WO1994008030A1 - PROCESS FOR PRODUCING D-α-AMINO ACID - Google Patents

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WO1994008030A1
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enzyme
arg
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PCT/JP1993/001408
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Hideaki Yamada
Sakae Shimizu
Yasuhiro Ikenaka
Kazuyoshi Yajima
Yukio Yamada
Hirokazu Nanba
Masayuki Takano
Satomi Takahashi
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Kanegafuchi Chemical Industry Co., Ltd.
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Definitions

  • the present invention has the general formula:
  • R phenyl group substituted phenyl group, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted, preferably an alkyl group or Choi two Le group having 1 to 5 carbon atoms
  • decarbamylase An enzyme having the ability to remove a levulinyl group (hereinafter referred to as "decarbamylase”) is acted on a DN-amino acid represented by the general formula:
  • Such optically active D-monoamino acids are important compounds as pharmaceutical intermediates, and in particular, D-phenylglycine and D- (4- (4) -intermediate during the production of semisynthetic penicillin and semisynthetic cephalosporin.
  • Hydroxyphenyl) glycine hereinafter referred to as “D-HPGJ”) and the like are mentioned as industrially useful compounds.
  • D-HPGJ Hydroxyphenyl) glycine
  • a method for producing D- ⁇ -amino acids there is known a method for obtaining the D- ⁇ -amino acid by removing the corresponding L-amino acid-lebamil group.
  • the removal of the substance can be carried out by a chemical method (see Japanese Patent Publication No. 58-4707) or a method using an enzymatic reaction of a microorganism (Japanese Patent Publication No. 57-18793, Japanese Patent Publication No. No. 0250 and Japanese Patent Publication No. Hei 11-48757).
  • D The DL-5-substituted hydantoin corresponding to one amino acid is selectively hydrolyzed to the D-form by the action of an enzyme to obtain ⁇ -force rubamyl-D- ⁇ -amino acid, followed by the action of decarbamylase
  • the optimal ⁇ of the first-stage hydantoin hydrolase was in ⁇ 8-9, so it was necessary to perform the reaction in a different reaction system from the second-stage decarbamylase.
  • the inventors of the present invention act on DN-potassium amino acids to enzymatically remove them and convert them to D- ⁇ -amino acids (hereinafter, referred to as “depotted rubamyl”).
  • depotted rubamyl D- ⁇ -amino acids
  • the present invention provides a compound represented by the general formula (I): R-CH-COOH
  • R represents a phenyl group, a phenyl group substituted with a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted alkyl group having preferably 1 to 5 carbon atoms, or a phenyl group.
  • an enzyme produced by microorganisms is allowed to act on N-potassium
  • Enzymes that convert N-potassium-D-one amino acid to D-one amino acid As decarbamylase, the genus Comamonas, the genus Blastobacter, the genus Alcaligenes, the genus Sporosarcina, and the lysozyme
  • the present invention provides a method for producing a D- ⁇ -amino acid, which comprises using an enzyme that can be produced by a microorganism belonging to the genus (Rhizobium), the genus Bradyrhizobium or the genus Arthrobacter.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the weakened lubamil reaction at 50 ° C. and 30 ° C. of the strains obtained by the new screening.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of a compound added during the culture of Comamonas sp. E222C on the production of decarbamylase.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the purified decarbamylase of Comamonas sp. E222C by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Fig. 4 is a graph showing the results of gel filtration of purified decarbamylase of Comamonas sp. E222C using a Sephadex G-150 column.
  • Figure 5 is a graph showing the results of examining the effect of anti-latency time of P H using Comamonas sp. E 2 2 2 C purification decarbamylase.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of examining the effect of temperature during the reaction using purified decarbamylase of Comamonas sp. E222C.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of a compound added during the culturing of Blastpactor sp. A17 p-4 on decarbamylase production.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of metal ions added during the cultivation of blast pacter sp. A17 p-4 on decarbamylase production.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the purified decarbamylase of Blastpactor sp. A17 p-4 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of gel filtration of blastpacter sp. A17p-4 purified decarbamylase using a Sephadex G-150 column.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of examining the effect of pH during the reaction using blastpacter sp. A17p-4 purified decarbamylase.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of examining the effect of temperature during the reaction using blastpacter sp. A17p-4 purified decarbamylase.
  • the decarbamylase used in the present invention may be one that specifically acts on the D-isomer or an enzyme that acts on either the D-isomer or the L-body.
  • An enzyme with severe stereoselectivity for DN-l-rubamyl-amino acid is sometimes called DN-l-rubamyl-unique amino acid amide hydrolase.
  • the orchid strains having relatively high weakened lubamil activity include Comamonas sp. E 222 C (FERM BP No. 4411, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Ichihigashi 1-chome 1-3 (zip code 305), September 18, 1992), Comamonas sp. E 206a, Comamonas sp. E 217a, Blastpactor sp. NA88—b, Blastpactor sp. Al 7p- 4 (FERM BP No.
  • NCA28-b Rhizobium sp. KNK1415
  • Arslobacta-sp. CA17-2 The bacteriological properties of NCA28-b, Rhizobium sp. KNK1415 and Arslobacta-sp. CA17-2 are shown below.
  • Colony morphology pale yellow, slightly translucent, round, regular, round-low convex, shiny, smooth, lmm (48 hr) in diameter
  • Colony morphology Slightly yellowish white, dull, perfectly round.
  • Colony morphology Slightly yellowish white, matte, round, uniform, convex, smooth, about 0.5 strokes in diameter (2 days)
  • D-amino acids such as D-p-hydroxyphenylglycine and D-phenylglycine; N-force rubamyl-DL-methionine; N-force rubamyl-D-phenylamine; N-force rubamyl-amino acids such as D-phenylalanine 5-substituted hydantoins such as DL-5-p-hydroxyphenylhydantoin and DL-5-phenylhydantoin; pyrimidine metabolites such as peracyl, dihydrouracil, and y5-ureidopropionic acid; Fe2 + , Fe It is preferable to add a small amount of metal ions such as 3+ , Be 2+ , Co 2+ , Al 3+ , Li +, Mn 2+ , Mg 2 ⁇ Cs +; urea, etc. to enhance and accumulate decarbamylase.
  • concentration of these decarbamylase production enhancing substances in the medium is selected from the range
  • the temperature during cultivation is in the range of 20 to 85 ° C, and the pH is in the range of 4 to 11, and the growth of microorganisms can be promoted by aeration and stirring.
  • the culture solution, cells or treated cells of the microorganism can be obtained as described above.
  • the cells can be used as they are, of course, but they can be used as dried cells such as freeze-dried cells, cell lysates or cell extracts, surfactants or ultrasonics.
  • the treated bacterial cell can be used as a microbial enzyme source in the reaction of the present invention.
  • the enzyme can be used in the form of an enzyme obtained by purifying or partially purifying an enzyme from a crushed product, an extract or a processed product of these cells, or a crude enzyme.
  • these enzymes or crude enzymes can be immobilized and used as immobilized enzymes.
  • the immobilization method for example, the immobilization method of International Patent Application PCT / JP91 / 01696 can be used.
  • enzymes produced from these microorganisms by genetic manipulation are basically equivalent to the enzymes that can be produced by the microorganism.
  • the weakened lubamil reaction is carried out in an aqueous medium, and its pH is used in the range of 6 to 11, and particularly preferably pH 7 to 9.5. In addition, some enzymes have an optimal pH between pH 8-9.
  • the temperature of the weakened lubamil reaction is usually in the range of 20 to 85 ° C, but a temperature suitable for the enzyme system of the strain to be used is adopted.
  • examples of the N-potassium-rubamyl-D-monoamino acid compound serving as a substrate for decarbamylase include DN-potassium-rubamylalanine, DN-potassium-rubamylmethionine, DN-potassium-rubamylparin, — N—potassium luleucine, D—N—potassium lysylglycine, D—N—potassium mono (4-hydroxyphenyl) glycine, D—N—potassium lubamil-1- (2-phenyl) glycine, D — N-potassium rubamylphenylalanine and the like.
  • —R in the general formula in the case of a substituted alkyl group, includes a phenyl group, an indolyl group, an alkylthio group, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and the like.
  • D produced by the weakened lubamil reaction by microbial enzymes as described above
  • the isolation of the amino acids can be performed by a known method such as concentration, neutralization, and treatment with an ion exchange resin. That is, in the case of relatively hydrophobic D-amino acids such as D-fuunyl glycine, D- (4-hydroxyphenol) glycine, D-mouth isine and D-phenylalanine, acidic Alternatively, the desired D-amino acid can be obtained as a precipitate by removing the insolubles in the form of alcohol and concentrating and neutralizing.
  • the target substance is adsorbed by ion exchange resin, and this is eluted with ammonia water and the like.
