WO1999020121A2 - Methods for obtaining protein mixtures and control factors from wound granulation, epithelialization or determined blastocyst tissue - Google Patents

Methods for obtaining protein mixtures and control factors from wound granulation, epithelialization or determined blastocyst tissue Download PDF

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WO1999020121A2
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granulation
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to various methods, in particular
  • control factors mentioned are substances which control the granulation and epithelization processes in wound tissues, ie they activate or interrupt the individual phases of these processes),
  • the granulation tissue formed in the wound is removed. This is then freed of general protein and lipids.
  • the dry powder obtained is processed into an aqueous extract. This extract can be injected into animals that have 6 to 8 Blood is taken days later from which the aforementioned stimulated serum is obtained.
  • the known method has been further developed in accordance with DE-PS 885127 in such a way that wound granulation tissue removed from animals is grown in the presence of a nutrient medium, the culture is carefully injured after visible response and a tissue extract is obtained from the culture after a certain further growth period.
  • the wound healing process is a convincing teaching example of nature, how a tissue defect is repaired by a juvenile, initially still undifferentiated tissue and how this undifferentiated tissue, subordinate to the central care and the central metabolism, is differentiated again and inserted into the whole organism.
  • juvenile cells sprout from the tissue, which is still intact in the periphery of the wound, which are then stimulated by proliferation-requiring factors to enormous cell division (proliferation) for the purpose of bridging and filling the defect. Once this purpose is achieved, the body produces factors that abruptly stop cell division and the conversion of juvenile wound tissue into differentiated tissue. Force structures and their classification in the overall organism.
  • control factors are referred to as "control factors" in the context of the invention. They are also contained in the previously known extract from wound granulation tissue.
  • the blastocyst can also be used at the stage of its determination as a starting material for the extraction of the substances which act analogously to the wound tissue (see Example 3).
  • the well-known extract from wound granulation tissue and the well-known serum stimulated by wound healing processes can be used successfully for the treatment of infectious diseases (by bacteria and / or Viruses and / or fungi caused) are used.
  • infectious diseases by bacteria and / or Viruses and / or fungi caused
  • a short-term or immediate amalgamation of the disease is achieved, i.e. the frequently threatening symptoms, such as poor general condition, fever, chills, vomiting, coughing, shortness of breath, poor circulation and generalization of the infection, disappear in a much shorter time than when using other therapies .
  • the invention is therefore based on the object of specifying methods by means of which
  • the protein mixtures mentioned can be obtained in larger amounts, in higher concentrations and at lower costs than previously (the therapeutic use of these more highly concentrated protein mixtures is ultimately intended to achieve a greater healing effect) and
  • the isolated control factors ultimately have a much stronger curative effect on cancer than the protein mixtures.
  • the following new operating methods are used to obtain the starting material (basic substance) compared to the known methods:
  • wounds are placed on mammals using special surgical procedures
  • carcinomas originate from ectodermal cells
  • the active substances which are formed in the epithelization tissue analogously to those in the wound granulation tissue, have a greater healing effect in diseases of tissue systems of ectodermal origin (skin, mucous membrane) due to affinity.
  • methods for obtaining epithelization tissue were also developed analogously to the methods given under (aa) (see Example 2 and FIGS. 2 and 3).
  • (ac) Blastocyst tissue in the state of determination is used as the starting material in order to obtain the substances which are analogous to the wound tissue.
  • FIG. 1 shows a flow diagram with a schematic representation of the embodiments of the processing rails G, S and L according to the invention
  • FIG. 2 shows a schematic sectional view of the implantation of a trap-like structure in an artificial wound
  • Fig. 3 is a schematic sectional view similar to Fig. 1, but for the case of the implantation of a net-like structure in an artificial wound.
  • Process line G low molecular weight total proteins in concentrated dosage form
  • Process track S control factors for proliferation termination and. Promotion of proliferation
  • Process line L lipid fraction for the manufacture of medicaments for skin diseases
  • Fig.l the new process stages compared to DE-PS 862942 and DE-PS 885127 are marked dark.
  • the starting material is referred to using the aforementioned surgical procedures either as wound granulation tissue, in FIG. 1 as “process stage aa”, as epithelization tissue, in FIG. 1 as “process stage ab”, or as blastocyst tissue, in FIG. 1 as “process stage ac” , won.
  • FIG 1 shows the sequence of the process line S (obtaining the control factors) in the left half from top to bottom, and the sequence of the process line G (obtaining the low-molecular total proteins) from top to bottom in the right half.
  • process line L (obtaining a specific lipid fraction) is indicated in FIG. 1 and is shown there as a stage branching off from the process stage bg of the process line G from right to left.
  • the product of this process line is a low molecular weight protein mixture.
  • the process rail G is used to produce the low-molecular protein mixture in a larger amount, in a higher concentration and at a lower cost; the end product is a pure low-molecular total protein mixture.
  • the starting material is obtained using the new, economical processes aa, ab and ac mentioned above and processed further as follows (see also FIG. 1):
  • Process stages (bg) with (dg) of process rail G are described in Example 6. Therapy of malignant tumors (cancer diseases) with substances from healing tissue
  • malignant tumors develop specific proteins that can trigger an enormous increase in proliferation and enable independent metabolism, infiltrative growth and metastases.
  • Extracts from the recently published publications are reproduced below that indicate with a certain relevance the possible application of the control factors that can be obtained from wound tissue.
  • Telomerase is a biochemical agent that stimulates the cell division of egg cells (probably also sperm cells) and thus secures the continued existence (“immortality") of the "body” (i.e. whole organism) of the individual. Telomerase is also formed in the embryonic cell structure. It disappears when the undifferentiated embryonic cell network in the womb develops into a differentiated fetus (see also Example 3).
  • a biologically determined organism creates a tissue bandage that, like an embryonic tissue bandage (which emerges from the fertilized egg cell equipped with a diploid chromosome set), also has all the characteristics of an undifferentiated proliferating juvenile tissue, namely the wound tissue.
  • an embryonic tissue bandage which emerges from the fertilized egg cell equipped with a diploid chromosome set
  • nature shows that biological substances are generated in the wound healing process, which abruptly interrupt the initially strongly stimulated cell division of the juvenile tissue and integrate its metabolism and blood supply in a subordinate manner to the whole organism.
  • a therapeutic application of control factors in wound healing processes would thus provide a therapeutically effective method with which cancerous diseases can be treated in a targeted and selective manner, but above all biologically.
  • the end product of this process line is pure lipid fractions from wound tissue.
  • Example 1 Implantation of a trap-like structure in a wound
  • Example 2 Mesh implantation on an artificial skin defect
  • Example 4 Determination of the most favorable time for tissue removal.
  • Example 5 Removing granulation, epithelization or blastocyst tissue.
  • Example 6 Processing of starting material into low-molecular total proteins.
  • Example 7 Genetic engineering processes for producing the genetic characteristics of the control factors and
  • a wound that is as long and deep as possible is surgically placed under sterile conditions in local anesthesia.
  • the neck region is best suited for this because there are no strong stress reactions.
  • a torsionally stable, trap-like structure made of indifferent material e.g. plastic, titanium, silicon, etc.
  • indifferent material e.g. plastic, titanium, silicon, etc.
  • the entire epithelium is removed in a largest possible field to obtain epithelization tissue, any fascia located below it is removed, and the muscle tissue is then superficially injured.
  • a close-meshed network of silicone etc. is placed directly on the wound bed of the muscle, attached to the skin edges with sutures, and the defect is covered sterile with special gauze. In this way, a much larger amount of epithelializing tissue is created compared to the previous method.
  • blastocyst tissue as a starting material
  • the fertilized egg cell After implantation, the fertilized egg cell initially forms a solid, spherical, undifferentiated cell structure, the so-called morula.
  • the blastocyst which is a germinal bladder, develops from it around the 4th day after fertilization (Blastocyst cavity) with outer (throphoblast) and inner (embryoblast) cell layers.
  • Furrowing results in the invasion of the germ bladder and thus the formation of the anatomically and functionally differentiated and finally determined cotyledons ectoderm, endoderm and mesoderm. This process is called "gastrulation”.
  • blastocyst tissue the blastocyst is removed on the 4th day after fertilization in an animal or after slaughter.
  • the optimal time for the removal in the hourly range
  • control factor PA proliferation termination
  • epithelializing tissue In order to obtain the control factor PA from epithelializing tissue, this must be done at the end of epithelializing, i.e. at the end of the defect coverage.
  • control factor PF proliferation promotion
  • the start of wound granulation which is usually on the 3rd to 5th postoperative day, can be easily determined macroscopically by the appearance of the typical "little wounds".
  • the beginning of epithelization by the marginal overgrowth of skin in the wound bed and the termination of epithelization by the complete defect closure with skin can be easily determined macroscopically.
  • the operations take place between the 8th to the 40th postoperative day.
  • proliferating, juvenile and determined tissues are simple for histologists. For this purpose e.g. With a biopsy needle, test material was taken from the wound granulation, epithelization or blastocyst tissue at the presumed times.
  • wound tissue obtained according to process steps (aa) or (ab) or the blastocyst tissue obtained according to (ac) can either be surgically removed from live animals under sterile caulks and local anesthesia or from dead animals after slaughter.
  • the removed tissue must be immediately covered with toluene.
  • the animal can be in the intended
  • the wound tissue is initially removed by excision in the healthy tissue. Then the pure granulation tissue or epithelialization tissue is detached by separating the surrounding tissue (muscles, skin) at the visible borders of the trap or the applied mesh. Then the granulation tissue formed in the trap or the epithelization tissue formed over the mesh is triggered and further processed as described in Example 6.
  • the granulation, epithelization, blastocyst tissue or serum obtained from either an animal or a human is freed from lipids.
  • Lipids are to be understood as the actual fats and the fat-like substances.
  • the tissue together with toluene is first largely crushed and homogenized in the sterilized processing device (e.g. in a meat grinder).
  • the toluene is then filtered off with suction and four times the amount by weight of acetone is added to the tissue and extracted in a sterilized stirrer for 2 to 3 hours at an ambient temperature of 0 ° C. Then the acetone is sucked off.
  • tissue residue is again mixed with the same volume of a mixture of 1: 1 acetone and diethyl ether, extracted again in the agitator for 30 minutes and then suction filtered. Then the same volume of diethyl ether is added and extracted again for 30 minutes. The ether is then suction filtered. After the last diethyl ether solution has been separated off, a first protein product is obtained in the form of a sterile lipid-free dry powder. All available lipid extraction substances are kept for the extraction and further use of the lipids and further processed within the lipids process line.
  • the lipid-free dry powder is mixed with 100 times the amount by weight of sterilized, distilled water and with 1 1/2 times the weight of sterilized Ringer's solution, overlaid with toluene and sterile in the refrigerator for 24 hours at a temperature of + 2 ° C aqueous leached.
  • aqueous solution which is then prepared as follows:
  • the total protein extract is processed in a spiral tube dialysis kettle, the low-molecular fractions diffusing into the external rinsing medium.
  • the external dialysate obtained in this way contains a mixture of low molecular weight proteins with which the therapeutic effects mentioned can be achieved.
  • This protein mixture also contains the control factors listed above, which are particularly suitable for the treatment of cancer (see therapy of malignant tumors). If necessary, it can also be used for the direct acquisition of isolated control factors.
  • the water of the external dialysate is evaporated in a vacuum kettle at a maximum temperature of 36 ° C (because higher temperatures significantly affect the effectiveness of the proteins) until an aqueous solution concentrated to 70 to 100 times is obtained or until a water-soluble dry powder is obtained (lyophilization ). Both products can then be converted into therapeutic preparations that can be used parenterally in the usual way.
  • blood can also be taken from humans (with their consent) if they undergo a wound healing process.
  • the serum produced from this blood in a known manner can be used for further processing and the wound tissue obtained in the aforementioned manner can be processed.
  • the low-molecular total proteins obtained after the "total protein process stage” contain those proteins which can be used therapeutically as control factors.
  • comparative analyzes are carried out with protein mixtures from other tissues, e.g. with muscle tissue from the wound area.
  • proteins are isolated chromatographically that appear for the first time in comparison tests with other tissues.
  • One of the desired proteins (control factor) is separated by conventional separation methods, e.g. using preparative column chromatography, including HPLC and isoelectric focusing, isolated and presented purely.
  • control factor PF is identical to the isolated protein
  • it is injected into animals with a freshly placed wound which has been left open and closed with a window dressing. Is the protein with that Control factor PF identical, then granulation (proliferation) is significantly stimulated in the wound.
  • the proteins determined in this way are then ordered, e.g. at BACHEM Inc., the amino acid sequences determined.
  • the amino acid code serves among other things checking whether the original protein or its original secondary products are still in use in the further process steps.
  • the corresponding protein is expressed from the cells of the starting material (wound tissue (aa) and (ab) or blastocyst tissue (ac)) and the corresponding mRNA is obtained therefrom.
  • the mRNA must contain the code of the amino acid sequences of the original protein (sequence test).
  • This mRNA can e.g. using SMART technology to convert the single-stranded cDNA with primers into the double-stranded DNA.
  • the bland-end DNA fragment is inserted into a bland-end cut vector with restriction enzymes and integrated with ligase.
  • the resulting plasmid is after the transfection, e.g. cloned with E. coli.
  • the resulting (round) plasmid is e.g. with adenoviruses, transduced into suitable mammalian cells. The transduced cells are then grown in vitro as cultures.
  • a special therapeutic method is that, for example, cancer cells from a patient, which are obtained during operations or from sample excisions, are used as recipient cells. For this purpose, they are transduced with a plasmid which contains genetic characteristics of the control factors. If these transduced cells are replanted to the patient, there is the possibility of triggering a biological chain reaction. sen, which leads to the termination of the proliferation and thus to the natural death of the cancerous tissue.
