JP2001502522A - 網膜芽細胞腫関連植物蛋白 - Google Patents
網膜芽細胞腫関連植物蛋白Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、網膜芽細胞腫蛋白をコードする植物細胞DNA配列の分離と特性付けに基づく。かかる所見は、細胞周期、細胞成長および植物細胞分化の考えられる調節因子としての網膜芽細胞腫植物蛋白の構造的および機能的特性に基づく。この理由から、数ある態様の中でも特に、植物性細胞、植物および/または植物性ウイルスの増殖制御における網膜芽細胞腫蛋白あるいはそれをコードするDNA配列の使用、ならびに網膜芽細胞腫植物蛋白に基づく制御経路の操作を通して修飾されたベクター、細胞、植物あるいは動物、あるいは動物細胞の使用を特許請求する。
Description
【発明の詳細な説明】
網膜芽細胞腫関連植物蛋白 説明
本発明は、植物および動物系において生物活性を持つ蛋白、かかる蛋白の発現
をコードするポリヌクレオチド、これらの蛋白とポリヌクレオチドを同定し合成
する際に使用するためのオリゴヌクレオチド、組換え形態のポリヌクレオチドを
含むベクターおよび細胞、これらを含む植物および動物、ならびに植物の成長と
ウイルスに対する植物の脆弱性の制御における該蛋白とポリヌクレオチドおよび
それらの断片の使用に関する。
細胞周期の進行は正と負のエフェクターによって調節されている。後者の中で
、網膜芽細胞腫(retinoblastoma)感受性遺伝子(Rb)の産物は哺乳類細胞の
G1期への移行を抑制する。哺乳類細胞では、Rbは、細胞のDNA複製に必要
な遺伝子のプロモーター領域の配列と相互作用することが知られている、E2F
ファミリーの転写因子の機能を阻害することによって、G1/Sの移行を調節す
る(たとえば、Weinberg,R.A.Cell 81,323(1995
);Nevins,J.
R.Science 258,424(1992)参照)。動物細胞に感染する
DNA腫瘍ウイルスは、LXCXEモチーフを介してRb蛋白と相互作用する腫
瘍蛋白を発現し、Rb−E2F複合体を破壊して、細胞をS期へと押し進める(
Weinberg、同上;Ludlow,J.W.FASEB J.7,866
(1993);Moran,E.FASEB J.7,880(1993);V
ousden,K.FASEB J.7,872(1993))。
本発明者は、植物ゲミニウイルス(geminivirus)の効率的な複製がウイルス
RepA蛋白におけるLXCXEアミノ酸モチーフの完全性を必要とすること、
およびRepAが酵母においてヒトRbファミリーのメンバーと相互作用しうる
ことを明らかにした(Xie,Q.,Suarez−Lopez,P.およびG
utierrez,C.EMBO J.14,4073(1995))。植物D
型サイクリンにおけるLXCXEモチーフの存在も報告されている(Soni,
R.,Carmichael,J.P.,Shah,Z.H.およびMurra
y,J.A.H.Plant Cell 7,85−103(1995))。
本発明者は、初めて植物Rb蛋白およびかかる蛋白をコード
する対応するポリヌクレオチドの特徴的配列を特定し、そのような蛋白とポリヌ
クレオチドを分離し、特に、かかる蛋白を既知の動物Rb蛋白配列と識別する配
列を特定した。発明者は、トウモロコシから植物性Rb植物蛋白をコードする既
知のDNA配列を決定した。これを以後ZmRb1と称する。発明者は、ZmR
b1が、その機能に必須のLXCXEモチーフを含む植物ゲミニウイルス蛋白、
RepAと酵母において相互作用することを明らかにした。発明者はさらに、Z
mRb1あるいはヒトRbファミリーのメンバーであるヒトp130のいずれか
をコードするプラスミドでトランスフェクションした植物細胞では、ゲミニウイ
ルスのDNA複製が減少することを測定した。
重要な点として、発明者の研究は、植物と動物の細胞が成長制御のために基本
的に同様の戦略を共有していると考えられること、従ってヒトRb蛋白ならびに
ZmRb1のような植物Rb蛋白は、特に植物の治療、診断、成長制御あるいは
研究において有用性を持つことが期待されること、およびそのような多くの植物
蛋白が動物において同様の有用性を持つであろうことを示唆していることである
。
本発明の最初の態様では、植物細胞および/または植物ウイ
ルスの増殖を制御する上での網膜芽細胞腫蛋白の使用を提供する。特に、本発明
は、ウイルスが正常な増殖のためにその蛋白のひとつたとえばウイルスRepA
蛋白中においてLXCXEアミノ酸モチーフの完全性を必要とする、植物細胞に
おけるウイルス感染および/または増殖の制御を提供する。そのようにして制御
