FR2809105A1 - Amorces d'amplification modifiees et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne la conception d'amorces d'amplification modifiées et leurs utilisations pour l'amplification par déplacement de brins (Strand Displacement Amplification ou SDA), l'amplification par déplacement de brins thermophile (thermophilic Strand Displacement Amplification ou tSDA) ou la tSDA par fluorescence en temps réel (fluorescent real time tSDA), et avec utilisation facultative d'une puce micro-électronique.

Description

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La présente invention concerne la conception d'une amorce d'amplification modifiée et les utilisations d'amorces d'amplification modifiées pour l'amplification par déplacement de brins (Strand Displacement
Amplification ou SDA), l'amplification par déplacement de brins thermophile (thermophilic Strand Displacement Amplification ou tSDA) ou la tSDA par fluorescence en temps réel (fluorescent real time tSDA), et avec utilisation facultative d'une puce micro-électronique.

L'amplification par déplacement de brins (Strand Displacement
Amplification ou SAD) est une méthode d'amplification d'acide nucléique isotherme in vitro basée sur la capacité d'une enzyme de restriction à casser le brin non modifié d'un duplex d'acide nucléique hemi-phosphorothioaté sur son site de reconnaissance. Une ADN polymérase est utilisée pour étendre depuis l'extrémité 3' de la césure et pour déplacer le brin d'ADN en aval de la matrice.

Le produit déplacé est utilisé comme matrice dans les cycles suivants de SDA.

La SDA nécessite quatre amorces. Deux amorces se lient à chaque brin d'ADN. L'amorce 1 (amorce d'amplification, AA) a un site de reconnaissance de l'enzyme de restriction (p. ex. BsoBI de Bacillus stearothermophilus), suivi immédiatement d'une séquence spécifique de la cible longue généralement de
15 à 20 nucléotides. Du côté 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction se trouve une séquence courte (18 à 24 nucléotides) utilisée pour fournir une région flanquante au site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. L'amorce 2 (amorce " bumper ", AB), s'hybride avec la cible en amont de l'amorce AA. L'extension de l'amorce AB déplace de la cible le produit d'extension de AA. Les cycles successifs de SDA entraînent une amplification exponentielle spécifique de la cible.

Pour les conceptions précédentes des amorces AA, on utilisait une séquence non spécifique de la cible du côté 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction comme région flanquante 5' et une séquence spécifique de la cible du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. Au cours des cycles initiaux de SDA, l'hybridation amorce - cible est menée par la portion de l'amorce AA spécifique de la cible. Comme la SDA est pratiquée à une température modérément élevée (50 à 60 C), une séquence spécifique de la cible raisonnablement longue est nécessaire pour une hybridation spécifique stable de la cible et une amplification efficace. Cependant, des séquences spécifiques de la cible plus longues du côté 3' du site de

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reconnaissance de l'enzyme de restriction entraînent un plus grand potentiel d'interactions entre amorces et de création de produits d'amplification primerdimer (PD). L'amplification PD est l'une des principales causes de l'amplification non spécifique dans la PCR (Polymerase Chain Reaction) (Brownie, J. et col., 1997, Nucleic Acids Res. 25 :3235-3241.) Lasituation peut être pire pour la SDA puisque (1) on utilise habituellement dans la SDA des concentrations d'amorce plus importantes que dans la PCR, ce qui augmente le risque d'interactions entre amorces et d'amplification PD, (2) une fois qu'un PD est formé entre des séquences AA du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction, le produit du PD sera amplifié de manière exponentielle car il contient un site de reconnaissance de l'enzyme de restriction cassable aux deux extrémités et (3) les amplifications PD peuvent être préférentiellement amplifiées car les produits de l'amplification PD sont plus courts que les produits de l'amplification spécifique de la cible.

Ces problèmes empirent en cas d'amplification multiplex d'acide nucléique car il y a plus d'amorces d'amplification présentes dans une seule réaction d'amplification. Comme cela a déjà été décrit, il y a un plus grand risque de compétition entre des amplifications non spécifiques et des amplifications spécifiques de la cib!e dans la SDA que dans la PCR. C'est pour ces raisons qu'aucun rapport n'a été publié concernant la co-amplification de cibles d'ADN multiples avec des jeux d'amorces multiplex. Walker et col. (1994. Nucleic Acids Research 22:2670-2677 ; brevet US 5,422,252) a décrit des amorces pour la SDA conçues pour amplifier des cibles d'ADN multiplex en utilisant une seule paire d'amorces après ajout de séquences d'amorçages communes aux extrémités 5' de chaque séquence d'amorce afin de minimiser les interactions entre amorces et les amplifications PD.

L'ADN optimal pour l'hybridation et le séquençage d'acides nucléiques est l'ADN simple brin (ssDNA). Actuellement, quatre méthodes sont utilisées pour obtenir du ssDNA : (1) dénaturation d'ADN double brin (dsDNA) ; (2) PCR (Polymerase Chain Reaction) asymétrique ; (3) digestion exonucléasique des brins phosphorylés de dsDNA et (4) liaison par affinité de l'un des brins d'ADN à une matrice insoluble (Gyllensten, U. B et Erlich, H. A., 1988. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 85 :7652-7656 ; Mitchel, L. G. et Merril, C. R., 1989. Anal. Biochem.

17:239-242; Rehbein, H. et col., 1998. Electrophoresis 8-9:1381-1384 ; Sambrook, J. et col., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e édition.

CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Dans la PCR asymétrique,

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une amorce est présente en quantité limitée et est complètement utilisée pendant les cycles initiaux de PCR. Dans les cycles suivants, seule l'amorce abondante est présente, ce qui cause un excès de fabrication d'un brin.
L'utilisation du principe de PCR asymétrique pour la création de ssDNA par
SDA a été testée sans succès.

Bien que la SDA ait trouvé des applications importantes, il reste des problèmes liés à la conception d'origine de l'amorce comme décrite ci-dessus.

Rappelons que le premier problème est le fait que l'amplification n'est pas très efficace. La faible efficacité de la SDA avec la conception d'origine de l'amorce est principalement due à une moindre efficacité d'hybridation car la SDA est pratiquée à une température relativement élevée avec des amorces dont seules les extrémités 3' sont des séquences spécifiques de la cible. Le second problème est la formation de produit PD et l'amplification de ce produit. Ceci est dû au fait que les quelques derniers nucléotides de l'extrémité 3' d'une amorce d'amplification présentant une homologie avec une séquence quelconque à l'extrémité 3' d'une autre amorce d'amplification (ou d'elle-même), et non uniquement avec les quelques derniers nucléotides de cette amorce, peuvent former un produit primer-dimer et ce produit peut être amplifié de manière exponentielle. Cette formation de primer-dimer dans la SDA est différente de celle de la PCR qui nécessite une homologie d'amorce entre les quelques derniers nucléotides des extrémités 3' des deux amorces pour qu'il y ait une amplification primer-dimer.

L'objet de la présente invention est donc d'améliorer la technique de SDA, d'améliorer l'amplification multiplex et de permettre la fabrication d'un ADN simple brin à l'aide de la SDA par des modifications de la conception de l'amorce de SDA. La sensibilité, la spécificité et le résultat de l'amplification de la cible ont été augmentés grâce à la nouvelle conception d'amorce de la présente invention, dans laquelle une séquence spécifique de la cible est incluse à l'extrémité 5' des amorces. La nouvelle conception d'amorce, tout en améliorant la SDA, est aussi utile à l'analyse multiplex par SDA et à la fabrication par SDA d'ADN simple brin.

La conception de l'amorce de la présente invention présente plusieurs améliorations par rapport à la conception standard de l'amorce pour SDA. Dans les deux cas, les amorces de SDA contiennent des séquences spécifiques de la cible et des séquences non spécifiques de la cible (voir figures 1A et 1B).

Dans la conception standard, les séquences spécifiques de la cible se trouvent

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du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. Il a été démontré que des interactions amorce - amorce entre les extrémités 3' de différentes amorces peuvent entraîner la création de produits d'amplification non spécifiques. Afin de minimiser ces interactions liées à la conception standard, il est avantageux de concevoir les régions spécifiques de la cible des amorces de telle sorte qu'elles soient les plus courtes possibles tout en leur conservant des caractéristiques Tf appropriées en matière d'hybridation d'une séquence cible. Comme la SDA est pratiquée à une température élevée (50 - 65 C), il est important de concevoir des régions spécifiques de la cible d'une longueur suffisante pour permettre une hybridation efficace avec la cible. La conception d'amorce de la présente invention surmonte ces limites par l'utilisation de séquences spécifiques de la cible longues situées du côté 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. L'augmentation de la longueur de la séquence spécifique de la cible permet une hybridation efficace avec la cible à des températures élevées sans contribuer à la formation de produits non spécifiques. Dans cette nouvelle conception, des séquences courtes sont utilisées du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction, ce qui minimise la formation de produits non spécifiques.

Les termes suivants sont définis comme suit :
Une amorce d'amplification est une amorce pour l'amplification d'une séquence cible par extension de l'amorce par hybridation avec la séquence cible. Les amorces d'amplification peuvent avoir une longueur comprise entre 10 et 75 nucléotides, de préférence comprise entre 15 et 50 nucléotides. La longueur totale d'une amorce d'amplification pour SDA est typiquement comprise entre 25 et 50 nucléotides. Généralement, l'extrémité 3' d'une amorce d'amplification pour SDA (séquence de liaison à la cible) s'hybride spécifiquement avec la séquence cible. La séquence de liaison à la cible a une longueur comprise approximativement entre 10 et 25 nucléotides et confère à l'amorce d'amplification sa spécificité d'hybridation. L'amorce d'amplification pour SDA comporte en outre un site de reconnaissance pour une endonucléase de restriction du côté 5' de la séquence de liaison à la cible. Le site de reconnaissance est prévu pour une endonucléase qui va casser un brin d'un ADN duplex lorsque le site de reconnaissance sera hémimodifié, comme le décrivent G. Walker et col. (1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392-396 et 1992 Nucl. Acids Res. 20 :1691-1696). Lesnucléotides situés du côté 5' du site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction (la " queue ") fonctionnent

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comme un site de ré-amorçage de la polymérase lorsque le reste de l'amorce d'amplification est cassé et déplacé pendant la SDA. La fonction de ré- amorçage des nucléotides de la queue maintient la réaction de SDA et permet la synthèse d'amplicons multiples à partir d'une seule molécule cible. La queue a généralement une longueur comprise entre 10 et 25 nucléotides. Sa longueur et sa séquence ne sont généralement pas critiques et peuvent être sélectionnées en routine et modifiées. Cependant, dans le cadre de la présente invention, l'amorce d'amplification a été modifiée de telle sorte que la queue contienne aussi une séquence de liaison à la cible. Comme la séquence de liaison à la cible située du côté 3' du site de restriction de l'endonucléase de restriction est une partie de l'amorce qui en détermine la spécificité de cible, pour les méthodes d'amplification ne nécessitant pas de séquences spécialisées aux extrémités de la cible, l'amorce d'amplification consiste en général essentiellement uniquement en cette séquence de liaison à la cible côté 3'. Par exemple, l'amplification d'une séquence cible conformément à l'invention utilisant la PCR (Polymerase Chain Reaction) utilisera des amorces d'amplification comprenant les séquences de liaison à la cible côté 3' des amorces d'amplification ici décrites. Pour des méthodes d'amplification nécessitant des séquences spécialisées ajoutées à la cible autres que le site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction et la queue de SDA (p. ex. un promoteur de l'ARN polymérase pour les techniques de Self-Sustained Sequence Replication (3SR), de Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) et de Transcription-Based Amplification Sytstem (TAS)), la séquence spécialisée nécessaire pourra être liée à la séquence de liaison à la cible par utilisation de méthodes de routine pour la préparation d'oligonucléotides sans modifier la spécificité d'hybridation de l'amorce.

Une amorce " bumper " ou amorce externe est une amorce utilisée pour déplacer les produits d'extension de l'amorce dans les réactions d'amplification isothermiques. L'amorce " bumper " forme un annelage avec une séquence cible en amont de l'amorce d'amplification de telle sorte que l'extension de l'amorce " bumper " déplace l'amorce d'amplification en aval et son produit d'extension.

Les termes cible ou séquence cible désignent les séquences d'acide nucléique à amplifier. Celles-ci incluent la séquence d'acide nucléique d'origine à amplifier, le second brin complémentaire de la séquence d'acide nucléique d'origine à amplifier et l'un des deux brins d'une copie de la séquence d'origine

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produite par la réaction d'amplification. Ces copies servent de cibles amplifiables en raison du fait qu'elles contiennent des copies de la séquence avec laquelle les amorces d'amplification s'hybrident.

Les copies de la séquence cible créées pendant la réaction d'amplification sont appelées produits d'amplification, amplimères ou amplicons.

Le terme produit d'extension désigne la copie d'une séquence cible produite par hybridation d'une amorce et extension de l'amorce par la polymérase, la séquence cible servant de matrice.

Le terme spécifique d'espèce désigne la détection, l'amplification ou l'hybridation d'oligonucléotides avec une espèce d'organisme ou un groupe d'espèces apparentées sans détection substantielle, amplification ni hybridation d'oligonucléotides avec d'autres espèces du même genre ou d'un genre différent.

Le terme sonde d'essai désigne tout oligonucléotide utilisé pour faciliter la détection ou l'identification d'un acide nucléique. Les sondes détecteur, les amorces de détection, les sondes de capture, les amorces signal et les sondes " reporter " décrites ci-dessous sont des exemples de sondes d'essai.

Le terme amplicon -désigne le produit de la réaction d'amplification généré par extension d'une ou de deux amorces d'une paire d'amorces d'amplification. Un amplicon peut contenir des acides nucléiques amplifiés de manière exponentielle si les deux amorces utilisées s'hybrident avec une séquence cible. Les amplicons peuvent aussi être fabriqués par amplification linéaire si l'une des amorces utilisées ne s'hybride pas avec la séquence cible. Ainsi ce terme est utilisé de manière générique ici et n'implique pas la présence d'acides nucléiques amplifiés de manière exponentielle.

Un réseau micro-électronique (ou micro-réseau électronique) est un dispositif comportant un réseau d'emplacements microscopiques autoadressables. Chaque emplacement microscopique contient une micro- électrode sous-jacente fonctionnant en courant continu (DC) portée par un substrat. La surface de chaque emplacement dispose d'une couche perméable pour le transport libre de petits contre-ions et une couche de fixation pour le couplage covalent d'entités de liaison spécifiques.

