KR100328111B1

KR100328111B1 - 데카르바밀라제의 제조방법

Info

Publication number: KR100328111B1
Application number: KR1020007013779A
Authority: KR
Inventors: 야마다히데아끼; 시미즈사까에; 이께나까야스히로; 야지마가즈요시; 야마다유끼오; 난바히로까즈; 다까노마사유끼; 다까하시사또미
Original assignee: 후루타 다케시; 가네가후치 가가쿠고교 가부시키가이샤
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 2002-03-09
Also published as: US5902736A; US5863785A; ES2159527T3; SG55164A1; CN1102672A; CN1048524C; EP0628637B1; WO1994008030A1; KR100293585B1; DE69330343T2; CN1187444C; CN1221793A; EP0628637A4; DE69330343D1; EP0628637A1

Abstract

본 발명은 하기 구조식 :

[상기식에서, R 은 페닐, 히드록시-치환 페닐, 치환 또는 비치환의 바람직하게는 C_{1 ∼ 5}의 알킬 또는 티에닐이다.]에 상응하는 D-N-카르바밀-α-아미노산을

하기 구조식:

[상기식에서, R은 상기한 바와 같다.]에 상응하는 D-α-아미노산으로 전환시키는 D-α-아미노산의 제조방법에 있어서, 코마모나스, 블라스토박터, 알칼리제네스, 스포로사르시나, 리조븀, 브라디리조븀 또는 아르트로박터 속의 미생물에 의해 생산되는 데카르바밀라제를 N-카르바밀-D-α-아미노산을 D-α-아미노산으로 전환시키기위한 효소로서 사용한다. N-카르바밀-D-α-아미노산을 D-α-아미노산으로 전환시키는 것은 중성 내지 알칼리성 pH 범위에서 수행된다.

Description

데카르바밀라제의 제조방법 {PROCESS FOR PREPARING DECARBAMYLASE}

본 발명은 하기 일반식 :

[상기식에서, R 은 페닐, 히드록시-치환 페닐, 치환 또는 비치환의 바람직하게는 C_{1 ∼ 5}의 알킬 또는 티에닐이다.]

에 상응하는 D-N-카르바밀-α-아미노산을 하기 구조식:

[상기식에서, R은 상기한 바와 같다.]

에 상응하는 D-α-아미노산으로 카르바밀기를 제거할 수 있는 효소 (이후에는 '데카르바밀라제'로 언급한다)에 의해 전환시키는 D-α-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

이들 광학 활성 D-α-아미노산은 의약품 중간체로서 중요하다. 특히, D-페닐글리신 및 D-(4-히드록시페닐) 글리신 (이후에는 ' D-HPG ' 로 언급한다) 은 반-합성 페니실린 및 반-합성 세팔로스포린의 제조에 유용하다.

상응하는 D-N-카르바밀-α-아미노산으로부터의 카르바밀기를 제거함에의한 D-α-아미노산의 제조는 공지되어있다. 제거는 화학적으로 (일본국 특허 공보 제 4707/1983 호) 또는 미생물의 효소 반응에 의해 (일본국 특허 공보 제 18793/1982 호, 제 20520/1988 호 및 제 48758/1989 호) 수행되었다.

이들 미생물 효소의 대부분은 중성범위 근처의 최적 pH 를 갖는다. 그러나, 이전 단계에서, N-카르바밀-D-α-아미노산은 상응하는 DL-5-치환 히단토인의 D-형을 선택적으로 가수분해함으로써 제조되는데, 8 내지 9 의 최적 pH 를 갖는 히단토인 가수분해 효소가 사용된다. 그러므로, 그후에 계속되는 N-카르바밀-D-α-아미노산의 D-α-아미노산으로의 데카르바밀라제에의한 전환은 이전 단계와는 다른 반응 매질에서 수행되어야한다.

제 1 도는 신규하게 스크리닝된 균주에의한 50 ℃ 내지 30 ℃ 에서의 탈카르바밀화의 결과를 보여주는 그래프이다.

제 2 도는 코마모나스 종 E 222 C 의 배양 배지에 여러 첨가제를 첨가했을 때의 그의 데카르바밀라제 생산성에대한 영향을 보여주는 그래프이다.

제 3 도는 정제된 코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과이다.

제 4 도는 Sephadex G-150 컬럼을 통한 정제된 코마모나스 종 E 222 C 의 겔 여과의 결과이다.

제 5 도는 정제된 코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 활성에대한 pH 의 영향을 보여주는 그래프이다.

제 6 도는 정제된 코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 활성에 대한 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.

제 7 도는 블라스토박터 종 A 17 p-4 의 배양 배지에 여러 첨가제를 첨가할 때의 그의 데카르바밀라제 생산성에대한 영향을 보여주는 그래프이다.

제 8 도는 블라스토박터 종 A 17 p-4 의 배양 배지에 여러 금속 이온을 첨가할 때의 그의 데카르바밀라제 생산성에대한 영향을 보여주는 그래프이다.

제 9 도는 정제된 블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 결과이다.

제 10 도는 Sephadex G-150 컬럼을 통한 정제된 블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 겔 여과의 결과이다.

제 11 도는 정제된 블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 활성에대한 pH 의 영향을 보여주는 그래프이다.

제 12 도는 정제된 블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 활성에 대한 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.

