CN1114691C - 具有核定位信号的噬菌体 - Google Patents
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Abstract
通过构建能表达组成λ噬菌体头部的gpD蛋白和核定位信号序列的融合蛋白的载体,并用该载体转化大肠杆菌,并且在此转化体中对在不能在大肠杆菌中表达gpD蛋白的突变λ噬菌体进行增殖而得到具核定位信号的λ噬菌体。已证明所得的λ噬菌体能够包装80%到100%基因组的λ噬菌体DNA。在进一步确证了核定位信号暴露于该噬菌体头部的外面之后,将该噬菌体微注射到细胞中以分析其核定位活性。因此已阐明该噬菌体具有核定位活性。
Description
本发明涉及遗传工程领域,尤其是通过病毒颗粒进行外源物质的转运。
将外源基因人工导入细胞的转基因技术是一种重要的技术,不仅仅因为它是一种分析各种生物现象的基本技术,而且因为其在诸如基因治疗和有益动物生产方面的应用。一般而言,转基因有两种方法。一种是利用具有外源基因的病毒的生物学方法,另一种用物理学方法将外源基因导入细胞的物理学方法。
利用病毒的方法的原理是用掺入目的基因的重组病毒感染细胞,并将整个重组病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中。这种方法目前正受到很大的关注,因为它是作为例如Lesch-Nyhan综合症和腺苷脱氨酶(ADA)缺陷这一类疾病的基因治疗的技术基础。然而,有人指出该方法存在一些问题,例如病毒的致病性,这是由于利用了病毒本身的生物学特性而引起的。因此,目前正在开发改良的逆转录病毒载体,它们没有与病毒致病性和复制相关的区域。但是,这些改良的载体仍然具有许多问题,因为它们仍然可能对细胞产生一些不良影响,而且它们仅仅感染正在***的细胞。
所以,除了上述利用病毒的方法之外,目前也在使用导入非病毒载体的物理学方法。在一种成熟的物理学方法中,将非病毒载体与化学物质例如磷酸钙、DEAE-葡聚糖、聚阳离子或脂质体一起导入细胞中。不过,这些物理学有这些问题,将基因转染到细胞中的效率低,在许多情况下如此转染的非病毒载体上的外源基因并未到达细胞核。因此,要应用于基因治疗,该方法有许多困难需要克服。
最近,有报道说被转送到真核细胞核中并在那里起作用的蛋白质具有一特定的氨基酸序列,其作用是作为将该蛋白质转入核中的信号(NLS:核定位信号)(G.Garcia-Bustos等,生物化学与生物物理(Biochem.Biophys.Acta)1071:83-101(1991))。而且,还有报道说将核定位信号结合到正常情况下并不转运到核中的蛋白质上将会使该蛋白质具有核转运活性(R.E.Lanford等,细胞(Cell)46:575-582(1986),Y.Yoneda等,实验细胞研究(Exp.Cell.Res.)170:439-452(1987),D.Chelsky等,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)9:2487-2492(1989))。根据这种知识,已用核定位信号进行了研究,从而以物理学方法导入的基因就非常有可能到达细胞核。也就是说,进行了技术研究就使DNA尽可能紧密地浓缩至40纳米(即核膜孔的大小),以及使核定位信号结合到该浓缩物上,并因此可以积极地将DNA转运到核中。例如,通过利用蛋白质进行了使DNA更紧密的研究,这些蛋白质例如HMG-1和组蛋白,以及聚-L-赖氨酸(Jose C.Perales等,E.J.B.266:255-266(1994)),和阳离子脂质体(J.Zabner等,J.B.C.270:18997-19007(1995))。
但是,这种合成化学方法存在与DNA复合物的溶解性和均一性的问题,以及依赖于盐浓度的DNA的浓缩的不同程度问题。而且,复合物的构建仅在高碱条件下才有可能,而在生理条件下是不可能的,这在实际运用中是一个需要解决的问题。