  • the genetically transduced cells are now grown in tissue cultures in vitro, whereby the genetic characteristic of the control factor per cell proliferation increases in a ratio of 1: 1.
  • the finished product DMEM solution can be used as the nutrient medium.
  • the solution is filled into culture bottles (50-500ml), the valve of which must remain open so that the C0 2 necessary for the culture to breathe and which is added to the brood air can penetrate into the bottle.
  • the genetically engineered cell material is introduced.
  • the control factor PF can be added to stimulate the greatest possible mitotic activity. Breeding is carried out in a known manner in the heated and thermostated, germ-free brood chamber.
  • the culture is discontinued and used as the starting material. From this, a low-molecular protein is obtained in a known manner (analogous to the overall protein process), which contains a control factor in concentrated form.
  • Example 8 the cell cultures grown according to Example 8 can be processed according to the process steps of the "total protein processing track" (Example 6).
  • the lipid removal can be omitted.
  • the protein mixture is dialyzed, the outer dialysate is separated off and concentrated or lyophilized in the usual way.
  • the extraction media eg, acetone, diethyl ether, toluene
  • the extraction media eg, acetone, diethyl ether, toluene
  • suction and / or substance gently evaporated by pressure reduction process from ⁇ If necessary, the residue is washed out with ethanol.
  • the lipid fractions obtained in this way are introduced into an ointment, cream or lotion base or into other solution carriers and used as dermatological medicines.

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Abstract

The invention relates to methods of obtaining control factors for the start and end phases of wound granulation and epithelialization from animal wound tissue or human or animal blood, whereby the granulation tissue and/or epithelialization tissue is removed from the wound of an animal or from the blood of a human being or an animal undergoing a healing process or from the blastocyst system of a human being or an animal; the lipids are separated from the above mentioned tissue or blood or serum thereof; solids and high molecular protein are removed from the first product obtained and the desired control factors are isolated from the second product obtained. The control factors are suitable for the production of medicaments.

Description

VERFAHREN ZUM GEWINNEN VON PROTEINGEMISCHEN UND STEUERUNGSFAKTOREN AUS WUNDGRANULATIONS-, EP1THELISIERUNGS- ODER DETERMINIERTEM BLASTOZYSTENGEWEBE METHOD FOR OBTAINING PROTEIN MIXTURES AND CONTROL FACTORS FROM Wound GRANULATION, EP1THELIZATION OR DETERMINATED BLASTOCYST TISSUE
RPRC! rp.ihιmgRPRC! rp.ihιmg
ie Erfindung betrifft verschiedene Verfahren, insbesondereThe invention relates to various methods, in particular
a) zur Gewinnung von niedermolekularen Proteingemischen aus Wundgeweben von Tieren,a) for obtaining low molecular weight protein mixtures from wound tissue from animals,
b) zur Gewinnung von Steuerungsfaktoren für Startphasen und Beendigungsphasen der Wundgranulation und der Epitheli- sierung aus Wundgeweben von Tieren oder aus Blut von Menschen oder Tieren (bei den genannten Steuerungsfaktoren handelt es sich um Stoffe, welche die Granulationε- und Epithelisierungsvorgänge in Wundgeweben steuern, d.h. sie aktivieren oder unterbrechen die einzelnen Phasen dieser Vorgänge) ,b) to obtain control factors for start phases and completion phases of wound granulation and epithelization from wound tissues from animals or from blood from humans or animals (the control factors mentioned are substances which control the granulation and epithelization processes in wound tissues, ie they activate or interrupt the individual phases of these processes),
c) zur Gewinnung von niedermolekularen Proteingemisehen aus Blastozystengewebe im Stadium der Gastrulation und von Steuerungsfaktoren für die Beendigung der Proliferation von Blastozystengewebe im Stadium der Gastrulation,c) to obtain low-molecular protein mixtures from blastocyst tissue in the gastrulation stage and to control factors for stopping the proliferation of blastocyst tissue in the gastrulation stage,
d) zur Gewinnung von niedermolekularen Proteingemischen aus Blut oder Blutserum von Menschen oder Tieren, welches durch Wundheilungsprozesse stimuliert wurde, undd) for obtaining low molecular weight protein mixtures from the blood or blood serum of humans or animals, which has been stimulated by wound healing processes, and
e) zur Gewinnung von Lipidextrakten aus Wundheilungs- oder Blastozystengeweben.e) for the extraction of lipid extracts from wound healing or blastocyst tissues.
Diese Verfahren bilden einen einheitlichen Verfahrenskomplex, da sie alle von tierischem Granulations- oder Epithelisierungsgewebe, von menschlichem oder tierischem Blastozystengewebe oder Blut bzw. Blutserum ausgehen und zur Bereitstellung von Stoffen zur Behandlung von bestimmten Krankheiten dienen. Aus der DE-PS 862942 ist ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebeextrakts und eines durch diesen Extrakt stimulierten Serums bekannt . Bei diesem Verfahren werden Säugetieren einfache Schnittwunden gesetzt, die mit Schichtnähten verschlossen wer- den.These methods form a uniform complex of processes, since they all originate from animal granulation or epithelization tissue, from human or animal blastocyst tissue or blood or blood serum and serve to provide substances for the treatment of certain diseases. From DE-PS 862942 a method for producing a tissue extract and a serum stimulated by this extract is known. In this procedure, simple cuts are made to mammals, which are closed with layered sutures.
Nach einem" Wundheilungsprozeß von 5 bis 8 Tagen wird das in der Wunde gebildete Granulationsgewebe entnommen. Dieses wird dann von Allgemeineiweiß und Lipiden befreit . Das erhaltene Trocken- pulver wird zu einem wäßrigen Extrakt verarbeitet. Dieser Extrakt kann Tieren eingespritzt werden, denen 6 bis 8 Tage später Blut entnommen wird, aus dem man das vorgenannte stimulierte Serum gewinnt.After a " wound healing process of 5 to 8 days, the granulation tissue formed in the wound is removed. This is then freed of general protein and lipids. The dry powder obtained is processed into an aqueous extract. This extract can be injected into animals that have 6 to 8 Blood is taken days later from which the aforementioned stimulated serum is obtained.
Das bekannte Verfahren wurde gemäß der DE-PS 885127 dahingehend weiterentwickelt, daß von Tieren entnommenes Wundgranula ionsgewebe in Gegenwart eines Nährmediums gezüchtet, die Kultur nach sichtbarem Angehen vorsichtig verletzt und nach einer bestimmten weiteren Wachstumszeit aus der Kultur ein Gewebeex- trakt gewonnen wird.The known method has been further developed in accordance with DE-PS 885127 in such a way that wound granulation tissue removed from animals is grown in the presence of a nutrient medium, the culture is carefully injured after visible response and a tissue extract is obtained from the culture after a certain further growth period.
Der Wundheilungsprozeß ist ein überzeugendes Lehrbeispiel der Natur, wie ein Gewebedefekt durch ein juveniles, zunächst noch undifferenziertes Gewebe repariert wird und wie dieses undiffe- renzierte Gewebe dann, der zentralen Versorgung und dem zentralen Stoffwechsel untergeordnet, wieder differenziert und in den Gesamtorganismus eingefügt wird.The wound healing process is a convincing teaching example of nature, how a tissue defect is repaired by a juvenile, initially still undifferentiated tissue and how this undifferentiated tissue, subordinate to the central care and the central metabolism, is differentiated again and inserted into the whole organism.
Zunächst sprießen aus dem in der Peripherie der Wunde noch in- takten Gewebe juvenile Zellen aus, die dann durch proliferati- onsfordernde Faktoren zur enormen Zellteilung (Proliferation) zum Zweck der Defektüberbrückung und Defektausfüllung angeregt werden. Sobald dieser Zweck erreicht ist, produziert der Körper Faktoren, welche die Zellteilung abrupt stoppen sowie die Um- Wandlung der juvenilen Wundgewebe in differenzierte Gewebe- Strukturen und deren Einordnung in den GesamtOrganismus erzwingen.First, juvenile cells sprout from the tissue, which is still intact in the periphery of the wound, which are then stimulated by proliferation-requiring factors to enormous cell division (proliferation) for the purpose of bridging and filling the defect. Once this purpose is achieved, the body produces factors that abruptly stop cell division and the conversion of juvenile wound tissue into differentiated tissue. Force structures and their classification in the overall organism.
Diese Faktoren werden im Rahmen der Erfindung als "Steuerungsfaktoren" bezeichnet. Sie sind auch in dem bisher bekannten Extrakt aus Wundgranulationsgewebe enthalten.These factors are referred to as "control factors" in the context of the invention. They are also contained in the previously known extract from wound granulation tissue.
Wenn im embryonalen, undifferenzierten Zellgewebeverband der Morula während der Phase, in der sich die Blastozyste entwik- kelt und bei der Gastrulation der Übergang in die endgültig anatomisch und funktionell differenzierten Keimblätter erfolgt, läuft ein den Wundheilungsprozessen biologisch identischer Vorgang ab. Zu diesem Zeitpunkt müssen also ebenfalls Regulations- mechanismen wirksam werden, die eine weitere Proliferation un- differenzierten embryonalen Gewebes unterbinden und die Differenzierung in die Wege leiten.If in the embryonic, undifferentiated cell tissue association of the morula during the phase in which the blastocyst develops and during the gastrulation, the transition to the finally anatomically and functionally differentiated cotyledons takes place, the wound healing processes are biologically identical. At this point in time, regulatory mechanisms must also take effect that prevent further proliferation of undifferentiated embryonic tissue and initiate differentiation.
Deshalb kann auch die Blastozyste im Stadium ihrer Determinierung als Ausgangsmaterial für die Gewinnung der dem Wundgewebe analog wirksamen Substanzen verwendet werden (siehe Beispiel 3) .For this reason, the blastocyst can also be used at the stage of its determination as a starting material for the extraction of the substances which act analogously to the wound tissue (see Example 3).
Außerdem ist bekannt, daß heilende Wunden selbst gegen hochgradig pathogene Infekte (z.B. Milzbrand) praktisch immun sind.It is also known that healing wounds are practically immune even to highly pathogenic infections (e.g. anthrax).
Untersuchungen zeigten, daß die parenterale Anwendung des bekannten Extraktes aus Wundgranulationsgewebe ausgeprägte Stimulationen des reticuloendothelialen Systems, Aktivierungen des Immunsystems, der erythropoetischen und leukopoetischen Systeme und der zellulären Phagozytose verursachen.Investigations showed that the parenteral application of the known extract from wound granulation tissue causes pronounced stimulations of the reticuloendothelial system, activations of the immune system, the erythropoietic and leukopoetic systems and the cellular phagocytosis.
Deshalb kann, wie klinische Untersuchungen beweisen, der bekannte Extrakt aus Wundgranulationsgewebe und das bekannte, durch Wundheilungsprozesse stimulierte Serum erfolgreich zur Behandlung von Infektionskrankheiten (durch Bakterien und/oder Viren und/oder Pilze verursacht) eingesetzt werden. Damit wird unter anderem eine kurzfristige oder sofortige Kupierung der Erkrankung erreicht, d.h. die häufig bedrohlichen Symptome, wie schlechter Allgemeinzustand, Fieber, Schüttelfrost, Erbrechen, Husten, Atemnot, Kreislaufschwäche und Generalisierung des Infektes, verschwinden in einer wesentlich kürzeren Zeit als bei Anwendung anderer Therapien.Therefore, as clinical studies prove, the well-known extract from wound granulation tissue and the well-known serum stimulated by wound healing processes can be used successfully for the treatment of infectious diseases (by bacteria and / or Viruses and / or fungi caused) are used. Among other things, a short-term or immediate amalgamation of the disease is achieved, i.e. the frequently threatening symptoms, such as poor general condition, fever, chills, vomiting, coughing, shortness of breath, poor circulation and generalization of the infection, disappear in a much shorter time than when using other therapies .
Weitere klinische Untersuchungen haben erwiesen, daß der be- kannte Extrakt aus Wundgranulationsgewebe und das bekannte, durch Wundheilungsprozesse stimulierte Serum auch erfolgreich zur Behandlung von malignen Tumoren, schlechtheilenden Wunden, Ulkuskrankheiten, Leberzirrhose, Schrumpfniere , Abnutzungs- krankheiten und Immunschwäche eingesetzt werden kann.Further clinical examinations have shown that the known extract from wound granulation tissue and the known serum stimulated by wound healing processes can also be used successfully for the treatment of malignant tumors, poorly healing wounds, ulcer diseases, cirrhosis of the liver, shrinking kidney, wear and tear and immune deficiency.
Darüber hinaus muß die Frage einer Impf-Prophylaxe bei durch diese Krankheiten gefährdeten oder für diese Krankheiten prädestinierten Patienten in Erwägung gezogen werden.In addition, the issue of vaccination prophylaxis in patients at risk or predestined for these diseases must be considered.
Außerdem kann angenommen werden, daß bei endemisch und/oder epidemisch auftretenden Infektionskrankheiten mit dem bekannten Extrakt aus Wundheilungsgewebe eine generell wirksame Impfme- thode verfügbar ist .In addition, it can be assumed that a generally effective vaccination method is available for endemic and / or epidemic infectious diseases with the known extract from wound healing tissue.