본 발명자들은 주로 데카르바밀라제를 갖는 것으로 공지되지 않은 속들중에서 D-N-카르바밀-α-아미노산으로부터 카르바밀 기를 효소적으로 제거 ('탈카르바밀화') 하여 D-α-아미노산을 형성 할 수 있는 미생물에대해 연구하였다. 코마모나스(Comamonas), 블라스토박터 (Blastobacter), 알칼리제네스(Alcaligenes), 스포로사르시나(Sporosarcina), 리조븀(Rhizobium), 브라디리조븀(Bradyrhizobium) 및 아르트로박터(Arthrobacter) 속의 박테리아가 데카르바밀라제 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 하기 일반식 (I):

[상기식에서, R 은 페닐, 히드록시-치환 페닐, 치환 또는 비치환의 바람직하게는 C_1∼5의 알킬 또는 티에닐이다.]

에 상응하는 N-카르바밀-D-α-아미노산을 하기 구조식 (II):

[상기식에서, R은 상기한 바와 같다.]

에 상응하는 D-α-아미노산으로 미생물 효소에의해 수성매질내에서 전환시키는 것으로 구성되며, 이 효소는 코마모나스, 블라스토박터, 알칼리제네스, 스포로사르시나, 리조븀, 브라디리조븀 또는 아르트로박터 속의 미생물에의해 생산되는 것을 특징으로 하는 D-α-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, D-이성질체 특이성 데카르바밀라제 및 비특이성 데카르바밀라제 모두를 실제로 사용할 수 있다. D-N-카르바밀-α-아미노산에 대한 강한 입체 특이성을 갖는 효소는 종종 D-N-카르바밀-α-아미노산 아미드 히드롤라제라고 불리운다.

본 발명에 따른 미생물중에서, 특히 높은 데카르바밀라제 활성을 보여주는 균주는 예를들면, 코마모나스 종 E 222 C (FERM BP 제 4411 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 일본국 305 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1 쵸메 1-3, 1992 년 9 월 18 일), 코마모나스 종 E 206 a, 코마모나스 종 E 217 a, 블라스토박터 종 NA 88-b, 블라스토박터 종 A 17 p-4 (FERM BP 제 4410 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 1992 년 9 월 18 일), 알칼리제네스 종 E 215 (FERM BP 제 4409 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 1992 년 9 월 18 일), 알칼리제네스 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 (Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans) CL 66-2 a, 스포로사르시나 종 NCA 28-b (FERM BP 제 4408 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 1992 년 9 월 24 일), 리조븀 종 KNK 1415 (FERM BP 제 4419 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 1993 년 9 월 22 일), 브라디리조븀 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum) IFO 14783, 브라디리조븀 종 IFO 15003, 아르트로박터 종 CA 17-2 (FERM BP 제 4420 호, 통상산업성 공업기술원 생명 공학 공업 기술 연구소, 1993 년 9 월 22 일) 이다.

균주의 전형적인 예인 코마모나스 종 E 222 C, 블라스토박터 종 A 17 p-4,알칼리제네스 종 E 215, 스포로사르시나 종 NCA 28-b, 리조븀 종 KNK 1415 및 아르트로박터 종 CA 17-2 는 하기와 같은 미생물학적 특성을 갖는다:

코마모나스 종 E 222 C

(a) 형태

간균 (구부러짐), 그램-가변성

포자: -

콜로니: 담황색, 반투명, 구형, 규칙적, 온전함, 윤이남, 약간 볼록함, 유연; 직경 1 mm (48 hr)

성장 (48 hr): 37 ℃ 에서, +

41 ℃ 에서, -

45 ℃ 에서, -

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 -

글루코오즈 발효 -

NO₃환원 -

인돌 생산 -

글루코오즈로부터의 산 생산 -

아르기닌 데히드롤라제 -

우레아제 -

아에스큘린 가수분해 -

젤라틴 가수분해 -

β-갈락토시다제 -

시토크롬 옥시다제 + (약함)

(c) 동화

글루코오즈 -

아라비노오즈 -

만노오즈 -

만니톨 -

N-아세틸글루코사민 -

말토오즈 -

글루콘산 +

카프론산 +

아디핀산 -

말산 +

시트르산 +

페닐 아세테이트 +

블라스토박터 종 A 17 p-4

(a) 형태

간균 (타원형), 그램-음성

포자: -

콜로니: 백색, 반투명, 구형, 규칙적, 온전함, 윤이남, 약간 볼록함, 유연, 유점액질 생산; 직경 1.0-1.5 mm (48 hr)

성장 (48 hr): 37 ℃ 에서, +

41 ℃ 에서, -

45 ℃ 에서, -

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 + (약함)

글루코오즈 발효 -

NO₃환원 -

인돌 생산 -

글루코오즈로부터의 산 생산 -

아르기닌 데히드롤라제 -

우레아제 +

아에스큘린 가수분해 +

젤라틴 가수분해 -

β-갈락토시다제 +

시토크롬 옥시다제 +

(c) 동화

글루코오즈 +

아라비노오즈 +

만노오즈 +

만니톨 +

N-아세틸글루코사민 +

말토오즈 +

글루콘산 -

카프론산 -

아디핀산 -

말산 -

시트르산 -

페닐 아세테이트 -

알칼리제네스 종 E 215

(a) 형태

간균, 그램-가변성

포자: -

이동성: +

콜로니: 담황색, 반투명, 구형, 규칙적, 온전함, 약간 볼록함, 윤이남, 유연; 직경1 mm (48 hr)

성장 (48 hr): 37 ℃ 에서, +

41 ℃ 에서, -

45 ℃ 에서, -

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 -

글루코오즈 발효 -

스포로사르시나 종 NCA 28-b

(a) 형태

구균, 그램-가변성

포자: +

이동성: -

콜로니: 구형, 규칙적, 온전함, 크림색 내지 백색, 반투명; 직경 <0.5 mm (48 hr)

