WO1997034004A1 - β-FRUCTOFURANNOSIDASE ET SON GENE, PROCEDE D'ISOLEMENT DU GENE DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE, SYSTEME POUR LA PRODUCTION DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE, ET VARIANT DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE - Google Patents

β-FRUCTOFURANNOSIDASE ET SON GENE, PROCEDE D'ISOLEMENT DU GENE DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE, SYSTEME POUR LA PRODUCTION DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE, ET VARIANT DE β-FRUCTOFURANNOSIDASE Download PDF

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WO1997034004A1
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fructofuranosidase
amino acid
dna
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seq
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PCT/JP1997/000757
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French (fr)
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Koji Yanai
Akitaka Nakane
Hirofumi Nakamura
Yuko Baba
Akemi Watabe
Masao Hirayama
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present invention relates to S-fructofuranosidase, its isolation method and its production, and more particularly, the present invention relates to novel / S-fructofuranosidase and a DNA encoding the same, and / or A method for isolating DNA that encodes S-fructofuranosidase, 9-a novel filamentous fungus that does not exhibit fructofuranosidase activity, and the production of recombinant / 3-fructofuranosidase using this filamentous fungus as a host And a method for selectively and efficiently producing a specific fructooligosaccharide, such as 1-gestose, from sucrose; a 3-fructofuranosidase variant.
  • a specific fructooligosaccharide such as 1-gestose
  • fructooligosaccharides are indigestible sugars in which 1 to 35 ⁇ fructose is linked to the fructose of sucrose at the C1 and C2 positions by; 3 bonds. It has been found that it has excellent physiological effects such as aquaculture (effects of improving lipid metabolism such as cholesterol, intractable caries).
  • Fructooligosaccharides are widely distributed in plants in nature, and are known to be contained in, for example, asparagus, onion, jerusalem artichoke, honey, etc., but recently, 9-fructofurano derived from 3 ⁇ 4i ⁇
  • the technology for large-scale production from sucrose using the transfer reaction of sidase has been developed and is being industrialized.
  • Fractooli The / 9-fructofuranosidase preparation used in industrial production of glycose uses 9-fructofuranosidase derived from Aspergillus niger, and therefore contains a relatively large amount of contaminating proteins. ing.
  • fructofuranosidase see bacteria (Fouet, A., Gene, 45, 221-225 (1986), Martin.I. Et al., Mol. Gen. Genet. , 208, 177-184 (1987), Steininctz, U. et al., Itol. Gen. Genet., 191, 138-144 (1983), Schol le, R. et al., Gene, 80, 49-56. (1989), Aslanidis, C. et al., J. Bacteriol., 171, 6753-6763 (1989), Sato, Y. and Kuramitsu, H .., Infect. Immun., 56, 1956-1960 (1989) , Gunasekaran.P. Et al., J. Bacteriol. .172, 6727-6735 (1990)), yeast (Taussing, E, and M.
  • 9-fructofuranosidase ⁇ such as, it is essential that its production system be.
  • ⁇ of the host that does not utilize sucrose is essential.
  • the resulting S3 ⁇ 4 is derived from the host-derived / 9-fructofuranosidase and the introduced ⁇ 3-fructofuranosidase. It becomes a mixture of furanosidases.
  • L and m * substances that do not show ctofuranosidase activity include several strains, such as the aforementioned Trichoderma, and yeasts lacking sucrose assimilation (Oda, Y., supra). ) Are known. However, when considering that the field of application of the produced ⁇ -fructofuranosidase is the food field, a long L, experienced in food, used for industrial production of enzymes, etc., it is highly safe to use aspergillus. Among filamentous fungi, it is desirable to use a strain that does not show ⁇ -futofuranosidase activity as a host.
  • 1-Kestose and nystose are sucrose fructoses bound to one and two molecules of fructose, respectively, and are one of the commercially produced fructo-oligosaccharide mixtures. It has recently been found that, by preparing each of these to a high degree and crystallizing them, physical properties and food processing, new superior properties, and the like appear while maintaining the physiological effects as fructooligosaccharides. These can be said to be fructo-oligosaccharides having new features. (Nipponhei 7-122-923, JP-A-6-31160).
  • the properties of S3 ⁇ 4 having fructose transfer activity used in this method include It is required not only that the conversion rate to toose is high, but also that the yield of nystose, which acts in an inhibitory manner in each step of chromatographic separation and crystallization, is low.
  • the conversion rate of sucrose to 11 gestose when using enzymes derived from Aspergillus niger, which is currently used for industrial production of fructooligosaccharide mixtures, is 44%.
  • the formation rate of the gas was 7% (Japanese Patent Application No. 8-646882). It can be said that the properties of this enzyme leave room for improvement in terms of the production of crystals per guest.
  • the properties such as productivity and stability of the enzyme are equivalent to those of the enzyme derived from Aspergillus niger currently used for industrial production of fractoligo sugar mixtures, and the conversion rate of sucrose to 1-kestose Such properties are expected to be developed to be equivalent to LL or Rock Forty Scobra liopsis brevicauris or to be LL.
  • the present inventors have now succeeded in isolating a novel 9-fructofuranosidase ⁇ , and furthermore, have used the novel ⁇ ⁇ ? To isolate 5t3t of other S-fructofuranosidases. did.
  • the present inventors have developed a novel filamentous fungus that does not exhibit i9-fructofuranosidase activity. We succeeded in the production of a recombinant fructofuranosidase using this filamentous fungus as a host.
  • the present inventors have found that by changing the amino acid sequence of 9-fructofuranosidase having fructosyltransferase activity, its properties can be changed, and a specific fructooligosaccharide such as 1-gestose, A 3 / 3-fructofuranosidase mutant that selectively and efficiently produces E. coli was also successfully produced.
  • the present invention is based on the above findings.
  • a novel / 3-fructofuranosidase gene and a / 3-fructofuranosidase encoded thereby there is provided a method for isolating fructofuranosidase using the novel 3-fructofuranosidase II.
  • a novel 3-fructofuranosidase was provided by the method according to the second aspect of the present invention.
  • a novel filamentous fungus having no yS-fructofuranosidase activity and production of recombinant 9-fructofuranosidase using the same as a host.
  • a / 9-fructofuranosidase mutant that selectively and efficiently produces a specific fructo-oligosaccharide, for example, 1-gestose, from sucrose.
  • the method for isolating S-fructofuranosidase ⁇ fe ⁇ comprises the steps of: ⁇ SiS ⁇ J comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2 et et By utilizing the homology of, ⁇ -factofuranosidase is isolated.
  • novel 9-fructofuranosidase isolated by the method according to the second aspect of the present invention is a polynucleotide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13 in the sequence listing or a homolog thereof. It is a pseudo.
  • the filamentous fungus according to the third aspect of the present invention is characterized in that a part or all of / 3-fructofuranosidase on the chromosomal DNA of a parent filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus is deleted. ⁇ It is considered to have no fructofuranosidase activity.
  • the S-fructofuranosidase mutant according to the fourth aspect of the present invention is a 5-fructofuranosidase mutant having fructose transfer activity that can be obtained as a result of mutating the parent 3-fructofuranosidase.
  • the mutation is an insertion, substitution or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence of the parent S-fructofuranosidase, or addition to one or both ends thereof, and a sucrose as a substrate.
  • the composition of fructooligosaccharides generated using the fructosyltransfer reaction of the / 3-fructofuranosidase mutant is different from that of the parent / 3-fructofuranosidase. It is. Brief description of]
  • FIG. 1 shows an expression vector pAW20-Hyg incorporating the 9-fructofuranosidase gene according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the expression vector pPRSO1-Hyg incorporating the novel / S-fructofuranosidase isolated by the method according to the second aspect of the present invention.
  • Figure 3 shows the nia D ⁇ gene derived from Aspergillus niger NRR L433 strain. It is a restriction map of the DNA fragment containing.
  • FIG. 4 is a diagram showing a method for preparing plasmid pAN203.
  • FIG. 5 is a diagram showing a method for producing plasmid PAN572.
  • FIG. 6 is a diagram showing a restriction enzyme diagram of plasmid pAN120.
  • FIG. 7 is a diagram showing a method for producing plasmid pY2831.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a method of extracting the plasmid pYSUC (F170W).
  • FIG. 9 is a diagram showing the PS3 ⁇ 4 method of plasmid pAN531.
  • novel filamentous fungus Aspergillus niger NIA 1602 strain having no 3-fructofuranosidase activity according to the present invention was obtained under the accession number of F ERM-BP 5853 on March 6, 1997 under the trade Deposited at the Life Science and Technology Research Institute (Ibaraki, Japan :! 3 ⁇ 4m Tsukuba mmi-chome 1-3). / 3-fructofuranosidase according to the first aspect of the present invention
  • the polypeptide according to the first aspect of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has 3-fructofuranosidase action! Acts as ⁇ .
  • the polypeptide according to the present invention includes a homologue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the term "homolog” refers to an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which some amino acids have been inserted, substituted or deleted, or has been deleted at one or both ends.
  • j8 the substance that has fructofuranosidase action.
  • Such "homologues" can be selected without particular difficulty by those skilled in the art with reference to the sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is clear that it can be selected and manufactured.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has fructofuranosidase, which has high transfer activity and efficiently produces fructooligosaccharides. Specifically, in a reaction using a sucrose solution having a concentration of 10% by weight or more as a substrate, the transfer activity is 10 times or more higher than the hydrolysis activity, and the conversion rate to fructooligosaccharide is 50% or more. It is. According to the first embodiment of the present invention / g-fructofuranosidase ⁇ fe?
  • a DNA fragment comprising a DNA sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, as a novel DNA encoding / 3-fructofuranosidase.
  • a preferred specific example of the novel protein according to the present invention is represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • a DNA fragment comprising the DNA sequence.
  • DNA sequence encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 refers to a DNA sequence having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the same degenerate codons are used. And a ⁇ S sequence encoding the amino acid represented by l ⁇ ij number 1.
  • ff ⁇ S according to the present invention includes a homolog of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Therefore, the DNA fragment according to the present invention further includes a nucleotide sequence encoding this homolog.
  • the DNA fragment according to the present invention has a predetermined 3 ⁇ 4g sequence, its DNA One means for obtaining fragments is to produce them according to the technique of nucleic acid synthesis.
  • the sequence may be obtained from Aspergillus niger, preferably from Aspergillus niger AC E-2-1 strain (FERM-P5886 or ATCC 20611), using a fei engineering technique. Can be. The specific method is described in detail in Example A below.
  • 8-fructofuranosidase can be produced in a host cell transformed with the DNA fragment encoding it. More specifically, a DNA molecule containing a DNA fragment encoding jS-fructofuranosidase according to the first aspect of the present invention in a state capable of replicating in a host cell and expressing the same, particularly An expression vector is used to transform the host cell, and the transformant is cultured.
  • DNA containing ⁇ F encoding the / S-fructofuranosidase according to the present invention particularly an expression vector and a DNA.
  • This DNA can be obtained by incorporating a DNA fragment encoding the / 3-fructofuranosidase according to the present invention into a vector.
  • the vector is a plasmid.
  • the creation of the DNA according to the present invention may be performed according to a method commonly used in the field of engineering.
  • the vector used in the present invention can be appropriately selected from a virus, a plasmid, a cosmid vector, etc., while taking into consideration the type of the host cell to be used.
  • the host cell is: «For bacteria, sphage-type pacteriophage, PBR, pUC-type plasmid, for Bacillus subtilis, pUB-type plasmid, for yeast, YEp, YCp-type vector No.
  • This plasmid preferably contains a selectable marker for the transformant, and as the selectable marker, a drug resistance marker and an auxotrophic marker gene can be used.
  • Preferred examples thereof include ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, tetracycline resistance ffiit gene when the host cell used is a bacterium, and tributophan synthesis gene fe ⁇ (TRP 1) when the host cell is a yeast. , Peracil synthesis gene (U RA3), leucine synthesis gene ⁇ (LEU2), and in the case of mold, hygromycin resistance ttite ⁇ (Hy g), bialaphos resistance gene (Bar). Child (ni aD).
  • the DNA as an expression vector according to the present invention may be used in the form of a DNA sequence for expression of ⁇ -ctofuranosidase ⁇ , such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a transcription termination signal, a transcription termination signal, and the like. Signal, translation control signal, etc.
  • the promoter may be a promoter capable of functioning in a host contained in the inserted fragment, a promoter such as lactose operon (lac) in Escherichia coli, a promoter such as tributofan operon (trp), or a yeast such as alcohol dehydrogenase. ⁇ ⁇ f (ADH), acid phosphatase ⁇
  • the host cell is Bacillus subtilis, yeast, or mold
  • any host cell can be used if it is used as a host, but yeast, mold and the like are preferable. It is also preferable to use a filamentous fungus based on the third fiber of the present invention described later.
  • the novel recombinant obtained by the above-mentioned transformant can be obtained as follows. First, the host cell is cultured under appropriate conditions, and a culture supernatant or cells are obtained from the resulting culture by a known method, for example, centrifugation. In the case of bacterial cells, suspend them in an appropriate buffer, disrupt the cells by freeze-thawing, sonication, trituration, etc., and centrifuge or filter the bacterial cell extract containing the new recombinant Get.
  • the enzyme can be purified by appropriately combining conventional separation and purification methods. For example, methods that utilize differences in heat resistance such as heat treatment, methods that utilize differences in solubility such as salt precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. A method utilizing a difference in molecular weight such as ion chromatography, a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography, a method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, and hydrophobic chromatography. And iS ⁇ B chromatography, which utilizes differences in properties, and further, methods utilizing isoelectric focusing, such as electrophoresis. According to the first embodiment of the present invention; 9-fructo-oligosaccharide using fructofuranosidase
  • a method for producing a fructo-oligosaccharide using the aforementioned recombinant host or recombinant; 3-fructofuranosidase.
  • the method for producing fructooligosaccharides according to the present invention is carried out by bringing the above-mentioned recombinant host or recombinant fructofuranosidase into contact with sucrose.
  • the contact between the recombinant host or the recombinant iS-fructofuranosidase according to the present invention and sucrose) teS-like and its conditions are not particularly limited as long as the recombinant novel enzyme can act on the sugar.
  • Preferred modes of contact in a solution are as follows. That is, the sucrose ⁇ SS is the range in which the sugar used can be dissolved. If it is within the range, it may be appropriately selected in consideration of the specific activity of the enzyme, the reaction temperature, etc., but it is powerful to set it in the range of 5 to 80%, preferably 30 to 70%. Range.
  • the reaction temperature and pH conditions in the reaction between the sugar and the enzyme are strongly preferred to be performed under optimal conditions for recombination. Therefore, the reaction is generally performed under the conditions of about 30 to 80 ° C. and the pH of about 4 to 10, preferably 40 to 70. C, pH 5-7.
  • gJg for the purification of the recombinant novel enzyme can be selected as appropriate, and the crude enzyme can be used as it is from the culture supernatant of the transformant or from the disrupted cells. It may be used as purified 13 ⁇ 4. Further, it may be used as a single purified product through various purification means.
  • sucrose in a state of being immobilized on a carrier according to a conventional method.
  • the produced fructooligosaccharide can be obtained by purifying the reaction solution according to a known method. For example, there is a method in which the enzyme is deactivated by heating, then decolorized with activated carbon, and further desalted with an ion exchange resin.
  • the nucleotide sequence used in the isolation method according to the second aspect of the present invention is as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the atisi library is screened using the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence comprising a part thereof in the sequence listing, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a portion thereof is sequenced. Selecting a sequence that hybridizes to the base sequence comprising from the remote fe library, and then isolating the selected sequence; and ⁇ selecting from the library and isolating the ⁇ -fructo from the isolated sequence.
  • the ⁇ fe ⁇ library may be either a chromosome library or a cDNA library.
  • the gene library may be prepared by a known method.
  • the base sequence comprising the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a part thereof is preferably a base sequence comprising a part of the base sequence of SEQ ID NO: 2, that is, as a probe
  • the mosquitoes used are preferable.
  • the probe is labeled.
  • the subject to which the method of isolating the / 3-fructofuranosidase residue according to the present invention is applied is not particularly limited as long as it is expected that ⁇ -fructofuranosidase is contained, for example, fungi, More specifically, harbor organisms for Aspergillus, Penicillium, or Scobrariopsis.
  • novel / 9-fructofuranosidase enzyme provided by the method for isolating ⁇ ⁇ F according to the second aspect of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 13 in the sequence listing. .
  • the / 3—fructofuranosidase according to the present invention is represented by SEQ ID NO: Includes homologues of the amino acid sequence shown in 11 or 13.
  • the term “homolog” refers to an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13 in which some amino acids are inserted, substituted with S, or deleted, or added to one or both termini. And which has its / 3—fructofuranosidase action. With reference to the sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13, it is clear that such a “homolog” can be selected and manufactured without difficulty by those skilled in the art.
  • the / S-fructofuranosidase having the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 11 and 13 according to the present invention has a high transfer activity and makes fructooligosaccharides efficient. Specifically, in a reaction using 30% or more of sucrose as a substrate, the transfer activity is 4 times JiLh and 7 times or more higher than the hydrolysis activity, respectively, and the conversion rate to fructo-oligosaccharide is 5%. 0% or more.
  • novel fragment encoding monofructofuranosidase provided by the isolation method according to the second aspect of the present invention encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13 in the sequence listing or a homolog thereof.
  • DN Ag ⁇ which encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13 has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 14, and has a degenerate relationship therewith. It also means a nucleotide sequence which has the same sequence except that codons are used and encodes the amino acid sequence shown in i ⁇ 11 or 13.
  • a DNA fragment comprising a DNA sequence having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 14 in the sequence listing.
  • the enzyme encoded by the novel gene according to the present invention includes a homologue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 or 13. Therefore, the DNA fragment according to the present invention further includes a nucleotide sequence encoding this homolog.
  • the DNA fragment according to the present invention has its sequence determined, one means for obtaining the DNA fragment is to produce it according to the method of nucleic acid synthesis.
  • this sequence may be Penicillium-Pocke-Folch or Scopulariopsis brevicaulis, preferably Penicillium-Pocke-Folch I AM7254 or Scobra ryopsis * Brevi-caulis IF0448.
  • 4 3 strains can be obtained using genetic engineering techniques. The specific method is described in detail in Example B described later. Aspergillus fungi exhibiting no 9-fructofuranosidase activity according to the third aspect of the present invention, and their production
  • a filamentous fungus of the genus Aspergillus according to the third aspect of the present invention which does not exhibit fructofuranosidase activity, is characterized in that the culture supernatant obtained by culturing the filamentous fungus and Z or the cells are broken.
  • sucrose which is the substrate, does not change when sucrose is used as a substrate and reacts with the crude S3 ⁇ 4 obtained by the above method.
  • Such a filamentous fungus can be obtained by inactivating itfe ⁇ , which encodes S-fructofuranosidase.
  • it can be obtained by inactivating the expression of / 3-fructofuranosidase, which is involved in the expression of ⁇ -fructofuranosidase, or inactivating the secretion of ⁇ -fructofuranosidase protein.
  • a parent Aspergillus ⁇ filamentous fungus is treated with NTG (1-methyl-3-2-troue-1-nitrosoguanidine), ultraviolet light and a mutagen to induce mutation.
  • NTG 1-methyl-3-2-troue-1-nitrosoguanidine
  • a method utilizing recombinant DNA technology is preferred.
  • the targeting method uses the ⁇ A vector or the ⁇ vector.
  • a vector comprising an inactivated fructofuranosidase ⁇ fe ⁇ and a selection marker for selecting a form ⁇ fe recombinant ⁇ is prepared.
  • the inactivated 3-fructofuranosidase residue is defined as a mutation (preferably deletion) that can inactivate the target iS-fructofuranosidase gene alone.
  • the target is 3) No difference from 3-fructofuranosidase / 9 / fructofuranosidase fe ⁇ .
  • Such an insertion type vector is introduced into cells, and homologous recombination with the target 9-fructofuranosidase II on the chromosome is caused in the region between the two mutation sites.
  • the target) S-fructofuranosidase II on the chromosome is 2 copies. Mutation is introduced into each of the three target fructofuranosidases at one site each, and the target jS-fructofuranosidase gene can be inactivated.
  • This replacement vector is introduced into cells, and homologous recombination is caused in each of the regions derived from 3-fructofuranosidase I ⁇ on both sides of the selection marker.
  • the target 3-fructofuranosidase ⁇ gene is inactivated because it replaces the target / 3-fructofuranosidase ⁇ ⁇ i selection marker ⁇ ⁇ gene inserted on the chromosome. Is done.
  • the two-stage ⁇ ift ⁇ yuichii-getting method can be used for the direct fi substitution method and the hit and run substitution method.
  • the target vector has at least one mutation (preferably deletion) that can inactivate the target / 3-fructofuranosidase gene alone on the vector.
  • Create ⁇ This vector is introduced into a cell, and homologous recombination with the target 9-fructofuranosidase gene on the chromosome, which has been disrupted by the selection marker, is caused in the regions on both sides of the mutation site.
  • the target; 3-fructofuranosidase can be replaced with the inactivated target 9-fructofuranosidase. Strains that have undergone such recombination can be selected based on the lack of marker ⁇ .
  • the number of mutations (preferably deletions) that alone can inactivate the objective fructofuranosidase residue is small.
  • At least one fructofuranosidase introduced! Prepare a vector consisting of ⁇ and selection marker ⁇ ⁇ . This vector is introduced into cells, and homologous recombination with the target (S-fructofuranosidase) occurs at the upstream region of the mutation site on the target / S-fructofuranosidase.
  • the vector itself containing the selectable marker ⁇ ⁇ was sandwiched between two copies of the target / 9-fructofuranosidase ⁇ & ?, and the mutation of the two copies of the target / S-fructofuranosidase ⁇ Includes and excludes. Subsequently, a part of the vector sandwiched between the two copies of the target jS-fructofuranosidase ⁇ fe ⁇ is subjected to loop-up, and homologous recombination is caused again in the downstream region of the mutation site.
  • the vector containing the selectable marker ⁇ ⁇ and one copy of the target S-fructofuranosidase gene are missing, and the target containing the mutation on the chromosome is hidden in the S-fructofuranosidase itfe ⁇ . Can be replaced. Strains that have undergone such recombination can be selected for lack of the marker gene. At this time, it is clear that the same result can be obtained by causing homologous recombination to occur in the downstream portion of the mutation site as the first step, and then initiating homologous recombination in the upstream portion.
  • ⁇ ffl can be used as the selection marker itfe ⁇ as long as it can select the form 3 ⁇ 4f.
  • a strain lacking the selectivity gene can be positively selected. Nitrogen i3 ⁇ 4S element ⁇ ⁇ (nia D), orotidic acid fl ⁇ acid enzyme ⁇ ⁇ (pyr G), and ATP-sulfurylase ⁇ ⁇ (sC) are preferred.
  • filamentous fungus examples include Aspergillus niger
  • the filamentous fungus according to the present invention can be preferably used for production of recombinant S-fructofuranosidase.
  • a DNA fragment containing a 3-fructofuranosidase-encoding DNA fragment in a state capable of replicating in a host cell of the present invention and capable of expressing the same gene power, in the form of an expression vector is used.
  • recombinant / 3-fructofuranosidase is produced as a single substance having / 3-fructofuranosidase activity. can do.
  • the preferred embodiment of the DNA molecule is plasmid, which is good according to a method commonly used in the field of ⁇ & ⁇ engineering.
  • a DNA encoding the above-described / 3-fructofuranosidase according to the first embodiment of the present invention DNA encoding the novel ⁇ -fructofuranosidase isolated by the method according to the second aspect of the present invention, and DNA encoding the / 3-fructofuranosidase mutant according to the fourth aspect of the present invention described below. Is received.
  • the expression system described in relation to the first aspect of the present invention described above may be used. Can be used.
  • the plasmid preferably contains a selection marker for the form-fe replacement, and the selection marker ⁇ ⁇ F is a drug 3 ⁇ 4 »cookable marker ⁇ ⁇ ? , You can add the claim marker ⁇ ⁇ .
  • Preferred examples thereof include hygromycin-resistant ffitfei (H yg), bialaphos-resistant ⁇ fe? (B ar), nitric acid ⁇ ⁇ (nia D), orotic acid! ⁇ Acid ⁇ (pyr G), ATP —Sul Furiraichize Densetsu (s C) and the like.
  • DNA ⁇ as an expression vector is a DNA sequence required for the expression of j3-fructofuranosidase II, such as transcriptional regulatory signals such as promoter, transcription start signal, translation stop signal, and transcription termination signal, and translation. Having a control signal etc. is preferred.
  • transcriptional regulatory signals such as promoter, transcription start signal, translation stop signal, and transcription termination signal, and translation. Having a control signal etc. is preferred.
  • the promoter include ⁇ -amylase ⁇ as well as a promoter that can function in the host of the present invention contained in the inserted fragment.
  • the promoter can be preferably used as much as possible.
  • the filamentous fungus according to the third aspect of the present invention was utilized; 9- Production of fructofuranosidase was carried out by appropriately transforming the filamentous fungus according to the present invention, which had been transformed with DNA encoding / 3-fructofuranosidase. Under such conditions, a culture supernatant or cells is obtained from the resulting culture by a known method, for example, centrifugation. In the case of cells, suspend the cells in an appropriate buffer, disrupt cells by freezing, sonication, trituration, etc., and contain recombinant / 9-fructofuranosidase by centrifugation or «ii. Thus, a bacterial cell extract can be obtained. 9.
  • the 9-fructofuranosidase mutant according to the fourth aspect of the present invention can be obtained as a result of mutating the parent 3-fructofuranosidase. Furthermore, in the present invention, this mutation is caused by insertion of one or 3 ⁇ 43 ⁇ 43 ⁇ 4 amino acids in the amino acid sequence of the parent S-fructofuranosidase. Or deletion, or its -Fructo-oligosaccharide component * a ⁇ , which is produced by the fructose transfer reaction of a / 9-fructofuranosidase mutant using sucrose as a substrate It means that the composition is different from that of tofuranosidase.
  • the origin of the parent / 9-fructofuranosidase is not limited as long as it is 9-fructofuranosidase having a fructose transfer activity, but it is preferably derived from a fungus, particularly a genus Aspergillus or Penicillium. / S-Fructofuranosidases derived from those belonging to the genus Scobrariopsis, Fusarium II, or Aureobasidium are preferred. More preferably, it is S-fructofuranosidase derived from Aspergillus.
  • 3-fructofuranosidase consisting of amino acid se ⁇ shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Dase or a homolog thereof is preferred.
  • the parent 3-fructofuranosidase may be / S-fructofuranosidase or a homolog thereof obtained by the isolation method according to the second aspect of the present invention described above.
  • the parent ⁇ -fructofuranosidase is composed of the amino acid SS ⁇ shown in SEQ ID NO: 1, 170, 300, 310, and A specific example thereof is a mutant in which one or two £ U: amino acid residues selected from the group consisting of the amino acid at position 6 are substituted with another amino group.
  • the amino acid at position 170 is an aromatic amino acid selected from the group consisting of tributofan, fenilalanine, and tyrosine, more preferably tributophan;
  • the amino acid at position 300 is an amino acid selected from the group consisting of tributofan, valine, glutamic acid, and aspartic acid;
  • the third amino acid is a group consisting of lysine, arginine, and histidine
  • a basic amino acid selected from, more preferably lysine or arginine,
  • the 170th, 300th and 31st amino acids are respectively substituted with tributophan, tryptophan and lysine or with tributophan, no, 'phosphine and lysine, respectively. It was done. These variants can make one gestose more selective and efficient than sucrose.
  • the amino acids at the 170th, 300th, 31st, and 386th positions described above are used. Specific examples thereof include one in which one or more amino acid residues selected from the group consisting of amino acids at positions corresponding to amino acids are substituted with other amino acid residues.
  • the position of the amino acid residue to be substituted in the homolog of parent iS-fructofuranosidase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is determined by J l ⁇ of amino acid SE ⁇ by a known algorithm. ⁇ Can be selected.
  • the / 3 / 3-fructofuranosidase mutant according to the fourth embodiment of the present invention can be obtained by recombinant DNA technology, polypeptide synthesis ⁇ -surgery, or the like.
  • a DNA encoding the parent / S-fructofuranosidase is obtained, and a specific site in this DNA is mutated to replace the amino acid coding.
  • transforming the host cells with an expression vector containing the mutated DNA, and culturing the transformed ⁇ cells, a; 3-fructofuranosidase mutant can be prepared.
  • Some methods for introducing mutations at specific sites in a gene include the Gapped duplex method (Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) and the Kunkel method (Methods in Enzymology, 154, 367 (1987)). It is known to the trader. These methods can be used to generate mutations at specific sites within D ⁇ which encode ⁇ -fructofuranosidase.
  • the nucleotide sequence of the DNA after the modification is determined by the method of chemical modification of maximum gilbird (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) ⁇ Dioxynucleotide ⁇ Termination method (Gene, 19, 269 (1982))
  • the amino acid sequence of the ⁇ -ctofuranosidase mutant can be determined from the confirmed nucleotide sequence. ⁇ production of a / 3 / 3-fructofuranosidase mutant according to the fourth aspect of the present invention
  • the 8-fructofuranosidase mutant according to the fourth aspect of the present invention is a DNA comprising a DNA fragment encoding the same in a state capable of replicating in a host cell and expressing the gene.
