WO1993003140A1 - Verbesserung der regeneration von oligodendrocyten - Google Patents

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WO1993003140A1
WO1993003140A1 PCT/EP1992/001173 EP9201173W WO9303140A1 WO 1993003140 A1 WO1993003140 A1 WO 1993003140A1 EP 9201173 W EP9201173 W EP 9201173W WO 9303140 A1 WO9303140 A1 WO 9303140A1
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WO
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ngf
oligodendrocytes
pharmaceutical composition
human
demyelination
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PCT/EP1992/001173
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Hans-Hinrich Althaus
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the regeneration of oligodendrocytes, in particular human oligodendrocytes. Furthermore, the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of diseases in which demyelination of nerve fibers occurs, and a method for their production.
  • the covering of nerve fibers in the central nervous system (CNS) with myelin is essential for the functioning of the transmission of neuronal signals.
  • the myelin sheath is formed by oligodendrocytes (OL), which wind their fibers around the axon of a nerve cell.
  • OL oligodendrocytes
  • Diseases such as multiple sclerosis, in which the myelin sheath of the axon is damaged or destroyed, also damage the OL.
  • PNS peripheral nervous system
  • remyelination of nerve cells in the adult CNS is functionally ineffective.
  • the identification and characterization of factors which are responsible for the regeneration of OL is therefore very important for the molecular understanding of demyelinating diseases and the development of therapeutic agents.
  • oligodendrocytes isolated from adult pig brain regenerate in vitro when cultivated and form a fiber network within 14 days (Althaus et al. (1984), Naturwissenschaften 71, 309-315). These OL cultures therefore represent an excellent test system for the determination of substances which stimulate the regeneration of OL. It has already been shown that phorbol esters such as phorbol-12-myristat-13-acetate (TPA) fiber regeneration the OL can increase significantly. Phorbol esters occur in the milk juice of the spurge family or in croton oil from the seeds of the Indian Croton tiglium. However, they are considered a possible medicine to treat demyelinating Diseases completely unsuitable because they have a strong local irritant and co-carcinogenic effect.
  • TPA phorbol-12-myristat-13-acetate
  • the object of the present invention was therefore to find a substance which brings about an improvement in the regeneration of oligodendrocytes and at the same time has no toxicity.
  • the object of the invention is achieved by a method for improving the regeneration of oligodendrocytes, in particular human oligodendrocytes, which is characterized in that oligodendrocytes are treated in cell culture with nerve growth factor (NGF) or active fragments of NGF.
  • NGF nerve growth factor
  • NGF active fragment of NGF
  • natural NGF in particular natural human or urine NGF and all fragments or derivatives of NGF which have its biological activity, ie an improvement in fiber regeneration of oligodendrocytes in vitro and / or the proliferation of mature oligodendrocytes.
  • NGF molecules which are suitable for the method according to the invention are, for example, NGF- ⁇ , NGF 2.5S or NGF 7S from the submaxillary gland of the mouse. These NGF molecules are commercially available, for example, from Sigma-S. Louis or Boehringer Mannheim.
  • the inventive method is carried out with a human NGF, particularly preferably 'by using human rekom- binantem NGF-beta.
  • a human NGF particularly preferably 'by using human rekom- binantem NGF-beta.
  • the production of an active NGF fragment by tryptic digestion of NGF is described by Mercanti et al. (Biochim.Biophys.Acta 496 (1977), 412-419).
  • This fragment consists of two linear oligopeptides linked by a disulfide bridge and contains amino acid residues 10 to 25 and 75 to 88 of the amino acid sequence of NGF (according to the nomenclature by Angeletti and Bradshaw (1970), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 68, 2417-2421).
  • oligodendrocytes in cell culture were treated with NGF (NGF 2.5S or human recombinant NGF), the fiber regeneration of the OL was improved in a manner similar to treatment with phorbol esters, but with a somewhat different time course.
  • NGF NGF 2.5S or human recombinant NGF
  • OL was treated with phorbol ester, a fiber network was created after only 24 hours, whereas 48 hours were required in the presence of NGF.
  • the NGF effect was inhibited by anti-NGF antibodies.
  • NGF activity concentrations did not result in faster regeneration of the OL fibers, but it was found that the extent of the fiber elongation and branching was concentration-dependent. NGF was able to improve fiber production in all oligodendrocytes that survived for at least the test period (2 weeks).
  • NGF 2.5S was found to induce the proliferation of a subclass of cultured mature OL. Similar results were obtained with human recombinant NGF. This effect was concentration-dependent and only occurred when the cells were treated with NGF for more than 24 hours. The induction of proliferation was blocked by anti-NGF antibodies. The highest rate of NGF proliferation was found when the cells were treated with a combination of phorbol ester and NGF.