성장 (48 hr): 37 ℃ 에서, -

45 ℃ 에서, -

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 +

글루코오즈 발효 -

리조븀 종 KNK-1415 (FRRM BP-4419)

(a) 형태

간균 (짧음), 그램-음성

포자: -

편모: 극모 또는 주모

콜로니: 회색, 불투명, 온전함, 규칙적, 유연, 약간 볼록함, 유점액질 생산; 직경 5 mm (5 일)

성장 (48 hr): 30 ℃ 에서, +

37 ℃ 에서, (±)

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 +

글루코오즈 발효 -

NO₃환원 +

인돌 생산 -

글루코오즈로부터의 산 생산 -

아르기닌 데히드롤라제 -

우레아제 +

아에스큘린 가수분해 +

젤라틴 가수분해 -

β-갈락토시다제 +

시토크롬 옥시다제 +

3-케토락토오즈 생산 -

H₂S 생산 -

(c) 동화

글루코오즈 +

아라비노오즈 +

만노오즈 +

만니톨 +

N-아세틸글루코사민 +

말토오즈 +

글루콘산 -

카프론산 -

아디핀산 -

말산 +

시트르산 -

페닐 아세테이트 -

GC 함량: 63.4 %

퀴논 분석: Q-10 95.7 %

Q-9 3.3 %

Q-11 0.6 %

Q-8 0.4 %

미생물 지방산 분석:

(전체 지방산)

성분 비율 (%)

3-OH C14 : 0 4.6

C16 : 1 5.9

C16 : 0 14.0

3-OH C16 : 0 0.1

C18 : 1 70.7

C18 : 0 3.3

미지 성분 1.4

(3-OH 지방산)

성분 비율 (%)

3-OH C14 : 0 88.8

3-OH C16 : 0 6.6

3-OH C18 : 0 4.6

(2-OH 지방산)

검출 안됨

아르트로박터 종 CA 17-2 (FERM BP-4420)

(a) 형태

간균 또는 구균, 그램-양성

포자: -

이동성: +

콜로니: 회색, 불투명, 구형, 규칙적, 볼록함, 유연;

직경 약 0.5 mm (2 일)

성장: 30 ℃ +

37 ℃ (+)

45 ℃ -

(b) 생리학적 활성

카탈라제 +

옥시다제 -

글루코오즈 발효 -

(c) 화학분류

펩티도글리칸중의 아미노산: L-리신

미콜 산: -

지방산 조성:

안테이소 C_{15 : 0}(12-메틸테트라데칸 산) 58 %

이소 C_{15 : 0}(13-메틸테트라데칸 산) 5.5 %

이소 C_{16 : 0}(14-메틸펜타데칸 산) 8 %

안테이소 C_{17 : 0}(14-메틸헥사데칸 산) 25 %

효소 데카르바밀라제는 미생물을 통상적으로 액체 배지내에서 통상적인 방법으로 배양함으로써 수득될 수 있다. 그러나, 고체 배지도 또한 사용될 수 있다. 이 배지는 통상적으로 각각의 미생물의 성장에 필수적인 무기 염뿐만이 아니라 동화가능한 탄소 및 질소원을 함유한다. 박테리아의 데카르바밀라제 생산성은 바람직하게는 소량의 물질, 예컨대 아미노산, 예를 들면, D-p-히드록시페닐글리신 또는 D-페닐글리신; N-카르바밀-α-아미노산, 예를 들면, N-카르바밀-DL-메티오닌 또는 N-카르바밀-D-페닐알라닌; 5-치환 히단토인, 예를 들면, DL-5-p-히드록시페닐히단토인 또는 DL-5-페닐히단토인; 피리미딘 대사산물, 예를 들면, 우라실, 디히드로우라실 또는 β-우레이도프로피온 산; 금속 이온, 예를 들면, Fe²⁺, Fe³⁺, Be²⁺, Co²⁺, Al³⁺, Li⁺, Mn²⁺, Mg²⁺또는 Cs⁺; 또는 요소를 배양 배지에 첨가함으로써 향상될 수 있다. 이들 첨가제는 배양 배지내에 금속 이온에 대하여 0.1 내지 10 mM, 및 기타 물질에 대하여 0.01 내지 1 중량 % 의 농도로 존재할 수 있다.

배양은 20 내지 85 ℃ 의 온도 및 4 내지 11 의 pH 에서 수행될 수 있다. 통기 및 교반은 미생물의 성장을 촉진할 수 있다.

배양후에, 배양배지 또는 이로부터 회수한 미생물을, 그 자체로 또는 더 가공하여 D-N-카르바밀-α-아미노산의 탈카르바밀화를 위한 효소원으로서 사용할 수 있다. 살아있는 또는 건조된 (예를 들면, 동결건조된) 박테리아를 사용할 수 있다. 이들은 또한 균질화, 추출, 계면활성제로의 처리, 또는 초음파 처리후에도 사용될 수 있다. 또한, 박테리아 균질물, 추출물등으로부터 회수된 순수한 또는 조 효소를 사용할 수 있다. 순수한 또는 조 효소는, 예를 들면, 국제 특허 출원 제 PCT / JP 91 / 01696 호에 공개된 바에 따라서 고정화 될 수 있다.

원칙적으로, 미생물의 유전자 조작에의해 제조된 효소는 원래 상태의 박테리아로부터 제조된 것들과 동등하게 유용하다.

탈카르바밀화 반응은 6 내지 11, 바람직하게는 7 내지 9.5 범위의 pH 에서 수성 매질내에서 수행된다. 어떤 효소는 8 내지 9 의 최적 pH 를 갖는다. 탈카르바밀화는 통상적으로는 20 내지 85 ℃ 에서 발생하나, 온도는 효소에 따라서 최적으로 결정된다.