有人建议可在感染动物的病毒例如腺病毒和SV40中,核定位信号存在于其衣壳蛋白质中,它们能在感染早期使其DNA积极地进行转运(Urs.F.Greber和Harumi Kasamatsu,细胞生物学动态(Trends in Cell Biology)6:189-195(1996))。还有人建议将直径为45纳米的SV 40颗粒以病毒颗粒的形式侵入核中(K.Hummeler等,J.Virol.6:87-93(1970))。而且,据报道,MS-2噬菌体有转运***,其中外源物质被衣壳包裹(日本公开国际申请No.Hei-508168)。但是,还未报道过任何可利用长链DNA并将DNA转运到核中的利用病毒颗粒的转运***。
本发明的目的之一是提供一个***,该***可将导入细胞中的基因送入核中。更具体地,本发明的目的是提供一种λ噬菌体,其带有暴露于头部的外表面的核定位信号,并能包装长链DNA。
为了将长链DNA转运到核中,有必要将DNA浓缩至约40纳米,即核膜孔的大小。本发明者注意到了λ噬菌体的头部,其头部在体外可对目的长链DNA进行紧密包装而且可使DNA免于遭受外部DNA酶的攻击,并作为该DNA的载体。而且,我们还注意到一个现象,即感染动物的病毒可以利用其衣壳蛋白内核定位信号而以病毒颗粒的形式侵入到核中,并尝试通过制备和利用结合有核定位信号的λ噬菌体头部将DNA积极地转运至核中。更具体地,我们利用以下步骤。
首先,我们构建了表达gpD蛋白质和核定位信号序列的融合蛋白的载体,其中的gpD蛋白质是组成λ噬菌体头部的蛋白质之一;以此载体转化大肠杆菌(Escherichia Coli),接着再以在大肠杆菌细胞中不能表达gpD的突变噬菌体(此后称之为“D琥珀噬菌体”)来对转化体进行感染。通过噬菌斑形成分析及利用抗-gpD抗体的Western印迹分析,我们证实了载体表达的gpD蛋白和核定位信号序列之间的融合蛋白可以对突变噬菌体进行补充,而且还得到了其头部结合有核定位信号的λ噬菌体。也就是说,我们已经发现了在大肠杆菌中表达的融合蛋白已被补充地整合到了其本身并不表达该蛋白的噬菌体头部。
接着,我们通过将表达gpD蛋白和核定位信号序列之间的融合蛋白的载体导入到以突变λ噬菌体溶源化的大肠杆菌中,然后热诱导该溶源化噬菌体而得到了类似的结果。更具体地,我们将表达上述融合蛋白的载体导入到以D琥珀噬菌体溶源化的大肠杆菌中,并以热诱导该转化体。结果是其头部未掺入该融合蛋白并由gpE蛋白组成的噬菌体对EDTA敏感,而掺入有该融合蛋白的噬菌体对EDTA具有抗性。然后,我们以EDTA处理所得噬菌体并计算其滴度。结果发现构建了包装有80%基因组大小的DNA的噬菌体,而且融合蛋白掺入到了其噬菌体头部之中。而且我们已证明确实存在有暴露于噬菌体头部的外表面的核定位信号。我们还证实甚至我们使用100%基因组大小DNA时,仍然以相同的方式形成掺入该融合蛋白的噬菌体。而且,我们将有核定位信号暴露于其头部外表面的噬菌体通过徽注射导入到属于人胎儿肺细胞的HEL-R66细胞中并证实该噬菌体具核转运活性,从而完成了本发明。
因此,本发明涉及能够包装大分子例如长链DNA并具有核转运活性的λ噬菌体。
更具体地,其涉及:
(1)具有作为其头部一个组分的核定位信号的包含蛋白质的噬菌体或其头部,
(2)(1)的噬菌体或其头部,其中所说的核定位信号包含SEQ ID NO:1到SEQID NO:4中的任何一段序列。
(3)(1)的噬菌体或其头部,其中所说的噬菌体是λ噬菌体,
(4)(3)的噬菌体或其头部,其中所说的含有核定位信号的蛋白质是在核定位信号和噬菌体头部蛋白质之间的融合蛋白。
(5)(4)的噬菌体或其头部,其中所说的噬菌体头部蛋白质是λ噬菌体的D蛋白。
(6)核定位信号和形成噬菌体头部的蛋白质之间的融合蛋白。
(7)(6)的融合蛋白,其中所说的核定位信号包括SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:4中的任何一段序列。
(8)(6)的融合蛋白,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
(9)(6)的融合蛋白,其中所说的噬菌体头部蛋白是λ噬菌体的D蛋白,
(10)编码(6)到(9)中任一个蛋白质的DNA,
(11)含有(10)的DNA的载体,
(12)携带(11)的载体的细菌宿主,
(13)(12)的细菌宿主,其中所说的宿主是大肠杆菌,