される特定の植物ウイルスはゲミニウイルスである。
そのような蛋白を用いた制御の好ましい方法は、これらを直接に、あるいは処
理することを所望する植物細胞中にそれらの発現をコードするDNAあるいはR
NAを導入することによって、植物細胞に適用することを含む。網膜芽細胞腫蛋
白を過剰発現すること、あるいはウイルスのLXCXEモチーフと相互作用する
が細胞の通常の機能には影響を及ぼさないRb蛋白あるいはそのペプチド断片を
発現することにより、正常なウイルス増殖を阻害することができ、従ってその細
胞から近隣細胞へと感染を拡大させることも可能である。
あるいは、DNAあるいはRNA転写のために必要なプロモーターを含むベク
ターの形態で植物細胞中にアンチセンスDNAあるいはRNAを導入することに
より、Rb蛋白の発現、従ってS期への移行を阻害するために周知のアンチセン
ス機序を利
用することも可能であろう。そのような植物は、数ある態様の中でも特に、たと
えば酵母においてDNAあるいはRNAを高いレベルまで複製するのに役立つで
あろう。細胞中にアンチセンスDNAを導入する方法は当業者には周知である:
たとえば、「遺伝子操作の原理−遺伝子工学入門(1994)R.W.Old&
S.B.Primrose;Oxford−Blackwell Scien
tific Publications 第5版、p398参照。
本発明の第二の態様では、植物に特徴的なRb蛋白の発現をコードする、特に
DNAあるいはcRNA(mRNA)の形態の組換え核酸を提供する。この核酸
は、既知の動物Rb蛋白の核酸とは異なるひとつまたはそれ以上の特徴的な領域
を特徴とし、本文中の配列番号1、塩基31−2079によって例示される。
該DNAあるいはRNAは、配列番号1中のコドンのヌクレオチドに改変され
た置換を含む配列を持つことができ、かかるRNAにおいてはTはUである。最
も好ましいDNAあるいはRNAは、低いストリンジェント性を条件として配列
番号1のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、これは好
ましくは高いストリンジェント性を条件として生じるハイブリダイゼーションで
ある。
「低いストリンジェント性の条件」および「高いストリンジェント性の条件」
の表現は当業者には明白であるが、米国特許第5202257号、Col−9−
Col 10の中で好都合に例示されている。何らかの修飾が為されて、異なる
アミノ酸、好ましくは配列番号1に対応する同じ種類のアミノ酸を持つ蛋白の発
現が導かれる場合、それは保存的置換である。そのような置換は当業者には既知
であり、たとえば米国特許第5380712号が参照され、これは該蛋白が網膜
芽細胞腫蛋白に関して活性を持つ時にのみ想定される。
好ましいDNAあるいはcRNAは、特にp130と比較してヒトRb蛋白と
30%−75%の相同性、より好ましくは50%−64%の相同性を備えたAお
よびBポケットサブ領域を持つ植物Rb蛋白をコードする。特にそのようにコー
ドされた植物Rb蛋白は、保存されたヒトRbのC706アミノ酸を持つ。好ま
しくはAおよびBポケットの間のスペーサー配列は動物Rb蛋白に関しては保存
されず、そのような動物蛋白で認められる同じ領域と50%未満の相同性である
ことが好ましい。
最も好ましくはそのようにコードされた蛋白は、ここに添付される配列表の配列
番号2の蛋白と80%以上の相同性、より好ましくは90%以上、最も好ましく
は95%以上の相同性を持つ。特に、配列番号1の塩基31−2079、あるい
は配列番号1全体の組換えDNA、あるいは配列番号2のZmRb1をコードす
るトウモロコシcDNAクローンをコードする対応するRNAが提供される。
本発明の第三の態様では、第二の態様の組換えDNAあるいはRNAによって
発現される蛋白、そのようなDNAあるいはRNAから誘導される新規蛋白、お
よび変異誘発性PCRプライマーの使用のような突然変異誘発手段によって自然
に生じるDNAあるいはRNAから誘導される蛋白を提供する。
第四の態様では、本発明のコレクトセンスあるいはアンチセンスの組換えDN
AあるいはRNAを含むベクター、細胞、植物および動物を提供する。
第一態様の特に好ましい使用においては、第二あるいは第三態様のDNA、R
NAあるいは蛋白を細胞に投与することを含む、細胞あるいはウイルスの増殖を
制御する方法が提供される。かかる投与は、蛋白の場合には直接であってもよく
、あるいは
DNAによる植物種子細胞のエレクトロポレーション、あるいは細胞またはウイ
ルス増殖を抑制しうる本発明の蛋白あるいはその断片を発現するもしくは過剰発
現することができる発現ベクターによる細胞の形質転換のような間接的手段も含
みうる。
あるいは、該方法は本発明のcDNAのアンチセンスRNAを生成することが
できる発現ベクターを使用する。
該植物蛋白および核酸のもうひとつの特異的な特徴は、配列番号2のアミノ酸
1−90の配列に対応するN末端領域および配列番号1の塩基31−300に対
応するヌクレオチド配列を含む。これらの配列は、動物の配列が300以上のア
ミノ酸と900以上の塩基対を持つのに対し、150未満と450未満単位しか
有していないことを特徴とする。
制限を意図しない以下の実施例を参照して本発明をさらに例示する。当業者に
は、これらに照らして、ここに添付される特許請求の範囲内に含まれるさらなる
具体例が想定されるであろう。
図
図1.図1中の図Aは、本発明のZmRb1蛋白とヒト網膜芽細胞腫蛋白の相対
的長さを示す。図1中の図Bは、ZmRb1、
ツメガエル(Xenopus)、ニワトリ、ラットおよび3種類のヒト蛋白(R
b、p107およびp130)のポケットAとポケットBのアミノ酸配列を示す
。
図2.この図は、WDVウイルスとWDVから誘導されるpWoriベクターの
主要な特性と、LXCXEモチーフが植物細胞における複製に必要であることを
確認するために使用した欠失と突然変異の位置を示す地図である。実施例1 DNAおよび蛋白発現クローンの分離
トウモロコシの根と成葉から、基本的にSoniら(1995)が述べたよう
にして液体窒素中であらかじめ凍結しておいた材料を粉砕することにより、全R
NAを分離した。無作為プライミングした32P標識PStI内部断片(1.4
kb)にハイブリダイズして、主要と主要でないp75ZmRb1 mRNAを
同定した。
その後p130の相同トウモロコシの既知のEST配列に相補的にデザインし
た5’標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、1ZAPII(Stra
tagene)中のトウモロコシcDNAライブラリーの部分(106pfu)
を
スクリーニングした。これらのオリゴヌクレオチドは、5’−AATAGACA
CATCGATCAA/G(M.5m、nt位置1411−1438)と5’−
GTAATGATACCAACATGG(M.3c、nt位置1606−159
0)(Isogen Biosciences)であった。
2回目のスクリーニング後、製造者が勧めるプロトコールに従ってExAss
istヘルパーファージ(Stratagene)でのin vivo切除によ
り、陽性クローンからpBluescript SK−(pBS)ファージミド
を分離した。SequenaseTMキット(USB)を用いてDNA塩基配列
決定を行った。
p75ZmRb1をコードするmRNAの5’末端をRACE−PCRによっ
て決定した。ポリ−A+mRNAをオリゴ−dT−セルロース(Amersha
m)でのクロマトグラフィーによって精製した。オリゴヌクレオチドDraI3
5(5’−GATTTAAAATCAAGCTCC、nt位置113−96)を
用いて最初の鎖を合成した。90℃で3分間変性した後、RNアーゼ処理によっ
てRNAを取り除き、cDNAを回収して、ターミナルトランスフェラーゼとd
ATPで5’尾部を
付加した。その後、プライマーDraI35とStratagene cDNA
合成キットのリンカー−プライマー(50塩基対)を用いてPCR断片を増幅し
た。
そのようにして生成した陽性クローンのひとつは、制限分析に従えば、使用し
た発現配列タグに含まれる領域の5’および3’に伸びる〜4kb挿入部分を含
んでいた。最長のcDNA挿入部分(3747塩基対)に対応するヌクレオチド
配列を配列番号1に示す。このZmRb1 cDNAは、683アミノ酸の蛋白
(予想上のMr 75247、p75ZmRb1)をコードすることができる単
一オープンリーディングフレームとそれに続く1646塩基対の3’非翻訳領域
を含む。同様の長さの非翻訳領域は、哺乳類のRb cDNAにおいても認めら
れている(Lee,W.−L.ら、Science 235,1394(198
7);Bernards,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 86,6474(1989))。ノザンブロット分析は、根の***組織と
成葉の両方から誘導したトウモロコシ細胞が、長さ〜2.7±0.2kbの主要
メッセージを含むことを示唆している。さらに、〜3.7±0.2kbのマイナ
ーメッセージも現われる。他の種で異種起源の転
写産物が検出されている(Destree,O.H.J.ら、Dev.Biol
.153,141(1992))。
pWoriにおいてWDV蛋白をコードする配列の大部分を削除することによ
り、プラスミドpWori△△を構築した(SanzとGutierrez、未