본 방법에서, 데카르바밀라제에대한 기질은 N- 카르바밀-D-α-아미노산, 예컨대 D-N-카르바밀알라닌, D-N-카르바밀메티오닌, D-N-카르바밀발린, D-N-카르바밀류신, D-N-카르바밀페닐글리신, D-N-카르바밀-(4-히드록시페닐) 글리신, D-N-카르바밀-(2-티에닐)-글리신 및 D-N-카르바밀페닐알라닌이다. 상기 구조식중의 기 R 은 예를 들면, 페닐-, 인돌릴-, 알킬티오-, 히드록실-, 아미노-또는 카르복실 치환 알킬일 수 있다.

탈카르바밀화 생성물인 D -α-아미노산은 통상적인 방법, 예컨대 농축, 중화및 이온-교환 크로마토그래피에의해 회수될 수 있다. 비교적 소수성인 D-α-아미노산, 예컨대 D-페닐글리신, D-(4-히드록시페닐) 글리신, D-류신 또는 D-페닐알라닌을 분리하기위해서는, 탈카르바밀화 반응 혼합물을 산성화 또는 알칼리성화하여 불순물을 침전시킨다음, 통상적인 방법으로 예를 들면, 농축 및 중화에의해 처리하여 아미노산을 침전시킨다. D-티에닐글리신, D-세린 및 D-알라닌과 같은 비교적 친수성인 생성물의 분리는 이온 교환 크로마토그래피에의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 암모니아 용액으로의 용출물은 다음에 중화되고 농축된다.

데카르바밀라제에 대한 기질로서의 N-카르바밀-D-아미노산은 5-치환 히단토인으로부터 효소 반응에의해 유도될 수 있다. 이 반응에대한 효소원으로서는, 여러 미생물의 배양 배지, 이로부터 회수된 미생물 (그 자체 또는 더 가공된), 또는 이로부터 추출된 효소를 사용할 수 있다. 이들 공정은 예를 들면, 일본국 특허 공개 공보 제 44690 / 1978 호, 제 69884 / 1978 호, 제 91189 / 1978 호, 제 133688 / 1978 호, 제 84086 / 1979 호 및 제 7001 / 1980 호에 공개되어 있다.

D-카르바밀-α-아미노산은 본 발명에의해 상응하는 광학 활성 D-α-아미노산으로 전환된다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에의해 기술된다.

실시예 1

고체 샘플 (일본국의 여러 장소에서 채취) 을 2 ml의 배지 A (1 g/l KH₂PO₄,1 g/l K₂HPO₄, 0.3 g/l MgSO₄ ^.7H₂O, 0.1 g/l 효모 추출물, 1 g/l NH₄Cl, 1.5 g/l 하기한 바와 같은 탄소원; pH 7.0) 또는 배지 B (1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.3 g/l MgSO₄ ^.7H₂O, 0.5 g/l 글루코오즈, 0.1 g/l 효모 추출물, 1.5 g/l 하기한 바와 같은 질소원; pH 7.0) 에 넣고 28 ℃ 에서 호기적으로 배양한다. 미생물을 동일한 배지내에서의 계대배양에의해서 증식시킨다. 그후에, 배양 배지를 아가 플레이트 (배지 A 또는 B 중에 2 % 아가 함유) 상에 바르고 28 ℃ 에서 2 내지 6 일간 배양하여 균주를 분리한다.

탄소 및 질소원:

N-카르바밀-D-p-히드록시페닐글리신 (C-D-HPG)

N-카르바밀-D-페닐글리신 (C-D-PG)

N-카르바밀-D-알라닌 (C-D-Ala)

DL-5-메틸히단토인 (DL-Ala-hyd)

DL-5-페닐히단토인 (DL-PG-hyd)

DL-5-p-히드록시페닐히단토인 (DL-HPG-hyd)

시트룰린

페닐우레아

n-부틸 카르바메이트

분리 균주를 100 ㎕ 의 기질 용액 (35 mM C-D-HPG, 200 mM 인산 칼륨; pH 7.0) 에 현탁시키고 28 ℃ 에서 1 내지 3 일간 배양시킨다. 그 후에, 현탁액의 샘플을 TLC 에 의해 Merck 60 F₂₅₄플레이트상에서 카르바밀-D-HPG 및 D-HPG 함량에 대하여 분석한다. 샘플을 부탄올 : 아세트 산 : 물 3 : 3 : 1 (v/v/v) 에 의해 전개시킨다. 아미노산을 UV 램프 (254 nm) 에 의해 또는 p-(디메틸아미노)-신남알데히드 및 닌히드린을 분무하여 검출한다. 1868 균주가 사용된 탄소 또는 질소원을 동화시킬 수 있다는 것이 발견된다. 이들중에서, 37 균주가 D-HPG 를 생산하며, 이중 16 균주는 높은 D-HPG 수율을 나타낸다 ( 2 mM).

실시예 2

16 데카르바밀라제 생산 균주를 더 스크리닝한다. 이 목적을 위하여, 이들을 1 ml 의 배지 C (1.5 g/l C-D-HPG, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.3 g/l MgSO₄ ^.7H₂O, 3 g/l 효모 추출물, 3 g/l 고기 추출물, 10 g/l 글리세롤, 2 g/l 폴리펩톤; pH 7.0) 에서 3 일간 28 ℃ 에서 배양한다. 그후에, 1 ml의 배양 배지를 원심분리하여 미생물을 수거하고, 이를 실시예에서 사용된 동일한 100 ㎕의 기질 용액에 현탁시킨다. 30 ℃ 또는 50 ℃에서 24 시간 후에, 현탁액을 D-HPG 함량에 대하여 분석한다.