(14)用于转化细胞的试剂盒,其中所说试剂盒含有(12)或(13)的细菌宿主,和(b)从其上已衍生出包含于在所说宿主中表达的融合蛋白中的头部蛋白的噬菌体,其中所说噬菌体在所说细菌宿主中不能表达所说的头部蛋白,
(15)(14)的试剂盒,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
(16)(14)的试剂盒,其中所说的包含于在细菌宿主中表达的融合蛋白的头部蛋白是λ噬菌体的D蛋白。
(17)将所需物质转运到目的细胞的核中的方法,其中所说方法包括:(a)将要被转位至核中的目的物质包装到(1)的噬菌体或其头部中,和(b)将所说噬菌体或其头部导入所需细胞中,
(18)(17)的方法,其中所说的目的物质是核酸,
(19)(17)的方法,其中所说的噬菌体是λ噬菌体,
(20)(17)的方法,其中所说的细胞是哺乳动物细胞。
本发明涉及将外源物质包装到结合有核定位信号的噬菌体头部,将该噬菌体导入外源物质要在其中发挥功能的目的细胞内,以及将外源物质与噬菌体颗粒一同转运到靶细胞核中的技术。
对本发明所使用的核定位信号并无特别限制,只要它具有将结合于该信号序列的物质转运到核中的活性即可。例如,在将λ噬菌体颗粒转位到核内的情况下,优选使用SV40 VP1。SV40大T抗原,或丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信号,或者含有在SV40大T抗原核定位信号内具核转位活性的最小单位的“PKKKRKV的序列(生物化学百科全书(Encyclopedia ofBiochemistry)第二版中的氨基酸单字母表示法)”。
只要外源物质能包装到其头部,对本发明所使用的噬菌体并无特定限制。可以使用例如λ噬菌体和M13噬菌体的噬菌体。
可以采用多种方法来制备其头部由含有核定位信号的蛋白质组成的噬菌体。例如,可将核定位信号序列以化学方法结合到噬菌体头部蛋白上,或者可将编码核定位信号序列的DNA与编码噬菌体头部蛋白质的基因结合在一起并掺入到载体中,在细菌宿主中将其作为融合蛋白表达,并在宿主中使不能表达该头部蛋白的突变噬菌体进行增殖,从而构建了该噬菌体头部。对上述方法中所使用的载体并无限制,可使用各种载体。只要本方法中所用的噬菌体在宿主中可以增殖,对细菌宿主没有特定的限制。例如,当使用λ噬菌体时,可以使用噬菌体可在其中增殖的各种大肠杆菌株。核定位信号可以通过直接地或者通过交联剂或间隔肽而化学方法结合到噬菌体头部蛋白上。编码核定位信号序列的DNA和编码噬菌体头部蛋白的基因可以直接或者通过间隔核苷酸而结合在一起。
对上述方法中使用的头部蛋白是没有限制的,当噬菌体是λ噬菌体时,蛋白质可使用gpD蛋白或gpE蛋白,噬菌体是M13时使用基因3蛋白质。
本发明中,在外源物质包装好之后将噬菌体导入细胞中。对包装而言,可以使用Ishiura等(基因(Gene)82:281-289(1989))的方法,也可以使用Sternberg等(日本专利No.Hei 59-500042)的方法。对外源物质而言,可以使用基因、基因片段、核酶、反义基因或任何其它能在核内发挥功能的物质。例如,当进行基因治疗时,使用缺陷基因的正常的对应物是有效的。当进行特定基因的功能分析时,用该基因的反义基因将是有效的。而且,如果希望创造转基因动物,在其中导入一个与要赋予的表型相关的基因是有效的。应该注意到的是本发明使得有可能包装长链核酸,例如带有其上游区的基因。
将包装有外源物质的噬菌体导入的方法,包括微注射法、脂质转染法、脂质体法、HVJ-脂质体法、免疫-脂质体法、pH敏感脂质体法、红细胞血影法、DEAE-葡聚糖法、利用细胞表面的受体的胞吞作用的方法、利用细胞表面特异抗原的方法、利用合成的大分子载体的方法、利用微粒枪的方法等等。对导入包装有外源物质的噬菌体的细胞并没有特定的限制,根据目的可以采用各种细胞。
图1表明的是各种核定位信号和作为λ噬菌体头部蛋白的gpD蛋白质之间的融合蛋白的图解。
图2表明的是显示通过交联剂将核定位信号结合到其上的λ噬菌体的核转位活性的显微摄影。
图3显示的是描述在其头部表面暴露有核定位信号的λ噬菌体的核转位活性的显微摄影。
下面将以实施例对本发明进行详细描述,但不应被理解为是对本发明的限制。
实施例1构建带有核定位信号的λ噬菌体