Un réseau ou matrice est une disposition particulière d'emplacements sur le dispositif. Les emplacements peuvent être disposés en réseaux en deux dimensions, en trois dimensions ou selon d'autres formats de matrice. Le

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nombre d'emplacements peut aller de plusieurs à au moins des centaines de milliers.

L'adressage (ou ciblage) électronique est le placement de molécules chargées sur des sites de test spécifiques. Comme l'ADN a une forte charge négative, il peut être déplacé vers une zone chargée positivement. Un site de test ou une rangée de sites de test sur la micropuce est activé(e) électroniquement avec une charge positive. Une solution de sondes d'ADN est introduite dans la micropuce. Les sondes chargées négativement se déplacent rapidement vers les sites chargés positivement, où elles se concentrent et se lient chimiquement au site. La micropuce est ensuite lavée et une autre solution de sondes d'ADN distinctes peut être ajoutée. Site par site, rangée par rangée, un réseau de sondes d'ADN spécifiquement liées peut être assemblé ou adressé sur la micropuce. Grâce à la possibilité d'adresser électroniquement les sondes de capture sur des sites spécifiques, le système permet la production de réseaux sur mesure par le placement de sondes de capture spécifiques sur une micropuce. Dans ce cadre, le terme " électroniquement adressable " fait référence à une capacité d'une micropuce de diriger des matériaux comme des acides nucléiques et des enzymes et d'autres composants d'amplification d'un emplacement vers un autre sur la micropuce par polarisation électronique des sites de capture sur la puce. " Polarisation électronique " vise à signifier que la charge électronique sur un site de capture ou en un autre endroit sur la micropuce peut être manipulée entre une charge positive nette et une charge négative nette de telle sorte que les molécules en solution et en contact avec la micropuce puissent être dirigées vers ou repoussées d'un emplacement sur la micropuce ou d'un emplacement vers un autre.

La concentration électronique et l'hybridation utilisent l'électronique pour déplacer et concentrer les molécules cibles vers un ou plusieurs sites de test (ou sites de capture) sur la micropuce. La concentration électronique d'ADN échantillon sur chaque site de test permet une hybridation rapide de l'ADN échantillon avec les sondes de capture complémentaires. A l'inverse du processus d'hybridation passif, le processus de concentration électronique a l'avantage distinct d'accélérer de manière importante la vitesse d'hybridation.

Pour supprimer tout ADN non lié ou non spécifiquement lié de chaque site, la polarité ou charge du site est inversée et rendue négative, ce qui force tout ADN non lié ou non spécifiquement lié à retourner en solution en s'écartant des

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sondes de captures. En outre, comme les molécules de test sont concentrées électroniquement sur le site de test, une moindre concentration de molécules d'ADN cible est nécessaire, ce qui limite le temps et le travail sinon exigé pour la préparation de l'échantillon avant test. Le terme " site de capture " désigne un emplacement spécifique sur une micropuce électroniquement adressable, où la polarisation électronique est initiée et où des molécules comme des sondes d'acide nucléique et des molécules cibles sont attirées ou adressées par cette influence.

Le contrôle de la stringence électronique est l'inversion du potentiel électrique visant à supprimer l'ADN non lié ou non spécifiquement lié rapidement et facilement dans le cadre du processus d'hybridation. La stringence électronique permet le contrôle de qualité du processus d'hybridation et assure que toutes les paires d'ADN liées sont réellement complémentaires. La précision, la maîtrise et l'exactitude de la technologie de plate-forme, par l'utilisation de l'apport contrôlé de courant dans le processus de stringence électronique, permettent la détection de mutations en un seul point, de mésappariements de paires de bases uniques ou d'autres mutations génétiques qui peuvent avoir des implications importantes dans le cadre de nombreuses applications diagnostiques ou de recherche. La stringence électronique est obtenu sans le traitement ni la manipulation lourds nécessaires pour obtenir les mêmes résultats par des méthodes conventionnelles. A l'inverse des réseaux passifs, cette technologie peut servir pour des fragments d'ADN simple brin aussi bien courts que longs. L'utilisation de sondes plus longues augmente la certitude que l'ADN qui s'hybride avec la sonde de capture est la cible correcte. Le contrôle de la stringence électronique diminue le nombre de sondes nécessaires et donc de sites de test sur la micropuce en comparaison avec les réseaux ADN classiques. A l'inverse, les processus d'hybridation passive traditionnels sont difficiles à maîtriser et nécessitent plus de réplicants de chaque paire de bases correspondante possible de telle sorte que les correspondances possibles puissent être identifiées à coup sûr.

Le multiplexage électronique permet l'analyse simultanée de tests multiples d'un seul échantillon. Le multiplexage électronique est facilité par la possibilité de maîtriser indépendamment des sites de test individuels (pour l'adressage des sondes de capture ou des molécules de capture et la concentration des molécules de l'échantillon test) ce qui permet l'utilisation simultanée de molécules biochimiquement non apparentées sur la même

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micropuce. Les sites sur un réseau d'ADN conventionnel ne peuvent pas être maîtrisés individuellement et donc les mêmes étapes de processus doivent être suivies sur tout le réseau. L'utilisation de l'électronique dans le cadre de cette technologie permet une plus grande versatilité et flexibilité par rapport à ces méthodes classiques.

La présente invention concerne la conception d'amorce d'amplification modifiée et les utilisations d'amorces d'amplification modifiées pour l'amplification par déplacement de brins (Strand Displacement Amplification ou
SDA), l'amplification par déplacement de brins thermophile (thermophilic Strand
Displacement Amplification ou tSDA) ou la tSDA par fluorescence en temps réel (fluorescent real time tSDA), et avec utilisation facultative d'une puce micro-électronique.

Dans l'un des modes d'application de la présente invention, les amorces d'amplification pour SDA sont conçues de telle sorte qu'elles contiennent des séquences spécifiques de la cible du côté 5' et du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. L'utilisation de séquences spécifiques de la cible du côté 5' et du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction augmente l'efficacité de l'hybridation spécifique de la cible. Cette conception permet de réduire la longueur de la portion 3' non spécifique de la cible de l'AA, limitant les risques d'interactions entre amorces.

Avec des amorces conçues conformément à la présente invention, la spécificité, la sensibilité et le résultat de la SDA sont augmentés et les amplifications PD sont limitées en comparaison avec la SDA utilisant la conception classique des amorces. Les produits d'amplification spécifiques de la cible ont été détectés à partir de 10 copies d'ADN cible après 10 minutes de réaction par SDA à 60 C. L'amplification maximale a été obtenue à partir de 10 copies de matrice après 30 minutes de SDA.

Dans un second mode de réalisation, des amplifications SDA multiplex sont possibles en utilisant des amorces d'amplification conçues conformément à la présente invention. L'amplification multiplex est une stratégie d'amplification simultanée de deux séquences cibles ou plus. Chaque réaction d'amplification est spécifique, mais plusieurs cibles sont amplifiées dans un seul mélange réactionnel. En utilisant les amorces conçues conformément à la présente invention et en ajustant les concentrations d'amorce pour chaque matrice, on a pu co-amplifier et détecter un nombre aussi faible que 10 copies

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de chaque matrice. Une version préférée de ce mode de réalisation permet de détecter des produits amplifiés en utilisant un réseau micro-électronique. La procédure complète, de l'amplification à la détection, a pris environ deux heures. L'association de la vitesse, de la simplicité et de la sensibilité de l'amplification par SDA et la détection sur réseau micro-électronique fournissent une méthode de détection de pathogènes bactériens cliniques et d'autres maladies.

Dans un troisième mode de réalisation, des amorces conçues conformément à la présente invention peuvent être utilisées pour générer de l'ADN simple brin par SDA. En particulier, il a été observé que le produit spécifique de la cible ne peut pas être généré par SDA à l'aide d'amorces d'amplification n'ayant qu'une séquence spécifique de la cible longue de trois paires de bases (pb) du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction.

L'utilisation de quantités molaires identiques d'une amorce d'amplification conçue conformément à la présente invention et d'une amorce conçue conformément à la présente invention n'ayant que trois pb du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction (nommée amorce d'arrêt) pour se lier à un brin d'ADN et d'une amorce d'amplification classique pour se lier à l'autre brin d'ADN dans le cadre d'une amplification par SDA permet de fabriquer du ssADN. L'amorce d'arrêt a été utilisée pour être en compétition avec l'amorce d'amplification classique sur la cible de telle sorte que les deux brins d'ADN cible soient inégalement amplifiés. Cette méthode produit de l'ADN simple brin qui peut être utilisé pour l'hybridation et le séquençage d'acide nucléique.

Dans un quatrième mode de réalisation de la présente invention, des amorces d'amplification pour utilisation dans le cadre d'autres méthodes d'amplification sont conçues pour contenir des séquences spécifiques de cible des côtés 5' et 3' d'une séquence non spécifique de cible.

Dans un cinquième mode de réalisation de la présente invention, une amorce d'amplification pour la discrimination de deux séquences étroitement liées est conçue pour éviter un ou plusieurs mésappariements (en relation avec la cible) dans la séquence spécifique de cible 3'.

Les SEQ ID NOs : 1 à 4 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces (1 et 2) et " bumper " (3 et 4) pour l'amplification du gène

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Yersinia enterocolitica yst qui sont conçues conformément à la conception conventionnelle des amorces pour SDA. Les SEQ ID NOs : 5 à 10 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces pour l'amplification du gène yst qui sont conçues conformément à un mode de réalisation de la présente invention. La SEQ ID NO : 11 est la séquence d'un nucléotide utilisée comme sonde de capture pour le gène yst. La SEQ ID NO : 12 est la séquence d'un nucléotide utilisée comme sonde " reporter " pour le gène yst. La SEQ ID
NO : 13 est la séquence d'un nucléotide du gène Staphylococcus aureus femA utilisée comme sonde de capture non spécifique. Les SEQ ID NOs : 14 et 15 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces pour l'amplification du gène yst qui ont été conçues conformément au second mode de réalisation de la présente invention. Les SEQ ID NOs : 16 à 19 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces (16 et 17) et " bumpers " (18 et 19) pour l'amplification du gène de la toxine 1 de Shiga (SLTI) d'Escherichia coli qui ont été conçues conformément à la présente invention. La SEQ ID NO: 20 est la séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde de capture pour le gène SLTI. La SEQ ID NO: 21 est la séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde " reporter pour le gène SLTI. Les SEQ ID NOs :22 à 25 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces (22 et 23) et " bumper " (24 et 25) pour l'amplification du gène Salmonella enterica invA qui ont été conçues conformément à la présente invention. La SEQ ID NO : 26 est la séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde de capture du gène invA. La SEQ ID NO : 27 est la séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde " reporter " du gène invA.

La SEQ ID NO : 28 est une séquence d'un oligonucléotide utilisée comme amorce conformément au troisième mode de réalisation de la présente invention. La SEQ ID NO : 29 est une séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde captive pour le gène yst. La SEQ ID NO : 30 est une séquence d'un oligonucléotide utilisée comme sonde " reporter pour le gène yst. Les SEQ ID NOs : 31 à 34 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces pour l'amplification du gène Camylobacter sodB qui ont été conçues conformément à la présente invention. Les SEQ ID NOs : 35 à 38 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées comme amorces pour l'amplification du gène SLTII d'E. coli qui ont été conçues conformément à la présente invention.

Les SEQ ID NOs : 39 à 42 sont des séquences d'oligonucléotides utilisées

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comme amorces pour l'amplification du gène Shigella ipaH qui ont été conçues conformément à la présente invention.

Les figures 1A et 1B présentent une comparaison de la conception de l'amorce d'amplification standard (AA) (Fig. 1A) et de la nouvelle conception de l'amorce AA (Fig. 1 B). Le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction
BsoBI est marqué par un demi-cercle grisé. La séquence spécifique de cible est utilisée à l'extrémité 3' du site de reconnaissance de l'enzyme BsoBI pour les deux conceptions. La séquence non spécifique de cible (conception standard de l'AA, Fig. 1A) ou la séquence spécifique de cible (nouvelle conception de l'AA, fig. 1 B) est utilisée à l'extrémité 5' du site de reconnaissance de l'enzyme BsoBl.

La figure 2 montre l'influence des nouvelles amorces AB et AA sur la
SDA. De l'ADN génomique de Yersinia enterocolitica a été utilisé comme matrice. 1* : ystAA1s, ystAA1A, ystAB1 et ystAB2A ont été utilisées comme jeu d'amorces. 2* : ystAA1s, ystAA2A, ystAB1s et ystAB2A ont été utilisées comme jeu d'amorces. 3* : ystAA1s, ystAA1A, ystAB1s et ystAB1A ont été utilisées comme jeu d'amorces. ystAA1s, ystAA1A, ystAB1s et ystAB1A ont été conçues conformément à la méthode SDA d'origine. ystAA2A et ystAB2A ont été conçues par la méthode présentée ici. NT : contrôle négatif sans matrice. M : de poids moléculaire. Les produits spécifiques de cible contenaient 111 pb (non cassés) et 87 pb (cassés).

La figure 3 compare les résultats de la SDA obtenus avec le jeu d'amorces de conception d'origine et les résultats obtenus avec le jeu d'amorces de conception nouvelle de la présente invention. De l'ADN génomique de Y. enterocolitica a été utilisé comme matrice. 1*: le jeu d'amorces d'origine (ystAA1s, ystAA1A, ystAB1s et ystAB1A) a été utilisé pour la SDA. 2* : un nouveau jeu d'amorces conformément à la présente invention (ystAA2s, ystAA2A, ystAB2s et ystAB2A) a été utilisé pour la SDA. 3* : un nouveau jeu d'amorces conformément à la présente invention (ystAA3s, ystAA3A, ystAB2s et ystAB2A) a été utilisé pour la SDA. NT : contrôle négatif sans matrice. M : de poids moléculaire.

Les figures 4A à 4B présentent l'évolution dans le temps de la réaction de SDA. La SDA a été réalisée à 60 C pendant des durées différentes comme indiqué. De l'ADN génomique de Y. enterocolitica a été utilisé comme matrice et les amorces de nouvelle conception conformément à la présente invention

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(ystAA3s, ystAA3A, ystAB2s et ystAB2A) ont été utilisées comme jeu d'amorces.
Figure 4A : 5 l d'échantillon de chaque point du temps a été utilisé pour pratiquer une électrophorèse sur gel non dénaturante. Après électrophorèse, le gel a été coloré avec du bromure d'éthidium. Figure 4B : un test avec puce a été utilisé pour détecter la spécificité des produits de SDA. NT1: contrôle négatif sans matrice sans ADN externe. NT2:contrôle négatif sans matrice avec 0,5 g d'ADN génomique de thymus de veau. M : marqueur du poids moléculaire.