Hierzu wird beispielsweise auf folgende Literatur hingewiesen:For example, reference is made to the following literature:
J. Hammerschmid, "Münchener Medizinische Wochenschrift",J. Hammerschmid, "Munich Medical Weekly Journal",
95. Jahrgang (1953), Nr. 3995th year (1953), No. 39
A. Kressner, "Münchener Medizinische Wochenschrift", 96. Jahrgang (1954), Nr. 30A. Kressner, "Munich Medical Weekly Journal", 96th year (1954), No. 30
V. di Carlo, "La Riforma Medica" ,V. di Carlo, "La Riforma Medica",
Ano 1954, Nr. 45Ano 1954, No. 45
J. Hammerschmid, "Münchener Medizinische Wochenschrift",J. Hammerschmid, "Munich Medical Weekly Journal",
97. Jahrgang (1955), Nr. 39 J. Hammerschmid, "Medizinische Klinik", 50. Jahrgang (1955), Nr. 2797th year (1955), No. 39 J. Hammerschmid, "Medical Clinic", 50th year (1955), No. 27
S. Nitschkoff, "Münchener Medizinische Wochenschrift", 97. Jahrgang (1955), Nr. 46S. Nitschkoff, "Munich Medical Weekly Journal", 97th year (1955), No. 46
A. Kirchdorfer, "Rassegna Internationale di Clinica e Terapia", Band XXXV (1955), Nr.13A. Kirchdorfer, "Rassegna Internationale di Clinica e Terapia", Volume XXXV (1955), No. 13
Es besteht daher ein großes Bedürfnis, die in Wundgeweben und/oder Blastozystengeweben enthaltenen Proteingemische und Steuerungsfaktoren in ausreichenden Mengen zur Verfügung zu stellen, um sie zur Behandlung der genannten Krankheiten und Defekte umfangreich einsetzen zu können.There is therefore a great need to provide the protein mixtures and control factors contained in wound tissues and / or blastocyst tissues in sufficient quantities to be able to use them extensively for the treatment of the diseases and defects mentioned.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren anzugeben, mit deren HilfeThe invention is therefore based on the object of specifying methods by means of which
1. die genannten Proteingemische in größeren Mengen, in höheren Konzentrationen und mit niedrigeren Kosten als bisher erhalten werden können (der therapeutische Einsatz dieser höher konzentrierten Proteingemische soll letztlich eine stärkere Heilwirkung erzielen) und1. the protein mixtures mentioned can be obtained in larger amounts, in higher concentrations and at lower costs than previously (the therapeutic use of these more highly concentrated protein mixtures is ultimately intended to achieve a greater healing effect) and
2. aus den genannten Proteingemischen jene Steuerungsfaktoren isoliert hergestellt werden können, welche die Proliferati- ons-, Einordnungs- und Epithelisierungsprozesse in Wundge- weben bzw. die Differenzierung des Blastozystengewebes im Stadium der Gastrulation regeln.2. Those control factors which regulate the proliferation, classification and epithelization processes in wound tissues or the differentiation of the blastocyst tissue at the stage of gastrulation can be produced in isolation from the protein mixtures mentioned.
Die isolierten Steuerungsfaktoren haben letztlich eine wesentlich stärkere Heilwirkung auf Krebserkrankungen als die Proteingemische.The isolated control factors ultimately have a much stronger curative effect on cancer than the protein mixtures.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Verfahren gelöst, welche gegenüber den in der DE-PS 862942 und der DE-PS 885127 beschriebenen Verfahren neue Verfahren darstellen sowie nachfol- gend und in den Patentansprüchen angegeben sind. Das Entscheidende der Erfindung ist die Darlegung bisher unbekannter Erkenntnisse, nämlich in welchen Geweben therapeutisch wirksame Substanzen zu welchen Zeiten gebildet werden und wie sie als Arzneistoffe verwendbar sind.This object is achieved according to the invention by methods which, compared to the methods described in DE-PS 862942 and DE-PS 885127, are new methods and are specified below and in the claims. The crucial point of the invention is the presentation of previously unknown findings, namely in which tissues therapeutically active substances are formed at what times and how they can be used as medicinal substances.
Die Stufen der erfindungsgemäßen Verfahren werden nachfolgend erläutert .The stages of the method according to the invention are explained below.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden zur Gewinnung des Ausgangsmaterials (Grundsubstanz) gegenüber den bekannten Verfahren folgende neue Operationsverfahren angewandt:According to a first embodiment of the invention, the following new operating methods are used to obtain the starting material (basic substance) compared to the known methods:
(aa) Zur Gewinnung von Wundgranulationsgewebe werden bei Säuge- tieren nach speziellen Operationsverfahren Wunden gesetzt(aa) To obtain wound granulation tissue, wounds are placed on mammals using special surgical procedures
(siehe Beispiel 1 und Fig. 1) .(see example 1 and Fig. 1).
(ab) Bisher wurde nur Wundgranulationsgewebe als Ausgangsmaterial verwendet .(ab) So far, only wound granulation tissue has been used as the starting material.
Nachdem jedoch z.B. Karzinome von ektodermalen Zellen abstammen, kann angenommen werden, daß die Wirksubstanzen, welche im Epithelisierungsgewebe analog zu jenen im Wundgranulationsgewebe gebildet werden, bei Erkrankungen von Gewebe-Systemen der ektodermalen Herkunft (Haut, Schleimhaut) affinitätsbedingt eine stärkere Heilwirkung haben. Deshalb wurden analog zu den unter (aa) angegebenen Methoden auch Verfahren zur Gewinnung von Epithelisierungsgewebe entwickelt (siehe Beispiel 2 und Fig. 2 und 3) . (ac) Als Ausgangsmaterial wird Blastozystengewebe im Zustand der Determinierung zur Gewinnung der dem Wundgewebe analog wirksamen Substanzen verwendet .However, since, for example, carcinomas originate from ectodermal cells, it can be assumed that the active substances, which are formed in the epithelization tissue analogously to those in the wound granulation tissue, have a greater healing effect in diseases of tissue systems of ectodermal origin (skin, mucous membrane) due to affinity. For this reason, methods for obtaining epithelization tissue were also developed analogously to the methods given under (aa) (see Example 2 and FIGS. 2 and 3). (ac) Blastocyst tissue in the state of determination is used as the starting material in order to obtain the substances which are analogous to the wound tissue.
Die Erfindung wird in den beigefügten Zeichnungen beispielhaft erläutert . Es zeigenThe invention is illustrated by way of example in the accompanying drawings. Show it
Fig. 1 ein Fließdiagramm mit schematischer Darstellung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen der Verarbeitungs- schienen G, S und L;1 shows a flow diagram with a schematic representation of the embodiments of the processing rails G, S and L according to the invention;
Fig. 2 eine schematische Schnittansicht der Implantation eines reusenartigen Gebildes in einer artifiziellen Wunde;2 shows a schematic sectional view of the implantation of a trap-like structure in an artificial wound;
Fig. 3 eine schematische Schnittansicht ähnlich Fig. 1, jedoch für den Fall der Implantation eines netzartigen Gebildes in einer artifiziellen Wunde.Fig. 3 is a schematic sectional view similar to Fig. 1, but for the case of the implantation of a net-like structure in an artificial wound.
Aus den Ausgangsmaterialien werden auf verschiedenen Verfah- rensschienen die folgenden therapeutisch wirksamen Endprodukte gewonnen:The following therapeutically effective end products are obtained from the starting materials on various process lines:
Verfahrensschiene G = niedermolekulare Gesamtproteine in konzentrierter DarreichungsformProcess line G = low molecular weight total proteins in concentrated dosage form
Verfahrensschiene S = Steuerungsfaktoren für Proliferationsab- bruch u. ProliferationsförderungProcess track S = control factors for proliferation termination and. Promotion of proliferation
Verfahrensschiene L = Lipidfraktion zur Herstellung von Medika- menten für HautkrankheitenProcess line L = lipid fraction for the manufacture of medicaments for skin diseases
Die Verfahrensschienen G, S und L sind in Fig. 1 erläutert.The process rails G, S and L are explained in FIG. 1.
In Fig.l sind die gegenüber der DE-PS 862942 und der DE-PS 885127 neuen Verfahrensstufen dunkel markiert. Das Ausgangsmaterial wird mit den vorgenannten Operationsverfahren entweder als Wundgranulationsgewebe, in Fig. 1 als "Verfahrensstufe aa" bezeichnet, als Epithelisationsgewebe, in Fig. 1 als "Verfahrensstufe ab" bezeichnet, oder als Blastozystengewebe, in Fig. 1 als "Verfahrensstufe ac" bezeichnet, gewonnen .In Fig.l the new process stages compared to DE-PS 862942 and DE-PS 885127 are marked dark. The starting material is referred to using the aforementioned surgical procedures either as wound granulation tissue, in FIG. 1 as "process stage aa", as epithelization tissue, in FIG. 1 as "process stage ab", or as blastocyst tissue, in FIG. 1 as "process stage ac" , won.
In Fig. 1 ist in der linken Hälfte von oben nach unten der Ab- lauf der Verfahrensschiene S (Gewinnung der Steuerungsfaktoren) , in der rechten Hälfte von oben nach unten der Ablauf der Verfahrensschiene G (Gewinnung der niedermolekularen Gesamtproteine) dargestellt.1 shows the sequence of the process line S (obtaining the control factors) in the left half from top to bottom, and the sequence of the process line G (obtaining the low-molecular total proteins) from top to bottom in the right half.
Ferner ist in Fig. 1 die Verfahrensschiene L (Gewinnung einer spezifischen Lipidfraktion) angegeben und wird dort als eine von der Verfahrensstufe bg der Verfahrensschiene G von rechts nach links abzweigende Stufe dargestellt.Furthermore, the process line L (obtaining a specific lipid fraction) is indicated in FIG. 1 and is shown there as a stage branching off from the process stage bg of the process line G from right to left.
Auf den Wortlaut in Fig. 1 und die dort ersichtliche Reihenfolge der Verfahrensstufen wird ausdrücklich Bezug genommen.Reference is expressly made to the wording in FIG. 1 and the order of the process stages that can be seen there.
Wie bereits erwähnt, können die oben angeführten Krankheiten erfolgreich mit den bekannten Proteingemischen behandelt wer- den. Eine Sonderstellung nimmt jedoch die Behandlung von Krebs- erkrankungen ein, worauf später eingegangen wird.As already mentioned, the diseases listed above can be successfully treated with the known protein mixtures. However, the treatment of cancer has a special position, which will be discussed later.
Mit den bekannten Verfahren konnten bisher nur die Proteingemische und diese nur in relativ niederen Konzentrationen herge- stellt werden. Außerdem konnte das Ausgangsmaterial bisher nur in geringen Mengen gewonnen werden. Das führte zu extrem hohen Herstellungskosten. Verfahrensschiene GSo far, only the protein mixtures, and these only in relatively low concentrations, could be produced with the known processes. In addition, the starting material has so far only been obtained in small quantities. This led to extremely high manufacturing costs. Process track G
Das Produkt dieser Verfahrensschiene ist ein niedermolekulares Proteingemisch.The product of this process line is a low molecular weight protein mixture.
Zur Herstellung des niedermolekularen Proteingemisches in größerer Menge, in höherer Konzentration und mit geringeren Kosten wird gemäß einer speziellen Ausfuhrungsform der Erfindung die Verfahrensschiene G angewandt, das Endprodukt ist ein reines niedermolekulares Gesamt-Proteingemisch.In accordance with a special embodiment of the invention, the process rail G is used to produce the low-molecular protein mixture in a larger amount, in a higher concentration and at a lower cost; the end product is a pure low-molecular total protein mixture.
Das Ausgangsmaterial wird mittels der obengenannten neuen, wirtschaftlichen Verfahren aa, ab und ac gewonnen und wie folgt weiterverarbeitet (siehe auch Fig. 1) :The starting material is obtained using the new, economical processes aa, ab and ac mentioned above and processed further as follows (see also FIG. 1):
(bg) Abtrennen der Lipide aus dem Granulationsgewebe, Epithelisierungsgewebe, Blastozystengewebe, Blut oder Serum zur Gewinnung eines fettfreien Albumin-Proteingemisch-Produk- tes.(bg) separating the lipids from the granulation tissue, epithelization tissue, blastocyst tissue, blood or serum in order to obtain a fat-free albumin-protein mixture product.
(cg) Abtrennen von Feststoffen, Albuminen und hochmolekularen Eiweißfraktionen aus dem Albumin-Proteingemisch-Produkt zur Gewinnung eines wässerigen und niedermolekularen Proteingemisch-Produktes, welches zur Behandlung der eingangs angeführten Erkrankungen eingesetzt werden kann.(cg) separation of solids, albumins and high-molecular protein fractions from the albumin-protein mixture product to obtain an aqueous and low-molecular protein mixture product which can be used for the treatment of the diseases mentioned at the beginning.
(dg) Konzentration der wässerig gelösten Proteine durch Abdampfen im Vakuum oder Gewinnung eines lyophilisierten Trockenpräparates durch Gefriertrocknung.(dg) Concentration of the aqueous dissolved proteins by evaporation in vacuo or extraction of a lyophilized dry preparation by freeze drying.
Die Verfahrensstufen (bg) mit (dg) der Verfahrensschiene G werden in Beispiel 6 geschildert . Therapie maligner Tumore (Krebskrankheiten) mit Substanzen aus WimdheilungsgewebenProcess stages (bg) with (dg) of process rail G are described in Example 6. Therapy of malignant tumors (cancer diseases) with substances from healing tissue
Nach dem derzeitigem Wissensstand entwickeln maligne Tumore spezifische Proteine, welche einen enormen Proliferationsschub auslösen können und einen eigenständigen Stoffwechsel, infil- tratives Wachstum und Metastasierungen ermöglichen.According to the current state of knowledge, malignant tumors develop specific proteins that can trigger an enormous increase in proliferation and enable independent metabolism, infiltrative growth and metastases.