  • the desired product can be obtained by neutralizing and concentrating.
  • the N-potassium-rubamyl-D-amino acid compound serving as a substrate for these decarbamylases can be obtained by converting a culture solution of microorganisms of various species, bacterial cells, a processed bacterial cell, or an enzyme extracted from the bacterial cells into 5-substituted hydantoins. And can be manufactured.
  • Such a manufacturing method is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Sho 53-44690, Sho 53-69884, Sho 53-911189, and This is described in Japanese Unexamined Patent Application Publication No. Sho 533-133868, Japanese Patent Application Laid-Open No. 54-84086, Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-701, and the like.
  • D-potamyl monoamino acids are converted to the corresponding bioactive D-amino acids by the method of the present invention.
  • Soil sample the (collecting place names collected from various parts of Japan), the medium of 2ml A (lg / 1 KH 2 P0 4, lg / 1 K 2 HP0 4, 0. 3gZl MgS_ ⁇ 4 ⁇ 7H 2 0, 0. lgZl yeast extract , NH 4 C1, the compounds described below using as a 1. 5 g / l carbon source (PH7. 0)), or medium B (lgZl KH 2 P0 4, lg / 1 K2HPO4. 0. 3 / l MgS0 4 ' 7H 2 0, 0. 5g / l glucose, 0.1 yeast extract, 1. compounds of the mounting serial below used as 5gZl nitrogen source (PH7.
  • Comamonas sp. E 222 C was used at 28 ° C using the medium C described in Example 2.
  • the blast pacter sp. Al 7 P-4 was cultured with shaking for 1 day or 7 days. Centrifuge 3 ml of the culture solution, suspend the cells in 300 1 reaction solution (200 mM potassium phosphate buffer solution, 1% (WZV) of various reaction substrates), and incubate at 30 with Comamonas sp. The reaction was performed at 50 ° C. for 24 hours with Blastpactor sp. A 17 P-4.
  • both cells showed strong hydrolytic activity of aliphatic and aromatic D-amino acids against N-terminal rubamil, but N-terminal rubamil of amino acid having a polar group. Activity was low.
  • Comamonas sp. E 222 C was able to hydrolyze yS-peridopropionic acid, and Blastobacter -sp.
  • a 17 P-4 also showed hydantoinase activity.
  • Medium is a nutrient medium D (lg / 1 KH 2 P0 4, lgZl K 2 HP0 4, 0. 3g / l MgS0 4 * 7H 2 0, 3gZl yeast extract, 3GZl meat extract, 1 Og / 1 glycerol, 2GZl polypeptone ( PH7.0)), the compound shown in Fig. 2 was added at a concentration of 0.15% (w / v), and the bacteria were inoculated and cultured with shaking at 28 ° C for 2 days.
  • D a nutrient medium D (lg / 1 KH 2 P0 4, lgZl K 2 HP0 4, 0. 3g / l MgS0 4 * 7H 2 0, 3gZl yeast extract, 3GZl meat extract, 1 Og / 1 glycerol, 2GZl polypeptone ( PH7.0)
  • Comamonas sp. E 222C was cultured at 28 ° C in the medium D described in Example 4 supplemented with 5-ureidopropionic acid (0.15% (wZv)) for 3 days to give a total of 3.61
  • the cells were suspended in 100 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), disrupted by ultrasonication, and the residue was removed by centrifugation. While adding ammonium sulfate to the crude enzyme solution, the ammonium sulfate precipitation fraction at a concentration of 20% to 40% of the saturation concentration was separated by centrifugation and dissolved in the above buffer solution.
  • This concentrated solution (5 ml) was subjected to gel filtration using the Sephacryl S-200 HR column (01.8 x 80 cm) in the above buffer containing 0.2 M NaCl, and the active fraction was desalted by dialysis. After that, adsorb to hydroxyapatite column (01.2 x 10 cm), and use 0 ⁇ 1M potassium phosphate buffer.
  • the active fraction (8.5 ml) was dialyzed for 12 hours against 500 ml of a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) for elution with a linear concentration gradient of (pH 7.0). This was adsorbed to a Mono Q HR 5Z5 column, eluted with a linear concentration gradient of 0 to 1.0 M NaCl, and this active fraction (1.2 ml) was used as a purified enzyme solution for analysis.
  • the reaction optimum pH was measured by the following method.
  • a buffer concentration: 20 OmM
  • the quantification of the produced D-phenylalanine was performed using 20 OmM potassium phosphate buffer solution (pH 7.0), 1.5 mM 4-aminoantipyrine, 2. ImM phenol, 2.25 u peroxidase (from horseradish, Calzam ').
  • One part of the above enzyme reaction solution was added to a reaction solution containing a laboratory (manufactured by CALZYME Lab.) And 0.375 units of D-amino acid oxidase (manufactured by Sigma) (final volume: 500 ⁇ 1).
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes and the increase in absorbance at 50 Onm was measured.
  • the optimum reaction temperature is the same as the above using a potassium phosphate buffer solution (pH 7.0), and the reaction is performed at 10 ° C to 80 ° C for 20 minutes. Phenol method [Bollter, WT Et al., Analytical Chemistry, Vol. 33, 592-594 (1961)).
  • the amino sequence of the amino terminus of the decarbamylase protein was determined.
  • the enzyme solution was desalted using a Centricon-10 microcentrifuge (manufactured by Amicon), charged to a pulse-type liquid phase protein sequencer, and analyzed.
  • the sequence of the amino terminus of the decarbamylase protein was
  • a 17P-4 strain We searched for an enzyme-enhancing substance that increases the production of decarbamylase when culturing Blastobacter sp. A 17P-4 strain.
  • the compound shown in FIG. 7 was added to the same medium D as used in Example 4 in 0.1 S ⁇ CwZ.
  • Example 4 HPLC was used to determine the amount of D-HPG produced at a reaction temperature of only 40 ° C, and as shown in Fig. 7, when peracyl, dihydrouracil or; 5-peridopropionic acid was added, decarbamylase was added. Was found to increase production.
  • 0.15% (wZV) of peracil was added to medium D, and the metal ions shown in Fig. 8 were added at a concentration of 2 mM, and this medium was inoculated. After shaking at 28 ° C for 4 days. Then, when the generated D—HPG was quantified, as shown in FIG. 8, Fe 2+ , Fe 3+ , Li +, Cs ⁇ Be 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Co 2+ , Al 3+ It was found that the addition of such ions increases the production of decarbamylase.
  • the enzyme solution (41 ml) was dialyzed against 51 of the above buffer solutions for 12 hours, and purified using a DE A ⁇ -Sephacel column and a Fenu-Sepharose CL-16B column according to the method described in Example ⁇ . Concentrated by filtration. Separate this concentrated solution (3 ml) in the above buffer containing 0.2 M NaCl. Gel filtration was performed using a Dex G-150 column ( ⁇ 1.580 cm), the active fraction was desalted by dialysis, and purified using a mono QHR55 column according to the method described in Example 5 to obtain an active fraction. (2 ml) was used for analysis as a purified enzyme solution. As a result of the above purification operation, as shown in Table 3, the specific activity was improved 37-fold compared to the cell lysate supernatant, and the enzyme activity recovery rate at that time was 2.3% .c
  • Example 9 Using an enzyme solution obtained in Example 9 were examined blast Park coater sp. A17P- 4 optimum reaction P H and the optimum reaction temperature of deca Rubamiraze. In each case, the reaction was performed according to the method described in Example 6. These results are shown in FIGS. 11 and 12. The optimum pH of Blastobacter sp. A 17p-4 decarbamylase was 9 and the optimum reaction temperature was 50 ° C.
  • Table for Rizobiumu genus and Brady Rizobiumu genus strains 7 strains of 4, 805 liquid medium 1 ml (yeast extract lg / l, mannitol 5g / l, K 2 H P0 4 0.7g / l, KH 2 P0 4 0. 1 g / Mg S0 4 ⁇ 7H 2 0 lg / l, C -D-HPG lg / 1 (pH7.0)) to the medium supplemented with C one D-HPG or C one D-Ala in a final concentration of 1 g / 1
  • the cells were inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the bacteria are collected by centrifugation and suspended in 0.5 ml of 1% CD-HPG or C-D-Ala, 0.1 MK-phosphate buffer (pH 7.0), 0.1% triton X-100. It became cloudy. After reacting for 24 hours while shaking at 37 ° C, analysis was performed by thin-layer chromatography according to the method described in Example 1. As shown in Table 4, it was found that the strain of Bradyrhizobium had weakened rubamil activity.
  • Soil was further screened by the method described in Example 1. Screening was performed for N-forced Lubamil-D-mouth isine (C-D-Leu), N-forced Lubamil-D-alanine (C-D-Ala), N-forced Lubamil-D-phenylglycine (C-D- PG) or DL-5-methylhydantoin (DL-Ala-hyd) was used as a carbon source or a nitrogen source. As in Example 12, the weakened rubamil activity was examined using CD-Ala and CD-HPG for 9 of the grown bacteria. As shown in Table 5, as shown in Table 5, there were a strain having higher activity against CD-HPG and a strain having higher activity against CD-Ala.
  • the rhizobime sp.KNK1415 obtained in Example 3 was added to 101 SE medium (sucrose 23 g 1, yeast extract 4 gZl, urea 2 gZl, KH 2 P0 4 2 g / Na 2 HPO 4 2 1, was inoculated into MgS 0 4 ⁇ 7 H 2 0 1 g / 1, MnCl 2 ⁇ 4H 2 0 0.0 lg / l (pH6.5)), at 30 ° C
  • the cells were cultured with shaking for 40 hours. The cells were collected by centrifugation, washed with 0.9% saline, disrupted by ultrasonic waves, and the residue was removed by centrifugation.
  • the nucleic acid was removed by protamine sulfate treatment (0.1 mg Zmg protein). Then, the centrifuged supernatant was heat-treated at 50 ° C for 30 minutes, and the denatured protein was removed by centrifugation, and ammonium sulfate was added to achieve 30% saturation. The precipitate is collected by centrifugation, dissolved in 500 ml of 2 OmM TrisHC1 (pH 7.5), 2 mM DTT, dialyzed against the same buffer, adsorbed on a DEAE cellulose column, and 10 mM Na-phosphate buffer. (PH 7.2), eluted with 0.15 M NaCl, and lmM DTT. The eluate was concentrated by ultrafiltration using a YM-10 membrane (Amicon). When this enzyme solution was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, this decarbamylase was electrophoresed at around 35,000.
  • the gel of the decarbamylase band was cut out from the SDS-polyacrylamide gel obtained by analyzing the decarbamylase obtained in Example 14, and the elution buffer (5 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1% SDS, 0.1% ImM EDTA , 15 OmM NaCl, 5 mM DTT) and eluted at room temperature.
  • the extract was concentrated by ultrafiltration, charged to a reversed-phase HPLC column (AP-303; manufactured by YMC), and eluted with an acetonitrile concentration gradient.
  • the fraction containing decarbamylase was charged to a gas-phase protein sequencer (manufactured by Applied Biosystems) and analyzed. 1 5 10

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Description

D—な一アミノ酸の製造法
産業上の利用分野
本発明は、 一般式：
*
R-CH-C00H
NH-C-NH2
明 II
0
[式中、 Rはフエニル基、 水酸基で置換されたフエニル基、 置換または 未置換の、 好ましくは炭素数 1〜5のアルキル基またはチェ二ル基を示す ( 書
]
で表わされる D— N—力ルバミル一 一アミノ酸に、 力ルバミル基を除去 する能力を有する酵素 （以下、 「デカルバミラーゼ」 と言う。 ） を作用さ せ、 一般式：
*
R-CH-C00H NH2
[式中、 Rは前記と同意義である。 ]
で表わされる D— 一アミノ酸を製造する方法に関する。
このような光学活性な D— 一アミノ酸類は、 医薬中間体として重要な 化合物であり、 特に半合成ペニシリ ン、 半合成セファロスポリ ンの製造中 間体としての、 D—フヱニルグリシンや D—（4ーヒドロキシフヱニル）グ リシン （以下、 「D— HPGJと言う。 ) 等が工業的に有用な化合物として 挙げられる。 従来の技術
D— α—アミノ酸類の製造法としては、 対応する D— Ν—力ルバミル— 一アミノ酸類の力ルバミル基を除去して、 これを得る方法が知られてお り、 この際の力ルバミル基の除去は、 化学的方法 （特公昭 5 8— 4 7 0 7 号公報参照） や微生物の酵素反応を利用する方法 （特公昭 5 7 - 1 8 7 9 3号公報、 特公昭 6 3 - 2 0 5 2 0号公報および特公平 1一 4 8 7 5 8号 公報参照） によって行われている。
しかし、 これらの微生物の酵素は、 中性付近に至適 ρΗをもつものが多 い。 D— 一アミノ酸に対応する D L— 5—置換ヒダントインを、 酵素の 作用により D—体を選択的に加水分解して Ν—力ルバミル— D— α—アミ ノ酸を得、 続いてデカルバミラーゼを作用させて D— 一ァミノ酸を得る 反応では、 第 1段階のヒダントイン水解酵素の至適 ρΗが ρΗ 8〜 9にある ため、 第 2段階のデカルバミラーゼとは異なる反応系で行う必要があつた。 発明の要約
本発明者らは、 D— N—力ルバミル一ひ一アミノ酸類に作用して酵素的 に力ルバミル基を除去して D— α—アミノ酸類に変換させる （以下、 「脱 力ルバミル」 と言う。 ） 能力を有する微生物について、 従来デカルバミラ ーゼの存在が知られていない属を中心に種々検討した結果、 コマモナス ( C omamonas)属、 ブラス卜ノくク夕一 ( B lastobacter) "7ノレカリゲ ネス （A lcaligenes) 属、 スポロサルシナ （ S porosarcina) 属、 リゾビ ゥム （Rhizobium) 属、 ブラディ リゾビゥム （ B radyrhizobium) 属また はァルスロパクター （Arthrobacter) 属に属する細菌類に脱力ルバミル 活性が存在することを見い出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 一般式 （I ) ： R-CH-COOH
NH-C-NH2
II
0
[式中、 Rはフエニル基、 水酸基で置換されたフエニル基、 置換または 未置換の、 好ましくは炭素数 1〜5のアルキル基、 もしくはチェ二ル基を 示す。 ]
で表わされる N—力ルバミル一 D— 一アミノ酸に、 水性媒体中で、 微生 物の産生する酵素を作用させ、
一般式 （II) ：
氺
R-CH-C00H NH2
[式中、 Rは前記と同意義である。 ]
で表わされる D—な一アミノ酸を製造する方法において、
N—力ルバミル一 D— 一アミノ酸を D— 一アミノ酸に変換する酵素 デカルバミラーゼとして、 コマモナス （Comamonas) 属、 ブラストバクタ 一 (Blastobacter) 属、 アルカリゲネス （ Alcaligenes) 属、 スポロサ ルシナ （ S porosarcina) 属、 リゾビゥム （Rhizobium) 属、 ブラディ リ ゾビゥム （ B radyrhizobium) 属またはァルスロバクタ一 （Arthrobacter) 属に属する微生物が産生することのできる酵素を用いることを特徴とする D— α—アミノ酸の製造法を提供する。
図面の簡単な説明
図 1は、 新規スクリーニングによって取得した株の 50°Cと 30°Cでの 脱力ルバミル反応の結果を示すグラフである。 図 2は、 コマモナス sp. E 2 2 2 Cの培養時に添加した化合物のデカル バミラーゼの生産に及ぼす影響を示すグラフである。
図 3は、 コマモナス sp. E 2 2 2 Cの精製デカルバミラーゼを S D S— ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により分析した結果を示す。
図 4は、 コマモナス sp. E 2 2 2 Cの精製デカルバミラーゼを、 セファ デックス G— 1 5 0カラムによって、 ゲル濾過した結果を示すグラフであ 0
図 5は、 コマモナス sp. E 2 2 2 Cの精製デカルバミラーゼを用いて反 応時の PHの影響を調べた結果を示すグラフである。
図 6は、 コマモナス sp. E 2 2 2 Cの精製デカルバミラーゼを用いて、 反応時の温度の影響を調べた結果を示すグラフである。
図 7は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4の培養時に添加した化合物 のデカルバミラーゼ生産に及ぼす影響を示すグラフである。
図 8は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4の培養時に添加した金属ィ オンのデカルバミラ一ゼ生産に及ぼす影響を示すグラフである。
図 9は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4の精製デカルバミラーゼを S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により分析した結果を示す。 図 1 0は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4精製デカルバミラーゼを、 セフアデックス G— 1 5 0カラムによってゲル濾過した結果を示すグラフ である。
図 1 1は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4精製デカルバミラーゼを 用いて、 反応時の pHの影響を調べた結果を示すグラフである。
図 1 2は、 ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4精製デカルバミラーゼを 用いて、 反応時の温度の影響を調べた結果を示すグラフである。
発明の詳細な説明 本発明で使用するデカルバミラーゼは、 D—異性体に特異的に作用する ものであっても、 D—体、 L一体いずれに作用する酵素であっても、 実際 上差し支えない。 なお、 D— N—力ルバミル一 一アミノ酸に対する立体 選択性の厳しい酵素は、 D— N—力ルバミル一な一アミノ酸アミ ドヒ ドロ ラーゼと呼ばれることがある。
これらの微生物の中で脱力ルバミル活性が比較的高い蘭株としては、 コ マモナス sp. E 222 C (FERM BP第 4411号， 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所， 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 (郵便番号 305), 平成 4年 9月 18日） 、 コマモナス sp. E 206a、 コマモナス sp. E 217a、 ブラストパクター sp. NA88— b、 ブラスト パクター sp. Al 7p-4 (FERM BP第 4410号， 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所， 平成 4年 9月 18曰） 、 アルカリゲネス sp. E215 (FERM BP第 4409号， 通商産業省工業技術院生命 工学工業技術研究所， 平成 4年 9月 18曰） 、 アルカリゲネス，キシロソ 干シタンス subsp. テニ卜リフイカンス ( Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans) CL66— 2 a、 スポロサルシナ sp. N C A 28 -b (FERM BP第 4408号， 通商産業省工業技術院生命工学工業 技術研究所， 平成 4年 9月 24日） 、 リゾビウス sp. KNK1415 (F ERM BP第 4419号， 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究 所， 平成 5年 9月 22日） 、 ブラディ リゾビゥム · ジャポニカム
( B radyrhizobiuni aponicum) I F014783、 ブラディリゾビゥム sp. I F015003、 ァルスロバクタ一 sp. CA17-2 (F ERMBP第 4420号， 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所， 平成 5年 9 月 22曰） などがある。
上記細菌の代表例として、 コマモナス sp. E 222 C. ブラストバクタ 一 sp. A17p— 4、 アルカリゲネス sp. E215、 スポロサルシナ sp.
NCA28— b、 リゾビゥム sp. KNK1415およびァルスロバクタ- sp. CA17— 2の菌学的性質を次に示す。
コマモナス sp. E 222 C
(a)形態的性質
•桿菌 （曲がっている）
•ダラム染色性 バリァブル （Variable)
•胞子の有無 なし
• コロニー形態 淡黄色、 やや半透明、 丸い、 規則的な、 真円の、 輝きのある、 低い凸面の、 滑らかな、 直径 1蘭 ( 48 hr)
各温度での生育 37°C +
(48hr) 41。C
45°C
(b)生理学的性質
カタラーゼ +
ォキシダーゼ
グルコース発酵性
NO 3還元性
ィンドール生成
グルコースからの酸生成
アルギニンデヒドロラーゼ
ゥレアーゼ
エスクリン（Aesculin)加水分解
ゼラチン加水分解
S—ガラク トシダーゼ
チトクロムォキシダーゼ + (弱い）
(c)資化性
グルコース - ァラビノース 一
マンノース 一
マンニトール 一
N—ァセチル グルコサミン ―
マルトース
ダルコン酸 +
カブロン酸 + アジピン酸
リンゴ酸 +
クェン酸 +
フエニルァセテ一ト +
ブラストパクター sp. A 17p- 4
(a) 形態的性質
•桿菌 （卵型）
•グラム染色性 陰性
•胞子の有無 なし
• コロニー形態 白、 やや半透明、 丸い、 規則的な、 真円の、 輝き のある、 低い凸面の、 平滑な、 ムコイ ド生成、 直径 1. 0〜1. 5mmズ 4 8hr)
一 - - - +
各温度での生育 37°C
(48hr) 41°C
45°C
(b) 生理学的性質
カタラーゼ +
ォキシダーゼ + (弱い）
グルコース発酵性
N 03還元性
ィンドール生成
グルコースからの酸生成
アルギニンデヒドロラ一ゼ
ゥレアーゼ +
エスクリン（Aesculin)加水分解 +
ゼラチン加水分解 一
;5-ガラク トシダ-ゼ +
チトクロム才キシダーゼ +
(c) 資化性
グルコース +
ァラビノース +
マンノース +
マンニトール +
N—ァセチルグルコサ ン +
マルトース +
ダルコン酸
カブロン酸 ァジピン酸
リンゴ酸
クェン酸
フエニルァセテ一ト
アル力リゲネス sp. E 215
(a)形態的性質 グラム染色性 バリァブル (Variable)
胞子の有無 なし
勤性 あり
コロニー形態 淡黄色、 やや半透明、 丸い、 規則的な、 真円の- 低い凸面の、 輝きのある、 滑らかな、 直径 lmm ( 48 hr)
•各温度での生育 37°C +
(48hr) 41。C
45°C
(b)生理学的性質
•力タラーゼ +
•ォキシダーゼ 一
'グルコース酷酵性 一 スポロサルシナ sp. N C A 28 -b
(a)形態的性質
•球菌
• グラム染色性 バリアプル (Variable)
•胞子の有無 あり
• ½動¾ なし
• コロニー形態 丸い、 規則的な、 真円の、 クリーム色又は白色、 やや半透明、 直径 0. 5随以下 （48hr)
•各温度での生育 37°C 一
45°C 一
(b)生理学的性質
•カタラーゼ +
•ォキシダーゼ +
•グルコース発酵性
リゾビゥム sp. KNK- 1415 (FERM B P - 4419 )
(a)形態的性質 桿菌 （やや棍棒状の短桿菌）
グラム染色性 陰性
胞子の有無 なし
ベン毛 極付近又は周生
コロニーの形態 やや黄色かかった白色、 光沢のない、 真円の.
大きさのそろった滑らかな、 やや凸面の、 直径 5 mm ( 5日）、 ムコィ ド生成
各温度での成育 3 0。C +
3 7。C (土）
(b) 生理学的性質
•力タラ ゼ +
•ォキシダーゼ +
•グルコース発酵性 一
• N 03還元性 +
•ィンドール生成 一
•グルコースからの酸生成 一
•アルギニンデヒドロラーゼ 一
•ゥレアーゼ +
•エスクリン（Aesculin)加水分解 +
•ゼラチン加水分解 一
• β—ガラク トシダーゼ +
*チトクロムォキシダ一ゼ +
• 3—ケトラク トース生成 一
• H 2 S生成 一
( 資化性
•グルコース +
*ァラビノース +
•マンノース +
•マンニトール +
• N—ァセチルダルコサミン +
•マルトース +
•ダルコン酸 一
•力ブロン酸 一
'アジピン酸 一
• リンゴ酸 +
• クェン酸 一
•フエニルアセテート 一 GC含量 63.4%
キノン分析 Q - 10 95.1%
Q-9 3.3%
Q-l 1 0.6%
Q-8 0.4% 菌体脂肪酸分析
(全菌体脂肪酸）
成分名 面積比 （％)
3-OH C 14 ： 0 4.6
C 16： 1 5.9
C16 ： 0 14.0
3-OH C16 ： 0 0.1
C18： 1 70.7
C18： 0 3.3
不明 1.4
(3— OH脂肪酸）
成分名 面積比 （％)
3-OH C14 ： 0 88.8
3-OH C 16 ： 0 6.6
3-OH C 18： 0 4.6
(2— OH脂肪酸）
検出されず
ァルスロパクター sp. CA 17-2 (FERM BP - 4420)
(a)形態的性質
•桿菌又は球菌
•グラム染色性 陽性
•胞子の有無 なし
•運動性 有り
•コロニー形態 やや黄色かかった白色、 光沢のない、 丸い 大きさのそろった、 凸面の、 滑らかな、 直径約 0.5画 （2日）
•各温度での生育 30 °C +
37°C ( + )
45°C
(b)生理学的性質 ，カタラーゼ +
*ォキシダ一ゼ 一
•グルコース発酵性 一
(C) 化学分類学的分析
•ペプチドグリカンのアミノ酸 L一 Lysine
• ミコール酸 ―
•脂肪酸組成 anteiso C！ 5： 0(12-メチルテトラデカン酸） 58% iso C15:0(13-メチルテトラデカン酸） 5.5% iso C16:0(14 -メチルペンタデカン酸） 8% anteiso C！ 7： 0(14-メチルへキサデカン酸） 25% これらの脱力ルバミル活性を示す酵素系は、 微生物を通常の方法で培養 することにより調製することができる。 培養は、 通常液体栄養培地で行わ れるが、 固体表面培養によっても行うことができる。 培地には、 通常資化 し得る炭素源、 窒素源、 各微生物の生育に必須の無機塩栄養素を含有させ る。 更に D— p—ヒ ドロキシフエニルグリシン、 D—フエニルグリシン等 の D—アミノ酸； N—力ルバミル一 DL—メチォニン、 N—力ルバミル一 D—フエ二ルァラニン等の N—力ルバミル一 ーァミノ酸類； DL— 5— p—ヒ ドロキシフヱニルヒダントイン、 DL— 5—フェニルヒダントイン 等の 5置換ヒダントイン類； ゥラシル、 ジヒドロウラシル、 y5—ウレイ ド プロピオン酸等のピリ ミジン代謝物； Fe2+、 Fe3+、 Be2+、 Co2+、 Al3+、 Li+、 Mn2+、 Mg2\ Cs+等の金属イオン類；尿素などを少量添 加してデカルバミラーゼを増強蓄積させることが好ましい。 これらデカル バミラーゼ生産増強物質の培地中濃度は、 金属イオン類で 0. l〜10m M、 その他の基質で 0. 01〜1重量％の範囲から選ばれる。
培養時の温度としては 20〜85°Cの範囲、 pHとしては 4〜11の範 囲が用いられ、 通気撹拌によつて微生物の生育を促進することもできる。
D— N—力ルバミル一ひーァミノ酸の脱力ルバミル反応においては、 前 記のようにして得ることのできる微生物の培養液、 菌体または菌体処理物 を酵素源として使用する。 菌体は、 生菌体のままで用い得ることは勿論で あるが、 凍結乾燥菌体のような乾燥菌体、 また、 菌体破砕物ゃ菌体抽出物 や、 界面活性剤や超音波で処理した菌体処理物を微生物酵素源として本発 明の反応に利用することができる。 さらに、 これら菌体の破砕物、 抽出物 や処理物より酵素を精製または部分精製した酵素または粗酵素の状態で使 用することができる。 また、 これら酵素または粗酵素を固定化し、 固定化 酵素として使用できる。 固定化方法としては、 例えば、 国際特許出願 P C T/ J P 9 1 / 0 1 6 9 6の固定法が使用できる。
さらに、 これらの微生物から遺伝子操作により産生させた酵素も、 基本 的には該微生物の産生することの出来る酵素と等価である。