현탁액의 샘플을 Cosmosil 5C 18 컬럼 (φ 4.6 x 250 mm, Nacarai Tesque) 으로 HPLC 한다. D-HPG 를 물 : 아세토니트릴 : 인산 95 : 5 : 0.01 (v/v/v) 으로 용출한다. D-HPG 농축물에 대하여 254 nm 에서 흡광도를 측정한다. 결과를 제 1 도에 나타낸다.

16 균주중에서, 단독 탄소원으로서의 C-D-Ala 상에서 성장한 세 균주 E 206 a, E 222 C 및 E 215 는 30 ℃에서 매우 활동적이다. E 222 C 에의한 D-HPG 의 수율은 30 ℃ 에서 30.8 mM 이지만 50 ℃에서는 단지 3.5 mM 이다. 단독 탄소원으로서의 C-D-HPG 상에서 배양된 세 균주 A 17 p-1, A 17 p-3 및 A 17 p-4 는 50 ℃에서 매우 활동적이다. A 17 p-4 에의한 D-HPG 의 수율은 50 ℃ 에서 28.8 mM 이나, 30 ℃에서는 단지 2.5 mM 이다.

실시예 3

데카르바밀라제의 기질 특이성

코마모나스 종 E 222 C 및 블라스토박터 종 A 17 p-4 의 데카르바밀라제의 기질 특이성을 측정하기 위하여, 이들 균주를 28 ℃ 에서 배지 C (실시예 2 와 동일)에서 1 일간 (E 222 C) 및 7 일간 (A 17 p-4) 배양한다. 3 ml 의 배양 배지를 원심분리하여 미생물을 분리하고, 이를 300 ㎕ 의 기질 용액 (200 mM 인산 칼륨, 1 % (w/v) 하기한 바와 같은 기질) 에 현탁시키고 30 ℃ (E 222 C) 또는 50 ℃ (A 17 p-4) 에서 24시간 동안 배양한다.

표 1 에 나타낸 바와 같이, 이 미생물 둘다는 N-카르바밀 치환된, 지방족 및 방향족 D-아미노산을 가수분해하는 높은 활성을 갖는다. 그러나, 극성기를 갖는 아미노산의 N-카르바밀 유도체는 덜 가수분해된다. 코마모나스 종 E 222 C 는 β-우레이도프로피온 산을 가수분해할 수 있다. 블라스토박터 종 A 17 p-4 또한 히단토이나제 활성을 갖는 것으로 발견되었다.

신규 데카르바밀라제의 기질 특이성

기 질	기질 전환율
기 질	코마모나스종. E 222 c	블라스토박터종. A 17 p-4
N-카르바밀 -D-알라닌D-발린D-류신D-세린D-페닐알라닌D-페닐글리신D-p-히드록시페닐글리신DL-노르발린DL-노르류신DL-메티오닌DL-트레오닌사르코신β-우레이도프로피온산우레이도숙신산DL-5-메틸히단토인DL-5-페닐히단토인DL-5-p-히드록시페닐히단토인	++++++++++++++++++++++++++++++-++++----	+++++++++-++++++++++++++----++++++

아미노산으로의 전환율 :

- : 0 %

+ : < 10 %

++ : < 50 %

+++ : < 80 %

++++ : 100 %

실시예 4

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 생산에 대한 촉진제

코마모나스 종 E 222 C 의 데카르바밀라제의 수율을 증가시킬 수 있는 물질을 만들기 위하여 연구를 수행하였다.

균주를 영양배지 D (1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.3 g/l MgSO₄ ^.7H₂O, 3 g/l 효모 추출물, 3 g/l 고기 추출물, 10 g/l 글리세롤, 2 g/l 폴리펩톤 ; pH 7.0) 에서 28 ℃ 에서 2 일간 배양한다. 배양배지에 추가로 제 2 도에 기재된 물질을 0.15 % (w/v) 의 농도로 함유시킨다.

1 ml 의 배양배지를 원심분리하여 미생물을 수거하고 이를 100 ㎕ 의 기질 용액 (35 mM C-D-HPG, 200 mM 인산 칼륨; pH 7.0) 에 현탁시킨다. 30 ℃ 에서 24 시간 후에, 실시예 2 에 기재된 절차에 따라서 HPLC 에의해 D-HPG 를 정량한다. 제 2 도에 나타낸 바와 같이, 데카르바밀라제 생산성은 요소, β-우레이도프로피온산, D-페닐글리신 또는 N-카르바밀 -DL-메티오닌에의해 개선될 수 있음이 발견된다.

실시예 5

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 정제

코마모나스 종 E 222 C 를 28 ℃ 에서 3 일간 0.15 % (w/v) 의 β-우레이도프로피온 산을 함유하는 배지 D (실시예 4 와 동일) 에서 배양한다. 총 3.6 l의 배양 배지를 원심분리하여 미생물을 수거하고, 이를 100 ml 의 10 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 에 현탁시키고, 초음파 처리에의해 균질화 한다음 원심분리하여 효소를 함유하는 상청액을 수득한다. 황산 암모늄을 효소 용액에 첨가한다. 20 내지 40 % 포화도의 황산 암모늄 농도에서 침전물 분획을 원심분리하여 효소를 분리하고, 이를 상기 사용한 바와 같은 동일한 완충 용액에 용해 시킨다.