  • host cells can be transformed in the form of an expression vector, and the cells can be produced in the host cells.
  • a DNA molecule especially an expression vector, comprising tfe ⁇ encoding a S-fructofuranosidase variant (of the present invention).
  • This DNA can be obtained by incorporating a DNA fragment encoding the 3-fructofuranosidase mutant according to the present invention into a vector: ⁇ .
  • this vector is a plasmid.
  • the DNA molecule according to the present invention may be implemented in accordance with a technique used in the field of genetic engineering.
  • the vector used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, cosmid vectors, etc., while taking into consideration the type of host cell to be used. For example, if the host cell is Escherichia coli, a sphage-type pacteriophage, pBR, pUC-type plasmid, Bacillus subtilis, a pUB-type plasmid, or a yeast, YEp, YRp, YCp-type plasmid Vector.
  • the plasmid preferably contains a selectable marker for the transformant, and as the selectable marker, a drug resistance marker or a demand marker can be used.
  • a drug resistance marker or a demand marker can be used.
  • Preferable specific examples thereof include ampicillin-resistant ⁇ , kanamycin-resistant ⁇ fe ⁇ , tetracycline-resistant ⁇ when the host cell used is a bacterium, and tributofan synthesis gene (TRP 1) and peracyl synthesis gene when yeast is used. (URA3), leucine synthesis ⁇ (LEU2), and in the case of mold, hygromycin-resistant ⁇ ⁇ (Hy g), bialaphos-resistant B (Bar), nitrate reduction ni (niaD), etc.
  • TRP 1 tributofan synthesis gene
  • DNA as an expression vector according to the present invention may be a DNA sequence required for expression of a gene encoding an S-fructofuranosidase mutant, such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. It is preferable to have a transcription control signal such as a transcription termination signal and a translation control signal.
  • Promoters include promoters that can function in the host contained in the inserted fragment, promoters such as lactose operon (1 ac) and tributofan operon (trp) in Escherichia coli, and yeast. Promoters such as alcohol dehydrogenase ⁇ gene (ADH), acid phosphatase (PHO), galactose ( ⁇ (GAL), glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase Liao ⁇ (GAP), and in molds ⁇ -amylase gene (am y), the dalcoamylase gene (g1a), the promoter of cellopiohydrolase gene (CBHI), and the promoter of -fructofuranosidase gene can be preferably used.
  • ADH alcohol dehydrogenase ⁇ gene
  • PHO acid phosphatase
  • GAL galactose
  • GAP glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase Liao ⁇
  • the host cell is Bacillus subtilis, yeast, or mold
  • Any host cell can be used as long as a host-vector system has been established, but yeast and mold are preferred.
  • yeast and mold are preferred.
  • the ⁇ -fructofuranosidase mutant is purified. Without, coarse!
  • a host cell using the filamentous fungus according to the third aspect of the present invention be able to. Furthermore, as a host having no sucrose assimilation ability, a strain of ⁇ belonging to the genus Trichoderma / a kind of yeast
  • a method for producing fructo-oli f
  • using a fructofuranosidase mutant is carried out by contacting sucrose with a host cell having the ⁇ -fructofuranosidase mutant function or a / 9-fructofuranosidase mutant.
  • the method for producing fructooligosaccharides using the S-fructofuranosidase mutant is substantially the same as the method for producing fructooligosaccharides using 9-fructofuranosidase according to the first aspect of the present invention. It can be carried out under the following conditions. Also, the Purification may be similar.
  • Example A 1 Purification of Fructofuranosidase and Determination of Partial Amino Acid Sequence Purification of ⁇ -fructofuranosidase from the cells of Aspergillus niger AC E-2-1 (ATC C 20611) was performed according to Agric. Biol, Chem .. 53, 667-673 (198 9) to obtain an electrophoretically uniform sample.
  • the purified product was decomposed with lysyl endopeptidase ( ⁇ Chemical Industry Co., Ltd.), and the resulting peptides were separated by HPLC (Waters). Column is TSKg e 1 ODS
  • amino acid sequence of each peptide fractionated using 120T was analyzed using a protein sequencer (Shimadzu Corporation). Then, four amino acid partial sequences were determined. The four amino acid partial sequences thus obtained were as shown in SEQ ID NOs: 3 to 6 in the sequence listing.
  • Example A2 Acquisition of partial DNA fragment of S-fructofuranosidase ⁇ by PCR
  • Aspergillus niger AC E-2-1 (ATCC 20611) was inoculated into YPD medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) and cultured. Then collect the bacteria and freeze! I did. After crushing this finely, TE buffer (10mM
  • PCR was performed using a Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. That is, the chromosome DN AO. 5 ⁇ 1 (equivalent to 1 / zg) prepared as described above, a 10-fold concentration of a reaction buffer [50 OmM KCK 10 OmM Tris—HC 1
  • the DNA precipitate was dissolved in sterile 8/1 water, and the ends were blunt-ended using a DNA blunting kit (Takara Shuzo). Furthermore, the 5 'end was phosphorylated using T4 DNA kinase (Nippon Gene), and then cloned into the SmaI site of pUC119.
  • the nucleotide sequence of the plasmid insert was determined using a fluorescent sequencer ALFred DNA sequencer manufactured by Pharmacia. As a result, the determined nucleotide sequence of the PCR fragment was as shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. The total length of this PCR fragment was 788 bp.
  • amino acids from the 5 'side were replaced by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • Amino acids 20 to 20, 176 to 195 from the 5 'side are amino acids 1 to 20 in SEQ ID NO: 4, and 10 to 3' are amino acids in SEQ ID NO.
  • the amino acid sequence corresponds to amino acids 1 to 10 in 5 and purified; the amino acid sequence was determined from 9-furanofuranosidase.
  • Example A3 Screening of clones containing the full-length DNA fragment encoding / 9-fructofuranosidase
  • chromosome DNA preparation prepared in Example A2 above was digested with restriction coR I, followed by agarose gel electrophoresis, and molecular cloning.
  • a library was prepared by packaging using an in vitro packaging kit GIGA PACK II Go 1 d manufactured by Escherichia coli and infecting Escherichia coli XL 1—B 1 ue MRA (P2).
  • plaque hybridization was performed using the ECL direct DN AZRNA labeling and detection system (Amersham), and 25 out of 15,000 plaques were identified. Htt got a clone. Secondary screening was performed on three of these positive clones, and after the positive clones were purified, phage DNA was prepared and analyzed by restriction S ⁇ ⁇ . As a result, it was revealed that all clones had the same EcoRI fragment of about 15 kbp.
  • Example A4 Expression of / 9-fructofuranosidase by Trichoderma viride
  • plasmid pDH25 (D. Cullen et al. (1987) Gene, 57, 21-26) was partially digested with EcoRI, ligated with an XbaI linker, and further digested with XbaI. A 3 kbp XbaI fragment of a hygromycin-resistant ⁇ fe?
  • Expression cassette consisting of a promoter of the trp C gene from Aspergillus nidulans, a terminator and a hygromycin B-phosphoryl oxidase from Escherichia coli Prepared as This fragment was inserted into the XbaI site of plasmid pAW20 to construct plasmid PAW20-Hyg (Fig. 1).
  • Trichoderma viride in seed medium (3% glucose, 0.1% polypeptone, 1% yeast extract, 0.14% ammonium sulfate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.03% magnesium), 28, 20
  • the mycelium was collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and washed twice with a 0.5 M sucrose solution.
  • the mycelium obtained as described above was suspended in a 0.5 M sucrose solution containing 5 mg / ml of Cellulase Onozuka R-10 (Seikagaku Corporation) and 5 mg / ml of Novozim 234 (Novo Nordisk), and 30 ° C, Shake slowly for 1 hour to form protoplasts.
  • Protoplasts SUTC buffer (0. 5M sucrose, 1 Omm Tris HCl (pH7. 5), 1 OmM calcium chloride) and 2 Kaiarai purification, the final in the same buffer so as to be 10 7 cells Roh ml Suspended.
  • Example B1 Southern analysis of chromosome DNA of ⁇ -fructofuranosidase
  • a DNA fragment containing the DNA consisting of the ⁇ S sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was used as a probe type DNA, and a DNA fragment to be used as a probe was prepared by PCR using pAW20—Hyg. PCR was performed using a Perldn Elmer Cetus DNA Thermal Cycler.
  • Plasmid DNA (p AW2 O-Hy g) 0.5 ⁇ 1 (0.1 g equivalent), 10 times concentration of reaction buffer [50 OmM KCl, 100 mM Tris-HC 1 (pH 8.3 ), 15 mM MgC, 1% Triton X-100] 10 U 2.5 mM dNTP solution 8 il, 0 OlmM primer # 1 as primer # 1
  • the reaction was carried out for 94 to 5 minutes by adding 21 each of the single-stranded DNA primers of SEQ ID NO: 16 in the sequence listing and Taq DNA polymerase (0.5 ⁇ l in total, 771 in sterile water). After pretreatment, 94 1 min sexual steps), 54.
  • a YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose
  • a chromosome DNA was prepared from the obtained cells according to the method described in HiS Example A2 above. ⁇ Approximately 10 g of a chromosomal DNA sample was digested with restricted coRI, followed by agarose gel electrophoresis, and blotting on a Hybond-N + membrane (Amersham) according to the method described in Molecular Cloning (supra). did.
  • the thus recovered DNA fragment of about 4 kbp of about 0.5 was ligated to the Agtl O vector 1 which had been digested with the restriction enzyme EcoRI and treated with phosphatase beforehand, and Stratagene was used.
  • Packaged using the invitro package packaging kit GI GAPACKIIGo 1d manufactured by A library was prepared by infecting 14 NM5 strains.
  • Plaque hybridization was performed using the ECL direct DNAZRNA labeling 'detection system (Amersham) using the approximately 2 kbp DNA fragment used in Example B1 as a probe, and approximately 25 000 plaques were detected. Obtained 4 positive clones. A secondary screening was performed on these positive clones, and after purifying the positive clones, phage DNA was prepared and analyzed with restriction enzymes.As a result, all clones had the same EcoR of about 4 kbp. It was found to have an I fragment.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained subclones by a conventional method, and the ⁇ S sequence was determined using a Pharmacia fluorescent measurement sequencer ALFred DNA sequencer. As a result, a base sequence represented by ⁇ ⁇ ⁇ number 12 in Table 15 ⁇ was obtained. The corresponding amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • Example ⁇ 3 Scobulariopsis brevicaulis (Scopulariopsis brevicaulis) I F04843 strain S-fructofuranosidase monosaccharide Scopulariopsis brevicaulis IF 04843 strain Chromosome DNA building about 20 After digesting g with the restriction enzyme EcoRI, agarose gel electrophoresis was carried out, and a DNA fragment of around 10 kbp was separated and recovered according to the method described in Molecular cloning (supra).
  • a hygromycin-resistant cassette composed of a promoter of the trp C gene from Aspergillus nidulans, a terminator, and hygromycin B-phosphoryl oxidase ⁇ & ⁇ from E. coli was expressed. It was prepared as a 3 kbp XbaI fragment. This fragment was ligated to the XbaI site of plasmid pPRSOl to construct plasmid pPRS01—Hyg (FIG. 2).
  • Trichoderma viride in seed medium (3% glucose, 0.1% polypeptone, 1% yeast extract, 0.14% ammonium sulfate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 0.03% magnesium sulfate), 28 ⁇
  • the mycelium was collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and washed twice with a 0.5 M sucrose solution.
  • the mycelium obtained as described above was suspended in a 0.5 M sucrose solution containing 5 mg Zml of Cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 5 mg Zml of Novozym 234 (Novo Nordisk), and 30 ⁇ , 1 Shake slowly for hours to form protoplasts.
  • Pro Bok Plast is SUTC buffer (0. 5M sucrose, 1 Omm Tris HCl (pH7. 5), 1 OmM calcium chloride) and 2 Kaiarai purification, the final same such that 1 0 7 Zm 1 Suspended in buffer.
  • the potato dextrose containing 0.5 M sucrose was added to a potato dextrose agar medium (Difco) containing 100 ig / m1 hygromycin B and 0.5 M sucrose.
  • SSJi together with agar medium, cultured for 5 days, and colonies that appeared were used as transformants.
  • the obtained transformant and the parent strain were cultured in the above-described seed medium at 28 ° C. for 4 days, the ⁇ -fructofuranosidase activity of the culture supernatant was measured.
  • the ⁇ -fructofuranosidase activity was defined as one unit of the activity of 1 / zmo 1 of glucose per minute when reacted under the conditions of a 10% by weight sucrose solution, ⁇ 5.5 and 40 ° C. As a result, no activity was detected in the parent strain, and an activity of about 0.04 unit / ml was detected in the transformant.
  • the thus prepared / S-fructofuranosidase was added in an amount of 4.2 units per 1 g of sucrose, and reacted for 23 hours under the conditions of a 60 fifi% sucrose solution, H7.0, and H40.
  • the sugar * ⁇ * after the reaction was 1.6% fructose, 16.2% glucose, 42.3% sucrose, 37.3% GF2, and 2.1% GF3.
  • Difficult example C 1 Acquisition of ni a D variable ⁇ from Aspergillus' Niger AC E- 2-1 strain
  • Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC20611) strain spores were grown on a minimal agar medium containing 6% chlorate (0.2% sodium glutamate, 0.1% dipotassium phosphorous, 0.1% It was applied to 05% magnesium sulfate, 0.05% rhodium chloride, 0.001% sulfuric acid, 3% sucrose, 0.5% agar, ⁇ 5.5), and kept warm at 30. After culturing for about 5 days, those that formed colonies were defined as chlorate-resistant strains. These resistant strains were inoculated on a minimal medium containing glutamate, nitrate, or oxalate as a nitrogen source, and the nitrogen source requirement was examined. As a result, chlorate-tolerant strains that can grow on a minimal medium containing sodium glutamate and nitrite as a single nitrogen source but cannot grow on nitrate are present, and these were defined as niaD changes.
  • Example C2 Acquisition of nia D gene of Aspergillus niger NRRL 4337 strain
  • Aspergillus niger NRRL 4337 strain was cultured in YPD liquid medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose).
  • YPD liquid medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose.
  • the synthetic DNA sequences of SEQ ID NOS: 17 and 18 in the sequence listing was prepared. From the cells obtained above, all DNAs extracted according to the method described in Example A2 were used as a ligature, and DNA was obtained by PCR using the synthetic primers. ⁇ Performed width. Each reaction mixture contains 5 g of chromosome DN AO.
  • a phage DNA was prepared from the positive clone, and it was confirmed that an approximately 15 kbp HindIII fragment was inserted. Southern analysis was performed on this inserted fragment, and as a smaller DNA fragment containing the niaD gene, an XbaI fragment of about 6.5 kbp was found, and the restriction map of this fragment was identified. The XbaI fragment is further fragmented with appropriate restriction ⁇ and then subcloned into plasmid pUC118, sequenced using these plasmids as type ⁇ , and isolated in the isolated DNA fragment. The location of nia D was identified ( Figure 3).
  • Example C3 Construction of plasmid pAN203 for ⁇ fe? Targeting
  • Plasmid PAN203 for targeting was subjected to PSi as follows (Fig. 4).
  • a single-strand DNA was prepared from this plasmid, and site-directed mutagenesis was performed using the synthetic DNA of SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing with the Sculptor in vitro mutagenesis system of Amersham, Inc.-Fructofuranosidase
  • a BamHI digestion site was newly created just before the start codon of ⁇ ⁇ (pW20B).
  • the plasmid pUC118 was cut with restriction Hindlll, and the ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo), followed by ligation with a Sa1I linker. Cleavage with the restriction enzyme Sa1I and religation were performed to construct the plasmid pUCl8PHd. After digesting pUC18PHd with SalI and EcoRI, an approximately 2.5 Kbp Sa1I-BamHI fragment prepared from pW20B, and an approximately 3 Kbp BamHI-E fragment prepared from pAW20B Plasmid pAN202 was constructed by ligating the coRI fragment.
  • a plasmid pAN203 was constructed by inserting an approximately 6.5 kbp XbaI fragment (FIG. 3) containing niaD ⁇ ⁇ into PAN202 at the XbaI site.
  • FIG. 3 Transformation of Aspergillus niger NI A5292 strain with plasmid pAN203
  • Aspergillus nigaichi NIA 5292 strain in a liquid medium 2% soluble flour, 1% polypeptone, 0.2% yeast extract, 0.5% sodium dihydrogen phosphate,
  • a minimal agar medium containing 0.2% potassium chlorate and 2% dalcos as the sole carbon source (0.2% sodium glutamate, 0.2% 1% dipotassium hydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% potassium chloride, 0.001% iron sulfate, 2% glucose, 6% potassium chlorate, 1.5% agar, ⁇ 5.5)
  • the cells were spread and cultured for 30 days. Approximately four said that a number of resistant strains emerged that again showed the nia D mutation phenotype and became resistant to chlorate.
  • Example C5 ⁇ of fructofuranosidase from Aspergillus niger NI A1602 strain as a host
  • PAN572 a plasmid for expression of a fructofuranosidase distant from Penicillium rockeforti, was PSSi-treated as follows (Fig. 5).
  • Plasmid PAN204 was prepared by inserting a PstI fragment of about 2 Kbp containing the 3-fructofuranosidase ⁇ gene promoter and terminator prepared from plasmid pAN202 into the Pstl site of this plasmid pUC18HBX. .
  • the primers were synthesized using ADNA Site-directed mutagenesis using the Sculptor in vitro mutagenesis system to disrupt the BamHI digestion site and create a new XbaI digestion site downstream of nia D ⁇ It was made possible to prepare niaD ⁇ fe ⁇ as an approximately 4.8 kbp XbaI fragment without the I digestion site. This 4.8 Kbp XbaI fragment was inserted into the XbaI site of plasmid pAN204 to form plasmid pAN205.
  • the S-fructofuranosidase (derived from Niscilium rockeforti) was prepared by using the single-strand DNA prepared from the plasmid ⁇ PRS01 containing this protein obtained in Example 4 as ⁇ .
  • site-directed mutation was performed using Amersham's Sculptor in vitro mutagenesis system, 9) within the translation region of fructofuranosidase ⁇ .
  • the existing BamHI site was disrupted in such a way that the encoded amino acid sequence was unchanged (pPRS02).
  • PCR was performed using the plasmid pPRS02 as a prominent type and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 24 and 25 in the sequence listing as primers; 9-fructofuranosidase ⁇ A kbp BamHI fragment was prepared and inserted into the BamHII site of plasmid pAN205 to produce plasmid pAN572.
  • Plasmid pAN572 which had been linearized by digestion with Hindill in advance was used to transform Aspergillus niger NIA 1602 according to the method described in Example C4.
  • One of the obtained transformants was subjected to liquid culture (5.0% sucrose, 0.7% malt extract, 1.0% polypeptone, 0.5% carboxymethylcellulose, 0.3% sodium chloride). 28, and cultured for 3 days.
  • the obtained cells were collected and disrupted by sonication, and then yS-fructofuranosidase activity was measured.
  • ⁇ -fructofuranosidase activity is defined as 1 unit of the activity of iS «l of l ⁇ mo 1 glucose per minute when reacted under the conditions of 10 Sfi %% sucrose solution, PH 5.5 and 40. did. As a result, an activity of 1 ⁇ 1 ( 3 units, Zm 1) was detected.
  • fructose is F
  • glucose G
  • sucrose G
  • the reaction solution was plasmid DNA (pAW20—Hyg) 0.5 1 (equivalent to 0.5 lg), 10-fold concentration of reaction buffer [500 mM KC1, 100 mM Tris—HC1 (pH 8.3) , 15mM MgC 12, 1% Triton X-100] 10 ⁇ 1, 2.5mM dNTP solution 8; zl, 0.01mM primer # 1 as primer # 1 + strand DNA primer of SEQ ID NO: 26 and primer # As 2, 2, 1/1 each of the single-stranded DNA primers of SEQ ID NO: 27 in the sequence listing, Taq DNA polymerase (Wako Pure Chemical Industries) 0.5 ⁇ 1, and sterile water 1 were added to obtain 100 1.
  • reaction buffer [500 mM KC1, 100 mM Tris—HC1 (pH 8.3) , 15mM MgC 12, 1% Triton X-100] 10 ⁇ 1, 2.5mM dNTP solution 8; zl, 0.01mM primer # 1 as primer #
  • the reaction is performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by a 94 minute step. Incubation was performed for 25 cycles at 54 ° C for 2 minutes (annealing step) and at 72 ° C for 3 minutes (extension step). Finally 72. The reaction was completed after incubation for 7 minutes at C.
  • the resulting reaction solution was extracted with phenol-chloroform-formisoamyl alcohol, followed by ethanol precipitation. After dissolving the precipitate in 20 ⁇ 1 ⁇ buffer, agarose gel electrophoresis was carried out, and a specifically amplified band of about 2 kb ⁇ was cut out in a conventional manner to recover a DNA fragment. This DNA fragment was digested with the restriction enzyme BamHI, and inserted into the BamHI site of plasmid pUC118 (Takara Shuzo) to obtain plasmid pANl20 (FIG. 6).
  • a single-stranded DNA was prepared according to a conventional method, and this was subjected to site-specific mutation as type I DNA.
  • the site-specific mutation was performed using Muta-Gene in vitro mutagenesis kit (Nihon Bio-Rad Laboratories). Using a DNA primer of SEQ ID NO: 28 in the sequence listing as a primer for site-specific mutation, the procedure was carried out in accordance with the instructions of the kit, and PAN120 (F170W) was obtained as a plasmid after the mutation treatment.
  • the yeast expression vector ⁇ 2831 was constructed as follows (FIG. 7). That is, restriction of plasmid p YPR2831 (H. Horiuchi et al., Agric. Biol. Chem., 54, 1771-1779.1990) was performed after digestion with EcoRI and Sa1I. Smoothing was performed using T4 DNA polymerase. This was ligated with BamHI linker (5'-I CGGATCCG—3 '), digested with BamHI, and then ligated with BamHI. After ligating, plasmid pY2831 was obtained.
  • PAN120 F170W was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutant gene was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (F170W) (Fig. 8). At this time, the same processing was performed for pAN120, and a plasmid pY SUC for expressing wild ⁇ S ⁇ ! was also constructed.
  • the wild-type enzyme and the F170W mutant were evaluated using the yeast culture supernatant.
  • the reaction conditions were 48% by weight sucrose solution, 40 T), pH 7, and the reaction was analyzed by HPLC. In wild and mutants, one guest
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to (GF2) was ⁇ was as shown below.
  • Example D1 The method of Example D1 except that the DNA primer of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing was used as a primer for site-directed mutagenesis of / 3-fructofuranosidase ⁇ by site-specific mutation As a result, plasmid pA120 (G300W) was obtained.
  • PAN120 (G300W) was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutation was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pY SUC (G30OW).
  • This plasmid is introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the ⁇ 300 W mutant is ⁇ ! As a result, S-fructofuranosidase activity (5.0 units / ml) was detected in the culture medium.
  • PAN120 H313K was digested with BamHI, and a 2 kb P BamHI DNA fragment containing the mutant ife ⁇ was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (H313K). This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the H313K mutant was introduced. Zml-fructofuranosidase activity was detected.
  • the wild-type enzyme and the H313K mutant were evaluated using the yeast culture supernatant.
  • the reaction conditions were 48 weight sucrose solution and 40.
  • the reaction was performed at C, pH 7, and the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC.
  • one guestose one guestose
  • the sugar composition (%) at the maximum conversion rate to (GF 2) was determined as shown below.
  • PAN120 (E 386K) was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutated fragment was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (E386K).
  • This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the mutant was transformed into the yeast 38.
  • One unit of fructofuranosidase activity of 7 ml Zml was detected.
  • the wild-type enzyme and the E386K mutant were evaluated using yeast culture supernatant.
  • the reaction was performed at a pH of 7 with a 48% by weight sucrose solution, and the saccharide after the reaction was analyzed by HPLC.
  • one guestose one guestose
  • the sugar composition (%) at the maximum conversion rate to (GF2) was as shown below.
  • pAN120 F170W + G300W
  • BamHI BamHIDNA fragment containing the mutant fe?
  • This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the F170W + G300W mutant was allowed to grow. 2.3 units of Zml / 9-1 fructofuranosidase activity was detected.
  • the wild-type enzyme and the F170W + G300W mutant were evaluated using yeast culture supernatants.
  • the reaction was carried out at a 48% by weight sucrose solution, 40 ° C., pH 7, and the saccharide after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF2) was maximum in each of the wild-type 1 and mutants was as shown below.
  • PAN120 F170W + G300W + H313R was digested with BamHI to remove a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutant ⁇ ⁇ . This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (F17OW + G300W + H313R).
  • This plasmid was introduced into the yeast strain Saccharomyces cerevisiae MS-161 in the same manner as in the method of Example DlfBfg, and the F170W + G300W + H313R mutant was turned into ⁇ . A unit of 0.9 Zml of i8-fructofuranosidase activity was detected.
  • Wild ⁇ ⁇ enzyme and F170W + G300W + H313R mutant Evaluation was performed using the culture.
  • the reaction was carried out at a 48% by weight sucrose solution, 40 ° C., pH 7, and the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-gestose (GF2) was the maximum was as shown below.
  • pAN120 (G300W + H313K) was digested with BamHI to remove a 2 kbp OB amHI DNA fragment containing the mutant strain. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (G300W + H313K). This plasmid was introduced into the yeast strain Saccharomyces cerevisiae MS-161 in the same manner as described in Example D1, and the G300W + H313K mutant was allowed to grow. 1.2 units Zml of monofructofuranosidase activity was detected.
  • the wild-type enzyme and the G300W + H313K mutant were evaluated using yeast culture supernatant.
  • the reaction was carried out under the conditions of a 48% by weight sucrose solution, 40, and a pH of 7, and the sugar chain flfig after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF2) was the maximum was as follows.
  • Example D1 Base substitution of iS-fructofuranosidase by site-specific mutation
  • DNA primers of SEQ ID NOS: 30 and 33 in the sequence listing were used as primers for site-specific mutation.
  • Plusmid PAN 120 G300V + H313K was obtained.
  • PAN120 (G300V + H313K) was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHIDNA fragment containing the mutant was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (G300V + H313K).
  • This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the G300V + H313K mutant was introduced into the culture supernatant. Fructofuranosidase activity was detected at 6 units / ml of Zml.
  • the wild-type enzyme and the G300V + H313K mutant were evaluated using yeast culture supernatant.
  • the reaction conditions were a 48% by weight sucrose solution, 40 and pH 7, and the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF2) was maximal in the wild type and the mutant was as shown below.
  • PAN120 (G300E + H313K) was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHIDNA fragment containing the mutant ⁇ ⁇ was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to generate plasmid pYSUC (G300E + H313K).
  • This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the G300E + H313K mutant was allowed to undergo ⁇ ! 2. Fructofuranosidase activity of 9 units Zml was detected.
  • the wild-type enzyme and the G300E + H313K mutant were evaluated using the yeast culture supernatant.
  • the reaction was carried out under the conditions of 48-fold S% sucrose solution, 40 and pH 7, and the sugar fiber after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF2) was the maximum was as shown below.
  • PAN120 (G300D + H313K) was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutant itfei was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (G300D + H313K).
  • This plasmid was introduced into the yeast Saccharomyces cerevisiae MS-161 strain in the same manner as described in Example D1, and the G300D + H313K mutant was introduced. ⁇ 3 units of Zml ⁇ -fructofuranosidase activity / 'detected.
  • the wild-type enzyme and the G300D + H313K mutant were evaluated using yeast culture supernatant.
  • the reaction conditions were as follows: 48 wt% sucrose solution, 40, pH 7,
  • the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF 2) was the maximum was as follows.
  • a plasmid pAN120 (F170W + G300W + H313K) was obtained in the same manner as described in Example D1 except that a DNA primer was used.
  • PAN120 F170W + G300W + H313K was digested with BamHI, and a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutation ⁇ ⁇ was extracted. This was inserted into the BamHI site of pY2831 to construct plasmid pYSUC (F170W + G300W + H313K).
  • plasmid pYSUC F170W + G300W + H313K
  • the wild-type enzyme and the G300W + H313K mutant were evaluated using yeast culture supernatant.
  • the reaction was carried out at a 48% by weight sucrose solution, 40 ° C, pH 7, and the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC.
  • the sugar composition (%) when the conversion rate to 1-kestose (GF2) was the maximum was as shown below.
  • pAN120 F170W + G300W + H313K was digested with BamHI to extract a 2 kbp BamHI DNA fragment containing the mutant fe ⁇ . This was inserted into the BamHI site of pAN205 (see Example C5) to construct plasmid pAN531 (FIG. 9).