用野生型λ噬菌体基因作模板通过PCR克隆了编码gpD蛋白质的cDNA,该gPD蛋白质是组成λ噬菌体头部的一种蛋白质。根据Sternberg等人的方法(Sternberg等,PNAS 92:1609-1613(1995))进行PCR。更具体地,用5′-GTAAGCCATGGTTATGACGAGCAAAG-3′(其含有从5′端的第6到第11位核苷酸残基的NcoI位点)(SEQ ID NO:5)和5′-GTTCGAATTCCTATTAAACG ATGCTGATTGCC-3′(其含有从5′端的第5到第10位核苷酸残基的EcoRI位点)(SEQ ID NO:6)作为引物,将含有该gpD基因的约4kb的片段作为模板,此片段通过用ApaI和ApaLI消化20徽克的λ噬菌体基因组(TOYOBO,7.9OD/毫升)而产生。PCR反应中,使用0.2微克模板,10×反应缓冲液(Pharmacia;500毫摩尔/升KCl,15毫摩尔/升MgCl2,100毫摩尔/升Tris-HCl(pH9.0)),1微摩尔/升各种引物,50微摩尔/升dNTP,100微升的5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia),进行的25个循环,包括:90℃变性3分钟,55℃退火2分钟,72℃延伸3分钟,最后的一个循环:90℃热变性3分钟55℃退火2分钟,72℃延伸10分钟。将通过上述PCR扩增的DNA片段导入大肠杆菌表达载体pTrcHisA(Invitrogen)的NcoI和EcoRI位点,所得载体被称之为“pTrcHisA-gpD”。通过循环测序法确证DNA的序列之后,将载体导入大肠杆菌TOP10(Seth G.N.Grant等,PNAS 87:4645-4649(1990))中,并在大肠杆菌中高水平地表达gpD蛋白质。通过SDS聚丙烯酰胺胶凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白质的表达。结果,在以1毫摩尔/升IPTG诱导6小时之后在11.6kDa的位置处检测到强带,它就是该蛋白质的分子量。
接着,用D琥珀噬菌体感染大肠杆菌TOP10(pTrcHisA-gpD)和大肠杆菌594(pTrcHisA-gpD),这两个菌株都因为导入了“pTrc HisA-gpD”而正表达gpD蛋白而且不含有抑制突变(sup°),然后测定其噬斑形成活性及滴度。结果表明在两种情况下都形成了噬菌斑,滴度相当于带有含有对D琥珀抑制突变的LE392的情况。因此,证明了甚至在gpD基因以反式存在时,通过功能互补也形成了该噬菌体。
然后,通过在大肠杆菌中表达核定位信号和gpD之间融合蛋白质而构建了具有核定位信号的噬菌体。核定位信号可以使用除三种类型的被本发明人证实是有效的来自于SV40VP1、SV40大T抗原和丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信号(分别为SEQ ID NOs:1,2,3)之外的其它两种核定位信号,一种是(1)核定位信号最小单位“PKKKRKV(SEQ ID NO:4)”和间隔蛋白质之间的融合蛋白,以及(2)单独的核定位信号最小单位“PKKKRKV”。而且,为了确证噬菌体形成能力,使用了来自Sternberg等在PNAS 92:1609-1613(1995)中所述的血管紧张肽II(并非核定位信号)的8个多肽和间隔蛋白质之间的融合蛋白,总共6种类型(图1)。接着,合成相应于这些核定位信号的寡核苷酸并导入到上述的“pTrcHisA-gpD”的NcoI位点上。在通过循环测序法证实已正确地构建了质粒之后,将载体导入到了大肠杆菌TOP10中,并在大肠杆菌中高水平地表达核定位信号和gpD蛋白质之间的融合蛋白质。以SDS聚丙烯酰胺胶电泳(SDS-PAGE)测定融合蛋白质的表达。结果,在以1毫摩尔/升IPTG诱导6小时之后,在所期望的蛋白质的分子量的预期位置检测到了强的带。而且,通过用D琥珀噬菌体感染细菌细胞来检测噬菌斑形成能力,并在使用三类肽,SV40大T抗原,丁型肝炎病毒δ抗原,和来自血管紧张素II的8个多肽与间隔蛋白质之间的融合蛋白质时,检测了噬斑形成。滴度测试表明所有噬菌体滴度的数量级为1010,但噬菌斑形成时间对SV40大T抗原而言是10小时,对丁型肝炎病毒δ抗原而言是18小时,与正常的噬菌斑形成时间的6小时相比延迟了(表1)。
