WO1998006828A1 - Phage lie au signal de localisation nucleaire - Google Patents

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protein
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fusion protein
nuclear
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Mahito Nakanishi
Emi Nagoshi
Teruo Akuta
Katsuo Takeda
Mamoru Hasegawa
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Dnavec Research Inc.
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    • C12N2795/10341Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10343Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to the field of genetic engineering, particularly to the transport of foreign substances using virus particles. 3 ⁇ 4 technology
  • Gene transfer technology that artificially introduces foreign genes into cells is not only a basic technology for analyzing various life phenomena, but also opens the way to meaningful applications for human beings, such as gene therapy and the creation of useful animals. This is an important technology.
  • This gene transfer technology is roughly divided into two methods. One is a biological method using a virus in which a foreign gene has been introduced, and the other is a physical method in which a foreign gene is physically introduced into cells.
  • the virus-based method is based on the principle that cells are infected with a recombinant virus containing the gene of interest and the virus genome is integrated into the cell's genome.
  • ADA Resh'Nyhan syndrome and adenosine deaminase
  • a physical method of introducing a non-viral vector is currently used in parallel with a method using a virus.
  • a method has been established in which a chemical substance such as calcium phosphate, DEAE-dextran, polycation, ribosome, and the like is combined with a non-viral drug and introduced into cells.
  • Physical methods have the problem that the efficiency of gene transfer into cells is low, and the probability that a foreign gene on a non-viral vector that has been transferred reaches the cell nucleus is low. Had many problems to overcome.
  • a nuclear translocation signal is present in the capsid protein, and it is known that they function to actively translocate DNA into the nucleus in the early stage of infection. (Urs. F. Greber and Harumi Kasajnatsu. Trends in Cell Biology vol 6, 189-195 (1996)). It has also been suggested that 45 nm diameter SV40 particles can enter the nucleus as they are.
  • An object of the present invention is to provide a system that allows a gene introduced into a cell to reach the nucleus. More specifically, an object of the present invention is to provide a human phage capable of exposing a nuclear localization signal to the outer surface of the head and capable of packaging long-chain DNA.
  • the present inventors are able to compactly package a desired long-chain DNA in vitro and protect the DNA from attack by an external DNase.
  • the present inventors have paid attention to the fact that a capsid protein of a virus that infects an animal has a nuclear translocation signal, whereby the virus enters the nucleus as a particle, and provides a nuclear translocation signal.
  • preparing the prepared ⁇ phage head we attempted to actively transfer DNA to the nucleus. Specifically, the present inventors have taken the following measures.
  • a vector that expresses a fusion protein of the gpD protein, one of the proteins that make up the human phage head, and a nuclear localization signal sequence was infected with a mutant phage that cannot express the gpD protein in E. coli (hereinafter, simply referred to as “D amber phage”). It was confirmed that the mutated human phage was complemented by the fusion protein of the gpD protein expressed from the vector 1 and the nuclear localization signal sequence, and that a human phage having a head with a nuclear localization signal was obtained. It was confirmed by Western blotting using gpD antibody. That is, they found that the fusion protein expressed in Escherichia coli was complementarily integrated into the head of a phage that did not express the protein.
  • a vector expressing a fusion protein of the gpD protein and the nuclear localization signal sequence was introduced into E. coli in which the mutant human phage was lysogenized, and the lysogen phage was thermally induced. Emitted with similar results.
  • the vector expressing the fusion protein was introduced into Escherichia coli in which D amber phage had been lysogenized, and the transformant was heat-induced.
  • a phage having a gpE protein head without the fusion protein being incorporated into the phage head becomes EDTA-sensitive, but a phage into which the fusion protein is incorporated exhibits EDTA resistance.
  • phage having a nuclear translocation signal exposed on the outer surface of the head are injected into human fetal lung cells, HEL-R66 cells, by the microinfusion method, and the phage has nuclear translocation activity.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a ⁇ phage that can package a macromolecule such as long chain DNA and has a nuclear localization activity.
  • nuclear transport signal comprises the sequence according to any of SEQ ID NOs: 1 to 4,
  • the protein containing a nuclear localization signal is a fusion protein of a nuclear localization signal and a phage head protein
  • the fusion protein according to (6), wherein the nuclear transport signal comprises the sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4,
  • a method of transferring a desired substance to be transferred to the nucleus to the nucleus of a desired cell comprising:
  • a foreign substance is packaged at a phage head to which a nuclear transport signal is added, the phage is introduced into a desired cell in which the foreign substance is desired to function, and the foreign substance together with the phage particles is transferred to the nucleus of the target cell.
  • the nuclear transport signal used in the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of transporting the substance having the signal sequence added to the nucleus.
  • SV40VP1 SV40 large T antigen
  • hepatitis D virus 5 antigen nuclear translocation signal, SV40 large T antigen nuclear translocation signal, the smallest unit having nuclear translocation activity, rPKKKRKV (This sequence is Stated (According to one-letter code)).
  • the phage used in the present invention is not particularly limited as long as a foreign substance can be packaged on its head, and human phage, M13 phage and the like can be used.
  • Various methods can be considered for preparing a phage using a protein containing a nuclear transport signal as a component of the head, such as a method of chemically binding the signal sequence to a protein of the phage head,
  • the DNA encoding the signal sequence is ligated to the gene encoding the phage head protein, integrated into a vector, expressed as a fusion protein in a bacterial host, and further mutated into a vector that cannot express the head protein.
  • growing the phage in the host to form a phage head is not particularly limited, and various vectors are used.
  • the bacterial host is not particularly limited as long as the phage to be used is capable of growing.
  • the chemical bond between the nuclear localization signal sequence and the protein on the phage head is not limited to the case where the sequence is directly linked to the protein, but also includes the cross-linking agent, spacer, and the like. Includes cases where In addition, the binding of the DNA encoding the nuclear localization signal sequence to the gene encoding the protein of the phage head protein is not only when directly linked, but also when a spacer nucleotide is interposed therebetween. included.
  • the phage head protein used here is not particularly limited.
  • the phage is a human phage
  • gpD protein and gpE protein can be mentioned.
  • gpE protein can be mentioned.
  • Ml3 protein can be mentioned.
  • the phage of the present invention is introduced into cells after packaging a foreign substance.
  • the method of packaging is the method of Ishiura et al. (Gene, 82, 281-289 (1989)) ⁇ Sternberg ( Sternberg) et al. (Registration No. 59-500042).
  • foreign substances include genes, gene fragments, lipozymes, antisense genes, and other substances desired to function in the nucleus. For example, when performing gene therapy, it is effective to use a normal gene or the like corresponding to a defective gene, and when analyzing the function of a particular gene, it is effective to use an anti-gene against the gene. W
  • Methods for introducing a phage packaged with a foreign substance into cells include microinjection, lipofection, ribosome method, HIV-liposome method, immo ribosome method, pH-sensitive ribosome method, erythrocyte ghost method, and DEAE.