  • Aspergillus niger ⁇ IA3144 strain was added to ⁇ medium (5% sucrose, 0.7% malt extract, 1% polypeptone, 0.5% carboxymethylcellulose, 0.3% NaCl), 28, After culturing for 3 days, the cells were broken by ultrasonication to prepare a crude S3 ⁇ 4 solution. As a result of measuring the / 9-fructofuranosidase activity of the crude enzyme solution, 25 units of activity were detected per 1 ml of the culture solution. 2.5 g of this crude oil was added per 1 g of sucrose, and reacted with a 55% by weight sucrose solution, pH 7, 40, for 20 hours. When the sugar composition after the reaction was analyzed by HPLC, fructose 1.2% Lucose 22.8%, sucrose 17.1%, GF2 55.3% GF33.8%.
  • the active fraction was loaded on a Sephacryl S-300 (Pharmacia) column (2.6 ⁇ 60 cm), eluted with 5 OmM trimethylamine-salt buffer (pH 8.0), and the active fraction was collected. 1 70W + G 300W + H313 K The mutant was purified. This was examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and showed a homogeneous band of the original parent fructofuranosidase; ⁇ 0,000 daltons.
  • Example D1 Base substitution of / 3-fructofuranosidase ⁇ by site-specific mutation Example D1 was used except that DNA primers of SEQ ID NOs: 28, 30, and 33 in the sequence listing were used as primers for site-specific mutation. The procedure was performed in the same manner as described above to obtain plasmid pAN120 (F170W + G300V + H313K).
  • ⁇ ⁇ after the displacement treatment is the 1 ⁇ 0th, 300th and 313rd amino acids only from phenylalanine to tributophan, Glycine, valine, and histidine were substituted with lysine, respectively, and were found to encode 9-fructofuranosidase.
  • pAN120 (F170W + G300V + H313K) was digested with BamHI to extract a 2 kbp BamHIDNA fragment containing the mutant ⁇ ⁇ . This was inserted into the BamHI site of pAN205 to construct plasmid pAN517.
  • the Aspergillus niger NIA 1602 strain (Sue-, niaD) was transformed in the same manner as described in Example D11. Aspergillus that lacks vector DNA and has a gene encoding the F170W + G300V + H313K mutant at the position of the fructofuranosidase gene on the host chromosome. ⁇ Nigar NIA 17 17 strains (Suc 10, nia D) were obtained.
  • Aspergillus niger NIA1771 strain was cultured in a medium (5% sucrose, 0.7% malt extract, 1% polypeptone, 0.5% carboxymethylcellulose, 0.3% NaC1). After culturing at 28 ° C for 3 days, the cells were disrupted with ultrasonic waves to prepare a crude liquid. As a result of measuring the J3-fructofuranosidase activity of the crude solution, 45 units of activity were detected per liter of the culture solution. Add 2.5 units of this crude ⁇ ! Per gram of sucrose, B x 45 sucrose, H7.5, 40. C, reacted for 24 hours.
  • fructose was 1.8%, dalcose 22.3%, sucrose 16.1%, GF2 55.7%, and GF34.1%. From this result, it was revealed that substitution of F170W + G300V + H313K increases GF2 and decreases GF3.
  • the active fraction was further loaded on a Sephataryl S-300 (Pharmacia) column (2.6 ⁇ 60 cm), eluted with 5 OmM trimethylamine monoacetate buffer (pH 8.0), and the active fraction was collected.
  • F1 70W + G300V + H313K mutant purified sample was used. When this was examined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it showed a uniform band of ⁇ 0,000 daltons, the same as that of the original parent / 3-fructofuranosidase.
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val 545 550 555 560 lie Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • CAGTACTGGG AGTACCTCGG GGAGTGGTGG CAGGAGGCGA CCAACTCCAG CTGGGGCGAC 780
  • TCTGGCCTGC CAATCGTGCC GCAGGTCTCC AGTATCCACG ATATGCTGTG GGCGGCGGGT 960 GAGGTCGGGG TGGGCAGTGA GCAGGAGGGT GCCAAGGTCG AGHCTCCCC CTCCATGGCC 1020 GGGTTTCTGG ACTGGGGGH CAGCGCCTAC GCTGCGGCGG GCAAGGTGCT GCCGGCCAGC 1080 TCGGCGGTGT CGAAGACCAG CGGCGTGGAG GTGGATCGGT ATGTCTCGTT CGTCTGGTTG 1140 ACGGGCGACC AGTACGAGCA GGCGGACGGG TTCCCCACGG CCCAGCAGGG GTGGACGG 1200 TCGCTGCTGC TGCCGCGCGA GCTGAAGGTG CAGACGGTGG AGAACGTCGT CGACAACGAG 1260 CTGGTGCGCG AGGAGGGCGT GTCGTGGGTG GTGGGGGAGT CGGACAACCA GACGGCCAGG 1320 CTGCGCACGC TGGGGATCAC
  • Fragment type Middle fragment Organism name: Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611) Array
  • Fragment type middle fragment
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • Sequence type peptide Fragment type: middle fragment
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • Fragment type middle fragment
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • Fragment type N-terminal fragment
  • Organism name Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611) Sequence
  • Sequence type nucleic acid
  • ATCGCSGAYC AYCCSHYGC 20 SEQ ID NO: 9
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Aspergil lus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
  • ATC GCC GAC CAC CCC TTC GCC GTC GAC GTC ACC GCC TTC CGC GAT CCG 48 lie Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro
  • Organism name Penici I lium roqueforti IAM7254
  • Gin Ser Pro lie Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gin Gly Thr Trp
  • Ala Ala Ala Gly Lys lie Leu Pro Ala Ser Ser Gin Ala Ser Thr Lys
  • 405 410 415 lie Ser Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Phe Val
  • 485 490 495 lie lie lie Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ala
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism Name Penici Ilium roqueforti IAH7254
  • GGCTCTGTCA CTT CAAGCC AACCATGGCG GGTGTGCTTG ACTGGGGCGT GTCGGCATAT 960
  • Organism name Scopulariopsis brevicaulis IF04843
  • Gly lie His Gly Asp Gly Pro Ser Ala Phe Leu Tyr Arg Gin His Asp
  • Sequence type nucleic acid
  • CAACCTACGT CTCTGTCAAT CGACAATTCC ACGTATCCTT CTATCGACTA CAACTCCGCC 60 CCTCCAAACC TCTCGACTCT TGCCAACAAC AGCCTCTTCG AGACATGGAG GCCGAGGGCA 120 CACGTCCTTC CGCCCCAGAA CCAGATCGGC GATCCGTGTA TGCACTACAC CGACCCCGAG 180 ACAGGAATCT TCCACGTCGG CTGGCTGTAC AACGGCAATG GCGCTTCCGG CGCCACGACC 240
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • nucleic acids of sequence Synthetic DNA CGACCAGTAC AAGCAGGCGG SEQ ID NO: 32
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明 細 書
3—フルクトフラノシダーゼおよびその遗^、
/3—フルクトフラノシダーゼ遗 の単離法、
iS—フルクトフラノシダ一ゼの産生系、 並びに
j8—フルク卜フラノシダーゼ変異体
[発 明 の 背 景]
発明の分野
本発明は、 S—フルクトフラノシダーゼ遗^およびその単離法並びにその産 ^に関し、 さらに詳しくは、 本発明は、 新規/ S—フルクトフラノシダーゼおよ びそれをコードする D N A、 および/ S—フルクトフラノシダーゼをコ一ドする D N Aの単離法、 9一フルクトフラノシダーゼ活性を示さない新規糸状菌およびこ の糸状菌を宿主として組換え /3—フルクトフラノシダーゼを製造する方法、 並び に、 ショ糖より特定のフラクトオリゴ糖、 例えば 1一ゲストース、 を選択的かつ 効率的に生成する ;3—フルクトフラノシダーゼ変異体に関する。
背景技術
一般にフラクトオリゴ糖は、 ショ糖のフラクトースに 1〜3 5^のフラクトー スが C 1と C 2の位置で ;3結合しているものであり、 難消化性の糖で、 腸内のビ フィズス菌增殖 (Εϋ作用、 コレステロールなどの脂質代謝改善効果、 難う蝕性な どの優れた生理効果を有するものであること力《見いだされている。
フラクトオリゴ糖は、 自然界では広く植物に分布しており、 例えばァスパラガ ス、 タマネギ、 キクイモ、 蜂蜜などに含まれていることが知られているが、 最近 では、 ¾i ^物由来の 9一フルクトフラノシダーゼの転移反応を利用してショ糖か ら大量に製造する技術が ¾iされ、 工業的に されている。 現在フラクトオリ ゴ糖の工業生産に利用されている /9一フルク トフラノシダーゼ製剤は、 ァスペル ギルス ·二ガー由来の菌体内 8—フラク 卜フラノシダーゼを利用しているため、 夾雑タンパク質が比較的多く含まれている。 そのため、 夾雑タンパク質を少なく し、 純度が高く、 力価の高い 一フルク 卜フラノシダ一ゼ製剤の作出が望まれて いる。 また、 /3—プラク トフラノシダーゼを固定ィ匕 S¾とすれば、 その利用効率 を高めることカ可能であるが、 酵素を固定化する際、 が菌体外に^^されて いる方が有利であり、 該 ;3 -フラクトフラノシダーゼを菌体外に生産させること が望まれている。
;9一フルクトフラノシダーゼをコ一ドする遺^?については、 細菌 (Fouet, A. , Gene, 45, 221-225(1986), Martin. I. et al. , Mol. Gen. Genet. , 208, 177-184(1987), Steininctz, U. et al.， Itol. Gen. Genet. , 191, 138-144(1983), Schol le, R. et al. , Gene, 80, 49-56(1989), Aslanidis, C. et al. , J. Bacteriol. , 171, 6753-6763(1989), Sato, Y. and Kuramitsu, H. . , Infect. Immun. , 56, 1956-1960(1989), Gunasekaran. P. et al. , J. Bacteriol. . 172, 6727-6735(1990)) 、 酵母 (Taussing, E, and M.
Carlson, Nucleic Acids Res. . 11, 1943-1954(1983), Laloux, 0. et al. , FEBS Lett. , 289, 64-68(1991) 、 カビ (Boddy. L. M. et ai. , Curr, Genet. , 24, 60-66(1993)、 植物
(Arai. li. et al. , Plant Cell Physiol. . 33, 245-252(1992), Unger, C. et al.
Plant Physiol. , 104. 1351-1357 (1994), Elliott, L et al. , Plant Mol. Biol. , 21, 515-524(1993). Sturm, A. and Chrispeels, H. J. , Plant Cell, 2, 1107-1119(1990) ) などから既に幾つか単離されている。 しかし、 転移活性を有し、 フラク トオリ
： ί«ιの工 に利用可能な S—フルク トフラノシダーゼをコ一ドする遗&^に ついては本発明者らが知る限り明らかにされていない。
また、 フラク トオリゴ糖の工業^に利用可能な /9一フルク トフラノシダーゼ をコ一ドする遗 fe^が得られれば、 この遗^との相同性を利用して類似の機能 を有する遗 を単離することができる。 本発明者等の知る限りでは、 この手法 を用いて新たな S—フルクトフラノシダーゼ遺^のスクリ一ニングを行った例 は報告されていない。 jS—フルク トフラノシダーゼのスクリーニングにおいても、 この新しい手法を用いて 一フルクトフラノシダーゼ遗伝子を単離する方法を発 明できれば、 スクリーニングの労力と時間は従来に比べ大幅に短縮できるように なる。 すなわち、 /9一フルクトフラノシダーゼをコードする遺伝子との相同性を 利用して類似の S—フルクトフラノシダーゼ遗 fe^を単離し、 次いで単離した遗 伝子をショ糖資化性がない宿主、 すなわちトリコデルマ ·ビリデ （Trichoderaa viride) やショ糖資化性を欠質させた酵母 (Oda, Y. And Ouchi, L， Appl.
Environ. Microbiol. , 1989, 55, 1742-1747 ) などへ導入し、 発現させること によつてその遗伝子産物である 9—フルク卜フラノシダーゼの特性を評価する。 この際発現されてくる β—フルクトフラノシダーゼは単一であるのでスクリー二 ングの労力と時間は従来に比べ大幅に^ Sできるようになる。 加えて発現された /S—フルクトフラノシダーゼが優れた特性を有している場合には、 その遺^を、 安全性および生産性の優れた菌株へ導入することで優れた ーフルクトフラノシ ダーゼの^^も可能となる。
さらに、 のような優れた ;9—フルクトフラノシダーゼの^には、 その生 産系の が必須である。 とりわけ、 ショ糖資化性がない宿主の ¾ϋが必須であ る。 すなわち、 利用する宿主自体に元々 yS—フルクトフラノシダーゼ活性が存在 する場合には、 得られる S¾は、 宿主由来の /9一フルクトフラノシダーゼと導入 した遗 fe?由来の )3 -フルクトフラノシダーゼの混合物となる。 そのため、 導入 した遗^由来の 一フルクトフラノシダーゼの優れた性質を引き出すためには、 宿主由来の iS—フルクトフラノシダーゼと分離した後使用する必要が生じる。 ― 方、 0—フルクトフラノシダーゼ活性を示さない宿主を利用することができれば、 S¾の分離の必要がなくなり、 粗 の で、 導入した遗^ F由来の β—フル クトフラノシダーゼの優れた性 を利用することができるようになる。 β—フル クトフラノシダーゼ活性を示さな L、m*物としては、 これまで前記したトリコデ ルマ （Trichoderma) 厲に厲する幾つかの菌株ゃショ糖資化性を欠失させた酵母 (Oda, Y. 前掲） などが知られている。 しかしながら、 生産させた^—フルクト フラノシダーゼの利用分野が食品分野であることを考盧した場合、 長 L、食経験が あり、 酵素の工業生産などにも利用され、 安全性が高いァスペルギルス属の糸状 菌の中で、 β—フ クトフラノシダ一ゼ活性を示さない菌株を宿主として利用す ること力《望まれる。
さらにまた、 フラクトオリゴ糖の工業^に利用可能な 8—フルクトフラノシ ダーゼをコードする遼^力 <得られれば、 その特性をより改善した変異体の製造 か可能となる。 例えば、 1一ゲストースを選択的かつ効率的に生産する /9一フル クトフラノシダーゼカ《得られれば下記のような利点力存在する。
1—ケストースおよびニストースはショ糖のフルクトースにそれぞれ 1および 2分子のフルクトースが結合したもので、 現: 業的に製造されているフラクト オリゴ糖混合物の一^である。 これらをそれぞれ高!^に調製し結晶化させる ことによって、 フラクトオリゴ糖としての生理効果を^したまま、 物性および 食品加 ±、 新たな優れた特性力、'現れることが最近見いだされており （特願平 7 一 2 2 2 9 2 3号、 特開平 6— 3 1 1 6 0号公報） 、 これらは新しい特徴を有す るフラクトオリゴ糖と言える。
このような状況の下、本発明者らの一部はショ糖を原料とした結晶 1—ゲスト ースの工業的製造法を提案している （待願平 8— 6 4 6 8 2号、 特願平 8— 7 7 5 3 4号、 特願平 8— 7 7 5 3 9号各明細害） 。 すなわち、 フルクトース転移活 性を有する をショ糖に作用させて 1 -ゲストースに変換し、 クロマト分離法 により 1一ゲストースを ¾S8 0 %以上に分画した後、 これを結晶 <bl液として Sが 9 5 %以上の結晶 1ーケストースを得る方法である。 この方法において使 用されるフルクトース転移活性を有する S¾の性質として、 ショ糖から 1ーケス トースへの変換率力高いことは勿論のこと、 クロマト分離および結晶化の各工程 において阻害的に作用するニストースの生成力く低いことが求められている。 現在 フラク トオリゴ糖混合物の工業的製造に利用しているァスペルギルス ·二ガー由 来の酵素を利用した場合のショ糖から 1一ゲストースへの変換率は 4 4 %であり、 この時の二スト一スの生成率は 7 %であった （待願平 8— 6 4 6 8 2号明細書） 。 この酵素の性質は、 結晶 1一ゲスト一スのェ 産という からは改善の余地 を残すものであるといえる。 そこで更に良い性質の酵素のスクリーニングを行い、 ぺニシリウム*ロックフォルティ一とスコブラリオプシス ·ブレビカウリスより それぞれ新たな を見出した。 これらの酵素の性質は、 ショ糖から 1一ゲスト ースへの変換率がそれぞれ最大で 4 7 %および 5 5 %であり、 その際のニストー スの生成率はそれぞれ 7 %および 4 %であった （特願平 8— 7 7 5 3 4号、特願 平 8— 7 7 5 3 9号明細害）。 このように、 これらの随はショ糖から 1ーケス トースへの変換率とニストース生成の抑制という点からはァスペルギルス ·ニガ 一由来の酵素より優位であるが、 の生産性や安定性においてより改善の余地 を残すものである。 すなわち、 酵素の生産性や安定性などの性質は、現在フラク トォリゴ糖混合物の工業的製造に利用しているァスペルギルス ·二ガー由来の酵 素と同等で、 かつショ糖から 1ーケストースへの変換率といった性質はべニシリ ゥム 'ロックフォルティーゃスコブラリオプシス ·ブレビカウリスと同等あるい はそれ LLであるような,の開発が期待されている。
[発 明 の 概 要]
本発明者らは、 今般、 新規な 9—フルクトフラノシダーゼ遗 の単離に成功 し、 さらにその新規遗^?を用いて他の S—フルクトフラノシダ一ゼ遺 の単 離法を 5t3tした。
また、 本発明者等は、 i9一フルクトフラノシダーゼ活性を示さない新規糸状菌 の作出に成功し、 さらにこの糸状菌を宿主として組換え 9一フルク トフラノシダ ーゼの 系を確立した。
さらに本発明者等は、、 フルク トース転移活性を有する 9一フルク卜フラノシ ダーゼのァミノ酸配列を変化させることによってその性質力変わることを見出し、 ショ糖より特定のフラクトオリゴ糖、 例えば 1—ゲストース、 を選択的かつ効率 的に生成する /3 -フルクトフラノシダーゼ変異体の作出にも成功した。
本発明は前記知見に基づくものである。
よって、 本発明による第一の態様によれば、 新規な /3—フルクトフラノシダ一 ゼ遗伝子およびそれがコ一ドする /3—フルクトフラノシダーゼが提供される。 また、 本発明による第二の態様によれば、 前記の新規な 3—フルクトフラノシ ダーゼ遗&?を用いた —フルクトフラノシダーゼ遗 の単離法が提供される。 また、 この本発明の第二の態様による方法により、 新規 ;3—フルクトフラノシ ダーゼが提供された。
さらに、 本発明による第三の態様によれば、 yS—フルクトフラノシダーゼ活性 を示さない新規糸状菌およびそれを宿主とした組換え 9一フルクトフラノシダ一 ゼの産^^が提供される。
さらにまた、 本発明による第四の態様によれば、 ショ糖より特定のフラクトォ リゴ糖、 例えば 1—ゲストース、 を選択的かつ効率的に生成する /9—フルクトフ ラノシダーゼ変異体が提供される。
そして、 本発明の第一の態様によるによる) δ—フルクトフラノシダーゼは、 配
Figure imgf000008_0001
に示されるァミノ酸配列を有するものである。
また、 本発明の第一の態様による /3—フルクトフラノシダーゼ遗
Figure imgf000008_0002
表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列をコードするものである。
また、 本発明の第二の態様による S -フルクトフラノシダーゼ遗 fe^の単離法 は、 配列表の配列番号 2言 et¾の塩基配列またはその一部を含んでなる ^SiS^Jと の相同性を利用することによって、 β—フ クトフラノシダ一ゼ遗^を単離す るものである。
また、 本発明の第二の態様による方法によって単離された新規 ;9一フルクトフ ラノシダーゼは、 配列表の配列番号 1 1または 1 3に記載のァミノ酸配列または その相同体を含んでなるポリべプチドである。
さらに、 本発明の第三の態様による糸伏菌は、 親ァスペルギルス属糸状菌の染 色体 D N A上の /3—フルクトフラノシダ一ゼ遗 の一部または全部を欠失させ ることによって、 ^一フルクトフラノシダーゼ活性を示さないものとされたもの である。
またさらに本発明の第四の態様による S—フルクトフラノシダーゼ変異体は、 親3—フルクトフラノシダーゼを変異させた結果得ることができるフルクトース 転移活性を有する 5—フルクトフラノシダーゼ変異体であって、 変異が、 親S— フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、 1個または複数個のアミノ酸 の挿入、 置 または欠失、 若しくはその一方または両末端への付加であり、 か つスクロースを基質として /3—フルクトフラノシダーゼ変異体のフルクト一ス転 移反応を利用して^されるフラクトオリゴ糖の成分^を、 親 /3—フルクトフ ラノシダーゼの場合の組成と異なるものとなるようにするものである。 の簡単な説明]
図 1は、 本発明による; 9一フルクトフラノシダーゼ遗伝子が組み込まれた発現 ベクター p AW 2 0— H y gを表す図である。
図 2は、 本発明の第二の態様による方法によって単離された新規 /S—フルクト フラノシダーゼ遠 が組み込まれた発現べクタ一 p P R S O l— H y gを表す 図である。
図 3は、 ァスペルギルス ·二ガー N RR L 4 3 3 7株由来の n i a D遗伝子を 含む D N A断片の制限酵素地図である。
図 4は、 プラスミ ド p AN 203の作製法を表す図である。
図 5は、 プラスミ ド PAN572の作製法を表す図である。
図 6は、 プラスミ ド pAN 120の制限酵^図を表す図である。
図 7は、 プラスミ ド p Y 2831の作製法を表す図である。
図 8は、 プラスミ ド pYSUC (F170W) のィ«法を表す図である。
図 9は、 プラスミ ド p AN 531の PS¾法を表す図である。
[発明の具体的説明]
胜物の寄託
本発明による 3—フルクトフラノシダーゼ活性を示さない新規糸状菌ァスペル ギルス ·二ガー N I A 1602株は、 F ERM— B P 5853の受託番号のもと、 寄託日 1997年 3月 6日として、 通商産業省工業技術 命工学工業技術研究 所 （日本国茨:! ¾mつくば mmi丁目 1番 3号） に寄託されている。 本発明の第一の態様による /3—フルク卜フラノシダーゼ
本発明の第一の態様によるポリぺプチドは、 配列表の配列番号 1に示されるァ ミノ酸配列を有するものである。 この配列番号 1に示されるァミノ酸配列を有す るポリべプチドは3—フルクトフラノシダーゼ作用を有する！^として作用する。 また、 本発明によるポリペプチドには、 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸 配列の相同体が含まれる。 ここで 「その相同体」 とは、 配列番号 1に示されるァ ミノ酸配列において、 いくつかのアミノ酸の挿入、 置換または欠失、 若しくはそ の一方または両末端への がなされたものであって、 かつその j8—フルクトフ ラノシダーゼ作用を^するものをいうものとする。 このような 「相同体」 は、 配列番号 1に示される配列を参照すれば、 当業者であれば格別の困難性なしに選 択し、 製造可能であることは明らかである。
配列番号 1に示されるアミノ酸配列が有する —フルクトフラノシダーゼは、 その転移活性が高く、 フラクトオリゴ糖を効率良く生成する。 具体的には、 濃度 1 0重量％以上のショ糖溶液を基質として用いた反応において、 転移活性が加水 分解活性と比較して 1 0倍以上高く、 フラクトオリゴ糖への変換率が 5 0 %以上 である。 本発明の第一の態様による/ g—フルクトフラノシダーゼ遗 fe?