表1
宿主大肠杆菌菌株 | 滴度(PFU/毫升) | 噬菌斑形成时间 |
LE 392(supE44,supF58)top 10(sup0)/pTrc-gpD(无诱导)top 10(sup0)/pTrc-血管紧张素II-gpD(IPTG诱导)top 10(sup0)/pTrc-SV40大T抗原-gpD(IPTG诱导)top 10(sup0)/pTrc-丁型肝炎病毒δ抗原-gpD(IPTG诱导) | 1.8×10100.5×10100.6×10100.4×10100.2×1010 | 6小时6小时6小时10小时18小时 |
还通过Western印迹法证实如此所得的噬菌体颗粒含有核定位信号和gpD之间的融合蛋白。
实施例2用具有核定位信号的λ噬菌体包装λ噬菌体基因组
代替通过大肠杆菌TOP10感染形成噬菌体的上述方法不同,在下面将使用其中的溶源性噬菌体(大肠杆菌594)或者80%基因组噬菌体在热诱导下期望能提供更好的噬菌体形成能力的方法。用100%基因组噬菌体使大肠杆菌594(λDam15 cIts 857 Sam7)溶源化,而且具有一个在42℃处理15分钟可使之失活的温度敏感型阻遏物cI。但由于D琥珀突变,在此大肠杆菌Sup0菌株中不能产生头部而仅能产生尾部。在大肠杆菌菌株中导入“pTrcHisA-gpD”以表达该融合蛋白,并用热诱导检测噬菌体形成。结果,使用上述6种肽中的任何一种都形成了噬菌体。结果表明在通过100%基因组噬菌体溶源化的该大肠杆菌菌株中,融合蛋白被掺入到了噬菌体头部。所得噬菌体的滴度见表2所示。
表2
所表达的蛋白质 | 滴度(PFU/毫升)(以大肠杆菌LE392分析) |
-- | 0 |
gpD | 5×108 |
SV40大T抗原-gpD融合蛋白 | 3.6×108 |
SV40VP1-gpD融合蛋白 | 3.0×108 |
丁型肝炎病毒δ抗原-gpD融合蛋白 | 3.3×108 |
血管紧张肽II-间隔-gpD融合蛋白 | 5×108 |
PKKKRKV-间隔-gpD融合蛋白 | 1.7×108 |
PKKKRKV-gpD融合蛋白 | 8.9×107 |
接着,以通过80%基因组D琥珀噬菌体溶源化的大肠杆菌(E.coli 594)进行另一套实验。噬菌体本身所编码的并作为该噬菌体的阻遏物的cI是温度敏感的,它在42℃处理15分钟后可失活,导致该细菌被噬菌体所裂解。另外,既然该噬菌体包含D琥珀突变,在这个Sup°宿主中,其不能表达gpD,其头部一般仅由gpE形成。(λ噬菌体头部蛋白质有两种-gpD和gpE.)仅由gpE形成的噬菌体对EDTA极其敏感。另一方面,如果允许大肠杆菌表达该融合蛋白并经热诱导噬菌体掺入融合蛋白,则其将表现出EDTA抗性。将“pTrcHisA-gpD”导入大肠杆菌菌株中,在8毫升的规模上制备噬菌体并以10mM EDTA进行处理。并以其感染大肠杆菌LE392,测定其滴度。结果证实用实施例1中6种肽中任何一种都有EDTA抗性。该结果表明80%基因组噬菌体比100%基因组噬菌体有更高的滴度,表明在前一种情况下头部结构被稳定(表3)。
表3
实施例3其上有通过交联剂结合的核定位信号的λ噬菌体的核转位活性(1)从λ噬菌体溶源化细菌中制备噬菌体颗粒
所表达的蛋白质 | 滴度(PFU/毫升)(以大肠杆菌LE392进行分析) | |
EDTA(-) | EDTA(+) | |
-- | 4.0×109 | 0 |
gpD | 8.6×108 | 6.8×108 |
SV40大T抗原-gpD融合蛋白 | 9.8×109 | 8.0×109 |
SV40VP1-gpD融合蛋白 | 2.3×108 | 2.4×108 |
丁型肝炎病毒δ抗原-gpD融合蛋白 | 5.6×108 | 5.6×108 |
血管紧张肽II-间隔-gpD融合蛋白 | 7.1×108 | 8.4×108 |
PKKKRKV-间隔-gpD融合蛋白 | 2.3×108 | 2.3×108 |
PKKKRKV-gpD融合蛋白 | 1.8×108 | 1.5×108 |
于32℃在LB(thy)培养基上培养以λ噬菌体溶源化的大肠杆菌w3550thy(λcI847 Sam7),于45℃振摇处于对数生长期(2×108个细胞/毫升)的菌体25分钟以诱导噬菌体产生。然后,将培养物在39℃振荡3小时,于5000rpm离心10分钟,将沉淀的大肠杆菌重新悬浮于SM缓冲液中(0.1摩尔/升NaCl,8毫摩尔/升MgSO4、0.01%明胶、50毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5))。加入37℃的氯仿并搅拌使浓缩的菌体裂解。而且,在溶液中加入DNase,在8000rpm离心30分钟以除去不溶物,并将上清于23000rpm离心60分钟沉淀噬菌体,并将噬菌体重新悬浮于SM缓冲液。以氯化铯密度梯度离心纯化所回收得到的噬菌体颗粒。(2)交联核定位信号与λ噬菌体
用交联剂(SMPB;Pierce)将核定位信号与λ噬菌体交联起来。用SV40大T抗原(SEQ ID NO:2)作为核定位信号。以1.1毫克/毫升在缓冲液(0.1摩尔/升NaCl,8毫摩尔/升MgSO4,20毫摩尔/升Hepes.NaOH(pH7.0))中制备λ噬菌体。将溶于无水DMSO中的10毫摩尔/升SMPB加入其中,其摩尔比为噬菌体颗粒的5000倍,并将混合物在25℃温育1个小时。然后在缓冲液(0.1摩尔/升NaCl、8毫摩尔/升MgSO4、20毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5))中透析过夜,除去未反应的SMPB就得到了SMPD修饰的λ噬菌体。以与SMPB等摩尔的量在含0.1摩尔/升的NaCl的20毫摩尔/升Tris-HCl(pH8.0)中溶解合成的核定位信号肽(Sawady Technology),并在溶液中将DTT加至50毫摩尔/升,在37℃进行还原反应1小时。在缓中溶液(0.1摩尔/升NaCl、8毫摩尔/升MgSO4、20毫摩尔/升Heps.NaOH(pH7.0))中进行凝胶过滤除去DTT之后,将洗脱物加到SMPB修饰的噬菌体上,并在25℃下反应3小时。将反应溶液置于离心管中以在预先置于管中的1毫升10%蔗糖溶液(含0.1摩尔/升NaCl、8毫摩尔/升MgSO4、20毫摩尔/升Hepes.NaOH(pH7.0))层上的分层,于4℃在20000rpm(Beckman TLS-55转头)离心1小时。在缓冲液(0.1摩尔/升NaCl,8毫摩尔/升MgSO4,20毫摩尔/升Hepes.NaOH(pH7.0))中重新悬浮沉淀物以回收其上结合有核定位信号的噬菌体。(3)通过微注射及间接荧光抗体法检测核转位活性
将具有核定位信号的λ噬菌体通过微注射注入以文献(Y.Yoneda等,Exp.Cell.Res.170:439-452(1987),T.Tachibana等,J.Biol.Chem.269:24542-24545(1994))所述方法在盖玻片上培养的细胞的胞质中。将细胞在37℃孵育5分钟到4小时之后,加入含3.7%甲醛的PBS(-)在室温下将细胞进行固定20分钟。固定前的“5分钟到4小时”孵育时间范围的设定是为了测定具核定位信号的噬菌体在注射后要到达核所需的时间。固定后在室温下以0.5%TritonX-100将细胞处理5分钟,在室温下浸入10%BlockAce(Dainippon Pharmaceutical)中阻断1小时。接着,将细胞在室温下与作为一级抗体的稀释500倍的兔抗-λ噬菌体血清(得自Dr.Hideyuki Ogawa,Osaka University)进行反应1小时,然后与作为二级抗体的FITC-标记的抗免IgG(6微克/毫升)在室温下反应1小时,用荧光显微镜检测细胞中具核定位信号的λ噬菌体的定位。结果证实具核定位信号的噬菌体在微注射之后立刻转位到了细胞核(图2,左上),在微注射30分钟之后仍然保留在细胞核周围(图2,右上)。在本实验中对照使用的是未修饰的λ噬菌体(该噬菌体不具有核定位信号),在微注射后噬菌体立刻分散于细胞质中(图2,左下),在30分钟之内均匀弥散(图2,右下)。
实施例4核定位信号在噬菌体头部的表面暴露的分析
将合成SV40大T抗原的N末端的半胱氨酸残基与SulfoLink Gel(Pierce)进行交联以制备固定柱(2毫升,5厘米)。用饱和硫酸铵对10毫升的抗-SV40LT-兔血清进行处理,并在偶联缓冲液(50毫摩尔/升Tris-HCl(pH8.5),5毫摩尔/升EDTA-Na)中通过透析进行平衡。并将其置于柱上,结合抗体以0.1摩尔/升Gly-HCl(pH2.5)洗脱,并以0.5毫升每份分馏,洗脱的馏分用0.5毫升的2摩尔/升Tris-HCl(pH8.0)中和。将如此所得的10毫克亲和纯化抗体与3×108分子的表达SV40大T抗原的80%基因组噬菌体(此后被称为“LT-噬菌体”)于4℃反应过夜。在其中加入100毫升的蛋白质A-Sepharose4B(Pharmacia,50%悬浮液),在室温下进行反应吸收1小时,于5000rpm离心5分钟,用大肠杆菌LE 392在上清中测定未吸收性噬菌体的滴度。作为对照,用相似的方法对仅表达gpD蛋白的噬菌体进行了分析。此外,用兔γ球蛋白取代抗-SV40LT兔血清进行了相似的分析,同样也未使用这些抗体(表4)。
表4
所表达的蛋白质 | 滴度(PFU/毫升)(以大肠杆菌LE392进行分析) | |||||
抗-SV40大T抗原核定位信号抗体 | 兔γ球蛋白 | 无抗体 | ||||
前-RXN | 后-RXN | 前-RXN | 后-RXN | 前-RXN | 后-RXN | |
DSV40大T抗原-gpD融合蛋白 | 3×1083×108 | 2.7×1082.4×107 | 3×1083×108 | 3.0×1082.4×108 | 3×1083×108 | 3.0×1082×108 |
结果表明绝大部分“LT-噬菌体”都有暴露于其头部表面的NLS,其滴度大约下降1/10证实了这一点(从3×108到2.4×107)。
实施例5其头部表面暴露有核定位信号的λ噬菌体的核转位活性
将可以表达SV40大T抗原和gpD之间的融合蛋白的质粒导入以80%基因组D琥珀噬菌体溶源化的大肠杆菌TOP10中。于32℃下将细菌在LB培养基(10毫摩尔/升MgSO4、100微充/毫升氨苄青霉素)中进行培养,对数生长期(2×108细胞/毫升)时在45℃振摇20分钟以诱导噬菌体产生。然后将培养物在有1毫摩尔/升IPTG存在的情况下在39℃振摇3小时,于5000rpm离心10分钟,并将沉淀的大肠杆菌细胞重新悬浮于λ缓冲液(10毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5),10毫摩尔/升MgSO4,0.01%明胶,10毫摩尔/升腐胺)中。在37℃时加入氯仿并搅拌以使浓缩的细菌裂解。而且,在溶液中加入了DNase,并在8000rpm离心30分以除去不溶物。在上清中加入10%的聚乙二醇#6000和1摩尔/升NaCl,在0℃处理2小时,并于8000rpm离心30分以沉淀噬菌体。将该噬菌体重新悬浮于λ-缓冲液中,所回收到的噬菌体粒子通过氯化铯密度梯度超离心进行纯化。
将噬菌体粒子溶于λ缓中液中直至2毫克/毫升,并以与实施例3(3)相同的方式进行微注射。将以野生型λ噬菌体与弗伦德(Freund′s)佐剂敏化的兔子制备的血清作为一级抗体用于检测。结果证实虽然作为对照的野生型λ噬菌体未表现出核转位活性(图3,上),具核定位信号的λ噬菌体在30分钟之内在细胞核中积累(图3,下)。
工业实用性本发明提供了能够包装大分子例如长链DNA并具有核转位活性的具有核定位信号的λ噬菌体。该噬菌体例如能够将所希望的外源基因,如包括上游区的长链DNA运输到细胞核中,因此其可望能在例如阐明生物学现象和基因治疗的各个领域中有效地应用。
序列表序列编号:1序列长度:20序列类型:氨基酸拓扑学:线性分子类型:肽序列描述:序列编号:1Lys Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Ser Ala Pro Gly Ala Ala pro Lys Lys1 5 10 15Pro Lys
20序列编号:2序列长度:33序列类型:氨基酸拓扑学:线性分子类型:肽序列描述:序列编号:2Tyr Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys1 5 10 15Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Asp Phe Glu Ser Glu Leu Leu Ser
