1H),3.56(brs,1.5H),3.52-3.50(m,1H),2.53-2.51(m,1H),2.28-2.26(m,2H),2.21(s,3H),1.59-1.56(m,1H),1.27(t,J＝13.6Hz,3H)；¹³C-NMR(CD₃Cl,125MHz)：δ173.0,170.1，65.4,63.0,62.1,42.8,40.8,20.7，14.3。

实施例5

式Ⅸ化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸叔丁酯在生物催化剂的作用下反应生成式Ⅹ化合物(3R,5R)-6-腈基二羟基己酸叔丁酯，反应式如下：

将式Ⅸ化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸叔丁酯(5.0g，22.2mmol)溶于40mL DMF，在500mL摇瓶中控制反应体系为150mL，用100mL灭菌后的MOPS缓冲溶液悬浮具有二羰基还原酶活性的基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶，加入2.5mol/L的葡萄糖10mL，0.15g的NADP+，将溶有式Ⅸ化合物3,5-二氧代-6-腈基己酸叔丁酯的DMF溶液缓慢倒入摇瓶中，投入二羰基还原酶基因工程菌全细胞的量为60g/L，投入葡萄糖脱氢酶的量为25mg/L，控制转化体系的温度为25℃，pH为6.5；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为12h，纯化，得到式Ⅹ化合物(3R,5R)-6-腈基二羟基己酸叔丁酯(3.76g，16.4mmol)，de值为94.8％。ESI-MS：m/z 230.31[M+H]⁺；¹H-NMR(CD₃Cl,400MHz)：δ3.86-3.84(m,1H),3.64-3.60(m,1H),3.54(br s,2H),2.69-2.67(m,1H),2.53-2.50(m,1H),2.46-2.42(m,1H),2.29-2.26(m,2H),1.57-1.55(m,1H),1.37(s,9H)；¹³C-NMR(CD₃Cl,125MHz)：δ173.2,117.3,83.3,64.5,60.1,42.7,41.6,25.7,27.8,27.7,27.7。

本发明的方法通过较佳实施例进行了描述，相关领域人员明显能在本发明内容和范围内对本发明中所述的方法和应用在有必要的地方稍加适当常识性的调整、改动和组合，来实现和应用本发明技术。本领域人员也可以借鉴本发明内容，通过适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的改进和调整对本领域技术人员来说是显而易见的，都应被视为包括在本发明之内。

序列表

<110> 浙江宏元药业股份有限公司

<120> 二羰基还原酶及其在他汀类药物中间体合成中的应用

<141> 2019-01-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 1

Met Ala Ile Pro Ala Pro Gly Leu Gly Thr Pro Ala Leu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ala Val Ile Ala Ser Val Leu Ala Ala Leu Ala Val Gly Thr Ala Ala

20 25 30

Ile Ala Thr Ala Gly Ile Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ile Gly Gly Ala

35 40 45

Ile Thr Gly Ser Gly Val Ser Ala Gly Ala Leu Pro Leu Thr Thr Leu

50 55 60

Ile Thr Val Ala Ala Pro Ala Gly Ala Leu Pro Ile Pro Ser Leu Leu

65 70 75 80

Gly Ser Leu Gly Leu Leu Ala Thr Ala His Val Ala Leu Thr Leu Ile

85 90 95

His Thr Pro Ala Pro Ala Leu Gly Val Ser Ile Pro Gly Ile Met Gly

100 105 110

Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly Gly Gly Leu Thr Leu Gly Ile Gly Ile

115 120 125

Ser Ala Pro Ala Ile Ala Leu Thr Gly Gly Ala Ile Ala Thr Ile Gly

130 135 140

Val Gly His Ile Ala Thr Ala Gly Ile Gly Leu Ser Pro Thr Leu Gly

145 150 155 160

Ala His Leu Leu Val Ala Pro Leu Gly Gly Leu Ala Ile Ala Val Thr

165 170 175

Ser Thr Met Thr Leu Ala Thr Gly Leu Val Leu Gly Ala Pro Val Leu

180 185 190

Ala Gly Ile Ala Ala Ala His Leu Ala Thr Thr Ala Gly Ile Ala Leu

195 200 205

Ala Thr Ala Leu Gly Ala Gly Pro Ala Val Ile Pro Ser Ser Thr Leu

210 215 220

Ala Gly Ala Leu Ile Ser Ala Leu Leu Ala Gly Ala Ile Gly Leu Thr

225 230 235 240

Ser Ala Gly Met Gly Met Ile Ala Gly Leu Ala Ala Ala Ser Ala Gly

245 250 255

Val Ser Pro Gly Pro Thr Ala Pro Val Thr Ala

260 265

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> Acinetobacter baumannii

<400> 2

atgaatattc ctcgttttgg tttaggcact ttccgcttga aagaacaagc tgttatcgat 60

tctgtcaaga acgcccttga cgtaggatat cgagcaatag ataccgcgca gatttacgac 120

aatgaggctg ccatcgggca agcaataaca gaatccggtg tgtcacggca ggatctcttt 180

ctaacgacta aaatttgggt tgacaacttc gcgcaagata agtttatccc ctcgctgaaa 240

gagagtttac agaagttgag aaccgaccat gtcgatctta cactcataca ctggccagct 300

ccggacctag gcgtaagcat tcctgaaatc atgcaactgt tattggaggc caaacagcaa 360

ggacttacga agcagatagg gatttctaat ttcaacatcg cactcactca acaggcgata 420

gataccattg gtgtggaaca tatcgctaca aatcaaatag agctatcccc ctatctgcag 480

aaccacaaat tagttaattt tttgcaagaa aagaacattg acgtcacgtc atacatgact 540

cttgcctatg gcaaagtact ccagaatcca gtgctagcag agatcgcggc tgcccataag 600

gcaaccacag cgcaaatagc tctggcctgg gcattacaga ggggattcgc ggttattccg 660

tcgagtacga aacgtgaaaa cttgatcagc aatcttaagg ctcaagatat agagctcact 720

tctgccgaaa tgcagatgat tgcagagcta gaccgcaact cccgagaagt ctcacctgag 780

ccctgggcgc cagtatggga t 801

Claims

1.一种二羰基还原酶，其特征在于，为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的二羰基还原酶，其特征在于，所述二羰基还原酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述的二羰基还原酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

4.权利要求1所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用。

5.根据权利要求4所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，包括以下步骤：式II化合物在二羰基还原酶的作用下反应生成式I化合物，反应式如下：

其中，R₁选自乙酰氧基、腈基、卤素、芳香基、烷基；R₂选自烷基、环烷基。

6.根据权利要求5所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，R₁选自腈基或乙酰氧基；R₂选自乙基或叔丁基，方案选自如下反应：

反应1：

；

反应2：

；

反应3：

；

反应4：

。

7.根据权利要求6所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，所述二羰基还原酶为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞，反应过程中，需添加辅酶，所述辅酶为NADP+或NADPH。

8.根据权利要求6所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，反应在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，所述的二羰基还原酶为基因工程菌全细胞，其投入量控制为50-110g/L，反应转化温度控制为25-37℃，pH控制为6-9。

10.根据权利要求7所述的二羰基还原酶在瑞舒伐他汀、阿托伐他汀中间体合成中的应用，其特征在于，所述反应在助溶剂存在的条件下进行，所述助溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。