Aus den neuerlich erschienen Publikationen werden nachfolgend jene auszugsweise wiedergegeben, die mit einer gewissen Relevanz auf mögliche Anwendungen der Steuerungsfaktoren, welche aus Wundgeweben gewonnen werden können, hinweisen.Extracts from the recently published publications are reproduced below that indicate with a certain relevance the possible application of the control factors that can be obtained from wound tissue.
American Association for Cancer Research San Diego, April 97,American Association for Cancer Research San Diego, April 97,
J.W. Shay, Southwestern Medical Center, University Dallas and D.S. Coffey, John Hopkins University HoustonJ.W. Shay, Southwestern Medical Center, University Dallas and D.S. Coffey, John Hopkins University Houston
Die Telomerase ist ein biochemischer Wirkstoff, welcher die Zellteilung von Eizellen (wahrscheinlich auch Samenzellen) anregt und damit den Fortbestand ("Unsterblichkeit") des "Körpers" (d.h. Gesamtorganismus) der Individuen sichert. Telomerase wird auch im embryonalen Zellverband gebildet. Sie verschwindet, wenn sich der undifferenzierte embryonale Zellver- band im Mutterleib zum differenzierten Foetus hin entwickelt (siehe hierzu auch Beispiel 3) .Telomerase is a biochemical agent that stimulates the cell division of egg cells (probably also sperm cells) and thus secures the continued existence ("immortality") of the "body" (i.e. whole organism) of the individual. Telomerase is also formed in the embryonic cell structure. It disappears when the undifferentiated embryonic cell network in the womb develops into a differentiated fetus (see also Example 3).
Es muß also natürliche Regulationsmechanismen geben, die die Telomerase inaktivieren und damit die weitere "unendliche" Pro- liferation embryonalen Gewebes beenden. Es ist erwiesen, daß in biologisch determinierten Organismen nur Krebszellen Telomerase routinemäßig bilden können. Dadurch können sich Krebszellen fortwährend und unbegrenzt teilen, ohne daß sie dem normalen Alterungsprozeß und Zelltod zu unterliegen. Weltweit wird nach jener Substanz gesucht, welche Telomerase inaktivieren und da- it die fortlaufende Proliferation der Krebszellen unterbinden (d.h. "den Krebs aushungern") kann.So there must be natural regulatory mechanisms that inactivate telomerase and thus end the further "infinite" proliferation of embryonic tissue. It has been proven that in biologically determined organisms only cancer cells can routinely produce telomerase. This allows cancer cells to divide continuously and indefinitely without being subject to normal aging and cell death. The worldwide search is for the substance that inactivates telomerase and it can prevent the continuous proliferation of cancer cells (ie "starve the cancer").
In diesem Zusammenhang wird auf folgende Literatur hingewiesen:In this context, reference is made to the following literature:
Journal of Clinical Investigation April 97,Journal of Clinical Investigation April 97,
C. Malbon, Stone Brook State University New York undC. Malbon, Stone Brook State University New York and
L. Norton, Sloan-Kettering- Institut New YorkL. Norton, Sloan-Kettering Institute New York
Malbon et al . haben einen Wirkstoff ("chemischen Schalter") identifiziert, welcher Brustkrebs-Zellen zu einem extrem starken Zellwachstum anregt. Sie glauben deshalb, daß diese Entdek- kung vielversprechende Möglichkeiten zur Bekämpfung dieser Krankheit eröffnet. Der Stoff wurde als "MAP-Kinase" bezeich- net . Sie veranlaßt normalerweise Zellteilungen mit einer Information, die auffallend kurz gehalten ist.Malbon et al. have identified an active ingredient ("chemical switch") that stimulates breast cancer cells to extremely rapid cell growth. They therefore believe that this discovery opens up promising options for combating this disease. The substance was called "MAP kinase". It normally causes cell division with information that is strikingly short.
Studien ergaben, daß Zellen, welche aus Brustkrebs-Gewebe entnommen wurden, 5- bis 20-mal mehr MAP-Kinase enthalten als Zel- len von normalen Geweben. Bei einem derartig übermäßigen Angebot von MAP-Kinase in Krebsgeweben erscheint es logisch, daß deshalb dieses Gewebe zu einer fortdauernden Zellteilung stimuliert wird. Nach Ansicht der Wissenschaf ler führt das in Abhängigkeit der Konzentration von MAP-Kinase wiederum zu den unterschiedlichen Verlaufsformen (Malignitätsgrad, Wachstums-, Infiltrations- und Metastasierungsintensität) der Krebserkrankung.Studies have shown that cells taken from breast cancer tissue contain 5 to 20 times more MAP kinase than cells from normal tissues. With such an excessive supply of MAP kinase in cancer tissues, it seems logical that this tissue is therefore stimulated to continue cell division. According to the scientists, depending on the concentration of MAP kinase, this in turn leads to the different forms of the cancer (degree of malignancy, intensity of growth, infiltration and metastasis).
In Laborexperimenten wurde nachgewiesen, daß nach einer Inakti- vierung der MAP-Kinase die Brustkrebszellen die Zellteilung einstellen und absterben. Es wurde herausgefunden, daß kleine Partikel von Desoxyribonukleinsäure (DNA) , welche in die Krebsgewebe-Kulturen implementiert wurden, jene chemischen Botenstoffe inaktivieren, welche die Produktion von MAP-Kinase in Gang setzen. Man weiß jedoch noch nicht, ob und wie aus diesen Erkenntnissen eine entsprechende Therapie-Strategie für Menschen abgeleitet werden kann, zumal entsprechende biologische Inaktivatoren noch nicht bekannt sind.Laboratory experiments have shown that breast cancer cells stop and die after the MAP kinase has been inactivated. It has been found that small particles of deoxyribonucleic acid (DNA) that have been implemented in the cancer tissue cultures inactivate those chemical messengers that initiate the production of MAP kinase. However, it is not yet known whether and how from these Knowledge, a corresponding therapy strategy for humans can be derived, especially since corresponding biological inactivators are not yet known.
Larry Norton vom Sloan-Kettering-Institut in New York berichtet, daß diverse Laboratoriumsforschungen seit längerem darauf hinweisen, daß die MAP-Kinase eine wichtige Rolle beim Krebswachstum spielt . Die neuen Studien von Malbon et al . hätten diese Vermutungen erhärtet, dies vor allem auf der Basis von Experimenten mit menschlichen Brustkrebszellen. Norton kommentiert: "Diese Experimente erbringen die sehr wichtige Erkenntnis, daß unser Denken in der richtigen Richtung verläuft und daß neben anderen Substanzen die MAP-Kinase eine wichtige Rolle in der Regulierung der Zellteilung in Krebsgeweben spielt. Ir- gendwo wird man den optimalen Weg finden, um die Substanzen biologisch zu inaktivieren, welche die Zellteilung in Krebsgeweben fortlaufend anregen. Dann wird eine gezielte Beeinflußung dieser Zellteilung möglich sein, so daß man auf diese Weise Krebszellen auch biologisch abtöten kann."Larry Norton of the Sloan-Kettering Institute in New York reports that various laboratory research has long indicated that MAP kinase plays an important role in cancer growth. The new studies by Malbon et al. would have corroborated these assumptions, especially on the basis of experiments with human breast cancer cells. Norton comments, "These experiments provide the very important insight that our thinking is going in the right direction and that, along with other substances, the MAP kinase plays an important role in regulating cell division in cancerous tissues. The best way will be found somewhere in order to biologically inactivate the substances which continuously stimulate cell division in cancer tissues. Then it will be possible to influence this cell division in a targeted manner so that cancer cells can also be killed biologically in this way. "
In diesem Zusammenhang wird auf folgende Literatur hingewiesen:In this context, reference is made to the following literature:
Nature Medicine, Band 1, Nummer 12, Dezember 95 "Unrestricted cell cycling and cancer" M. Strauss et al . , Max Delbrück Center für Molekularmedizin, Max Planck Gesellschaft, Humboldt-Universität BerlinNature Medicine, Volume 1, Number 12, December 95 "Unrestricted cell cycling and cancer" M. Strauss et al. , Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Max Planck Society, Humboldt University Berlin
Die Erkenntnisse über die Entstehung und Entwicklung von Krebs- erkrankungen sind heute soweit fortgeschritten, daß eine Anzahl von typischen Veränderungen bekannt sind, die mit einer Ansprechbarkeit des Tumors auf die verschiedenen Behandlungen, wie Chemotherapie, Hormontherapie und/oder Strahlentherapie, korrelieren. Ein wichtiger Marker ist dabei ein Protein, das als p53 einzuordnen ist. Es ist in ca. 50% der malignen Tumore vorhanden. Sobald p53 in malignen Tumoren nicht mehr nachgewiesen werden kann, geht die Ansprechbarkeit maligner Tumore auf Chemotherapie, Hormontherapie und/oder Strahlentherapie rapide zurück und das Tumorwachs- turn verläuft dann enorm rasch und fatal .The knowledge about the origin and development of cancer is so advanced today that a number of typical changes are known, which correlate with the responsiveness of the tumor to the various treatments, such as chemotherapy, hormone therapy and / or radiation therapy. An important marker is a protein that can be classified as p53. It is present in approximately 50% of malignant tumors. As soon as p53 can no longer be detected in malignant tumors, the responsiveness of malignant tumors to chemotherapy, hormone therapy and / or radiation therapy declines rapidly and the tumor growth rate is extremely rapid and fatal.
Alle multizellularen Organismen (einschließlich Menschen) haben sich einen sehr engmaschigen Kontroll-Mechanismus entwickelt, welcher die Zeilproliferation überwacht. Dieser Mechanismus bildet die Vorausetzung für das Überleben dieser Organismen und ist eine Art Schalter zwischen den alternativen Routen in Richtung Zellteilung und zeitlichem Anhalten des Teilungszyklus mit der Quintessenz Zelldifferenzierung oder Zelltod. Dieser Schalter-Mechanismus wurde im Hinblick auf die bedeutende Rolle bei der Kontrolle der Zeilproliferation als "restriction point (R-point) in Säugetier-Zellen" benannt. Wird während der Grundphase der Gen-Replikation von Zellen dieser "R-point" beschädigt oder zerstört, dann führt das zu unreguliertem Zellwachstum mit verheerenden Auswirkungen auf den gesamten Organismus .All multicellular organisms (including humans) have developed a very tight control mechanism that monitors cell proliferation. This mechanism is the prerequisite for the survival of these organisms and is a kind of switch between the alternative routes towards cell division and temporal stopping of the division cycle with the quintessential cell differentiation or cell death. This switch mechanism was named "restriction point (R-point) in mammalian cells" in view of the important role in controlling cell proliferation. If this "R-point" is damaged or destroyed during the basic phase of gene replication of cells, this leads to unregulated cell growth with devastating effects on the entire organism.
Mit den Proteingemischen, die gemäß den in DE-PS 862942 und DE- PS 885127 dargelegten Verfahren hergestellt wurden, konnte in klinischen Untersuchungen nachgewiesen werden, daß neben der Behandlung der angeführten Krankheiten, insbesondere der Be- handlung der Krebskrankheiten, mit diesen Proteingemischen außergewöhnliche therapeutische Erfolge erzielt wurden. In Abhängigkeit vom Krankheitsstadium führte diese Therapie zur Rückbildung des Tumors bis hin zu seinem Verschwinden, zum Verschwinden der paratumorösen Infiltrate, zum Stillstand und/oder Verschwinden der Metastasen, zur weitgehenden Stabilisierung bis Normalisierung des Allgemeinzustandes und damit zur Erreichung normaler Lebensqualität und signifikanter Verlängerung der Lebenserwartung (siehe oben) . Dabei waren diese Proteingemische infolge der damaligen Verfahrenstechniken, insbesondere bezüglich der Gewinnung des Aus- gangsmaterials, bei weitem nicht in dem Maße mit wirksamen Substanzen angereichert, wie das nunmehr mit den erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist. Außerdem waren Gewinnungs- und Herstellungsmethoden derart aufwendig und kostspielig, daß unter den damals gegebenen Voraussetzungen eine Bedarfsversorgung auf breiter Ebene nicht möglich war. Vor allem aber gab es noch keine anwendbaren Techniken, um jene Substanzen, d.h. die Steuerungsfaktoren, isoliert herzustellen, welche das Wachstum von malignen Tumoren und von deren Metastasen zum Stillstand bringen können.With the protein mixtures which were produced in accordance with the processes set out in DE-PS 862942 and DE-PS 885127, it was possible in clinical studies to demonstrate that in addition to the treatment of the diseases mentioned, in particular the treatment of cancerous diseases, these protein mixtures are exceptional therapeutic agents Successes have been achieved. Depending on the stage of the disease, this therapy led to the regression of the tumor up to its disappearance, to the disappearance of the paratumorous infiltrates, to a standstill and / or disappearance of the metastases, to a substantial stabilization until normalization of the general condition and thus to the achievement of normal quality of life and a significant extension of life expectancy (see above) . As a result of the process techniques at that time, in particular with regard to the extraction of the starting material, these protein mixtures were by no means enriched with active substances to the extent that is now possible with the process according to the invention. In addition, extraction and production methods were so complex and costly that under the conditions prevailing at the time, a supply of needs on a broad level was not possible. Above all, however, there were still no applicable techniques to isolate those substances, ie the control factors, that can stop the growth of malignant tumors and their metastases.