脱力ルバミル反応は、 水性媒体中で行われ、 その pHとしては 6〜1 1 の範囲が用いられるが、 特に好ましくは、 pH 7〜9. 5である。 さらに、 pH 8〜 9に至適 pHを持つ酵素もある。 脱力ルバミル反応の温度としては、 通常 2 0〜8 5 °Cの範囲が用いられるが、 使用する菌株の酵素系に適した 温度が採用される。
本発明において、 デカルバミラーゼの基質となる N—力ルバミル— D— 一アミノ酸化合物の例としては、 D— N—力ルバミルァラニン、 D— N 一力ルバミルメチォニン、 D— N—力ルバミルパリン、 D— N—力ルバミ ルロイシン、 D— N—力ルバミルフヱニルグリシン、 D— N—力ルバミル 一（4ーヒドロキシフエニル）グリシン、 D— N—力ルバミル一（2—チェ ニル）グリシン、 D— N—力ルバミルフェニルァラニンなどが挙げられる。 —般式中の Rとしては、 置換アルキル基の場合の置換基としてはフヱニル 基、 インドリル基、 アルキルチオ基、 ヒ ドロキシル基、 アミノ基、 カルボ キシル基などがある。
前述したような微生物酵素による脱力ルバミル反応によって生成した D 一 一アミノ酸類の単離は、 濃縮、 中和、 イオン交換樹脂処理などの公知 の方法により行うことができる。 すなわち、 D—フユニルグリシン、 D— ( 4ーヒ ドロキシフヱ二ノレ）グリシン、 D—口イシンや D—フエ二ルァラ二 ンなどの比較的疎水性の D— ーァ ミノ酸類の場合は、 酸性またはアル力 リ性での不溶物を除去後、 濃縮、 中和等により目的の D—ひ一アミノ酸を 沈澱として得ることができる。 また、 D—チェニルグリシン、 D—セリン や D—ァラニンなどのように比較的親水性である場合には、 ィォン交換樹 脂により目的物を吸着させ、 これをアンモニア水等で溶出し、 ついで中和 し濃縮することにより目的物を取得することができる。
ところで、 これらデカルバミラーゼの基質となる N—力ルバミル一 D— アミノ酸化合物は、 多種の種属の微生物の培養液、 菌体、 菌体処理物また は菌体から抽出した酵素を 5—置換ヒダントイン類に作用させて、 製造す ることができる。 このような製造方法は、 特開昭 5 3— 4 4 6 9 0号公報、 特開昭 5 3— 6 9 8 8 4号公報、 特開昭 5 3— 9 1 1 8 9号公報、 特開昭 5 3— 1 3 3 6 8 8号公報、 特開昭 5 4— 8 4 0 8 6号公報および特開昭 5 5 - 7 0 0 1号公報等に記述されている。
これらの D—力ルバミル一 ーァミノ酸類を、 本発明の方法によって対 応する 学活性の D— 一アミノ酸類に変換する。
実施例
以下、 実施例を示し、 本発明を具体的に説明する。
実施例 1
土壌試料 （採取地名： 日本各地より採取） を、 2mlの培地 A (lg/1 KH2P04、 lg/1 K2HP04、 0. 3gZl MgS〇4 · 7H20、 0. lgZl酵母エキス、 NH4C1、 1. 5g/l 炭素源として用い以 下に記載の化合物 （PH7. 0) ) 、 または培地 B (lgZl KH2P04、 lg/1 K2HPO4. 0. 3 /l MgS04' 7H20、 0. 5g/lグル コース、 0. 酵母エキス、 1. 5gZl窒素源として用いる以下に記 載の化合物 （PH7. 0) ) に接種し、 28 °Cで好気的に振盪培養し、 同 様の培地に継植して微生物の増殖が認められるまで培養した。 その後、 平 板培地 （2%寒天を含む同様の培地） に広げ、 28 °Cで 2〜 6曰培養して 微生物を分離した。
炭素源または窒素源として用いる化合物
N—力ルバミル一 D— p—ヒ ドロキンフエ二ルグリシン（C一 D— HPG)
N—力ルバミル一 D—フエニルグリシン（ C一 D— P G )
N—力ルバミル一 D—ァラニン（C— D— Ala)
DL— 5—メチルヒダントイン（DL— Ala— hyd)
DL— 5—フエニルヒダントイン（DL— PG— hyd)
DL— 5— P—ヒ ドロキシフエニルヒダントイン（DL— HP G— hyd) シトノレリ ン
フエニルゥレア
カルバミ ン酸ー n—ブチルエステル
それぞれの平板培地上の株を 100 // 1の反応液 （35 mM C-D-H PG、 200mMリン酸カリウム緩衝液 （ΡΗ7.· 0) に懸濁し、 28°Cで ：！〜 3日間反応させた後、 薄層クロマトグラフィ一により力ルバミル D— HPG及び D— HPGの分析を行なった。 薄層クロマトグラフィーは、 メ ルク社製 6 OF 254プレートを使用し、 ブタノール:酢酸:水， 3:3:Γ (V /ν/ν) で展開し、 紫外線ランプ（254nm)または Ρ— (ジメチルァミノ） シナムアルデヒドとニンヒ ドリンのスプレーによって検出した。 その結果、 1868株が上記の炭素源または窒素源化合物を資化する微生物として分 離でき、 その内 37株が D— HPGを生産しており、 その 16株が良好な D— HPG生産性 （2mM以上の D— HPGを生産） を示した。
実施例 2
実施例 1で得られた 16株のデカルバミラーゼ生産株については、 2次 スクリーニングの為に、 1mlの培地 C (1. 5g/l C一 D— HPG、 1 g/1 KH2P04、 lg/1 K2HP04、 0. 3g/l MgS04 - 7H2 0、 3gZl酵母エキス、 3g/l肉エキス、 l OgZlグリセロール、 2g/l ポリペプトン （pH7. 0) ) により、 28°Cで 3日間培養した。 培養液 lmlを遠心分離し、 菌体を実施例で使用したのと同じ反応液 10 Ο/ilに 懸濁し、 30°Cまたは 50°Cで 24時間反応させて、 生成した D— HPG の定量を行なった。
D— HP Gの定量は、 コスモシル （Cosmosil) 5C18カラム (Φ 4. 6 x 250匪、 ナカライテスク社製） を用い、 水：ァセトニトリル：リン酸 (95:5:0. 01 (v/v/v)) を溶離液として、 高速液体クロマトグラ フィー （HPLC) によって分離し、 254ηπιの吸光度を測定することに より行なった。 その結果を図 1に示す。
16株のうちの 3株、 E 206a、 E 222 Cおよび E 215は、 C一 D— Alaを単一炭素源として生育し、 30°Cで高い活性を示した。 E22 2Cでは、 30°Cで 30. 8mMの D— HPGが生成していたが、 50°C では 3. 5 mMの D— HP Gしか生成していなかった。 また他の 3株、 A 17p— 1、 Al 7p— 3および Al 7p— 4は、 C一 D— HPGを単一炭 素源として生育し、 50°Cで高い活性を示した。 A17p— 4では、 50 。(：で 28. 8mMの D— HPGが生成していたが、 30°Cでは 2. 5mMの D— HP Gしか生成していなかった。
実施例 3
得られたデカルバミラーゼの基質特異性
コマモナス sp. E 222 Cおよびブラストパクター sp. A17p— 4が 生産するデカルバミラーゼの基質特異性を調べるため、 実施例 2に記載の 培地 Cを用い、 28°Cで、 コマモナス sp. E 222 Cを 1日間、 またはブ ラストパクター sp. Al 7 P— 4を 7日間振とう培養した。 培養液 3 mlを 遠心分離し、 この菌体を 300 1の反応液 （200mMリン酸カリウム緩 衝液、 1%(WZV)の種々の反応基質） に懸濁し、 コマモナス sp. E 222 Cでは 30 で、 ブラストパクター sp. A 17 P— 4では 50°Cでそれぞ れ 24時間反応させた。
表 1に示すように、 両菌体とも、 脂肪族および芳香族 D—アミノ酸の N 一力ルバミル体に対する強い加水分解活性を示したが、 極性基を持つァミ ノ酸の N—力ルバミル体に対する活性は低かった。 またコマモナス sp. E 222 Cでは yS—ゥレイ ドプロピオン酸を加水分解でき、 ブラストバクタ -sp. A 17 P— 4ではヒダントイナーゼ活性も有することがわかった。
新規デカルバミラーゼの基質特異性
Figure imgf000019_0001
ァミノ酸への転換率
一 ： %
+： < 10%
++： < 50%
+++： < 80%
++++： 100% 実施例 4
コマモナス sp. E 222 C株デカルバミラーゼの生産増強物質
コマモナス sp. E222 C株を培養する際に、 デカルバミラーゼ生産を 増加させる酵素生産増加物質の探索を行なった。
栄養培地である培地 D (lg/1 KH2P04、 lgZl K2HP04、 0. 3g/l MgS04* 7H20、 3gZl酵母エキス、 3gZl肉エキス、 1 Og /1グリセロール、 2gZlポリペプトン （PH7. 0) ) に、 図 2に示す化 合物を 0. 15%(w/v)の濃度で添加し、 菌を植えて 28°Cで 2日間振盪 培養した。
この培養液 1 mlを遠心分離し、 菌体を 100 1の反応液 （ 200 mMリ ン酸カリウム緩衝液 （pH7. 0)、 35mM C-D-HPG) に懸濁し、 30°Cで 24時間反応させ、 生成した D— HP Gを、 実施例 2に示す方法 に従い、 HPLCにより定量した。 その結果、 図 2に示す様に、 尿素、 β 一ウレイ ドプロピオン酸、 D—フエニルグリシン、 Ν—力ルバミル一 DL 一メチォニンにより活性が増強されることがわかった。
実施例 5
コマモ_ナス sp. E 222 Cが生産するデカルバミ_ラーゼの精製
コマモナス sp. E 222 Cを 28°Cにて、 ；5—ウレイ ドプロピオン酸 （ 0 . 15%(wZv)を添加した実施例 4に記載の培地 Dで 3日間振盪培養し、 合計 3. 61の培地を遠心分離して菌体を分離した。 この菌体を 10 mMリ ン酸カリウム緩衝液 （pH 7. 0) 100mlに懸濁し、 超音波によって破 砕し、 遠心分離によって残渣を除いた。 この粗酵素液に硫安を添加しつつ、 飽和濃度の 20%から 40%までの濃度での硫安沈澱画分を遠心分離によつ て分離し、 上記緩衝液に溶解させた。
この酵素液 177 mlを上記緩衝液 101に対して 12時間透析し、 DE AE—セファセル （Sephacel) カラム （05x 15cm) に吸着させ、 0 〜1Mの NaCl直線型濃度勾配で溶出させ、 活性画分を集めた。 この溶出 液の NaCl濃度を 4Mに合わせ、 フヱニルーセファロース （Phenyl^ S epharose) 〇1^ー48カラム （01. 5 x 15 cm) に吸着させ、 4〜0 Mの NaCl直線型濃度勾配で溶出させ、 活性画分を集めて YM— 10膜 （ァ ミコン社） を用いて限外濾過により濃縮した。
この濃縮液 （5ml) を 0. 2M NaClを含む上記緩衝液中、 セファタ リル （Sephacryl) S - 200 HRカラム （01. 8 x 80cm) を用いて ゲル濾過し、 活性画分を透析により脱塩した後、 ヒドロキシァパタイ トカ ラム （01. 2x 10 cm) に吸着させ、 0〜1Mのリン酸カリウム緩衝液
(pH7. 0) の直線型濃度勾配で溶出し、 活性画分 （8. 5ml) を 10m Mリン酸カリウム緩衝液 （pH 7. 0) 500mlに対し、 12時間透析し た。 これをモノ （Mono) Q HR 5Z5カラムに吸着させ、 0〜1. 0 M NaClの直線型濃度勾配で溶出させて、 この活性画分 （1. 2ml) を 精製酵素液として分析に用いた。
以上の精製操作により、 表 2に示す様に、 細胞破碎上清と比較して、 比 活性が 108倍向上し、 その際の酵素活性回収率は約 2%であった。 また この精製酵素 1 Omgをキングとレムリ一の方法 [King, J., Laemmli, U.K., ジャーナル'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 62巻、 465— 477 (1971)] により 10 %ポリアクリルァミ ドゲルを用いた S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動に付したところ、 図 3に示す様に、 分子量 38, 000付近に単一バ ンドが得られた。 表 2
コマモナス s p. E 222 c デカルバミラーゼの精製 酵素活性 比活性 収率 精製段階
(mg) (U) (U/mg) (%)
1)無細胞抽出液 6316 23.5 0.0037 100
2)硫安沈殿画分 2362 21.2 0.0090 90. 2
3) DEAE—セファセル画分 146 21.6 0.15 91. 9
4) フヱニルーセファロース画分 40. 0 10.9 0.27 46. 4
5)セフアクリル S— 200 HR画分 23. 8 6.6 0.28 29. 1
6) ヒドロキシァパタイト 画分 2. 5 0.7 3. 0
7)モノ Q HR 5/5画分 1. 2 0.48 2. 0
o
0 o0 また、 セフアデックス （Sephadex) G— 150カラム （01. 5x8 5 cm) を用い、 0. 2M NaClと◦. 1 mMジチオスレィ トール （D T T) を含む 1 OmMリン酸カリウム緩衝液 （pH7. 0) でゲル濾過を行なつ たところ、 図 4に示す様に、 分子量 111, 000付近に溶出された。
実施例 6
コマモナス sp, E 222 Cデカルバミラーゼの性質
実施例 5で得た酵素液を用い、 コマモナス sp. E 222 Cが産生するデ 力ルバミラ一ゼの反応至適 p Hおよび反応至適温度を調べた。
反応至適 pHは、 以下の方法によって測定した。 反応液 （500 //1) の 緩衝液 （濃度 20 OmM) として、 pH4. 2〜5. 9では酢酸一塩酸緩衝 液、 pH5. 0〜8. 8ではリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 6〜9. 9で はトリス一塩酸緩衝液及び pH 8. 9〜11. 1ではグリシン一 NaOH緩 衝液をそれぞれ用い、 1 OmMの N—力ルバミル一 D—フエ二ルァラニン と酵素液を添加したものを反応液として用い 3 (TCで 20分間反応させ、 500 1エタノールを添加して反応を停止させた。
生成した D—フエ二ルァラニンの定量は、 20 OmMリン酸カリウム緩 衝液 （pH7. 0) 、 1. 5mM4—ァミノアンチピリ ン、 2. ImMフエ ノール、 2. 25uパーォキシダーゼ （西洋わさび由来、 カルザィム ' ラ ボラ トリー （CALZYME Lab. )社製） 及び 0. 375単位の D— アミノ酸ォキシダーゼ （シグマ社製） を含む反応液に、 上記酵素反応液の 1部を添加し （最終容量 500 ^1) . 37°Cで 60分間反応させて 50 Onmの吸光度の増加を測定することによって行った。
また、 反応至適温度は、 リン酸カリウム緩衝液 （pH7. 0) を用いて 上記と同様の反応液組成で、 10°C〜80°Cで 20分間反応させ、 生成し たアンモニアを、 インドフエノール法 [ボルタ一 （Bollter, W. T. ) ら、 アナリティカル 'ケミストリー （Analytical Chimistry) 33巻、 592-594 (1961) ) によって測定した。
以上の結果を図 5および図 6に示す。 コマモナス sp. E 222 Cのデカ ルバミラーゼでは反応至適 pHが pH8〜9で、 反応至適温度が 40°Cであ ることがわかる。
実施例 7
コマモナス sp. E 222 C株デカルバミラ一ゼのァミノ酸配列
実施例 5で得た酵素液を用い、 デカルバミラーゼ蛋白のァミノ末端のァ ミノ配列の決定を行なった。 酵素液をセントリコンー 10マイクロセント レーター （アミコン社製） を用いて脱塩し、 パルス式液相プロティンシー ケンサ一にチャージし、 解析を行なった'ところ、 デカルバミラーゼ蛋白の ァミノ末端の配列は
1 5 10
Ser— Arg— I le- Val- Asn- Tyr- Ala- Ala- Ala- G In- Leu-
15 20
Gly- Pro- I le- Gin- Arg- Ala- Asp- Ser— (Arg)— A la— Asp
25 30
- Val -Met- Glu-( Arg) - Leu- Leu- A la- His
(20番目及び 26番目の Argはピークが不明瞭で確定できなかった。 ）で あることがわかった。
実施例 8
ブラストバクタ一 sp. A 17P— 4株デカルバミラーゼの生産増強物質 ブラストパクター sp. A 17P— 4株を培養する際に、 デカルバミラー ゼ生産を増加させる酵素生産増強物質の探索を行なった。
実施例 4で用いたのと同じ培地 Dに図 7に示す化合物を 0. 1 S^CwZ
V)添加し、 これに植菌し、 28 °Cで 3日間振盪培養した。 実施例 4に示し た方法で、 反応温度のみを 40°Cとして生成した D— HPGを HPLCで 定量したところ、 図 7に示す様に、 ゥラシル、 ジヒ ドロウラシルまたは ;5 ーゥレイ ドプロピオン酸を添加した場合、 デカルバミラ一ゼの生産量が増 加することがわかった。
さらに、 金属イオンの添加効果を調べるため、 培地 Dに 0. 15%(wZ V)のゥラシルを添加し、 さらに図 8に示す金属イオンを 2 mMの濃度で添 加し、 この培地に植菌し、 28°Cで 4日間振盪培養した。 そして生成した D— HPGを定量したところ、 図 8に示す様に、 Fe2+、 Fe3+、 Li+、 C s\ Be2+、 Mg2+、 Mn2+、 Co2+、 Al3+等のイオンを添加することによ り、 デカルバミラーゼの生産量が增加することがわかった。
実施例 9
ブラストパクター sp. A 17p— 4が生産するデカルバミラーゼの精製 ブラストパクター sp. A 17 p— 4を実施例 4で用いたのと同じ培地 D に、 0. 15%(wZv)のゥラシルと 2mMの FeS04 · 7H20を添加し、 この培地に植菌し、 28 °Cで 7日間振盪培養した。 合計 4. 81の培養液 を遠心分離し、 菌体を 1 OmMリン酸カリウム緩衝液 12 Omlに懸濁し、 直径 25画のガラスビーズ [ダイノーミル ·ゲイ 'ディ ·エル （Dyn 0— Mill KDL) (スイス） ] を用いて、 5°Cで 20分間破碎し、 遠心 分離によって残渣を除いた。 この粗酵素液に硫安を添加しつつ、 飽和濃度 の 20%から 40%までの濃度での硫安沈澱画分を遠心分離によって分離 し、 上記緩衝液に溶解させた。
この酵素液 41 mlを 51の上記緩衝液に対して 12時間透析し、 実施例 δに示す方法によって DE A Ε—セファセルカラムおよびフエ二ルーセファ ロース CL一 6 Bカラムによって精製を行ない、 限外濾過によって濃縮し た。 この濃縮液 （3ml) を 0. 2M NaClを含む上記緩衝液中、 セファ デックス G— 150カラム（ø 1. 5 80cm)を用いてゲル濾過し、 活性 画分を透析により脱塩した後、 実施例 5に示す方法によってモノ QHR5 5カラムを用いて精製し、 活性画分 （2ml) を精製酵素液として分析に 用いた。 以上の精製操作により、 表 3に示す様に、 細胞破砕上清と比較し て、 比活性が 37倍向上し、 その際の酵素活性回収率は 2. 3%であった c
表 3
ブラストバクタ一 s p.A17p— 4 デカルバミラ一ゼの精製 酵素活性 比活性 収率 精製段階
(mg) (U) (UZmg) (%) en
1)無細胞抽出液 4657 52.0 0.011 100
2)硫安沈殿画分 797 30.2 0.038 58. 1
3) DEAE—セファセル画分 284 18.3 0.064 35. 2
4) フヱニルーセルロース画分 89. 6 7.6 0.085 14. 6
5)セフアデックス G— 150 画分 15. 4 4.1 0.27 7. 9
7) モノ Q II R 5/5画分 2. 9 1.2 0. 1 2. 3
またこの精製酵素を SDS—ポリアクリルアミ ド電気泳動に付したとこ ろ、 図 9に示す様に、 分子量 39; 000付近に単一バンドが得られた。 また、 実施例 5に示す方法によってセフアデックス G— 150カラムによ るゲル濾過を行なったところ、 図 10に示す様に、 分子量 120, 000 付近に溶出された。
実施例 10
ブラストパクター sp. A 1 7 p— 4デカルバミラーゼの性質
実施例 9で得た酵素液を用い、 ブラストパクター sp. A17P— 4デカ ルバミラーゼの反応至適 PH及び反応至適温度を調べた。 いずれの場合も、 反応は実施例 6に示す方法に従って行った。 これらの結果を図 11及び図 12に示す。 ブラストバクタ一 sp. A 17p— 4デカルバミラーゼの反応 至適 pHは 9であり、 反応至適温度は 50°Cであることがわかった。
実施例 11
ブラストパクター sp. A 17 p— 4デカルバミラ一ゼのァミノ酸配列 実施例 9で得た酵素液を用い、 デカルバミラーゼ蛋白のァミノ末端ァミ ノ酸配列の決定を実施例 7と同様の方法により行なつたところ、 デカルバ ミラーゼ蛋白のァミノ末端のァミノ酸配列は、
1 5 10
Ala— Arg— Lys- Leu - Asn— Leu— Ala— Val— Ala— Gin - Leu—
15 20 Gly— Pro— I le - A la— Arg— Ala— G lu— Thr— Arg— Asp— Gin—
25 30
Val— Val— Ala - Arg_ Leu— Met— Glu— Met— Met— Lys— Glu—
35 40
Ala— Lys— Ser_ Ser— (Arg)— Gly— Thr
(38番目の Argはピークが不明瞭で確定できなかった。 ） であることが わかった。
実施例 12
表 4のリゾビゥム属及びブラディ リゾビゥム属の株 7株について、 1ml の 805液体培地 （イーストエキス lg/l、 マンニトール 5g/l、 K2H P04 0.7g/l、 KH2P04 0. 1 g/ Mg S04 · 7H20 lg/l、 C -D-HPG lg/1 (pH7.0) ) に終濃度 1 g/1の C一 D— H P G又は C一 D— Alaを添加した培地に植菌し、 30°Cで 24時間振とう培養した。 菌を遠心分離によって集め、 0.5mlの 1%C— D— HPG又は C一 D— Ala、 0. 1MK—リン酸緩衝液 （pH7.0) 、 0. 1%トリ トン X—1 00に懸濁した。 37 °Cで振とうしながら 24時間反応後、 実施例 1に示 す方法によって薄層クロマトグラフィーによって分析した。 表 4に示すよ うにブラディリゾビゥム属の株に脱力ルバミル活性が存在することがわかつ フ
表 4
fe株ふ デカルバミラーゼ活性 リゾビゥム，ロティ + +
(Rhizobium loti) IFO 14779
リゾビゥム ·メリロティ + +
(Rhizobium meliloti) IFO 14782
リゾビゥム ·フレディィ + +
(Rhizobium Fredii) IFO 14780
リゾビゥム ·力レガエ + +
(Rhizobium galegae) IFO 14965
リゾビゥム ·ファクイイ +
(Rhizobium huakuii) IFO 15243
ブラディ リゾビゥム · ジャポニカム +
(Bradyrhizobiuni japonicum) IFO 14783
ブラディリゾビゥム sp. +
(Bradyrhizobiuni sp. ) IFO 15003 実施例 13
実施例 1に示す方法によって、 土壌よりさらにスクリーニングを行った。 スクリーニングを、 N—力ルバミル一 D—口イシン （C一 D— Leu) 、 N 一力ルバミル一 D—ァラニン （C一 D— Ala) 、 N—力ルバミル一 D—フエ ニルグリシン （C— D— PG) 又は DL— 5—メチルヒダントイン （DL -Ala-hyd) を炭素源又は窒素源として用いて行った。 生育した菌のう ち、 9株につき C— D— Alaと C— D— HPGを用い、 実施例 12と同様 に脱力ルバミル活性を調べた。 結果は、 表 5に示すように、 C一 D— HP Gに対しより活性の高い菌株と C— D— Alaに対しより活性の高い菌株と があった。
表 5
菌株名 活性
リゾビゥム sp. KNK1415 C-D-PG + + + (C— D— HPG) アル力リゲネス ·キシロ
ソキシダンス · subsp.
デニトリフイカンス CL66-2a C— D— Leu + + (C - D— HPG)
CL67-1 C-D-Leu + + CC-D-HPG) CL85-1 C— D - Leu + (C— D - HPG) CA17-1 C一 D— Ala + (C— D— Ala) ァルスロパクター
sp. CA17-2 C-D-Ala + + (C— D— Ala)
CA77-2 C— D— Ala + + (C— D— Ala) AH71-1 DL-Ala-hyd +(C— D_Ala) AH57-1 DL-Ala-hyd + + (C— D— Ala) 実施例 14
実施例 3で得られたリゾビゥム sp. KNK1415を 101の SE培地 (ショ糖 23gノ 1、 酵母エキス 4gZl、 尿素 2gZl、 KH2 P04 2 g/ Na2HPO4 2 1、 MgS 04 · 7 H20 1 g/ 1、 MnCl2 · 4H20 0.0 l g/l (pH6.5) ) に植菌し、 30°C で 40時間振とう培養した。 遠心分離によって集菌し、 0.9%食塩水で 菌体を洗浄後、 超音波により菌体を破砕し、 残渣を遠心で除いた後、 プロ タミン硫酸処理 （0. lmgZmg蛋白） により除核酸した。 そして遠心 した上清を 50°C、 30分間熱処理し、 変性した蛋白を遠心で除き、 30 %飽和となる様に硫安を添加した。 沈でんを遠心分離によって集め、 50 0m 1の 2 OmM Tris · HC1 (pH7.5)、 2mM DTTに溶解し、 同緩衝液に透析後、 DEAEセルロースカラムに吸着させ、 10mM N a—リン酸緩衝液 （pH7.2) 、 0.15M NaC l、 lmM DTT で溶出した。 この溶出液を YM— 10膜 （アミコン社） を用いて限外濾過 による濃縮を行った。 この酵素液を SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気 泳動によって分析したところ、 約 35, 000付近にこのデカルバミラー ゼは泳動された。
実施例 15
実施例 14で得られたデカルバミラ一ゼを分析した S D S—ポリアクリ ルアミ ドゲルよりデカルバミラーゼのバンド部分のゲルを切り出し、 溶出 バッファー （5 OmM Tris - HCl (pH7.5) 、 0.1%SDS、 0. ImM EDTA, 15 OmM NaCl、 5mM DTT) 中でホモジナ ィズし、 室温で溶出させた。 この抽出液を限外濾過によって濃縮し、 逆相 HPLCカラム （AP— 303 ； YMC社製） にチャージし、 ァセトニ卜 リルの濃度勾配により溶出させた。 このデカルバミラーゼを含む画分を気 相プロテイン · シーケンサー （アプライ ド ·バイオシステム社製） にチヤ ージし、 解析したところ、 デカルバミラーゼのァミノ末端の配列は 1 5 10
Thr-Arg-Gln-Met- I le- Leu- Ala- Val- Gly- Gln- であることがわかった。
発明の効果
抗生物質の中間原料等として重要な D— α—アミノ酸類を製造する新規 な脱力ルバミル酵素を発見したことにより、 従来とは違った条件、 例えば ρΗ8〜9での反応や 50°Cでの反応が行える様になり、 効率的に D—ァ ミノ酸を製造することが可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲 一般式：
氺
R-CH-C00H
NH-C-NHz
II
0
[式中、 Rはフエニル基、 水酸基で置換されたフエニル基、 置換または 未置換アルキル基、 もしくはチェ二ル基を示す。 ]
で表わされる N—力ルバミル— D— 一アミノ酸に、 水性媒体中で、 微生 物の産生する酵素を作用させ、
一般式：
氺
R-CH-C00H
NH2
[式中、 Rは前記と同意義である。 ]
で表わされる D— ーァミノ酸を製造する方法において、
N—力ルバミル一 D— 一アミノ酸を D—α—アミノ酸に変換する酵素 デカルバミラーゼとして、 コマモナス （Comamonas) 属、 ブラストバクタ ― (Blastobacter) 属、 アルカリゲネス （Alcaligenes) 属、 スポロサ ルシナ （ S porosarcina) 属、 リゾビゥム （Rhizobium) 属、 ブラディ リ ゾビゥム （ B radyrhizobium) 属またはァルスロバクタ一 （ Arthrobacter) 属に属する微生物が産生することのできる酵素を用いることを特徵とする D—ひ一アミノ酸の製造法。
2. 該微生物が産生することのできるデカルバミラーゼを、 培養液、 菌 体、 菌体破碎物、 菌体抽出物、 菌体処理物、 粗酵素、 精製酵素固定化菌体 または固定化酵素として作用させる請求項 1記載の製造法。
3. 該微生物が、 コマモナス sp. E 222 C (FERM B P第 441
1号） 、 ブラストパクター sp. A l 7p- 4 (F ERM BP第 44 1 0号） 、 アル力リゲネス sp. E 2 1 5 (FERM B P第 4409号） 、 スポロ サルシナ sp. NCA28 -b (FERM B P第 4408号） 、 リゾビゥム sp. KNK 14 1 5 (FERM B P第 44 1 9号） 、 ブラディ リゾビゥ ム · ジャポ '二カム ( B radyrhizobium japonicum I F 0 14 783、 ブ ラディ リゾビゥム sp. I FO 1 5003またはァルスロパクター sp. C A l 7 -2 (FERM B P第 4420号） である請求項 1または 2記載 の製造法。
4. デカルバミラーゼの産生増強物質を添加した培地で、 該微生物を培 養し、 産生したデカルバミラーゼを作用させる請求項 1または 2記載の製 造法。
5. デカルバミラーゼ産生増強物質が、 D—アミノ酸、 N—力ルバミル 一 一アミノ酸、 5—置換ヒダントイン類、 ピリミジン代謝物または金属 ィォンである請求項 4記載の製造法。
6. 該微生物がコマモナス属の微生物であり、 産生増強物質が尿素、 β ーゥレイ ドプロピオン酸、 D—フエ二ルグリシンまたは Ν—力ルバミル一 D L—メチォ二ンである請求項 4記載の製造法。
7. 該微生物がブラストパクター属に属する微生物であり、 産生増強物 質が、 ゥラシル、 ジヒ ドロウラシル、 ^一ウレイ ドプロピオン酸、 Li+、 Cs+、 e Mg2+、 Mn2+、 Fe2+、 Fe3+、 Co2+または Al3+である請求 項 4記載の製造法。
8. 水性媒体の pHを 6〜1 1に保持する請求項 1記載の製造法。
9. 水性媒体の PHを 7.5〜9.5に保持する請求項 1記載の製造法。
10. 40°C〜50°Cでデカルバミラーゼを作用させる請求項 1記載の 製造法。
11. 至適 pHが 8〜 9にあるデカルバミラーゼ。
12. 至適温度が 40°C〜50°Cにあるデカルバミラ一ゼ。
13. コマモナス sp. E 222 C、 ブラストパクター sp. A17p— 4 またはリゾビゥム sp. KNK1415が産生する請求項 11または 12記 載のデカルバミラーゼ。
14. 該酵素のァミノ末端側のアミノ酸配列が
1 5 10
Ser— Arg— I le- Val- Asn-Tyr- Ala- Ala- Ala-Gin- Leu-
15 20
Gly- Pro- I le-Gln- Arg- Ala- Asp- Ser- (Arg) -A la- Asp
25 30
- Val -Met- Glu-( Arg) - Leu- Leu- A la- His
である、 コマモナス sp. E 222 Cが産生する請求項 13記載のデカルバ ミラーゼ。
15. 該酵素のァミノ末端側のアミノ酸配列が
1 5 10
Ala— Arg— Lys— Leu— Asn— Leu— Ala— Val— Ala— Gin— Leu—
15 20
Gly- Pro- I le - Ala— Arg— Ala— Glu— Thr— Arg - Asp— Gin -
25 30
Val— Val— A la - Arg— Leu— Met— Glu— Met— Met— Lys— Glu—
35 40
Ala- Lys- S er— S er—（Arg)— Gly— Thr
である、 ブラストパクター sp. A 17p— 4が産生する請求項 13記載の デカルバミラーゼ。
16. 該酵素のァミノ末端側のアミノ酸配列が、
1 5 10
Thr-Arg- Gin-Met- I le— Leu— Ala— Val— Gly— G In— であるリゾビゥム sp. KNKl 415が産生する請求項 13記載のデカル バミラーゼ。
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