그후, 177 ml 의 효소 용액을 10 l 의 동일한 완충액으로 12 시간 투석하고, DEAE -Sephacel 컬럼 (φ 5 x 15 cm) 내로 충진하고, 선형 구배 0 내지 1 M NaCl 로 용출한다. 용출물을 4 M 의 NaCl 농도로 조정하고 Phenyl-Sepharose CL-4B 컬럼 (φ 1.5 x 15 cm) 로 충진하고, 4 내지 0 M NaCl 의 선형구배로 용출한다. 수득된 분획을 YM-10 멤브레인 (Amicon) 을 통한 한외여과에의해 농축한다.

농축물 (5ml) 을 추가로 0.2 M NaCl 을 함유하는 상기 사용된 바와 같은 동일한 완충 용액으로 Sephacryl S-200 HR 컬럼 (φ 1.8 x 80 cm) 을 통하여 겔-여과한다. 활성 분획을 투석에의해 탈염하고, 히드록시아파타이트 컬럼 (φ 1.2 x 10 cm) 에 충진하고, 0 내지 1 M 인산 칼륨 (pH 7.0) 선형 구배로 용출한다. 활성 용출물 (8.5 ml) 을 12 시간 500 ml 의 10 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 에 대하여 투석하고, Mono Q HR 5/5 컬럼내로 충진하고 0 내지 1.0 M NaCl 의 선형구배로 용출한다. 수득된 활성 분획 (1.2 ml) 을 정제된 효소 용액으로서 분석한다.

표 2 에 나타낸 바와 같이, 정제된 효소 용액의 특이적 활성은 균질화된 세포 현탁액 상청액의 108 배이다. 효소 활성 회수율은 약 2 % 이다. 10 mg 의 정제된 효소를 King and Laemmli 방법 [King, J., Laemmli, U. K., Journal of Molecular Biology, Vol. 62, 165-477 (1971)] 에 따라서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (10 % 폴리아크릴아미드) 한다. 도 3 에 나타낸 바와 같이 MW 38,000 근처에서 단일 밴드가 검출된다.

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 정제

정 제 단 계	단백질(mg)	효소 활성(U)	특이적 활성(U/mg)	회 수 율(%)
1) 세포 균질물의상청액2) 황산 암모늄침전 분획3) DEAE-Sephacel분획4) 페닐-Sepharose분획5) Sephacryl S-200HR 분획6) 히드록시아파타이트분획7) Mono Q HR 5/5분획	6316236214640.023.82.51.5	23.521.221.610.96.60.70.48	0.00370.00900.150.270.280.280.40	10090.291.946.429.13.02.0

또한, 정제된 효소를 0.2 M NaCl 및 0.1 mM 디티오트레이톨 (DTT) 을 함유하는 10 mM 인산 칼륨 (pH 7.0) 으로 Sephadex G-150 컬럼 (φ 1.5 x 85 cm) 을 통하여 겔여과 한다. 효소는 제 4 도에 나타낸 바와 같이 MW 111,000 부근 에서 용출된다.

실시예 6

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 특성

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 최적 pH 및 온도를 실시예 5 에서 수득된 효소 용액을 사용하여 측정한다.

최적 pH 를 하기와 같이 측정한다: 효소 용액을 200 mM 아세테이트-히드로클로라이드 (pH 4.2-5.9), 인산 칼륨 (pH 5.0-8.8), 트리스-히드로클로라이드 (pH 7.6-9.9) 또는 글리신-NaOH (pH 8.9-11.1) 로 완충시킨 10 mM N-카르바밀-D-페닐알라닌과 접촉시킨다. (혼합물의 부피는 500 ㎕ 이다.) 30 ℃ 에서 20 분의 반응시간후에, 반응을 500 ㎕ 의 에탄올을 첨가하여 종결한다.

형성된 D-페닐알라닌을 정량하기위해, 반응 혼합물의 샘플을 200 mM 인산 칼륨 (pH 7.0), 1.5 mM 4-아미노안티피린, 2.1 mM 페놀, 2.25 u 퍼옥시다제 (양고추냉이로 부터 수득, CALZYME Lab.) 및 0.375 단위의 D-아미노산 옥시다제 (Sigma) 를 함유하는 용액에 첨가하여, 총부피를 500 ㎕ 로 한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 60 분간 배양한 후에, 500 nm 에서의 흡광도 증가를 측정한다.

최적 온도를 하기와 같이 측정한다: 효소 용액을 상기 사용된 것과 동일한 기질 용액 (인산 칼륨; pH 7.0 으로 완충됨) 과 20 분간 10-80 ℃ 에서 접촉시킨다. 그 후, 형성된 암모니아를 인도페놀 방법 [Bollter, W. T. 등, Analytical Chemistry, Vol. 33, 592-594 (1961)] 에 의해 정량한다.

결과를 제 5 도 및 제 6 도에 나타낸다. 코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 최적 pH 및 온도는 8-9 와 40 ℃ 인 것으로 발견된다.

실시예 7

코마모나스 종 E 222 C 데카르바밀라제의 아미노산 서열

단백질 데카르바밀라제의 아미노산 서열을 실시예 5 에서 수득된 용액을 사용하여 결정한다. 효소 용액을 Centricon-10 Microcentrater (Amicon) 로 탈염하고 펄스-액체 단백질 시퀀서내로 충진한다. 효소는 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는다 (20 및 26 위치의 Arg 는 불명료한 피이크로 인하여 확인되지 않는다)

실시예 8

블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 생산에 대한 촉진제

블라스토박터 종 A 17 p-4 의 데카르바밀라제의 수율을 증가시킬 수 있는 물질을 만들기 위하여 연구를 수행하였다.