本発明の第一の態様によれば、 /3—フルクトフラノシダーゼをコードする新規 遗 として、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列をコードする D N A配列を含 んでなる D N A断片が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明による新規遗^?の好ましい具体例と して、 配列表の配列番号 2に示さ
Figure imgf000011_0001
らなる D N A配列を含んでなる D N A断片が提供される。
に、 タンパク質のアミ
Figure imgf000011_0002
列は、 いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。 よって配列番号 1に示される アミノ酸配列をコードする種々の i ^配列を適宜選択すること力可能である。 従 つて、 本発明において「配列番号 1に示されるアミノ酸をコードする D N A配列」 とは、 配列番号 2に示される塩基配列を有するもの、 およびその縮重関係にある コドンが使用されている は同一の塩基配列を有しかつ l^ij番号 1に示される アミノ酸をコードする ¾S配列をも意味するものとする。
さらに、 前記したように本発明による ff^^Sには、 配列番号 1に示されるァ ミノ酸配列の相同体をも包含するものである。 従って、 本発明による D N A断片 には、 さらにこの相同体をコードする塩基配列も包含される。
本発明による D N A断片はその ¾g配列が定まつていることから、 その D N A 断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法に従って製造することである。
またこの配列はァスペルギルス ·ニガ一 （Aspergillus niger ) 、 好ましくは ァスペルギルス ·二ガー AC E— 2— 1株 （F ERM— P 5886または AT C C 20611) 、 から遗 fei工学的な手法を用いて得ることができる。 その具体 的な方法は後記する ¾M例 Aに詳細に説明されている。
)8—フルクトフラノシダーゼをコードする遠伝子の発現
本発明の第一の態様による; 8—フルクトフラノシダーゼは、 それをコードする DN A断片によって形質転換された宿主細胞において製造することができる。 よ り具体的には、 本発明の第一の態様による jS—フルクトフラノシダーゼをコード する D N A断片を、 宿主細胞内で複製可能でかつ同遗 が発現可能な状態で含 む DNA分子、 特に発現ベクター、 の形態とし、 それによつて宿主細胞の形 換を行い、 その形質転換体を培養する。
従って、 本発明によれば、 さらに本発明による /S—フルクトフラノシダーゼを コードする遗^ Fを含んだ DNA 、 特に発現ベクター、 力《提供される。 この DNA は、 ベクター^?に本発明による /3—フルクトフラノシダーゼをコ一 ドする D N A断片を組み込むことによって得ることが出来る。 本発明の好ましい 態様によれば、 このベクターはプラスミ ドである。
この本発明による D N A の作成は遗 工学の分野で慣用されている手法 に準じて実施されてよい。
本発明において利用されるベクターは、 使用する宿^胞の種類を勘案しなが ら、 ウィルス、 プラスミ ド、 コスミ ドベクターなどから適： 択することができ る。 例えば、 宿主細胞が; «菌の場合はスファージ系のパクテリオファージ、 P BR, pUC系のプラスミ ド、 枯草菌の場合は pUB系のプラスミ ド、 酵母の場 合は YEp、 YCp系のベクターが挙げられる。 このプラスミ ドは形質転換体の選択マ一カーを含むのが好ましく、 選択マーカ 一としては薬剤耐性マ一カー、 栄養要求マーカー遺伝子を使用することができる。 その好ましい具体例としては、 使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐 ¾¾伝子、 カナマイシン耐性遗伝子、 テトラサイクリン耐 ffiit伝子などであり、 酵母の場合はトリブトファン合成遗 fe^ (T R P 1 ) 、 ゥラシル合成遣伝子 (U RA3)、 ロイシン合成遗^ (LEU2) などがあり、 カビの場合はハイグロ マイシン耐 ttite^ (Hy g)、 ビアラホス耐性遺伝子 (Ba r) .硝酸還元酵 素遗伝子 (n i aD) などが挙げられる。
さらに、 本発明による発現ベクターとしての DNA は、 β—つ） クトフラ ノシダーゼ遗 の発現に な DN Α配列、 例えばプロモーター、 転写開始信 号、 リボゾーム結合部位、 翻訳停止シグナル、 転写終結信号などの転写調節信号、 翻訳調節信号などを有しているの力《好ましい。
プロモーターとしては、 挿入断片に含まれる宿主中において機能することがで きるプロモーターはもちろんのこと、 大腸菌においてはラクト一スオペロン (l a c) . トリブトフアンオペロン （t r p)等のプロモーター、 酵母ではァ ルコールデヒドロゲナーゼ遗^ f (ADH)、 酸性フォスファターゼ遗
(PHO)、 ガラクトース遗 (GAL)、 グリセロアルデヒド 3リン酸デヒ ドロゲナーゼ遗^ (GPD) などのプロモーター、 カビでは α—アミラーゼ遗 f (amy)、 セロピオハイドロラーゼ I遗 (CBH I)等のプロモータ 一が好ましく用いることができるものとして挙げられる。
また、 宿 胞が枯草菌、 酵母、 カビの場合には、 分泌型ベクターを使用して、 菌体外に組換え^一フルクトフラノシダーゼを分泌させることも有利である。 宿
¾¾胞としては、 宿主一^ ^クタ一系カ¾&されているものであるならばいずれも 禾【J用可能であるが、 好ましくは酵母、 カビなどが挙げられる。 更に後記する本発 明の第三の纖による糸状菌を用いることも好ましい。 前記した形質転換体の する組換え新規 は、 次のようにして得ることが 出来る。 まず前記の宿主細胞を適切な条件下で培養し、 得られた培養物から公知 の方法、 例えば遠心分離により培養上清あるいは菌体を得る。 菌体の場合にはこ れを適切な緩衝液中に懸濁し、 凍結融解、 超音波処理、 磨砕等により菌体を破砕 し、 遠心分離またはろ過により組換え新規 を含有する菌体抽出物を得る。 酵素の精製は、 慣用されている分離、 精製法を適宜組み合わせて すること ができる。 例えば、 熱処理のような耐熱性の差を利用する方法、 塩沈澱および溶 媒沈澱のような溶解性の差を利用する方法、 透析、 限外ろ過、 ゲルろ過および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法、 ィ オン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一 クロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、 疎水クロマトグラフ ィー、 iS^Bクロマトグラフィーのような ^Τ性の差を利用する方法、 更に等電点 電気泳動のような等 の差を利用する方^が挙げられる。 本発明の第一の態様による; 9一フルクトフラノシダーゼを用いたフラクトオリ ゴ糖の
更に本発明によれば、 前記の組換え宿主または組換え ;3 -フルク トフラノシダ ーゼを用いた、 フラク トオリゴ糖の製造法力 される。
すなわち、 本発明によるフラクトオリゴ糖の製造法は、 前記の組換え宿主また は組換え 一フルクトフラノシダーゼと、 スクロースとを接触させることによつ て実施される。
本発明による組換え宿主または組換え iS—フルクトフラノシダーゼと、 スクロ ースとの接) teS様およびその条件は、 組換え新規酵素が該糖に作用可能な様態で ある限り特に限定されない。 溶液中で接触させる埸合の好ましい態様を示せば次 の通りである。 すなわち、 スクロースの^ «Sは、 用いる糖が溶解されうる範 囲であれば、 本酵素の比活性、 反応温度等を考慮して適宜選択してよいが、 5〜 8 0 %の範囲とするの力く 的であり、 好ましくは 3 0〜7 0 %の範囲である。 糖と酵素との反応における反応温度および p H条件は、 組換え新規 の最適条 件下で行うこと力く好ましい。 よって、 3 0〜8 0 °C程度、 p H 4〜1 0程度の条 件下で行うのが一般的であり、 好ましくは 4 0〜7 0。C、 p H 5〜7の範囲であ る。
また、 組換え新規酵素の精製の ¾Jgも適宜選択することができ、 形質転換体の 培養上清あるいは菌体破碎物から粗酵素のまま用いることもでき、 また、 各種精 »：程で得られた精製 1¾として利用してもよい。 さらには各種精製手段を経て 単雠精製された として用いてもよい。
更に は、 常法に準じて担体に固定化された状態でスクロースと接触させて もよい。
生成したフラクトオリゴ糖は、 反応液を公知の方法に従い精製することにより 得ることが出来る。 例えば、 加熱して酵素を失活させた後、 活性炭により脱色し、 さらに、 イオン交換樹脂で脱塩する方法が挙げられる。 本発明の第二の態様による^一フルクトフラノシダーゼ遗 fe?の単離法
本発明の第二の態様による遗 の単離法にお L、て利用される塩基配列は、 配 列番号 2に示されるものである。
本発明による第二の態様による遗&?の単離法にあつては、 配列表の配列番号
2に示される塩基配列またはその" ¾5を含んでなる塩基配列との相同性を利用す る。 その具体的な方法としては、
① β—フルクトフラノシダーゼ遗^が含まれると予想される遗^ライブ ラリーを、 前記 ¾S配列をプローブとしてスクリーニングする方法、
② 前記 ¾S配列情報に基づいたプライマーを調製し、 8—フルクトフラノシ ダ一ゼ遗^が含まれると予想されるサンプルを铸型とした P C Rを実施する方 法
力《挙げられる。
前記①の方法をより具体的に説明すると、 その方法は、
一フルクトフラノシダーゼ遗^が含まれると予想される遺伝子ライブラリ 一を用意する工程と、
配列表の配列番号 2記載の塩基配列またはその一部を含んでなる塩基配列を用 いて前 atisiライブラリ一をスクリ一二ングし、 前記配列表の配列番号 2記載 の塩基配列またはその一部を含んでなる塩基配列とノヽィブリダイズする配列を遠 fe?ライブラリーから選択し、 その後選択された配列を単離する工程と、 そして 遗 ライブラリーから選択、 単離された配列から、 β—フルクトフラノシダ —ゼ遗 を単離する工程と
を含んでなる。
ここで、 遗 fe^ライブラリ一は、 染色体ライブラリー、 c D N Aライブラリー のいずれであってもよい。遠伝子ライブラリーの作製は、 公知の方法によって実 施されてよい。
また、 遗 ライブラリーのスクリーニングにおいて、 配列番号 2記載の塩基 配列またはその一部を含んでなる塩基配列は、 好ましくは配列番号 2記載の塩基 配列の一部を含んでなる塩基配列、 すなわちプローブとして用いられるのカ《好ま しい。 また、 このプローブは標識されてなるのが好ましい。
遗 ^ライブラリーのスクリーニングの方法、 プローブを標識する方法および その標識、 選択された配列の単離、 さらにその単離配列からの /8—フルクトフラ ノシダーゼ遣^の単離は、 遗 工学の分野で憤用されている手法によって、 適切に選択された条件下で実施されてよい。 配列番号 2の配列が与えられている のであるから、 当業者であれば、 それらの手法および条件を容易に選択できると 考んりれる。
また、 前記②の方法をより具体的に説明すると、 その方法は、
配列表の配列番号 2記載の塩基配列またはその一部を含んでなる ¾S配列から なるプライマーを用意する工程と、
前記プライマーを用い、 ； S—フルクトフラノシダーゼ遗 ^が含まれると予想 されるサンプルを铸型とした P C Rを実施する工程と、 そして
增幅された P C R産物から、 9—フルクトフラノシダーゼ遗 を単離するェ 程と
を含んでなる。
ここで、 利用されるプライマーの調製、 9一フルクトフラノシダーゼ遗 が 含まれると予想されるサンプルの調製、 P C Rは、 遺 工学の分野で慣用され ている手法によって、適切に選択された条件下で実施されてよい。 配列番号 2の 配列が与えられているのであるから、 当業者であれば、 それらの手法および条件 を容易に選択できると考えられる。
本発明による /3—フルクトフラノシダーゼ遺 の単離法が適用される対象は、 β一フルクトフラノシダーゼが含まれると予想されるものであれば特に限定され ないが、 例えば、 真菌類、 より具体的にはァスペルギルス厲、 ぺニシリウム属、 またはスコブラリオプシス厲に厲する港生物である。 本発明の第二の態様による遗 fe^の単離法により得られた新規g—フルクトフ ラノシダーゼおよびその遠
本発明の第二の態様による遗^ Fの単離法により提供される新規 /9一フルクト フラノシダーゼ酵素は、 配列表の配列番号 1 1または 1 3に示されるアミノ酸配 列を有するものである。
さらに、 本発明による /3—フルクトフラノシダーゼ^は、 配列表の配列番号 1 1または 1 3に示されるアミノ酸配列の相同体を包含する。 ここで 「その相同 体」 とは、 配列番号 1 1または 1 3に示されるアミノ酸配列において、 幾つかの ァミノ酸の挿入、 S換または欠失、 もしくはその一方または両末端への付加がな されたものであって、 かつその /3—フルクトフラノシダーゼ作用を^するもの を言うものとする。 このような 「相同体」 は、配列番号 1 1または 1 3に示され る配列を参照すれば、 当業者であれば困難性なしに選択し、 製造可能であること は明らかである。
本発明による配列番号 1 1および 1 3に記載のアミノ酸配列を有する /S—フル クトフラノシダーゼは、 その転移活性が高く、 フラクトオリゴ糖を効率良く する。 具体的には、 3 0 %以上のショ糖を基質として用いた反応において、転移 活性が加水分解活性と比較してそれぞれ 4倍 JiLhおよび 7倍以上高く、 フラクト ォリゴ糖への変換率がともに 5 0 %以上である。
本発明の第二の態様による遗 の単離法により提供された 一フルクトフラ ノシダーゼをコードする新規遠^は、 配列表の配列番号 1 1または 1 3に示さ れるァミノ酸配列またはその相同体をコードする D N A配列を含んでなるもので める。
—般に、 蛋白質のアミノ酸配列が与えられれば、 それをコードする 配列は、 いわゆるコドン表を参照して容易に定まる。 よって配列番号 1 1あるいは 1 3に 示されるァミノ酸配列をコードする種々の塩基配列を適: ¾択することが可能で ある。 従って、 本発明において ΓΕ列番号 1 1あるいは 1 3に示されるアミノ酸 配列をコードする D N Ag^ とは、 配列番号 1 2あるいは 1 4に示される塩基 配列を有するもの、 およびその縮重関係にあるコドンが使用されている以外は同 —の 配列を有しかつ i£ ^番号 1 1あるいは 1 3に示されるアミノ酸配列をコ 一ドする塩基配列をも意味するものとする。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明による新規遗 fe^の好ましい具体例と して、 配列表の配列番号 1 2または 1 4に示される塩基配列を有する D N A配列 を含んでなる D N A断片が提供される。
さらに、 前記したように本発明による新規遺 がコードする酵素には、 配列 番号 1 1あるいは 1 3に示されるアミノ酸配列の相同体をも包含するものである。 従って、 本発明による D N A断片には、 さらにこの相同体をコードする塩基配列 も包含される。
本発明による D N A断片はその 配列力定まつていることから、 その D N A 断片を取得する一つの手段は核酸合成の手法に従つて製造することである。
またこの配列はぺニシリウム ·口ッケフオルチ （Penici Ilium roqueforti) あ るいはスコブラリオプシス ·ブレヴィカウリス （Scopulariopsis brevicaulis)、 好ましくはぺニシリゥム ·口ッケフオルチ I AM 7 2 5 4株あるいはスコブラ リオプシス *ブレヴィカウリス I F 0 4 8 4 3株、 から遺 工学的手法を用い て得ることが出来る。 その具体的な方法は後記する実施例 Bに詳細に説明されて いる。 本発明の第三の態様による 9一フルクトフラノシダーゼ活性を示さないァスぺ ルギルス厲糸状菌およびその取得
本発明の第三の態様による /9一フルクトフラノシダーゼ活性を示さないァスぺ ルギルス属糸状菌とは、 該糸状菌を培養して得られる培養上清および Zまたは菌 体を破枠して得られる粗 S¾を用い、 ショ糖を基質として反応させたとき、 基質 であるショ糖に変化を来さな I、ものを意味する。
このような糸状菌は、 S—フルクトフラノシダーゼをコードする itfe^自体を 不活化することによって得ることができる。 さらに、 /3—フルク トフラノシダ一 ゼをコードする の発現に係わる の不活化や、 β—フルクトフラノシダ ーゼ蛋白質の 、 分泌に係わる の不活化などによっても取得することがで さる 0
しかしながら、 8—フルク トフラノシダーゼ活性を示さない糸状菌を組換え8 一フルクトフラノシダーゼを生産する宿主として利用することを勘案した場合、 変異の安定性や酵素の生産性といった観点から、 3—フルクトフラノシダーゼを コードする遗^?自体が不活化されたものが好ましい。 特に 9—フルク卜フラノ シダーゼをコ一ドしている領域の一部若しくは全てを欠質しているものが好まし い o
このような糸伏菌を取得するための方法としては、親ァスペルギルス厲糸状菌 を N T G ( 1—メチルー 3—二トロー 1—ニトロソグァ二ジン）、紫外線といつ た変異原によって処理し、 変異を誘発させる方法が利用可能である力 組換え D N A技術を利用した方法が好ましい。
組換え D N A技術を利用して /3—フルク卜フラノシダーゼ遗^?を不活性ィ匕さ せる方法としては、 相同組換えの を利用して行う方法があり、 大別して 1段 11¾伝子ターゲッティング法および 2段 Pgita^ターゲッティング法の 2通りの 方法が挙げられる。
1段！ ターゲッティング法においては、 揷 A ベクターまたは置 ¾ ベ クタ一を利用する。
挿入型ベクターとして、 不活性化された —フルクトフラノシダーゼ遗 fe^と、 形 ¾fe換体を選択するための選択マ一力ー遗 とを含んでなるベクターを用意 する。 ここで、 不活性ィ匕された 3—フルクトフラノシダーゼ遺^とは、 単独で 標的 iS—フルクトフラノシダーゼ遺伝子を不活化可能な変異 （好ましくは欠失） か Ί«れた 2箇所に導入された以外は標的 )3—フルクトフラノシダーゼ遗 と異 なるところがない /9一フルク トフラノシダーゼ遗 fe^である。
このような挿入型ベクターを細胞に導入し、 2箇所の変異箇所の間の領域で、 染色体上の標的9一フルクトフラノシダーゼ遗 と相同組換えを起こさせる。 その結果、 染色体上に標的 )S—フルクトフラノシダーゼ遗 は 2コピーとなる。 どちらの標的3—フルクトフラノシダーゼ遗 にもそれぞれ 1箇所ずつ変異が 導入され、 標的 jS—フルクトフラノシダーゼ遺伝子を不活化することができる。 —方、 置^ ベクターとして、 標的 /S—フルクトフラノシダーゼ遗 fe^内部に 選択マーカー遗 fe^を挿入して、 分断された標的 /9一フルクトフラノシダーゼ遗 を含むべクタ一を用意する。
この置換型べクタ一を細胞に導入し、 選択マ一力ー遗 の両側の 3—フルク トフラノシダーゼ遗^に由来する領域でそれぞれ相同組換えを起こさせる。 そ の結果、 染色体上の標的 /3—フルク トフラノシダーゼ遗^ i選択マ一カー遗伝 子が挿入された遗 ^と置換されるため、 標的3—フルクトフラノシダーゼ遗伝 子が不活化される。
また、 2段 ¾ift ^夕一ゲッティング法においては、 直接 fi換法と、 ヒットェ ンドラン （hit and run) 置換法とか J用可能である。
直接置換法の第一段階は、 1段 Pgilfe ^ターゲッティング法の置 べクタ一 を用いる方法と同様の操作を行う。 第 2段階として、 ベクター上に、 単独で標的 /3—フルクトフラノシダーゼ遺伝子を不活化可能な変異 （好ましくは欠失） が少 なくとも 1つ以上導入された檫的9一フルクトフラノシダーゼ遗 を作製する。 このベクターを細胞に導入し、 変異箇所の両側の領域で、 染色体上の、 選択マー カー遗 で分断された標的9一フルクトフラノシダーゼ遺伝子と相同組換えを 起こさせる。 その結果、 標的 ;3—フルクトフラノシダーゼ遗 を、 不活化され た標的9一フルクトフラノシダーゼ遗 ^と置き換えることができる。 このよう な組換えを起こした菌株は、 マ一カー遗 ^が欠落したことを指標に選抜するこ とができる。
一方、 ヒッ トエンドラン （hit and run) 置換法の第一段階では、 単独で檁的 —フルクトフラノシダーゼ遺 を不活化可能な変異 （好ましくは欠失） が少 なくとも 1つ以上導入された檁的^一フルク トフラノシダーゼ遗！ ^と選択マ一 カー遗^とからなるベクターを用意する。 このベクターを細胞に導入し、 標的 /S—フルクトフラノシダ一ゼ遗 上の変異箇所の上流領域で染色体上の標的) S —フルクトフラノシダーゼ遗 と相同組換えを起こさせる。 その結果、 染色体 上で、選択マーカー遗^を含むベクター本体が 2コピーの標的 /9一フルクトフ ラノシダーゼ遗&?により挟まれた形となり、 2コピーの標的/ S—フルクトフラ ノシダーゼ遗 のうち、 変異を含むものと含まないもの力生じる。 続いて、 2 コピーの標的 jS -フルクトフラノシダーゼ遗 fe^の間に挟まれたベクタ一部分を ル一プアゥ卜させ、 変異箇所の下流領域で再び相同組換えを生じさせる。 それに よって、選択マーカー遗 ^を含むベクターと 1コピーの標的 S—フルク トフラ ノシダーゼ遗伝子とが欠落して、 染色体上の遗 を変異を含む標的; S—フルク トフラノシダーゼ itfe^に匿き換えることができる。 このような組換えを起こし た菌株は、 マーカー遺伝子が欠落したことを指檁に選抜することができる。 この 際、 第一段階として変異箇所の下流部分で相同組換えを起こさせ、 続いて上流部 分で相同組換えを起こさせても同様の結果が得られることは明らかである。 以上の操作を行う上で、選択マーカ一 itfe^としては形 ¾f£換体を選択できる ものであれば何でも^ ffl可能である。 また、 2段階遗 feTターゲッティング法に おいては、 選択マーカ一遺伝子が欠落した株を選抜する操作があるため、 選択マ 一力ー遗 fe^が欠落した株をポジティブに選択できるような、 たとえば硝 i¾S元 ^ ^ (n i a D) 、 ォロチジン酸 fl ^酸酵素遗 ^ (p y r G)、 A T P —スルフリラ一ゼ遗^ ( s C) などが好ましい。
本発明の第三の態様による糸状菌の具体例としては、 ァスペルギルス ·二ガー
N I A 1 6 0 2株 （F E RM B P— 5 8 5 3) が挙げられる。 本発明の第三の態様による 3—フルクトフラノシダーゼ活性を示さな I、糸状菌 を宿主とする組換え; 3—フルクトフラノシダーゼの製造方法
本発明による糸状菌は、 組換え S—フルクトフラノシダーゼの製造のために好 ましく用いることができる。 具体的には、 3—フルクトフラノシダーゼをコード する D N A断片を、 本発明の宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子力発現可能な 状態で含む D N A^、 特に発現ベクター、 の形態とし、 これにより本発明によ る糸状菌の形質転換を行い、 この形 ^換体において、 /3—フルクトフラノシダ ーゼ活性を有するものとしては単一のものとして、 組換え /3—フルクトフラノシ ダーゼを産生することができる。
上記において D N A分子の好ましい態様はプラスミ ドであり、遗 &ί工学の分 野で慣用されている手法に準じて されて良 L、。
本発明の好ましい態様によれば、 β—フルクトフラノシダーゼをコードする D Ν Α断片の具体例として、前記した本発明の第一の態様による /3—フルクトフラ ノシダーゼをコ一ドする D N A、 本発明の第二の態様による方法によって単離さ れた新規^一フルク卜フラノシダーゼをコードする D N A、後記する本発明の第 四の態様による /3—フルクトフラノシダーゼ変異体をコードする D N Aが挙げら れる。
また、 この第三の態様による糸状菌を宿主として、 /9一フルクトフラノシダー ゼを発現させるための発 の好ましい例としては、 前記した本発明の第一の態 様に関して説明した発現系を利用することができる。
具体的には、 前記プラスミ ドは形 ®fe換体の選択マーカ一遗 を含むのが好 ましく、 運択マーカー遗^ Fとしては薬 ¾»厨性マーカー遗^？、 栄 求マーカ ー遗 ^を^することができる。 その好ましい具体例としては、 ハイグロマイ シン耐 ffitfei (H y g) 、 ビアラホス耐性遗 fe? (B a r ) , 硝 Μ¾元^遗 （n i a D) 、 ォロチジン酸!^酸 遗 （p y r G)、 AT P—スル フリラ一ゼ遗伝子 （s C) などが挙げられる。
さらに、 発現べクタ一としての DNA^ ^は、 j3—フルクトフラノシダーゼ遗 の発現に必要な DN A配列、 例えばプロモーター、 転写開始信号、 翻訳停止 シグナル、 転写終結信号などの転写調節信号、 翻訳調節信号などを有しているの 力《好ましい。 プロモーターとしては、 挿入断片に含まれる本発明の宿主中におい て機能することができるプロモータ一はもちろんのこと、 α—アミラーゼ遗
(amy) 、 ダルコアミラーゼ遗^? (g 1 a)、 ）9一フルクトフラノシダーゼ τ , グリセ口アルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遗 (gp d) 、 フォ スフォグリセレートキナーゼ遗^ (p gk) などのプロモータ一力く好ましく用 いることができるものとして挙げられる。
また、 発現べクタ一を分泌型ベクターとして、 菌体外に組換え ;3—フルクトフ ラノシダーゼを分泌^させることも有利である。
本発明の第三の態様による糸状菌を利用した; 9一フルクトフラノシダーゼの生 産は、 /3—フルクトフラノシダーゼをコードする DNAによって形 ®fe換された 本発明による糸状菌を適切な条件下で培養し、 得られた培養物から公知の方法、 例えば遠心分離により培養上清あるいは菌体を得る。 菌体の場合、 これを適切な 緩衝液中に懸濁し、 凍結禱、 超音波処理、 摩砕などにより菌体を破砕し、遠心 分離または «iiにより組換え /9一フルクトフラノシダーゼを含有する菌体抽出物 を得ることができる。 本発明の第四の態様による 9一フルクトフラノシダーゼ変異体
本発明の第四の態様による )9—フルクトフラノシダーゼ変異体は、親3—フル クトフラノシダーゼを変異させた結果得ることができるものである。 さらに、 本 発明にあっては、 この変異が、 親 S—フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に おいて、 1個または ¾¾¾個のアミノ酸の挿入、
Figure imgf000024_0001
または欠失、 若しくはその —方または両末端への付加であり、 かつスクロースを基質として /9一フルクトフ ラノシダーゼ変異体のフルク トース転移反応を利用して生成されるフラクトオリ ゴ糖の成分 *a ^を、 親/ s—フルク トフラノシダ一ゼの場合の組成と異なるものと なるようにするものであることを意味する。
本発明において、 親 /9一フルク トフラノシダーゼは、 フルクトース転移活性を 有する 9一フルク トフラノシダ一ゼであればその起源は限定されないが、 好まし くは真菌類由来、 特にァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 スコブラリオプシス 属、 フザリウム厲、 またはオーレォバシジゥム属に属するものに由来する/ S—フ ルク トフラノシダーゼが好ましい。 より好ましくは、 ァスペルギルスに由来する S—フルク トフラノシダーゼであり、 とりわけ前記した本発明の第一の態様によ る、 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸 se^よりなる 3—フルク 卜フラノシ ダーゼまたはその相同体が好ましい。 また、 親3—フルクトフラノシダーゼは、 前記した本発明の第二の態様による単離法によつて得られた /S—フルクトフラノ シダーゼまたはその相同体であつてもよい。
本発明の好ましい態様によれば、 親^—フルク トフラノシダーゼが配列番号 1 に示されるアミノ酸 SS^よりなるものである場合、 その配列中の 1 7 0、 3 0 0、 3 1 3、 および 3 8 6番目のァミノ酸からなる群から選択される 1個または 2個 £U:のァミノ酸残基が他のァミノ 基によつて置換されてなる変異体がその具 体例として挙げられる。
本発明の好ましい態様によれば、
1 7 0番目のアミノ酸が、 トリブトファン、 フエ二ルァラニン、 およびチロシ ンからなる群から還択される芳香族ァミノ酸、 より好ましくはトリブトファンに、
3 0 0番目のアミノ酸が、 トリブトファン、 バリン、 グルタミン酸、 およびァ スパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸に、
3 1 3番目のァミノ酸が、 リジン、 アルギニン、 およびヒスチジンからなる群 から選択される塩基性アミノ酸、 より好ましくはリジンまたはアルギニンに、
3 8 6番目のアミノ酸力 リジン、 アルギニン、 およびヒスチジンからなる群 から選択される塩基性アミノ酸、 より好ましくはリジンに
置換されたものが好ましいものとして挙げられる。 これら変異体は、 ショ糖より 1一ゲストースを選択的かつ効率的に生成することができるという有利な性質を 有している。
本発明の特に好ましい態様によれば、 1 7 0番目、 3 0 0番目および 3 1 3番 目のアミノ酸がトリブトファン、 トリプトファン、 およびリジンに、 またはトリ ブトファン、ノ、'リン、 およびリジンにそれぞれ置換されたものである。 これら変 異体は、 ショ糖より 1一ゲストースをより選択的かつ効率的に^することがで きるという
Figure imgf000026_0001
また、親 /S—フルク卜フラノシダーゼか ΈΞ列番号 1に示されるアミノ酸配列の 相同体である場合には、 前記の 1 7 0、 3 0 0、 3 1 3、 および 3 8 6番目のァ ミノ酸に相当する位置のァミノ酸からなる群から選択される 1個または 2個以上 のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基により置換されてなるものがその具体例とし て挙げられる。 ここで、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列よりなる親 iS—フル クトフラノシダーゼの相同体において置換されるべきアミノ酸残基の位置は、 公 知のアルゴリズムによるアミノ酸 SE ^の J l^によつて^に選択することができ る。 一方、 公知のアルゴリズムによるアミノ酸配列の比較が困難な場合にあって は、 酵素の立体構造を比較することによって置換されるべきアミノ^基の位置 を特定することができる。 本発明の第四の態様による 3—フルクトフラノシダーゼ変異体の
本発明の第四の態様による /3—フルクトフラノシダーゼ変異体は、 組換え D N A技術、 ポリぺプチド合 β¾¾術などによつて することができる。 組換え D N A技術を用いる場合には、 親/ S—フルクトフラノシダーゼをコ一ド する D N Aを取得し、 この D N A内で特異的部位に突然変異を発生させてコ一ド するアミノ酸を置換させた後、 変異処理を施した D N Aを含む発現べクタ一で宿 ^ffl胞を形 Κ¾換し、 形 ® δ換細胞を培養することによって ;3—フルクトフラノ シダーゼ変異体を調製することができる。
遺伝子の特定部位に突然変異を導入するための幾つかの方法は、 Gapped duplex法 （Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))、 Kunkel法（Methods in Enzymology, 154, 367 (1987)) など当業者に公知である。 これらの方法は、 β 一フルクトフラノシダーゼをコードする D Ν Α内で特異的部位に突然変異を発生 させることに利用することができる。 変 ¾t理後の D N Aの塩基配列は、 マキサ 厶ーギルバードの化学修飾法 (Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) ゃジ デォキシヌクレオチド鑌終結法 (Gene, 19, 269 (1982)) 等により確認すること ができ、 β—つ) クトフラノシダーゼ変異体のアミノ酸配列は、 確認された塩基 配列より解読することができる。 本発明の第四の態様による /3—フルクトフラノシダーゼ変暴体の Φ産
本発明の第四の態様による 8—フルクトフラノシダ一ゼ変異体は、 それをコー ドする D Ν Α断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現可能な状態で 含む D N A 、 特に発現ベクター、 の形態として宿主細胞の形質転換を行い、 その宿 ^!ffl胞において産生させることができる。
従って、 本発明によれば、 本発明の) S—フルクトフラノシダーゼ変異体をコー ドする tfe^を含んだ D N A分子、 特に発現ベクター、 が提供される。 この D N A は、 ベクター: ^に本発明による ;3—フルクトフラノシダーゼ変異体をコ 一ドする D N A断片を組み込むことによって得ることができる。 本発明の好まし い形態によれば、 このベクターはプラスミ ドである。 この本発明による D N A分子の¾は遺^ F工学の分野で憤用されている手法 に準じて実施されて良い。
本発明において利用されるベクターは、 使用する宿^胞の種類を勘案しなが ら、 ウィルス、 プラスミ ド、 コスミ ドベクターなどから適: til択することができ る。 例えば、 宿主細胞が大腸菌の場合はスファージ系のパクテリオファージ、 p BR、 pUC系のプラスミ ド、 枯草菌の場合は pUB系のプラスミ ド、 酵母の場 合は YEp、 YRp、 YCp系のプラスミ ドベクターが挙げられる。
このプラスミ ドは形質転換体の選択マーカーを含むのが好ましく、 選択マーカ 一としては薬剤耐性マ一カー、 栄 求マ一力一遗 を使用することができる。 その好ましい具体例としては、 使用する宿主細胞が細菌の場合は、 アンピシリン 耐性遗 、 カナマイシン耐性遗 fe^、 テトラサイクリン耐性遗 などであり、 酵母の場合は、 トリブトファン合成遺伝子 (TRP 1) 、 ゥラシル合成遺伝子 (URA3)、 ロイシン合成遗 (LEU2) などであり、 カビの場合には、 ハイグロマイシン耐性 ϋί^子 （Hy g)、 ビアラホス耐性遗 (B a r)、 硝 酸還元 遗 （n i aD) などが挙げられる。
さらに、 本発明による発現ベクターとしての DN A は、 S—フルクトフラ ノシダーゼ変異体をコードする遗伝子の発現に必要な DN A配列、 例えばプロモ 一ター、転写開始信号、 リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号 などの転写調節信号、 翻訳調節信号などを有しているのが好ましい。
プロモータ一としては、 挿入断片に含まれる宿主中において機能することがで きるプロモーターはもちろんのこと、 大腸菌においてはラクトースォペロン (1 a c) , 卜リブトフアンオペロン （t r p) などのプロモーター、 酵母では アルコールデヒドロゲナーゼ遗伝子 （ADH)、 酸性フォスファターゼ （PHO) 、 ガラクトース遗^ (GAL) 、 グリセロアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナー ゼ遼^ (GAP) などのプロモーター、 カビでは α—アミラーゼ遠伝子 (am y ) 、 ダルコアミラーゼ遺伝子 （g 1 a ) 、 セロピオハイドロラーゼ遗伝子 ( C B H I )、 —フルクトフラノシダーゼ遗伝子などのプロモーターが好ましく用 いることができるものとして挙げられる。
また、 宿主細胞が枯草菌、 酵母、 カビの場合には、 分泌型ベクターを使用して、 菌体外に 一フルクトフラノシダ一ゼ変異体を分泌生産させることも有利である。 宿主細胞としては、 宿主一ベクター系が確立されているものであれば何でも利 用可能であるが、 好ましくは酵母、 カビなどが挙げられる。 また、 ショ糖資化 性がない宿主は、 発現させた /9一フルクトフラノシダーゼ変異体以外にショ糖を 基質とする が存在しないため、 ^一フルクトフラノシダ一ゼ変異体を精製す ることなく、 粗！^の状態でフラクトオリゴ糖の製造に利用できるため、 その利 用は特に好まい、0 よって、 本発明の好ましい態様によれば、 宿主細胞として、 前記本発明の第三の態様による糸状菌を用いることができる。 またさらに、 ショ 糖資化性がない宿主としてはトリコデルマ属に厲する^の菌株ゃある種の酵母