  • -Dextran method method using cell surface receptor endocytosis, method using specific antigen on cell surface, method using synthetic polymer carrier, use of particle gun, etc.
  • There are no particular restrictions on the cells into which the phage containing the foreign substance is introduced and various cells may be used depending on the purpose.
  • FIG. 1 is a diagram showing fusion proteins of various nuclear localization signals and gpD protein which is a human phage head protein.
  • FIG. 2 is a micrograph showing the nuclear translocation activity of human phage bound to a nuclear translocation signal by a cross-linking agent.
  • Figure 3 is a photomicrograph showing the nuclear translocation activity of human phage with the nuclear translocation signal exposed on the head surface.
  • 5′-GTAAGCCATGGTTATGACGAGCAAAG-3 (the Ncol site is present in the 5th to 6th to 11th sequences) (SEQ ID NO: 5) and 5′-GTTCGAATTCCTATT AAACGATGCTGATTGCC-3 '(the ⁇ RI site is present in the 5th to 10th sequence on the 5' side) (SEQ ID NO: 6) was used as a primer, and a phage gene (7.90 D / ml, manufactured by T0Y0B0) 20 g Was digested with Apal and ApaLI, and a fragment containing the gpD gene of about 4 kb was used as type III.
  • PCR was performed using 0.2 / g type II, 10X Reaction buffer (Pharmacia, 500 mM KC1, 15 mM
  • a fusion protein of a nuclear localization signal and gpD was expressed in Escherichia coli, and a nuclear transfer signal binding phage was constructed.
  • the nuclear transport signal three types of nuclear transport signals of SV40VP1, SV40 large T antigen, and hepatitis D virus 5 antigen, which have been confirmed by the present inventors as effective (SEQ ID NO: 1, (Indicated by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) and (1) a fusion protein of rp KKRKV (SEQ ID NO: 4), which is the minimum unit of nuclear translocation signal, with sugar protein, (2) nuclear translocation Only the smallest unit of signal, "PKKKRKV", uses two types of nuclear translocation signals Was.
  • angiotensin ⁇ ⁇ polypeptides which are not nuclear translocation signals
  • a fusion protein with a single protein was also used (6 types in total) ( Figure 1).
  • oligo DNA corresponding to this nuclear localization signal sequence was synthesized and introduced into the Ncol site of pTrcHisA-gpDj. After confirming that the plasmid was constructed correctly by the cycle sequence method, The vector was introduced into E. coli T0P10, and the fusion protein between the nuclear localization signal and the gpD protein was highly expressed in E.
  • the expression of the protein was determined by SDS-PAGE using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). As a result, a strong band was detected at the position of the molecular weight of the target protein at 6 hours after induction with the IPTG of ⁇ , and the D amber phage was infected to examine the black-forming ability.
  • SV40 large SV antigen hepatitis D virus (5 antigens, fusion protein of eight angiotensin II polypeptides and sugar protein) Plaques were formed using the same type of peptide, and when the titers were compared, all were recovered in the order of 10 to the 10th power, but the plaque formation time was 10 hours with SV40 large ⁇ antigen, The hepatitis D virus antigen was delayed compared to normal 6 hours, such as 18 hours (Table 1).
  • Example 2 Packaging of human phage genome by human phage binding to nuclear transport signal
  • E. coli 594 a method of heat-inducing lysogenic phage (E. coli 594) and 80% genomic phage, which is expected to have higher phage formation ability, is used below.
  • Escherichia coli 594 ADaml5 clts857 Sam7
  • 100% genomic phage is lysogenized and cl, a repressor, is temperature-sensitive. C15 minutes of processing will release the reblesser.
  • the E. coli at sup ° cannot construct the head, but can construct only the tail.
  • the E. coli lysogenic the input phage w3350thy- (AcI847 Sajn7) were cultured in 32 ° C in LB (thy) medium, 25 objects containing the logarithmic growth phase (2xl0 8 cells / ml) at 45 ° C
  • the phage was induced by shaking for minutes. Then, after shaking at 39 ° C for 3 hours, centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes, and precipitated E. coli, SM buffer solution (0.1 M NaCl, 8 mM MgSO ⁇ , 0.01% gelatin, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)) Suspended in water. 37.
  • a cross-linking agent (SMPB; Pierce) was used for cross-linking the nuclear translocation signal with ⁇ phage.
  • SV40 large T antigen SEQ ID NO: 2
  • the human phage was adjusted to 1.1 mg / ml with a buffer solution (0.1 M NaCl, 8 mM MgSO 20 mM Hepes ⁇ NaOH (pH 7.0)).
  • a buffer solution 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO 20 mM Hepes ⁇ NaOH (pH 7.0)
  • 25 Add lOmM SMPB dissolved in anhydrous DMSO at a 5000-fold molar ratio to phage particles. Incubated at C for 1 hour.
  • This buffer (0.1M NaCl, 8mM gS0 4, 20mM Tris-HCl (pH7.5)) Day ⁇ was dialyzed to obtain a SMPB qualified input phage excluding SMPB unreacted.
  • Synthetic peptide for nuclear translocation signal (Sady Technology Co., Ltd.) is dissolved in equimolar amount of SMPB in 20 mM Tris ⁇ HC1 at pH 8.0 containing 0.1 M NaCl, and DTT is added to 50 mM, 37 ° C. The reduction reaction was performed at C for 1 hour.
  • Buffer - After removing the DTT by gel filtration (0.1MN aCl, 8mM MgS0 4j 20mM Hepes NaOH (pH7.0)), in addition to the SMPB-modified phage, and allowed to react for 3 hours at 25 ° C. Add 1 ml of 10% sucrose solution (containing 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO 20 mM Hepes and NaOH (pH 7.0)) to the lower layer of the centrifuge tube, and add the solution after the reaction to the upper layer, and 2,000 rpm (Beckman TLS) at 4 ° C.
  • sucrose solution containing 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO 20 mM Hepes and NaOH (pH 7.0)
  • Nuclear translocation signal binding phage is located in the cytoplasm of cells cultured on Exp. Ce 11. Res. 170, 439-452 (1987) T. Tachibana et al. J Biol Chem, vol. 269, 24542-24545 (1994)) according to the method described in the literature. After the injection, the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes to 4 hours, and PBS ( ⁇ ) containing 3.7% formaldehyde was added and fixed at room temperature for 20 minutes. The time range of the incubation before immobilization (5 minutes to 4 hours) was set to confirm how long after the injection, the nuclear translocation signal-binding human phage reaches the nucleus. It is.