Im biologisch determinierten Organismus entsteht im Bedarfsfall ein Gewebeverband, der wie ein embryonaler Gewebeverband (welcher aus der befruchteten, mit diploidem Chromosomensatz ausgestatteten Eizelle hervorgeht) ebenfalls alle Merkmale eines undifferenziert wuchernden juvenilen Gewebes aufweist, nämlich das Wundgewebe. Hier zeigt nun die Natur in einem Schul- beispiel, daß beim Wundheilungsprozeß biologische Substanzen erzeugt werden, welche die zunächst stark angeregten Zellteilungen des juvenilen Gewebeverbandes abrupt unterbrechen und seinen Stoffwechsel sowie seine Blutversorgung dem Gesamtorganismus untergeordnet einbinden.If necessary, a biologically determined organism creates a tissue bandage that, like an embryonic tissue bandage (which emerges from the fertilized egg cell equipped with a diploid chromosome set), also has all the characteristics of an undifferentiated proliferating juvenile tissue, namely the wound tissue. Here, in a school example, nature shows that biological substances are generated in the wound healing process, which abruptly interrupt the initially strongly stimulated cell division of the juvenile tissue and integrate its metabolism and blood supply in a subordinate manner to the whole organism.
Durch eine therapeutische Anwendung von Steuerungsfaktoren der Wundheilungsprozesse wäre somit eine therapeutisch wirkungsvolle Methode verfügbar, mit der Krebskrankheiten gezielt und selektiv, vor allem aber biologisch, behandelt werden können.A therapeutic application of control factors in wound healing processes would thus provide a therapeutically effective method with which cancerous diseases can be treated in a targeted and selective manner, but above all biologically.
Die Beobachtungen von Hammerschmid, Nitschkoff, Kressner u.a. (s. Literaturnachweis) beweisen, daß sich Präkanzerosen (signifikante Vorstadien des Übergangs in Krebsgewebe) unter der Behandlung mit dem bekannten niedermolekularen Protein- gemisch aus Wundgeweben vollkommen zurückbilden. Es kann deshalb angenommen werden, daß mit der Anwendung der Steuerungsfaktoren auch eine erfolgreiche Vorbeugungsmethode zur Vermeidung der Entstehung von Krebs bei erkannten oder ver- muteten Präkanzerosen zur Verfügung steht . Darüber hinaus muß die Frage einer Impf-Prophylaxe bei krebsgefährdeten und krebsprädestinierten Patienten in Erwägung gezogen werden.The observations by Hammerschmid, Nitschkoff, Kressner and others (see literature references) prove that precancerous lesions (significant pre-stages of the transition to cancerous tissue) completely disappear when treated with the known low-molecular protein mixture from wound tissue. It can therefore be assumed that the use of the control factors also provides a successful preventive method for avoiding the development of cancer in the case of recognized or suspected precancerous diseases. In addition, the issue of vaccination prophylaxis in cancer-prone and cancer-prone patients must be considered.
Um die isolierten Steuerungsfaktoren in ausreichender Menge wirtschaftlich zu produzieren, benutzt man am günstigsten die in der Verfahrensschiene S angeführten gentechnischen Verfahren (siehe Fig. 1) :In order to economically produce the isolated control factors in sufficient quantity, the most favorable method is to use the genetic engineering methods listed in the process line S (see FIG. 1):
(bs) Gentechnische Bearbeitung der Steuerungsfaktoren und Klonen von Zellen mit den genetischen Merkmalen dieser(bs) Genetic engineering of the control factors and cloning of cells with the genetic characteristics of these
Faktoren (siehe Beispiel 7) ;Factors (see example 7);
(es) Züchtung der geklonten Zellen in-vitro (siehe Beispiel 8);(es) culturing the cloned cells in vitro (see Example 8);
(ds) Verarbeitung der Gewebezucht nach "Verfahrensschiene Gesamtproteine" (siehe Beispiel 9) .(ds) Processing of tissue cultivation according to "process track total proteins" (see example 9).
Verfahrensschiene LProcess line L
Das Endprodukt dieser Verfahrensschiene sind reine Lipidfrak- tionen aus Wundgeweben.The end product of this process line is pure lipid fractions from wound tissue.
Nachdem in klinischen Untersuchungen die Wirkung von Salben geprüft wurde, deren arzneifreie Basis mit von Lösungsmitteln getrennten Lipidfraktionen aus Granulations- und/oder Epithelisierungsgewebe angereichert waren, und sich dabei überraschende Erfolge bei der Behandlung von Hautkrankheiten, u.a. bei dege- nerativen, chronischen, infizierten und superinfizierten Haut- erkrankungen und schlecht heilenden Defekten (Ulcus cruris etc.) ergaben, werden entsprechend einer speziellen Ausführungsform der Erfindung die Lipidfraktionen, die aus Granulations- und/oder Epithelisierungsgewebe abgetrennt wurden, von den Lösungsmitteln befreit, um sie als in der Hautheilkunde therapeutisch verwendbare Grundsubstanz zu gewinnen. Diese Ausführungsform der Verfahrenschiene L wird in Beispiel 10 erläutert .After the effects of ointments, the drug-free basis of which had been enriched with solvent-separated lipid fractions from granulation and / or epithelization tissue, had been tested in clinical studies, and there were surprising successes in the treatment of skin diseases, among others in the case of degenerative, chronic, infected and superinfected skin diseases and poorly healing defects (ulcus cruris etc.), the lipid fractions, which have been separated from granulation and / or epithelization tissue, are freed from the solvents in accordance with a special embodiment of the invention in order to obtain them as a base substance therapeutically usable in dermatology . This embodiment of the process rail L is explained in Example 10.
Die vorgenannten Verfahrensstufen werden anhand von folgenden Beispielen erläutert:The above process steps are explained using the following examples:
Beispiel 1: Implantation eines reusenartigen Gebildes in eine Wunde Beispiel 2: Netz-Implantation auf einen artifiziellen HautdefektExample 1: Implantation of a trap-like structure in a wound Example 2: Mesh implantation on an artificial skin defect
Beispiel 3 : Verwendung von Blastozystengewebe alsExample 3: Use of blastocyst tissue as
Ausgangsmaterial Beispiel 4 : Ermittlung des günstigsten Zeitpunkts für die Gewebeentnahme Beispiel 5: Entnahme von Granulations- , Epithelisierungs- oder Blastozystengewebe Beispiel 6 : Verarbeitung von Ausgangsmaterial zu niedermolekularen Gesamtproteinen Beispiel 7 : Gentechnische Verfahren zur Herstellung der genetischen Merkmale der Steuerungsfaktoren undStarting material Example 4: Determination of the most favorable time for tissue removal. Example 5: Removing granulation, epithelization or blastocyst tissue. Example 6: Processing of starting material into low-molecular total proteins. Example 7: Genetic engineering processes for producing the genetic characteristics of the control factors and
Zellklonung Beispiel 8 : Züchtung der geklonten Zellen Beispiel 9 : Verarbeitung der geklonten Gewebezucht analog denCell Cloning Example 8: Culturing the Cloned Cells Example 9: Processing the Cloned Tissue Cultivation Analogous to
Verfahrensstufen bg mit dg Beispiel 10: Herstellung von Lipidextrakten aus Wundheilungsge- weben oder Blastozystengeweben Beispiel 1Process stages bg with dg Example 10: Production of lipid extracts from wound healing tissues or blastocyst tissues example 1
Implantation eines reusenartigen Gebildes in eine WundeImplantation of a trap-like structure into a wound
Verfahrensstufe aa. Fig. 1 und 2Process stage aa. 1 and 2
Bei Säugetieren, vorwiegend beim Schwein (wegen der den menschlichen Geweben, nach den Primaten, artverwandtesten Chromosomen) wird unter sterilen Bedingungen operativ in Lokalanästhe- sie eine bezüglich Länge und Tiefe größtmögliche Wunde gesetzt. Am besten eignet sich hierfür die Halsregion, weil dort keine starken Belastungsreaktionen stattfinden. In die Wunde, wird dann unter Spreizen ein verwindungsstabiles reusenartiges Gebilde aus indifferentem Material (z.B. Kunststoff, Titan, Si- licon etc.) implantiert (siehe Fig. 2) und die Wunde darüber mit schichtweisen Nähten verschlossen.In mammals, predominantly in pigs (because of the human tissues, after the primates, most closely related chromosomes), a wound that is as long and deep as possible is surgically placed under sterile conditions in local anesthesia. The neck region is best suited for this because there are no strong stress reactions. A torsionally stable, trap-like structure made of indifferent material (e.g. plastic, titanium, silicon, etc.) is then implanted into the wound with spreading (see FIG. 2) and the wound is closed with layer-by-layer sutures.
Bei den bisher bekannten Verfahren der Wundsetzung (einfache Schnitt-Trennung und anschließendes Zusammenfügen der Wundrän- der mit Nähten) war zur Defektausfüllung nur ein sehr schmaler Raum nötig, so daß die Ausbeute an Granulationsgewebe relativ gering war. Der Vorteil des neuen Verfahrens ist, daß durch das Implantat zwischen den Wundrändern ein Hohlraum entsteht, der durch einsprießendes Granulationsgewebe ausgefüllt werden muß. Dadurch wird eine vielfach größere Menge von Granulationsgewebe gebildet. Das ist ein großer wirtschaftlicher Vorteil für die Gewinnung des Ausgangsmaterials .In the previously known methods of wound setting (simple incision separation and subsequent joining of the wound edges with sutures), only a very small space was required to fill in the defect, so that the yield of granulation tissue was relatively low. The advantage of the new method is that the implant creates a cavity between the edges of the wound, which has to be filled in by granulation tissue that sprouts in. As a result, a much larger amount of granulation tissue is formed. This is a great economic advantage for the extraction of the raw material.
Experimente :Experiments:
Bei 4 Labor-Ratten wurde in der Region Hals-Schultergürtel eine 2 cm lange, 12 bis 14 mm tiefe Wunde gesetzt. In diese Wunde wurde eine Reuse eingebracht, welche aus zwei feinmaschigen Siliconlamellen (12 mm x 16 mm) bestand, die einen mittleren Hohlraum von 8 mm bildeten. Die Wunde wurde mit Schichtnähten geschlossen und nach 6 Tagen das Wundgewebe entnommen.In 4 laboratory rats, a 2 cm long, 12 to 14 mm deep wound was made in the neck-shoulder girdle region. A trap was inserted into this wound, which consisted of two fine-meshed silicone lamellae (12 mm x 16 mm), the middle one 8 mm cavity formed. The wound was closed with layered sutures and the wound tissue was removed after 6 days.
Bei allen Tieren war massives Granulationsgewebe in die Reuse eingewuchert .In all animals, massive granulation tissue was overgrown in the trap.
Beispiel 2Example 2
Netz-Implantation auf einen artifiziellen HautdefektMesh implantation on an artificial skin defect
Verfahrensstufe ab, Fig. 1 und 2Process stage from, Fig. 1 and 2nd
Analog zu dem vorgenannten Verfahren (aa) wird zur Gewinnung von Epithelisierungsgewebe das gesamte Epithel in einem grδßt- möglichen Feld abgetragen, eventuell darunter liegende Faszien werden entfernt, dann wird das Muskelgewebe oberflächlich verletzt. Direkt auf das Wundbett des Muskels wird ein engmaschiges Netz aus Silicon etc. gelegt, an den Hauträndern mit Nähten befestigt und der Defekt steril mit Spezialgazen abgedeckt. Auf diese Weise entsteht gegenüber dem bisherigen Verfahren eine vielfach größere Menge von Epithelisierungsgewebe.Analogously to the aforementioned method (aa), the entire epithelium is removed in a largest possible field to obtain epithelization tissue, any fascia located below it is removed, and the muscle tissue is then superficially injured. A close-meshed network of silicone etc. is placed directly on the wound bed of the muscle, attached to the skin edges with sutures, and the defect is covered sterile with special gauze. In this way, a much larger amount of epithelializing tissue is created compared to the previous method.
Beispiel 3Example 3
Verwendung von Blastozystengewebe als AusgangsmaterialUse of blastocyst tissue as a starting material
Verfahrensstufe ac, Fig. 1Process stage ac, Fig. 1
Wissenschaftliche Grundlagen:Scientific basics:
Die befruchtete Eizelle bildet nach der Einnistung zunächst durch Teilungen einen soliden kugelförmigen undifferenzierten Zellverband, die sog. Morula. Aus ihr entwickelt sich um den 4. Tag nach der Befruchtung die Blastozyste, die eine Keimblase (Blastozystenhöhle) mit äußeren (Throphoblast) und inneren (Embryoblast) Zellschichten bildet.After implantation, the fertilized egg cell initially forms a solid, spherical, undifferentiated cell structure, the so-called morula. The blastocyst, which is a germinal bladder, develops from it around the 4th day after fertilization (Blastocyst cavity) with outer (throphoblast) and inner (embryoblast) cell layers.
Durch eine Furchung erfolgt die Einstülpung der Keimblase und damit die Ausbildung der anatomisch sowie funktionell differenzierten und endgültig determinierten Keimblätter Ektoderm, En- doderm und Mesoderm. Dieser Vorgang wird als "Gastrulation" bezeichnet .Furrowing results in the invasion of the germ bladder and thus the formation of the anatomically and functionally differentiated and finally determined cotyledons ectoderm, endoderm and mesoderm. This process is called "gastrulation".
Mit Beginn der Gastrulation wird also genau der Zeitpunkt der Differenzierung des embryonalen Gewebes bestimmt. Daher müssen zu diesem Zeitpunkt die Regulationsmechanismen wirksam werden, welche die Proliferationen (Zellteilungen) undifferenzierten embryonalen Gewebes unterbinden und seine Differenzierung in die Wege leiten. Diese Regulationsmechanismen haben therapeutische Wirkungen, die mit den Effekten der Substanzen aus Granulations- und Epithelisierungsgeweben identisch sind.With the start of gastrulation, the exact time of differentiation of the embryonic tissue is determined. Therefore, the regulatory mechanisms that prevent the proliferation (cell division) of undifferentiated embryonic tissue and initiate its differentiation must take effect at this time. These regulatory mechanisms have therapeutic effects that are identical to the effects of the substances from granulation and epithelization tissues.
Zur Gewinnung von Blastozystengewebe wird am 4. Tag nach der Befruchtung bei einem Tier operativ oder nach der Schlachtung die Blastozyste entnommen. Um den für die Entnahme optimalen Zeitpunkt (im Stundenbereich) möglichst genau festzustellen, empfiehlt es sich, durch vorangehende Versuche mittels histolo- gischer Untersuchungen festzustellen, wann sich durch Furchung die Einstülpung der Keimblase und damit die Ausbildung der anatomisch sowie funktionell differenzierten und endgültig determinierten Keimblätter Ektoderm, Endoder und Mesoderm vollzieht. Dieser Vorgang kann bei verschiedenen Tierarten um Stunden differieren.To obtain blastocyst tissue, the blastocyst is removed on the 4th day after fertilization in an animal or after slaughter. In order to determine the optimal time for the removal (in the hourly range) as precisely as possible, it is advisable to carry out previous tests using histological examinations to determine when the indentation of the germ bladder and thus the formation of the anatomically and functionally differentiated and finally determined cotyledons is achieved Ectoderm, endoder and mesoderm. This process can differ by hours for different animal species.
Außerdem ist es möglich, bei Schwangerschaftsabbrüchen, welche um den 4. Tag nach der Befruchtung durchgeführt werden, mit Einwilligung der Patientin menschliches Blastozystengewebe zu erhalten. Auch hier ist durch eine histologische Untersuchung zu klären, ob das Gewebe verwendet werden kann. Beispiel 4In addition, if the pregnancy is terminated around the 4th day after fertilization, it is possible to receive human blastocyst tissue with the patient's consent. Here, too, a histological examination must be carried out to determine whether the tissue can be used. Example 4
Ermittlung des günstigsten Zeitpunkts für die GewebeentnahmeDetermination of the best time for tissue removal
Der Steuerungsfaktor PA (Proliferations-Abbruch) , der vor allem zur Beendigung der Proliferation von Krebsgeweben einzusetzen ist, kann aus allen Ausgangsmaterialien gewonnen werden. Um den Steuerungsfaktor PA aus Epithelisierungsgewebe zu gewinnen, muß dieses bei Beendigung der Epithelisierung, d.h. bei Abschluß der Deffektdeckung, entnommen werden.The control factor PA (proliferation termination), which is primarily used to stop the proliferation of cancer tissue, can be obtained from all starting materials. In order to obtain the control factor PA from epithelializing tissue, this must be done at the end of epithelializing, i.e. at the end of the defect coverage.
Der Steuerungsfaktor PF (Proliferations-Förderung) , der die Proliferation von Krebsgeweben und normalen Geweben fördert sowie als Initialtherapie von Krebserkrankungen und zur Behandlung von Heilungsverzögerungen dient, kann nur aus juvenilem und proliferierendem Gewebe gewonnen werden.The control factor PF (proliferation promotion), which promotes the proliferation of cancer tissues and normal tissues and serves as an initial therapy for cancer and for the treatment of delayed healing, can only be obtained from juvenile and proliferating tissue.
Beide Faktoren werden in den angeführten Ausgangsmaterialien und zudem bei verschiedenen Tierarten zu verschiedenen Zeiten produziert, so daß zur optimalen Gewinnung die Feststellung des spezifischen Produktionszeitpunkts wichtig ist. Hierfür stehen drei Methoden zur Verfügung:Both factors are produced in the starting materials listed and also in different animal species at different times, so that it is important to determine the specific time of production for optimal extraction. There are three methods for this:
a) Visuelle Untersuchungena) Visual examinations
Diese Untersuchungen werden durch das Anbringen eines Fensterverbandes wesentlich erleichtert.These investigations are made considerably easier by attaching a window bandage.
Der Beginn der Wundgranulation, das ist in der Regel am 3. bis 5. postoperativen Tag, ist durch das Erscheinen der typischen "Wundwärzchen" makroskopisch leicht feststellbar. Ebenso ist auch der Beginn der Epithelisierung durch das randständige Einwuchern von Haut in das Wundbett und die Beendigung der Epithelisierung durch den kompletten Defektverschluß mit Haut makroskopisch leicht feststellbar. Die Vorgänge finden zwischen 8. bis 40. postoperativen Tag statt .The start of wound granulation, which is usually on the 3rd to 5th postoperative day, can be easily determined macroscopically by the appearance of the typical "little wounds". Likewise, the beginning of epithelization by the marginal overgrowth of skin in the wound bed and the termination of epithelization by the complete defect closure with skin can be easily determined macroscopically. The operations take place between the 8th to the 40th postoperative day.
b) Histologische Gewebeuntersuchungenb) Histological tissue examinations
Die Unterscheidungen zwischen proliferierenden, juvenilen bzw. determinierten Geweben sind für Histologen einfach. Zu diesem Zweck wird z.B. mit einer Biopsie-Nadel zu den mutmaßlichen Zeitpunkten Untersuchungsmaterial aus dem Wundgranulations- , Epithelisierungs- oder Blastozystenge- webe entnommen.The distinctions between proliferating, juvenile and determined tissues are simple for histologists. For this purpose e.g. With a biopsy needle, test material was taken from the wound granulation, epithelization or blastocyst tissue at the presumed times.
Beispiel 5Example 5
Die Entnahme von Wundgewebe und BlastozystengewebeThe removal of wound tissue and blastocyst tissue
Das nach den Verfahrensstufen (aa) oder (ab) gewonnene Wundgewebe bzw. das nach (ac) gewonnene Blastozystengewebe kann entweder am lebenden Tier operativ unter sterilen Kautelen und Lokalanästhesie oder am toten Tier nach der Schlachtung entnommen werden.The wound tissue obtained according to process steps (aa) or (ab) or the blastocyst tissue obtained according to (ac) can either be surgically removed from live animals under sterile caulks and local anesthesia or from dead animals after slaughter.
Die ökonomisch günstigste Vorgehensweise ist sicher von Land zu Land verschieden. Tierschutzvorschriften sind zu beachten.The most economically advantageous approach is certainly different from country to country. Animal welfare regulations must be observed.
In jedem Falle ist das entnommene Gewebe sofort mit Toluol zu überschichten.In any case, the removed tissue must be immediately covered with toluene.
Bei der operativen Entnahme kann das Tier in der vorgesehenenDuring the surgical removal, the animal can be in the intended
Haltung belassen werden, und bei einer späteren Schlachtung entfällt bei der Gewebeentnahme nach Schlachtung der häufig übliche Verwertungszwang nach sanitären Maßnahmen (Freibank, Wertverlust des Schlachtfleisches) . Allerdings ist der technische Aufwand kostspieliger als bei Gewebentnahmen nach der Schlachtung. Der Effekt Aufwand/Nutzen ist abzuwägen.Posture, and in a later slaughter the removal of tissue after slaughtering is often omitted Usual compulsory recovery after sanitary measures (free bank, loss of value of the meat). However, the technical effort is more expensive than taking tissue after slaughter. The effect of effort / benefit must be weighed up.
Wird das Wundgewebe von einem geschlachteten Tier entnommen, dann entfallen erneute aseptische Operationen, da das Gewebe durch die sofort durchzuführende Einbringung in Toluol absolut sterilisiert wird.If the wound tissue is removed from a slaughtered animal, there is no need for additional aseptic operations, since the tissue is absolutely sterilized by the immediate introduction into toluene.
Das Wundgewebe wird zunächst insgesamt durch Exzision weit im gesunden Gewebe entnommen. Dann wird das reine Granulationsgewebe bzw. Epithelisierungsgewebe herausgelöst, indem das umgebende Gewebe (Muskulatur, Haut) an den sichtbaren Grenzen zur Reuse bzw. zum aufgelegten Netz abgetrennt wird. Dann wird das in der Reuse gebildete Granulationsgewebe bzw. das über dem Netz gebildete Epithelisierungsgewebe ausgelöst und wie in Beispiel 6 beschrieben, weiter verarbeitet.The wound tissue is initially removed by excision in the healthy tissue. Then the pure granulation tissue or epithelialization tissue is detached by separating the surrounding tissue (muscles, skin) at the visible borders of the trap or the applied mesh. Then the granulation tissue formed in the trap or the epithelization tissue formed over the mesh is triggered and further processed as described in Example 6.
Hierbei ergibt sich ein weiterer Vorteil gegenüber den bekannten Verfahren: Während bisher der größte Teil des zu verarbeitenden Gewebes aus bindegewebigen Substanzen bestand, wird mit diesen Verfahren fast ausschließlich reines Granulations- bzw. Epithelisierungsgewebe gewonnen. Das bedeutet, daß das Aus- gangsmaterial und die therapeutisch wirksamen Substanzen in einem entscheidend höheren Reinheitsgrad und damit auch mit einem höheren Wirkungsgrad verfügbar sind, als das bisher der Fall war. Beispiel 6This results in a further advantage over the known methods: While up to now the major part of the tissue to be processed consisted of connective tissue substances, this method almost exclusively produces pure granulation or epithelializing tissue. This means that the starting material and the therapeutically active substances are available in a significantly higher degree of purity and thus also with a higher degree of efficiency than was previously the case. Example 6
Verarbeitung des Ausgangsmaterials zu niedermolekularen Gesam - proteinenProcessing of the starting material to form low molecular weight proteins
Verarbeitungsschi.ene Gesamtproteine, Verf hrensstufen bg - dgProcessing stages total proteins, process levels bg - dg
Stufe bg:Level bg:
In dieser Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das entweder von einem Tier oder einem Menschen erhaltene Granulations-, Epithelisierungs- , Blastozystengewebe oder Serum von Li- piden befreit. Unter Lipiden sind dabei die eigentlichen Fette und die fettähnlichen Stoffe zu verstehen.In this step of the method according to the invention, the granulation, epithelization, blastocyst tissue or serum obtained from either an animal or a human is freed from lipids. Lipids are to be understood as the actual fats and the fat-like substances.
Dazu wird zunächst das Gewebe mitsamt Toluol im sterilisierten Bearbeitungsgerät (z.B. in einem Fleischwolf) weitgehend zerkleinert und homogenisiert . Dann wird das Toluol abgenutscht und das Gewebe mit der vierfachen Gewichtsmenge Aceton versetzt und in einem sterilisierten Rührwerk 2 bis 3 Stunden lang bei einer Umgebungstemperatur von 0°C extrahiert. Dann wird das Aceton abgenutscht .For this purpose, the tissue together with toluene is first largely crushed and homogenized in the sterilized processing device (e.g. in a meat grinder). The toluene is then filtered off with suction and four times the amount by weight of acetone is added to the tissue and extracted in a sterilized stirrer for 2 to 3 hours at an ambient temperature of 0 ° C. Then the acetone is sucked off.
Der Gewebe-Rückstand wird wiederum mit derselben Volumenmenge eines Gemisches aus 1:1 Aceton und Diethylether versetzt, erneut 30 Minuten im Rührwerk extrahiert und nun wieder abgenutscht. Dann wird dieselbe Volumenmenge Diethylether zugesetzt und erneut 30 Minuten extrahiert. Der Ether wird dann im Vakuum abgenutscht. Nach der Abtrennung der letzten Diethyletherlosung wird ein erstes Proteinprodukt in Form eines sterilen lipid- freien Trockenpulvers erhalten. Alle verfügbaren Lipid-Extraktions-Substanzen werden zur Gewinnung und Weiterverwendung der Lipide aufbewahrt und im Rahmen der Verfahrensschiene Lipide weiterverarbeitet .The tissue residue is again mixed with the same volume of a mixture of 1: 1 acetone and diethyl ether, extracted again in the agitator for 30 minutes and then suction filtered. Then the same volume of diethyl ether is added and extracted again for 30 minutes. The ether is then suction filtered. After the last diethyl ether solution has been separated off, a first protein product is obtained in the form of a sterile lipid-free dry powder. All available lipid extraction substances are kept for the extraction and further use of the lipids and further processed within the lipids process line.
Stufe (cg) :Level (cg):
In dieser Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das lipidfreie Trockenpulver mit der lOOfachen Gewichtsmenge steri- lilsiertem, destilliertem Wasser und mit der l1/2fachen Ge- wichtsmenge sterilisierter Ringerlösung versetzt, mit Toluol überschichtet und steril im Kühlraum 24 Stunden lang bei einer Temperatur von +2°C wässerig ausgelaugt.In this stage of the method according to the invention, the lipid-free dry powder is mixed with 100 times the amount by weight of sterilized, distilled water and with 1 1/2 times the weight of sterilized Ringer's solution, overlaid with toluene and sterile in the refrigerator for 24 hours at a temperature of + 2 ° C aqueous leached.
Von dem dann vorliegenden wässerig gelösten Gemisch wird das Toluol abgenutscht, dann wird mit mindestens 5000 U/min zentri- fugiert, um Feststoffe abzutrennen. Auf diese Weise wird ein erstes lipidfreies Gesamt-Eiweiß-Produkt in wässeriger Lösung gewonnen, das dann wie folgt aufbereitet wird:The toluene is then filtered off with suction from the aqueous solution then present, and centrifugation is carried out at least 5000 rpm in order to separate off solids. In this way, a first lipid-free total protein product is obtained in aqueous solution, which is then prepared as follows:
Zur Entfernung der hochmolekularen parenteral unverträglichen Eiweißfraktionen wird der Eiweiß-Gesamtextrakt in einem Schlauchspiralen-Dialyse-Kessel bearbeitet, wobei die niedermolekularen Fraktionen in das äußere Spülmedium diffundieren.To remove the high-molecular parenterally incompatible protein fractions, the total protein extract is processed in a spiral tube dialysis kettle, the low-molecular fractions diffusing into the external rinsing medium.
Das so gewonnene Außendialysat enthält ein Gemisch von niedermolekularen Proteinen, mit denen man die angeführten therapeutischen Effekte erzielen kann.The external dialysate obtained in this way contains a mixture of low molecular weight proteins with which the therapeutic effects mentioned can be achieved.
Dieses Proteingemisch enthält auch die oben angeführten Steue- rungsfaktoren, welche speziell für die Behandlung der Krebserkrankungen geeignet sind (siehe Therapie maligner Tumore) . Es kann gegebenenfalls auch für die direkte Gewinnung isolierter Steuerungsfaktoren verwendet werden. Stufe (dg) :This protein mixture also contains the control factors listed above, which are particularly suitable for the treatment of cancer (see therapy of malignant tumors). If necessary, it can also be used for the direct acquisition of isolated control factors. Level (dg):
Das Wasser des Außendialysats wird im Vakuumkessel bei einer Temperatur von maximal 36° C (weil höhere Temperaturen die Wirksamkeit der Proteine entscheidend beeinträchtigen) so lange verdampft, bis man eine auf das 70 bis lOOfach konzentrierte wässerige Lösung erhält oder bis ein wasserlösliches Trockenpulver entsteht (Lyophilisierung) . Beide Produkte können dann in üblicher Weise in parenteral anwendbare therapeutische Präparate übergeführt werden.The water of the external dialysate is evaporated in a vacuum kettle at a maximum temperature of 36 ° C (because higher temperatures significantly affect the effectiveness of the proteins) until an aqueous solution concentrated to 70 to 100 times is obtained or until a water-soluble dry powder is obtained (lyophilization ). Both products can then be converted into therapeutic preparations that can be used parenterally in the usual way.
Alternativ zu den vorangehend geschilderten Verfahren zur Gewinnung des Ausgangsmaterials kann auch eine Blutentnahme bei Menschen (mit deren Einwilligung) erfolgen, wenn diese einen Wundheilungsprozeß durchlaufen. Für die Weiterverarbeitung kann das aus diesem Blut in bekannter Weise erzeugtes Serum verwendet und wie das in vorgenannter Weise gewonnene Wundgewebe verarbeitet werden.As an alternative to the above-described methods for obtaining the starting material, blood can also be taken from humans (with their consent) if they undergo a wound healing process. The serum produced from this blood in a known manner can be used for further processing and the wound tissue obtained in the aforementioned manner can be processed.
Beispiel 7Example 7
Gentechnische Verfahren zur Herstellung eines SteuerungsfaktorsGenetic engineering processes for the production of a control factor
In den nachfolgenden Beispielen aufgeführte gentechnische Ver- fahren sind dem Fachmann bekannt . Deshalb ist ihre Beschreibung auf das Wesentliche beschränkt. Falls solche Verfahren von Firmen im Auftrag durchgeführt werden, so wird nur darauf verwiesen, ohne diese Verfahren zu erläutern. Stehen vorgefertigte Werkzeuge zur Verfügung, so wird die Anwendung nur soweit erklärt, als dies zum Verständnis der patentgemäßen Verfahren erforderlich ist.Genetic engineering methods listed in the following examples are known to the person skilled in the art. Therefore, their description is limited to the essentials. If such procedures are carried out by companies on behalf, it is only referred to without explaining these procedures. If ready-made tools are available, the application is only explained to the extent that this is necessary to understand the patented processes.
Sowohl die in den niedermolekularen Gesamtproteinen als auch die in den aufbereiteten Ausgangsmaterialien (Stufen aa, ab und ac) vorhandenen Steuerungsfaktoren können im Bedarfsfall rela- tiv einfach analytisch identifiziert werden. Hierfür stellt z.B. die Firma CLONTECH Inc. zuverlässige Werkzeuge zur Verfügung. Verschiedene Kits sowie der Northern Blot ermöglichen auch bei geringen Mengen des Startmaterials einfache Erforschung von Genen mit differenzierter Bedeutung.Both the control factors present in the low-molecular total proteins and in the prepared starting materials (stages aa, ab and ac) can be rela- easily identified analytically. For this purpose the company CLONTECH Inc. provides reliable tools. Various kits as well as the Northern blot enable simple research into genes with different meanings even with small amounts of the starting material.
In den nach der "Verfahrensstufe Gesamtproteine" gewonnenen niedermolekularen Gesamtproteinen sind jene Proteine enthalten, die man als Steuerungsfaktoren therapeutisch verwenden kann.The low-molecular total proteins obtained after the "total protein process stage" contain those proteins which can be used therapeutically as control factors.
Um das gesuchte spezifische Protein (Steuerungsfaktor) zu identifizieren, führt man vergleichende Analysen mit nach den gleichen Verfahren hergestellten Proteingemischen aus anderen Geweben, z.B. mit Muskelgewebe aus der Wundumgebung durch.In order to identify the specific protein (control factor) sought, comparative analyzes are carried out with protein mixtures from other tissues, e.g. with muscle tissue from the wound area.
Man isoliert zunächst chromatographisch jene Proteine, die im Vergleichstest gegenüber anderen Geweben erstmalig auftreten. Eines der gewünschten Proteine (Steuerungsfaktor) wird durch übliche Trennverfahren, z.B. mittels präparativer Säulenchro- matographie, inklusive HPLC und isoelektrischer Fokussierung, isoliert und rein dargestellt.First, those proteins are isolated chromatographically that appear for the first time in comparison tests with other tissues. One of the desired proteins (control factor) is separated by conventional separation methods, e.g. using preparative column chromatography, including HPLC and isoelectric focusing, isolated and presented purely.
Nun wird getestet, ob das isolierte Protein mit dem gesuchten Steuerungsfaktor PA identisch ist. Dazu wird es z.B. Versuchs- tieren mit fulminant wachsenden Krebsgeschwüren injiziert oder es werden in-vitro-Kulturen von stark proliferierendem Krebsgewebe damit besprüht. Ist das verwendete Protein mit dem Steuerungsfaktor PA identisch, dann wird die Proliferation von Krebsgeweben abgebrochen .Now it is tested whether the isolated protein is identical to the control factor PA sought. For this it is e.g. Experimental animals are injected with fulminantly growing cancerous ulcers or sprayed with it in vitro cultures of strongly proliferating cancerous tissue. If the protein used is identical to the control factor PA, the proliferation of cancerous tissue is stopped.
Soll hingegen getestet werden, ob der Steuerungsfaktor PF mit dem isolierten Protein identisch ist, so wird es bei Tieren mit einer frisch gesetzten, offen belassenen und mit einem Fensterverband verschlossenen Wunde injiziert. Ist das Protein mit dem Steuerungsfaktor PF identisch, dann wird in der Wunde die Granulation (Proliferation) signifikant angeregt.If, on the other hand, it is to be tested whether the control factor PF is identical to the isolated protein, it is injected into animals with a freshly placed wound which has been left open and closed with a window dressing. Is the protein with that Control factor PF identical, then granulation (proliferation) is significantly stimulated in the wound.
Von den so ermittelten Proteinen werden dann per Auftrag, z.B. bei BACHEM Inc., die Aminosäure-Sequenzen ermittelt. Der Aminosäure-Code dient u.a. der Kontrolle, ob bei den weiteren Verfahrensschritten überhaupt das ursprüngliche Protein bzw. dessen ursprünglichen Folgeprodukte noch in Gebrauch sind.The proteins determined in this way are then ordered, e.g. at BACHEM Inc., the amino acid sequences determined. The amino acid code serves among other things checking whether the original protein or its original secondary products are still in use in the further process steps.
Aus den Zellen des Ausgangsmaterials (Wundgewebe (aa) und (ab) oder Blastozystengewebe (ac) ) wird das entsprechende Protein exprimiert und daraus die entsprechende mRNA gewonnen.The corresponding protein is expressed from the cells of the starting material (wound tissue (aa) and (ab) or blastocyst tissue (ac)) and the corresponding mRNA is obtained therefrom.
Die mRNA muß den Code der Aminosäuresequenzen des Ursprungs- Proteins enthalten (Sequenztest) .The mRNA must contain the code of the amino acid sequences of the original protein (sequence test).
Diese mRNA kann z.B. mittels SMART-Technologie über die einsträngige cDNA mit Primern in die doppelsträngige DNA übergeführt werden.This mRNA can e.g. using SMART technology to convert the single-stranded cDNA with primers into the double-stranded DNA.
Das bland-end DNA-Fragment wird mit Restriktionsenzymen in einen bland-end geschnittenen Vektor eingefügt und mit Ligase eingebunden. Das entstandene Plasmid wird nach der Transfek- tion, z.B. mit E. Coli, klonisiert. Das entstandene (runde) Plasmid wird, z.B. mit Adenoviren, in geeignete Säugetierzellen transduziert . Die transduzierten Zellen werden dann in-vitro als Kulturen gezüchtet .The bland-end DNA fragment is inserted into a bland-end cut vector with restriction enzymes and integrated with ligase. The resulting plasmid is after the transfection, e.g. cloned with E. coli. The resulting (round) plasmid is e.g. with adenoviruses, transduced into suitable mammalian cells. The transduced cells are then grown in vitro as cultures.
Ein spezielles therapeutisches Verfahren besteht darin, daß z.B. Krebszellen eines Patienten, die bei Operationen oder aus Probeexzisionen gewonnen werden, als Empfängerzellen benützt werden. Dazu werden sie mit einem Plasmid transduziert, welches genetische Merkmale der Steuerungsfaktoren enthält. Werden diese transduzierten Zellen dem Patienten replantiert, dann be- steht die Möglichkeit, eine biologische Kettenreaktion auszulö- sen, welche zum Abbruch der Proliferationen und damit zum natürlichen Absterben der Krebsgewebe führt .A special therapeutic method is that, for example, cancer cells from a patient, which are obtained during operations or from sample excisions, are used as recipient cells. For this purpose, they are transduced with a plasmid which contains genetic characteristics of the control factors. If these transduced cells are replanted to the patient, there is the possibility of triggering a biological chain reaction. sen, which leads to the termination of the proliferation and thus to the natural death of the cancerous tissue.
Beispiel 8Example 8
Züchtung der geklonten Substanzen, Verfahrensstufe esCultivation of the cloned substances, process stage es
Die gentechnisch transduzierten Zellen werden nun in Gewebekul- turen in-vitro gezüchtet, wobei sich das eruierte genetische Merkmal des Steuerungsfaktors pro Zellvermehrung im Verhältnis 1 : 1 mitvermehrt .The genetically transduced cells are now grown in tissue cultures in vitro, whereby the genetic characteristic of the control factor per cell proliferation increases in a ratio of 1: 1.
Als Nährmedium kann man z.B. das Fertigprodukt DMEM-Lösung ver- wenden. Die Lösung wird in Kulturflaschen (50-500ml) gefüllt, deren Ventil geöffnet bleiben muß, damit das für die Kultur zur Veratmung notwendige, der Brutraumluft zugesetzte C02 in die Flasche eindringen kann. Dann wird das gentechnisch manipulierte Zellmaterial eingebracht. Zur Anregung größtmöglicher Mitosetätigkeit kann gegebenenfalls der Steuerungsfaktor PF zugegeben werden. Bebrütet wird in bekannter Weise im beheizten und thermostatisierten, keimfreien Brutraum.For example, the finished product DMEM solution can be used as the nutrient medium. The solution is filled into culture bottles (50-500ml), the valve of which must remain open so that the C0 2 necessary for the culture to breathe and which is added to the brood air can penetrate into the bottle. Then the genetically engineered cell material is introduced. If necessary, the control factor PF can be added to stimulate the greatest possible mitotic activity. Breeding is carried out in a known manner in the heated and thermostated, germ-free brood chamber.
Nach der spezifisch optimalen Wachstumszeit wird die Kultur ab- gesetzt und als Ausgangsmaterial verwendet. Daraus wird in bekannter Weise (analog Verfahrensschiene Gesamtproteine) ein niedermolekulares Protein gewonnen, welches in konzentrierter Form einen Steuerungsfaktor enthält .After the specifically optimal growth time, the culture is discontinued and used as the starting material. From this, a low-molecular protein is obtained in a known manner (analogous to the overall protein process), which contains a control factor in concentrated form.
Dieses Produkt wird nach den allgemein bekannten Methoden zu einem therapeutisch anwendbaren Präparat verarbeitet . Beispie] 9_This product is processed into a therapeutically applicable preparation according to the generally known methods. Example] 9_
Verarbeitung der geklonten ZellkulturenProcessing of the cloned cell cultures
Die nach Beispiel 8 gezüchteten Zellkulturen können im Prinzip nach den Verfahrensstufen der "Verarbeitunsschiene Gesamtproteine" (Beispiel 6) verarbeitet werden.In principle, the cell cultures grown according to Example 8 can be processed according to the process steps of the "total protein processing track" (Example 6).
Die Lipidentfernung kann entfallen.The lipid removal can be omitted.
Nach dem Zentrifugieren und Fällen von Eiweißsubstanzen wird das Proteingemisch dialysiert, das Aussendialysat abgetrennt und in üblicher Weise konzentriert oder lyophilisiert .After centrifuging and precipitation of protein substances, the protein mixture is dialyzed, the outer dialysate is separated off and concentrated or lyophilized in the usual way.
Beispiel IQExample IQ
Herstellung von ipidextrakten aus WundheilungsgewebenProduction of ipide extracts from wound healing tissues
Die Extraktionsmedien (z.B Aceton, Diethylether, Toluol), welche zur Abtrennung der Lipide aus den Wundheilungsgeweben in der Verfahrensstufe (bg) verwendet wurden, werden abgenutscht und/oder mittels Druckminderungsverfahren substanzschonend ab¬ gedampft . Gegebenenfalls wird der Rückstand noch mit Ethanol ausgewaschen.The extraction media (eg, acetone, diethyl ether, toluene), which were used for separation of the lipids from the wound healing tissues in the process stage (bg) are filtered off with suction and / or substance gently evaporated by pressure reduction process from ¬. If necessary, the residue is washed out with ethanol.
Die so gewonnenen Lipidfraktionen werden in eine Salben- , Creme- oder Lotionsbasis oder in sonstige Lösungsträger eingeschleust und als dermatologische Arzneien verwendet . The lipid fractions obtained in this way are introduced into an ointment, cream or lotion base or into other solution carriers and used as dermatological medicines.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Gewinnen von Steuerungsfaktoren für die Startphasen und die Beendigungsphasen der Wundgranulation und der Epithelisierung aus Wundgeweben von Tieren oder aus Blut von Menschen oder Tieren unter Anwendung der Verfahrensstufen1. Method for obtaining control factors for the start and end phases of wound granulation and epithelization from wound tissue from animals or from blood from humans or animals using the process steps
(a) Entnehmen von Granulations- und/oder Epithelisierungsgewebe aus der Wunde eines Tieres oder Entnehmen von Blut von einem Menschen oder einem Tier, der bzw. das gerade einen Wundheilungsprozeß durchläuft,(a) removing granulation and / or epithelializing tissue from the wound of an animal or taking blood from a human or an animal that is currently undergoing a wound healing process,
(b) Abtrennen der Lipide aus dem Granulationsgewebe, Epithelisierungsgewebe, Blut oder Serum zur Gewinnung eines ersten Proteinprodukts und(b) separating the lipids from the granulation tissue, epithelization tissue, blood or serum to obtain a first protein product and
(c) Abtrennen von Feststoffen und hochmolekularen Eiweißfraktionen aus dem ersten Proteinprodukt zur Gewinnung eines zweiten Proteinprodukts,(c) separating solids and high molecular weight protein fractions from the first protein product to obtain a second protein product,
dadurch gekennzeichnet, daßcharacterized in that
(d) aus dem zweiten Proteinprodukt die gewünschten Steuerungsfaktoren isoliert werden.(d) the desired control factors are isolated from the second protein product.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) nach der Blutentnahme das Serum aus dem Blut isoliert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that in step (a) the serum is isolated from the blood after the blood sample.
3. Verfahren zum Gewinnen von Steuerungsfaktoren für die Startphasen und die Beendigungsphasen der Wundgranulation und der Epithelisierung aus einem Gewebe eines Tieres oder eines Menschen,3. Procedure for gaining control factors for the start and end phases of wound granulation and epithelization from an animal or human tissue,
gekennzeichnet durch die Verfahrensstufencharacterized by the process stages
(a) Entnehmen eines Blastozystengewebes im Stadium der Determinierung von einem Menschen oder einem Tier,(a) removing a blastocyst tissue at the stage of determination from a human or an animal,
(b) Abtrennen der Lipide aus dem Blastozystengewebe zur Gewinnung eines ersten Proteinproduktes,(b) separating the lipids from the blastocyst tissue to obtain a first protein product,
(c) Abtrennen von Feststoffen und hochmolekularen Eiweißfraktionen aus dem ersten Proteinprodukt zur Gewinnung eines zweiten Proteinproduktes und(c) separating solids and high molecular weight protein fractions from the first protein product to obtain a second protein product and
(d) Isolieren der gewünschten Steuerungsfaktoren aus dem zweiten Proteinprodukt .(d) isolating the desired control factors from the second protein product.
4. Verfahren zum Gewinnen von Steuerungsfaktoren für die Startphasen und die Beendigungsphasen der Wundgranulation und der Epithelisierung aus Wundgeweben von Tieren oder aus Blut von Menschen oder Tieren unter Anwendung der Verfahrensstufen4. A method for obtaining control factors for the start and end phases of wound granulation and epithelization from wound tissue from animals or from blood from humans or animals using the process steps
(a) Entnehmen von Granulations- oder Epithelisierungsgewebe aus der Wunde eines Tieres oder Entnehmen von Blut von einem Menschen oder einem Tier, das bzw. der einen Wundheilungsprozeß durchläuft,(a) removing granulation or epithelializing tissue from the wound of an animal or taking blood from a human or animal which is undergoing a wound healing process,
(b) Abtrennen der Lipide aus dem Granulationsgewebe, Epithelisierungsgewebe, Blut oder Serum zur Gewinnung eines ersten Proteinprodukts und (c) Abtrennen von Feststoffen und hochmolekularen Eiweißfraktionen aus dem ersten Proteinprodukt zur Gewinnung eines zweiten Proteinprodukts,(b) separating the lipids from the granulation tissue, epithelization tissue, blood or serum to obtain a first protein product and (c) separating solids and high molecular weight protein fractions from the first protein product to obtain a second protein product,
gekennzeichnet durchmarked by
(d) Isolieren der gewünschten Steuerungsfaktoren aus dem zweiten Proteinprodukt ,(d) isolating the desired control factors from the second protein product,
(e) Gentechnische Bearbeitung der Steuerungsfaktoren durch Darstellung der kodierenden RNA's und DNA 's und der Vektoren zum Zweck der Klonierung von geeigneten Empfängerzellen mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten, welche für die Steuerungsfaktoren kodieren, die in den in der Stufe (d) gewonnenen Produkten vorliegen,(e) Genetic engineering of the control factors by displaying the coding RNA's and DNA's and the vectors for the purpose of cloning suitable recipient cells with one or more DNA fragments which code for the control factors obtained in the step (d) Products,
(f) Züchtung des geklonten Gewebes in einem Nährmedium und(f) culturing the cloned tissue in a nutrient medium and
(g) Isolieren der gewünschten Steuerungsfaktoren aus der Gewebezucht der Stufe (f) .(g) isolating the desired control factors from tissue engineering in step (f).
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) nach der Blutentnahme das Serum aus dem Blut isoliert wird.5. The method according to claim 4, characterized in that in step (a) the serum is isolated from the blood after the blood sample.
Verfahren zum Gewinnen von Steuerungsfaktoren für die Startphasen und die Beendigungsphasen der Wundgranulation und der Epithelisierung aus Wundgeweben von Tieren oder aus einem Gewebe eines Tieres oder eines Menschen,Process for obtaining control factors for the start and end phases of wound granulation and epithelization from wound tissue from animals or from a tissue of an animal or a human,
gekennzeichnet durch die Verfahrensstufencharacterized by the process stages
(a) Entnehmen eines Blastozystengewebes im Stadium der Determinierung von einem Menschen oder einem Tier, (b) Abtrennen der Lipide aus dem Blastozystengewebe zur Gewinnung eines ersten lipidfreien Proteinprodukts,(a) removing a blastocyst tissue at the stage of determination from a human or an animal, (b) separating the lipids from the blastocyst tissue to obtain a first lipid-free protein product,
(c) Abtrennen von Feststoffen und hochmolekularen Eiweißfraktionen aus dem ersten Proteinprodukt zur Gewinnung eines zweiten Proteinprodukts und(c) separating solids and high molecular weight protein fractions from the first protein product to obtain a second protein product and
(d) Isolieren der gewünschten Steuerungsfaktoren aus dem zweiten Proteinprodukt,(d) isolating the desired control factors from the second protein product,
(e) gentechnische Bearbeitung der Steuerungsfaktoren durch Darstellung der kodierenden RNA's und DNA's und der Vektoren zum Zweck der Klonierung von geeigneten Empfängerzellen mit einem oder mehreren DNA-Fragmenten, welche für die Steuerungsfaktoren kodieren, die in den in der Stufe (d) gewonnenen Produkten vorliegen,(e) genetic engineering of the control factors by displaying the coding RNAs and DNAs and the vectors for the purpose of cloning suitable recipient cells with one or more DNA fragments which code for the control factors which are present in the products obtained in step (d) ,
(f) Züchtung des geklonten Gewebes in einem Nährmedium und(f) culturing the cloned tissue in a nutrient medium and
(g) Isolieren der gewünschten Steuerungsfaktoren aus der Gewebezucht der Stufe (f) .(g) isolating the desired control factors from tissue engineering in step (f).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (d) das zweite Proteinprodukt chromatographisch aufgetrennt wird und die Fraktionen, welche die gewünschten Steuerungsfaktoren enthalten, isoliert werden.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that in step (d) the second protein product is separated chromatographically and the fractions which contain the desired control factors are isolated.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) das Granulationsoder Epithelisierungsgewebe dem Tier oder das Blastozystengewebe im Zustand der Determinierung dem Menschen oder dem Tier, oder das Blut dem Menschen oder dem Tier zu einem Zeitpunkt entnommen wird, in dem die maximale Menge der zu gewinnenden Steuerungsfaktoren gebildet worden ist.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that in step (a) the granulation or epithelization tissue to the animal or the blastocyst tissue in the state of determination to humans or animals, or the blood to humans or animals is taken from a time at which the maximum amount of control factors to be obtained has been formed.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) dem Tier das Granulationsgewebe während des 4. bis 10. postoperativen Tages, das "Epithelisierungsgewebe während des 6. und 44. postoperativen Tages und das Blastozystengewebe etwa am 4. Tag nach der Befruchtung entnommen wird.Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that in step (a) the granulation tissue for the animal during the 4th to 10th postoperative day, the " epithelialization tissue during the 6th and 44th postoperative day and the blastocyst tissue approximately on 4th day after fertilization.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (a) gewonnene Granulations- , Epithelisierungs- oder Blastozystengewebe in ein Nährmedium inokuliert und bis zur Bildung der maximalen Menge der zu gewinnenden Steuerungsfaktoren vermehrt wird.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the granulation, epithelization or blastocyst tissue obtained in step (a) is inoculated into a nutrient medium and is increased until the maximum amount of the control factors to be obtained is formed.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 und 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) das Granula- tionsgewebe oder das Epithelisierungsgewebe dem Tier in einem Stadium der fortschreitenden Wundheilung entnommen wird.11. The method according to any one of claims 1, 4 and 7 to 10, characterized in that in step (a) the granulation tissue or the epithelization tissue is removed from the animal at a stage of progressive wound healing.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (a) das Blastozystengewebe von einem Menschen oder Tier im Stadium der Gastrulation gewonnen wird.12. The method according to any one of claims 2 and 6 to 10, characterized in that in step (a) the blastocyst tissue is obtained from a human or animal at the stage of gastrulation.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 und 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von13. The method according to any one of claims 1, 4 and 7 to 11, characterized in that for the extraction of
Granulationsgewebe in der Stufe (a) dem Tier eine Wunde gesetzt wird, in die Wunde ein Gegenstand eingebracht wird, der mindestens einen Hohlraum und an seiner Oberfläche zu dem Hohlraum führende gitterartige Öffnungen aufweist, die Wunde dann vernäht wird, nach maximaler Gra- nulation oder nach Abbruch der Granulation der genannte Gegenstand mitsamt dem gebildeten Granulationsgewebe aus der Wunde entfernt und das Granulationsgewebe von dem Gegenstand abgelöst wird.Granulation tissue in step (a) a wound is placed on the animal, an object is introduced into the wound which has at least one cavity and has grid-like openings on its surface leading to the cavity, the wound is then sewn, after maximum nulation or after termination of the granulation said object together with the granulation tissue formed is removed from the wound and the granulation tissue is detached from the object.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 und 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von Epithelisierungsgewebe in der Stufe (a) bei einem Tier ein Hautdefekt gesetzt wird, die freiliegende Muskulatur oberfläch- lieh verletzt wird, dann in den Defekt ein netzförmiger Gegenstand eingebracht wird, die Wunde mit einem Fensterverband, der ein Beobachten des Beginns oder des Abschlusses der Epithelisierung ermöglicht, abgedeckt wird und dann nach einer ausreichenden Zeit das gewünschte gebildete Gewebe entnommen wird.14. The method according to any one of claims 1, 4 and 7 to 11, characterized in that in order to obtain epithelization tissue in step (a) an animal skin defect is set, the exposed muscles are injured surface, then in the defect a reticulated object is inserted, the wound is covered with a window bandage which enables the beginning or the end of the epithelization to be observed, and the desired tissue formed is then removed after a sufficient time.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 , dadurch gekennzeichnet, daß das in der Stufe (a) dem Tier oder dem Menschen entnommene Gewebe gentechnisch bearbeitet wird, um Zellen mit den genetischen Merkmalen der zu gewinnenden Steuerungsfaktoren zu bilden, und daß dann diese Zellen geklont werden .15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the tissue removed from animal or human in stage (a) is genetically processed to form cells with the genetic characteristics of the control factors to be obtained, and then these Cells are cloned.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die geklonten Zellen zur Gewinnung der genetischen Eigenschaften der Steuerungsfaktoren in-vitro gezüchtet werden.16. The method according to claim 15, characterized in that the cloned cells are grown to obtain the genetic properties of the control factors in vitro.
17. Verwendung der nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 erhaltenen Steuerungsfaktoren oder ihrer genetischen Wirkstoffe zur Herstellung eines Arzneimittels.17. Use of the control factors obtained by a method according to any one of claims 1 to 16 or their genetic active ingredients for the manufacture of a medicament.
18. Verwendung des in der Stufe (c) eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhaltenen zweiten Protein- produkts zur Herstellung eines Arzneimittels. 18. Use of the second protein product obtained in step (c) of one of the processes according to one of claims 1 to 16 for the manufacture of a medicament.
19. Verwendung der in der Stufe (b) eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 erhaltenen Lipide zur Herstellung eines Arzneimittels . 19. Use of the lipids obtained in step (b) of one of the processes according to one of claims 1 to 16 for the production of a medicament.
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