Les figures 5A et 5B présentent les résultats de la SDA avec la conception d'amorce conformément à un deuxième mode de réalisation de la présente invention, selon laquelle l'amorce comporte 6 nucléotides de séquence non spécifique de cible et 6 nucléotides de séquence spécifique de cible du côté 3' du site de reconnaissance de BsoBl. Figure 5A : de l'électrophorèse sur gel pour yst. Figure 5B : de la détection par puce pour yst.

Les figures 6A à 6D présentent la détection des produits de la SDA par amplification de matrice unique pour des jeux d'amorce triplex. Les trois premiers jeux d'amorces (SLTI + invA + yst) étaient présents à des concentrations standard (AA/AB 500 nM/50 nM). Une matrice génomique de E. coli a été utilisée pour SLTI, de S. enterica pour invA et de Y. enterocolitica pour yst. Figure 6A : résultats de l'électrophorèse sur gel pour SLTI. Les flèches indiquent les bandes attendues de produit amplifié (cassé et non cassé), M = marqueur du poids moléculaire. Figure 6B : résultats de la détection par puce pour SLTI. Figure 6C : de la détection par puce pour yst. Figure 6D : de la détection par puce pour invA. Les chiffres au-dessus des barres de signal sont les rapport signaux spécifiques/signaux non spécifiques.

La figure 7 présente la détection des produits de SDA à partir de la co- amplification de trois matrices dans les jeux d'amorces triplex. Les conditions étaient les mêmes que pour les figures 6A à 6D sauf pour les concentrations d'amorce, qui étaient les suivantes. Pour les jeux d'amorces SLTI, AA/AB = 200 nM/20 nM. Pour les jeux d'amorces yst, AA/AB = 400 nM/ 40 nM. Pour les jeux d'amorces invA, les concentrations standard ont été utilisées (AA/AB = 500 nM/50 nM).

Les figures 8A et 8B présentent la détection des produits de SDA pour la fabrication d'ADN simple brin. De l'ADN génomique de Yersinia enterocolitica a

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été utilisé comme matrice. Figure 8A : de la détection de l'hybridation passive avec des sondes de capture antisens yst (ystCA)et des sondes reporter antisens yst (ystRA) ou avec des sondes de capture sens yst (ystCs)et des sondes reporter sens yst (ystRs). Figure 8B : résultats de détection par hybridation électronique pour des échantillons dessalés et dénaturés avec des sondes de capture ystCA et des sondes reporter ystRA. PT : SDA classique.

L'amplification par déplacement de brins (Strand Displacement Amplification ou SDA) est une technique in vitro d'amplification d'acide nucléique permettant d'obtenir un produit d'amplification X 1010 en 15 minutes à
60 C (Spargo, C. A. et col., 1996. Mol. Cell. Probes 7 :247-256). interactions entre amorces et les amplifications PD sont les principales réactions de compétition des amplifications spécifiques de cible. Certains produits d'amplification PD ont été séquences et les résultats ont montré que certains des produits résultaient d'interactions entre 2 ou 3 pb d'amorces. Les interactions entre amorces peuvent être minimisées en choisissant soigneusement la région de la cible à amplifier. Cette stratégie ne fonctionne pas toujours en raison d'autres contraintes. Cela devient plus difficile pour la conception d'amorces pour la SDA multiplex puisque le nombre d'amorces impliquées augmente. Avec les conceptions d'amorces pour SDA déjà publiées, l'hybridation amorce - cible dépend de l'interaction entre la partie de l'amorce AA spécifique de la cible et la cible. La partie 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction ne participe pas à cette hybridation spécifique. La seule fonction de cette partie est de fournir une région flanquante pour le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction (Walker G. T., 1993. PCR Methods Appl. 3 :1-6).

Le fait que la séquence de l'AA du côté 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction ne soit pas impliquée dans l'amplification primer-dimer exponentielle a été utilisé pour concevoir de nouvelles amorces d'amplification afin d'améliorer la spécificité, la sensibilité et les résultats de la SDA. Conformément à la présente invention, la séquence spécifique de cible (p. ex. de 1 à 50 nucléotides, de préférence de 10 à 40 nucléotides, ou mieux de 15 à 30 nucléotides), est utilisée dans cette partie de l'amorce d'amplification pour fournir une région flanquante autour du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. Cette séquence est aussi impliquée dans l'hybridation spécifique amorce - cible des cycles initiaux de SDA. Cette conception d'amorce tire aussi

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avantage du fait qu'une partie du site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction, p. ex. 5 pb du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction si
BsoBI est l'endonucléase de restriction utilisée, est incorporée dans la matrice cassée déplacée dans le cadre de la SDA. Les AA comportant des séquences plus courtes du côté 3' (p. ex. 5 à 30 nucléotides, de préférence 6 à 20 nucléotides ou mieux 9 à 12 nucléotides) du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction sont conçues pour réduire les interactions entre amorces entre ces parties. Une meilleure spécificité, sensibilité et de meilleurs résultats sont obtenus avec des amorces conçues conformément à la présente invention malgré l'utilisation de séquences 3' plus courtes. On estime que la compétition entre l'amplification spécifique de cible et l'amplification non spécifique indépendante de la matrice au cours des cycles initiaux de SDA est un facteur important déterminant l'issue de l'amplification globale par SDA. Une hybridation amorce - cible plus marquée et moins d'interactions entre amorces au cours de ces cycles de SDA permettra d'augmenter de manière sûre la spécificité et la sensibilité des réactions globales. Une grande quantité de produits d'amplification est produite à partir de 10 copies d'une matrice d'ADN au bout de 30 minutes de SDA à 60 C. Ce résultat indique que la totalité de l'amplification est de fait favorable à une amplification spécifique. De plus, la conception d'amorce de la présente invention rend la conception d'amorce pour la SDA multiplex beaucoup plus facile puisque des séquences plus courtes sont nécessaires du côté 3' du site de restriction.

On a aussi observé qu'une séquence non spécifique de cible peut être incluse du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction adjacent à la séquence spécifique de site sans affecter de manière négative la réaction d'amplification. Dans ce mode de réalisation, la séquence non spécifique de cible comprend 1 à 40 nucléotides, de préférence 5 à 30 nucléotides ou mieux 10 à 20 nucléotides et elle se trouve entre le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction et la séquence 3' spécifique de cible.

L'électrophorèse sur gel est une méthode rapide permettant de visualiser la taille des produits d'amplification mais ne permettant pas de confirmer la spécificité de ces produits. Le test sur puce utilisant des réseaux micro- électroniques est un système de détection rapide et sensible de l'acide nucléique. Le test sur puce peut être utilisé pour identifier les produits spécifiques de cible. Il faut moins d'une heure au système pour terminer la totalité de la procédure de détection. L'association de la vitesse, de la simplicité

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et de la sensibilité du système de SDA et le test sur puce représentent une méthode potentielle de détection de pathogènes bactériens cliniques puisque les méthodes actuelles de diagnostic par culture pour la détection des pathogènes bactériens nécessitent plusieurs jours à plusieurs semaines en raison de la vitesse de croissance extrêmement limitée de certains pathogènes (Spargo, C. A. et col., 1993 Mol. Cell. Probes 7:395-404).

L'amplification multiplex est une stratégie d'utilisation de plusieurs jeux d'amorces d'amplification afin d'amplifier une ou plusieurs séquences cible en une seule réaction. Chaque réaction d'amplification est spécifique, mais plusieurs cibles sont amplifiées dans un seul mélange réactionnel. En utilisant les amorces conçues conformément à la présente invention (c. -à-d. des amorces ayant une séquence cible du côté 5' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction et des séquences cible plus courtes du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction) et en ajustant les concentrations d'amorce pour chaque matrice, il a été possible de co-amplifier et de détecter des nombres aussi faibles que 10 copies de chaque matrice. Les concentrations d'amorce sont déterminées de manière empirique à l'aide de techniques conventionnelles. Un aspect préféré de ce mode d'administration consiste à détecter les produits amplifiés à l'aide d'un réseau microélectronique. L'ensemble de la procédure, de l'amplification à la détection, a duré environ deux heures. l'association de la vitesse, de la simplicité et de la sensibilité de l'amplification SDA avec la détection sur un réseau micro- électronique fournissent une méthode de détection de pathogènes bactériens cliniques et de maladies. Ainsi, la conception des amorces conformément à la présente invention peut être utilisée pour amplifier deux ou trois séquences cible ou plus dans le cadre de la SDA, avec une sensibilité similaire à celle de la PCR multiplex.

L'ADN optimal pour l'hybridation et le séquençage d'acide nucléique est l'ADN simple brin. Lors de la conception d'amorces améliorées pour l'amplification par SDA, il a été observé qu'il n'était pas possible de fabriquer un produit spécifique de cible par SDA en utilisant des amorces d'amplification ayant une séquence spécifique de cible de trois paires de bases uniquement (pb) situées du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction. Ce fait est utile pour la fabrication d'ADN simple brin par SDA. En particulier, l'ADN simple brin est généré par SDA en utilisant (1) des quantités molaires égales de (a) une amorce d'amplification classique conçue conformément à la

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présente invention et (b) une amorce conçue conformément à la présente invention ayant une séquence spécifique de cible de trois nucléotides uniquement du côté 3' du site de reconnaissance de l'enzyme de restriction (nommée amorce d'arrêt) pour se lier à un brin de l'ADN et (2) une amorce d'amplification classique conformément à la présente invention pour se lier à l'autre brin d'ADN. L'amorce d'arrêt a été utilisée pour entrer en compétition sur la cible avec l'amorce d'amplification classique de telle sorte que les deux brins d'ADN cible soient amplifiés de manière inégale.

Les méthodes préférées sont l'utilisation de la SDA, de la tSDA ou de la tSDA homogène par fluorescence en temps réel. Ces méthodes sont connues des hommes du métier et présentées p. ex. dans les brevets US 5,547,861,
5,648,211,5,846,726, 5,919,630,5,928,869, 5,935,791 et 6,054,279 dont les résultats sont spécifiquement incorporés au présent brevet en référence. l'utilisation de réseaux micro-électroniques pour l'analyse des acides nucléiques est connue des hommes du métier et présentée dans les brevets
US 5,605,662 et 5,632,957 et dans les demandes PCT publiées WO 96/01836 et WO 97/12030.

Comme les acides nucléiques n'ont pas besoin d'être entièrement complémentaires pour s'hybrider, il faut comprendre que les séquences de la sonde et de l'amorce peuvent être modifiées dans une certaine mesure sans perte d'utilité comme sondes et amorces pour SDA. Par exemple, dans la conception d'amorce de la présente invention, le site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction se trouve entre la partie de liaison à la cible 5' et la partie de liaison à la cible 3' de l'amorce AA et peut être impliqué ou non dans l'hybridation avec l'acide nucléique cible. Comme les hommes du métier le savent, l'hybridation de séquences d'acides nucléiques complémentaires et partiellement complémentaires peut être obtenue par ajustement des conditions d'hybridation afin d'augmenter ou de diminuer la strigence (p. ex. ajustement du pH ou de la température d'hybridation ou de la teneur en sel du tampon). Ce type de modifications mineures des séquences de l'amorce et de la sonde et tout ajustement nécessaire des conditions d'hybridation ne nécessitent qu'une expérimentation de routine et restent dans le cadre d'une connaissance ordinaire du métier.

Les produits d'amplification générés à l'aide des amorces présentées ici peuvent être détectés par une taille caractéristique, par exemple, sur des gels polyacrylamide ou d'agarose colorés au bromure d'éthidium. Les séquences

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cible amplifiées peuvent aussi être détectées à l'aide d'une sonde d'essai, à savoir un oligonucléotide portant un marqueur détectable. Dans un mode d'application, au moins une sonde d'essai marquée peut être utilisée pour la détection des séquences cible amplifiées par hybridation (sonde détecteur) par hybridation et extension comme décrit par Walker et col. (1992, Nucl. Acides Res. 20 :1691-1696) détecteur) ou par hybridation, extension et conversion en une forme double brin comme décrit dans le brevet européen EP 0 678 582 (amorce signal). De préférence, la sonde d'essai est sélectionnée pour s'hybrider à une séquence de la cible se trouvant entre les amorces d'amplification, c. -à-d. qu'il doit s'agir d'une sonde d'essai interne. Une amorce d'amplification ou la séquence de liaison à la cible de cette amorce peuvent aussi être utilisées comme sonde d'essai. L'amplification et/ou la détection peuvent se faire sur un réseau micro-électronique.

Le marqueur détectable de la sonde d'essai est un groupement qui peut être détecté soit directement soit indirectement comme indication de la présence de l'acide nucléique cible. Pour une détection directe du marqueur, les sondes d'essai peuvent être marquées avec un radio-isotope et détectées par autoradiographie ou marquées avec un groupement fluorescent et détectées par fluorescence conformément aux techniques connues. Les sondes d'essai peuvent aussi être détectées indirectement par un marqueur nécessitant l'ajout de réactifs supplémentaires pour être détecté. Les marqueurs détectables de manière indirecte incluent par exemple les agents chimiluminescents, les enzymes qui produisent des produits de réaction visibles et des ligands (p. ex. haptènes, anticorps ou antigènes) qui peuvent être détectés par liaison à des molécules de liaison spécifiques marquées (p. ex. anticorps ou antigènes/haptènes). Les ligands sont aussi utilies pour immobiliser l'oligonucléotide marqué par un ligand (sonde de capture) à la phase solide pour faciliter sa détection. Des marqueurs particulièrement utiles sont entre autres la biotine (détectable par liaison à de l'avidine ou à de la streptavidine marquée) et des enzymes comme la peroxydase de raifort ou l'alcaline phosphatase (détectable par ajout de substrats enzymatiques pour produire des produits de réaction colorés). Les méthodes d'ajout de ce type de marqueurs ou d'inclusion de ce type de marqueurs aux oligonucléotides sont bien connues des hommes du métier et toutes ces méthodes sont adaptées à la présente invention.