  • the cells were treated with 0.5% TritonX-100 for 5 minutes at room temperature, and further immersed in 10% Block Ace (Odaimoto Pharmaceutical) to perform blocking at room temperature for 1 hour. Then, a 500-fold dilution of Persian human phage serum (provided by Dr. Hideyuki Ogawa, Faculty of Science, Osaka University) was reacted as a primary antibody for 1 hour at room temperature. ml) was reacted as a secondary antibody at room temperature for 1 hour, and nuclear localization signal binding in the cells was examined by fluorescence microscopy to examine phage localization.
  • Block Ace Odaimoto Pharmaceutical
  • LT-phage 80 ° genomic phage expressing 10 mg of the obtained affinity purified antibody and SV40 large T antigen. Reaction was carried out overnight at C. To this was added 100 ml of ProteinA-Sepharose 4B (Pharmacia, 50% slurry), and allowed to react at room temperature for 1 hour to absorb.
  • Plasmid expressing the SV40 large T antigen and gpD fusion protein was introduced into E. coli T0P10 in which 80% genomic D amber phage was lysogenized. This was cultured at 32 ° C in LBUOmM MgSCK lOOmg / ml (Ambicilin) medium, and those that entered the logarithmic growth phase ⁇ xlOells / ml) were shaken at 45 ° C for 20 minutes to generate phage. Triggered. Then, in the presence of lmM IPTG, after shaking at 39 ° C. for 3 hours, and centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to precipitate the E.
  • coli-buffer solution (lOmM Tris-HCl (pH7.5), lOmM MgS0 ⁇ , 0.01% gelatin, lOmMput reseine).
  • the concentrated bacteria were lysed by adding black-mouthed form at 37 ° C and stirring. Further, after adding DNase, insoluble materials were removed by centrifugation at 8000 rpm for 30 minutes. The supernatant was added with 10% polyethylene glycol # 6000 and 1M NaCl, treated at 0 ° C for 2 hours, and then centrifuged at 8000 rpm for 30 minutes to precipitate the phage, which became turbid in e-buffer solution. The collected phage particles were purified using cesium chloride density gradient ultracentrifugation.
  • the phage particles were dissolved at a concentration of 2 mg / ml with a human-buffer solution, and microinjection was performed in the same manner as in Example 3 (3).
  • the primary antibody used for the detection was a serum prepared by sensitizing wild type phage with porcine indoor adjuvant to Egret.
  • the nuclear translocation activity was detected.
  • the phage bound to the nuclear localization signal aggregated into the nucleus after 30 minutes (Fig. 3 lower).
  • a nuclear transfer signal binding phage capable of translocating to the nucleus by packaging a macromolecule such as long chain DNA. This makes it possible, for example, to allow a desired foreign gene to reach the nucleus as a long-chain DNA including its upstream region, and is expected to be effectively used in various fields such as elucidation of life phenomena and gene therapy.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid synthetic DNA
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書 核移行シグナル結合ファージ
本発明は遺伝子工学の分野、 特にウィルス粒子を用いた外来物の輸送の分野に 関する。 ¾技術
細胞に外来遺伝子を人為的に導入する遺伝子導入技術は、 様々な生命現象を解 析するための基礎技術としてのみならず、 遺伝子治療や有用動物の作出など人類 にとって有意義な応用への道を切り開く重要な技術であるといえる。 この遺伝子 導入技術には、 大きく分けて 2つの方法が用いられている。 1つは、 外来遺伝子 を導入したウィルスを用いる生物学的方法であり、 もう 1つは、 外来遺伝子を物 理的に細胞内へ導入する物理的方法である。
ウィルスを用いる方法は、 目的の遺伝子を組み込んだ組み換えウィルスを細胞 に感染させ、 ウィルスゲノムごと細胞のゲノムに組み込ませるという原理に基づ いており、 現在、 レッシュ 'ナイハン症候群やアデノシンデアミナーゼ (ADA) 欠損症などに対する遺伝子治療の基盤技術として最も注目されている方法である。 しかし、 この方法は、 ウィルスの生物学的特性をそのまま用いているため、 ウイ ルスの病原性など様々な問題が指摘されてきた。 このことからレトロウィルスに おいては、 現在、 ウィルスの病原性や複製に関する領域をゲノムから除去した改 変ベクターが開発されているが、 このような改変べクタ一であっても望ましくな い影響が細胞に現れる可能性があり、 また***している細胞にしか感染できない など多くの問題点がいまなお存在している。
そこで、 現在はウィルスを用いる方法と並行して、 非ウィルスベクターを導入 する物理的方法が用いられている。 この物理的方法では、 これまでリン酸カルシ ゥム、 DEAE-デキストラン、 ポリカチオン、 リボソームなどの化学物質と非ウイ ルスぺク夕一とを組み合わせて細胞内に導入する方法が確立されている。 しかし、 物理的方法では、 遺伝子の細胞への導入効率が低く、 さらには導入された非ウイ ルスベクター上の外来遺伝子が細胞核内へ到達する確率が低いという問題点があ り、 遺伝子治療などへの応用には多くの克服すべき問題があつた。
一方、 近年、 真核細胞の核内に輸送され核内で機能するタンパク質には、 核内 に輸送されるシグナルの役割を果たす特定のアミノ酸配列 (NLS ; nuclear local ization signal) が存在することが報告された (G.Garcia-Bustos et al.Bioche m Biophys Acta, 1071,83-101(1991)) 。 さらに、 本来核に移行しないタンパク に核移行シグナルを付加すると、 核内への移行活性が付与されるという報告もな された (R.E.Lanford et al. Cell, 46, 575-582(1986)、 Y.Yoneda et al. Exp Ce 11 Res, 170,439-452(1987), D. Che 1 sky et al. Mol Cell Biol, 9,2487-2492( 198 9)) 。 この知見に基づいて、 核移行シグナルを用いて、 物理的方法により導入さ れた遺伝子の核内への到達率を高める研究が進められている。 即ち、 DNAをでき るだけ核膜孔 40nmに近いサイズまで凝集させ、 この凝集物に核移行シグナルを付 与し、 DNAを積極的に核に移行させる手法が研究されている。 例えば、 ポリ L-リ ジン (Jose C.PERALES et al. E. J.B.266,255-266( 1994)) 、 カチォニックリポ ソ一ム (J.Zabner et al. J.B.C.270, 18997-19007( 1995)) の他、 HMG- 1やヒスト ンなどのタンパク質などを用いて、 DNAをコンパク卜にする研究が行われてきた。 しかしながら、 このような合成化学的アブローチによる方法では、 DNAとの複 合体の溶解性や均一性に問題があったり、 また、 塩濃度により DNAの凝集の度合 いが変化するという問題があった。 さらには、 この複合体の構築条件が強アル力 リという極めて狭い範囲に限られ、 生理的条件下では構築できないなど実用化に 至るまでに克服すべき多くの問題点を抱えていた。
なお、 アデノウイルスや SV40ウィルスなど動物に感染するウィルスでは、 キヤ プシドタンパク質に核移行シグナルが存在しており、 感染の初期において DNAを 積極的に核内へ移行させる働きをしていることが示唆されている (Urs.F.Greber and Harumi Kasajnatsu. Trends in Cell Biology vol 6,189-195(1996)) 。 ま た、 直径 45nmの SV40粒子が、 核内に粒子のまま進入することも示唆されている
(K.Hummeler et al. J Viol,6, 87-93(1970)) 。 さらに、 MS-2ファージでは、 外 来の物質をキヤプシドで包む輸送系が報告されている (特表甲- -508168) 。 しかし、 長鎖 DNAを利用でき、 かつ、 該 DNAを核へ移行させることが可能な輸送系としてゥ ィルス粒子を用いた報告例はない。
¾明の開^
本発明は、 細胞内に導入した遺伝子を核内へ到達させるシステムを提供するこ とを課題とする。 より具体的には、 本発明は、 核移行シグナルを頭部外面に露出 し、 かつ長鎖 DNAをパッケージングできる人ファージを提供することを課題とす る。
長鎖 DNAを核へ移行させるためには DNAを核膜孔 40η に近いサイズにまでコンパ クトに凝集させる必要がある。 そこで、 本発明者らは、 所望の長鎖 DNAをインビ トロ (in vitro) でコンパク トにパッケージングすることが可能であり、 しかも 該 DNAを外部の DNA分解酵素 (DNase) の攻撃から保護することが可能な久ファ一 ジの頭部に着目し、 これを DNAのキャリア一として用いた。 さらに、 本発明者ら は、 動物に感染するウィルスのキヤプシドタンパク質には核移行シグナルが存在 し、 これによりウィルスが粒子のまま核内に進入することに着目し、 核移行シグ ナルを付与した λファージ頭部を調製することによって、 DNAを積極的に核へ移 行させることを試みた。 具体的には、 本発明者らは、 以下の手段を講じた。
まず、 人ファ一ジの頭部を構成するタンパク質の 1つである gpDタンパク質と 核移行シグナル配列との融合タンパク質を発現するべクタ一を構築し、 このべク 夕一で大腸菌を形質転換し、 さらに大腸菌内で gpDタンパク質を発現できない変 異人ファージ (以下、 単に 「Dアンバーファージ」 と称する) をこの形質転換体 に感染させた。 これによりベクタ一から発現した gpDタンパク質と核移行シグナ ル配列との融合タンパク質によって変異人ファージが相補され、 核移行シグナル を付与した頭部を有する人ファージが得られることを、 プラークの形成及び抗 gp D抗体を用いたウエスタンブロッテイング法により確認した。 即ち、 大腸菌に発 現させた融合タンパク質が、 該タンパク質を発現しないファージの頭部に相補的 に組み込まれることを見いだした。
次に、 変異人ファージを溶原化させた大腸菌に、 gpDタンパク質と核移行シグ ナル配列との融合タンパク質を発現するベクターを導入し、 溶原ファージを熱誘 発して同様の結果を得た。 貝-体的には、 まず、 Dアンバーファージが溶原化して いる大腸菌に、 上記融合タンパク質を発現するべク夕一を導入し、 該形質転換体 の熱誘発を行った。 この際、 融合タンパク質がファージ頭部に組み込まれずに gp Eタンパク質からなる頭部を有するファージは、 EDTA感受性となるが、 融合タン パク質が組み込まれたファージは、 EDTA抵抗性を示す。 次いで、 得られたファー ジを EDTAで処理し、 力価を測定したところ、 80%ゲノムサイズの DNAをパッケ一 ジングした人ファージが構築されることが判明し、 融合タンパク質がファージ頭 部に組み込まれていることを確認した。 さらに該ファ一ジにおいて核移行シグナ ルが頭部外面に露出していることを確認した。 また、 100%ゲノムサイズの DNAを 用いた場合でも、 同様に融合タンパク質が組み込まれたファージが形成されるこ とを確認した。 さらに、 核移行シグナルを頭部外面に露出させたファージをマイ クロインジヱクシヨン法により、 ヒト胎児肺細胞である HEL- R66細胞に注入して、 該ファージが核への移行活性を有することを証明し、 これにより本発明を完成し た。
即ち、 本発明は、 長鎖 DNAなど巨大分子をパッケージングでき、 かつ、 核移行 活性を有する λファージに関し、 より具体的には、
( 1) 核移行シグナルを含むタンパク質を頭部の構成成分として含むファージ またはその頭部、
(2) 核移行シグナルが、 配列番号 1〜4のいずれかに記載の配列を含む、 ( 1) 記載のファージまたはその頭部、
(3) ファージがえファージである、 ( 1) 記載のファージまたはその頭部、
(4) 核移行シグナルを含むタンパク質が、 核移行シグナルとファージ頭部夕 ンパク質との融合タンパク質である、 (3) 記載のファージまたはその頭部、
(5) ファージ頭部タンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である (4) 記載 のファージまたはその頭部、
(6) 核移行シグナルとファージ頭部を形成するタンパク質との融合蛋白質、
(7) 核移行シグナルが、 配列番号 1〜4のいずれかに記載の配列を含む、 (6) 記載の融合タンパク質、
(8) ファージがえファージである、 (6) 記載の融合タンパク質、 (9) ファージ頭部を形成するタンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である (6) 記載の融合タンパク質、
(10) (6) 〜 (9) のいずれかのタンパク質をコードする DNA、
(11) (10) 記載の DNAを含むベクター、
(12) (11) 記載のベクタ一を保持する細菌宿主、
(13) 大腸菌である (12) 記載の細菌宿主、
(14) (a) (12) または (13) 記載の細菌宿主と、 (b) 該細菌宿主が発現 する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が由来するファージ (ただし、 該 頭部タンパク質を該細菌中で発現できない) とを含む、 細胞の形質転換に用いる キッ ト、
(15) ファージが人ファージである (14) 記載のキッ ト、
(16) 細菌宿主が発現する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が、 入フ ァ一ジ Dタンパク質である、 (14) 記載のキッ ト、
(17) (a) 核に移行させたい所望の物質を ( 1) 記載のファージまたはその 頭部にパッケージングする工程と、 (b) 該ファージまたはその頭部を所望の細 胞に導入する工程とを含む、 核に移行させたい所望の物質を所望の細胞の核に移 行させる方法、
(18) 所望の物質が核酸である、 (17) 記載の方法、
(19) ファージがえファージである、 (17) 記載の方法、
(20) 細胞が哺乳動物細胞である (17) 記載の方法、
に関する。
本発明は、 核移行シグナルの付加したファージ頭部で、 外来物をパッケージン グし、 該ファージを、 外来物を機能させたい所望の細胞に導入し、 ファージ粒子 ごと外来物を標的細胞の核へ移行させる技術に関する。
本発明に用いられる核移行シグナルとしては、 このシグナル配列を付加した物 質を核へ移行させる活性を有する限り、 特に制限はないが、 例えば、 人ファージ 粒子を核へ移行させる場合には、 SV40VP1、 SV40ラージ T抗原、 または D型肝炎ゥ ィルス (5抗原の核移行シグナル、 SV40ラージ T抗原核移行シグナルのうち核移行 活性を有する最小単位である rPKKKRKV (この配列は、 生化学辞典第 2版記載の 1文字コードに従った) 」 を含む配列などを用いるのが好適である。
また、 本発明に用いられるファージとしては、 その頭部に外来物をパッケージ ングすることが可能であれば、 特に制限はなく、 人ファージ、 M13ファージなど を用いることが可能である。
核移行シグナルを含むタンパク質を頭部の構成成分としたファージを調製する 方法としては、 種々の方法が考えられるが、 例えば、 該シグナル配列をファージ 頭部のタンパク質に化学的に結合させる方法や、 該シグナル配列をコードする DN Aとファージ頭部タンパク質をコードする遺伝子を結合させてベクタ一に組み込 み、 細菌宿主内で融合タンパク質として発現させ、 さらに該頭部タンパク質を発 現できない変異ファ一ジを該宿主中で増殖させてファージ頭部を形成させる方法 などが挙げられる。 この場合に用いられるベクタ一としては、 特に制限はなく、 種々のベクターが用いられる。 また、 細菌宿主としては、 用いるファージが増殖 可能であれば特に限定されないが、 例えば、 人ファージを用いる場合には、 該フ ァ一ジが増殖可能な種々の大腸菌株が挙げられる。 なお、 核移行シグナル配列と ファージ頭部のタンパク質との化学的な結合には、 該配列とタンパク質とが直結 している場合のみならず、 問に架橋剤ゃスぺーサ一ぺブチドなどが挟まれている 場合も含まれる。 また、 核移行シグナル配列をコードする DNAとファージ頭部夕 ンパク質をコードする遺伝子との結合には、 直結している場合のみならず、 間に スぺーサ―ヌクレオチドが挟まれている場合も含まれる。
ここで用いられるファージ頭部タンパク質としては、 特に制限はなく、 例えば、 ファージが人ファージであれば、 gpDタンパク質及び gpEタンパク質が挙げられ、 またファージが Ml 3であれば、 gene 3 proteinが挙げられる。
本発明におけるファージは外来物をパッケージングした上で、 細胞に導入され るが、 このパッケージングの方法としては、 石浦らの方法 (Gene, 82, 281- 289( 19 89) ) ゃスターンベルグ (Sternberg) らの方法 (登録昭 59-500042) などが挙げ られる。 また外来物としては、 遺伝子、 遺伝子断片、 リポザィム、 アンチセンス 遺伝子、 その他核で機能させたい所望の物質が挙げられる。 例えば、 遺伝子治療 を行う場合には、 欠陥遺伝子に対応する正常な遺伝子などを用いることが有効で あり、 また、 特定の遺伝子の機能を解析する場合には、 該遺伝子に対するアンチ W
センス遺伝子などを用いることが有効である。 さらに、 トランスジヱニック動物 を作出する場合には、 与えたい形質に関与する遺伝子を導入することが有効であ る。 なお、 本発明によれば、 上流域も含めた形の遺伝子など、 長鎖の核酸をパッ ケージングすることが可能である。
外来物をパッケージングしたファージを細胞内に導入する方法としては、 マイ クロインジェクション法、 リポフエクシヨン法、 リボソーム法、 HIV-リポソ一ム 法、 ィムノ リボソーム法、 pH感受性リボソーム法、 赤血球ゴース ト法、 DEAE-デ キス トラン法、 細胞表面の受容体のエンドサイ トーシスを利用する方法、 細胞表 面の特異的抗原を利用する方法、 合成高分子キャリアーを利用する方法、 パーテ ィクル銃などの利用が可能である。 外来物をパッケージングしたファージが導入 される細胞としては、 特に制限はなく、 目的に応じて様々な細胞が用いられる。 図面の簡単な説明
図 1は種々核移行シグナルと人ファージ頭部タンパク質である gpDタンパク質 との融合タンパク質を示す図である。
図 2は架橋剤により核移行シグナルを結合した人ファージの核移行活性を示 す顕微鏡写真である。
図 3は核移行シグナルを頭部表面に露出させた人ファ一ジの核への移行活性 を示す顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。
[実施例 1 ] 核移行シグナル結合人ファージの構築
野生型のえファージ遺伝子を銪型として、 PCR法により、 えファージ頭部を構 成するタンパク質の 1つである gpDタンパク質の cDNAをクローニングした。 PCRは、 スターンベルグ (Sternberg) らの方法 (Sternberg et al. PNAS 92, 1609-1613 ( 1995)) に従った。 具体的には、 5' -GTAAGCCATGGTTATGACGAGCAAAG-3, (5,側の 6〜 11番目の配列に Ncol部位が存在する) (配列番号: 5 ) 及び 5' -GTTCGAATTCCTATT AAACGATGCTGATTGCC-3' (5'側の 5〜10番目の配列に ^RI部位が存在する) (配列 番号: 6 ) をブライマーとし、 えファージ遺伝子 (T0Y0B0社製、 7. 90D/ml) 20〃 gを Apal及び ApaLIで切断し、 約 4kbの gpD遺伝子を含む断片を銪型として用いた。
PCRは、 0.2 /gの銪型、 10 X Reaction buffer (pharmacia社製、 500mM KC1、 15mM
MgCh. lOOmM Tris-hcL(pH9.0)) 、 1〃Mのブライマ一、 50 zM dNTP、 100〃1の 5U
Taq DM polymerase (pharmacia社製) を用い、 90°Cで 3分の熱変性、 55°Cで 2分 のアニーリング、 72°Cで 3分の伸 長反応の後、 「90。Cで 3分の熱変性、 55°Cで 2分 のアニーリング、 72°Cで 10分の伸長反応」 のサイクルを 25サイクルを行った。 こ れにより増幅された DNA断片を、 大腸菌の発現べクタ一 pTrcHisA ( In nitrogen ) の NcoI、 部位に導入した。 該ベクタ一を 「pTrcHisA-gpD」 と称する。 サ ィクルシークェンス法により、 DNA配列を確認した後、 該ベクタ一を人腸菌 T0P10
( Seth G. N . Grant et al . PNAS 87, 4645-4649( 1990 ) ) に導入し、 大腸菌内で gpD タンパク質を高発現させた。 該タンパク質の発現を SDSポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動法 (SDS-PAGE) により検 出した。 この結果、 lmMの IPTGで誘導後 6時間目に 該タンパク質の分子量である 11.6kDaの位置に強いバンドが検出された。
次に、 「pTrcHisA-gpD」 が導入されたため gpDタンパク質を発現しており、 か つ、 サプレッサ一変異の入っていない (sup° ) 大腸菌 T0P10 (pTrcHisA-gpD) 及び 大腸菌 594 (pTrcHisA-gpD) に、 Dアンバーファージを感染させ、 プラーク形成能 及び力価を検討した。 この結果、 いずれの大腸菌を用いた場合でもプラークが形 成され、 その力価は、 Dアンバーに対するサブレッサ一変異を有する LE392と同等 であった。 これにより、 gpD遺伝子がトランスに存在しても、 機能相補に よりフ ァ一ジが形成されることが示された。
そこで、 次に、 核移行シグナルと gpDの融合タンパク質を大腸菌内で発現させ、 核移行シグナル結合ファージの構築を行った。 まず、 核移行シグナルとしては、 本発明者らにより、 有効性の確認されている SV40VP1、 SV40ラージ T抗原、 D型 肝 炎ウィルス 5抗原、 の 3種類の核移行シグナル (それぞれ配列番号: 1、 配列番 号: 2、 配列番号: 3で示される) に加え、 ①核移行シグナルの最小単位である rp KKRKV (配列番号: 4 ) 」 とスぺ一サ一タンパク質との融合タンパク質、 ②核 移行シグナルの最小単位である 「PKKKRKV」 のみ、 の 2種類の核移行シグナルを用 いた。 さらに、 ファージ形成能の確認のために、 文献 (Sternberg et al . PNAS 92, 1609-1613( 1995)) 記載のアンギオテンシン Πの 8個のポリペプチド (これは 核移行シグナルではない) とスぺ一サ一タンパク質との融合タンパク質も用いた (計 6種類) (図 1 ) 。 そして、 この核移行シグナル配列に対応するオリゴ DNAを 合成し、 上記の 「pTrcHisA-gpDj の Ncol部位に導入した。 サイクルシークェンス 法により、 プラスミ ドが正確に構築されていることを確認した後、 該ベクタ一を 大腸菌 T0P10に導入し、 大腸菌内で核移行シグナルと gpDタンパク質との融合タン パク質を高発現させた。 該タンパク質の発現を SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動法 (SDS-PAGE) により検出した。 この結果、 ΙπΜの IPTGで誘導後 6時間目に目的 のタンパク質の分子量の位置に強いバンドが検出された。 さらに、 D アンバーフ ァ一ジを感染させ、 ブラ一ク形成能を検討したところ、 SV40ラージ Τ抗原、 D型肝 炎ウィルス (5抗原、 アンジォテンシン I Iの 8個のポリべプチドとスぺ一サ一タン パク質との融合タンパク質、 の 3種類のベプチドを用いた場合にプラークが形成 された。 また、 力価を比較したところ、 全て 10の 10乗のオーダ一で回収されたが、 プラーク形成時間は、 SV40ラージ Τ抗原で 10時間、 、 D型肝炎ウィルス 抗原で 18 時間など、 通常の 6時間と比較して遅延していた (表 1 )。
表 1
疳主大》菌株 力価 (PRJ/«1 ) プラーク形成時
LE392 (supE44,supF58) 1 .8X 10' β時 M
T0P10 (sup0 ) I 0.5 X 10, 6時 r',
pTrc-gpD (»導なし)
T0P10 (sup9) / 0.6 X 10 ' 帽
pTrc-アンギオテンシン ΙΙ-gpO ( IPTGiS導)
TOP10 (sup0) / 0.4X 10" io時 ru
pTrc-SMOラージ T抗尿- epD ( IPTG»導)
TOP 10 (eup。) / 0.2X 10" 18時 M
pTrc-Dfili肝炎ウイ〗レス δ抗厘-epD ( IPTG»導 ) なお、 これにより得られたファージ粒子に、 核移行シグナルと gpDとの融合タン パク 質が組み込まれていることを、 ウエスタンブロッテイング法により確認した
. [実施例 2] 核移行シグナル結合人ファージによる人ファージゲノムのパヅケ —ジング
上記した大腸菌 TOP10に対する感染によりファージを形成させる方法に代えて、 より高いファージ形成能が期待される、 溶原化ファージ (大腸菌 594) 及び 80%ゲ ノムファ一ジを熱誘発する方法を以下に用いた。 大腸菌 594 (ADaml5 clts857 S am7) には、 100%ゲノムのファージが溶原化しており、 リブレッサ一である clが、 温度感受性であり、 42。C15分の処理で、 リブレッサーが解除される。 しかしなが ら、 Dアンパ一変異により、 sup°の本大腸菌では、 頭部の構築はできず、 尾部 (Tail) のみしか構築できない。 そこで、 本大腸菌に 「pTrcHisA-gpD」 を導入し て、 融合タンパク質を発現させ、 熱誘発によりファージの形成を検討した。 この 結果、 上記 6種のペプチドのいずれを用いた場合でも、 ファージが形成された。 これにより 100%ゲノムを用いた本大腸菌において、 融合夕ンパク質がファ一ジ頭 部に組み込まれたことが示された。 なお、 形成されたファージのカ価を表 2に示 す。
表 2 発現タンパク質 力価 (PFU/ml)
(大 »菌 LE392を用いて解析)
- 0
gpO 5x10'
SV40ラージ T抗 W-gpDlft合タンパク K 3.6x10'
SV40VP1-gpD»合タンパク H 3.0x10'
D型肝炎ウィルス <5抗厚- gpD»合タンパク K 3.3X10' アンギオテンシン II-スぺーサ一- epD»合タンパク Κ 5x10'
/-スぺーサ一- gpD»合タンパク R 1.7X10'
-gpD»合タンパク質 8.9X10' 次いで、 80 ゲノム Dアンバーファージを溶原化した大腸菌 594を用いて検討し た。 また、 該ファージ上にコードされ該ファージのリブレッサーである clは、 温 度感受性となっており、 42°C15分の処理で、 リブレッサーが解除され、 ファージ が溶菌可能となる。 さらに、 sup°の本宿主においては、 Dアンバー変異を有する ため、 gpDは発現せず、 通常、 gpE (人ファージ頭部タンパク質には、 gpDと gpEの 2種類がある) のみで頭部が形成される。 この gpE単独ファージは、 EDTAに対し て極めて感受性が高い。 一方、 この大腸菌に、 融合タンパク質を発現させ、 熱誘 発により出現したファージに該融合タンパク質が組み込まれれば、 EDTA抵抗性を 示すものと考えられる。 そこで、 該大腸菌に、 「pTrcHisA-gpD」 を導入し、 8ml のスケールでファージを調製し、 lOmM EDTAで処理後、 大腸菌 LE392に感染させ、 その力価を測定した。 この結果、 実施例 1で用いた 6種類のペプチドのいずれを 用いた場合でも、 EDTA抵抗性が確認された。 80%ゲノムファージは、 100%ゲノ ムファージよりも力価が高いことから、 ファージ頭部の構造が安定化しているこ とが示唆された (表 3) 。
表 3 発現タンパク K 力価 (PFU/ml)
(大 »»LE392を用いて解析)
EDTA (-) EDTA (+)
4,0x10* 0
gpD 8.6X10' 6.8X10*
SV40ラ一ジ T抗 W-9PD»合タンパク質 9.8x10" 8.0x10'
SV40VP1-BPDIB合タンパク質 2.3X10* 2.4X10*
DSS肝炎ウィルス δ抗原- gpD»合タンパク Ji 5.6X10" 5.6X10* アンギオテンシン II-スぺーサ一- gpD»合タンパク質 7.1X10* 8.4X10*
PKKKRKV-スぺーサ一 -gpD»合タンパク Jt 2.3X10· 2.3x10'
-apD»合タンパク » 1.8x10" 1.5X10'
:実施例 3] 核移行シグナルを架橋剤により結合した人ファージの への^^ 腿 ( 1) 人ファージ溶原菌からのファージ粒子の調製
入ファージを溶原化した大腸菌 w3350thy— (AcI847 Sajn7) を LB (thy) 培地中 で 32°Cにて培養し、 対数増殖期 (2xl08cells/ml) に入ったものを 45°Cで 25分間 振とうしてファージの生成を誘発した。 次いで、 39°Cで 3時間振とう後、 5000rpm で 10分間遠心して沈殿した大腸菌を、 SM緩衝液 (0,1M NaCl, 8mM MgSO^, 0.01% gelatin, 50mM Tris-HCl(pH7.5)) に懸濁した。 濃縮した菌を、 37。Cクロ口ホル ムを加えて攪拌し溶菌させた。 さらに、 DNaseを加えた後、 8000rpmで 30分問遠心 して不溶物を除き、 上清を 23000rpmで 60分間遠心してファージを沈殿させ、 SM緩 衝液に懸濁した。 回収したファ一ジ粒子を塩化セシウムの密度勾配遠心法を用レ、 て精製した。
(2) 核移行シグナルと λファージの架橋
核移行シグナルと λファージの架橋には、 架橋剤 (SMPB; Pierce) を用いた。 核移行シグナルとしては、 SV40ラージ T抗原 (配列番号: 2) を用いた。 人ファ ージは、 緩衝液 (0.1M NaCl, 8mM MgSO 20mM Hepes · NaOH(pH7.0)) で l.lmg/m 1に調製した。 無水 DMSOに溶解した lOmM SMPBをファージ粒子に対して 5000倍のモ ル比で加え、 25。Cで 1時間インキュべ一卜した。 これを緩衝液 (0.1M NaCl, 8mM gS04, 20mM Tris-HCl(pH7.5)) でー晚透析して、 未反応の SMPBを除いた SMPB修 飾入ファージを得た。 核移行シグナルの合成ペプチド (サヮディ一 'テクノロジ —社) は、 SMPBと等モル量を 0.1M NaClを含む pH8.0の 20mM Tris · HC1に溶解し、 DTTを 50mMになるように加え、 37°Cで 1時間、 還元反応を行った。 緩衝液 (0.1M N aCl, 8mM MgS04j 20mM Hepes - NaOH(pH7.0)) でゲルろ過して DTTを除去後、 SMPB 修飾ファージに加え、 25°Cで 3時間反応させた。 遠心チューブの下層に 10%ショ 糖溶液 (0.1M NaCl, 8mM MgSO 20mM Hepes · NaOH(pH7.0)を含む) を lml加え、 反応後の溶液を上層に加え、 4°Cにおいて 20000rpm (Beckman TLS-55口一夕一) で 1時間遠心し、 沈殿を緩衝液 (0.1M NaCl, 20mM Hepes - NaOH(pH7.0), 8mM MgS 04) で溶解して、 核移行シグナルの結合したファージを回収した。
(3) マイクロインジヱクション及び間接蛍光抗体法による核への移行活性の 検出
核移行シグナル結合えファージは、 カバ一グラス上に培養した細胞の細胞質に 文献記載の方法 (Y.Yoneda et al . Exp . Ce 11. Res .170 , 439-452 ( 1987 ) T.Tachib ana et al . J Biol Chem, vol .269 , 24542-24545 ( 1994 ) ) に従ってマイクロイン ジェクシヨンした後、 37°Cで 5分〜 4時間インキュベートし、 3.7%ホルムアル デヒドを含む PBS (- )を加えて、 室温で 20分間固定した。 なお、 この固定前のイン キュペートの時間の幅 「5分〜 4時間」 は、 インジェクション後どのくらいの時 間で、 核移行シグナル結合人ファージが核に到達するかを確認するために設定し たものである。 固定後、 0.5%TritonX-100で 5分間室温で処理し、 さらに 10% ブ ロックエース (大曰本製薬) に浸して、 室温で 1時間ブロッキングを行った。 次 いで、 500倍希釈のゥサギ人ファージ血清 (大阪大学理学部、 小川英行先生よ り 供与された) を 1次抗体として室温で 1時間反応させ、 さらに F ITC標識抗ゥサギ Ig G (6 ig/ml ) を 2次抗体として室温で 1時間反応させて、 蛍光顕微鏡で細胞内の核 移行シグナル結合えファージの局在を検討した。 この結果、 核移行シグナル結合 入ファージは、 マイクロインジェクション直後から核へ移行し (図 2左上) 、 30 分後も核周囲に留まっていることが確認された (図 2右上) 。 本実験の対照とし て用いた、 核移行シグナルのない未修飾の入ファージでは、 マイクロインジェク シヨン直後から細胞質に分散し (図 2左下) 、 30分以内でほぼ均等に拡散した (図 2右下) 。
[実施例 4 ] ファージ頭部における核移行シグナルの表面露出の検討
SV40ラージ T抗原の合成べプチドの N末端側のシスティンを利用して、 SulfoLin k Gel (PIERCE社製) と架橋させ、 固定化カラム (2ml, 5cm) を作製した。 10mlの 抗 SV40LTゥサギ血清を飽和硫安処理し、 coupl ing buffer(50mM Tris-HCl(pH 8. 5 ), 5mM EDTA-Na )で透析し平衡化した。 これをカラムに供し、 結合抗体を 0.1MG ly-HCl (pH2.5 )にて 0.5mlづっ溶出し、 溶出画分を 0.5mlの 2M Tris-HCl (pH8.0)にて 中和した。 得られたァフィ二ティー精製抗体 10mgと SV40ラージ T抗原を発現させた 80¾ゲノムファージ (以下 「LT-phage」 と称する) 3 x l08分子を 4。Cで一晩反応させ た。 これに ProteinA- Sepharose 4B (Pharmacia社製、 50% slurry)100mlを添加し、 室温で 1時間反応させ吸収させ、 遠心 (5000rpm,5niin)後、 その上清の未吸収ファ —ジの力価を大腸菌 LE392にて調べた。 比較対照として、 gpDタンパク質のみを発 現させたファージにっき検討した。 なお、 抗 SV40LTゥサギ血清の代わりにゥサギ ァグロブリンを用いた検討、 及びこれら抗体の無添加での検討も行った (表 4) 表 4
力価 (PFU/ml) (大 HBLE392を用いて解析)
JftSV40ラージ ΤΛΗΕ
核移行シグナルべプチト'抗体 ゥサギ τグロブリン 無添加
発 IXZ白 H
反応 Id 反応後 反応前 反応後 反応後
3 X10 :.7X10 3 X10 3.0X10 3 X10 3.0X10
SV40ラーシ 抗 II一 3X10 1.4X10 3 10 J.4X10 3 X10 2X10 gpDM合 S白 K この結果、 「LT-phage」 では力価が約 1/10に低下 (3x10'から 2.4x10'へ低下) し、 大部分のファージで NLSが頭部表面に提示されていることが示された。
[実施例 5 ] 核移行シグナルを頭部表面に露出させた人ファージの核への移 行活性
80%ゲノム Dアンバーファージが溶原化した大腸菌 T0P10に、 SV40ラージ T抗原と gpD融合蛋白を発現するプラスミ ドを導入した。 これを LBUOmM MgSCK lOOmg/mlァ ンビシリン)培地中で 32°Cにて培養し、 対数増殖期 ^xlO ells / ml)に入ったも のを 45°Cで 20分振とうして、 ファージの生成を誘発した。 次いで、 lmM IPTG存在 下、 39°Cで 3時間振とう後、 5000rpmで 10分間遠心して沈殿した大腸菌を入-緩衝液 (lOmM Tris-HCl (pH7.5), lOmM MgS0<,0.01% gelatin, lOmMput re seine) に想濁し た。 濃縮した菌を、 37°Cでクロ口ホルムを加えて撹拌し、 溶菌させた。 さらに、 DNaseを加えた後、 8000rpmで 30分間遠心して不溶物を除いた。 上清に 10%ポリエ チレングリコール #6000と 1M NaClを加え、 0°Cで 2時間処理の後、 8000rpmで 30分間 遠心してファージを沈殿させ、 え-緩衝液に 濁した。 回収したファージ粒子を塩 化セシウム密度勾配超遠心法を用いて精製した。
ファージ粒子を 2mg/mlになるように人-緩衝液で溶解して、 実施例 3 (3) と同 様にマイクロインジェクションをおこなった。 検出に用いた 1次抗体は、 野性型入 ファージをフ口インドアジュバンドと共にゥサギに感作し作製した血清を用いた。 この結果、 対照として用いた野生型えファージでは、 核への移行活性は検出され なかったが (図 3上) 、 核移行シグナル結合えファージでは、 30分後には核に集 積することが確認された (図 3下) 。 産業上の利用可能性
本発明により、 長鎖 DNAなど巨大分子をパッケージングして、 核へ移行し得る核 移行シグナル結合ファージが提供された。 これにより、 例えば、 所望の外来遺伝 子をその上流域も含んだ長鎖 DNAとして、 核へ到達させることが可能となり、 生命 現象の解明や遺伝子治療など様々な分野において有効利用が期待される。
西薩 配列番号: 1
配列の長さ : 2 0
配列の型: アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ベプチド
配列
Lys Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Ser Ala Pro Gly Ala Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15
Pro Lys
20 配列番号: 2
配列の長さ : 3 3
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Tyr Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gin His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys 1 5 10 15
Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Asp Phe Glu Ser Glu Leu Leu Ser
20 25 30 配列番号: 3
配列の長さ : 3 0
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ベプチド 配列
Lys Lys Asp Lys Asp Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp 1 5 10 15
Gin Met Glu l ie Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro
20 25 30 配列番 : 4
配列の長さ : 7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 配列番号: 5
配列の長さ : 2 6
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 合成 DNA
配列
GTAAGCCATG GTTATGACGA GCAAAG 26 配列番号: 6
配列の長さ : 3 2
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成 DNA
配列
GTTCGAATTC CTATTAAACG ATGCTGATTG CC 32

Claims

請求の範囲
1. 核移行シグナルを含む夕ンパク質を頭部の構成成分として含むファージまた はその頭部。
2. 核移行シグナルが、 配列番号 1〜 4のいずれかに記載の配列を含む、 請求の 範囲 1記載のファージまたはその頭部。
3. ファージがえファージである、 請求の範囲 1記載のファージまたはその頭部 c
4. 核移行シグナルを含むタンパク質が、 核移行シグナルとファージ頭部タンパ ク質との融合夕ンパク質である、 請求の範囲 3記載のファージまたはその頭部。
5. ファージ頭部タンパク質が、 人ファ一ジ Dタンパク質である請求の範囲 4記 載のファ一ジまたはその頭部。
6. 核移行シグナルとファージ頭部を形成するタンパク質との融合蛋白質。
7. 核移行シグナルが、 配列番号 1〜4のいずれかに記載の配列を含む、 請求の 範囲 6記載の融合タンパク質。
8. ファージが人ファージである、 請求の範囲 6記載の融合タンパク質。
9. ファージ頭部を形成するタンパク質が、 人ファージ Dタンパク質である請求 の範囲 6記載の融合夕ンパク質。
10. 請求の範囲 6〜9のいずれかに記載の融合タンパク質をコ一ドする DNA。
11. 請求の範囲 10記載の DNAを含むベクタ一。
12. 請求の範囲 11記載のベクターを保持する細菌宿主。
13. 大腸菌である請求の範囲 12記載の細菌宿主。
14. (a)請求の範囲 12または 13記載の細菌宿主と、 (b)該細菌宿主が 発現する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が由来するファージ (ただし、 該頭部タンパク質を該細菌中で発現できない) とを含む、 細胞の形質転換に用い るキッ ト。
15. ファージがえファージである請求の範囲 14記載のキヅト。
16. 細菌宿主が発現する融合タンパク質に含まれる頭部タンパク質が、 人ファ —ジ Dタンパク質である、 請求の範囲 14記載のキット。
17. (a)核に移行させたい所望の物質を請求の範囲 1記載のファージまたは その頭部にパッケージングする工程と、 (b) 該ファージまたはその頭部を所望 の細胞に導入する工程とを含む、 核に移行させたい所望の物質を所望の細胞の核 に移行させる方法。
18. 所望の物質が核酸である、 請求の範囲 17記載の方法。
19. ファージが人ファージである、 請求の範囲 17記載の方法。
20. 細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲 17記載の方法。
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