発表)。pBSベクターにおいてZmRb1 cDNAの上流にCaMV 35
Sプロモーター(pWDV3:35SGUSから得た)を挿入することにより、
プラスミドp35S.Rb1を構築した。ZmRb1配列の代わりにヒトp13
0の完全なコード配列をp35S.Rb1に導入することにより、プラスミドp
35S.130を構築した。p35S.Rb1プラスミドにおいてZmRb1の
代わりにWDV RepAとRepB ORFsをコードする配列に置換するこ
とにより、プラスミドp35.A+Bを構築した(Soni,R.とMurra
y,J.A.H.Anal.Biochem.218,474−476(199
4)参照)。
ヌクレオチド第31位置のメチオニンコドン付近の配列はコンセンサス翻訳開
始を含む(Kozak,M.J.Mol.Biol.196,947(1987
))。cDNAが完全な長さのZmRb1コード領域を含むかどうかを調べるた
めに、
推定上のイニシエーターAUGに近接する領域から誘導したオリゴヌクレオチド
を用いたRACE−PCRによって、mRNAの5’末端を増幅した。これは〜
150塩基対の断片を生じるはずである。結果は、完全なコード領域を含むZm
Rb1cDNAクローンと一致している。
ZmRb1蛋白は、Rbファミリーのすべてのメンバーにおいて存在する「ポ
ケット」のAおよびBサブ領域と相同な区域を含む。これらのサブ領域は保存さ
れないスペーサーによって分けられている。ZmRb1も、保存されていないN
末端とC末端領域を含む。全体として、ZmRb1はRbファミリーのメンバー
と〜28−30%のアミノ酸同一性(〜50%の類似性)を共有し(Hanno
n,G.J.,Demetrick,D.& Beach,D.Genes D
ev.7,2378(1993);Cobrinik,D.,Whyte,P.
,Peeper,D.S.,Jacks,T.& Weinberg,R.A.
同上、p.2392(1993)、Ewen,M.E.,Xing,Y.Law
rence,J.B.およびLivingston,D.M.Cell 66,
1155(1991))(Lee W.L.ら、Science 235,13
94
(1987);Bernardsら、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 86,6974(1989))、AおよびBサブ領域が最も高い相同性
を示す(〜50−64%)。興味深いことに、その機能にとって極めて重要なヒ
トRbのアミノ酸C706(Kaye,F.J.,Kratzke R.A.,
Gerster,J.L.およびHorowitz,J.M.Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 87,6922(1990))も、トウモロコ
シp75ZmRb1中に保存されている。
注:561−577アミノ酸はプロリンに富む領域を含む。
ZmRb1は、リン酸化の潜在的部位であるサブ領域Aの5’尾部のひとつお
よびC末端領域のいくつかと共に、サイクリン依存性キナーゼ(CDKs)によ
るリン酸化のための16のコンセンサス部位、SPあるいはTPを含む。核酸は
、これらの部位のひとつまたはそれ以上が変化あるいは欠失していて、蛋白をリ
ン酸化に対して、従ってその機能性に対してより抵抗性にしている、たとえばE
2Fあるいは同様のものに結合している蛋白をコードするものが好ましい。これ
は、PCRによって行われる突然変異誘発によって容易に実施できる。実施例2 in vivo活性
コムギ矮小性ゲミニウイルス(WDV)の複製は、ウイルスRepA蛋白の無
傷のLXCXEモチーフに依存している。このモチーフは、酵母においてヒトR
bファミリーのメンバーであるp130との相互作用を仲介することができる。
それ故、発明者は、酵母の2ハイブリッド系を用いることによりp75ZmRb
1がWDV RepAと結合することができるかどうかを検討した(Field
s,S.とSong,O.Nature340,245−246(1989))
。酵母細胞を、融合GAL4BD−RepA蛋白をコードするプラスミドおよび
異なるGAL4AD融合蛋白をコードするプラスミドで同時形質転換した。GA
L4AD−p75ZmRb1融合も、GAL4BD−RepAと結合して、ヒス
チジン不在下でレシピエント酵母細胞を増殖させることができた。この相互作用
は、ヒトp130蛋白に関して見られるものよりもわずかに強かった。RepA
も、p75ZmRb1のN末端切断形態にある程度まで結合することができた。
RepA−p75ZmRb1相互作用におけるLXCXEモチーフの役割を、我
々が以前にヒトp130と
の相互作用を破壊することを示したWDV RepAの点突然変異(E198K
)を用いて評価した。融合GAL4BD−RepA(E198K)をコードする
プラスミドとZmRb1の同時形質転換は、RepAとp75ZmRb1間の相
互作用がLXCXEモチーフを通して起こることを示唆した。
これに関して、WDV RepAのE198K突然変異体は、動物のウイルス
性腫瘍蛋白の類似点突然変異体と同様に行動する(Moran,E.,Zerl
er,B.,Harrison,T.M.およびMathews,M.B.Mo
l.CellBiol.6,3470(1986);Cherington,V
.ら、同上、p.1380(1988);Lillie,J.W.,Lowen
stein,P.M.,Green,M.R.およびGreen,M.Cell
50,1091(1987);DeCarpio,J.A.ら、同上、p.27
5(1988))。
酵母2ハイブリッド系におけるトウモロコシp75ZmRb1とWDV Re
pAの特異的相互作用(Fieldsら)は、DNA結合領域(GAL4BD)
と活性化領域(GAL4AD)を含む2つの分離したGAL4融合蛋白から機能
的GAL4活性を再形成する能力に依存した。酵母HF7c細胞を、GAL4B
D
−RepAあるいはGAL4BD−RepA(E198K)融合を発現するプラ
スミド、およびGAL4AD単独(Vec)またはヒトp130に融合したGA
L4AD、トウモロコシp75(p75ZmRb1)あるいはp75の69アミ
ノ酸のN末端欠失(p75ZmRb1−DN)を発現するプラスミドで同時形質
転換した。左上方の隅に示された分布に従って、ヒスチジンと共にあるいはヒス
チジンなしで細胞を平板に線条接種した。ヒスチジンなしで増殖する能力は、融
合蛋白の相互作用に対するGAL4活性の機能的再形成に依存する。これが、G
AL4応答因子の制御下にあるHIS3遺伝子の発現の引き金となるからである
。これらの酵母同時形質転換株の増殖特性はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベル
と相関する。
2ハイブリッド分析の方法はXieら(1995)の中で述べられている。G
AL4AD−ZmRb1融合をpGAD424ベクターにおいて構築した。実施例3 in vivo活性
ゲミニウイルスのDNA複製は、細胞DNA複製の機序ならびに他のS期特異
的因子を必要とする(Davies,J.W.
とStanley,J.Trends Genet.5,77(1989);L
azarowitz,S.Crit.Rev.Plant Sci.11,32
7(1992))。この必要条件と一致して、ゲミニウイルス感染は、通常は分
化細胞の核中には存在しない蛋白である増殖細胞核抗原(PCNA)の蓄積が示
すように、非増殖性細胞をS期へと推し進めると思われる(Nagar,S.,
Pedersen,T.J.,Carrick,K.M.,Hanley−Bo
wdoin,L.およびRobertson,D.Plant Cell 7,
705(1995))。Rbの植物相同体の発見と、効率的なWDV DNA複
製がRepAにおける無傷のLXCXEモチーフを必要とするという発明者の所
見はとが一緒になって、動物細胞におけるように、ウイルスRepA蛋白による
植物Rbの分離は感染細胞のS期への不適切な進行を促進するというモデルを裏
付けている。それ故、p75ZmRb1の機能を検討するひとつの方法は、植物
細胞でのプロモーター機能下でZmRb1配列を含むプラスミドでトランスフェ
クションした細胞においてゲミニウイルスのDNA複製を測定することであった
。これは以前にヒト細胞において使用されたものに類似したアプローチ
である(Uzvolgi,E.ら、Cell GrowthDiff.2,29
7(1991))。WDV複製蛋白の発現がWDVプロモーターあるいはCaM
V 35Sプロモーターのいずれかによって指令される時には、p75ZmRb
1あるいはヒトp130を発現するプラスミドでトランスフェクションしたコム
ギ細胞において、新たに複製されるウイルス性プラスミドDNAの蓄積が損なわ
れた。
WDV DNA複製はS期細胞環境を必要とするので、p75ZmRb1およ
びヒトp130によるウイルスDNA複製への干渉は、植物でのG1/S移行の
制御における網膜芽細胞腫蛋白の役割を強く示唆している。植物Rb相同体の存
在は、それらの古来からの相違にもかかわらず、植物と動物の細胞が、少なくと
も一部には、細胞周期の制御のために同様の調節蛋白と経路を用いていることを
意味する。
2つの系の証拠がこのモデルを支持している。第一に、出芽酵母cdc28突
然変異体のG1/S移行を特異的に補完するが、G2/M移行は補完しない蛋白
をコードする遺伝子がアルファルファ細胞において同定された(Hirt,H.
,Pay,A.,Bogre,L.,Meskiene,I.および
Heberle−Bors,E.Plant J.4,61(1993))。第
二に、D型サイクリンの植物相同体がシロイスナズナ(Arabidopsis
)から分離され、これらは、その哺乳類類縁と同様にLXCXEモチーフを含ん
でいる。CDK4およびCDK6の植物バージョンと共に、植物D型サイクリン
はRb様蛋白のリン酸化状態を制御することによってG1期への移行を調節する
と考えられる。
動物細胞においては、Rbファミリーは腫瘍抑制および分化と発育の制御に関
係づけられてきた。従って、p75ZmRb1も、植物細胞生存期間の他のレベ
ルで鍵となる調節の役割を果たすと考えられる。植物細胞におけるRb相同体の
存在によって提起されるひとつの重要な疑問は、動物におけるように、Rb経路
の分断は腫瘍を生じやすい状態を導くかどうかということである。これに関して
、発明者は、Agrobacterium tumefaciensとA.rh
yzogenesのTiプラスミドによってコードされているVirB4蛋白が
LXCXEモチーフを含むことを認めた。腫瘍誘発にはVirB4蛋白が必要で
あるが(Hooykas,P.J.J.とBeijersbergen,A.G
.M.Annu.Rev.Phyto
pathol.32,157(1994))、この状況におけるLXCXEモチ
ーフの機能は今後の検討課題である。ゲミニウイルス感染は感染した植物におけ
る腫瘍発現を伴わないが、一部の場合には活動中の異常発育が認められている(
G.DafallaとB.Gronenborn、私的通信)。
培養したコムギ細胞におけるZmRb1あるいはヒトp130によるコムギ矮
小性ゲミニウイルス(WDV)のDNA複製の阻害を次のように実施した。A.
コムギ細胞を、指示されたように、ウイルスDNA複製に必要なWDV蛋白をコ
ードする複製WDVベースのプラスミド、pWori単独(0.5g)(Xie
ら、1995)で、ならびに対照プラスミド、pBS(10g)あるいはCaM
V 35Sプロモーターの制御下でZmRb1配列をコードするp35S.Rb
1(10g)でトランスフェクションした。全DNAをトランスフェクション後
1日目と2日目に精製し、等しい量をアガロースゲルに分割して、エチジウムブ
ロマイド染色し、サザンハイブリダイゼーションによってウイルスpWoriD
NAを同定した。プラスミドDNAはもっぱら新たに複製されたプラスミドDN
Aを表わす。これはDpnI消化には完全に耐性で、Mbolに対して
感受性があるからである。MboI消化したサンプルは、消化していないサンプ
ルの約半分の長さであったことに留意しなければならない。B.WDV DNA
複製へのヒトp130の影響を調べるため、コムギ細胞をpWori(0.5g
)およびプラスミドpBS(対照)、p35S.Rb1あるいはp35S.13
0(各々10g)で同時トランスフェクションした。被検プラスミド(pWor
i)の複製をトランスフェクションの2日後に分析し、エチジウムブロマイド染
色とサザンハイブリダイゼーションを用いてパートAで述べたように検出した。
C.ウイルス蛋白の発現がCaMV 35Sプロモーターによって指令された時
のWDV DNA複製へのZmRb1あるいはヒトp130の影響を調べるため
、被検プラスミドpWori△△(機能的WDV複製蛋白をコードしていないが
、異なるプラスミド、すなわちpWoriによってそれらが与えられた時に複製
する)を使用した。コムギ細胞を、指示されたように、pWori△△(0.2
5g)、pWori(0.25g)、p35S.A+B(6g)、p35S.R
b1(10g)および/またはp35S.130(10g)で同時トランスフェ
クションした。トランスフェクションの36時間後に被検プラス
ミド(pWori△△)の複製を分析し、エチジウムブロマイド染色とサザンハ
イブリダイゼーションを用いてパートAで述べたように検出した。プラスミドp
Wori(M1)とpWori△△(M2;SanzとGutierrez,未
発表)、各々100pgをマーカーとして使用した。DNA抽出をSoniとM
urray,Arnal.Biochem.218,474−476(1995
)のように修正したことを除いて、コムギ細胞の懸濁培養、粒子衝撃によるトラ
ンスフェクションおよびウイルスDNA複製の分析をXieら、(1995)が
述べたようにして実施した。
微生物の寄託に関する情報
開示の6ページで言及されている微生物は下記の施設に寄託された:
COLECCION ESPANOLA DE CULTIVOS TIPO(
CECT)
Departamento de Microbiologia Facult
ad de Ciencias Biologicas 46100 BURJ
ASOT(Valencia)Spain
寄託同定番号:pBS.Rb1
寄託日:1996年6月12日
整理番号:4699
この情報は願書に同封される書式PCE/RO/134に反映されていると思
われる。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】平成10年7月16日(1998.7.16)
【補正内容】
請求の範囲
1.組換え核酸をその中に組み込むことによって植物細胞中の網膜芽細胞腫蛋白
のレベルおよび/または活性を上昇させるあるいは低下させることを含む、その
細胞内での植物細胞あるいは植物ウイルスの増殖を制御する方法。
2.核酸が、細胞における網膜芽細胞腫蛋白の発現を上昇させるあるいは抑制す
ることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
3.核酸が、細胞の通常の機能には影響を及ぼさずにウイルスのLXCXEモチ
ーフと相互作用する網膜芽細胞腫蛋白あるいは網膜芽細胞腫蛋白のペプチド断片
を発現することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
4.網膜芽細胞腫蛋白が、配列番号2において認められるひとつまたはそれ以上
のコンセンサスSPあるいはTP部位の変化あるいは欠失によって、サイクリン
依存性キナーゼによるリン酸化に耐性となっていることを特徴とする、請求項3
に記載の方法。
5.DNAあるいはRNAが、DNAあるいはRNAをコードする網膜芽細胞腫
蛋白に対してアンチセンスであり、網膜芽細
胞腫蛋白の発現を抑制することを特徴とする、請求項2に記載の方法。
6.アンチセンスRNAをコードする核酸を網膜芽細胞腫植物蛋白に導入するこ
とを含む、細胞周期のS期を指令するように植物細胞を形質転換する方法。
7.網膜芽細胞腫蛋白が、ここに添付される配列表の配列番号2の配列と80%
以上の相同性を備えたアミノ酸配列を持つことを特徴とする網膜芽細胞腫蛋白の
発現をコードする組換え核酸。
8.配列番号1の塩基31−207、その改変置換だけを持つ配列、あるいは高
いストリンジェント性の条件下で配列番号1のボリヌクレオチドとハイブリダイ
ズすることができる配列を含むことを特徴とする、請求項7に記載の組換え核酸
。
9.配列番号2に関して保存的に置換される網膜芽細胞腫蛋白をコードすること
を特徴とする、請求項7または8に記載の組換え核酸。
10.網膜芽細胞腫植物蛋白に対するアンチセンスDNAあるいはRNAを含む
ことを特徴とする組換え核酸。
11.配列番号2を含む網膜芽細胞腫植物蛋白あるいはそれと
少なくとも80%の相同性を持つ配列に対するアンチセンスDNAあるいはRN
Aを含むことを特徴とする、請求項10に記載の組換え核酸。
12.配列番号1の配列あるいはそれと少なくとも80%の相同性を持つ配列に
対するアンチセンスDNAあるいはRNAを含むことを特徴とする、請求項10
または11に記載の組換え核酸。
13.植物細胞の通常の機能には影響を及ぼさずにウイルスのLXCXEモチー
フと相互作用する網膜芽細胞腫蛋白あるいは網膜芽細胞腫蛋白のペプチド断片を
コードすることを特徴とする組換え核酸。
14.配列番号2において認められるひとつまたはそれ以上のコンセンサスSP
あるいはTP部位が変化あるいは欠失している網膜芽細胞腫植物蛋白をコードす
ることを特徴とする、請求項13に記載の組換え核酸。
15.請求項7ないし9、13および14のいずれか一項に記載の組換えDNA
あるいはRNAの発現によって生成される蛋白。
16.配列番号2において認められるひとつまたはそれ以上の
コンセンサスSPあるいはTP部位が変化あるいは欠失していることを特徴とす
る、請求項15に記載の蛋白。
17.請求項7ないし9、13および14のいずれか一項に記載の組換え核酸を
含むことを特徴とする組換えベクター。
18.網膜芽細胞腫蛋白の発現をコードする組換え核酸を含むことを特徴とする
植物細胞。
19.請求項7ないし9、13および14のいずれか一項に記載の組換え核酸を
含むことを特徴とする、請求項18に記載の植物細胞。
20.該核酸から網膜芽細胞腫蛋白を発現することを特徴とする、請求項18ま
たは19に記載の植物細胞。
21.請求項18ないし20のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とす
るトランスジェニック植物。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG
,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT
,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,
CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,F
I,GB,GE,GH,HU,IL,IS,JP,KE
,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,
LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M
X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE
,SG,SI,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,
UG,US,UZ,VN,YU,ZW
(72)発明者 シー,チ
スペイン国、エ―28049・カントブランコ、
ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント
ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ
ロ・オチヨアー”(セ・エセ・イ・セ―
ウ・ア・エメ)(番地なし)
(72)発明者 ペラヨ,サンス―ブルゴス・アンドレス
スペイン国、エ―28049・カントブランコ、
ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント
ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ
ロ・オチヨアー”(セ・エセ・イ・セ―
ウ・ア・エメ)(番地なし)
(72)発明者 スアレス,ロペス・パウラ
スペイン国、エ―28049・カントブランコ、
ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント
ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ
ロ・オチヨアー”(セ・エセ・イ・セ―
ウ・ア・エメ)(番地なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.植物細胞および植物ウイルスの増殖および/または複製の制御のための網膜 芽細胞腫(retinoblastoma)(Rb)蛋白の使用。 2.ウイルスが正常な増殖のためにその蛋白のひとつにおいてLXCXEアミノ 酸モチーフの完全性を必要とすることを特徴とする、請求項1に記載の使用。 3.ウイルスがゲミニウイルスである、請求項1に記載の使用。 4.転写因子を放出するためにウイルスが網膜芽細胞腫(Rb)蛋白と結合する ことを特徴とする、請求項1に記載の使用。 5.植物細胞における網膜芽細胞腫蛋白のレベルおよび/または活性の上昇ある いは低下を含む、その細胞内での植物細胞あるいは植物ウイルスの増殖および/ または複製を制御する方法。 6.直接適用によって蛋白のレベルを上昇させることを特徴とする、請求項5に 記載の方法。 7.蛋白の発現をコードするDNAあるいはRNAを、処理することを所望する 植物細胞内に導入することによって蛋白のレベルを上昇させることを特徴とする 、請求項5に記載の方法。 8.蛋白が過剰発現される請求項5、6あるいは7に記載の方法。 9.細胞の成長あるいは通常のウイルス増殖を抑制するように、ウイルスのLX CXEモチーフと相互作用するが細胞の正常な機能には影響を及ぼさないRb蛋 白あるいはそのペプチド断片を発現することを含む、植物細胞あるいは植物ウイ ルスの増殖および/または複製を制御する方法。 10.動物Rb蛋白とは共通しない、ひとつまたはそれ以上の植物Rb蛋白の特 徴を持つRb蛋白の発現をコードする組換え核酸。 11.既知の動物Rb蛋白の核酸とは異なるひとつまたはそれ以上の特徴的領域 を含むことを特徴とする、請求項10に記載の核酸。 12.ヒトRb蛋白と30%−75%の相同性を備えた配列を含むAおよびBポ ケットサブ領域を有する植物Rb蛋白をコードする、DNAあるいはcRNA形 態の組換え核酸。 13.p130 Rb網膜芽細胞腫蛋白と30%−75%の相同性を備えた配列 を持つ、請求項12に記載の核酸。 14.動物あるいはp130 Rb網膜芽細胞腫蛋白と50% −64%の相同性を持つことを特徴とする、請求項12あるいは13に記載の核 酸。 15.ヒトRbのC706アミノ酸をコードする、請求項12ないし14のいず れか一項に記載の核酸。 16.AとBポケット間のスペーサー配列が動物Rb蛋白に関しては保存されな い、請求項12ないし15のいずれか一項に記載の核酸。 17.スペーサー配列が、網膜芽細胞腫動物蛋白において認められる同じ領域と 50%未満の相同性を持つ、請求項16に記載の核酸。 18.配列番号2と80%以上の相同性を持つ、請求項12ないし17のいずれ か一項に記載の核酸。 19.相同性が90%以上である、請求項18に記載の核酸。 20.配列番号1の塩基31−2079に対応する配列を含む組換えDNA。 21.配列番号1に対応する配列を含む組換えDNA、あるいは配列番号2のZ mRb1をコードするトウモロコシcDNAクローンをコードする、対応するR NA。 22.請求項12ないし21のいずれか一項に記載の組換え DNAあるいはRNAによってコードされる蛋白、あるいはかかるDNAあるい はRNAから誘導される新規蛋白、ならびに突然変異誘発手段によって変化させ た、自然に生じるDNAあるいはRNAから誘導される蛋白。 23.突然変異誘発手段が、突然変異誘発性PCRプライマーを用いた突然変異 誘発を含む、請求項22に記載の蛋白。 24.請求項10ないし21のいずれか一項に記載されているものと同じ核酸配 列を有する遺伝子である、網膜芽細胞腫植物蛋白をコードする遺伝子のアンチセ ンスDNAあるいはRNA。 25.請求項12ないし22のいずれか一項に記載のDNAあるいはRNAを含 むベクター、細胞、植物あるいは動物。 26.網膜芽細胞腫蛋白に対するアンチセンスDNAあるいはRNAを細胞に組 み込むことによってこの細胞中の網膜芽細胞腫植物蛋白のレベルを低下させるこ とを含む、植物性細胞あるいは植物ウイルスの増殖および/または増殖を制御す るための方法。 27.請求項22に記載されている蛋白をコードするcDNA。 28.ひとつまたはそれ以上の部位が変化あるいは欠失していて、蛋白をリン酸 化に対して、従ってその機能性に対してより 抵抗性にしている、たとえばE2Fあるいは同様のものに結合している蛋白をコ ードする核酸。 29.請求項28に述べられている核酸によってコードされる蛋白。
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