균주를 제 7 도에 나타낸 바와 같은 물질을 0.15 % (w/v) 로 추가로 함유하는 영양배지 D (실시예 4 에 정의된 바와 동일) 에서 28 ℃ 에서 3 일간 배양한다. 그 다음에, D-HPG 를 실시예 4 와 동일한 방법으로 형성하나 반응 온도는 40 ℃ 이고, HPLC 에 의해 정량한다. 제 7 도에 나타낸 바와 같이, 데카르바밀라제 수율은 우라실, 디히드로우라실 또는 β-우레이도프로피온산 존재하에 증가된다.

금속 이온의 효소 생산성에 대한 효과를 시험하기위하여, 균주를 제 8 도에 나타낸 바와 같이 0.15 % (w/v) 의 우라실 및 2 mM 금속 이온을 추가로 함유하는 배지 D 내에서 28 ℃ 에서 4 일간 배양한다. D-HPG 를 정량함으로써, Fe²⁺, Fe³⁺, Li⁺, Cs⁺, Be²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺및 Al³⁺과 같은 이온이 데카르바밀라제를 증가시킨다는 것을 발견하였다.

실시예 9

블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 정제

블라스토박터 종 A 17 p -4 를 28 ℃ 에서 7 일간 0.15 % (w/v) 의 우라실 및 2 mM FeSO₄ ^.7H₂O 를 추가로 함유하는 배지 D (실시예 4 와 동일) 에서 배양한다. 총 4.8 l의 배양 배지를 원심분리하여 미생물을 분리하고, 이를 120 ml 의 10 mM 인산 칼륨에 현탁시키고, 5 ℃ 에서 20 분간 유리 비이드 [직경: 0.25 mm; Dyno-Mill KDL, 스위스] 로 균질화 한다음 원심분리하여 조효소 용액을 상청액으로서 수득한다. 황산 암모늄을 효소 용액에 첨가하여 20-40 % 포화도의 황산 암모늄 농도에서 분획을 침전시킨다. 침전물을 원심분리에의해 분리하고, 이를 상기 사용한 바와 같은 동일한 완충 용액에 용해 시킨다.

그후, 41 ml 의 효소 용액을 5 l 의 상기 사용된 바와 같은 동일한 완충액으로 12 시간 투석하고, DEAE -Sephacel 컬럼 및 페닐-Sepharose CL-6B 컬럼으로 정제하고 실시예 5 와 동일한 방법으로 한외여과하여 농축한다. 농축물 (3 ml) 을 상기한 바와 같은 동일한 완충용액 (0.2 M NaCl 을 추가로 함유) 으로 Sephadex G-150 (φ 1.5 x 80 cm) 컬럼을 통하여 겔여과 하고, 투석에의해 탈염하고, 실시예 5 와 동일한 방법으로 Mono Q HR 5/5 컬럼으로 정제한다. 이렇게 수득된 활성 분획 (2 ml) 을 정제된 효소 용액으로서 분석한다. 표 3 에 나타낸 바와 같이, 정제된 효소 용액의 특이적 활성은 균질화된 세포 현탁액 상청액의 37 배 이다. 효소 활성 회수율은 2.3 % 이다.

블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 정제

정 제 단 계	단백질(mg)	효소활성(U)	특이적 활성(U/mg)	회수율(%)
1) 세포 균질물의상청액2) 황산 암모늄침전 분획3) DEAE-Sephacel분획4) 페닐-셀룰로오즈분획5) Sephadex G-150분획6) Mono Q HR 5/5분획	465779728489.615.42.9	52.030.218.37.64.11.2	0.0110.0380.0640.0850.270.41	10058.135.214.67.92.3

정제된 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한다. MW 39,000 부근에서 단일 밴드가 검출된다; 제 9 도 참조. 또한, 정제된 효소를 실시예 5 와 동일한 방법으로 Sephadex G-150 컬럼을 통하여 겔-여과 한다. 효소는 MW 120,000 에서 용출된다; 제 10 도 참조.

실시예 10

블라스토 박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 특성

블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 최적 pH 및 온도를 실시예 9 에서 수득된 효소 용액을 사용하여 실시예 6 과 동일한 방법으로 측정한다. 결과를 제 11 도 및 제 12 도에 나타낸다. 블라스토박터 종 A 17 p -4 데카르바밀라제의 최적 pH 및 온도는 9 와 50 ℃ 이다.

실시예 11

블라스토박터 종 A 17 p-4 데카르바밀라제의 아미노산 서열

단백질 데카르바밀라제의 아미노산 서열을 실시예 9 에서 수득된 효소 용액을 사용하여 실시예 7 과 동일한 방법으로 측정한다. 효소는 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는다 (38 위치의 Arg 는 불명료한 피이크로 인하여 확인되지 않는다):

실시예 12

표 4 에 나타낸 리조븀 및 브라디리조븀 속의 7 균주를 1 g/l 의 최종농도로 C-D-HPG 또는 C-D-Ala 를 함유하는 1ml 의 805 액체 배지 (효모 추출물 1 g/l, 만니톨 5 g/l, K₂HPO₄0.7 g/l,KH₂PO₄0.1 g/l, MgSO₄ ^.7 H₂O 1 g/l,C-D-HPG 1 g/l; pH 7.0) 내에서 30 ℃ 에서 24시간동안 배양시킨다. 배양배지를 원심분리하여 미생물을 분리하고, 이를 0.5 ml 의 기질 용액 (1 % C-D-HPG 또는 C-D-Ala, 0.1 M 인산 칼륨 (pH 7.0), 0.1 % 트리톤 X-100) 에 현탁시킨다. 현탁액을 37 ℃ 에서 24 시간 배양하고 TLC 에의해 실시예 1 과 동일한 방법으로 분석한다. 탈카르바밀화 활성은 표 4 에 나타낸 바와 같이 브라디리조븀 속에서 발견된다.