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On peut citer comme exemple de méthodes de détection spécifique pouvant être employées une méthode de chimiluminescence au cours de laquelle les produits amplifiés sont détectés à l'aide d'une sonde de capture marquée à la biotine et d'une sonde détecteur conjuguée à une enzyme comme décrit dans le brevet US 5,470,723. Après hybridation de ces deux sondes d'essai avec différents sites dans la région de test de la séquence cible (entre les sites de liaison des deux amorces d'amplification), le complexe est capturé sur une plaque de microtitrage tapissée de streptavidine à l'aide de la sonde de capture et le signal chimiluminescent est développé et lu dans un luminomètre. Une autre possibilité de détection des produits d'amplification est une amorce signal décrite dans le brevet EP 0 678 582 et peut être incluse dans la réaction par SDA. Dans ce mode d'application, les produits d'amplification secondaires marqués sont créés pendant la SDA de manière dépendante de l'amplification de la cible et peuvent être détectés comme une indication d'amplification de la cible à l'aide du marqueur associé.

A des fins commerciales, les amorces d'amplification pour la détection et l'identification spécifique d'acides nucléiques peuvent être présentées sous forme de kits. En général, ce type de kits contient au moins une paire d'amorces d'amplification. Les réactifs permettant de réaliser une réaction d'amplification d'acide nucléique peuvent aussi être inclus avec les amorces d'amplification spécifiques de cible : tampons, amorces supplémentaires, nucléoside triphosphates, enzymes, etc. Les éléments du kit sont présentés ensemble dans un même emballage incluant éventuellement des instructions pour la réalisation d'un mode d'application spécifique des méthodes de l'invention. D'autres éléments optionnels peuvent aussi être inclus dans le kit, comme p. ex. un oligonucléotide marqué avec un marqueur adapté pour une utilisation comme sonde d'essai et/ou des réactifs ou des moyens de détection du marqueur.

Les séquences de liaison à la cible des amorces d'amplification confèrent une spécificité d'hybridation d'espèce sur les oligonucléotides et donc une spécificité d'espèce à la réaction d'amplification. Ainsi, les séquences de liaison à la cible des amorces d'amplification de l'invention sont aussi utiles dans d'autres protocoles d'amplification d'acide nucléique comme les techniques de PCR, de SDA conventionnelle (schéma de réaction essentiellement identique à celui de la tSDA mais conduit à des températures plus basses en utilisant des enzymes mésophiles), de 3SR, de NASBA et de

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TAS. En particulier, tout protocole d'amplification utilisant l'hybridation cyclique spécifique d'amorces avec la séquence cible, l'extension des amorces en utilisant la séquence cible comme matrice et la séparation ou le déplacement des produits d'extension de la séquence cible, peut employer les séquences de liaison à la cible de l'invention. Pour des méthodes d'amplification ne nécessitant pas de séquences spécialisées ne se liant pas à la cible (p. ex.

PCR), les amorces d'amplification peuvent n'être que les séquences de reconnaissance de liaison à la cible des amorces d'amplification, le site de l'endonucléase de restriction étant remplacé par une séquence non spécifique de la cible quelconque. Conformément à ce mode d'application de l'invention, des amorces d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5' une séquence ne se liant pas à la cible - une séquence de liaison spécifique à la cible 3' sont fournies.

Un autre mode d'application de la présente invention est dirigé vers les amorces ci-dessus utiles pour les réactions d'amplification autres que la SDA dans lesquelles une amorce a un ou plusieurs mésappariements (par rapport à la cible) dans la région spécifique de cible 3', p. ex. 1 à 10 nucléotides, de préférence 1 à 3 nucléotides. Ces amorces modifiées sont utiles pour l'amplification et la détection de mésappariements (essai SNP) (Sommer S.S. et col., 1989 Mayo Clin. Proc. 64:1361-1372).

D'autres séquences, nécessaires pour la réalisation d'une réaction d'amplification sélectionnée, peuvent aussi être ajoutées aux séquences de liaison à la cible présentées ici sans modifier la spécificité d'espèce de l'oligonucléotide. Pour d'autres réactions d'amplification (p. ex. 3SR, NASBA et TAS), les amorces d'amplification peuvent consister en la séquence de liaison à la cible et en d'autres séquences nécessaires pour la réaction d'amplification sélectionnée (p. ex. séquences nécessaires pour la SDA comme décrit cidessus ou promoteur reconnue par l'ARN polymérase pour la technique de 3SR). L'adaptation des séquences de liaison à la cible de l'invention pour des méthodes d'amplification autres que la méthode SDA se fait par des méthodes de routine de préparation d'amorces d'amplification comme la synthèse chimique et les exigences structurelles bien connues des amorces de la réaction d'amplification sélectionnée. Les séquences de liaison à la cible de l'invention peuvent donc aisément être adaptées à l'amplification et à la détection de la cible spécifique Y. enterocolitica dans de nombreuses réactions

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d'amplification en n'utilisant que des méthodes de routine pour la production, le criblage et l'optimisation.

Dans le cadre de la SDA, les amorces " bumper " sont essentielles pour la spécificité d'espèce car elles agissent pour déplacer les produits d'amorce ; d'amplification en aval spécifiques d'espèce de la cible. Il est nécessaire que les amorces " bumpers " s'hybrident avec la cible en amont des amorces d'amplification de telle sorte que lorsqu'elles sont étendues elles déplacent l'amorce d'amplification et son produit d'extension. La séquence particulière de l'amorce " bumper " n'est donc généralement pas critique et peut être dérivée d'une séquence cible quelconque en amont qui est suffisamment proche du site de liaison de l'amorce d'amplification pour permettre le déplacement du produit d'extension de l'amorce d'amplification par extension de l'amorce " bumper ". Des mésappariements occasionnels avec la cible dans la séquence de l'amorce " bumper " ou une hybridation croisée avec des séquences non spécifiques de cible n'affectent généralement pas de manière négative l'efficacité de l'amplification tant que l'amorce " bumper " reste capable de s'hybrider avec la séquence spécifique de la cible.

Les réactions d'amplification utilisant les amorces de l'invention peuvent incorporer la thymine comme suggéré par Walker et col. (1995, Nucl. Acids Res. 20 :1691-1696) entièrement ou partiellement remplacer le TTP par le 2'- désoxyuridine 5'-triphosphate dans la réaction afin de limiter la contamination croisée des réactions d'amplification suivantes, p. ex. comme exposé dans le brevet EP 0 624 643. La dU (uridine) est incorporée dans les produits d'amplification et peut être excisée par traitement avec l'UDG (uracile DNA glycosylase). Ces sites abasiques empêchent l'amplification du produit d'amplification dans les réactions d'amplification suivantes. L'UDG peut être inactivée par l'inhibiteur de l'uracile DNA glycosylase (UGI) avant réalisation de l'amplification suivante afin d'empêcher l'excision de la dU dans les produits d'amplification nouvellement formés.

La SDA est une méthode isotherme d'amplification d'acide nucléique au cours de laquelle l'extension des amorces, la césure d'un site de reconnaissance/clivage d'une endonucléase de restriction hémimodifiée, le déplacement des produits d'extension simple brin, l'annelage des amorces aux produits d'extension (ou à la séquence cible d'origine) et l'extension subséquente des amorces surviennent simultanément dans le mélange réactionnel. Ceci est différent de la PCR, au cours de laquelle les étapes de la

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réaction ont lieu au cours de phases ou cycles distincts en raison des caractéristiques de cycles de température de la réaction. La SDA est basée sur
1) la capacité d'une endonucléase de restriction à casser le brin non modifié d'une forme hémiphosphorothioate du site de reconnaissance/clivage de son double brin et 2) la capacité de certaines polymérases d'initier la réplication à la césure et de déplacer les produits d'extension amont. Après une incubation initiale à une température élevée (environ 95 C) pour dénaturer les séquences cible double brin pour l'annelage des amorces, la polymérisation et le déplacement subséquents des brins nouvellement synthétisés ont lieu à une température constante. La production de chaque nouvelle copie de la séquence cible comporte cinq étapes : 1) liaison des amorces d'amplification à une séquence cible d'origine ou à un produit d'extension simple brin déplacé préalablement polymérisé ; 2) extension des amorces par une polymérase déficiente en 5'-3' exonucléase incorporant un a-thio-désoxynucléoside triphosphate (a-thio dNTP) ; 3) césure d'un site de restriction double brin hémimodifié ; 4) dissociation de l'enzyme de restriction du site de césure et 5) extension de l'extrémité 3' de la césure par la polymérase déficiente en 5'-3' exonucléase avec déplacement du brin aval nouvellement synthétisé. La césure, la polymérisation et le déplacement surviennent simultanément et de manière continue à une température constante car l'extension de la césure génère un autre site de restriction cassable. Lorsqu'une paire d'amorces d'amplification est utilisée, chacune s'hybridant à l'un ou aux deux brins de la séquence cible double brin, l'amplification est exponentielle. Ceci est dû au fait que les brins sens et antisens servent de matrices pour l'amorce opposée dans les cycles suivants d'amplification. Lorsqu'une seule amorce d'amplification est utilisée, l'amplification est linéaire car un seul brin sert de matrice à l'extension d'amorce. Exemples d'endonucléases de restriction cassant leurs sites de reconnaissance/clivage double brin lorsqu'un a-thio dNTP est incorporé : HINcII, Hindll, Aval, Ncil et Fnu4HI. Toutes ces endonucléases de restriction et d'autres qui présentent l'activité de césure exigée peuvent être utilisées dans le cadre de la SDA conventionnelle. Cependant, elles sont relativement thermolabiles et perdent leur activité à partir de 40 C environ.

Les cibles d'amplification par SDA peuvent être préparées en fragmentant des acides nucléiques plus longs par restriction avec une endonucléase qui ne casse pas la séquence cible. Cependant, on préfère généralement que les acides nucléiques cible ayant des sites de

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reconnaissance/clivage de l'endonucléase de restriction sélectionnée pour la césure dans la réaction de SDA soient générés comme décrit par Walker, et col. (1992, Nucl. Acides Res. 20 :1691-1696) dans le brevet US 5,270,184 (joint pour référence). En bref, si la séquence cible est double brin, quatre amorces y sont hybridées. Deux des amorces (S, et S2) sont des amorces d'amplification pour SDA et deux (B1 et B2) sont des amorces externes ou " bumper". S1 et S2 se lient aux brins opposés des acides nucléiques double brin flanquant la séquence cible. B, et B2 se lient à la séquence cible du côté 5' (amont) de S1 et S2, respectivement. La polymérase déficiente en exonucléase est ensuite utilisée pour étendre simultanément les quatre amorces en présence de trois désoxynucléoside triphosphates et au moins un désoxynucléoside triphosphate modifiée (p. ex. 2'-désoxyadénosine 5'-O-(1- thiotriphosphate), " dATPaS "). Les produits d'extension de S, et S2 sont ainsi déplacés de la matrice de la séquence cible d'origine par extension de B, et B2.

Les produits d'extension simple brin déplacés des amorces d'amplification servent de cibles pour la liaison de l'amorce d'amplification opposée et de l'amorce " bumper (p. ex. le produit de S1 se lie à S2 et B2). Le cycle d'extension et de déplacement suivant entraîne la formation de fragments d'acides nucléiques doub!e brin ayant un site de reconnaissance/clivage de l'endonucléase de restriction hémimodifiée à chaque extrémité. Ce sont des substrats adaptés à l'amplification par SDA. Comme dans la SDA, les étapes individuelles de la réaction de génération de cible sont successives et continues, générant des séquences cibles ayant les séquences de reconnaissance/clivage aux extrémités nécessaires pour la césure par l'enzyme de restriction dans la SDA. Comme tous les composants de la réaction de SDA sont déjà présents dans la réaction de fabrication de la cible, les séquences cibles fabriquées automatiquement et de manière continue entrent dans le cycle de SDA et sont amplifiées.

Pour éviter la contamination croisée d'une réaction de SDA par les produits d'amplification d'une autre, on peut incorporer du dUTP dans l'ADN amplifié par SDA à la place du dTTP sans inhibition de la réaction d'amplification. Les acides nucléiques modifiés par uracile peuvent ensuite être spécifiquement reconnus et inactivés par traitement à l'uracile DNA glycosylase (UDG). Ainsi, si on incorpore du dUTP dans l'ADN amplifié par SDA au cours d'une réaction précédente, toutes les réactions de SDA suivantes peuvent être traitées avec de l'UDG avant amplification des cibles double brin et tout ADN

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contenant du dU de réactions amplifiées précédentes deviendra impossible à amplifier. L'ADN cible à amplifier dans la réaction suivante ne contient pas de dU et ne sera pas affecté par l'UDG. L'UDG peut ensuite être inhibé par traitement à l'UGI avant amplification de la cible. L'UDG peut aussi être inactivé par la chaleur. Dans la tSDA, la température plus élevée de la réaction ellemême (# 50 C) peut être utilisée simultanément pour inactiver l'UDG et amplifier la cible.

La SDA nécessite une polymérase n'ayant pas d'activité 5'-3' exonucléase, initiant la polymérisation sur une césure simple brin pour les acides nucléiques double brin et déplaçant le brin en aval de la césure tout en générant un nouveau brin complémentaire en se servant du brin intact comme matrice. La polymérase doit s'étendre par ajout de nucléotides à un groupement 3'-OH libre. Pour optimiser la réaction de SDA, il est aussi souhaitable que la polymérase soit hautement réactionnelle pour maximiser la longueur de la séquence cible qui peut être amplifiée. Les polymérases hautement réactives sont capables de polymériser de nouveaux brins d'une longueur importante avant dissociation et arrêt de la synthèse du produit d'extension. L'activité de déplacement est essentielle à la réaction d'amplification car elle rend la cible disponible pour synthèse de copies supplémentaires et génère le produit d'extension simple brin avec lequel une seconde amorce d'amplification pourra s'hybrider dans les réactions d'amplification exponentielle. L'activité de césure de l'enzyme de restriction revêt aussi une grande importance car c'est la césure qui perpétue la réaction et permet l'initiation des cycles suivants d'amplification de la cible.

La tSDA est essentiellement réalisée comme la SDA décrite par Walker et col. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392-396 et 1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696), avec substitution de la polymérase thermostable souhaitée et de l'endonucléase de restriction thermostable. Bien sûr, la température de la réaction sera ajustée à la température plus élevée adaptée aux enzymes substituées et le site de reconnaissance/clivage de l'endonucléase de restriction Hincll sera remplacé par le site de reconnaissance/clivage de l'endonucléase de restriction approprié à l'endonucléase thermostable sélectionnée. Egalement à la différence de Walker et col., le praticien pourra inclure les enzymes dans le mélange réactionnel avant l'étape initiale de dénaturation si elles sont suffisamment stables à la température de dénaturation. Les endonucléases de restriction préférées pour la tSDA sont

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BsrI, BstNI, BsmAl, BslI et BsoBI (New England BioLabs) et BstOI (Promega).
Les polymérases thermophiles préférées sont Bca (Panvera) et Bst (New
England Biolabs).

La tSDA homogène par fluorescence en temps réel est une modification de la tSDA. Elle emploie des oligonucléotides détecteurs pour produire une extinction de fluorescence de manière dépendante de la cible. Les oligonucléotides détecteurs contiennent une paire de colorants donneur/accepteur liés de telle sorte que l'extinction de fluorescence surviennent en l'absence de cible. Le dépliement ou la linéarisation d'une structure secondaire avec appariements de bases intramoléculaires dans l'oligonucléotide détecteur en présence de la cible augmente la distance entre les colorants et réduit l'extinction de fluorescence. Le dépliement de la structure secondaire avec appariement de bases implique classiquement un appariement de bases intermoléculaire entre la séquence de la structure secondaire et un brin complémentaire de telle sorte que la structure secondaire soit au moins partiellement détruite. Elle peut être complètement linéarisée en présence d'un brin complémentaire de longueur suffisante. Dans un mode de réalisation préféré, un site de reconnaissance de l'endonucléase de restriction (RERS) est présent entre les deux colorants de telle sorte que l'appariement de bases intermoléculaire entre la structure secondaire et un brin complémentaire rende aussi le RERS double brin clivable ou cassable par une endonucléase de restriction. Le clivage ou la césure par l'endonucléase de restriction sépare les colorants donneur et accepteur en fragments d'acides nucléiques séparés, contribuant encore à une diminution de l'extinction. Dans les deux modes de réalisation, une modification associée d'un paramètre de fluorescence (p. ex. augmentation de l'intensité de la fluorescence du donneur, diminution de l'intensité de la fluorescence de l'accepteur ou rapport de fluorescence avant et après dépliement) est suivi comme une indication de la présence de la séquence cible. La détection d'une modification de l'intensité de la fluorescence du donneur est préférée car cette modification est généralement plus importante que la modification de l'intensité de la fluorescence de l'accepteur.

D'autres paramètres de fluorescence, comme une modification de la durée de vie de la fluorescence, peuvent aussi être suivis.

Un oligonucléotide détecteur pour la tSDA homogène par fluorescence en temps réel est un oligonucléotide contenant une section simple brin 5' ou 3' qui s'hybride avec la séquence cible (séquence de liaison à la cible) ainsi

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qu'une structure secondaire avec appariements de bases intramoléculaires adjacente à la séquence de liaison à la cible. Les oligonucléotides détecteurs de l'invention comprennent en outre une paire de colorants donneur/accepteur liés à l'oligonucléotide détecteur de telle sorte qu'il y ait extinction de la fluorescence du donneur lorsque la structure secondaire est appariée intramoléculairement par base et de telle sorte que le dépliement ou la linéarisation de la structure secondaire entraîne une diminution de l'extinction de fluorescence. Le clivage d'un oligonucléotide désigne la rupture des liaisons phosphodiester des deux brins d'un ADN duplex ou la rupture de la liaison phosphodiester d'un ADN simple brin. Ceci est différent de la césure qui désigne la rupture de la liaison phosphodiester d'un seul brin d'un ADN duplex.

Les oligonucléotides détecteurs de l'invention pour la tSDA homogène par fluorescence en temps réel comprend une séquence qui forme une structure secondaire appariée par bases intramoléculairement dans les conditions de réaction sélectionnées pour l'extension ou l'hybridation de l'amorce. La structure secondaire est adjacente à la séquence de liaison à la cible de l'oligonucléotide détecteur de telle sorte qu'au moins une partie de la séquence de liaison à la cible forme une queue 3' ou 5' simple brin. Le terme " adjacent à la séquence de liaison à la cible " est utilisé ici dans le sens que tout ou partie de la séquence de liaison à la cible est laissée simple brin dans une queue 5' ou 3' disponible pour hybridation avec la cible. C'est-à-dire que la structure secondaire ne comporte pas la totalité de la séquence de liaison à la cible. Une partie de la séquence de liaison à la cible peut être impliquée dans l'appariement de bases intramoléculaire dans la structure secondaire, elle peut inclure tout ou partie d'une première séquence impliquée dans l'appariement de bases intramoléculaire dans la structure secondaire, elle peut inclure tout ou partie d'une première séquence impliquée dans l'appariement de bases intramoléculaire dans la structure secondaire mais de préférence ne s'étend pas en sa séquence complémentaire. Par exemple, si la structure secondaire est une structure tige-boucle (P. ex. " épingle à cheveux ") et si la séquence de liaison à la cible de l'oligonucléotide détecteur est présente sous forme d'une queue 3' simple brin, la séquence de liaison à la cible peut aussi s'étendre via tout ou partie du premier bras de la tige et, éventuellement, via tout ou partie de la boucle. Cependant, la séquence de liaison à la cible de préférence ne s'étend pas dans le second bras de la séquence impliquée dans l'appariement de bases intramoléculaire de la tige. C'est-à-dire qu'il est souhaitable d'éviter

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que les deux séquences soient impliquées dans l'appariement de bases intramoléculaire dans une structure secondaire capable de s'hybrider avec la cible. Des mésappariements dans la partie appariée par bases intramoléculairement de la structure secondaire de l'oligonucléotide détecteur peut réduire l'importance de la modification de fluorescence en présence de la cible mais ceci est acceptable si la sensibilité du test n'est pas problématique.

Des mésappariements dans la séquence de liaison à la cible de la queue simple brin sont aussi acceptables mais peuvent également réduire la sensibilité du test et/ou sa spécificité. Cependant, une caractéristique de la présente invention est qu'un appariement de bases parfait dans la structure secondaire et dans la séquence de liaison à la cible ne compromet pas la réaction. Des appariements parfaits dans les séquences impliquées dans l'hybridation améliorent la spécificité du test sans effets négatifs sur la cinétique de la réaction.

Une fois ajoutées à la réaction d'amplification, les oligonucléotides détecteurs amorces signal de l'invention sont convertis en forme double brin par hybridation et extension comme décrit ci-dessus. Le déplacement de brin par la polymérase entraîne aussi un dépliement ou une linéarisation de la structure secondaire et la ccnvertit en forme double brin par synthèse d'un brin complémentaire. Le RERS, s'il est présent, devient aussi double brin et clivable ou cassable par l'endonucléase de restriction. Lorsque la structure secondaire est dépliée ou linéarisée par l'activité de déplacement de brin de la polymérase, la distance entre le colorant donneur et le colorant accepteur est augmentée, ce qui réduit l'extinction de la fluorescence du donneur. La modification de fluorescence associée du colorant donneur ou du colorant accepteur peut être suivie ou détectée comme indication d'amplification de la séquence cible. Le clivage ou la césure du RERS généralement augmente encore l'importance de la modification de fluorescence en produisant deux fragments séparés du produit d'amplification secondaire double brin, chacun ayant un des deux colorants attaché. Ces fragments sont libres de diffuser dans la solution de réaction, ce qui augmente encore la distance entre les colorants de la paire donneur/accepteur. Une augmentation de l'intensité de la fluorescence du donneur ou une diminution de l'intensité de la fluorescence de l'accepteur peuvent être détectées et/ou suivies comme indicateurs que l'amplification de la cible est en cours ou a eu lieu, mais d'autres paramètres de fluorescence qui sont affectés par la proximité de la paire de colorants donneur/accepteur

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peuvent aussi être suivis. Une modification de l'intensité de la fluorescence du donneur ou de l'accepteur peut aussi être détectée sous la forme d'une modification du rapport des intensités de fluorescence du donneur et/ou de l'accepteur. Par exemple, une modification de l'intensité de fluorescence peut être détectée sous la forme de a) une augmentation du rapport de fluorescence du fluorophore du donneur après linéarisation ou dépliement de la structure secondaire et de la fluorescence du fluorophore du donneur dans l'oligonucléotide détecteur avant linéarisation ou dépliement, ou b) une augmentation du rapport de fluorescence du colorant accepteur après linéarisation ou dépliement et de la fluorescence du colorant accepteur dans l'oligonucléotide détecteur avant linéarisation ou dépliement.

Il sera apparent que les oligonucléotides détecteurs de l'invention seront adaptés, outre à la SDA, à l'utilisation comme amorces signal dans d'autres méthodes d'amplification par extension d'amorce (p. ex. PCR, 3SR, TMA ou NASBA). Par exemple, les méthodes peuvent être adaptées pour utilisation dans la PCR en utilisant des amorces d'amplification par PCR et une DNA polymérase déplaçant le brin sans activité exonucléase 5'->3' (p. ex Sequencing Grad Taq de Promega ou exo Vend ou exo Deep Vent de New England Biolabs) dans la PCR. Les oligonucléotides détecteurs amorces signal s'hybrident avec la cible en aval des amorces d'amplification de PCR, sont déplacés et deviennent double brin essentiellement comme on l'a décrit pour la SDA. Dans la PCR, tout RERS peut être sélectionné pour être utilisé dans l'oligonucléotide détecteur puisqu'il n'y a pas de désoxynucléoside triphosphates modifiés présents susceptible d'induire une césure plutôt qu'un clivage du RERS. Comme les cycles thermiques sont l'une des caractéristiques de l'amplification par PCR, l'endonucléase de restriction est de préférence ajoutée à basse température après le cycle final d'annelage de l'amorce et d'extension de l'amorce pour la détection finale de l'amplification. Cependant, une endonucléase de restriction thermophile restant active pendant les phases de PCR à haute température peut être présente pendant l'amplification pour permettre un test en temps réel. Comme dans les systèmes de SDA, la séparation de la paire de colorants réduit l'extinction de fluorescence avec une modification d'un paramètre de fluorescence comme l'intensité servant d'indication de l'amplification de la cible.

La modification de fluorescence résultant du dépliement ou de la linéarisation des oligonucléotides détecteurs peut être détectée à un moment

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choisi de la réaction. Cependant, comme les structures secondaires linéarisées sont produites en même temps que l'hybridation ou l'extension d'amorce, la modification de fluorescence peut aussi être suivie pendant la réaction, c'est-à- dire " en temps réel ". Cette méthode homogène en temps réel peut être utilisée pour fournir des informations semi-quantitatives ou quantitatives concernant la quantité initiale de cible présente. Par exemple, la vitesse à laquelle l'intensité de fluorescence change pendant la réaction de dépliement ou de linéarisation (soit faisant partie de l'amplification de la cible soit dans des méthodes de détection sans amplification) est une indication des concentrations initiales de cible. Il en résulte que lorsqu'une plus grande quantité de copies initiales de la séquence cible est présente, la fluorescence du donneur atteint plus rapidement une valeur seuil sélectionnée (c'est-à-dire temps plus court jusqu'à positivité). Le temps nécessaire à la diminution de la fluorescence de l'accepteur pour atteindre la positivité, défini comme le temps nécessaire pour atteindre une valeur minimale sélectionnée, est également plus court. En outre, la vitesse de modification des paramètres de fluorescence pendant la réaction est plus rapide pour des échantillons contenant des quantités initiales plus importantes de cible que pour des échantillons contenant des quantités initiales plus faibles de cible (c'est-à-dire pente plus importante de la courbe de fluorescence). Ces mesures ou d'autres connues des hommes du métier peuvent être pratiquées comme indications de la présence de cible ou comme indication de l'amplification de la cible. La quantité initiale de cible est typiquement déterminée par comparaison des résultats expérimentaux pour des quantités connues de cible.

Les tests de présence d'une séquence cible sélectionnée selon les méthodes de l'invention peuvent être pratiqués en solution ou à la phase solide. Les tests en temps réel ou homogènes en point terminal dans lesquels l'oligonucléotide détecteur fonctionne comme une amorce sont typiquement réalisés en solution. Les tests d'hybridation utilisant les oligonucléotides détecteurs de l'invention peuvent aussi être réalisés en solution (p. ex. tests homogènes en temps réel) mais sont aussi particulièrement bien adaptés à des tests à la phase solide pour détection en temps réel ou en point terminal de la cible. Dans un test à la phase solide, les oligonucléotides détecteurs peuvent être immobilisés à la phase solide (p. ex. billes, membranes ou tube à essai) par des marqueurs internes ou terminaux en utilisant des méthodes connues des hommes du métier. Par exemple, un oligonucléotide détecteur marqué à la

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biotine peut être immobilisé sur une phase solide modifiée par l'avidine où il produira une modification de fluorescence lorsqu'il sera exposé à la cible dans des conditions d'hybridation appropriées. La capture de la cible par ce moyen facilite la séparation de la cible de l'échantillon et permet l'élimination de substances dans l'échantillon susceptibles d'interférer avec la détection du signal ou tout autre aspect du test. Un exemple de système à la phase solide pouvant être utilisé est un micro-réseau électronique, c'est-à-dire un système d'hybridation sur matrice électronique programmable.

Une version simplifiée du système d'hybridation sur matrice électronique programmable pouvant être utilisé avec la présente invention est décrite comme suit. Généralement, un substrat porte une matrice ou réseau de microemplacements électroniquement adressables. Une couche perméable est disposée sur les électrodes individuelles. La couche perméable permet le transport d'entités chargées relativement petites mais empêche des entités plus grandes, comme l'ADN, d'entrer directement en contact avec les électrodes. La couche perméable évite la dégradation électrochimique qui surviendrait dans l'ADN par contact direct avec les électrodes. Elle sert en outre à éviter la forte adsorption non spécifique de l'ADN aux électrodes. Des régions de fixation sont disposées sur la couche perméable et fournissent des sites spécifiques de liaison pour les matériaux cible.

Pour le fonctionnement, un réservoir comprend l'espace entre les régions de fixation qui contient les matériaux souhaités (et non souhaités) pour la détection, l'analyse ou l'utilisation. Les entités chargées, comme de l'ADN chargé, sont situées dans le réservoir. Dans un aspect, le système de matrice active programmable comprend une méthode de transport des matériaux chargés vers l'un des micro-emplacements spécifiques. Une fois activé, un micro-emplacement génère le transport électrophorétique en champ libre de toute entité de liaison chargée fonctionnalisée spécifique vers l'électrode. Par exemple, si une électrode est rendue positive et l'autre négative, des lignes de force électrophorétiques courent entre ces deux électrodes. Les lignes de force électrophorétique entraînent le transport des entités de liaison chargées qui ont une charge négative nette vers l'électrode positive. Les matériaux chargés ayant une charge positive nette se déplacent sous l'action de la force électrophorétique vers l'électrode chargée négativement. Lorsque l'entité de liaison chargée négativement ayant été fonctionnalisée entre en contact avec la couche de fixation suite à ce mouvement sous la force électrophorétique,

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l'entité de liaison fonctionnalisée spécifique se lie de manière covalente à la couche de fixation correspondant à la première électrode.

Le transport électrophorétique résulte généralement de l'application d'un voltage, ce qui est suffisant pour permettre l'électrolyse et le transport d'ions dans le système. La mobilité électrophorétique en résulte et le courant passe dans le système, de telle sorte que les ions sont transportés dans la solution électrolytique. Ainsi, un circuit complet peut être formé via le flux de courant des ions, le reste du circuit étant complété par les composants électroniques traditionnels, comme les électrodes et l'ensemble de circuits contrôlé. Par exemple, pour une solution électrolytique aqueuse contenant des matériaux classiques comme du chlorure de sodium, du phosphate neutre de sodium, des tampons et des espèces ioniques, le voltage qui entraîne l'électrolyse et le transport des ions est supérieur ou égal à environ 1,2 volt.

Il est possible de protéger les couches de fixation qui ne sont pas soumises à la réaction en rendant négatives les électrodes correspondantes.

Ceci entraîne des lignes de force électrophorétiques émanant de ces régions de fixation. Les lignes de force électrophorétiques permettent d'écarter les entités de liaison chargées négativement de la couche de fixation non réactive et vers la couche de fixation correspondant à la première élecrode. Ainsi, une protection par " champ de force " est formée autour des couches de fixation dont on souhaite qu'elles soient non réactives avec les molécules chargées à ce moment donné.

L'un des résultats extrêmement avantageux de ce système est que les matériaux de liaison chargés peuvent être hautement concentrés dans des régions adjacentes à la couche de fixation du signal. Par exemple, si un microemplacement individuel est chargé positivement et si les autres microemplacements sont chargés négativement, les lignes de force électrophorétique entraîneront le transport des entités de liaison dont la charge nette est négative vers le micro-emplacement chargé positivement. Ainsi, une méthode de concentration et de réaction d'analytes ou de produits en réaction sur un micro-emplacement spécifique du dispositif peut être obtenue. Après fixation des entités de liaison spécifiques à la couche de fixation, la micro- électrode sous-jacente peut continuer à fonctionner en mode courant continu (CC). Cette caractéristique unique permet aux analytes chargés relativement dilués ou aux molécules réactionnelles libres dans la solution d'être transportés rapidement, concentrés et de faire l'objet d'une réaction de manière sérielle ou

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parallèle à un micro-emplacement quelconque maintenu à la charge opposée à celle de l'analyte ou des molécules réactionnelles. Cette possibilité de concentrer un analyte dilué ou des molécules réactionnelles sur des microemplacements sélectionnés accélère beaucoup les vitesses de réaction sur ces micro-emplacements.

Une fois que la réaction voulue est terminée, le potentiel de l'électrode peut être inversé, ce qui crée une force électrophorétique dans la direction opposée à la force d'attraction antérieure. Ainsi, des analytes non spécifiques ou des molécules non réactionnelles peuvent être écartés du microemplacement. Des analytes spécifiques ou des produits de réaction peuvent être libérés de tout micro-emplacement et transportés vers d'autres emplacements pour une autre analyse, stockés sur d'autres emplacements adressables ou complètement éliminés du système. Ce retrait ou déconcentration de matériaux par inversion du champ améliore la capacité de discrimination du système en entraînant la suppression des matériaux liés de manière non spécifique. En contrôlant la quantité de force électrophorétique non répulsive pour des matériaux liés de manière non spécifique sur la couche de fixation, on peut obtenir le contrôle de la stringence électronique. En augmentant le potentiel électrique au niveau de l'électrode de telle sorte que l'on crée un champ suffisant pour éliminer des séquences d'ADN partiellement hybridées, ce qui permet l'identification d'hybridations avec mésappariements simples, on peut identifier des mutations ponctuelles.

Les opérations peuvent être conduites en parallèle ou en série sur les différentes couches de fixations. Par exemple, une réaction peut survenir d'abord sur une première couche de fixation, utilisant les potentiels comme montré. Le potentiel d'une première électrode peut être inversé, c'est-à-dire rendu négatif, et le potentiel de la seconde électrode adjacente peut être rendu positif. Ainsi, une réaction en série survient. Les matériaux qui n'étaient pas spécifiquement liés à la première couche de fixation seront transportés par la force électrophorétique vers la couche de fixation. Ainsi, l'aspect de concentration est utilisé pour fournir des concentrations élevées sur cette couche de fixation spécifique lorsqu'elle est soumise à la force électrophorétique positive. Les matériaux concentrés peuvent ensuite être transportés vers une couche de fixation adjacente ou autre. Plusieurs couches de fixation peuvent aussi être déprotégées dans le sens où il y a un champ de force électrophorétique net émanant de l'électrode par la couche de fixation

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vers le réservoir. En déprotégeant la couche de fixation multiple, on réalise des réactions multiplex. Chaque site individuel peut servir en lui-même de " tube à essai " biologique du fait que l'environnement particulier traité par une couche de fixation donnée peut différer des environnements entourant les autres couches de fixation.

Dans un mode de réalisation, la couche perméable contient de l'avidine et l'une des amorces de SDA contient de la biotine. Après amplification, les amplicons sont adressés électroniquement sur le réseau et se lient à l'avidine.
Une ou plusieurs sondes détecteur marquées sont ensuite ajoutées et s'hybrident avec les amplicons. La présence de sondes détecteur hybridées est ensuite détectée. Dans un second mode de réalisation, une ou plusieurs sondes de capture sont conçues pour s'hybrider avec l'acide nucléique amplifié. Chaque sonde de capture contient de la biotine et est soit liée à soit adressée électroniquement vers un réseau dans lequel la couche perméable contient de l'avidine. Les amplicons sont ensuite adressés électroniquement sur le réseau et s'hybrident avec les sondes de capture. Une ou plusieurs sondes détecteur marquées sont ensuite ajoutées et s'hybrident avec les amplicons. La présence de sondes détecteur hybridées est ensuite détectée.

De plus amples détails concernant le micro-réseau électronique et les systèmes associés sont donnés par Heller et col. (1997, Brevet US N
5,605,662 ; 1997, Brevet US N 5,682,957; 1997, demande PCT publiée N W097/12030) et Sosnowski et col. (1998, demande PCT publiée N W098/10273) dont les découvertes sont incluses spécifiquement ici pour référence.

En outre, des techniques utilisant la SDA et des micro-réseaux électroniques, incluant plusieurs formats de tests, sont présentés dans la demande simultanément en instance, N de série 09/290,632, déposée le 12 avril 1999, incluse ici pour référence. Dans un mode de réalisation, décrit dans cette demande, un test sandwich est utilisé au cours duquel une sonde de capture simple brin est déposée électroniquement sur le réseau et sert à capturer un brin d'une molécule chargée comme un acide nucléique cible ou un amplicon de cet acide nucléique. De nombreuses molécules comme les sondes de capture d'acide nucléique peuvent être déposées électroniquement sur différents endroits du réseau. De préférence, l'hybridation de la molécule cible ou de l'amplicon et de la sonde de capture doit être pratiquée électroniquement. Après capture de la molécule chargée sur les sites de

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capture, la molécule capturée peut être détectée par une sonde reporter marquée qui se lie à la molécule capturée.

Dans un second mode de réalisation décrit dans cette demande, une amplification électronique est conduite sur le micro-réseau. Dans ce mode de réalisation, l'acide nucléique cible est concentré électroniquement à proximité des amorces ancrées situées sur un site de capture et utilisé dans la SDA ou une autre méthode d'amplification. L'hybridation électronique est utilisée pour hybrider les molécules matrice avec amorces SDA ancrées. Les micropuces sont ensuite incubées avec un mélange réactionnel pour SDA qui contient les composants de la SDA autres que la matrice et les amorces d'amplification.

Après arrêt de la réaction, les produits sont dénaturés et la micropuce est incubée avec les sondes reporter pour détecter la présence d'acide nucléique cible. Ces modes de réalisation montrent que (a) l'amplification peut être pratiquée sur un micro-réseau électronique et suivie d'une analyse et (b) que l'amplification peut être pratiquée en solution et suivie d'une analyse pratiquée sur un micro-réseau électronique.

Les exemples suivants illustrent des modes de réalisation spécifiques de l'invention décrite ici. Comme cela semblera évident aux hommes du métier, des changements et modifications divers sont possibles et sont envisagés dans le cadre de la portée de l'invention décrite.

EXEMPLE 1 Analyse de la conception de l'amorce pour les amplifications par SDA 1. Matériel K2HP04 (pH 7,6) MgOAc, désoxynucléotide 5'-triphosphate (dATP, dGTP, dTTP), 2'-désoxycytosine 5'-O-(1-thiotriphosphate) (dDTPaS), tréhalose, BSA, enzyme de restriction BsoB1, exo Bst DNA polymérase, ADN génomique de Yersinia enterocolitica (type 3, souche 89A7489), ADN génomique de placenta humain, fournis gracieusement par Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD, USA). ADN génomique de thymus de veau acquis auprès de Sigma (St. Louis, MO, USA). Tous les oligonucléotides ont été synthétisés par Synthetic Genetics (San Diego, CA, USA) et sont présentés dans le tableau 1. Les AA ont été purifiées par PAGE

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et les autres oligonucléotides ont été purifiés par HPLC. Les sondes oligonucléotidiques reporter ont été synthétisées avec une amine 5' et conjuguées à du Rouge Texas Bodipy (BTR) par Nanogen. Les sondes de capture ont été marquées à la biotine à l'extrémité 5'. Les gels non dénaturant (Gel TBE à 10 % d'acrylamide) ont été acquis auprès de Novex (San Diego,
CA, USA). Le marqueur VIII du poids moléculaire de l'ADN a été acquis auprès de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA). La colonne pour chromatographie Micro Bio-Spin a été acquise auprès de Bio-Rad (Hercules,
CA, USA). Le logiciel Oligo Primer Analysis, version 5. 0, a été acquis auprès de
Wojcinch Rychlik National Biosciences (Plymouth, MN).

TABLEAU 1
Oligonucléotides
Amorce Séquence (SEQ ID NO :) ystAA1s CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGCATCATTTGGAGCATTC (1) ystAA1A ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTATACCTCAGCGGTTATT (2) ystAB1s TTGTTCTTGTGTTAA (3) ystAB1A AGGATCACAAGCTTG (4) ystAA2s AATGCTGTCTTCATTTGGAGCCTCGGGCCAAGAAACAGT (5) ystAA3s AATGCTGTCTTCATTTGGAGCCTCGGGCCAAGAAAC (6) ystAA2A GGAACGGAGGATCACAAGCTCTCGGGTATACCTCGAGCG (7) ystAA3A GGCAACGGAGGATCACAAGCTCTCGGGTATACCTCA (8) ystAB2s ATGAAAAAGATAGTTTTTGTTC (9) ystAB2A ATCCCAATCACTACTGAC (10) ystCs (Biot-) TCAGTGATGCATTATCGACA (11 ) YstRs (BTR-)CCAAGAAACAGTTTCAGGGC (12) Cs non (Biot-)CCAGCATCTTCAGCATCTTCTGTAAATTTACCACTAAC spécifique (13)
AA : amorce d'amplification ; AB : amorce " bumper " ; C : sonde de capture ; R : sonde reporter ; S : sens : A : antisens ; le site de reconnaissance de la BsoBI est en gras.

2. Réactions d'amplification par déplacement de brin
De l'ADN génomique de Y. enterocolitica a été dilué en série dans 100 ng/pl d'ADN génomique de thymus de veau ou d'ADN génomique de

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placenta humain. La concentration finale d'ADN génomique externe était de 0,5 g par réaction. Les réactions d'amplification ont été effectuées dans les conditions décrites par Spargo et col. (1993, Mol. Cell. Probes 10 :247-256) avec certaines modifications. Les réactions de SDA ont été effectuées dans un volume de 50 l avec une concentration finale de 9,75 mM de MgOAc, 1,4 mM respectivement de dATP, dGTP, dTTP et dCTPaS, 35 mM de K2HP04, 4 g de BSA, 1,8 % (p/v) de tréhalose, 500 nM respectivement de AA, 50 nM respectivement de AB, 1,8 U de BsoB1 et 3,8 U de exo Bst. Avant ajout du mélange d'enzymes (10 l contenant 1,8 U de BsoB1, 3,8 U de exo Bst, 9 % (p/v) de tréhalose, 2 g de BSA et 87,5 mM de K2HP04), le mélange réactionnel incomplet (40 l) contenant des quantités diverses d'ADN génomique cible a été chauffé à 95 C pendant cinq minutes pour dénaturer la matrice, puis deux minutes à 60 C pour entraîner l'annelage des amorces aux matrices. Après ajout du mélange d'enzymes, le mélange réactionnel a été incubé à 60 C pendant 30 minutes puis placé une à deux minutes sur la glace pour arrêter la réaction.

3. Détection des produits de la SDA
Après SDA, 5 l de la réaction d'amplification ont été versés sur un gel dénaturant à 10 % et visualisés par coloration au bromure d'éthidium. La spécificité des produits a été détectée par hybridation électronique avec des sondes de capture marquées à la biotine situées sur un réseau micro- électronique (Sosnowski et col., 1997. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94 :1119- 1123). Pour le test sur réseau micro-électronique (test sur puce), l'échantillon a d'abord été dessalé à l'aide de colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin selon les procédures décrites dans le mode d'emploi du fabricant. La L-histidine a été utilisée comme tampon d'échange. Un aliquot de l'échantillon dessalé (20 l) a été chauffé dans l'eau bouillante pendant 5 minutes pour dénaturer l'ADN et a été placé sur de la glace jusqu'à utilisation. L'échantillon dénaturé a été adressé électroniquement vers des emplacements désignés et les emplacements ont été lavés avec 50 mM de L-histidine. Une sonde reporter marquée au BTR dissoute dans 1xSTE a été hybridée avec les cibles pendant 5 minutes à 22 C. Après lavage avec le STE, la cartouche a été examinée et les résultats ont été notés.

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4. Résultats
Le jeu d'amorces yst d'origine (ystAA1s, ystAA1A, ystAB1s et ystAB1A, tableau 1) utilisé dans cet exemple est l'un des jeux d'amorces les plus sensibles conçus pour être utilisés avec la méthode SDA standard. Il n'y a eu aucune interaction prévisible des extrémités 3' entre ces deux AA. Le jeu d'amorces d'origine et les jeux d'amorces de nouvelle conception amplifient une région cible similaire pour minimiser la variation pouvant être due à l'amplification de séquences cibles différentes. Les mêmes sondes reporter et capture ont été utilisées pour les tests sur puce. Lorsque les AA ont été conçues selon la méthode décrite ici, une augmentation des amplifications spécifiques de la cible et une diminution des amplifications non spécifiques indépendantes de la matrice ont été observées en comparaison avec les résultats obtenus avec le jeu d'amorce d'origine (figure 3). Pour démontrer que cette augmentation de la sensibilité et de la spécificité était due à l'utilisation des nouvelles AA et non à l'utilisation des nouvelles AB, l'une des AB d'origine a été d'abord remplacée par l'une des nouvelles AB. Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de différence significative en matière de résultat de SDA entre ces deux AB (figure 2,3* contre 1 *). Pour voir si l'amélioration observée était due aux différences de longueur des produits amplifiés, la méthode a été utilisée en remplaçant l'une des AB et des AA d'origine par l'une des nouvelles AA ET AB. Les produits amplifiés après cette substitution ont exactement la même longueur que les produits d'origine. Les résultats ont indiqué que plus de produits spécifiques de la cible ont été produits avec le jeu d'amorces substitué (figure 2,2* contre 1 *). Sur la base de ces résultats, il semble que l'augmentation de la sensibilité, de la spécificité et des résultats a été due à l'utilisation du nouveau schéma de conception des AA.

Comme la portion 3' des AA est impliquée dans les interactions entre amorces et les amplifications PD exponentielles, il était souhaitable de minimiser la longueur de cette portion afin de réduire le risque d'interactions entre amorces et d'amplifications PD non spécifiques. Des AA ont été conçues ayant la même séquence du côté 5' du site de reconnaissance de la BsoBI mais ayant des longueurs différentes aux extrémités 3'. Les résultats ont indiqué que des amplifications efficaces spécifiques de la cible ont été obtenues avec des longueurs de portion 3' comprises entre 12 et 9 pb (figure 3). L'efficacité a été diminuée lorsque des AA ayant des portions 3' d'une longueur de 6 pb ont été utilisées. Il n'est pas surprenant de constater que

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l'efficacité de l'amplification avec le jeu d'amorces ystAA3s et ystAA3A est supérieure à celle de l'amplification avec le jeu d'amorces ystAA2s et ystAA2A car il y a une interaction de l'extrémité 3' des amorces pour 2 pb entre ystAA2s et ystAA2A et il n'y a aucune interaction prévisible des extrémités 3' entre ystAA3s et ystAA3A selon le logiciel Oligo.

La SDA utilisant des amorces conçues selon la méthode décrite ci- dessus a aussi été comparée à la SDA utilisant des amorces de conception standard pour le gène socB de Campylobacter, de la toxine Shiga I d'E. coli et pour le gène invA de Salmonella. Les résultats obtenus sont très similaires aux résultats présentés ici. L'évolution dans le temps de la réaction de SDA a aussi été testée. Les résultats ont indiqué que les produits d'amplification spécifique de la cible détectables ont été obtenus au bout de 10 minutes seulement de SDA à 60 C à partir de 10 copies de la cible. Le nombre de produits obtenu a atteint son maximum en 25 à 30 minutes (figure 4). Des produits détectables spécifiques de cible ont aussi été obtenus à partir de 5 copies de matrice cible. l'ADN génomique de thymus de veau ou l'ADN génomique de placenta humain ont été utilisés comme ADN externe pour simuler des échantillons cliniques. Il y a eu une forte bande de produit d'amplification de 115 pb pour le contrôle négatif sans matrice lorsque de l'ADN génomique de thymus de veau était présent dans ce contrôle négatif (figure 4A). Cette bande est aussi apparue lorsqu'un nombre inférieur de copies de la cible a été utilisé avec le jeu d'amorces ystAA3s et ystAA3A (figure 3). Les résultats des tests sur puce ont montré que le produit de cette bande n'interférait pas avec la détection spécifique de cible (figure 4B). On estime que le produit était le produit d'interactions et d'amplifications non spécifiques entre l'ADN d'arrière-plan et le jeu d'amorces utilisé.

Des amorces ont été conçues comme décrit ci-dessus et contenant aussi une séquence non spécifique de cible du côté 3' du site BsoBI entre le site BsoBI et la séquence spécifique de cible 3'. Les amorces d'amplification ystAA5s et ystAA5A contenaient 6 nucléotides d'une séquence non spécifique de cible et 6 nucléotides d'une séquence spécifique de cible du côté 3' du site BsoBl. Ces amorces ont les séquences suivantes dans lesquelles le site de reconnaissance de la BsoBI est en gras, la séquence aléatoire est soulignée et la séquence (de liaison) spécifique de cible est en italiques : ystAA5s - AATgCTgTCTTCATTTggAgCCTCgggAggTCCAACAgT (SEQ ID NO : 14)

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ystAA5A - CggCTggTggCAACggAggATCTCgggTgCTCgTgTATA (SEQ
ID NO :15)
Une SDA utilisant ces amorces d'amplification avec des amorces " bumper "(ystAB2s et ystAB2A) a été réalisée et les résultats sont présentés dans les figures 5A (électrophorèse sur gel) et 5B (détection sur puce). En comparaison avec la SDA utilisant des amorces d'amplification sans séquence spécifique de cible 3', on voit que les mêmes résultats ont été obtenus pour chaque réaction de SDA.

EXEMPLE 2
Amplification et détection mutliplex d'ADN
1. Matériel.

K2HP04 (pH 7,6) MgOAc, dATP, dGTP, dTTP, 2'-désoxycytosine 5'-0- (1-thiotriphosphate) (dDTPaS), tréhalose, BSA, enzyme de restriction BsoBI, exo Bst DNA polymérase, ADN génomique de Yersinia enterocolitica (type 3, souche 89A7489), ADN génomique de Salmonella enterica (ATCC 10749), ADN génomique dE. coli (ATCC 43890) et ADN génomique de placenta humain, fournis gracieusement par Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD, USA). Les oligonucléotides ont été synthétisés par Synthetic Genetics (San Diego, CA, USA) et sont présentés dans le tableau 2. Les amorces d'amplification (AA) ont été purifiées par PAGE et les autres oligonucléotides ont été purifiés par HPLC. Les sondes reporter ont été synthétisées avec de l'amine 5' et conjuguées à du Rouge Texas Bodipy (BTR). Les sondes de capture ont été marquées à la biotine à l'extrémité 5'. Les colonnes pour chromatographie Micro Bio-Spin ont été acquises auprès de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Les gels non dénaturants (gels TBE à 10 % d'acrylamide) ont été acquis auprès de Novex (San Diego, CA, USA). Le marqueur VIII de poids moléculaire de l'ADN a été acquis auprès de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA).

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TABLEAU 2 Oligonucléotides Amorce Séquence (SEQ ID NO :) ystAA3s AATGCTGTCTTCATTTGGAGCCTCGGGGCCAAGAAAC (6) ystAA3A GGCAACGGAGGATCACAAGCTCTCGGGTATACCTCA (8) ystAB2s ATGAAAAAGATAGTTTTTGTTC (9) ystAB2A ATCCCAATCACTACTGAC (10) ystCs (Biot-)CATTATCGACACCAATAACC (11 ) ystRs (BTR-)TTCAGGGCAGTTCAGTGATG (12) SLTIAAS TTATATGTGGCAGGATTTGTTCTCGGGACAAATAATG (16) SLTIAAA AGCTACTGTCACCAGACAATGCTCGGGCTGTTGTACCT (17) SLTIABS ACGGCTTATTGTTGAACGAA (18) SLTIABA CTGCAACACGCTGTAACGTG (19) SLTICs (Biot-) GGGATTCACATGTTACCTTTC (20) SLTIRs (BTR-)TTTTTTATCGCTTTGCTGATT (21) invAAAs GTGTTTATGGGGTCGTTCTACCTCGGGAGAATCCTC (22) invAAAA TCAATCAAGATAAGACGGCTGCTCGGGATCGATAATG (23) invAABs CTGAATATCGTACTGGCGAT (24) invAABA TGGCGATAATTTCACCGGCATCG (25) invACs (Biot-) ACCACGCTCTTTCGTCTG (26) invARs (BTR-)TGCGGTACTGTTAATT (27) femAs (Biot-)CCAGCATCTTCAGCATCTTCTGTAAATTTACCACTAAC (13)
AA : amorce d'amplification ; AB : amorce " bumper " ; C : sonde de capture ; R : sonde reporter ; S : sens ; A : antisens ; le site de reconnaissance de la BsoBI est en gras.

2. Amplification par déplacement de brin
Les réactions d'amplification par SDA ont été réalisées dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Brièvement, une réaction de SDA standard a été réalisée dans un volume de 50 l avec une concentration finale de 9,75 mM de MgOAc, 1,4 mM respectivement de dATP, dGTP, dTTP et dCTPaS, 35 mM de K2HP04 (pH 7,6), 4 g de BSA, 1,8 % (p/v) de tréhalose, 500 nM de chaque AA, 50 nM de chaque amorce " bumper " (AB), 1,8 U de BsoB1, 3,8 U d'exo Bst et diverses quantités d'ADN génomique cible. La

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concentration d'ADN cible a été déterminée en mesurant l'absorption à A260 et l'ADN a été dilué dans 100 ng/ l d'ADN génomique de placenta humain. L'ADN génomique de placenta humain (0,5 g) a été utilisé dans chaque réaction de
SDA comme ADN génomique externe pour simuler des échantillons cliniques.

Avant ajout du mélange d'enzymes (10 l contenant 1,8 U de BsoB1, 3,8 U d'exo Bst, 9 % (p/v) de tréhalose, 2 g de BSA et 87,5 mM de K2HP04), le mélange réactionnel incomplet (40 l, contenant tous les autres composants de la SDA) a été chauffé à 95 C pendant 5 minutes pour dénaturer les matrices, puis incubé pendant 2 minutes à 60 C pour permettre l'annelage des amorces aux matrices. Ensuite le mélange d'enzymes à température ambiante a été ajouté au mélange réactionnel incomplet. Le mélange réactionnel a été incubé à 60 C pendant 30 minutes puis placé une à deux minutes sur la glace pour arrêter la réaction.

3. Détection des produits de la SDA
Après la réaction de SDA, les produits de la SDA ont été visualisés avec du bromure d'éthidium colorant par électrophorèse sur gel d'acrylamide non dénaturant avec confirmation finale par hybridation électronique à des sondes de capture marquées à la biotine spécifiques de la cible immobilisées sur un réseau de micro-électrodes Nanogen comme décrit dans l'exemple 1. Une sonde marquée à la biotine non spécifique de la cible (gène femA de Staphylococcus aureus) a aussi été immobilisée sur le réseau comme contrôle négatif. Pour le test sur puce, des aliquots d'échantillons de SDA ont d'abord été dessalés à l'aide de colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin conformément aux procédures décrites dans le manuel du fabricant. De la Lhistidine (50 mM) a été utilisée comme tampon d'échange. L'échantillon dessalé (20 l) a été chauffé dans l'eau bouillante pendant 5 minutes pour dénaturer l'ADN et a été laissé sur de la glace jusqu'à utilisation. Les échantillons dénaturés ont été adressés électroniquement vers des emplacements désignés pendant 30 secondes à 400 nA/emplacement. La sonde reporter marquée au BTR (500 nM dans 1 XSTE) a été ajoutée à la cartouche et s'est hybridée avec les échantillons d'ADN pendant 5 minutes à 22 C. Après plusieurs lavages avec 0,2XSTE, la fluorescence de la cartouche a été examinée et les résultats ont été notés.

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4. Résultats
L'amplification multiplex est une stratégie permettant d'amplifier simultanément deux séquences ou plus. Chaque réaction d'amplification est spécifique mais plusieurs cibles sont amplifiées dans un seul mélange réactionnel. Au cours de l'amplification multiplex, l'efficacité d'amplification de chaque matrice est différente et certains produits sont produits avec une plus grande efficacité que d'autres. Il est difficile de co-amplifier plusieurs matrices sans ajuster certaines des conditions, en particulier lorsque le nombre de copies utilisé est faible (Chamberlain & Chamberlain, 1994. The Polymerase
Chain Reaction, Mullis et col. (eds), Birkhauser, Boston, p. 38-46). L'une des méthodes les plus efficaces consiste à ajuster la concentration de chaque jeu d'amorces. L'efficacité d'amplification pour chaque matrice des jeux d'amorces triplex avec les concentrations d'amorces standard a d'abord été testée. Les résultats ont indiqué que le gène le plus efficacement amplifié était le gène
SLTI et que le moins efficacement amplifié était le gène invA (figure 5). Il y a plusieurs raisons pouvant expliquer les variations d'efficacité. Tout d'abord, la température de fusion (Tf) de chaque jeu d'amorces est différente.

Deuxièmement, la Bst DNA polymérase peut ne pas incorporer le dCsTP aussi efficacement que le dCTP natif et des pourcentages de C différents dans les matrices entraînent des différences d'efficacité d'amplification. Troisièmement, l'efficacité de la SDA est étroitement liée à la taille de l'amplicon, l'efficacité de l'amplification diminuant de 5 à 100 fois pour chaque augmentation de 50 pb de la longueur de la cible (Walker, 1993, PCR Methods and Applications 3 :1-6). longueur de l'amplicon non cassé est de 93 pb pour SLTI, 96 pb pour yst et 103 pb pour invA. Quatrièmement, les interactions entre amorces sont différentes pour chaque jeu d'amorces individuel.

Sur la base des résultats de SDA pour l'amplification monoplex dans des jeux d'amorces triplex, plusieurs concentrations d'amorces ont été testées pour la co-amplification en conservant intacte la concentration d'amorces pour invA et en changeant la concentration d'amorces pour yst et SLTI. Une coamplification équivalente de deux ou trois cibles a été mieux réussie lorsque les concentrations de AA/AB ont été réduites à 400 nM/40 nM pour yst et à 200 nM/20 nM pour SLTI. D'autres paramètres de réaction n'ont pas été ajustés car nous avons obtenu des résultats cohérents avec ces paramètres de réaction pour amplifier plusieurs gènes cible différents provenant d'organismes différents, de la bactérie à l'être humain. Avec les concentrations d'amorces

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décrites ci-dessus, les trois matrices ont été très bien co-amplifées et les signaux spécifiques de cible ont été détectés à partir de 10 copies seulement de cible (figure 7). Il a également été remarqué que les signaux de fluorescence pour chaque cible de co-amplifications de trois matrices étaient plus forts que ceux de co-amplifications de deux matrices dans des jeux d'amorces triplex. L'électrophorèse sur gel a montré qu'il y avait moins de bandes d'arrière-plan dans la réaction d'amplification de trois matrices que dans la réaction d'amplification de deux matrices. On estime que ceci est dû à un nombre plus important d'amorces utilisé pour les amplifications spécifiques de cible dans la réaction d'amplification de trois matrices et qu'ainsi le nombre d'amorces libres laissées pour les interactions entre amorces et les amplifications PD était moindre. Lorsque deux matrices ont été amplifiées dans des jeux d'amorce triplex, le nombre d'amorces libres laissées pour une amplification non spécifique a été plus important.

En résumé, pour concevoir des amorces visant à éviter les interactions entre les amorces et en ajustant les concentrations d'amorces, il est possible d'amplifier trois séquences cible ou plus par SDA et d'obtenir une sensibilité proche de celle de la PCR multiplex sans autre ajustement des paramètres réactionnels.

EXEMPLE 3 Fabrication de ssDNA par SDA 1. Méthodes K2HP04 (pH 7,6) MgOAc, dATP, dGTP, dTTP, 2'-désoxycytosine 5'-0- (1-thiotriphosphate) (dDTPaS), tréhalose, BSA, enzyme de restriction BsoBI, exo Bst DNA polymérase, ADN génomique de Yersinia enterocolitica et ADN génomique de placenta humain, fournis gracieusement par Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD, USA). Les amorces ont été conçues selon la méthode décrite ici). Les oligonucléotides ont été synthétisés par Synthetic Genetics (San Diego, CA, USA) et sont présentés dans le tableau 3. Toutes les amorces d'amplification ont été purifiées par PAGE et les autres oligonucléotides ont été purifiés par HPLC. Les sondes reporter ont été synthétisées avec de l'amine 5' et conjuguées à du Rouge Texas Bodipy (BTR). Les sondes de capture ont été marquées à la biotine à

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l'extrémité 5'. Les colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin ont été acquises auprès de Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

TABLEAU 3 Oligonucléotides Amorce Séquence (SEQ ID NO :) ystAA3s AATGCTGTCTTCATTTGGAGCCTCGGGGCCAAGAAAC (6) ystAA3A GGCAACGGAGGATCACAAGCTCTCGGGTATACCTCA (8) ystAA4A GGCAACGGAGGATCACAAGCTCTCGGGTAT (28) ystAB2s ATGAAAAAGATAGTTTTTTGTTC (9) ystAB2A ATCCCAATCACTACTGAC(IO) ystCA (Biot-) GGTTATTGGTGTCGATAATG (29) ystRA (BTR-) CATCACTGAACTGCCCTGAA (30) ystCs (Biot-) CATTATCGACACCAATACC (11) ystRs (BTR-) TTCAGGGCAGTTCAGTGATG (12)
AA : amorce d'amplification ; AB : amorce " bumper " ; C : sonde de capture ; R : sonde reporter ; S : sens ; A : antisens ; le site de reconnaissance de la BsoBI est en gras.

2. Réactions d'amplification par déplacement de brin
Les réactions d'amplification ont été effectuées dans les conditions décrites dans l'exemple 1. Brièvement, les réactions de SDA ont été réalisées dans un volume de 50 l avec une concentration finale de 9,75 mM de MgOAc, 1,4 mM respectivement de dATP, dGTP, dTTP et dCTPaS, 35 mM de K2HP04 (pH 7,6), 4 g de BSA, 1,8 % (p/v) de tréhalose, 500 nM d'amorce d'amplification 1 (ystAA3s), 250 nM d'amorce d'arrêt (ystAA4A), 50 nM de chaque amorce " bumper ", 1,8 U d'enzyme de restriction BsoBI, 3,8 U d'exo Bst DNA polymérase et différentes copies d'ADN génomique de Y. enterocolitica dilué dans 100 ng/ l d'ADN génomique de placenta humain. La concentration finale d'ADN génomique de placenta humain était de 0,5 g par réaction. Ces composants ont été divisés en deux mélanges. Le mélange 1 (40 pl, contenant du MgOAc, du dNTPs, des matrices, des amorces, la moitié du BSA et du K2HPO4) a été chauffé à 95 C pendant 5 minutes pour dénaturer la matrice, puis à 60 C pendant deux minutes pour entraîner l'annelage des amorces et des matrices puis 10 l du mélange 2 (contenant le

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reste des composants de la SDA) ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été incubé à 60 C pendant trente minutes puis placé une à deux minutes sur la glace pour arrêter la réaction.

3. Détection des produits de la SDA
Les produits de la SDA ont été détectés par hybridation passive ou électronique avec des sondes de capture marquées à la biotine placées sur des réseaux de micro-électrodes comme décrit dans l'exemple 1. Brièvement, la sonde de capture oligonucléotidique spécifique de la cible marquée à la biotine et la sonde non spécifique de la cible ont été adressées électroniquement vers des emplacements désignés. Des aliquots des échantillons de SDA ont été dessalés en utilisant des colonnes de chromatographie Micro Bio-Spin conformément aux procédures décrites dans le mode d'emploi du fabricant. La L-histidine (50 mM) a été utilisée comme tampon d'échange. Pour l'hybridation de cible passive, des échantillons de
SDA non dessalés non dénaturés (20 l) ont été chargés dans la cartouche et hybridés passivement avec les sondes pendant 20 minutes à 37 C. Pour l'hybridation électronique, les échantillons dessalés ont d'abord été dénaturés par chauffage dans l'eau bouillante pendant cinq minutes. Les échantillons ont été adressés électroniquement vers des emplacements désignés. Les emplacements ont été lavés avec 50 mM de L-histidine. La sonde reporter marquée au BTR a été hybridée passivement avec l'ADN. Après lavage avec du STE, la fluorescence de la cartouche a été examinée et les résultats ont été notés.

4. Résultats
Si du ssDNA a été produit, les signaux ne devraient être détectés que lorsque la sonde reporter et la sonde de capture spécifique d'un brin de l'ADN amplifié ont été utilisées pour détecter les produits de la SDA par hybridation passive. Aucun signal ne devrait être détecté lorsque les sondes reporter et de capture spécifiques d'un autre brin ont été utilisées. L'expérience décrite dans cet exemple a été conçue pour fabriquer du ssDNA sens. Les résultats ont indiqué que des signaux ont été détectés lorsque des sondes reporter et de capture antisens ont été utilisées (Figure 8A). Aucun signal n'a été détecté provenant des sondes reporter et de capture sens. Les résultats ont démontré que du ssDNA a été fabriqué par cette méthode. Des signaux faibles ont aussi

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été détectés avec la SDA classique pour un nombre de copies cible de départ de 102 (figure 8A). On estime que les signaux faibles détectés avec la SDA classique ont été dus à une amplification légèrement irrégulière des deux brins.

L'hybridation électronique est influencée par les concentrations de sel dans les échantillons. Le dessalage de l'échantillon est nécessaire pour l'hybridation électronique. Lorsque des échantillons dessalés ont été utilisés pour l'hybridation électronique, les signaux ont été plus forts en comparaison avec les résultats de l'hybridation passive (figure 8B), ce qui signifie qu'une partie de l'ADN amplifié était double brin bien que les nombres de signaux absolus puissent parfois être trompeurs en raison des cartouches différentes et des conditions d'hybridation différentes. Les signaux provenant de produits de la SDA asymétrique ont été plus forts que les signaux provenant des produits de la SDA classique même par hybridation électronique car un certain pourcentage de l'ADN dénaturé forme à nouveau un annelage avec le dsDNA dans nos conditions d'hybridation et parce que la quantité de dsDNA générée par SDA asymétrique était plus faible. En utilisant les mêmes principes pour fabriquer du ssDNA pour le brin sens du gène yst et du gène SLTI d'E. coli, des résultats similaires ont été obtenus.

En résumé, cet exemple décrit une méthode de SDA simple pour générer du ssDNA. Aucune optimisation des conditions n'a été nécessaire pour les matrices d'ADN individuelles. Cette méthode peut être utilisée pour fabriquer des quantités détectables de ssDNA pour un test sur puce. Cette méthode fournit plus d'informations pour mettre au point un instrument totalement intégré capable de pratiquer l'amplification et la détection.

EXEMPLE 4 Amorces pour l'amplification par SSDA
Conformément à la présente invention, des amorces ont été conçues pour le gène sodB de Campylobacter, pour le gène de la toxine Shiga Il (SLTII) de E. coli et pour le gène ipaH de Shigella. Ces amorces sont présentées dans le tableau 4. Des amplifications SDA réussies ont été effectuées à l'aide de ces amorces.

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TABLEAU 4 Jeux d'amorces Amorce Séquence (SEQ ID NO :) sodBAAs gCTACAggAgTTTTTggTTCACTCgggTTTTggTTAgT (31) sodBAAA TAAAggAACTTTATCTTCAgTCTCgggTgTAgCTgCgT(32) sodBABs CAAAgCTgAATTTATCAAAg (33) sodBABA CATgTTCCCAAACATCTACA (34) SLTIIAAs CCACTCTgCAACgTgTCgCAgCTCgggAACCTTCCggAA (35) SLTIIAAA ATTACCACTgAACTCCATTAACTCgggATAAgATgAAA (36) SLTIIABs TCCATgACAACggACAgCAg (37) SLTIIABA TCTggATgCATCTCTggTCA (38) ipaHAAs ggTTCCCggAAAACAAACAATCTCgggTATCACAgA (39) ipaHAAA gAgACggTATCggAAAggCggCTCgggAACTCggAAAA (40) ipaHABs CCCTggCTgATgCCgTgACA(41) ipaHABA CggAATCCggAggTATTgCg (42)
AA : amorce d'amplification ; AB : amorce " bumper " ; C : sonde de capture ; R : sonde reporter ; S : sens ; A : antisens ; le site de reconnaissance de la 3soBI est en gras.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Oligonucléotide utile à une réaction d'extension d'amorce caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3'.

2. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence de liaison à la cible 5' comporte 1 à 50 nucléotides.

3. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence de liaison à la cible 3' comporte 5 à 30 nucléotides.

4. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence ne se liant pas à la cible comporte 1 à 30 nucléotides.

5. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que lequel la réaction d'extension d'amorce est l'amplification par déplacement de brin et dont la séquence ne se liant pas à la cible est le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction cassé par une enzyme de restriction au cours de l'amplification par déplacement de brin.

6. Oligonucléotide selon la revendication 1 caractérisé en ce que 1 à 10 nucléotides de la séquence de liaison à la cible 3' est(sont) un mésappariement.

7. Paire d'amorces d'amplification caractérisé en ce qu'elle comporte : a) une première amorce comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' et b) une deuxième amorce comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3'.

8. Kit caractérisé en ce qu'Il comporte : a) une paire d'amorces d'amplification selon la revendication 7 et b) un ou plusieurs détecteurs capable de détecter un produit amplifié.

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9. Procédé de détection de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique cible dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le traitement dudit échantillon à l'aide d'une paire d'amorces d'acide nucléique par une réaction d'extension d'amorce dans laquelle une première amorce comporte une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' et une deuxième amorce comporte une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' et b) la détection de tout produit d'acide nucléique amplifié, dans lequel la détection du produit amplifié indique la présence d'acide nucléique cible.

10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que lesdites séquences de liaison à la cible 3' comportent des mésappariements.

11. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que ladite réaction d'extension d'amorce est une amplification par déplacement de brin et ladite séquence ne se liant pas à la cible est le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction cassé par une enzyme de restriction pendant l'amplification par déplacement de brin.

12. Procédé d'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible d'un acide nucléique cible caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'hybridation avec l'acide nucléique i) d'une première amorce d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' et ii) d'une seconde amorce d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' et b) l'extension des première et seconde amorces d'amplification hybridées sur la séquence d'acide nucléique cible au cours d'une réaction d'extension d'amorce par laquelle la séquence cible d'acide nucléique est amplifiée.

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13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que lesdites séquences de liaison à la cible 3' comportent des mésappariements.

14. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détection de l'acide nucléique cible amplifié par hybridation avec une sonde détecteur.

15. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que ladite réaction d'extension d'amorce est une amplification par déplacement de brin et ladite séquence ne se liant pas à la cible est le site de reconnaissance d'une enzyme de restriction cassé par une enzyme de restriction pendant l'amplification par déplacement de brin.

16. Procédé de fabrication d'ADN simple brin au cours d'une réaction d'extension d'amorce caractérisé en ce qu'il comporte ;les étapes suivantes : a) l'hybridation avec un acide nucléique i) d'une première amorce d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3', ii) d'une seconde amorce d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' pour laquelle la séquence de liaison à la cible 3' comporte 2 à 7 nucléotides de la séquence de liaison à la cible 3' de ladite première amorce et iii) d'une troisième amorce d'amplification comportant une séquence de liaison à la cible 5', une séquence ne se liant pas à la cible et une séquence de liaison à la cible 3' ; et b) l'extension des première, seconde et troisième amorces d'amplification avec la séquence d'acide nucléique cible au cours d'une réaction d'extension d'amorce dans laquelle de l'ADN simple brin complémentaire de la séquence d'acide nucléique cible est amplifié.

17. Procédé selon la revendication 16 caractérisé en ce que ladite réaction d'extension d'amorce est l'amplification par déplacement de brin et ladite séquence ne se liant pas à la cible est le site de reconnaissance d'une enzyme

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de restriction cassé par une enzyme de restriction au cours de l'amplification par déplacement de brin.

18. Molécule d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend un oligonucléotide sélectionné dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ I D Nos : 1 à 42.

19. Molécule d'ADN selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ ID Nos : 1, 2, 5-8, 14-17,22, 23, 28,31, 32,35, 36,39 et 40.

20. Molécule d'ADN selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ ID Nos : 3, 4, 9,10, 18, 19, 24, 25, 33, 34, 37, 38, 41 et 42

21. Molécule d'ADN selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ ID Nos : 11, 20, 26 et 29.

22. Molécule d'ADN selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ ID Nos : 12, 21, 27 et 30.

23. Molécule d'ADN selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit oligonucléotide est choisi dans le groupe comportant les oligonucléotides de séquences SEQ ID No : 13.

24. Molécule d'ADN selon la revendication 19 caractérisée en ce que le site de restriction de l'endonucléase de restriction CTCGGG est remplacé par une séquence ne se liant pas à la cible.