(Oda, Y, and Ouchi, K. , Appl. Environ. Microbiol. , 55, 1742-1747, 1989) を利用することができる。 本発明の第四の態様による 3—フルクトフラノシダーゼ変異体を用いたフラク トオリゴ糖の製造
更に本発明によれば、 —フルクトフラノシダ一ゼ変異体を用いたフラク トオリ =f||の製造法が提供される。 このフラクトオリゴ糖の製造法は、 前記の β -フルクトフラノシダーゼ変異体 能を有する宿主細胞または /9一フルク トフ ラノシダーゼ変異体と、 スクロースとを接触させることによって実施される。 この S—フルクトフラノシダーゼ変異体を用いたフラクトオリゴ糖の製造法は、 前記の本発明の第一の態様による 9—フルクトフラノシダーゼを用いてたフラク トオリゴ糖の製造法と実質的に同様の条件で実施することができる。 また、 その 精製も同様であってよい。 実 施 例
実施例 A
実施例 A 1 ： 一フルクトフラノシダーゼの精製と部分アミノ酸配列の決定 ァスペルギルス ·二ガー AC E— 2— 1 (ATC C 20611) の菌体からの β—フルク 卜フラノシダーゼの精製は、 Agric. Biol, Chem.. 53， 667-673 (198 9)記載の方法により行い、 電気泳動的に均一な標品を得た。
精製 をリシルエンドべプチダ一ゼ （^化学工業社） で分解し、 生じたぺプ チドを HPLC (ウォーターズ社） で分取した。 カラムは TSKg e 1 ODS
120T (東ソ一社） を用い分取した各ペプチドのアミノ酸配列をプロテイン シーケンサー （島津製作所社） を用いて解析した。 そして、 4箇所のアミノ酸部 分配列を決定した。 した 4箇所のァミノ酸部分配列は配列表の配列番号 3〜 6に示されるとおりであつた。
—方、 リシルェンドぺプチダ一ゼで分解する前の酵素蛋白の Ν末端を同様にプ 口ティンシーケンサーを用いて解析した。 その配列は リ表の配列番号 7に示さ れるとおりであった。
実施例 A 2： PCR法による S—フルクトフラノシダーゼ遗 の部分 DN A 断片の取得
ァスペルギルス ·二ガー AC E— 2— 1 (ATCC 20611) を YPD培地 (1%酵母エキス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース） に植菌して培養した。 その後集菌し、 凍結！^した。 これを細かく粉砕した後、 TE緩衝液 （10mM
Tr i s—HC l (pH8. 0) ， 1 mM E D T A) を 8 m 1加え、 更に 10%SDSを含む TE緵衝液を 4m 1加え、 60°C、 30分間保温した。 その 後、 フエノール · クロ口ホルム ·イソアミルアルコール （25： 24： 1) を 12m 1加え激しく振とうした。 遠心後、 水層を別の容器に移し、 これに lml の 5 M酢酸カリウム溶液を加え、 氷中に 1時間以上放置した。 遠心後、 水層を別 の容器に移し、 2. 5容のエタノールを加え、 エタノール沈澱をした。 沈澱を乾 燥させた後、 5m 1の TE緩衝液に溶解し、 l OmgZml RNa s e A
(シグマ社） 溶液を 5ίί 1加え、 37°C、 1時間保温し、 更に 20mgZml proteinase (和光純薬社） 溶液を 50 n 1加え、 37 、 1時間保温した。 次 に、 3miの PEG溶液 （20%ポリエチレングリコール 6000、 2. 5M塩 化ナトリウム） を加え、 DN Aを沈港させた。 沈澱を 500 1の TE緩衝液に 溶解し、 フエノール ·クロ口ホルム ·イソアミルアルコール抽出を 2回行い、 ェ タノール沈濺をした。 沈«を 70%エタノールで洗浄後、 乾燥し、 適当量の TE 緩衝被に溶解し染色体 D N A試料とした。
PCRは Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを使用して行った。 すなわ ち、 上述のようにして調製した染色体 DN AO. 5β 1 (1/zg相当量） 、 10 倍濃度の反応緩衝液 [50 OmM KC K 10 OmM Tr i s— HC 1
(pH8. 3) 、 15mM Mg C 12 N 1% Tr i t onX - 100] 10 a K 2. 5mM dNTP溶液 8^ 1、 1 mMプライマ一 # 1として配列表 の配列番号 8の +鎖 DNAプライマ一及びプライマ一 # 2として配列表の配列番 号 9の一鎖 DNAプライマー各 1 ^ 1、 TaqDNAポリメラーゼ （和光纏社）
0. 5 1、 滅菌水 79;u 1を加えて 100 1とした。 反応は 94て、 5分間 の前処理後、 94 1分間 （^性ステップ） 、 54^2分間 （アニーリングステ ップ） 、 72て 3分間 （伸長ステップ） のインキュベーションを 25サイクル行 つた。 最後に 72 で 7分間のインキュベーションを行い反応を終了した。 得ら れた反応液をフエノール ·クロ口ホルム ·イソアミルアルコールで抽出し、 その 後エタノール沈 «を行った。 この沈教を 20 1の TE緩衝液に溶解した後、 ァ ガロースゲル鴛気^ ¾を行い、 特異的に增幅された約 800 b pのバンドを常法 に従って切り出して DNA断片を回収し、 エタノール沈 «を行つた。
DNA沈澱を 8 // 1の滅菌水に溶解し、 DN Aブランティングキット （宝酒造 社） を用いて末端を平滑化した。 さらに、 T4DNAキナーゼ （日本ジーン社） を利用して 5' 末端をリン酸ィ匕した後、 pUC 119の Sma I部位にクロー二 ングした。 このプラスミ ドの挿入断片についてフアルマシア社製蛍光シークェン サー ALF r ed DNAシークェンサ一を用いて塩基配列を決定した。 この結 果、 決定された P CRフラグメン卜の塩基配列は配列表の配列番号 10に示され る通りであった。 この P CRフラグメントの全長は 788 b pであったが、 この D N A断片がコードするアミノ酸配列のうち 5' 側から 14ァミノ酸が配列表の 配列番号 3の？〜 20番目のアミノ酸に、 5' 側から 176〜195番目のアミ ノ酸が配列表の配列番号 4の 1〜20番目のアミノ酸に、 また 3' 側から 10ァ ミノ酸が配列表の配列番号 5の 1~10番目のァミノ酸に相当し、 精製; 9一フル ク卜フラノシダ一ゼから決定したアミノ酸配列に一致した。
実施例 A 3： /9一フルクトフラノシダーゼをコードする完全長 DNA断片を含 むクローンのスクリ一二ング
上記 ¾ί¾例 A 2で調製した染色体 D N A標品約 lOi gを制限 c oR I で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 Molecular Cloning
(Cold Spring Harbour、 1982年） に記載の方法に従い、 Hybond— N +メンブレン （アマシャム社） にブロッテイ ングした。
このメンブレンと、 上記実施例 A 2で作成した 788 b pの PCR断片を用い、 ECLダイレク ト DNAZRNAラベリング ·検出システム （アマシャム社） を ^してサザン解析を行った。 その結果、 約 15 kbpの位置にプローブとハイ ブリダィズする D N A断片が存在することが明らかとなつた。
そこで前出の染色体 DNA標品約 20 gを制限 S^E c oR Iで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 Molecular Cloning (前掲） に記載の方法に従 い、 15 k b p付近の DNA断片を分離、 回収した。
こうして回収した約 15 kb pの DNA断片約 0. 5 gと、 あらかじめ制限 S^H i n d IIIと E c oR Iで二重消化しておいた; I D A S H II 1 gをラ ィゲーシヨンし、 ストラタジーン社製の in vitroパッケ一ジングキット G I G A PACK II Go 1 dを用いてパッケージングし、 大腸菌 XL 1— B 1 u e M RA (P2) に感染させることによりライブラリーを作成した。
前出の 788 b pの PC R断片をプローブとして用い、 ECLダイレクト DN AZRNAラベリング ·検出システム （アマシャム社） を使用してプラークハイ ブリダィゼ一シヨンを行い、 15， 000個のプラークの中から 25個の Httク ローンを得た。 このうち 3個の陽性クローンについて 2次スクリ一二ングを実施 し、 陽性クローンを純ィ匕した後、 ファージ DNAを調製し、 制限 S¾による解析 を行った。 その結果、 どのクローンも同一の約 15 k bpの E c oR I断片を有 することが明らかとなった。
この約 15kb pの E c oR I断片より必要な D N A領域を適宜制限酵素で小 断片化した後にプラスミ ドベクター pUC 118あるいは pUC 119にサブク ローニングを行った。 得られたサブクローンからプラスミ ド DN Aを常法により 調製し、 前記実施例 A 2と同様にしてフアルマシァ社製蛍光シークェンサ一 AL F r e d DN Aシークェンサ一を用いて 配列を決定した。 この結果、 配列 表の配列番号 2に示されるような ¾S配列が得られた。 実施例 A 4 ： トリコデルマ ·ビリデ （Trichoderma viride) による /9一フルク 卜フラノシダーゼ遺 の発現
¾lίg例A3で翻製したファージDNAょりiS-フルクトフラノシダーゼをコ一 ドする遗 fe^を含む約 5. 5 k b pの H i n d III— Xh o I断片を調製し、 こ れをプラスミ ドベクター pUC 119の H i nd III一 S a 1 I部位に連結し、 プラスミ ド p AW20を得た。
—方、 プラスミ ド pDH25 (D. Cullen et aし (1987 ) Gene, 57, 21-26) を E c oR Iで部分消化し、 Xb a Iリンカーを連結した後、 さらに Xb a Iで 消化し、 ァスペルギルス ·二ドランス （Aspergillus nidulans) 由来の t r p C 遺伝子のプロモーター、 ターミネータ一と大腸菌由来のハイグロマイシン Bリン 酸化酵素遺^で構成されるハイグロマイシン耐性遗 fe?発現カセットを 3 k b pの Xba I断片として調製した。 この断片をプラスミ ド pAW20の Xba I 部位に ¾ してプラスミ ド P AW20— Hy gを構築した （図 1)。
トリコデルマ ·ビリデをシード培地 （3%グルコース、 0. 1%ポリペプトン、 1%酵母エキス、 0. 14%硫酸アンモニゥム、 0. 2%リン酸二水素カリウム、 0. 03% マグネシウム） で、 28 、 20時間培養し、 菌糸体を 3000 r.p.m.、 10分間の遠心分雠により集菌し、 0. 5 Mショ糖溶液で 2回洗浄した。 上述のようにして得た菌糸体を、 セルラーゼオノズカ R— 10 (生化学工業社） 5mgZml、 ノボザィム 234 (ノボノルディスク社） 5mg/mlを含む 0. 5Mショ糖溶液に懸濁し、 30°C、 1時間ゆっくり振とうしてプロトプラス 卜を形成させた。 據過により菌体残渣を除去し、 2500r.p,m.、 10分間遠心 してプロトプラストを集めた。 プロトプラストは SUTC緩衝液 （0. 5Mショ 糖、 1 OmMトリスー塩酸 （pH7. 5) 、 1 OmM塩化カルシウム） で 2回洗 浄し、 最終的に 107個ノ mlとなるように同緩衝液に懸濁した。
プロトプラスト懸溺液 10 Οίί 1に対し、 プラスミ ド pAW20—Hy gを 1 mg m 1の濃度になるように TE緩衝液に溶解しておいた DN A溶液 10 1 を加え、 氷冷下、 5分間放置した。 その後、 PEG溶液 （60%ポリエチレング リコール 4000、 1 OmMトリスー塩酸 （pH 7. 5) 、 1 OmM塩ィ匕カルシ ゥム） を 400 ^ 1加え、 更に氷冷下 20分間放置した。 次に、 SUTC緩衝液 でプロトプラストを洗浄した後、 ハイグロマイシン B 100 /m 1及び 0. 5Mショ糖を含むポテトデキストロース寒天培地 （ディフコ） に 0. 5Mシ ョ糖を含むポテトデキストロ一ス钦寒天培地とともに重層し、 28°C、 5日間培 養し、 現れたコロニーを形 ®fe換体とした。
取得した形質転換体と親株を上記シード培地で、 28 、 4日間培養した後、 培養上清の —フルクトフラノシダーゼ活性を Agri Biol. Chem. , 53, 667-673 (1989)記載の方法で測定した結果、 親株には活性が検出されなかったが、 形質 転換体には 1 X 102単位 Zm 1の活性が検出された。 実施例 B
実施例 B 1 ： ^一フルクトフラノシダーゼ 菌の染色体 DN Aに対するサザ ン解析
(1) プローブ用 DNA断片の調製
配列表の配列番号 2の ¾S配列よりなる D N Aを含むブラスミ ド p A W 20— Hy gを祷型 DN Aとして PC Rによりプローブとして使用する DN A断片を調 製した。 P CRは Perldn Elmer Cetus DNA Thermal Cycler を使用して行った。 すなわち、 プラスミ ド DNA (p AW2 O-Hy g) 0. 5 β 1 (0. 1 g相 当量） 、 10倍濃度の反応緩衝液 [50 OmM KC l、 100mM T r i s -HC 1 (pH8. 3) 、 15mM MgCし、 1% T r i t onX- 100] 10 U 2. 5mM dNTP溶液 8 i l、 0. O lmMプライマー #1として配列表の i^ij番号 15の +鎖 DNAプライマ一およびプライマー #2 として配列表の配列番号 16の一鎖 DN Aプライマー各 2 1、 Ta qDNAポ リメラーゼ （和 0. 5 μ 1、 滅菌水 77 1を加えて 100 ;t 1とし た。 反応は 94 、 5分間の前処理後、 94 1分間 性ステップ） 、 54。C 2分間 （アニーリングステップ） 、 72°C3分間 （伸長ステップ） のインキュべ ーシヨンを 25サイクル行った。 最後に、 Ί 2でで 7分間にィンキュベーシヨン を行い反応を終了した。 得られた反応液をフヱノール ·クロ口ホルム ·イソアミ ルアルコールで抽出し、 その後エタノール沈殿を行った。 この沈殿を 20〃 1の TE緩衝液に溶解した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 特異的に増幅された 約 2 k bpのバンドを常法に従って切り出して DNA断片を回収し、 エタノール ¾J¾を行った。 DNA沈殿を 0. n I 1の濃度になるように滅菌水に溶解 して試料とした。
(2) β—フルクトフラノシダーゼ^菌の染色体 DN Αの調製とサザン解 析
;3—フルクトフラノシダーゼ生産能を有する糸状菌株、 すなわちァスペルギル ス · ジャポニカス （Aspergillus japonicus ) I F O 4408株、 ァスペルギル ス ·アクレタス （Aspergillus aculeatus ) I F031348株、 ぺニシリウム •ロッケフォルチ （Penicil lium roqueforti) I AM7254株、 スコプラリォ プシス ·ブレビカウリス （Scopulariopsis brevicaulis) I F O 4843株、 I F05828株、 I F05841株、 I F 06588株、 I F031688株、 I F031915株、 スコブラリオプシス ·ブレビカウリス ·バラエティ ·グラ ブラ (Scopulariopsis brevicaulis var. glabra) I F07239株、 スコブラ リォプシス ·ロゼオラ （Scopulariopsis roseola) I F 07564株をそれぞれ YPD液体培地 （1%酵母エキス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース） 、 28 °C、 2日間培養した。 得られた菌体より上記 HiS例 A 2に記載の方法に準じて染 色体 DN Aを調製した。 ^色体 DNA標品約 10 gを制限 c o R Iで 消ィ匕した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 Molecular Cloning (前掲） に記 載の方法に従い、 Hyb ond-N+ メンブレン （アマシャム社） にブロッティ ングした。
このメンブレンと、 上記（1) で親製した約 2 k b pの DN A断片を用い、 E CLダイレクト DNA/ RNAラベリング '検出システム （アマシャム社） を使 用してサザン解析を行った。 その結果、 ァスペルギルス ·ジャポニカス
(Aspergillus japonicus ) I F 04408株では約 20 k b pの位置に、 ァス ペルギルス ·アクレタス （Aspergillus aculeatus ) I F 031348株では約 13 k b pの位置に、 ぺニシリウム · ロッケフォルチ （Penici Ilium roqueforti) I AM7254株では約 4 k b pの位置に、 スコブラリオプシス ·ブレビカウリ ス （Scopulariopsis brevicaulis) I F04843株、 I F05828株、 I F 05841株、 I F06588株、 I F031688株、 I F031915株で は約 l Okbpの位置に、 スコブラリオプシス ·ブレビカウリス ·バラエティ · グラブラ （Scopulariopsis brevicaulis var. glabra) I F 07239株では約 2. 7 k b pの位置に、 スコブラリオプシス ·ロゼオラ （Scopulariopsis roseola) I F07564株では約 10 k b pの位置にそれぞれハイブリダイズ するバンドが検出された。 よって、 これらの ^一フルクトフラノシダーゼ^菌 から配列表の配列番号 2き2«の D N Aとの相同性を利用することによって9ーフ ルクトフラノシダーゼ遗 fe^を単離することカ《可能であることが示された。 実施例 B 2 ：ぺニシリウム · ロッケフォルチ （Penicillium roqueforti) I A M7254株の 一フルクトフラノシダーゼ遗 の単離
ぺニシリウム ' ロッケフォルチ （Penicil lium roqueforti) I A M 7254株 の染色体 DN A標品約 20 u gを制限酵素 E c oR Iで消化した後、 ァガロース ゲル電気泳勖を行い、 Molecular cloning (前掲） に記載の方法に従い、 4 k b p付近の DN A断片を分離、 回収した。
こうして回収した約 4 kb pの DNA断片約 0. 5 と、 あらかじめ制限酵 素 E c oR Iで消化し、 フォスファターゼ処理を施しておいた、 A g t l Oべク ター 1 をライゲーションし、 ストラタジーン社製の i n v i t r oパッケ 一ジングキット G I GAPACKIIGo 1 dを用いてパッケージングし、 菌 NM5 14株に感染させることによりライブラリーを作成した。
実施例 B 1で使用した約 2 k b pの DN A断片をプローブとして用い、 E C L ダイレクト DNAZRNAラベリング '検出システム （アマシャム社） を使用し てプラークハイプリダイゼーションを行い、 約 2 5 000個のプラークの中から 4個の陽性クローンを得た。 これらの陽性クローンについて 2次スクリーニング を実施し、 陽性クローンを純ィ匕した後、 ファージ DNAを調製し、 制限酵素によ る解析を行つた結果、 どのクローンも同一の約 4 k b pの E c oR I断片を有す る事が明らかとなった。
この約 4 k b pの E c oR I断片より必要な D N A領域を適宜制限^で小断 片ィ匕した後にプラスミ ドベクター pUC 1 1 8あるいは pUC 1 1 9にサブクロ 一二ングを行った。 得られたサブクローンからプラスミ ド DNAを常法により調 製し、 フアルマシア測蛍光シークェンサ一 ALF r e d DNAシークェンサ 一を用いて ¾S配列を決定した。 この結果、 15^表の Β^ϋ番号 12に示される塩 基配列が得られた。 また、 対応するアミノ酸配列は配列表の配列番号 1 1に示さ れる通りである。 実施例 Β 3 ：スコブラリオプシス 'プレビカウリス （Scopulariopsis brevicaulis) I F04843株の S—フルクトフラノシダ一ゼ遗 の単雠 スコプラリオプシス ·プレビカゥリス （Scopulariopsis brevicaulis) I F 0 4843株の染色体 DNA棟品約 20 gを制限酵素 E c o R Iで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 Molecular cloning (前掲） に記載の方法に従 い、 1 O k b p付近の DNA断片を分離、 回収した。
こうして回収した約 1 O k b pのDNA断片約0. 5 と、 あらかじめ制限 i n dill と E c oR Iで二重消化しておいた λ D A S ΗΠベクタ一 1 // gをライゲーションし、 ストラタジーン ¾S¾の i n V i t r。パッケージング キット GI GAPACKII Go 1 dを用いてパッケージングし、 ^菌 XL I -B l ue MR A (P 2)株に感染させる事によりライブラリーを作成した。 実施例 B 1で使用した約 2 kb pの DN A断片をプローブとして用い、 ECL ダイレクト DNAZRN Aラベリング '検出システム （アマシャム社） を使用し てプラークハイブリダィゼ一ションを行い、 約 15000個のプラークの中から 3個の陽性クローンを得た。 これらの陽性クローンについて 2次スクリーニング を実施し、 iS¾クローンを純化した後、 ファージ DN Aを調製し、 制限酵素によ る解析を行った結果、 どのクローンも同一の約 1 Okbpの E coRI断片を有 する事が明らかとなった。
この約 l Okbpの EcoRI断片より必要な D N A領域を適宜制限酵素で小 断片化した後にプラスミ ドベクター pUC 118あるいは pUC 119にサブク ローニングを行った。 得られたサブクローンからプラスミ ド DNAを常法により 調製し、 フアルマシア社製蛍光シークェンサ一 ALF r e d DNAシークェン サーを用いて塩基配列を決定した。 この結果、 配列表の配列番号 14に示される 配列が得られた。 また、 対応するアミノ酸配列は配列表の配列番号 13に示 される通りである。 実施例 B 4： トリコデルマ ·ビリデ （Trichoderma viride) によるぺニシリゥ ム .ロッケフォルチ （Penici Ilium roqueforti) I AM7254株由来の β—つ ルク トフラノシダーゼ遗 の発現
H½例 B2で調製したファージ DNAより/ S—フルク トフラノシダーゼをコ一 ドする遗&?を含む約 4 kbpの Ec oRI断片を調製し、 これをプラスミ ドべ クタ一 PUC118の EcoR I部位に ¾ί¾し、 プラスミ ド pPRSO 1を得た。 一方、 プラスミ ド pDH25 (D. Cullen et al., (1987) Gene, 57, 21— 26) を E c oR Iで部分消化し、 Xba Iリンカ一を連結した後、 さらに Xba Iで 消化し、 ァスペルギルス ·二ドランス （Aspergillus nidulans) 由来の t r p C 遗伝子のプロモータ一、 ターミネーターと大腸菌由来のハイグロマイシン Bリン 酸化酵素遗& ^で構成されるハイグロマイシン耐性遗 fe^発現カセッ卜を 3 k b pの Xb a I断片として調製した。 この断片をプラスミ ド p PR S O lの Xb a I部位に連結してプラスミ ド p PRS 01— Hy gを構築した （図 2) 。
トリコデルマ ·ビリデをシード培地 （3%グルコース、 0. 1%ポリペプトン、 1%酵母エキス、 0. 14%硫酸アンモニゥム、 0. 2%リン酸二水素カリウム、 0. 03%硫酸マグネシウム） で、 28^、 20時間培養し、 菌糸体を 3000 r.p.m.、 1 0分間の遠心分離により集菌し、 0. 5 Mショ糖溶液で 2回洗浄した。 上述のようにして得た菌糸体を、 セルラーゼオノズカ R— 1 0 (ヤクルト社） 5mgZml、 ノボザィム 234 (ノボノルディスク社） 5mgZm lを含む 0. 5Mショ糖溶液に懸濁し、 30^、 1時間ゆっくり振とうしてプロトプラス トを形成させた。 «過により菌体残渣を除去し、 2500r.p.m.、 1 0分間遠心 してプロトプラストを集めた。 プロ卜プラストは SUTC緩衝液 （0. 5Mショ 糖、 1 OmMトリスー塩酸 （pH7. 5) 、 1 OmM塩化カルシウム） で 2回洗 浄し、 最終的に 1 07個 Zm 1となるように同緩衝液に懸濁した。
プロトプラスト懸滴液 1 00 βΐ に対し、 プラスミ ド p PRS O l— Hy gを lmg/m 1の濃度になるように TE緩衝液に溶解しておいた DN A溶液 10 ΐ を加え、 氷冷下、 5分間放 Sした。 その後、 PEG溶液（60%ポリエチレ ングリコール 4 000、 1 OmMトリスー塩酸 （pH 7. 5) 、 1 OmM塩化力 ルシゥム） を 400 / 1 加え、 更に氷冷下 20分間放置した。 次に、 SUTC緩 衝液でプロトプラストを洗浄した後、 ハイグロマイシン B 100 ig /m 1およ び 0. 5Mショ糖を含むポテトデキストロース寒天培地 （ディフコ社） に 0. 5 Mショ糖を含むポテトデキストロース钦寒天培地とともに SJiし、 28て、 5日 間培養し、 現れたコロニーを形質転換体とした。 取得した形質転換体と親株とを上記シード培地で、 28°C、 4日間培養した後、 培養上清の β一フルクトフラノシダーゼ活性を測定した。 β—フルクトフラノシ ダーゼ活性は、 10重量％ショ糖溶液、 ρΗ5. 5、 40°Cの条件で反応させた 時、 1分間に 1 /zmo 1のグルコースを ϋ¾ϊさせる活性を 1単位とした。 その結 果、 親株には活性が検出されなかった力、 形 換体には約 0. 04単位/ m l の活性が検出された。
このようにして調製した/ S—フルクトフラノシダーゼをショ糖 1 gあたり 4. 2単位添加し、 60fifi%ショ糖溶液、 H7. 0、 40ての条件で 23時間反 応させた。 反応後の糖 *§β¾はフルクトースが 1. 6%、 グルコースが 16. 2%、 ショ糖が 42. 3%、 GF2が 37. 3%、 GF 3が 2. 1%であった。
H½例 C
難例 C 1 ： ァスペルギルス '二ガー AC E— 2— 1株からの n i a D変^ の取得
ァスペルギルス ·二ガー ACE— 2— 1 (ATCC20611) 株の胞子を、 6%の塩素酸塩を含む最少寒天培地 （0. 2%グルタミ ン酸ナトリウム、 0. 1 %リン Κτ素二カリウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 05%塩化力リウ ム、 0. 001%硫赚、 3%ショ糖、 0. 5%寒天、 ρΗ5. 5) に塗布し、 30 にて保温した。 約 5日間培養した後、 コロニーを形成したものを塩素酸耐 性株とした。 これら耐性株をグルタミン酸塩、 硝酸塩、 または亜確酸塩をそれぞ m—の窒素源として含む最少培地に植菌し、 窒素源要求性の検討を行った。 そ の結果、 グルタミン酸ナトリウム、 亜硝酸塩を単一の窒素源として含む最少培地 では生育できるが、 硝酸塩では生育できない塩素酸耐性株力、'存在し、 これらを n i aD変 ¾» とした。
n i a D変^ M^iの内の 3株について菌体内の二トレートレダクターゼ （硝 酸還元 i aD遗 fe?産物） 活性の測定を行った。 これら 3株を液^地 (0. 2%グルタミン酸ナトリウム、 0. 1%リン酸水素二カリウム、 0. 05 %硫酸マグネシウム、 0. 05%塩ィ匕カリウム、 0. 001%硫酸鉄、 3%ショ 糖 3g) 中で、 30 、 60時間振とう培養した。 得られた湿菌体 0. 2 gを 2 m 1の 5 OmMリン酸ナトリウムバッファー （pH7. 5) に懇灞し、 ホモジナ ィズ '超音波により破砕し、 不溶画分を遠心によって除き、 得られた上清をサン プルとした。 サンプル液 50 1に対し蒸留水 1000 1、 0. 2Mリン酸ナ トリウム溶液 （PH7. 5) 750 K 0. 04mg/m 1 F AD 100 / 2mg/m 1 NADPH100 ^ 1 および 22. SmgZm 1硝酸ナトリウム 1000 // 1を加え、 37。Cで反応させた。 反応させたサンプルに対し、 1%ス ルファニルアミ ド （3 N塩酸にて溶解） 500 μ K 0. 02%Ν— 1一ナフチ ルエチレンジアミン 500 1を加えて発色させ、 A540を測定することによ りニトレートレダクターゼ活性の検出を試みたが、 これら 3株には二トレートレ ダクターゼ活性は検出されなかった。 そこで、 これら 3株を n i aD変 と結 論し、 この内の 1株を N I A5292株と命名し、 以下の実験に供した。 実施例 C2：ァスペルギルス ·二ガー NRRL 4337株の n i a D遺伝子 の取得
(1) プローブのお
ァスペルギルス ·二ガー NRRL 4337株を YPD液体培地 （1%酵母ェキ ス、 2%ポリペプトン、 2%グルコース） で培養した。—方、 Unkles, S. E.. et al.， Gene 111, 149-155 (1992)に記載のァスペルギルス ·二ガーの n i a D遗 の ¾S配列をもとに配列表の配列番号 17および 18の合成 D N Aブラ ィマーを作製した。 得られた前記菌体より H½例 A 2に記載の方法に準じて抽出 した全 DN Aを祷型にし、前記合成プライマーを用いて PCR法による DNAの 增幅を行った。 反応液 100 1あたり染色体 DN AO. 5 g、 プライマー各 100 pmo 1、 および Ta Q DN Aポリメラーゼ 2. 5U (二ツボンジーン社） を含み、 94°C1分間、 50 2分間、 72°C2分間の温度条件で 25サイクル 反応させた。 その結果、約 800 bpの DN A断片が特異的に増幅された。 この DNA断片の塩基配列を決定をしたところ、 既に報告されているァスペルギルス •二ガーの n i a D遗^?の塩基配列と 100%—致し、 この DNA断片が n i a D遗 ίέΐに由来することが明らかとなった。 そこでこの約 800 b ρの DNA 断片をプローブとして用いることとした。
(2) ァスペルギルス ·二ガーの染色体 DN Aのサザン解析
ァスペルギルス ·二ガー NRRL 4337株の全 DN Aを制限酵素 (H i nd III、 EcoRI、 B amH I) で完全消化した後、 ァガロースゲル電気泳動に より分画し、 モレキュラー ·クローニング （Cold Spring Harbour、 1982年） に記 載の方法に従つて ナイロン膜 （Hybond-N十、 アマシャム社） 上にプロッ トした。 このナイロン膜に対し、 前出の約 80 Obpの DNA断片をプローブにしてサザ ンハイブリダィゼーシヨンを行った。 なお、 プローブの標識 ·シグナルの検出に は、 アマシャム社の EC Lダイレクト DNAラベリング，検出システムを用い、 条件は添付のマニュアルに従った。 その結果 H i n d IIIで消化した際約 15 K b pの位置にシグナルが検出された。
(3) n i &0遺 の単離
ァスペルギルス ·二ガー NRRL 4337株の全 D N Aを制限酵素 H i n dll Iで完全消化した後、 ァガロースゲル電気^!により分画し、 15 Kb p付近の DNA断片を常法により抽出し、 回収した。 回収した DNA断片をス DASHII の H i ndlllサイトに¾¾し、 STRATAGEE社の GIGAPACK II Goldによりパッケ 一ジングを行い、 大腸菌に感染させることによりライブラリーを^した。
前出の約 800 b pの DN A断片をプローブとして用い、 アマシャム社の EC Lダイレクト DN Aラベリング ·検出システムを使用してプラークハイプリダイ ゼーシヨンを行い、 陽性クローンを得た。 得られた陽性クローンについて 2次ス クリーニングを実施し、 陽性クローンを純化した。
陽性クローンよりファージ DN Aを調製し、約 1 5 k b p H i n d III断片 が挿入されていることを確認した。 この挿入断片に対してサザン解析を行い、 n i a D遺伝子が含まれるより小さな DN A断片として、約 6. 5 k b pの Xb a I断片を見出し、 この断片の制限^ ^地図を ί«した。 さらにこの Xb a I断片 を適宜制限^で小断片化した後にプラスミ ド pUC 1 1 8にサブクローン化し、 これらのプラスミ ドを铸型にして 配列を決定し、 単離した DNA断片内にお ける n i a D遣^の位置を特定した （図 3) 。 実施例 C 3 ：遗 fe?ターゲッティング用プラスミ ド p AN203の構築
遗 ターゲッティング用プラスミ ド PAN203は以下のようにして PSiし た （図 4) 。
上言己 例 A 3において得られた、 jS—フルクトフラノシダーゼ遗伝子を含む 約 1 5 k b p E c oR I断片より、 iS-フルクトフラノシダーゼ遗 の開始 コドンおよび上流領域を含む約 3 k b p S a i l断片を調製し、 プラスミ ド p UC 1 1 9にサブクローン化してプラスミ ド pW20を得た。 このプラスミ ドょ り一本鑌 DNAを調製し、 配列表の配列番号 19の合成 DN Aを用いて、 アマシ ャ厶社の Sculptor in vitro mutagenesis systemにより部位特異的変異を行い、 —フルクトフラノシダーゼ遗^の開始コドンの直前に B amH Iの消化部位 を新たに作製した （pW2 0 B) 。
また、 ；9一フルクトフラノシダーゼ遗^を含む約 15 k b p E c oR I断 片より、 3—フルクトフラノシダーゼ遗 ^の終止コドンおよび下流領域を含む 約 1. 5 k b p P s t I断片を調製し、 プラスミ ド pUC 1 1 9にサブクロー ン化してプラスミ ド pBW20を得た。 このプラスミ ドより一本鎖 DN Aを調製 し、 配列表の配列番号 20の合成 DNAを用いて、 アマシャム社の Sculptor in vitro mutagenesis systemにより部位特異的変異を行 l<、、 S—フルクトフラノシ ダーゼ遺 の終止コドンの直後に B amH Iの消化部位を新たに ^した （p BW20 B)。 p BW20 Bより約 1. 5kbp P s t I断片を調製し、 例A4にぉぃて得られたpAW20の約l. 5k bp P s t I断片と入れ換え たプラスミ ド PAW20Bを構築した。
次に、 プラスミ ド pUC 118を制限 H i ndlllで切断し、 T 4 DN A ポリメラーゼ （宝酒造社） で末端を平滑化した後、 S a 1 Iリンカーを連結した。 制限酵素 Sa 1 Iで切断し、 再連結してプラスミ ド pUCl 8PHdを構築した。 pUC18PHdを Sa l Iおよび E c o R Iで消化した後、 pW20Bより調 製した約 2. 5Kbpの Sa 1 I一 B amH I断片、 さらに p AW20 Bより調 製した約 3Kb pの B amH I— E c oR I断片とを ¾gしてプラスミ ド p AN 202を構築した。 さらに、 PAN202を Xb a I部位に、 n i a D遗^を 含む約 6. 5kbp Xba I断片 （図 3) を挿入してプラスミ ド pAN203 を構築した。 実施例。 4：ァスペルギルス ·二ガー N I A5292株のプラスミ ド p AN2 03による形質転換
ァスペルギルス ·ニガ一 N I A 5292株を液体培地 （2%可溶性激粉、 1% ポリペプトン、 0. 2%酵母エキス、 0. 5%リン酸二水素ナトリウム、
0. 05%硫酸マグネシウム） 中で、 28て、 24時間振とう培養した。 菌体を ガラスフィルターで集菌し、 液（lmgZm 1 3—グルクロニダーゼ （シ グマ社） 、 5 m gZm 1ノボザィム （ノボ ·ノルディスク社） 、 10 mMリン酸 ナトリウム （pH5. 8)、 0. 8M塩化カリウム） に懸濁して、 30てで穏ゃ かに 1. 5時間加温した。 プロトプラスト化した細胞をガラスフィルターでろ過 し、 通過画分を遠心により集菌して STCバッファ一 （10mMトリス （pH 7. 5) 、 10mM塩化カルシウム、 1. 2Mソルビトール） で 2回洗浄した後、 STCバッファーに懸衝した。 铳いてプロトプラストと予め制限 ¾¾H i nd IIIで消化したプラスミ ド p AN203を混合して、氷上に 20分間静置した後、 さらに PEG液 (1 OmMトリス （pH7. 5)、 1 OmM塩ィ匕カルシウム、 6 0%ポリエチレングリコール 6000) を加えて氷上にもう 20分間静置し、 D NAをプロトプラスト内に導入した。 プロトプラストは STCバッファ一にて数 回洗浄した後、 1. 2Mソルビトールと 0. 8%ァガーを含むッァペック培地 (0. 2%硝酸ナトリウム、 0. 1%リン酸水素二カリウム、 0. 05%碰マ グネシゥム、 0. 05%塩化カリウム、 0. 001%¾»第二鉄、 3%ショ糖） に懸濁し、 1. 2M ソルビトールと 1. 5%ァガーを含むッァペック寒天培地 に重層して、 30 で培養した。 約 5日間培養した後、 コロニーを形成したもの を形質転換体として選択した。 これら形 Kfe換体を液 養し、 その菌体より全 DN Aを調製した。 これらの全 DNAに対してサザン解析を行い、 プラスミ ド p AN203が宿主の jS -フルクトフラノシダーゼ遗伝子の上流領域に 1コピーの み相同組換えにより挿入されたような形 Κίδ換体を選抜した。