균주	데카르바밀라제 활성
리조븀 로티 IFO 14779리조븀 멜리로티 IFO 14782리조븀 프레디 IFO 14780리조븀 갈레게 IFO 14965리조븀 후아쿠이 IFO 15243브라디리조븀 자포니쿰 IFO 14783브라디리조븀 종 IFO 15003	+++++++++++

실시예 13

토양 샘플을 실시예 1 과 동일한 방법으로 또다른 스크리닝을 한다. N-카르바밀-D-류신 (C-D-Leu), N -카르바밀 -D-알라닌 (C-D -Ala), N-카르바밀-D-페닐글리신 (C-D-PG) 또는 DL-5-메틸히단토인 (DL-Ala-hyd) 을 탄소 또는 질소원으로서 사용한다. 성장한 다른 균주중에서, 9 개 균주를 실시예 12 에 기재된 방법에 따라서 C-D-Ala 또는 C-D-HPG 에 대한 데카르바밀라제의 활성을 시험한다. 결과를 표 5 에 나타낸다. 어떤 균주는 C-D-Ala 보다 C-D-HPG 에 대하여 더 특이적이고, 또다른 균주는 C-D-HPG 보다 C-D-Ala 에 대하여 더 특이적이다.

균주	기질	활성
리조븀 종 KNK 1415알칼리제네스 크실로속시단스아종 데니트리피칸스CL 66-2aCL 67-1CL 85-1CA 17-1아르트로박터 종CA 17-2CA 77-2AH 71-1AH 57-1	C-D-PGC-D-LeuC-D-LeuC-D-LeuC-D-AlaC-D-AlaC-D-AlaDL-Ala-hydDL-Ala-hyd	+++ (C-D-HPG)++ (C-D-HPG)++ (C-D-HPG)+ (C-D-HPG)+ (C-D-Ala)++ (C-D-Ala)++ (C-D-Ala)+ (C-D-Ala)++ (C-D-Ala)

실시예 14

실시예 13 에서 수득한 리조븀 종 KNK 1415 의 균주를 10 l 의 SE 배지 ( 슈크로오즈 23 g/l, 효모 추출물 4g/l, 요소 2 g/l, KH₂PO₄2g/l, Na₂HPO₄2g/l, MgSO₄ ^.7 H₂O 1g/l, MnCl₂ ^.4 H₂O 0.01 g/l; pH 6.5) 내에서 30 ℃에서 40 시간 배양한다. 배양 배지를 원심분리하여 미생물을 분리하고, 이를 0.9 % 식염수로 세척하고, 초음파처리에 의해 균질화하고, 원심분리한다. 상청액을 황산 프로타민 (0.1 mg/mg 단백질) 으로 탈핵을 위하여 처리한다음 원심분리한다. 상청액을 30 분간 50 ℃로 가열하고 원심분리하여 변성된 단백질을 제거한다. 이 용액에, 황산 암모늄을 30 % 포화도의 농도로 첨가한다. 황산 암모늄 침전물을 원심분리에의해 수거하고, 500 ml 의 완충액 용액 (20 mM Tris^.HCl (pH 7.5), 2 mM DTT) 에 용해하고, 동일한 완충용액에 대하여 투석한다음, DEAE-셀룰로오즈 컬럼에 충진하고 용액 (10 mM 인산 나트륨 (pH 7.2), 0.15 M NaCl, 1 mM DTT) 으로 용출한다. 용출물을 YM-10 막 (Amicon) 으로 한외여과에의해 농축하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에의해 분석한다. 효소 데카르바밀라제는 약 35,000 에서 검출된다.

실시예 15

실시예 14 로부터의 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 데카르바밀라제의 밴드 부분을 절단하고, 완충용액 (50 mM Tris^.HCl (pH 7.5), 0.1 % SDS, 0.1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 5 mM DTT) 내에 균질화하고 실온에서 용출한다. 추출물을 한외여과에의해 농축하고, 역상 HPLC 컬럼 (AP-303; YMC) 내로 충진하고 구배 아세토니트릴로용출한다. 수득된 데카르바밀라제 함유 분획을 기체상 단백질 시퀀서(Applied Biosystems)내로 충진한다. 효소는 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는다:

본 발명에 따른 신규 데카르바밀라제를 사용함으로써, 항생제와 같은 의약품의 제조를 위한 중요한 중간체인 D-α-아미노산을 pH 8-9 및 50 ℃ 와 같은 통상적인 조건하에서 보다 효율적으로 제조할 수 있다.

Claims

8 내지 9의 최적 pH 및 40 내지 50 ℃의 최적 온도를 가지며, 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는, 코마모나스종 E 222 C 를 영양배지에서 배양함으로써 데카르바밀라제를 제조하는 방법:
8 내지 9의 최적 pH 및 40 내지 50 ℃의 최적 온도를 가지며, 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는, 블라스토박터종 A 17 p-4 를 영양배지에서 배양함으로써 데카르바밀라제를 제조하는 방법:
8 내지 9의 최적 pH 및 40 내지 50 ℃의 최적 온도를 가지며, 아미노 말단에서 하기 아미노산 서열을 갖는, 리조븀종 KNK 1415 를 영양배지에서 배양함으로써데카르바밀라제를 제조하는 방법: