WO1998045475A1 - Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations - Google Patents

Systemes de detection d'hybridation d'acides nucleiques, leur procede de preparation et leurs utilisations Download PDF

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WO1998045475A1
WO1998045475A1 PCT/FR1998/000722 FR9800722W WO9845475A1 WO 1998045475 A1 WO1998045475 A1 WO 1998045475A1 FR 9800722 W FR9800722 W FR 9800722W WO 9845475 A1 WO9845475 A1 WO 9845475A1
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WO
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domain
sequence
primer
nucleic acid
detection
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Application number
PCT/FR1998/000722
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English (en)
Inventor
Robert Teoule
Sylvie Sauvaigo
Hervé Bazin
Original Assignee
Cis Bio International
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to means for detecting the hybridization of nucleic acids, which can be used in particular for diagnosis.
  • Techniques for identifying RNA or DNA sequences are described in detail below.
  • target sequences in a sample implement the hybridization of the target sequence with a labeled probe, and the detection of the duplex formed, after elimination of the non-hybridized probe.
  • probes (generally larger than 100 bases) and short probes, ranging in size from 10 to 30 bases long.
  • the probes most commonly used in medical diagnosis are synthetic oligonucleotides conjugated to a marker, either by direct attachment to this marker, or by conjugation to a ligand; in the latter case, the detection is carried out by means of a marker fixed to this ligand.
  • Radioactive or cold markers can be used.
  • radioactive markers include, for example, in the case of radioactive markers, the 5 ′ labeling of synthetic oligonucleotides with the enzyme polynucleotide kinase with ⁇ 32 P ATP, or the incorporation of radioactive dCTP or dATP during labeling by nick translation.
  • non-radioactive markers which can be incorporated chemically into synthetic oligonucleotides (PCT application WO 89/12462)
  • Biotinylated analogs of UTP can also be incorporated by cleavage translation into double-stranded DNA.
  • Biotin is generally detected through its binding to avidin, which itself serves as an attachment support for fluorescent molecules, enzymes or other detectable compounds.
  • haptens dinitrophenyl group, digoxigenin
  • specific labeled antibodies serve as developers of the system.
  • the sensitivity of molecular hybridization tests is an important factor which is often limiting in the application of diagnostic tests in molecular biology.
  • the sensitivity of a test depends directly on the labeling used to reveal the hybridized probe.
  • One of the ways to improve the sensitivity of a test is to amplify the signal by increasing the number of markers incorporated into the probe, in order to obtain so-called "polymarked" probes.
  • terminal-transferase enzyme which is capable of extending a single-stranded DNA chain by the addition at its 3 ′ end of nucleotide analogs, for example biotinylated nucleotides .
  • nucleotide analogs for example biotinylated nucleotides .
  • the main drawback of this method is that the number of nucleotides added by the enzyme to the end of the single-stranded DNA chain is random. This results in a mixture of products of different lengths, which makes the marking difficult to reproduce, and produces heterogeneous probes, difficult to standardize and therefore not suitable for medical diagnosis.
  • COLLINS (Application EP 204 510) proposes a variant in which the probe is extended by a homopolymeric tail (poly A) using the enzyme terminal transferase.
  • the marker then consists of a homopolymer (poly T) in which are incorporated detectable molecules. This system does not, however, completely eliminate the drawbacks resulting from the inability to control the action of the enzyme.
  • US Patent 4,882,269 describes a system in which polymarked secondary probes hybridize to several sites of a primary probe.
  • the object of the present invention is to propose a system allowing the amplification of a hybridization signal, devoid of the drawbacks mentioned above, and simple to obtain, to purify and to use, in particular in the context of simultaneous detection. of several nucleic acid sequences.
  • the inventors came up with the idea of using, as labeled detection probes, nucleic acid molecules of particular structure, which until now have only been used as amplification products of a sequence. target, intended to be fixed on a solid support, then detected by conventional methods, for example by means of a probe.
  • nucleic acid molecules are described by NEWTON et al. [Nucleic Acids Res., 21, pp. 1155-1162, (1993)], as well as in Application EP 416 817 in the name of IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC. They are in the form of a double-stranded domain (which is a copy of the target sequence), provided at at least one of its ends with a single-stranded tail, which makes it possible to fix the molecule on a solid support, or to visualize it, via a labeled probe complementary to said tail. The double-stranded domain is separated from the single-stranded tail by a region comprising a stop block.
  • nucleic acid molecules are obtained by polymerase chain reaction (PCR amplification) of the target sequence using primers comprising a nucleotide sequence capable of hybridizing to said target sequence, and a polynucleotide tail, separated by a stop synth.
  • primers comprising a nucleotide sequence capable of hybridizing to said target sequence, and a polynucleotide tail, separated by a stop synth.
  • a “synthon” is a molecule (nucleotide analog or other) having the ability to be incorporated into a synthetic polynucleotide.
  • a “stop synthon” is a synthon which further has the property of causing polymerase arrest when encountered on the template strand during a copy or elongation reaction of a polynucleotide.
  • the present invention relates to the use of nucleic acid molecules having the structure: single-strand synthon stop region / double-strand region, described above as a probe for detecting a target sequence. More specifically, the subject of the present invention is a method for detecting at least one target nucleic acid sequence, characterized in that said target sequence is placed in the presence of at least one detection probe constituted by a molecule nucleic acid consisting of:
  • a binding domain consisting of a simple polynucleotide -
  • a visualization domain C constituted by a double-stranded polynucleotide, in which is incorporated at least one labeled nucleotide constituting a detection means, under conditions allowing the hybridization of the domain A of said nucleic acid probe with the sequence target, and in that the hybrid formed is detected via the domain C of said nucleic acid probe.
  • a detection probe which can be used for implementing the method according to the invention is shown diagrammatically in FIG. 1.
  • the size of the binding domain A of the detection probe is advantageously between 8 and 40 nucleotides in length, preferably 15 to 25 nucleotides.
  • Domain B can be constituted by one or more stop synthons, identical or different; synthons which can be used as stop synthons are for example chosen from alkane diols, or any other compound such as those described for example by WILK et al. [Nucleic Acids Res., 18, pp. 2065-2068, (1990)], by KUBARENA et al. [Nucleic Acids Res., 20, pp. 4533-4538, (1992)], or in the publication of NEWTON et al. and in Application EP 416 817 cited above.
  • synthons which can be used as stop synthons are for example chosen from alkane diols, or any other compound such as those described for example by WILK et al. [Nucleic Acids Res., 18, pp. 2065-2068, (1990)], by KUBARENA et al. [Nucleic Acids Res., 20, pp. 4533-4538, (1992)], or in the publication of NEWTON et al. and
  • the detection means incorporated in domain C constitute a signal amplifier allowing the visualization of the detection probe.
  • Detection means which can be used in the context of the present invention are, in general, markers, known in themselves, conventionally used for labeling nucleic acid probes in order to allow their visualization. They are in particular nucleotides or nucleotide analogs, which can be incorporated by a polymerase into an oligonucleotide chain, and which can be labeled so as to be detected either directly, for example in the case of labeling radioactive or by a fluorescent molecule, either indirectly, for example in the case of ligands, (such as biotin or a hapten), revealed by means of the attachment of labeled molecules (such as avidin or an antibody). They can also be introduced into the polynucleotide chain in the form of labeling precursors intended to be modified subsequently in order to produce the molecule emitting the visualization signal.
  • At least 1/50, preferably at least 1/10, and quite preferably, at least 1/5, of the monomers constituting the double-strand C domain of the detection probe are nucleotides or the like. of labeled nucleotides, as defined above. These labeled monomers can be incorporated into only one of the strands of domain C; to obtain a higher marking and a higher signal, it is generally preferable to incorporate them in each of the two strands.
  • the level of the signal generated by the detection probe also depends on the size of the double-stranded domain C; advantageously, this is between 0.1 and 50 kb, and preferably between 1 and 10 kb.
  • sequence of the double-strand C domain is not essential, insofar as this polynucleotide has the sole function of allowing the visualization of the detection probe, thanks to the labeled nucleotides which are incorporated therein.
  • the hybridization of domain A of the detection probe with the target sequence can be carried out directly; in this case, the domain A is chosen so that its sequence is complementary to the target sequence to be detected. You can also, if desired, use an adapter; in most cases this will not however be necessary, even if it is desired to detect several target sequences. Indeed, as will be seen below, it is very easy to simultaneously prepare detection probes differing from one another by the sequence of domain A.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for the simultaneous detection of several target sequences.
  • these probes can simultaneously use several detection probes, differing from each other by the sequence of domain A; possibly, these probes can also differ from each other by the nature of the B domain (ie the number and / or the nature of the stop synthons). In addition, they can differ from each other by the sequence of domain C and / or, advantageously, by the nature of the labeling of the nucleotides incorporated in said domain. This allows for example to assign to each target sequence a specific display signal.
  • the target sequence (s) to be detected can be fixed on a solid support.
  • this solid support consists of a plurality of electrodes, for example microelectrodes arranged in a matrix, at least 2 of which each carry a different target sequence.
  • the target sequence (s) are fixed on these electrodes using for example the methods described in PCT Application WO / 94/22889.
  • Detection probes which can be used in accordance with the invention for the detection of a target sequence can be easily obtained by enzymatic synthesis by carrying out, using a polymerase, at least one primer containing at least one stop building block, in a suitable reaction mixture, comprising at least one labeled nucleotide or nucleotide analog.
  • the present invention also relates to detection probes which can be used in accordance with the invention for the detection of a target sequence, as well as their preparation process.
  • a method for preparing detection probes in accordance with the invention comprises at least one step during which at least one of the strands of domain C is synthesized by carrying out the elongation by polymerase in the presence of a template strand in a suitable reaction mixture, of a primer P 'comprising from 5' to 3 ': a domain A and a domain B as defined above, and a domain X consisting of a sequence capable of hybridizing to the template strand for initiate polymerization, and is characterized in that all or part of at least one of the triphosphate nucleotides of the reaction mixture is replaced by one of its labeled derivatives.
  • the structure of the primer P ' is shown diagrammatically in FIG. 2.
  • the labeled derivatives of nucleotides are incorporated by the polymerase into the neo-synthesized primer extension product, in place of all or part of the corresponding nucleotides. It is thus possible to obtain an important labeling of the domain C. For example, in the theoretical case of a 10 kb fragment, (that is to say 20,000 nucleotides if the fragment is double strand), if we replace 1/3 of thymidines triphosphates by a labeled analog, and considering that we have a sequence to be amplified in which the 4 bases are found in equal proportions, we obtain a fragment in which are incorporated more than 800 labeled monomers / strand.
  • the polymerase extension is carried out in the presence of a second primer P "comprising a sequence capable of hybridizing to the elongation product of primer P.
  • the elongation of the primer P is carried out until the polymerase encounters a stop building block present in the elongation product of the primer P"; the extension product of the primer P "can hybridize to the X domain of a primer P ', and serve as a matrix for the following elongation step.
  • the reaction can be continued, and these steps repeated, according to the conventional scheme of polymerase chain reaction methods, until the desired quantity of detection probes in accordance with the invention is obtained.
  • the method according to the invention may be implemented under the usual conditions of known methods of polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the matrix from which the double-stranded domain C is obtained can have any sequence, hereinafter called “neutral sequence", because it is in particularly totally independent of the target sequences which it is envisaged to detect using these probes.
  • neutral sequence a sequence rich in bases A and T will preferably be chosen, this type of sequence is generally amplifying better than sequences rich in G and C.
  • the A domain at 5 ′ of the primer P ′ must be chosen so as not to interfere in the elongation of the neutral sequence; in particular, it should not hybridize stably with it (which can easily be checked beforehand using sequence homology analysis software).
  • This domain must also not exhibit sequence complementarity with the X domain of the same primer P ′, or with any region of the primer P ′′.
  • the position of the primer P ′′ and of the X part of the 'primer P' on their respective matrices determines the size of the domain C. This can be very important. Indeed, different techniques known to those skilled in the art make it possible to easily obtain and with good yields, elongation fragments of several tens of kilobases [BARNES, Proc. Natl. Acad.
  • the primer P “comprises at least the sequence capable of hybridizing to said template strand to initiate the polymerization; however, it can also comprise a domain A and a domain B as defined above, and therefore have the same structure as the primer P '. In this case, the domains A and B of the primers P' and P "can be identical or different.
  • the problems of fidelity of DNA polymerases do not arise, insofar as the degree of homology between domain C and the “ neutral sequence "used as initial matrix does not play any role, and where only the length of the C domain and the number of markers which can be incorporated into it matter.
  • a series of primers P ′ which are identical to each other with regard to the sequence of the domain X s ′ is used in the same reaction mixture. hybridizing with the neutral sequence, and differing from each other by the sequence of domain A, and optionally by the nature of domain B. This makes it possible to simultaneously prepare probes allowing the detection of several different target sequences. If it is desired to simultaneously prepare probes which also differ from each other at the level of the C domain, the reaction mixture can contain several “neutral sequences” and for each of them, the series of primers P ′ and primer P ′′ appropriate.
  • a subject of the present invention is also a kit for the preparation of detection probes in accordance with the invention, characterized in that it comprises at least one primer P 'as defined above, a polynucleotide usable as a template for the extension of said primer, and a labeled nucleotide triphosphate.
  • said kit also comprises a primer P ".
  • the quality of the amplification products obtained is easily controllable by electrophoresis on agarose gel. If good amplification conditions are selected, only one band is observed on gel.
  • the purified product is quantifiable by UV spectrometry or by assaying the incorporated marker.
  • the implementation of the process in accordance with the invention makes it possible to obtain, in a simple and reproducible manner, marked detection probes having homogeneous characteristics, which are easy to quantify and to purify by conventional methods, and which have a very high specific activity, greater than that of the labeled probes usually obtained by cut translation.
  • the detection probes according to the invention have the following advantages: - they have very rapid hybridization kinetics, corresponding roughly to the hybridization kinetics of the oligonucleotides; as in the case of oligonucleotides, this kinetics is essentially linked to their concentration in the medium and with respect to the target sequence; this makes it possible to easily define the hybridization and washing conditions necessary for the specificity of hybridization of the detection probes in accordance with the invention.
  • the recognition domain C being in double-stranded form, it does not present any risk of cross hybridization with the target sequence and therefore, there is no problem of background noise.
  • the amplification conditions were first developed with unmodified primers, that is to say without comprising the A and B domains. The amplification was then reproduced with the modified P 'primer comprising the three domains A, B and C.
  • the amplification is carried out on 0.1 ⁇ g of human genomic DNA (CLONTECH), in the presence of 10 pmol of each of the primers, 2.5 units of Taq polymerase (CIS BIO INTERNATIONAL), 5 ⁇ l of 10 X buffer (Tris / 100 mM HCl, pH 9; KCl 500 mM; MgCl 2 15 mM; Triton XlOO 1%, BSA 2 mg / ml) CIS BIO INTERNATIONAL), 0.75 ⁇ l of each of the triphosphate nucleotides (20 mM solutions, BOEHRINGER MANNHEIM ).
  • a single strip, of the expected length, is obtained.
  • the primer J 15 (stop) 2 ⁇ makes it possible to amplify a fragment of 6023 bp when it is used with the primer ⁇ 6528 , and a fragment 10709 bp when it is used with the primer ⁇ 1 1214 .
  • the XL PCR kit (PERK-IN ELMER) is used following the protocol recommended by the manufacturer and the technique of high-temperature starting (hot-start).
  • the lower phase of the reaction medium is prepared in 500 ⁇ l thin-walled tubes (PERKIN-ELMER) according to the manufacturer's instructions. 40 pmoles of primers and 1.1 mM final in Mg (OAc) 2 are used .
  • the lower phase is covered with wax (PERKIN-ELMER); the upper phase is then added.
  • the amplification is carried out using 1 ng of phage ⁇ DNA.
  • the amplification takes place according to the following protocol:
  • the amplification products are checked after electrophoresis on 0.8% agarose gel and staining with ethidium bromide. Only one band of the expected length is observed.
  • the amplification is carried out with the primers ⁇ 2 and ⁇ o stop) ⁇ on 1 ng of phage DNA ⁇ .
  • the reagents are the same as in B, above.
  • the amplification conditions are as follows:
  • the amplification is controlled after electrophoresis on 0.6% agarose gel.
  • oligonucleotide complementary to domain A of primer K 20 (stop) 2 ⁇ of sequence: 5 'TGG CAT GGT AGC CAC GTG 3' this oligonucleotide is labeled 5 ′ by the polynucleotide kinase, in the presence of ⁇ 32 P ATP. It is hybridized in solution for 10 minutes at 37 ° C. with 5 ⁇ l of the amplification product, in 1 ⁇ PBS buffer, 0.25 M NaCl. The hybridization product is separated by electrophoresis on 0.6 agarose gel %. The gel is dried and then autoradiographed for 1 night. The autoradiograph shows that the radioactivity is localized at the top of the gel at the level of the amplification band, as well as at the bottom of the gel, at the level of the labeled non-hybrid oligonucleotide.
  • the target is a 30-base-long RNA obtained by in vitro transcription and the sequence of which is as follows: 5 'UUG CCU GGA CGA CCG GGU CCU UUC UUG GAG 3'. 10 to 10 dilute solutions are prepared. The undiluted solution is considered to be solution 1.
  • the detection of the target is done by sandwich hybridization using a capture probe fixed on a microcarrier, and an oligonucleotide (G4) which is either labeled with a biotin, thus constituting a detection probe of conventional type, used for comparison. , or highlighted using a detection probe according to the invention.
  • G4 oligonucleotide
  • the oligonucleotide G4 the sequence of which is as follows: 5 ′ GGT CGT CCT GGC AAT 3 ′ is labeled with a biotin at its 5 ′ end according to the method described in PCT Application WO / 89/12462, or else added with a additional sequence (sequence I 15 ) at its 3 'end.
  • the sequence I 15 5 'ATC CGT TCT ACA GCC 3' hybridizes specifically to an oligonucleotide (cI 15 cJ 15 ), part of which is complementary to I 15 and part of which is complementary to the sequence J 15 .
  • the assembly G4 I 15 + cl 15 cj 15 plays the role of an adapter.
  • the detection probe according to the invention is obtained by PCR amplification of a fragment of human DNA with the primers J 15 (stop) 2 H 1217 o and H 13180 (see example 1A).
  • the reaction medium contains 0.1 ⁇ g of human DNA in Taq IX buffer (CIS BIO INTERNATIONAL), with 2.5 U of Taq DNA polymerase (CIS BIO INTERNATIONAL) and 6 pmol of each of the primers.
  • the nucleotide triphosphates are at 300 nM except for dTTP which is at 240 nM.
  • the amplification medium also contains 60 nM of bio-16-dUTP (BOEHRINGER-MANNHEIM, France).
  • the amplification conditions are as follows: 94 ° C 5 min., Then 35 cycles, 94 ° C 1 min., 60 ° C 1 min. 30 and 70 ° C 1 min. 30 and a final elongation 5 min. at 70 ° C. A double-stranded fragment of 1010 base pairs is thus obtained in which approximately 1/5 of the thymidines are replaced by biotinylated uridines.
  • the amplification is controlled on 1% agarose gel. A single strip of expected size is obtained. The fragment is purified on a SEPHACRYL®HR column (MICROSPIN TM S400, PHARMACIA). Hybridization on a chip:
  • the chip has 48 square electrodes with a side of 50 ⁇ m.
  • the capture probe Gc the sequence of which is as follows: 5 'CTC CAA GAA AGG ACC C 3' and 2 oligonucleotides of different sequence (T1 and T2), used as controls, are each fixed on an electrode by their ends 5 ', by copolymerization with pyrrole, according to the process described in PCT Application WO / 94/22889.
  • the hybridizations take place in 1 hour at 45 ° C. in a PBS I X buffer, 0.5 M NaCl, 10 mM EDTA, 2.5 X DENHARDT containing 100 ⁇ g / ml of sonicated herring sperm DNA.
  • the hybridization solutions are heated for 3 min. at 80 ° C. in microtubes in the presence of the RNA to be assayed, then transferred to a hybridization bag in which the chip is placed.
  • Detection with biotinylated G4 oligonucleotide is Detection with biotinylated G4 oligonucleotide:
  • the hybridization of the target RNA on the chip is carried out in 20 ⁇ l of 1 X buffer containing 1 ⁇ l of the A N solution to be tested and 15 pmol of the oligonucleotide G4 labeled with biotin. 3 rinses are then carried out in 1 X PBS buffer, containing 0.5 M NaCl and 0.05% Tween 20.
  • the chip is then incubated for 10 minutes in a solution of streptavidin-phycoerythrin at 5 ng / ⁇ l in PBS / NaCl / Tween, then rinsed in the washing buffer.
  • the chip is mounted on a slide and under a coverslip in a drop of PBS / NaCl / Tween buffer.
  • the signal is recorded, after irradiation at 500-550 nm for 1 second, by a microscope coupled to a CCD camera.
  • Detection with the detection probe according to the invention It takes place in 2 stages. a) hybridization with the adapter:
  • RNA to be tested (1 ⁇ l) is first hybridized on the chip with 25 pmol of the oligonucleotide I] 5 G 4 and 25 pmol of the oligonucleotide cI 15 cJ 15 .
  • the chip is treated 2 x 5 minutes in a 0.1 N NaOH solution and rinsed with distilled water.
  • b) hybridization with the detection probe After a rapid rinsing in the PBS / NaCl / Tween buffer, the chip is transferred to a second hybridization bag containing 10 ⁇ l of the detection probe according to the purified invention and 10 ⁇ l 2 X hybridization buffer. Rinses, streptavidin-phycoerythrin development, and signal recording are performed as described above. Signals are recorded after 1 second irradiation. Results
  • the signal on each electrode is quantified in arbitrary units of fluorescence (UAFs); the signal range is linear from 0 to 250 UAFs.
  • UAFs fluorescence
  • the control electrodes carrying the oligonucleotides T1 and T2 give signals between 4 and 10 UAFs (results not shown in the table), which corresponds to the background noise.
  • a signal of 250 UAFs corresponds, under the conditions used, to a saturation of the reading system.
  • the signal obtained with the oligonucleotide G4 labeled with a single biotin decreases very quickly when the dilution increases, while the use of a detection probe according to the invention allows a higher signal to be obtained. , and further clearly increases the sensitivity of the test.
  • the background noise in the presence of the detection probe according to the invention, or of the conventional probe constituted by the biotinylated oligonucleotide G4, is the same.
  • a detection probe according to the invention and labeled with digoxigenin is prepared according to the protocol described in example 1 A) above, replacing 1/5 of the dTTPs with digoxigenin-1 l-2'- deoxy-uridine-5'-triphosphate (BOEHRINGER-MANNHEIM).
  • oligonucleotide G4 DIG oligonucleotide G4 labeled with digoxigenin at its 5 ′ end and purified by HPLC.
  • the target consists of RNA as in the previous example. Dilutions of the target are made from 10 to 10. This target is fixed on a microplate coated with streptavidin (LABSYSTEM) via the biotin-labeled Gc capture probe. Hybridization with G4 DIG
  • the target A N is incubated in 50 ⁇ l of PBS / NaCl buffer containing 30 pmol of G4 DIG and 40 pmol of biotinylated Gc capture probe.
  • the solutions are heated for 3 minutes at 80 ° C. and then transferred to the wells. Incubate for 1 hour at 42 ° C. After 3 washes with the PBS / NaCl / Tween buffer, incubation is carried out for 1 hour at 37 ° C. with the anti-DIG antibody labeled with peroxidase (stock solution at 75 U / ml, BOEHRINGER-MANNHEIM, diluted to 1/2000 in PBS / NaCl containing 3% BSA).
  • RNA to be tested is first hybridized in 50 ⁇ l of PBS / NaCl / Tween buffer containing 40 pmol of Gc-biotin probe, 40 pmol of I 15 G4, and 40 pmol of cl 15 cj 15 .
  • the solutions are denatured for 3 minutes at 80 ° C. and then transferred to the wells of the microplate. Incubation takes place for 1 hour at 42 ° C. Three washes with PBS / NaCl / Tween are carried out and then the incubation is carried out with the detection probe.
  • b) hybridization with the detection probe is carried out with the detection probe:
  • the wells are incubated in the dark, in the presence of 50 ⁇ l of peroxidase substrate (O-phenylenediamine, in citrate-phosphate buffer, pH 5.5, containing 0.02% H 2 O 2 ) .
  • the reaction is stopped after 10 minutes for the amplifier system and 30 minutes for the controls, with 50 ⁇ l of 1 M oxalic acid.
  • the optical density is read at 492 nm.

Abstract

L'invention est relative à la détection d'acides nucléiques en utilisant une sonde constituée par: un domaine de fixation A, constitué par un polynucléotide simple brin; un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt; et un domaine de visualisation C, constitué par un polynucléotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucléotide marqué constituant un moyen de détection. L'utilisation de ces sondes permet l'amplification du signal d'hybridation avec des séquences cibles d'acide nucléique.

Description

SYSTEMES DE DETECTION D'HYBRIDATION D'ACIDES NUCLEIQUES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS.
La présente Invention est relative à des moyens de détection de l'hybridation d'acides nucléiques, utilisables en particulier pour le diagnostic. Les techniques d'identification de séquences d'ARN ou d'ADN
(séquences cibles) dans un échantillon mettent en oeuvre l'hybridation de la séquence cible avec une sonde marquée, et la détection du duplex formé, après élimination de la sonde non-hybridée.
Ces techniques sont couramment utilisées en particulier pour le diagnostic de pathologies virales ou infectieuses, pour la recherche médicale ou génétique, l'identification de clones, l'analyse de gènes transcrits, etc.
Deux types de sondes sont utilisées, les sondes dites longues
(généralement de taille supérieure à 100 bases) et les sondes courtes, de taille variant entre 10 et 30 bases de long. Les sondes les plus couramment utilisées en diagnostic médical sont des oligonucleotides de synthèse conjugués à un marqueur, soit par attachement direct à ce marqueur, soit par conjugaison à un ligand ; dans ce dernier cas, la détection s'effectue par l'intermédiaire d'un marqueur fixé sur ce ligand.
On peut utiliser des marqueurs radioactifs ou froids.
De nombreuses techniques de marquage sont décrites par exemple par SAMBROOK et al., [Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. Ces méthodes incluent par exemple, dans le cas de marqueurs radioactifs, le marquage en 5' d'oligonucléotides de synthèse par l'enzyme polynucleotide kinase avec du γ32P ATP, ou encore l'incorporation de dCTP ou dATP radioactif lors du marquage par translation de coupure (nick- translation).
A titre d'exemple de marqueurs non-radioactifs, pouvant être incorporés par voie chimique dans des oligonucleotides de synthèse (Demande PCT WO 89/12462), on citera en particulier la biotine ; Des analogues biotinylés de l'UTP peuvent également être incorporés par translation de coupure dans des ADN double- brin.
La biotine est généralement mise en évidence par l'intermédiaire de sa liaison à l'avidine, qui sert elle-même de support d'attachement pour des molécules fluorescentes, des enzymes ou d'autres composés détectables.
Dans d'autres systèmes de marquage non-radioactif, des haptènes (groupe dinitrophényle, digoxigénine) remplacent la biotine, et des anticorps spécifiques marqués servent de révélateurs au système. La sensibilité des essais d'hybridation moléculaire est un facteur important qui est souvent limitant dans l'application des tests de diagnostic en biologie moléculaire.
La sensibilité d'un essai dépend directement du marquage servant à révéler la sonde hybridée. Un des moyens d'améliorer la sensibilité d'un essai est d'amplifier le signal en augmentant le nombre de marqueurs incorporés dans la sonde, afin d'obtenir des sondes dites « polymarquées ».
Dans ce but, il a par exemple été proposé d'utiliser l'enzyme terminal-transférase, qui est capable d'allonger une chaîne ADN simple-brin par addition à son extrémité 3' d'analogues de nucléotides, par exemple de nucléotides biotinylés. L'inconvénient principal de cette méthode réside dans le fait que le nombre de nucléotides ajoutés par l'enzyme à l'extrémité de la chaîne ADN simple-brin est aléatoire. Il en résulte un mélange de produits de différentes longueurs, ce qui rend le marquage difficilement reproductible, et produit des sondes hétérogènes, difficiles à standardiser et donc non-adaptées au diagnostic médical.
COLLINS (Demande EP 204 510) propose une variante dans laquelle la sonde est allongée par une queue homopolymérique (poly A) en utilisant l'enzyme terminal-transférase. Le marqueur est alors constitué d'un homopolymère (poly T) dans lequel sont incorporées des molécules détectables. Ce système ne, permet toutefois pas d'éliminer complètement les inconvénients résultant de l'impossibilité de contrôler l'action de l'enzyme.
Il a également été proposé d'amplifier le signal en d'utilisant des sondes oligonucléotidiques polymarquées ramifiées, ou bien reliées entre elles par des "ponts" polynucléotidiques s'hybridant à leurs extrémités, comme décrit respectivement dans les Demandes EP 292 128 et EP 450 594, au nom de SEGEV.
Le Brevet US 4,882,269 décrit un système dans lequel des sondes secondaires polymarquées s'hybrident sur plusieurs sites d'une sonde primaire.
La Demande EP 0317 077 ainsi que la Demande PCT WO 92/02526 décrivent un système dans lequel les sondes secondaires sont constituées par des constructions polynucléotidiques polymarquées en forme de peigne.
Ces systèmes présentent l'inconvénient de nécessiter la synthèse de nombreux oligonucleotides différents, ainsi que la mise en œuvre d'étapes d'hybridation et/ou de ligation pour former les constructions finales. En outre, il est difficile d'obtenir des produits finaux homogènes dans leurs caractéristiques, et leur purification est délicate. En particulier, si l'on veut détecter plusieurs séquences cibles différentes, l'on est obligé pour chacune d'elles, soit de synthétiser une nouvelle sonde, soit d'utiliser un adaptateur, qui est un oligonucléotide s'hybridant d'une part avec la séquence-cible à détecter, et d'autre part avec la sonde. La présente Invention a pour but de proposer un système permettant l'amplification d'un signal d'hybridation, dépourvu des inconvénients mentionnés ci- dessus, et simple à obtenir, à purifier et à utiliser, en particulier dans le cadre de la détection simultanée de plusieurs séquences d'acide nucléique.
Dans ce but les Inventeurs ont eu l'idée d'utiliser comme sondes de détection marquées des molécules d'acide nucléique de structure particulière, qui n'étaient utilisées jusqu'à présent qu'en tant que produits d'amplification d'une séquence cible, destinés à être fixés sur un support solide, puis détectés par les méthodes classiques, par exemple par l'intermédiaire d'une sonde.
De telles molécules d'acide nucléique sont décrites par NEWTON et al. [Nucleic Acids Res., 21, pp. 1155-1162, (1993)], ainsi que dans la Demande EP 416 817 au nom de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC. Elles se présentent sous la forme d'un domaine double-brin (qui est une copie de la séquence cible), pourvu à au moins l'une de ses extrémités d'une queue simple-brin, qui permet de fixer la molécule sur un support solide, ou de la visualiser, par l'intermédiaire d'une sonde marquée complémentaire de ladite queue. Le domaine double-brin est séparé de la queue simple-brin par une région comprenant un synthon d'arrêt.
Ces molécules d'acide nucléique sont obtenues par l'amplification en chaîne par polymérase (amplification PCR) de la séquence cible à l'aide d'amorces comprenant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider à ladite séquence cible, et une queue polynucléotidique, séparées par un synthon d'arrêt.
Un « synthon » est une molécule (analogue de nucleotide ou autre) possédant la capacité d'être incorporée dans un polynucleotide de synthèse. Un « synthon d'arrêt » est un synthon qui possède en outre la propriété de provoquer un arrêt de la polymérase lorsqu'il est rencontré sur le brin matrice lors d'une réaction de copie ou d'élongation d'un polynucleotide.
Lorsqu'une amorce comprenant un synthon d'arrêt est utilisée pour l'amplification d'une séquence cible dans une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, la queue polynucléotidique située au delà du synthon d'arrêt n'est pas copiée, et le produit d'amplification final se présente donc sous forme d'une copie double-brin de la séquence cible, pourvue d'une queue simple-brin. La présente invention concerne l'utilisation de molécules d'acide nucléique ayant la structure : région simple-brin synthon d'arrêt/région double-brin, décrite ci-dessus en tant que sonde de détection d'une séquence-cible. Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de détection d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce que l'on met ladite séquence cible en présence d'au moins une sonde de détection constituée par une molécule d'acide nucléique constituée par :
- un domaine de fixation A, constitué par un polynucleotide simple-
- un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et
- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucleotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucleotide marqué constituant un moyen de détection, dans des conditions permettant l'hybridation du domaine A de ladite sonde d'acide nucléique avec la séquence cible, et en ce que l'hybride formé est détecté par l'intermédiaire du domaine C de ladite sonde d'acide nucléique.
Une sonde de détection utilisable pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention est schématisée sur la Figure 1. La taille du domaine de fixation A de la sonde de détection est avantageusement comprise entre 8 et 40 nucléotides de long, préférentiellement 15 à 25 nucléotides.
Le domaine B peut être constitué par un ou plusieurs synthons d'arrêt, identiques ou différents ; des synthons utilisables comme synthons d'arrêt sont par exemple choisis parmi les alcanes diols, ou tout autre composé tels que ceux décrits par exemple par WILK et al. [Nucleic Acids Res., 18, pp. 2065-2068, (1990)], par KUBARENA et al. [Nucleic Acids Res., 20, pp. 4533-4538, (1992)], ou bien dans la publication de NEWTON et al. et dans la Demande EP 416 817 citées ci-dessus.
Les moyens de détection incorporés dans le domaine C constituent un amplificateur de signal permettant la visualisation de la sonde de détection. Des moyens de détection utilisables dans le cadre de la présente invention sont, de manière générale les marqueurs, connus en eux-mêmes, classiquement utilisés pour marquer les sondes d'acide nucléique en vue de permettre leur visualisation. Il s'agit en particulier de nucléotides ou d'analogues de nucléotides, pouvant être incorporés par une polymérase dans une chaîne oligonucléotidique, et pouvant être marqués de manière à être détectés soit directement, par exemple dans le cas d'un marquage radioactif ou par une molécule fluorescente, soit indirectement, par exemple dans le cas de ligands, (tels que la biotine ou un haptène), révélés par l'intermédiaire de la fixation de molécules marquées (telles que l'avidine ou un anticorps). Ils peuvent également être introduits dans la chaîne polynucléotidique sous forme de précurseurs de marquage destinés à être modifiés ultérieurement afin de produire la molécule émettant le signal de visualisation.
Avantageusement, au moins 1/50, de préférence au moins 1/10, et de manière tout à fait préférée, au moins 1/5, des monomères constitutifs du domaine double-brin C de la sonde de détection, sont des nucléotides ou analogues de nucléotides marqués, tels que définis ci-dessus. Ces monomères marqués peuvent être incorporés dans un seul des brins du domaine C ; pour obtenir un marquage plus important et un signal plus élevé, on préférera généralement les incorporer dans chacun des deux brins.
Le niveau du signal généré par la sonde de détection dépend également de la taille du domaine double-brin C ; avantageusement , celle-ci est comprise entre 0,1 et 50 kb, et préférentiellement entre 1 et 10 kb.
En revanche, la séquence du domaine double-brin C n'est pas primordiale, dans la mesure où ce polynucleotide a pour seule fonction de permettre la visualisation de la sonde de détection, grâce aux nucléotides marqués qui y sont incorporés.
Pour la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention, l'hybridation du domaine A de la sonde de détection avec la séquence cible peut s'effectuer directement ; dans ce cas, le domaine A est choisi de manière à ce que sa séquence soit complémentaire de la séquence cible à détecter. On peut également, si on le souhaite, utiliser un adaptateur ; dans la plupart des cas ceci ne sera toutefois pas nécessaire, même si l'on souhaite détecter plusieurs séquences cibles. En effet, comme on le verra ci-après, il est très facile de préparer simultanément des sondes de détection différant entre elles par la séquence du domaine A.
Le procédé conforme à l'invention est donc particulièrement approprié pour la détection simultanée de plusieurs séquences cibles.
Comme indiqué ci-dessus, peut utiliser simultanément plusieurs sondes de détection, différant entre elles par la séquence du domaine A ; éventuellement, ces sondes peuvent également différer entre elles par la nature du domaine B (c'est à dire le nombre et/ou la nature des synthons d'arrêt). En outre, elles peuvent différer entre elles par la séquence du domaine C et/ou, avantageusement, par la nature du marquage des nucléotides incorporés dans ledit domaine. Ceci permet par exemple d'attribuer à chaque séquence cible un signal de visualisation spécifique.
La ou les séquence(s) cible(s) à détecter peuvent être fixées sur un support solide. Avantageusement, ce support solide est constitué par une pluralité d'électrodes, par exemple des microélectrodes disposées en matrice, dont au moins 2 portent chacune une séquence cible différente. La ou les séquence(s) cible(s) sont fixées sur ces électrodes en utilisant par exemple les méthodes décrites dans la Demande PCT WO/94/22889.
Des sondes de détection utilisables conformément à l'invention pour la détection d'une séquence-cible, peuvent être facilement obtenues par synthèse enzymatique en procédant à l'extension, à l'aide d'une polymérase, d'au moins une amorce contenant au moins un synthon d'arrêt, dans un mélange réactiormel approprié, comprenant au moins un nucleotide ou un analogue de nucleotide marqué.
La présente invention a également pour objet des sondes de détection utilisables conformément à l'invention pour la détection d'une séquence- cible, ainsi que leur procédé de préparation.
Un procédé de préparation de sondes de détection conforme à l'invention comprend au moins une étape au cours de laquelle au moins l'un des brins du domaine C est synthétisé en procédant à l'élongation par polymérase en présence d'un brin matrice dans un mélange réactiormel approprié, d'une amorce P' comprenant de 5' en 3' : un domaine A et un domaine B tels que définis ci-dessus, et un domaine X constitué par une séquence capable de s'hybrider au brin matrice pour amorcer la polymérisation, et est caractérisé en ce que tout ou partie d'au moins l'un des nucléotides triphosphate du mélange réactiormel est remplacé par l'un de ses dérivés marqués.
La structure de l'amorce P' est schématisée sur la Figure 2.
Dans ces conditions, les dérivés marqués de nucléotides sont incorporés par la polymérase dans le produit d'élongation d'amorce néo-synthétisé, à la place de tout ou partie des nucléotides correspondants. On peut ainsi obtenir un marquage important du domaine C. Par exemple, dans le cas théorique d'un fragment de 10 kb, (c'est-à-dire 20 000 nucléotides si le fragment est double brin), si l'on remplace 1/3 des thymidines triphosphates par un analogue marqué, et en considérant que l'on dispose d'une séquence à amplifier dans laquelle les 4 bases se trouvent en proportions égales, on obtient un fragment dans lequel sont incorporés plus de 800 monomères marqués/brin. Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'élongation par polymérase est effectuée en présence d'une seconde amorce P" comprenant une séquence capable de s'hybrider au produit d'élongation de l'amorce P'. L'élongation de l'amorce P" s'effectue jusqu'à ce que la polymérase rencontre un synthon d'arrêt présent dans le produit d'élongation de l'amorce P' ; le produit d'élongation de l'amorce P" peut s'hybrider au domaine X d'une amorce P', et servir de matrice pour l'étape suivante d'élongation. La réaction peut être poursuivie, et ces étapes répétées, selon le schéma classique des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase, jusqu'à l'obtention de la quantité souhaitée de sondes de détection conformes à l'Invention.
Dans ce but, le procédé conforme à l'invention pourra être mis en œuvre dans les conditions usuelles des méthodes connues d'amplification en chaîne par polymérase (PCR). On peut par exemple utiliser un procédé d'amplification en chaîne par polymérase du type de ceux décrits dans la publication de NEWTON et al. ou dans la Demande EP 416 817 citées ci-dessus ; bien que similaires par leur structure globale (région simple-brin synthon d'arrêt/région double-brin) aux molécules d'acide nucléique obtenues par ces procédés, les sondes de détection conformes à l'invention s'en différencient par la présence d'oligonucléotides marqués, dans la portion double-brin résultant de l'amplification.
Pour l'obtention des sondes de détection conformes à l'invention, la matrice à partir de laquelle on obtient le domaine double-brin C peut avoir une séquence quelconque, dénommée ci-après « séquence neutre », du fait qu'elle est en particulier totalement indépendante des séquences cibles que l'on envisage de détecter à l'aide de ces sondes. Pour améliorer le rendement de la réaction, en particulier dans le cas où l'on met en œuvre une réaction d'amplification en chaîne par polymérase, on choisira de préférence, une séquence riche en bases A et T, ce type de séquence s'amplifiant généralement mieux que les séquences riches en G et C.