次に、 この形質転換体の分生子を 6%の塩素酸カリウムを含み、 2%のダルコ ースを単一の炭素源とするような最少寒天培地 （0. 2%グルタミン酸ナトリウ ム、 0. 1%リン酸水素二カリウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 05% 塩化カリウム、 0. 001%硫酸鉄、 2%グルコース、 6%塩素酸カリウム、 1. 5%寒天、 ρΗ5. 5) に塗布して 30てで培養した。 約 4曰で、 再び n i a D変異の表現型を示すようになり塩素酸塩に耐性を示すようになつた耐性株が 多数出現した。 これらの塩素酸耐性株について /3—フルクトフラノシダーゼ活性 の有無を検討した結果、 約半数の塩素酸耐性株においては、 9一フルクトフラノ シダーゼ活性力検出されず、 宿主の )3—フルクトフラノシダーゼ遗 の下流領 域で再び相同組換えが起こり、 n i a D遗&?を含むベクターと共に8—フルク トフラノシダーゼ遗 が欠落したことが示唆された。 これらの塩素酸耐性株よ り全 DNAを調製し、 これらの全 DN Aに対してサザン解析を行った結果、 n i a D遗&?を含むベクターと共に )3—フルクトフラノシダーゼ遗^が染色体上 から欠落したことが確認され、 その内の 1株を N I A 1602と命名した。
実施例 C5：ァスペルギルス ·二ガー N I A1602株を宿主としたべニシリ ゥム ·ロッケフォルティ由来の 一フルクトフラノシダーゼの^
ぺニシリゥム ·ロッケフォルティ由来の 一フルクトフラノシダーゼ遠^の 発現用プラスミ ドである p AN572は以下のようにして PSSiした （図 5)。
まず、 プラスミ ド pUCl 8を制限 » H i ndlllで切断し、 T4DNAポ リメラーゼ （宝酒造社） で末端を平滑化した後再連結した。 さらに制限 B a mHIで切断し、 T 4 DN Aポリメラーゼで末端を平滑化した後連結し、 プラス ミ ド p UC 18HBXを構築した。 このプラスミ ド pUC18HBXの P s t l 部位に、 プラスミ ド pAN202より調製した3—フルクトフラノシダーゼ遗伝 子のプロモーターとターミネータ一を含む約 2Kb pの P s t I断片を挿入して プラスミ ド PAN204を作製した。
次に、 n i aD遗 fe^をより小さな DNA断片として取り扱えるようにし、 さ らに B a mH I消化部位を破壊するため、 配列表の配列番号 21および 22の合 成 DN Aをプライマーとし、 アマシャム社の Sculptor in vitro mutagenesis systemを使用して部位特異的変異を行い、 B a mH I消化部位を破壊すると共に、 n i a D遗 の下流に新たに X b a I消化部位を作製して、 B a mH I消化部 位を含まない約 4. 8 k bp Xb a I断片として n i aD遗 fe^を調製できる ようにした。 この 4. 8Kbpの Xba I断片をプラスミ ド pAN204の Xb a I部位に挿入してプラスミ ド pAN205を した。 一方、 ぺニシリゥム ·ロッケフォルティ由来の) S-フルクトフラノシダーゼ遗 こついては、 実施例 Β 4において得られた、 この遣^を含むプラスミ ド ρ PRS 01より調製した一本鎮 DNAを鋅型として、 配列表の配列番号 23の合 成 DN Αをフライマーとし、 アマシャム社の Sculptor in vitro mutagenesis sy stemを使用して部位特異的変異を行い、 ；9一フルクトフラノシダーゼ遗 の翻 訳領域内に存在する B amH I部位を、 コードしているアミノ酸配列に変化がな いような形で破壌した （pPRS02)。 さらに、 プラスミ ド p PR S 02を錚 型として、 配列表の配列番号 24および 25の合成 DN Aをプライマーとして P CRを行い、 ；9—フルクトフラノシダーゼ遗 feiの翻訳領域を約 1. 8 k bpの B amH I断片を調製し、 これをプラスミ ド p A N 205の B a mH I I部位に 挿入してプラスミ ド p AN572を作製した。
予め H i n dillで消化して線状にしたプラスミ ド pAN 572を用いて、 実 施例 C 4に記載の方法に従ってァスペルギルス ·二ガー N I A 1602株を形質 転換した。 得られた形質転換体の内 1株を液^地 （5. 0%ショ糖、 0. 7% 麦芽エキス、 1. 0%ポリペプトン、 0. 5%カルボキシメチルセルロース、 0. 3%塩化ナトリウム） で、 28て、 3日間培養した。 得られた菌体を回収し て、 超音波により破砕した後、 yS—フルクトフラノシダーゼ活性を測定した。 β 一フルクトフラノシダーゼ活性は、 10Sfi%%ショ糖溶液、 PH 5. 5、 40 の条件で反応させた時、 1分間に l^mo 1のグルコースを iS«lさせる活 性を 1単位とした。 その結果、 1 X 1 ( 3単位 Zm 1の活性が検出された。 実施例。
以下、 3—フルクトフラノシダーゼ変異体の記載にあたって、 次の命名を用い て参照を容易にする：
原アミノ酸：位置：置換アミノ酸 この命名に従い、 例えば 170番目のフヱニルァラニンをトリブトフアンに置 換したものは、 F 170Wとして示される。
また、 多数の変異は、 +によって分離され、 例えば
F 170W+G 300 V + H 313K
は、 170、 300、 および 313番目のアミノ酸であるフエ二ルァラニン、 グ リシン、 およびヒスチジンが、 それぞれトリブトファン、 バリン、 およびリジン に置換されていることを示す。
また、 以下において、 フルクトースを F、 グルコースを G、 およびショ糖を G
F、 ならびにショ糖にフラクトースが 1〜3 ^F結合したオリゴ糖類を、 それぞ れを GF2、 GF 3> および GF 4と略記する。 錢例 D1 ： F 170W変異体の作製と生産
(1) 部位特異的変異による 5-フルクトフラノシダーゼ遗 &ίの塩基 S換 ァスペルギルス ·ニガ一 ACE— 2— 1 (ATCC20611) 株の/ S—フル クトフラノシダーゼ遗 を含むプラスミ ド pAW20-Hy g ( ½例 4参 照） を^ DNAとして PCRを行い、 /3—フルクトフラノシダーゼ遗 の翻 訳領域を取り出した。 PCRは Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを使用 して行った。 反応液は、 プラスミ ド DNA (pAW20— Hy g) 0. 5 1 (0. l g相当量） 、 10倍濃度の反応緩衝液 [ 500 mM KC 1、 100 mM Tr i s— HC 1 (pH8. 3) 、 15mM MgC 12、 1% Tr i t onX-100] 10^ 1、 2. 5mM dNTP溶液 8;z l、 0. 01 mM プライマー # 1として配列表の配列番号 26の +鎖 DNAプライマーおよびブラ イマ一 #2として配列表の配列番号 27の一鎖 DN Aプライマー各 2/ 1、 Ta qDNAポリメラーゼ （和光純薬） 0. 5χί 1、 滅菌水 1を加えて 100 1とした。反応は、 94°C、 5分間の前処理後、 94 1分間 性ステップ） 、 54°C2分間 （アニーリングステップ） 、 72°C3分間 （伸長ステップ） のィ ンキュベーションを 25サイクル行った。 最後に 72。Cで 7分間のィンキュベー ションを行い反応を終了した。 得られた反応液をフヱノール ·クロ口ホルム ·ィ ソァミルアルコールで抽出し、 その後エタノール沈殿を行った。 沈殿を 20 β 1 の ΤΕ緩衝液に溶解した後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 特異的に増幅され た約 2 k b ρのバンドを常法に従つて切り出して DN A断片を回収した。 この D N A断片を制限酵素 B a mHIで消化した後、 プラスミ ド pUC118 (宝酒造） の B amH I部位に挿入してプラスミ ド pANl 20を得た （図 6)。
プラスミ ドを大腸菌 C J 236株に導入した後、 常法に従い一本鎖 DN Aを調 製し、 これを铸型 DN Aとして部位特異的変異を行った。 部位特異的変異は Muta -Gene in vitroミユータジエネシスキット （日本バイオ ·ラッドラボラトリーズ） を用いて行った。 部位特異的変異用プライマーとして、配列表の配列番号 28の DN Aプライマーを用い、 キットの説明書に従って実施し、 変異処理後プラスミ ドとして PAN120 (F 170W) を得た。
p AN 120 (F 170W) の挿入断片の: ^配列を調べたところ、 目的の部 分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないこと力¾ ^できた。 すなわち、 変 MM理後の遗 ^は 170番目のアミノ酸だけがフエ二ルァラニン からトリブトフアンに置換された^一フルク卜フラノシダーゼをコ一ドしている ことが明らかとなった。
(2)酵母用発現ベクター pY2831の構築
酵母用発現ベクター ρΥ2831は以下のようにして構築した （図 7) 。 すな わち、 プラスミ ド p YPR2831 (H. Horiuchi et al., Agric. Biol. Chem. , 54, 1771-1779. 1990) を制限 ¾¾E c o R Iおよび S a 1 Iで消化した後、 末 端を T 4 DN Aポリメラーゼを用いて平滑化した。 これに B amH Iリンカ一 (5' 一 CGGATCCG— 3' ) を連結し、 B a mH Iで消化した後、 自 B¾ 結してプラスミ ド p Y2831を得た。
(3)酵母による F 170W変異体の
PAN120 (F170W) を BamHIで消化し、 変異遺伝子を含む 2 k b pの BamHI DNA断片を取り出した。 これを p Y 2831の B a mH I部 位に挿入してプラスミ ド pYSUC (F 170W) を構築した （図 8)。 この際、 p AN 120についても同様の処理を行い、 野^ S^!を発現させるためのブラ スミ ド pY SUCも構築した。
これらのプラスミ ドを酵母サッカロミセス ·セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) MS— 161株 （Sue-, ura3, trpl) に群酸リチウム法 (Ito, H. et al.. J. Bacteriol.. 153, 163-168. 1983) で導入し、 形質転換体を得た。 この形 Sfe換体を SD— U r a培地 （0. 67 %酵母ニトロゲンベース （ディフ コ社） 、 2%グルコース、 50 gZmlゥラシル） で、 30て、 一晚培養した。 この培養液を終濃度が 1%となるように 培地 （0. 67%酵母ニトロゲンべ ース （ディフコ社：） 、 2%グルコース、 2%カザミノ酸、 50 gZmlゥラシ ル） にシードし、 30 、 2日間培養し、 培養上清を得た。 これらの培養上清の S—フルクトフラノシダーゼ活性を Agric. Biol. Chem. , 53, 667-673 (1989)記 載の方法で測定した結果、 野^ を発現させた場合は 12. 7単位 Zm 1、 F 170W変異体を発現させた場合は 10. 1単位 Zm 1の活性がそれぞ 出 された。
(4) F 170W変異体の評価
野生型酵素および F 170W変異体につき、酵母の培養上清を用いて評価を行 つた。 反応条件は、 48重量％%ショ糖溶液、 40 T)、 pH7で行い、 反応後の «i«a成を HPLCにて分析した。 野^および変異体において、 1一ゲストース
(GF2)への変換率がそれぞれ^の時の糖組成 (%) は以下に示される通り であった。 F G GF GF 2 GF 3 GF 4
野牛^ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
F 17 OW 0.6 22.1 20.9 45.8 10.3 0.3
この結果から、 F 17 OWの置換によって GF 2が增加し、 GF 3が減少する ことが明らかとなった。 実施例 D2： G 300W変異体の作製と生産
(1)部位特異的変異による /3—フルクトフラノシダーゼ遗 の塩基 fi« 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 29の DNAプライマー を使用した以外は実施例 D1に記載した方法と同様の方法で行い、 プラスミド p A 120 (G 300W) を得た。
P AN120 (G300W) の挿入断片の^ S配列を調べたところ、 目的の部 分の塩基のみが ϋ換され、 それ以外の部分は変化していないことが ¾ できた。 すなわち、 変異処理後の遺伝子は 300番目のァミノ酸だけがグリシンからトリ ブトファンに置換された —フルクトフラノシダーゼをコードしていることが明 らかとなつた。
(2)酵母による G 300W変異体の
PAN120 (G300W) を BamHIで消化し、 変異 « を含む 2 k b pの BamHI DNA断片を取り出した。 これを p Y 2831の B a mH I部 位に挿入してプラスミ ド pY SUC (G30 OW) を構築した。
このプラスミ ドを、 実施例 D 1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS— 161株に 入し、 ^300 W変異体を^！させたところ、 培 ¾±淸に 5. 0単位/ m 1の) S—フルクトフラ ノシダーゼ活性が検出された。
(3) G 300W変異体の評価 野生型酵素および G 300W変異体につき、 酵母の培養上清を用いて評価を行 つた。 反応条件は、 48重量 ショ糖溶液、 40°C、 pH7で行い、 反応後の 糖組成を H PLCにて分析した。 野生型および変異体において、 1—ゲストース (GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 （％) は以下に示される通り であつた。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4 野^ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
G300W 0.6 21.9 21.7 46.4 9.4 0.0
この結果から、 G300Wの置換によって GF2力増加し、 GF3が滅少する ことが明らかとなった。 実施例 D3： H 313 K変異体の作製と生産
(1)部位特異的変異による^一フルクトフラノシダーゼ遗 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 30の DN Aプライマー を使用した は実施例 D1に記載した方法と同様の方法で行い、 プラスミ ド p AN120 (H313K) を得た。
P AN120 (H313K) の挿入断片の ¾S配列を調べたところ、 目的の部 分の のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないことが 、できた。 すなわち、 変異処理後の遗^は 313番目のァミノ酸だけがヒスチジンからリ ジンに置換された; 9一フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかと なった。
(2)酵母による H 313 K変異体の
P AN120 (H313K) を BamHIで消化し、 変異 i fe^を含む 2kb Pの BamHI DNA断片を取り出した。 これを p Y 2831の B a mH I部 位に挿入してプラスミ ド pYSUC (H313K) を構築した。 このプラスミ ドを、 実施例 D1記載の方法と同様にして、酵母サッカロミセス •セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 H 313 K変異体を させたところ、 培養上清に 5. 0単位 Zmlの —フルクトフラ ノシダーゼ活性が検出された。
(3) H313 K変異体の評価
野生型酵素および H313 K変異体につき、酵母の培養上清を用いて評価を行 つた。 反応条件は、 48重量 ショ糖溶液、 40。C、 pH7で行い、 反応後の 糖組成を H PLCにて分析した。 野^ および変異体において、 1一ゲストース
(GF 2)への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 (%) は以下に示される通り でめつた
F G GF GF 2 GF 3 GF 4 野 Φ型 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
H313K 0.4 21.9 18.8 52.9 6.0 0.0
この結果から、 H313Kの置換によって GF 2が増加し、 GF 3が減少する ことが明らかとなった。 実施例 D4： E386 K変異体の作製と生産
(1)部位特異的変異による jS—フルクトフラノシダーゼ遣 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 31の DNAプライマー を使用した は実施例 D1に記載した方法と同様の方法で行い、 プラスミ ド p AN 120 (E 386K) を得た。
PAN120 (E 386K) の挿入断片の ¾S配列を調べたところ、 目的の部 分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないこと力、' 、できた。 すなわち、 変位処理後の itfe^は 386番目のァミノ酸だけがグルタミン酸から リジンに置換された j8—フルクトフラノシダーゼをコードしていることが明らか となった。
(2)酵母による E 386 K変異体の^^
P AN120 (E 386K) を BamHIで消化し、 変異遠^?を含む 2 k b pの BamHI DNA断片を取り出した。 これを p Y 2831の B a mH I部 位に挿入してプラスミ ド pY SUC (E 386K) を構築した。
このプラスミ ドを、 ½例 D1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレヒシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS— 161株に導八し、 Ε 38り Κ変異体を させたところ、 培養上清に 10. 7単位 Zmlの 一フルク トフ ラノシダーゼ活性が検出された。
(3) E 386K変異体の評価
野生型酵素および E 386 K変異体につき、 酵母の培養上清を用いて評価を行 つた。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40て、 pH7で行い、反応後の糖 を HPLCにて分析した。 野^ および変異体において、 1一ゲストース
(GF2)への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 (%) は以下に示される通り であった。
F G GF GF2 GF 3 GF4
野^ ϋ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
Ε 386Κ 22.3 (F+G) 19.9 49.3 7.9 0.6
この結果から、 Ε 386Κの置換によって GF 2が增加し、 GF 3が滅少する ことが明らかとなった。 実施例 D5 ： F 170W+G 300W変異体の と
(1)部位特異的変異による 9一フルク トフラノシダーゼ遗 fe^の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 28および 29の DNA プライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行 、、 プ ラスミ ド pAN120 (F170W+G 300W) を得た。
P AN120 (F 170W+G 300W) の挿入断片の;^ g配列を調べたとこ ろ、 目的の部分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないことが 確認できた。 すなわち、 変位処理後の遗 は 170番目と 300番目のァミノ 酸だけがフエ二ルァラニンからトリブトファン、 グリシンからトリブトファンに それぞれ置換された3—フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らか となった。
(2)酵母による F 170W+G 300W変異体の^
p AN120 (F 170W+G 300W) を BamHIで消化し、 変異遺 fe? を含む 2 k b pの B amH I DN A断片を取り出した。 これを pY2831の B a mH I部位に挿入してプラスミ ド p YSUC (F 170W+G 300 W) を 構築した。
このプラスミ ドを、 実施例 D1記載の方法と同様にして、酵母サッカロミセス •セレビシ工 (Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 F 170 W+G 300W変異体を^させたところ、 培養上清に 2. 3単位 Zmlの /9一 フルクトフラノシダーゼ活性が検出された。
(3) F 170W+G300W変異体の評価
野^ 酵素および F 170W+G 300W変異体につき、酵母の培養上淸を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40°C、 pH7で行い、 反応後の糖 を H PLCにて分析した。 野^ 1および変異体において、 1—ケ ストース （GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 (%) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4
野^ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
F170I+G300W 0.7 21.7 22.5 46.7 8.0 0.3 この結果から、 F 17 OW+G 30 OWの置換によって GF 2が增加し、 GF 3が減少することが明らかとなつた。 実施例 D 6 ： F 170W+G 300W+H313 R変異体の作製と生産
( 1 )部位特異的変異による )9一フルクトフラノシダーゼ遗 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 28、 29、 および 32 の DNAプライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で 行い、 プラスミ ド p AN120 (F 17 OW+G 300W+H313R) を得た。
PAN 120 (F 17 OW+G 300W+H313 R) の挿入断片の塩基配列 を調べたところ、 目的の部分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変化して いないこと力確認できた。 すなわち、 変位処理後の遗 ίέ は 170番目、 300 番目および 313番目のアミノ酸だけがフエ二ルァラニンからトリブトファン、 グリシンからトリブトファン、 ヒスチジンからアルギニンにそれぞれ置換された /5—フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2)酵母による F 170W+G 300W+H313 R変異体の生産
P AN120 (F 170W+G 300W+H313 R) を BamH Iで消化し、 変異遗^を含む 2 k bpの BamH I DNA断片を取り出した。 これを pY 2831の BamH I部位に挿入してプラスミ ド pYSUC (F 17 OW + G 3 00W+H313R) を構築した。
このプラスミ ドを、 実施例 DlfBfgの方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 F 170 W+G300W+H313R変異体を^させたところ、 培養上清に単位 0. 9 Zmlの i8—フルクトフラノシダーゼ活性が検出された。
(3) F170W+G 300W+H313R変異体の評価
野^ Μ酵素および F 170W+G300W+H313R変異体につき、 酵母の 培 清を用いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40°C、 pH7で行い、 反応後の糖組成を H PLCにて分析した。 野生型および変異体に おいて、 1一ゲストース （GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 （％) は以下に示される通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4 ^M 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
F170W+G300W+H313B 1.4 24.0 18.6 48.8 7.2 0.0 この結果から、 F 170W+G 300W + H313 Rの置換によって G F 2力 增加し、 GF 3力 <減少することが明らかとなった。 実施例 D7 ： G300W+H313K変異体の作製と^
(1) 部位特異的変異による 9一フルクトフラノシダ一ゼ遗 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 29および 30の DNA プライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行い、 プ ラスミ ド pANl 20 (G300W+H313 K) を得た。
p AN120 (G300W + H313 K) の挿入断片の塩基配列を調べたと ころ、 目的の部分の塩基のみが fi換され、 それ以外の部分は変化していないこと 力、'確認できた。 すなわち、 変位処理後の遺伝子は 300番目と 313番目のァミ ノ酸だけがグリシンからトリブトファン、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換 された /3—フルクトフラノシダーゼをコードしていることが明らかとなった。
(2) 酵母による G 300W+H313K変異体の^
pANl 20 (G 300W+H313 K) を BamH Iで消化し、 変異遗 を含む 2kbpOB amH I DNA断片を取り出した。 これを pY2831の BamH I部位に挿入してプラスミ ド pYSUC (G 300W+H313 K) を 構築した。 このプラスミ ドを、 実施例 D 1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 G 300 W+H313K変異体を^させたところ、 培養上清に 1. 2単位 Zmlの 一 フルクトフラノシダーゼ活性が検出された。
(3) G 300W+H313K変異体の評価
野生型酵素および G 300W+H313 K変異体につき、 酵母の培養上清を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40 、 pH7で行い、 反応後の糖糸 flfigを HPLCにて分析した。 野^ および変異体において、 1—ケ ストース （GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 (%) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4
野^ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
G300W+H313 0.8 21.2 19.4 53.8 4.7 0.0
この結果から、 G300W+H313Kの置換によって GF 2が増加し、 GF 3が減少することが明らかとなつた。 実施例 D 8： 0300 + ^1313 変異体の と生産
(1)部位特異的変異による iS—フルク トフラノシダ一ゼ遗 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 30および 33の DNA プライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行い、 プ ラスミ ド PAN 120 (G300 V + H313 K) を得た。
pANl 20 (G300 V + H313 K)の挿入断片の塩基配列を調べたと ころ、 目的の部分の のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないこと が確認できた。 すなわち、 変位処理後の遺 fe^は 300番目と 313番目のァミ ノ酸だけがダリシンからバリン、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換された —フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2)酵母による G300 V + H313 K変異体の生産
P AN120 (G 300V + H313K) を BamH Iで消化し、 変異遗 を含む 2 k b pの B amH I DN A断片を取り出した。 これを pY2831の B a mH I部位に揷入してプラスミ ド pYSUC (G 300V + H313 K) を 構築した。
このプラスミ ドを、 実施例 D1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) MS— 161株に導入し、 G 300 V + H313K変異体を させたところ、 培養上清に 3. 6単位 Zmlの /9一 フルクトフラノシダーゼ活性が検出された。
(3) G 300V + H313K変異体の評価
野生型酵素および G 300V + H313 K変異体につき、酵母の培養上清を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40 、 pH7で行い、 反応後の糖組成を H PLCにて分析した。 野^および変異体において、 1ーケ ストース （GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 （％) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF4 野生型 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
G300V+H313K 0.9 21.6 19.0 53.7 4.7 0.0
この結果から、 G 300 V + H313Kの S換によって GF 2力'增加し、 GF 3が減少することが明らかとなつた。 実施例 D 9 ： G300E + H313 K変異体の ^と^
(1)部位特異的変異による 3—フルクトフラノシダーゼ遗 ^の塩基置換 部位特異的変異用ブライマ一として配列表の配列番号 30および 34の DNA プライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行い、 プ ラスミ ド PAN120 (G 300 E+H313K) を得た。
P AN 120 (G300 E + H313 K) の挿入断片の塩基配列を調べたと ころ、 目的の部分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変化していないこと 力確認できた。 すなわち、 変位処理後の遺伝子は 300番目と 313番目のァミ ノ酸だけがグリシンからグルタミン酸、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換さ れた9一フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2)酵母による G 300 E + H313 K変異体の生産
P AN120 (G300 E+H313K) を BamHIで消化し、 変異遗^ を含む 2 k b pの B amH I DN A断片を取り出した。 これを pY2831の B a mH I部位に挿入してプラスミ ド pYSUC (G 300 E + H 313 K) を
¾築した 0
このプラスミ ドを、 実施例 D1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 G 300 E + H313K変異体を^!させたところ、 培養上清に 2. 9単位 Zmlの — フルク トフラノシダーゼ活性が検出された。
(3) G300 E + H313K変異体の評価
野生型酵素および G 300 E + H313 K変異体につき、 酵母の培養上清を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重 S%ショ糖溶液、 40 、 pH7で行い、 反応後の糖纖を H PLCにて分析した。 野 および変異体において、 1ーケ ストース （GF2)への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 {%) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4
野 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
G300E+H313 1.2 22.0 19.3 52.8 4.7 0.0 この結果から、 G 300 E + H313 Kの置換によって GF 2力増加し、 GF 3が減少することが明らかとなつた。 実施例 D 10 ： G300D+H313K変異体の作製と^^
(1)部位特異的変異による iS—フルクトフラノシダーゼ遗伝子の塩基置換 部位特異的変異用プライマ一として配列表の配列番号 30および 35の DNA プライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行い、 プ ラスミ ド PAN120 (G 300D + H313K) を得た。
PAN 120 (G 300D + H313 K)の挿入断片の塩基配列を調べたと ころ、 目的の部分の塩基のみが置換され、 それ以外の部分は変ィ匕していないこと が確認できた。 すなわち、変位処理後の遺伝子は 300番目と 313番目のァミ ノ酸だけがグリシンからァスパラギン酸、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換 された /9一フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2)酵母による G300D + H313 K変異体の^
PAN 120 (G 300D + H313K) を BamHIで消化し、変異 itfei を含む 2 k b pの B amH I DNA断片を取り出した。 これを pY2831の BamHI部位に挿入してプラスミ ド pYSUC (G 300D + H313K) を 構築した。
このプラスミ ドを、 実施例 D 1記載の方法と同様にして、酵母サッカロミセス •セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS— 161株に導入し、 G 300 D + H313K変異体を させたところ、 培養上清に 4· 3単位 Zmlの ^一 フルクトフラノシダーゼ活性か'検出された。
(3) G 300D+H313K変異体の評価
野生型酵素および G 300D + H313 K変異体につき、 酵母の培養上清を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40で、 pH7で行い, 反応後の糖組成を H PLCにて分析した。 野^および変異体において、 1ーケ ストース （GF 2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 （％) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF 4
野^ 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
G300D+H313 0.5 21.6 19.6 53.3 5.0 0.0
この結果から、 G 300D + H313Kの置換によって GF 2力增加し、 GF 3が減少することが明らかとなつた。 実施例 D 11 ： F 170W+G300W+H313 K変異体の作製と生産
(1) 部位特異的変異による /3—フルクトフラノシダーゼ遗 fe^の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 28、 29および 30の
DNAプライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で行 い、 プラスミ ド p AN120 (F 170W+G300W+H313 K) を得た。
PAN 120 (F 170W+G300W + H313 K) の挿入断片の驢配 列を調べたところ、 目的の部分の^ ¾のみが置換され、 それ以外の部分は変化し ていないことが確認できた。 すなわち、 変位処理後の遺伝子は 1 Ί 0番目、 30 0番目および 313番目のァミノ酸だけがフヱニルァラニンからトリブトファン、 グリシンからトリブトフアン、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換された； 3— フルクトフラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2) 酵母による F 170W+G300W + H313 K変異体の^ j||
P AN120 (F 170W+G 300W+H313 K) を B amH Iで消化し、 変異遗 ^を含む 2 kb pの B amH I DNA断片を取り出した。 これを pY 2831の BamH I部位に挿入してプラスミ ド pYSUC (F 170W+G3 00W+H313K) を構築した。 このプラスミ ドを、 実施例 D1記載の方法と同様にして、 酵母サッカロミセス •セレ dシェ (Saccharomyces cerevisiae) MS - 161株に導入し、 F 170 W+G 300W + H313K変異体を生産させたところ、 培養上清に単位 2. 0 Zmlの3—フルク 卜フラノシダーゼ活性が検出された。
(3) F 170W+G 300W+H313K変異体の評価
野生型酵素および G 300W + H313 K変異体につき、 酵母の培養上清を用 いて評価を行った。 反応条件は、 48重量％ショ糖溶液、 40°C、 pH7で行い、 反応後の糖組成を H PLCにて分析した。 野^および変異体において、 1—ケ ストース （GF2) への変換率がそれぞれ最大の時の糖組成 (%) は以下に示さ れる通りであった。
F G GF GF 2 GF 3 GF4 野生型 0.4 22.3 20.5 45.1 11.3 0.3
F170W+G300W+H313K 0.7 22.3 18.9 54.3 3.9 0.0 この結果から、 F 170W + G30 OW-f H313 Kの置換によって G F 2が 増加し、 GF 3が減少することが明らかとなった。
(4) ァスペルギルス ·二ガーによる F 170W+G300W+H313 K変 異体の と評価
p AN 120 (F 170W+G 300W+H313 K) を BamHIで消化し、 変異遗 fe^を含む 2 k bpの BamHI DN A断片を取り出した。 これを pA N205 例 C5参照） の BamHI部位に挿入してプラスミ ド pAN53 1を構築した （図 9)。
p AN531を H i n d IIIで消化して直鎖状にした後、 これによりァスペル ギルス ·二ガー N I A 1602株 （Sue-, niaD) を形 ®fe換した。 得られた形質 転換体の全 DN Aに対してサザン解析を行い、 β一フルクトフラノシダーゼ遗伝 子のプロモーター領域で相同組換えを起こし、 宿主の染色体上の /3—フルクトフ ラノシダーゼ遺伝子の位置に pAN531が 1コピーだけ導入された形質転換体 を選択した。
この形質転換体よりベクター DNA部分を欠落させるため、 分生子を調製し、 塩素酸を含む培地 （6%塩素酸カリウム、 3%ショ糖、 0. 2%グルタミ ン酸ナ トリウム、 0. 1%K2HP04、 0. 05%MgS( 7H20、 0. 05%K C l、 0. 01%F e SO 7Η20、 1. 5%寒天） に塗布した。 この培 にコロニーを形成する株は、 再び相同組換えを起こし、 ベクター DNAが欠落し たこと力、'期待される力、 この際、 導入したときと同じプロモーター領域で組換え が起きると元の宿主に戻ることとなるが、 ；9—フルクトフラノシダーゼ遗^ Fの ターミネータ一領域で組換えが起きれば F 170W+G300W+H313 Κ変 異体をコードする itfe^が残り、 これらは /3—フルクトフラノシダーゼ活性の有 無で容易に区別することができる。 実際、 塩素酸耐性を示した株の内、 一フル クトフラノシダーゼ活性を示すものと示さないものは 1 ： 1の割合で現れ、 β— フルクトフラノシダーゼ活性を示した株のから 1株を選び、 ァスペルギルス ·二 ガー Ν I A3144株 （Suc+， niaD) と命名した。 この株の全 DN Aに対してサ ザン解析を行い、 ベクター DN Aが欠落し、 宿主の染色体上の3—フルクトフラ ノシダーゼ遗^の位置に F 170W+G300W+H313 K変異体をコード する遗 &ίが導入されていることを確認した。
次に、 ァスペルギルス ·二ガー Ν I A3144株を^^培地 （5%ショ糖、 0. 7%麦芽エキス、 1%ポリペプトン、 0. 5%カルボキシメチルセルロース、 0. 3%NaC l) で、 28 、 3日間培養した後、 菌体を超音波で破枠して粗 S¾液を調製した。 粗酵素液の /9一フルクトフラノシダーゼ活性を測定した結果、 培養液 lml当たり 25単位の活性が検出された。 この粗^をショ糖 1 gあた り 2. 5単位添加し、 55重量％ショ糖溶液、 pH7、 40で、 20時間反応さ せた。 反応後の糖組成を H PLCで分析したところ、 フルクトース 1. 2%、 グ ルコース 22. 8%、 ショ糖 17. 1%、 GF 2 55. 3% GF 3 3. 8 %であった。
(5) F 170W+G 300W + H313 K変異体の精製と酵素化学的諸性質 前記 （4) で調製した粗酵素液を 2 OmM T r i s-HC 1 (pH7. 5) 緩衝液に対して透析した後、 あらかじめ同緩衝液で平衡化しておいた DEAE卜 ョパール 650 S (東ソ一） カラム （1. 6X18 cm) に負荷した。 次に、 T r i s -HC 1 (pH7. 5) 緩衝液中で、 N a C 1の 0から 300 mMの直線 的濃度勾配により溶出し、 活性画分を集めた。 更に、 この活性画分をセファクリ ル S— 300 (フアルマシア） カラム （2. 6X60 cm) に負荷し、 5 OmM トリメチルアミンー醉酸緩衝液 （pH8. 0) で溶出し、 活性画分を集め、 F 1 70W+G 300W+H313 K変異体精製樣品とした。 これを SDS—ポリア クリルァミ ドゲル電気泳動で調べたところ、 元の親 —フルクトフラノシダーゼ と同じ;^ 0万ダルトンの均一なバンドを示した。
この精製標品を用いて、 至適 pH、 至適 SE、 PH安定性、 温度安定性につき 元の親9一フルクトフラノシダーゼと比較したところ、 ほとんど同じであった。 実施例 D 12 ： F 170W+G 300 V + H313 K変異体の と生産
(1) 部位特異的変異による /3—フルク トフラノシダーゼ遗 の塩基置換 部位特異的変異用プライマーとして配列表の配列番号 28、 30、 および 33 の DNAプライマーを使用した以外は実施例 D 1に記載した方法と同様の方法で 行い、 プラスミ ド pAN 120 (F 170W+G 300V + H313 K) を得た。
pANl 20 (F 170W+G300 V + H313K) の挿入断片の 配 列を調べたところ、 目的の部分の^のみが置換され、 それ以外の部分は変ィ匕し ていないことが確認できた。 すなわち、 変位処理後の遗^は 1 Ί 0番目、 30 0番目および 313番目のアミノ酸だけがフヱニルァラニンからトリブトファン、 グリシン力、らバリン、 ヒスチジンからリジンにそれぞれ置換された; 9一フルクト フラノシダーゼをコ一ドしていることが明らかとなった。
(2) ァスペルギルス ·二ガーによる F 1 70W+G 300 V + H3 1 3 K変 異体の^ と評価
p AN 1 20 (F 170W+G 300V + H3 1 3K) を B amH Iで消イ匕し、 変異遗^^を含む 2 k b pの B amH I DN A断片を取り出した。 これを p A N205の B amH I部位に挿入してプラスミ ド p AN 5 1 7を構築した。
P AN5 17を H i n d IIIで消化して直鎖状にした後、 実施例 D 1 1に記載 の方法と同様にしてァスペルギルス ·二ガー N I A 1602株 （S u e―、 n i a D) を形質転換を行い、 ベクター DNA力く欠落し、 宿主の染色体上の 一フル クトフラノシダーゼ遗伝子の位置に F 1 70W+G 300 V + H31 3 K変異体 をコードする ¾伝子が導入されているァスペルギルス ·二ガー N I A 1 7 1 7株 (S u c十、 n i a D) を得た。
次に、 ァスペルギルス ·二ガー N I A 1 7 1 7株を 培地 （5%ショ糖、 0. 7%麦芽エキス、 1%ポリペプトン、 0. 5%カルボキシメチルセルロース、 0. 3%N a C 1 ) で、 28°C、 3日間培養した後、 菌体を超音波で破砕して粗 液を調製した。 粗 液の J3—フルク トフラノシダーゼ活性を測定した結果、 培養液 lm l当たり 45単位の活性が検出された。 この粗^!をショ糖 1 gあた り 2. 5単位添加し、 B x 45ショ糖、 H7. 5、 40。C、 24時間反応させ た。 反応後の糖組成を H P L Cで分析したところ、 フルクトース 1. 8%、 ダル コース 22. 3%、 ショ糖 1 6. 1%、 GF 2 55. 7%, GF 3 4. 1% であった。 この結果から、 F 1 70W+G300 V + H 3 1 3Kの置換によって GF 2が增加し、 GF 3が減少することが明らかとなった。
(3) F 1 70W+G 300 V + H 3 1 3 K変異体の精製と酵素化学的諸性質 前記 （2) で調製した粗酵素液を 2 OmM T r i s -HC 1 (pH 7. 5) 緩衝液に対して透析した後、 あらかじめ同緩衝液で平衡化しておいた DEAEト ョパール 650 S (東ソ一） カラム （1. 6X18 cm) に負荷した。 次に、 T r i s -HC 1 (ρΗ7. 5)緩衝液中で、 N a C 1の 0から 300 mMの直線 的濃度勾配により溶出し、 活性画分を集めた。 更に、 この活性画分をセフアタリ ル S— 300 (フアルマシア） カラム （2. 6X60 cm) に負荷し、 5 OmM トリメチルァミン一酢酸緩衝液 (pH8. 0) で溶出し、 活性画分を集め、 F1 70W+G300 V + H313 K変異体精製標品とした。 これを SDS—ポリア クリルァミ ドゲル電気泳動で調べたところ、 元の親 /3—フルクトフラノシダーゼ と同じ^ 0万ダルトンの均一なバンドを示した。
この精製標品を用いて、 至適 pH、 至適温度、 pH安定性、 温度安定性につき 元の親 /3—フルクトフラノシダ一ゼと比絞したところ、 ほとんど同じであった。
配 列 表
配列番号： 1
配列の長さ ： 6 3 5
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類： タンハ。ク質
起源
生物名： Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
配列の特徴
特徴を表わす記号： mat peptide
存在位置： 1. . 6 3 5
特徴を決定した方法： E
配列
Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu Ser Thr 1 5 10 15
Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala His lie
20 25 30
Leu Pro Ala Glu Gly Gin lie Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Thr Asp
35 40 45
Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly Asp Gly
50 55 60
lie Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80
Asp Asn Gly Ser Phe Leu lie Gin Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val
85 90 95 Ala Val Phe Asp Gly Ala Val lie Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro
100 105 110
Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro lie His Trp Ser lie
115 120 125
Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp
130 135 140
Gly Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gin Gly Pro Val lie Ala Asp 145 150 155 160
His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe
165 170 175
Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu Glu Val Ala
180 185 190
Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys
195 200 205
Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly
210 215 220
Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe 225 230 235 240
Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala Thr Asn Ser
245 250 255
Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe
260 265 270
Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gin
275 280 285 Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Leu Pro
290 295 300
He Val Pro Gin Val Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly 305 310 315 320
Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val Glu Phe Ser
325 330 335
Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser Gly
355 360 365
Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gin
370 375 380
Tyr Glu Gin Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly Trp Thr Gly 385 390 395 400
Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val Glu Asn Val
405 410 415
Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly Val Ser Trp Val Val Gly
420 425 430
Glu Ser Asp Asn Gin Thr Ala Arg Leu Arg Thr Leu Gly lie Thr lie
435 440 445
Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala Asn Gly Ser Val Thr Ala
450 455 460
Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gin Thr Ala Ala Val Val Pro Phe Ala Gin 465 470 475 480 Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Gin Leu Glu Phe Pro
485 490 495
Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gin Ser Gly Phe Glu lie Leu Ala
500 505 510
Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala lie Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser
515 520 525
Leu Val Val Asp Arg Ser Gin Thr Ser Ala Ala Ala Pro Thr Asn Pro
530 535 540
Gly Leu Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val 545 550 555 560 lie Glu Asn Gly Gin Glu Gin Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val
565 570 575
Val Asp Asn Ala Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu
580 585 590
Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gin He Arg Phe
595 600 605
Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gin Phe Arg Asn Val Ser Val Ser
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn
625 630 635 配列番号： 2
配列の長さ ： 1 9 0 5
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の觀： D N A
05*、
生物名： Aspergillus niger ACE- 2-1 (ATCC 20611)
配列の特徴
特徴を表わす記号： mat peptide
存在位置： 1. . 1 9 0 5
特徴を決定した方法： E
配列
TCATACCACC TGGACACCAC GGCCCCGCCG CCGACCAACC TCAGCACCCT CCCCAACAAC 60 ACCCTCTTCC ACGTGTGGCG GCCGCGCGCG CACATCCTGC CCGCCGAGGG CCAGATCGGC 120 GACCCCTGCG CGCACTACAC CGACCCATCC ACCGGCCTCT TCCACGTGGG GHCCTGCAC 180
GACGGGGACG GCATCGCGGG CGCCACCACG GCCAACCTGG CCACCTACAC CGATACCTCC 240
GATAACGGGA GCTTCCTGAT CCAGCCGGGC GGGAAGAACG ACCCCGTCGC CGTGTTCGAC 300
GGCGCCGTCA TCCCCGTCGG CGTCAACAAC ACCCCCACCT TACTCTACAC CTCCGTCTCC 360
TTCCTGCCCA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGCGGCA GCGAGACGCA GTCGTTGGCC 420
GTCGCGCGCG ACGGCGGCCG CCGCTTCGAC AAGCTCGACC AGGGCCCCGT CATCGCCGAC 480
CACCCCTTCG CCGTCGACGT CACCGCCTTC CGCGATCCGT TTGTCTTCCG CAGTGCCAAG 540
HGGATGTGC TGCTGTCGH GGATGAGGAG GTGGCGCGGA ATGAGACGGC CGTGCAGCAG 600
GCCGTCGATG GCTGGACCGA GAAGAACGCC CCCTGGTATG TCGCGGTCTC TGGCGGGGTG 660
CACGGCGTCG GGCCCGCGCA GTTCCTCTAC CGCCAGAACG GCGGGAACGC TTCCGAGTTC 720
CAGTACTGGG AGTACCTCGG GGAGTGGTGG CAGGAGGCGA CCAACTCCAG CTGGGGCGAC 780
GAGGGCACCT GGGCCGGGCG CTGGGGGTTC AACTTCGAGA CGGGGAATGT GCTCTTCCTC 840
ACCGAGGAGG GCCATGACCC CCAGACGGGC GAGGTGTTCG TCACCCTCGG CACGGAGGGG 900
TCTGGCCTGC CAATCGTGCC GCAGGTCTCC AGTATCCACG ATATGCTGTG GGCGGCGGGT 960 GAGGTCGGGG TGGGCAGTGA GCAGGAGGGT GCCAAGGTCG AGHCTCCCC CTCCATGGCC 1020 GGGTTTCTGG ACTGGGGGH CAGCGCCTAC GCTGCGGCGG GCAAGGTGCT GCCGGCCAGC 1080 TCGGCGGTGT CGAAGACCAG CGGCGTGGAG GTGGATCGGT ATGTCTCGTT CGTCTGGTTG 1140 ACGGGCGACC AGTACGAGCA GGCGGACGGG TTCCCCACGG CCCAGCAGGG GTGGACGGGG 1200 TCGCTGCTGC TGCCGCGCGA GCTGAAGGTG CAGACGGTGG AGAACGTCGT CGACAACGAG 1260 CTGGTGCGCG AGGAGGGCGT GTCGTGGGTG GTGGGGGAGT CGGACAACCA GACGGCCAGG 1320 CTGCGCACGC TGGGGATCAC GATCGCCCGG GAGACCAAGG CGGCCCTGCT GGCCAACGGC 1380 TCGGTGACCG CGGAGGAGGA CCGCACGCTG CAGACGGCGG CCGTCGTGCC GTTCGCGCAA 1440 TCGCCGAGCT CCAAGTTCTT CGTGCTGACG GCCCAGCTGG AGTTCCCCGC GAGCGCGCGC 1500 TCGTCCCCGC TCCAGTCCGG GTTCGAAATC CTGGCGTCGG AGCTGGAGCG CACGGCCATC 1560 TACTACCAGT TCAGCAACGA GTCGCTGGTC GTCGACCGCA GCCAGACTAG TGCGGCGGCG 1620 CCCACGAACC CCGGGCTGGA TAGCTTTACT GAGTCCGGCA AG GCGGTT GTTCGACGTG 1680 ATCGAGAACG GCCAGGAGCA GGTCGAGACG HGGATCTCA CTGTCGTCGT GGATAACGCG 1740 GHGTCGAGG TGTATGCCAA CGGGCGCTTT GCGHGAGCA CCTGGGCGAG ATCGTGGTAC 1800 GACAACTCCA CCCAGATCCG CTTCTTCCAC AACGGCGAGG GCGAGGTGCA GHCAGGAAT 1860 GTCTCCGTGT CGGAGGGGCT CTATAACGCC TGGCCGGAGA GAAAT 1905 配列番号： 3
配列の長さ ： 2 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー■·直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント 生物名： Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611) 配列
Leu Asp Gin Gly Pro Val lie Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val
1 5 10 15
Thr Ala Phe Arg
20 配列番号： 4
配列の長さ ： 2 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名： Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
Val Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Ala Ala
20 配列番号： 5
E^Jの長さ ： 2 0
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名： Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
配列
Val Gin Thr Val Glu Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu
1 5 10 15 Gly Val Ser Trp
20 配列番号： 6
配列の長さ ： 2 0
配列の型： アミノ酸
トポロジー ：直鎖状
配列の ：ペプチド
フラグメント型：中間部フラグメント
起源
生物名： Aspergillus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
配列
Ala Ala Leu Leu Ala Xaa Gly Ser Val Thr Ala Glu Glu Asp Arg Thr
1 5 10 15
Leu Gin Thr Ala
20 配列番号： 7
ϋの長さ ： 6 配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ぺプチド
フラグメント型： N末端フラグメン卜
起源
生物名： Aspergillus niger ACE-2- 1 (ATCC 20611) 配列
Ser Tyr His Leu Asp Thr
1 5 配列番号： 8
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の Μϋ:他の核酸 合成 DNA
ATCGCSGAYC AYCCSHYGC 20 配列番号： 9
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー：直趙状
12^の TO:他の核酸 合成 DNA
配列
TCE1TETCSA CSACETTYTC 20 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 7 8 8
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
源
生物名： Aspergil lus niger ACE-2-1 (ATCC 20611)
Ε3¾の特徴
特徴を表す記号： P C D S (partial amino acid sequence)
存在位置： 1 . . 7 8 8
特徴を決定した方法： E
配列
ATC GCC GAC CAC CCC TTC GCC GTC GAC GTC ACC GCC TTC CGC GAT CCG 48 lie Ala Asp His Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro
1 5 10 15
1ΤΓ GTC TTC CGC AGT GCC AAG HG GAT GTG CTG CTG TCG HG GAT GAG 96 Phe Val Phe Arg Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Ser Leu Asp Glu
20 25 30
GAG GTG GCG CGG AAT GAG ACG GCC GTG CAG CAG GCC GTC GAT GGC TGG 144 Glu Val Ala Arg Asn Glu Thr Ala Val Gin Gin Ala Val Asp Gly Trp
35 40 45
ACC GAG AAG AAC GCC CCC TGG TAT GTC GCG GTC TCT GGC GGG GTG CAC 192 Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val Bis
50 55 60 GGC GTC GGG CCC GCG CAG TTC CTC TAC CGC CAG AAC GGC GGG AAC GCT 240 Gly Val Gly Pro Ala Gin Phe Leu Tyr Arg Gin Asn Gly Gly Asn Ala 65 70 75 80
TCC GAG TTC CAG TAC TGG GAG TAC CTC GGG GAG TGG TGG CAG GAG GCG 288 Ser Glu Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gin Glu Ala
85 90 95
ACC AAC TCC AGC TGG GGC GAC GAG GGC ACC TGG GCC GGG CGC TGG GGG 336 Thr Asn Ser Ser Trp Gly Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly
100 105 110
TTC AAC TTC GAG ACG GGG AAT GTG CTC TTC CTC ACC GAG GAG GGC CAT 384 Phe Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His
115 120 125
GAC CCC CAG ACG GGC GAG GTG TTC GTC ACC CTC GGC ACG GAG GGG TCT 432 Asp Pro Gin Thr Gly Glu Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser
130 135 140
GGC CTG CCA ATC GTG CCG CAG GTC TCC AGT ATC CAC GAT ATG CTG TGG 480 Gly Leu Pro lie Val Pro Gin Val Ser Ser lie His Asp Met Leu Trp 145 150 155 160
GCG GCG GGT GAG GTC GGG GTG GGC AGT GAG CAG GAG GGT GCC AAG GTC 528 Ala Ala Gly Glu Val Gly Val Gly Ser Glu Gin Glu Gly Ala Lys Val
165 170 175
GAG TTC TCC CCC TCC ATG GCC GGG ΊΊΊ CTG GAC TGG GGG TTC AGC GCC 576 Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu Asp Trp Gly Phe Ser Ala
180 185 190 TAC GCT GCG GCG GGC AAG GTG CTG CCG GCC AGC TCG GCG GTG TCG AAG 624 Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala Ser Ser Ala Val Ser Lys
195 200 205
ACC AGC GGC GTG GAG GTG GAT CGG TAT GTC TCG TTC GTC TGG TTG ACG 672 Thr Ser Gly Val Glu Val Asp Arg Tyr Val Ser Phe Val Trp Leu Thr
210 215 220
GGC GAC CAG TAC GAG CAG GCG GAC GGG TTC CCC ACG GCC CAG CAG GGG 720 Gly Asp Gin Tyr Glu Gin Ala Asp Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Gly 225 230 235 240
TGG ACG GGG TCG CTG CTG CTG CCG CGC GAG CTG AAG GTG CAG ACG GTG 768 Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Lys Val Gin Thr Val
245 250 255
GAG AAC GTC GTC GAC AAC GA 788 Glu Asn Val Val Asp Asn
260 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 5 6 5
配歹 ijの型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の ：タンパク質
起源
生物名： Penici I lium roqueforti IAM7254
リの特徽
特徴を表わす記号： mat peptide 存在位置： 1. . 5 6 5
特徴を決定した方法： E
配列
Val Asp Phe His Thr Pro lie Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu 1 5 10 15
Ser Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu Phe Lys Thr Trp Arg Pro Arg Ala
20 25 30
His Leu Leu Pro Pro Ser Gly Asn lie Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr
35 40 45
Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Trp Leu Tyr Ser Gly
50 55 60
lie Ser Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Lys Asp Leu Asn 65 70 75 80
Pro Asp Gly Ala Pro Ser He Val Ala Gly Gly Lys Asn Asp Pro Leu
85 90 95
Ser Val Phe Asp Gly Ser Val lie Pro Ser Gly lie Asp Gly Met Pro
100 105 110
Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro lie His Trp Ser lie
115 120 125
Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gin Ser Leu Ala Val Ser Tyr Asp
130 135 140
Gly Gly His Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gin Gly Pro Val lie Pro Thr 145 150 155 160
Pro Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe
165 170 175 Gin Ser Pro lie Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gin Gly Thr Trp
180 185 190
Tyr Val Ala lie Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Cys Gin Phe
195 200 205
Leu Tyr Arg Gin Asn Asp Ala Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly
210 215 220
Gin Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly Asp Trp 225 230 235 240
Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Val Phe Ser Leu
245 250 255
Asn Ala Glu Gly Tyr Ser Glu Asp Gly Glu lie Phe lie Thr Leu Gly
260 265 270
Ala Glu Gly Ser Gly Leu Pro lie Val Pro Gin Val Ser Ser lie Arg
275 280 285
Asp Met Leu Trp Val Thr Gly Asn Val Thr Asn Asp Gly Ser Val Thr
290 295 300
Phe Lys Pro Thr Met Ala Gly Val Leu Asp Trp Gly Val Ser Ala Tyr 305 310 315 320
Ala Ala Ala Gly Lys lie Leu Pro Ala Ser Ser Gin Ala Ser Thr Lys
325 330 335
Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe lie Ser Tyr Val Trp Leu Thr Gly Asp
340 345 350
Leu Phe Glu Gin Val Lys Gly Phe Pro Thr Ala Gin Gin Asn Trp Thr
355 360 365 Gly Ala Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Asn Val Arg Thr lie Ser Asn
370 375 380
Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Ser Leu Thr Ser Trp Arg Val 385 390 395 400
Ala Arg Glu Asp Ser Gly Gin lie Asp Leu Glu Thr Met Gly lie Ser
405 410 415 lie Ser Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Phe Val
420 425 430
Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ala Val Pro Phe Asn Thr
435 440 445
Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Asn lie Ser Phe Pro
450 455 460
Thr Ser Ala Arg Asp Ser Gly lie Gin Ala Gly Phe Gin Val Leu Ser 465 470 475 480
Ser Ser Leu Glu Ser Thr Thr lie Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser
485 490 495 lie lie Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ala
500 505 510
Gly lie Leu Ser Asp Asn Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp Val
515 520 525
Leu Arg Asn Gly Lys Glu Gin Val Glu Thr Leu Glu Leu Thr lie Val
530 535 540
Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 545 550 555 560 Gly Thr Trp Ala Arg
565 配列番号： 1 2
配列の長さ ： 1 6 9 5
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー ·.直鎖状
■の觀： D N A
起源
生物名： Penici Ilium roqueforti IAH7254
配列の特徴
特徴を表わす記号： mat peptide
存在位置： 1 . . 1 6 9 5
特徴を決定した方法： E
配列
G GATTTCC ATACCCCGAT TGACTATAAC TCGGCTCCGC CAAACCTTTC TACCCTGGCA 60 AACGCATCTC TTTTCAAGAC ATGGAGACCC AGAGCCCATC TTCTCCCTCC ATCTGGGAAC 120 ATAGGCGACC CGTGCGGGCA CTATACCGAT CCCAAGACTG GTCTCTTCCA CGTGGGTTGG 180 CTTTACAGTG GGATHCGGG AGCGACAACC GACGATCTCG TTACCTATAA AGACCTCAAT 240 CCCGATGGAG CCCCGTCAAT TGTTGCAGGA GGAAAGAACG ACCCTCTTTC TGTCTTCGAT 300 GGCTCGGTCA TTCCAAGCGG TATAGACGGC ATGCCAACTC TTCTGTATAC CTCTGTATCA 360 TACCTCCCAA TCCACTGGTC CATCCCCTAC ACCCGGGGAA GCGAGACACA ATCCTTGGCC 420 GHTCCTATG ACGGTGGTCA CAACTTCACC AAGCTCAACC AAGGGCCCGT GATCCCTACG 480 CCTCCGTTTG CTCTCAATGT CACCGCTTTC CGTGACCCCT ACGTTTTCCA AAGCCCAAH 540 CTGGACAAAT CTGTCAATAG TACCCAAGGA ACATGGTATG TCGCCATATC TGGCGGTGTC 600
CACGGTGTCG GACCTTGTCA GTTCCTCTAC CGTCAGAACG ACGCAGATTT TCAATATTGG 660
GAATATCTCG GGCAATGGTG GAAGGAGCCC CTTAATACCA CTTGGGGAAA GGGTGACTGG 720
GCCGGGGGH GGGGCTTCAA CTTTGAGGTT GGCAACGTCT TTAGTCTGAA TGCAGAGGGG 780
TATAGTGAAG ACGGCGAGAT ATTCATAACC CTCGGTGCTG AGGGTTCGGG ACTTCCCATC 840
GHCCTCAAG TCTCCTCTAT TCGCGATATG CTGTGGGTGA CCGGCAATGT CACAAATGAC 900
GGCTCTGTCA CTT CAAGCC AACCATGGCG GGTGTGCTTG ACTGGGGCGT GTCGGCATAT 960
GCTGCTGCAG GCAAGATOT GCCGGCCAGC TCTCAGGCAT CCACAAAGAG CGGTGCCCCC 1020
GATCGGTTCA TTTCCTATGT CTGGCTCACT GGAGATCTAT TCGAGCAAGT GAAAGGATTC 1080
CCTACCGCTC AACAAAACTG GACCGGGGCC CTCHACTGC CGCGAGAGCT GAATGTCCGC 1140
ACTATCTCTA ACGTGGTGGA TAACGAAOT TCGCGTGAGT CCTTGACATC GTGGCGCGTG 1200
GCCCGCGAAG ACTCTGGTCA GATCGACCTT GAAACAATGG GAATCTCAAT TTCCAGGGAG 1260
ACTTACAGCG CTCTCACATC CGGCTCATCT TTTGTCGAGT CTGGTAAAAC GHGTCGAAT 1320
GCTGGAGCAG TGCCCTTCAA TACCTCACCC TCAAGCAAGT TCTTCGTGCT GACAGCAAAT 1380
ATATCTTTCC CGACCTCTGC CCGTGACTCT GGCATCCAGG CTGGTTTCCA GGTTTTATCC 1440
TCTAGTCTTG AGTCTACAAC TATCTACTAC CAATTCTCCA ACGAGTCCAT CATCGTCGAC 1500
CGCAGCAACA CGAGTGCTGC GGCGAGAACA ACTGCTGGGA TCCTCAGTGA TAACGAGGCG 1560
GGACGTCTGC GCCTCTTCGA CGTGTTGCGA AATGGAAAAG AACAGGHGA AACTTTGGAG 1620
CTCACTATCG TGGTGGATAA TAGTGTACTG GAAGTATATG CCAATGGACG CTTTGCTCTA 1680
GGCACTTGGG CTCGG 1695 配列番号： 1 3
Figure imgf000085_0001
： 5 7 4
15 ^の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状 配列の觀： タンパク質
起源
生物名： Scopulariopsis brevicaulis IF04843
の特徴
特徵を表わす記号： mat peptide
存在位置： 1. . 5 7 4
特徴を決定した方法： E
配列
Gin Pro Thr Ser Leu Ser lie Asp Asn Ser Thr Tyr Pro Ser lie Asp 1 5 10 15
Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Ala Asn Asn Ser Leu
20 25 30
Phe Glu Thr Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Gin Asn Gin
35 40 45
lie Gly Asp Pro Cys Met His Tyr Thr Asp Pro Glu Thr Gly lie Phe
50 55 60
His Val Gly Trp Leu Tyr Asn Gly Asn Gly Ala Ser Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80
Glu Asp Leu Val Thr Tyr Gin Asp Leu Asn Pro Asp Gly Ala Gin Met
85 90 95 lie Leu Pro Gly Gly Val Asn Asp Pro lie Ala Val Phe Asp Gly Ala
100 105 110
Val lie Pro Ser Gly lie Asp Gly Lys Pro Thr Met Met Tyr Thr Ser
115 120 125 Val Ser Tyr Met Pro He Ser Trp Ser He Ala Tyr Thr Arg Gly Ser
130 135 140
Glu Thr His Ser Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Lys Asn Phe Thr 145 150 155 160
Lys Leu Val Gin Gly Pro Val lie Pro Ser Pro Pro Phe Gly Ala Asn
165 170 175
Val Thr Ser Trp Arg Asp Pro Phe Leu Phe Gin Asn Pro Gin Phe Asp
180 185 190
Ser Leu Leu Glu Ser Glu Asn Gly Thr Trp Tyr Thr Val lie Ser Gly
195 200 205
Gly lie His Gly Asp Gly Pro Ser Ala Phe Leu Tyr Arg Gin His Asp
210 215 220
Pro Asp Phe Gin Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Pro Trp Trp Asn Glu Glu 225 230 235 240
Gly Asn Ser Thr Trp Gly Ser Gly Asp Trp Ala Gly Arg Trp Gly Tyr
245 250 255
Asn Phe Glu Val lie Asn He Val Gly Leu Asp Asp Asp Gly Tyr Asn
260 265 270
Pro Asp Gly Glu lie Phe Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Ser Phe Asp
275 280 285
Pro He Lys Pro Gin Ala Ser Asp Asn Arg Glu Met Leu Trp Ala Ala
290 295 300
Gly Asn Met Thr Leu Glu Asp Gly Asp lie Lys Phe Thr Pro Ser Met 305 310 315 320 Ala Gly Tyr Leu Asp Trp Gly Leu Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys
325 330 335
Glu Leu Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ser Gin Lys Ser Gly Ala Pro Asp
340 345 350
Arg Phe Val Ser Tyr Leu Trp Leu Thr Gly Asp Tyr Phe Glu Gly His
355 360 365
Asp Phe Pro Thr Pro Gin Gin Asn Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro
370 375 380
Arg Glu Leu Ser Val Gly Thr He Pro Asn Val Val Asp Asn Glu Leu 385 390 395 400
Ala Arg Glu Thr Gly Ser Trp Arg Val Gly Thr Asn Asp Thr Gly Val
405 410 415
Leu Glu Leu Val Thr Leu Lys Gin Glu lie Ala Arg Glu Thr Leu Ala
420 425 430
Glu Met Thr Ser Gly Asn Ser Phe Thr Glu Ala Ser Arg Asn Val Ser
435 440 445
Ser Pro Gly Ser Thr Ala Phe Gin Gin Ser Leu Asp Ser Lys Phe Phe
450 455 460
Val Leu Thr Ala Ser Leu Ser Phe Pro Ser Ser Ala Arg Asp Ser Asp 465 470 475 480
Leu Lys Ala Gly Phe Glu lie Leu Ser Ser Glu Phe Glu Ser Thr Thr
485 490 495
Val Tyr Tyr Gin Phe Ser Asn Glu Ser lie He lie Asp Arg Ser Asn
500 505 510 Ser Ser Ala Ala Ala Leu Thr Thr Asp Gly lie Asp Thr Arg Asn Glu
515 520 525
Phe Gly Lys Met Arg Leu Phe Asp Val Val Glu Gly Asp Gin Glu Arg
530 535 540
He Glu Thr Leu Asp Leu Thr lie Val Val Asp Asn Ser lie Val Glu
545 550 555 560
Val His Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg
565 570 配列番号： 1 4
BE^jの長さ ： 1 7 2 2
配列の型：核酸
鏆の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の觀： D N A
起源
玍物名： Scopulariopsis brevicaulis IF04843
の特徴
特徴を表わす記号： mat peptide
¾E位置： 1. . 1 7 2 2
特徴を決定した方法： E
CAACCTACGT CTCTGTCAAT CGACAATTCC ACGTATCCTT CTATCGACTA CAACTCCGCC 60 CCTCCAAACC TCTCGACTCT TGCCAACAAC AGCCTCTTCG AGACATGGAG GCCGAGGGCA 120 CACGTCCTTC CGCCCCAGAA CCAGATCGGC GATCCGTGTA TGCACTACAC CGACCCCGAG 180 ACAGGAATCT TCCACGTCGG CTGGCTGTAC AACGGCAATG GCGCTTCCGG CGCCACGACC 240
GAGGATCTCG TCACCTATCA GGATCTCAAC CCCGACGGAG CGCAGATGAT CCTTCCGGGT 300
GGTGTGAATG ACCCCAHGC TGTCTTTGAC GGCGCGGHA TTCCCAGTGG CATTGATGGG 360
AAACCCACCA TGATGTATAC CTCGGTGTCA TACATGCCCA TCTCCTGGAG CATCGCHAC 420
ACCAGGGGAA GCGAGACCCA CTCTCTCGCA GTGTCGTCCG ACGGCGGTAA GAACTTCACC 480
AAGCTGGTGC AGGGCCCCGT CATTCCTTCG CCTCCCTTCG GCGCCAACGT GACCAGCTGG 540
CGTGACCCCT TCCTGTTCCA AAACCCCCAG TTCGACTCTC TCCTCGAAAG CGAGAACGGC 600
ACGTGGTACA CCGHATCTC TGGTGGCATC CACGGTGACG GCCCCTCCGC GTTCCTCTAC 660
CGTCAGCACG ACCCCGACTT CCAGTACTGG GAGTACCHG GACCGTGGTG GAACGAGGAA 720
GGGAACTCGA CCTGGGGCAG CGGTGACTGG GCTGGCCGGT GGGGCTACAA CTTCGAGGTC 780
ATCAACAHG TCGGTCTTGA CGATGATGGC TACAACCCCG ACGGTGAAAT CTTTGCCACG 840
GTAGGTACCG AATGGTCGTT TGACCCCATC AAACCGCAGG CCTCGGACAA CAGGGAGATG 900
CTCTGGGCCG CGGGCAACAT GACTCTCGAG GACGGCGATA TCAAGTTCAC GCCAAGCATG 960
GCGGGCTACC TCGACTGGGG TCTATCGGCG TATGCCGCCG CTGGCAAGGA GCTGCCCGCT 1020
TCTTCAAAGC CTTCGCAGAA GAGCGGTGCG CCGGACCGGT TCGTGTCGTA CCTGTGGCTC 1080
ACCGGTGACT ACTTCGAGGG CCACGACTTC CCCACCCCGC AGCAGAAHG GACCGGCTCG 1140
CTHTGCTTC CGCGTGAGCT GAGCGTCGGG ACGAHCCCA ACGTTGTCGA CAACGAGCTT 1200
GCTCGCGAGA CGGGCTCTTG GAGGGTTGGC ACCAACGACA CTGGCGTGCT TGAGCTGGTC 1260
ACTCTGAAGC AGGAGAHGC TCGCGAGACG CTGGCTGAAA TGACCAGCGG CAACTCCTTC 1320
ACCGAGGCGA GCAGGAATGT CAGCTCGCCC GGATCTACCG CCTTCCAGCA GTCCCTGGAT 1380
TCCAAGTTCT TCGTCCTGAC CGCCTCGCTC TCCTTCCCTT CGTCGGCTCG CGACTCCGAC 1440
CTCAAGGCTG GTTTCGAGAT CCTGTCGTCC GAGTTTGAGT CGACCACGGT CTACTACCAG 1500
TTTTCCAACG AGTCCATCAT CAHGACCGG AGCAACTCGA GTGCTGCCGC CTTGACTACC 1560
GATGGAATCG ACACCCGCAA CGAGTTTGGC AAGATGCGCC TGTTTGATGT TGTCGAGGGT 1620
GACCAGGAGC GTATCGAGAC GCTCGATCTC ACTA GTGG TTGATAACTC GATCGHGAG 1680 GTTCATGCCA ACGGGCGATT CGCTCTGAGC ACTTGGGTTC GG 1722 配列番号： 15
配列の長さ ： 28
配列の型：核酸
トポロジー ··直鎖状
62^の種類：他の核酸 合成 DNA
配列
GCGAATTCCA ATGAAGCTCA CCACTACC 28
I ^番号： 16
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の 他の核酸 合成 DNA
配列
GCGGATCCCG GTCAATTTCT CTCC 24 番号： 17
配列の長さ ： 19
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
ΙΕ^ϋの 他の核酸 合成 DNA
配列
GACTGACCGG TGTTCATCC 配列番号： 18
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTCGGTTGTC ATAGATGTGG 配列番号： 19
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の ：他の核酸 合成 DNA
CAATCCAGGA GGATCCCAAT GAAG 配列番号： 20
配列の長さ： 22
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の觀：他の核酸 合成 DNA ϋ
TGACCGGGAT CCGGGCATGC AG 配列番号： 21
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の ：他の核酸 合成 DNA
CGCGTCGTCT AGAGGHGTC ACTT 配列番号： 22
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の 他の核酸 合成 DNA 配列
CCCTATTGGG GTCCATGGCC C 配列番号： 23
SS^iJの長さ ： 22
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の,：他の核酸 合成 DNA
CAACTGCTGG CATCCTCAGT GA 配列番号： 24
配列の長さ ： 30
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の TO:他の核酸 合成 DNA 配列
GCGGATCCAT GAAGCTATCA AATGCAATCA 配列番号： 25
配列の長さ ： 26
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GCGGATCCH ACCGAGCCCA AGTGCC 配列番号： 26
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の ：他の核酸 合成 DNA
GCGGATCCAA TGAAGCTCAC CACTACC 配列番号： 21
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GCGGATCCCG GTCAATTTCT CTCC 配列番号： 28
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
GTCACCGCCT GGCGCGATCC G 配列番号： 29
Figure imgf000095_0001
： 19
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
SSJijの ：他の核酸 合成 DNA
GGCACGGAGT GGTCTGGCC 配列番号： 30
配列の長さ ： 24
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CTCCAGTATC AAGGATATGC TGTG 配列番号： 31
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の 他の核酸 合成 DNA CGACCAGTAC AAGCAGGCGG 配列番号： 32
Figure imgf000096_0001
： 21
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
lE^jの ：他の核酸 合成 DNA 配列
TCCAGTATCC GCGATATGCT G 配列番号： 33
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の 他の核酸 合成 DNA 配列
CGGCACGGAG GTTTCTGGCC TGC 配列番号： 34
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
CGGCACGGAG GAGTCTGGCC TGC 配列番号： 35
配列の長さ ： 23
配列の型 ·.核酸
卜ポロジ一：直鎖状
配列の 他の核酸 合成 DNA 配列
CGGCACGGAG GAHCTGGCC TGC

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列またはその相同体をコード する DN A配列を含んでなる、 DNA断片。
2. 配列表の配列番号 2に示される塩基配列を含んでなる、 請求項 1記載の
DNA»T -0
3. 配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列またはその相同体をコード する、 DNA0
4. 配列表の配列番号 2に示される塩基配列を有する、 請求項 3記載の D N
5. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列またはその相同体を含んで なる、 ポリペプチド。
6. 請求項 3または 4に記載の DN Aがプラスミ ドベクターに組み込まれて なる、 組換えプラスミ ド。
7. 請求項 6の組換えプラスミ ドによって形質転換された、 宿主細胞。
8. 請求項 7記載の宿主細胞を培養し、 その宿主および Zまたはその培養物 から /3—フルクトフラノシダ一ゼを採取する工程を含んでなる /3—フルク トフラ ノシダーゼの製造法。
9. 請求項 7記載の宿主細胞または請求項 8で得られた ;3—フルクトフラノ シダーゼと、 スクロースとを接触させる工程を含んでなる、 フラク トオリゴ糖の 製造法。
1 0. 配列表の配列番号 2記載の塩基配列またはその一部を含んでなる塩基 配列との相同性を利用することによって、 —フルクトフラノシダーゼ遗&^を 単離する方法。
1 1. /9一フルクトフラノシダーゼ遺伝子が含まれると予想される遗&?ラ イブラリーを用意する工程と、
配列表の配列番号 2記載の塩基配列またはその一部を含んでなる ¾S配列を用 いて前記遗 ライブラリ一をスクリ一二ングし、 前記配列表の配列番号 2記載 の塩基配列またはその一部を含んでなる 配列とハイブリダイズする配列を遠 fe?ライブラリーから選択し、 その後選択された配列を単離する工程と、 そして 遗 fe^ライブラリーから選択、 単離された配列から、 0—フルクトフラノシダ 一ゼ遠 を単離する工程と
を含んでなる、 請求項 1 0に記載の方法。
1 2. 遗 ラィブラリ一が染色体ライブラリーまたは c D N Aライブラリ —である、 請求項 1 1記載の方法。
1 3. 配列表の配列番号 2記載の塩基配列またはその一部を含んでなる塩基 配列からなるプライマーを用意する工程と、
前記プライマーを用い、 一フルクトフラノシダーゼ遗 fe^が含まれると予想 されるサンプルを鋒型とした P C Rを する工程と、 そして 増幅された PCR産物から、 ^一フルクトフラノシダーゼ遗^を単離するェ 程と
を含んでなる、 請求項 10に記載の方法。
14. β—フルク卜フラノシダーゼ遗伝子が含まれると予想される遗 fe?ラ イブラリーまたは 一フルクトフラノシダーゼ遺伝子が含まれると予想されるサ ンプルが、 真菌類由来である、 請求項 11〜13のいずれか一項に記載の方法。
15. 真菌類がァスペルギルス厲、 ベニシリゥム属、 またはスコブラリオプ シス属である、 請求項 14記載の方法。
16. 配列表の配列番号 11記載のァミノ酸配列またはその相同体を含んで なる、 ポリペプチド。
17. 請求項 16に記載のポリペプチドをコードする、 DNA。
18. 配列表の配列番号 12記載の塩基配列を含んでなる、 請求項 17に記 載の DNA。
19. 配列表の配列番号 13記載のァミノ酸配列またはその相同体を含んで なる、 ポリペプチド。
20. 請求項 19に記載のポリペプチドをコードする、 DNA。
21. 配列表の配列番号 14記載の塩基配列を含んでなる、 請求項 20に記 載の DNA。
22. ァスペルギルス厲に厲し、 かつ |S—フルクトフラノシダーゼ活性を示 さない、糸伏菌。
23. 親ァスペルギルス属糸状菌の染色体 DN A上の /3—フルクトフラノシ ダーゼ遗 の一部または全部が欠失させることによって、 β—フルクトフラノ シダーゼ活性を示さない、 請求項 22に記載の糸状菌。
24. ァスペルギルス ·二ガーである、 請求項 23に記載の糸状菌。
25. ァスペルギルス ·二ガー N I A 1602株 （F ERM BP— 585 3) である、 請求項 24に記載の糸状菌。
26. S—フルクトフラノシダーゼをコ一ドする DNAを含んでなる DNA 構築物によって請求項 22〜25のいずれか一項に記載の糸状菌を形 換し、 その形 換体を培養し、
その形 換体および Zまたはその培養物から /9一フルクトフラノシダーゼを する工程を含んでなる、 /3—フルクトフラノシダーゼの製造法。
27. 親 ーフルクトフラノシダーゼを変異させた結果得ることができるフ ルクトース転移活性を有する 9一フルクトフラノシダーゼ変異体であって、 変異が、
親S—フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列において、 1個または 個 のアミノ酸の揷入、 置換、 または欠失、 若しくはその一方または両 への であり、 かつ
スクロースを基質として /3—フルクトフラノシダ一ゼ変異体のフルクトース転 移反応を利用して生成されるフラクトオリゴ糖の成分組成を、 親 /S—フルクトフ ラノシダーゼの場合の組成と異なるものとなるようにするものである、
;3—フルク トフラノシダーゼ変異体。
2 8. 変異が、 フラクトオリゴ糖の のうち 1—ゲストースの生成の選択 性および Zまたは効率性を向上させるものである、請求項 2 7に記載の /5 -フル ク トフラノシダーゼ変異体。
2 9. 親 ;3—フルクトフラノシダーゼが真菌類由来のものである、請求項 2 7または 2 8に記載の /3—フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 0. 親 yS—フルク トフラノシダーゼがァスペルギルス属、 ぺニシリウム属、 スコブラリオプシス属、 オーレォバシジゥム属、 またはフザリウム属由来のもの である、請求項 2 9に記載の —フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 1. 親/ S—フルクトフラノシダーゼが配列表の配列番号 1記載のアミノ酸 配列からなる /3—フルクトフラノシダーゼまたはその相同体である、 請求項 3 0 に記載の ;3—フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 2. E ^表の配列番号 1記載のァミノ酸配列中の 1 7 0、 3 0 0、 3 1 3、 および 3 8 6番目のァミノ酸からなる群から選択される 1個または 2個以上のァ ミノ酸残基、 または IS ^表の配列番号 1記載のァミノ酸配列の相同体において前 記ァミノ酸に相当する位置のァミノ酸からなる群から選択される 1個または 2個 J¾±のアミノ酸残基が、 他のアミノ酸残基により置換されてなる、 請求項 3 1に 記載の /3—フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 3.
Figure imgf000103_0001
記載のァミノ酸配列中の 1 7 0番目のアミノ酸ま たはそれに相当する位置のアミノ酸が、 トリブトファン、 フユ二ルァラニン、 お よびチロシンからなる群から選択される芳香族アミノ酸に置換されてなる、 請求 項 3 2に記載の 一フルクトフラノシダ一ゼ変異体。
3 4. 配列表の配列番号 1記載のァミノ酸配列中の 3 0 0番目のアミノ酸ま たはそれに相当する位置のアミノ酸が、 トリブトファン、 バリン、 グルタミン酸、 およびァスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸に置換されてなる、 請 求項 3 2に Bi¾の 3—フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 5.
Figure imgf000103_0002
1記載のァミノ酸配列中の 3 1 3番目のァミノ酸ま たはそれに相当する位緩のアミノ酸が、 リジン、 アルギニン、 およびヒスチジン からなる群から選択される i!S性アミノ酸に置換されてなる、 請求項 3 2に記載 の 9一フルクトフラノシダーゼ変異体。
3 6.
Figure imgf000103_0003
記載のァミノ酸配列中の 3 8 6番目のアミノ酸ま たはそれに相当する位 11のアミノ酸が、 リジン、 アルギニン、 およびヒスチジン からなる群から選択される塩基性アミノ酸に置換されてなる、 請求項 3 2に記載 の β—フルクトフラノシダーゼ変異体 0
3 7. Β2 ^表の配列番号 1記載のァミノ酸配列中の 1 7 0、 3 0 0、 および 3 1 3番目のアミノ酸またはそれに相当する位置のアミノ酸が、 それぞれトリプ トフアン、 トリブトファン、 およびリジンに置換されてなる、 請求項 3 2に記載 の iS—フルク トフラノシダーゼ変異体。
3 8. 配列表の配列番号 1記載のァミノ酸配列中の 1 7 0、 3 0 0、 および 3 1 3番目のア ミノ酸またはそれに相当する位置のァミノ酸が、 それぞれトリプ トフアン、 ノ<リン、 およびリジンに置換されてなる、 請求項 3 2に記載の —フ ルク トフラノシダーゼ変異体。
3 9. 請求項 2 7〜 3 8のいずれか一項に記載の 3—フルクトフラノシダ一 ゼ変異体をコードする、 D N A。
4 0. 請求項 3 9にき H«の D N Aを含んでなる、 9一フルクトフラノシダ一 ゼ変異体発現ベクター。
4 1. 請求項 4 0に記載の発現べクタ一を含んでなる、 宿主細胞。
4 2. 宿主細胞が請求項 2 2〜2 5のいずれか一項に記載の糸状菌である、 請求項 4 1記載の宿細胞。
4 3. 請求項 2 7〜 3 8のいずれか一項に記載の iS—フルクトフラノシダー ゼ変異体の製造法であって、
請求項 3 9に記載の D N Aまたは請求項 4 0に記載の発現ベクターによって、 宿主細胞を形 ®IS換し、
その形質転換体を培養し、
その形 換体および Zまたはその培養物から 5一フルクトフラノシダーゼを 採取する工程を含んでなる、 ）5—フルク トフラノシダ一ゼ変異体の製造法。
4 4. 宿主細胞が請求項 2 2〜2 5のいずれか一項に記載の糸状菌である、 請求項 4 3に記載の /3—フルクトフラノシダ一ゼ変異体の製造法。
4 5. 請求項 4 1または 4 2に記載の宿 ¾^胞または請求項 2 7〜3 8のい ずれか一項に記載の ーフルク卜フラノシダーゼ変異体と、 スクロースとを接触 させる工程を含んでなる、 フラクトオリゴ糖の製造法。
4 6. 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の D N A断片又は D N Aによって 形 ΚΙδ換された、 請求項 2 2〜2 5のいずれか一項に記載の糸状菌。
4 7. 請求項 4 6に記載の糸状菌を培養し、 その糸状菌および Ζまたはその 培養物から 9一フルクトフラノシダーゼを採取する工程を含んでなる、 j3 -フル クトフラノシダーゼの製造法。
4 8. 請求項 1 7または 2 0に記載の D N Aによって形質転換された、 請求 項 2 2〜2 5のいずれか一項に記載の糸状菌。
4 9. 請求項 4 8に記載の糸状菌を培養し、 その糸状菌および Zまたはその 培養物から /3—フルクトフラノシダーゼを採取する工程を含んでなる、 ；0—フル クトフラノシダーゼの製造法。
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