20 25 30序列编号:3序列长度:30序列类型:氨基酸拓扑学:线性分子类型:肽序列描述:序列编号:3Lys Lys Asp Lys Asp Gly Glu Gly Ala Pro Pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp1 5 10 15Gln Met Glu Ile Asp Ala Gly Pro Arg Lys Arg Pro序列编号:4序列长度:7序列类型:氨基酸拓扑学:线性分子类型:肽序列描述:序列编号:4Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5序列编号:5序列长度:26序列类型:核酸链型:双链拓扑学:线性分子类型:其它核酸,合成DNA序列描述:序列编号:5GTAAGCCATG GTTATGACGA GCAAAG 26序列编号:6序列长度:32序列类型:核酸链型:双链拓扑学:线性分子类型:其它核酸,合成DNA序列描述:序列编号:6GTTCGAATTC CTATTAAACG ATGCTGATTG CC 32
Claims (22)
1.噬菌体,具有作为其头部一个组分的包含核定位信号的蛋白质,其中所说的核定位信号包含SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4中任一个的序列。
2.权利要求1的噬菌体,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
3.权利要求2的噬菌体,其中所说的含有核定位信号的蛋白质是核定位信号和噬菌体头部蛋白质的融合蛋白。
4.权利要求3的噬菌体,其中所说的噬菌体头部蛋白质是λ噬菌体的D蛋白。
5.核定位信号与形成噬菌体头部的蛋白质之间的融合蛋白,其中所说的核定位信号包括SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4中任一个的序列。
6.权利要求5的融合蛋白,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
7.权利要求5的融合蛋白,其中所说的噬菌体头部蛋白是λ噬菌体的D蛋白。
8.编码权利要求5的蛋白质的DNA。
9.含有权利要求8的DNA的载体。
10.携带权利要求9的载体的细菌宿主。
11.权利要求10的细菌宿主,其中所说的宿主是大肠杆菌。
12.用于转化细胞的试剂盒,其中所说试剂盒含有(a)权利要求10或11的细菌宿主,和(b)从其上已衍生出包含于在所说宿主中表达的融合蛋白中的头部蛋白的噬菌体,其中所说噬菌体在所说细菌宿主中不能表达所说的头部蛋白。
13.权利要求12的试剂盒,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
14.权利要求12的试剂盒,其中所说的包含于在细菌宿主中表达的融合蛋白中的头部蛋白是λ噬菌体的D蛋白。
15.将所需物质转运到目的细胞的核中的方法,所说方法包括:(a)将要被转位至核中的目的物质包装到权利要求1的噬菌体或其头部中,和(b)将所说噬菌体或其头部导入所需细胞中。
16.权利要求15的方法,其中所说的目的物质是核酸。
17.权利要求15的方法,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
18.权利要求15的方法,其中所说的细胞是哺乳动物细胞。
19.噬菌体头部,具有作为其一个组分的包含核定位信号的蛋白质,其中所说的核定位信号包含SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:4中任一个的序列。
20.权利要求19的噬菌体头部,其中所说的噬菌体是λ噬菌体。
21.权利要求20的噬菌体头部,其中所说的含有核定位信号的蛋白质是核定位信号和噬菌体头部蛋白质的融合蛋白。
22.权利要求21的噬菌体头部,其中所说的噬菌体头部蛋白质是λ噬菌体的D蛋白。
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