Le domaine A en 5' de l'amorce P' doit être choisi de façon à ne pas interférer dans l'élongation de la séquence neutre ; en particulier, il ne doit pas s'hybrider de façon stable avec celle-ci (ce qui peut facilement être vérifié au préalable grâce à des logiciels d'analyse d'homologie de séquence). Ce domaine ne doit pas non plus présenter de complémentarité de séquence avec le domaine X de la même amorce P', ou avec une quelconque région de l'amorce P". La position de l'amorce P" et de la partie X de l'amorce P' sur leurs matrices respectives conditionne la taille du domaine C. Celle-ci peut être très importante. En effet, différentes techniques connues de l'homme du métier permettent d'obtenir facilement et avec de bons rendements, des fragments d'élongation de plusieurs dizaines de kilobases [BARNES, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, p. 2216- 2220 (1994); CHENG et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, p. 5695-5699, (1994)]. L'amorce P" comprend au moins la séquence capable de s'hybrider audit brin matrice pour amorcer la polymérisation; toutefois, elle peut comprendre en outre, un domaine A et un domaine B tels que définis ci-dessus, et donc avoir la même structure que l'amorce P'. Dans ce cas, les domaines A et B des amorces P' et P" peuvent être identiques ou différents. Dans le cadre de la mise en œuvre du procédé de préparation de sondes de détection conforme à l'invention, les problèmes de fidélité des ADN polymérases ne se posent pas, dans la mesure où le degré d'homologie entre le domaine C et la « séquence neutre » utilisée comme matrice initiale ne joue aucun rôle, et où seuls importent la longueur du domaine C et le nombre de marqueurs qui peuvent y être incorporés.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de préparation de sondes de détection conforme à l'invention, on utilise dans un même mélange réactiormel une série d'amorces P' identiques entre elles en ce qui concerne la séquence du domaine X s'hybridant avec la séquence neutre, et différant entre elles par la séquence du domaine A, et éventuellement par la nature du domaine B. Ceci permet de préparer simultanément des sondes permettant la détection de plusieurs séquences cibles différentes. Si l'on souhaite préparer simultanément des sondes différant également entre elles au niveau du domaine C, le mélange réactiormel peut contenir plusieurs « séquences neutres » et pour chacune d'entre elles, la série d'amorces P' et l'amorce P" appropriées.
La présente invention a également pour objet un nécessaire pour la préparation de sondes de détection conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce P' telle que définie ci-dessus, un polynucleotide utilisable comme matrice pour l'élongation de ladite amorce, et un nucleotide triphosphate marqué. Avantageusement ledit nécessaire comprend en outre une amorce P".
Pour purifier les sondes de détection conformes à l'invention à l'issue de la réaction enzymatique ayant permis leur obtention, de nombreuses méthodes de purification connues en elles-mêmes sont utilisables. Ces méthodes permettent l'élimination des nucléotides triphosphates et des amorces non incorporés et de l'enzyme résiduelle. Les fragments recherchés sont récupérés avec de bons rendements. Ces méthodes sont applicables directement sur le produit de la réaction enzymatique, ou bien après son isolation après migration sur gel d'électrophorèse.
La qualité des produits d'amplification obtenus est facilement contrôlable par électrophorèse sur gel d'agarose. Si de bonnes conditions d'amplification sont sélectionnées, une seule bande est observée sur gel. Le produit purifié est quantifiable par spectrométrie UV ou bien par dosage du marqueur incorporé.
La mise en œuvre du procédé conforme à l'Invention permet d'obtenir de façon simple et reproductible, des sondes de détection marquées ayant des caractéristiques homogènes, qui sont faciles à quantifier et à purifier par des méthodes classiques, et qui ont une très haute activité spécifique, supérieure à celle des sondes marquées obtenues habituellement par translation de coupure.
En outre, les sondes de détection conformes à l'invention présentent les avantages suivants : - elles possèdent une cinétique d'hybridation très rapide, correspondant à peu près à la cinétique d'hybridation des oligonucleotides ; comme dans le cas des oligonucleotides, cette cinétique est essentiellement liée à leur concentration dans le milieu et par rapport à la séquence cible ; ceci permet de définir facilement les conditions d'hybridation et de lavage nécessaires à la spécificité d'hybridation des sondes de détection conformes à l'invention.
- le domaine de reconnaissance C étant sous forme double-brin, il ne présente pas de risques d'hybridation croisée avec la séquence cible et donc, il n'y a pas de problème de bruit de fond.
- les molécules incorporées dans ce domaine de reconnaissance et servant à la révélation sont suffisamment espacées pour qu'il n'y ait pas d'encombrement stérique gênant éventuellement leur liaison avec un ligand.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation de sondes de détection conformes à l'Invention. II doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Amplification de différentes séquences d'acide nucléique à l'aide d'amorces comprenant un synthon d'arrêt.
X) Amplification d'un fragment de 1010 paires de bases d'ADN humain. - Amorce P' : J15(stop)2H12170:
5 ' ACC ATC GCT TCC AGA (stop) 2 GCA AGG CAG GAG CTG CAG GA 3 ' Le domaine B de cette amorce comprend 2 synthons d'arrêt (stop) consécutifs, chacun d'entre eux étant constitué d'une unité 6-hexyl-phosphate de structure : -0-CH2 - ( CH2 ) 4 -CH2-0- P02H- - Amorce P" :
^1-3180 :
5 ' GAT GC CCT AGA GTG CAG TG 3 '
Les conditions d'amplification ont d'abord été mises au point avec des amorces non modifiées, c'est-à-dire ne comportant pas les domaines A et B. L'amplification a ensuite été reproduite avec l'amorce P' modifiée comportant les trois domaines A, B et C.
L'amplification est réalisée sur 0,1 μg d'ADN génomique humain (CLONTECH), en présence de 10 pmoles de chacune des amorces, 2,5 unités de Taq polymérase (CIS BIO INTERNATIONAL), 5 μl de tampon 10 X (Tris/HCl 100 mM, pH 9 ; KCl 500 mM ; MgCl2 15 mM ; Triton XlOO 1 %, BSA 2 mg/ml) CIS BIO INTERNATIONAL), 0,75 μl de chacun des nucléotides triphosphate (solutions à 20 mM, BOEHRINGER MANNHEIM). Après une première dénaturation à 94°C, 5 minutes, on effectue 35 cycles des séquences suivantes : 94°C 1 min. 30", 60°C 1 min. 30", 70°C 1 min. 30", et une dernière élongation 5 min. à 70°C. Le résultat est visualisé après migration sur gel NUSIEVEΘ/AGAROSE (2%/l %).
Une seule bande, de la longueur attendue, est obtenue.
Le rendement et la spécificité de la réaction avec l'amorce modifiée et l'amorce non modifiée sont équivalents. B) Amplification de fragments de 6023 et 10709 paires de bases d'ADN du phage λ. - Amorce P' :
- J15(stop)2λ1 :
5 ' ACC ATC GCT TCC AGA(stop) 2 GCT GAA GTG GTG GAA ACC GC 3 '
Le domaine B de cette amorce comprend 2 synthons d'arrêt consécutifs identiques à ceux décrits en A) ci-dessus. - Amorce P" :
" λ6 28 :
5 ' CTG CCT GCA TCT CTT CGA CC 3 ' oubien - ^-112-15 :
5' CAG CGA CCT TGT CCA CCT CC 3'
L'amorce J15(stop)2λ, permet d'amplifier un fragment de 6023 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce λ6528, et un fragment 10709 pb lorsqu'elle est utilisée avec l'amorce λ1 1214. On utilise le kit XL PCR (PERK-IN ELMER) en suivant le protocole préconisé par le fabricant et la technique du démarrage à haute température (hot-start). La phase inférieure du milieu réactiormel est préparée dans des tubes de 500 μl à paroi mince (PERKIN-ELMER) selon les instructions du fabricant. On utilise 40 pmoles d'amorces et 1,1 mM final en Mg(OAc)2. La phase inférieure est recouverte de cire (PERKIN-ELMER) ; la phase supérieure est ensuite rajoutée. L'amplification est réalisée à partir de 1 ng d'ADN de phage λ.
L'amplification se déroule selon le protocole suivant :
- 94°C, 1 minute ;
- 10 cycles : 94°C 15 sec./68°C 5 minutes ; - 20 cycles : 94°C 15 sec./68°C 5 minutes avec des incréments de 15 secondes à chaque cycle ;
- une dernière élongation 10 minutes à 72°C.
Les produits d'amplification sont contrôlés après électrophorèse sur gel d'agarose 0,8% et coloration au bromure d'éthidium. On n'observe qu'une seule bande de la longueur attendue.
C) Amplification d'un fragment de 20874 paires de bases d'ADN du phage λ.
- Amorce P' :
- K20(stop)2λ! :
5 ' CAC GTG GCT ACC ATG CCA TTT (stop) 2 GCT GAA GTG GTG GAA ACC GC Le domaine B de cette amorce comprend 2 synthons d'arrêt consécutifs identiques à ceux décrits en A) ci-dessus.
- Amorce P" :
- λ2 :
5 ' GCC TCG CAT ATC AGG AAG CAC L'amplification est réalisée avec les amorces λ2 et ^o stop)^ sur 1 ng d'ADN de phage λ. Les réactifs sont les mêmes qu'en B, ci-dessus. Les conditions d'amplification sont les suivantes :
- 94°C 1 min. ;
- 18 cycles 94°C 1 min 68°C 10 min. ;
- 15 cycles 94°C 1 min./68°C 10 min. avec incréments de 15 sec à chaque cycle ;
- 10 min. à 72°C.
L'amplification est contrôlée après électrophorèse sur gel d'agarose 0,6%.
On observe une seule bande de la taille attendue.
Pour vérifier que le domaine A est bien sous forme simple-brin après amplification, on utilise l'oligonucléotide complémentaire du domaine A de l'amorce K20(stop)2λ de séquence : 5 ' TGG CAT GGT AGC CAC GTG 3 ' cet oligonucléotide est marqué en 5' par la polynucleotide kinase, en présence de γ 32P ATP. Il est hybride en solution 10 minutes à 37°C avec 5 μl du produit d'amplification, dans un tampon PBS 1 X, NaCl 0,25 M. Le produit d'hybridation est séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,6%. Le gel est séché puis autoradiographié pendant 1 nuit. L' autoradiographié montre que la radioactivité est localisée en haut du gel au niveau de la bande d'amplification, ainsi qu'en bas du gel, au niveau de l'oligonucléotide marqué non hybride.
La présence de la radioactivité au niveau de la bande de 20,8 kb montre que l'on a bien une hybridation de l'oligonucléotide marqué sur un fragment complémentaire simple brin.
Ces exemples démontrent que l'on peut obtenir facilement des fragments très longs (jusqu'à 20000 pb) en utilisant des amorces de type P' et que la portion simple brin demeure sous cette forme après la réaction d'amplification. EXEMPLE 2 : Détection d'un acide nucléique cible ; mise en évidence de l'amplification de signal par une sonde de détection conforme à l'invention.
Cible :
La cible est un ARN de 30 bases de long obtenu par transcription in vitro et dont la séquence est la suivante : 5 ' UUG CCU GGA CGA CCG GGU CCU UUC UUG GAG 3 ' . On prépare des solutions diluées de 10 en 10. La solution non diluée est considérée comme étant la solution 1. Méthode :
La détection de la cible se fait par hybridation sandwich en utilisant une sonde de capture fixée sur un microsupport, et un oligonucléotide (G4) qui est soit marqué avec une biotine, constituant ainsi une sonde de détection de type classique, utilisée à titre de comparaison, soit mis en évidence à l'aide d'une sonde de détection conforme à l'invention.
L'oligonucléotide G4 dont la séquence est la suivante : 5 ' GGT CGT CCT GGC AAT 3 ' est marqué par une biotine à son extrémité 5' selon le procédé décrit dans la Demande PCT WO/89/12462, ou bien additionné d'une séquence supplémentaire (séquence I15) à son extrémité 3'.
La séquence I15 : 5 ' ATC CGT TCT ACA GCC 3 ' s'hybride spécifiquement à un oligonucléotide (cI15cJ15) dont une partie est complémentaire de I15 et une partie est complémentaire de la séquence J15. L'ensemble G4 I15 + cl15cj15 joue le rôle d'un adaptateur. Préparation d'une sonde de détection d'hybridation conforme à l'invention :
La sonde de détection conforme à l'invention est obtenue par amplification PCR d'un fragment d'ADN humain avec les amorces J15(stop)2H1217o et H13180 (voir exemple 1A). Le milieu réaction-nel contient 0,1 μg d'ADN humain dans du tampon Taq IX (CIS BIO INTERNATIONAL), avec 2,5 U de Taq DNA polymérase (CIS BIO INTERNATIONAL) et 6 pmoles de chacune des amorces. Les nucléotides triphosphates sont à 300 nM sauf le dTTP qui est à 240 n-M. Le milieu d'amplification contient en outre 60 nM de bio-16-dUTP (BOEHRINGER- MANNHEIM, France). Les conditions d'amplification sont les suivantes : 94°C 5 min., puis 35 cycles, 94°C 1 min., 60°C 1 min. 30 et 70°C 1 min. 30 et une dernière élongation 5 min. à 70°C. On obtient ainsi un fragment double brin de 1010 paires de bases dans lequel environ l/5ème des thymidines sont remplacées par des uridines biotinylées. L'amplification est contrôlée sur gel d'agarose 1%. On obtient une seule bande de taille attendue. Le fragment est purifié sur colonne SEPHACRYL®HR(MICROSPIN™S400, PHARMACIA). Hybridation sur puce :
La puce comporte 48 électrodes carrées de 50 μm de côté. La sonde de capture Gc, dont la séquence est la suivante : 5 ' CTC CAA GAA AGG ACC C 3 ' et 2 oligonucleotides de séquence différente (Tl et T2), utilisés à titre de témoins, sont fixés chacun sur une électrode par leur extrémité 5', par copolymérisation avec du pyrrole, selon le procédé décrit dans la Demande PCT WO/94/22889.
Les hybridations se déroulent en 1 heure à 45 °C dans un tampon PBS I X, NaCl 0,5 M, EDTA 10 mM, DENHARDT 2,5 X contenant 100 μg/ml d'ADN de sperme de hareng soniqué. Les solutions d'hybridation sont chauffées 3 min. à 80 °C dans des microtubes en présence de l'ARN à doser, puis transférées dans un sac d'hybridation dans lequel est placée la puce. Détection avec l'oligonucléotide G4 biotinylé :
L'hybridation de l'ARN cible sur la puce est effectuée dans 20 μl de tampon 1 X contenant 1 μl de la solution d'A N à tester et 15 pmoles de l'oligonucléotide G4 marqué à la biotine. On effectue ensuite 3 rinçages dans un tampon PBS 1 X, contenant 0,5 M NaCl et 0,05% de Tween 20. La puce est ensuite incubée 10 minutes dans une solution de streptavidine-phycoérythrine à 5 ng/μl dans PBS/NaCl/Tween, puis rincée dans le tampon de lavage. La puce est montée sur lame et sous lamelle dans une goutte de tampon PBS/NaCl/Tween. Le signal est enregistré, après irradiation à 500-550 nm pendant 1 seconde, par un microscope couplé à une caméra CCD. Détection avec la sonde de détection conforme à l'invention : Elle se déroule en 2 étapes. a) hybridation avec l'adaptateur :
L'ARN à tester (1 μl) est d'abord hybride sur la puce avec 25 pmoles de l'oligonucléotide I]5G4 et 25 pmoles de l'oligonucléotide cI15cJ15. La puce est traitée 2 x 5 minutes dans une solution NaOH 0,1 N et rincée à l'eau distillée. b) hybridation avec la sonde de détection : Après un rapide rinçage dans le tampon PBS/NaCl/Tween, la puce est transférée dans un deuxième sac d'hybridation contenant 10 μl de la sonde de détection conforme à l'invention purifiée et 10 μl de tampon d'hybridation 2 X. Les rinçages, la révélation à la streptavidine-phycoérythrine, et l'enregistrement du signal sont effectués comme décrit ci-dessus. Les signaux sont enregistrés après une irradiation de 1 seconde. Résultats
Le signal sur chaque électrode est quantifié en unités arbitraires de fluorescence (UAFs) ; la gamme de signal est linéaire de 0 à 250 UAFs. Les résultats (exprimés en UAFs) pour les électrodes portant la sonde de capture Gc, sont illustrés par le Tableau I ci-après.
Figure imgf000017_0001
Les électrodes témoin portant les oligonucleotides Tl et T2 donnent des signaux entre 4 et 10 UAFs (résultats non représentés sur le tableau), ce qui correspond au bruit de fond. Un signal de 250 UAFs correspond, dans les conditions utilisées, à une saturation du système de lecture.
On voit que le signal obtenu avec l'oligonucléotide G4 marqué par une seule biotine décroît très vite lorsque la dilution augmente, alors que l'utilisation d'une sonde de détection conforme à l'invention permet l'obtention d'un signal plus élevé, et en outre augmente nettement la sensibilité du test. Le bruit de fond en présence de la sonde de détection conforme à l'invention, ou de la sonde classique constitué par l'oligonucléotide G4 biotinylé, est le même.
EXEMPLE 5 : Utilisation d'une sonde de détection conforme à l'invention pour la révélation sur microplaque.
Une sonde de détection conforme à l'invention et marquée à la digoxigénine, est préparée selon le protocole décrit à l'exemple 1 A) ci-dessus, en remplaçant 1/5 des dTTP par de la digoxigénine-l l-2'-deoxy-uridine-5'-triphosphate (BOEHRINGER-MANNHEIM).
Les tests sont effectués, d'une part avec cette sonde, et d'autre part, à titre de comparaison, avec l'oligonucléotide G4 DIG (oligonucléotide G4 marqué à la digoxigénine à son extrémité 5' et purifié par HPLC).
La cible est constituée d'ARN comme dans l'exemple précédent. On effectue des dilutions de la cible de 10 en 10. Cette cible est fixée sur une microplaque recouverte de streptavidine (LABSYSTEM) par l'intermédiaire de la sonde de capture Gc marquée à la biotine. Hybridation avec G4 DIG
L'A N cible est incubé dans 50 μl de tampon PBS/NaCl contenant 30 pmoles de G4 DIG et 40 pmoles de sonde de capture Gc biotinylée. Les solutions sont chauffées 3 minutes à 80°C puis transférées dans les puits. On incube 1 heure à 42°C. Après 3 lavages avec le tampon PBS/NaCl/Tween, on incube pendant 1 heure à 37°C avec l'anticorps anti-DIG marqué à la peroxydase (solution mère à 75 U/ml, BOEHRINGER-MANNHEIM, diluée au 1/2000 dans du PBS/NaCl contenant 3% de BSA).
Hybridation avec la sonde de détection conforme à l'invention :
Elle se déroule en 2 étapes : a) hybridation avec l'adaptateur :
L'ARN à tester est d'abord hybride dans 50 μl de tampon PBS/NaCl/Tween contenant 40 pmoles de sonde Gc -biotine, 40 pmoles de I15G4, et 40 pmoles de cl15cj15. Les solutions sont dénaturées 3 minutes à 80°C puis transférées dans les puits de la microplaque. L'incubation se déroule 1 heure à 42°C. On effectue 3 lavages au PBS/NaCl/Tween puis on procède à l'incubation avec la sonde de détection. b) hybridation avec la sonde de détection :
On distribue dans chaque puits, 50 μl de PBS/NaCl contenant 5 μl de la solution purifiée de la sonde de détection marquée à la digoxigénine, et 3% de BSA. Les microplaques sont incubées 1 heure à 42 °C. Après 3 lavages, on procède à l'incubation pendant 1 heure à 37°C, avec l'anticorps anti-DIG dilué au 1/4000. Révélation :
Après 3 lavages, les puits sont incubés à l'obscurité, en présence de 50 μl de substrat de la peroxydase (O-phénylènediamine, dans un tampon citrate- phosphate, pH 5,5, contenant 0,02% H2O2). La réaction est arrêtée au bout de 10 minutes pour le système amplificateur et de 30 minutes pour les témoins, par 50 μl d'acide oxalique 1 M. La densité optique est lue à 492 nm.
Les résultats, exprimés en unités de densité optique, sont rassemblés dans le Tableau II ci-dessous. TABLEAU II
Figure imgf000019_0001
NT : non testé
On observe comme dans l'exemple précédent une très nette augmentation du signal et une très nette augmentation de la sensibilité du test, après soustraction du bruit de fond, lorsqu'une sonde de détection conforme à l'invention est utilisée.
LISTE DE SEQUENCES ( 1 ) INFORMATIONS GENERALES :
(i) DEPOSANT
(A) NOM CIS BIO INTERNATIONAL
(B) RUE R.N.306 (C) VILLE: SACLAY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91400
(A) NOM: TEOULE Robert
(B) RUE: 52 rue Thiers
(C) VILLE: GRENOBLE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 38000
(A) NOM: SAUVAIGO Sylvie
(B) RUE: Le Noyaret
(C) VILLE: HERBEYS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 38320
(A) NOM: BAZIN Hervé
(B) RUE: Résidence "Les Genêts" Bâtiment 11
(C) VILLE: VILLENEUVE LES AVIGNON
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 30400
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SYSTEMES DE DETECTION D'HYBRIDATION D'ACIDES NUCLEIQUES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LEURS UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 12
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 1: ACCATCGCTT CCAGANNGCA AGGCAGGAGC TGCAGGA 3
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 2: GATTGCCCTA GAGTGCAGTG 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 3: ACCATCGCTT CCAGANNGCT GAAGTGGTGG AAACCGC 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 4: CTGCCTGCAT CTCTTCGACC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 5: CAGCGACCTT GTCCACCTCC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 43 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 6: CACGTGGCTA CCATGCCATT TNNGCTGAAG TGGTGGAAAC CGC 43
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 7: GCCTCGCATA TCAGGAAGCA C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 8: TGGCATGGTA GCCACGTG 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO : 9: UUGCCUGGAC GACCGGGUCC UUUCUUGGAG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO : 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GGTCGTCCTG GCAAT 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: ATCCGTTCTA CAGCC 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: CTCCAAGAAA GGACCC 16

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de détection d'au moins une séquence cible d'acide nucléique, caractérisé en ce que l'on met ladite séquence cible en présence d'au moins une sonde de détection constituée par une molécule d'acide nucléique constituée par :
- un domaine de fixation A, constitué par un polynucleotide simple-
- un domaine intermédiaire B, constitué par au moins un synthon d'arrêt ; et
- un domaine de visualisation C, constitué par un polynucleotide double-brin, dans lequel est incorporé au moins un nucleotide marqué constituant un moyen de détection, dans des conditions permettant l'hybridation du domaine A de ladite sonde d'acide nucléique avec la séquence cible, et en ce que l'hybride formé est détecté par l'intermédiaire du domaine C de ladite sonde d'acide nucléique.
2) Procédé selon la revendication 1 caractérisée en ce que pour détecter simultanément plusieurs séquences cibles, on utilise simultanément plusieurs sondes de détection différant entre elles par la séquence du domaine A.
3) Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que lesdites sondes de détection diffèrent également entre elles par la séquence du domaine C et/ou par la nature des nucléotides marqués incorporés dans ledit domaine.
4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la séquence cible est fixée sur un support solide.
5) Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit support solide est constitué par une pluralité d'électrodes, dont au moins 2 portent chacune une séquence cible différente.
6) Sonde de détection d'hybridation telle que définie dans la revendication 1, caractérisée en ce la taille du domaine A est comprise entre 8 et 40 nucléotides de long.
7) Sonde de détection selon la revendication 6, caractérisée en ce que au moins 1/50 des nucléotides constitutifs du domaine C sont des nucléotides marqués.
8) Sonde de détection selon une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que la taille du domaine C est comprise entre 0,1 et 50 kb.
9) Procédé de préparation d'une sonde de détection selon une quelconque des revendications 6 à 8, comprenant au moins une étape au cours de laquelle au moins l'un des brins du domaine C est synthétisé en procédant à l'élongation par polymérase en présence d'un brin matrice dans un mélange réactiormel approprié, d'une amorce P' comprenant de 5' en 3' : un domaine A et un domaine B tels que définis ci-dessus, et un domaine X constitué par une séquence capable de s'hybrider au brin matrice pour amorcer la polymérisation, et caractérisé en ce que tout ou partie d'au moins l'un des nucléotides triphosphate du mélange réactionnel est remplacé par l'un de ses dérivés marqués.
10) Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que l'élongation par polymérase est effectuée en présence d'une seconde amorce P" comprenant une séquence capable de s'hybrider au produit d'élongation de l'amorce P'.
11) Procédé selon une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que le mélange réactionnel comprend plusieurs amorces P' différant entre elles par la séquence du domaine A, et identiques entre elles en ce qui concerne la séquence du domaine X.
12) Nécessaire pour la mise en œuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 9 à 11, comprenant au moins une amorce P', un polynucleotide utilisable comme matrice pour l'élongation de ladite amorce, et un nucleotide triphosphate marqué.
13) Nécessaire selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une amorce P".
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