  • NGF nerve growth factor
  • oligodendrocytes are treated with a combination of NGF and one or more protease inhibitors.
  • An example of a suitable and preferred protease inhibitor is aprotinin, which is marketed, for example, by Bayer-Leverkusen under the trade name "Trasylol”.
  • Another object of the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of diseases in which demyelination of nerve fibers occurs, and which as an active ingredient NGF or an active fragment thereof, optionally together with pharmaceutically customary carriers, auxiliaries, fillers and Contains diluents.
  • the pharmaceutical composition preferably contains human NGF, preferably human recombinant NGF- ⁇ .
  • the composition can contain one or more pharmaceutically acceptable protease inhibitors, for example aprotinin.
  • the invention further relates to a method for producing a pharmaceutical composition for the treatment of diseases in which demyelination of nerve fibers occurs, which contains NGF or an active fragment thereof as active ingredient, optionally together with pharmaceutically customary carriers, auxiliaries, fillers and diluents , preferably using human NGF, particularly preferably human recombinant NGF- ⁇ , as the active ingredient.
  • compositions according to the invention can be processed with therapeutically acceptable carrier substances for the production of pharmaceutical preparations.
  • Suitable carriers for the preparation of such solutions are water, polyols, sucrose, invert sugar and glucose.
  • Suitable carriers for injection solutions are water, alcohols, polyols, glycerin and vegetable oils.
  • the pharmaceutical preparations can also contain preservatives, solvents, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for changing the osmotic pressure, buffers and, if appropriate, other therapeutic agents.
  • Diseases in which demyelination of nerve fibers occurs and which are prevented with the aid of the pharmaceutical see composition are treatable, can be caused by inflammation, autoimmune processes, enzymes or toxins. Examples of such diseases are multiple sclerosis, slow virus encephaly, various forms of myelitis or heavy metal poisoning.
  • composition according to the invention is preferably applied systemically.
  • the application can be carried out by the methods familiar to the person skilled in the art, for example intracisternal C, intravenously or peripherally.
  • NGF can be suspended, for example in physiological saline.
  • protease inhibitors e.g. Aprotinin
  • the preferred lower limit of the daily dose of NGF is at a concentration of 10 ng NGF / l blood, while the preferred upper limit is 300 ng NGF / l.
  • the administration of NGF is preferably over a longer period, i.e. at least 48 hours.
  • Figure 1 shows the fiber growth of oligodendrocytes in the presence of NGF
  • FIG. 2 shows the incorporation of [ 3 H] thymidine into cultured oligodendrocytes in the presence of various growth factors.
  • example 1 shows the incorporation of [ 3 H] thymidine into cultured oligodendrocytes in the presence of various growth factors.
  • Oligodendrocytes were obtained from the corpus callosum from about 1 year old pigs via a density gradient and then brought into culture (Gebicke-Harter et al. (1984), J. Neurochem. 42, 357-368). The cells were sown on Petri dishes coated with poly-D-lysine and in a medium consisting of MEM / HAM's F-10 (1: 1 v / v), 10% fetal calf serum and transferrin (10 ⁇ g / ml), insulin 5 ⁇ g / ml and mezlocillin (40 ⁇ g / ml) cultivated under normal culture conditions (5% C0 2 , 37 ° C).
  • the cells were mature oligodendrocytes, they were immunocytochemical GC + , WP + (marker for mature OL), A 2 B 5 "(marker for OL progenitor cells) and 0X42" (marker for Microglial cells). Monoclonal antibodies and polyclonal antisera were used as markers.
  • NGF human recombinant NGF- ⁇ , 100 ng / ml
  • trasylol 1000 U / ml, Bayer Leverkusen
  • the protease inhibition caused by Trasylol ensured a more constant NGF level during the cultivation.
  • FIG. 1 shows a comparison of the fiber length between untreated control cells, NGF-treated cells and phorbol ester (TPA) -treated cells.
  • Oligodendrocytes were treated on poly-D-lysine-coated multi-well culture plates (160,000 cells / well) after 6 days in vitro with various growth factors (plus trasylol) with the concentrations shown in Table '1, the culture medium being renewed daily has been.
  • the proliferation of the oligodendrocytes was measured by the incorporation of [ 3 H] thymidine at 24-hour intervals. Each treatment was performed twice and repeated at least twice. The standard deviation between the individual samples was in the range from 20 to 25%.
  • nterleukin-2 100-10000 / ml human, recombinant 6.
  • EGF l-100ng / ml mouse submaxillary
  • PDGF (2-10ng / ml) human platelet derived growth factor
  • the various growth factors were obtained from Sigma-St.Louis (1,2,5,7,9) and Boehringer Mannheim (1-3, 8).
  • the culture medium which was renewed daily, was mixed with 10% fetal calf serum and contained the growth factors in the above-mentioned final concentrations + 1000 U / ml trasylol.
  • IGF I and II the usual insulin concentration was reduced from 5 ⁇ g to 0.5 ⁇ g / ml.
  • the fiber formation was classified as follows:
  • FIG. 2 shows the incorporation of [ 3 H] thymidine in the presence of various growth factors. It can be seen that, in addition to phorbol ester (TPA), only NGF has an effect on the proliferation of OL. In the presence of anti-NGF antibodies, cell proliferation generated by NGF is completely inhibited.
  • TPA phorbol ester

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Regeneration von Oligodendrocyten, insbesondere von humanen Oligodendrocyten, bei dem man Oligodendrocyten in Zellkultur mit Nerve Growth Factor (NGF) oder aktiven Fragmenten von NGF behandelt. Weiterhin wird eine Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, offenbart, die als Wirkstoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln enthält.

Description

Verbesserung der Regeneration von Oligc<_3ndrocyten
B e s c h r e i b u n g
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbes¬ serung der Regeneration von Oligodendrocyten, insbesondere von humanen Oligodendrocyten. Weiterhin betrifft die Erfin¬ dung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Die Umhüllung von Nervenfasern im zentralen Nervensystem (ZNS) mit Myelin ist essentiell für das Funktionieren der Weitergabe von neuronalen Signalen. Die Myelinhülle wird von Oligodendrocyten (OL) gebildet, die ihre Fasern um das Axon einer Nervenzelle wickeln. Krankheiten, wie etwa Multiple Sklerose, bei denen die Myelinhülle des Axons geschädigt oder zerstört wird, führen auch zu Schädigungen der OL. Im Gegen¬ satz zum peripheren Nervensystem (PNS) ist eine Remyelinie- rung von Nervenzellen im adulten ZNS funktional unwirksam. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von Fak¬ toren, die für die Regenerierung von OL verantwortlich sind, für das molekulare Verständnis von demyelinierenden Krankhei¬ ten und die Entwicklung von therapeutischen Mitteln sehr bedeutsam.
Reife Oligodendrocyten, die aus adultem Schweinehirn isoliert wurden, regenerieren bei Kultivierung in vitro und bilden innerhalb 14 Tagen ein Fasernetzwerk aus (Althaus et al. (1984), Naturwissenschaften 71, 309-315). Diese OL-Kulturen stellen daher ein hervorragendes Testsystem zur Ermittlung von Substanzen dar, welche die Regenerierung von OL stimulie¬ ren. Es wurde damit bereits gezeigt, daß Phorbolester wie etwa Phorbol-12-myristat-13-acetat (TPA) die Faserregenera¬ tion der OL erheblich steigern können. Phorbolester kommen im Milchsaft der Wolfsmilchgewächse oder in Crotonöl aus den Samen des indischen Croton tiglium vor. Sie sind jedoch als mögliche Arzneimittel zur Behandlung von demyelinierden Krankheiten völlig ungeeignet, da sie stark lokal reizend und kokarzinogen wirken.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Sub¬ stanz zu finden, die eine Verbesserung der Regeneration von Oligodendrocyten bewirkt und zugleich keine Toxizität auf¬ weist.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Verbesserung der Regeneration von Oligodendrocyten, insbeson¬ dere humanen Oligodendrocyten gelöst, welches dadurch gekenn¬ zeichnet ist, daß man Oligodendrocyten in Zellkultur mit Nerve Growth Factor (NGF) oder aktiven Fragmenten von NGF behandel .
Die Bezeichnung "NGF" oder "aktives Fragment von NGF" im Sinne der vorliegenden Erfindug betrifft natürlichen NGF, insbesondere natürlichen humanen oder urinen NGF und alle Fragmente oder Derivate von NGF, die dessen biologische Akti¬ vität aufweisen, d.h. eine Verbesserung der Faserregenerie¬ rung von Oligodendrocyten in vitro oder/und die Proliferation von reifen Oligodendrocyten bewirken. Beispiele für NGF-Mole¬ küle, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, sind etwa NGF-ß, NGF 2,5S oder NGF 7S aus der Submaxillaris- Drüse der Maus. Diese NGF-Moleküle sind beispielsweise von Sigma-S .Louis oder Boehringer Mannheim kommerziell erhält¬ lich. Vorzugsweise führt man das erfindungsgemäße Verfahren mit einem humanen NGF, besonders bevorzugt' mit humanem rekom- binantem NGF-ß durch. Die Herstellung eines aktiven NGF-Frag- ents durch tryptische Verdauung von NGF ist bei Mercanti et al. (Biochim.Biophys.Acta 496 (1977), 412-419) beschrieben. Dieses Fragment besteht aus zwei linearen Oligopeptiden, die durch eine Disulfidbrücke verknüpft sind, und enthält die Aminosäurereste 10 bis 25 und 75 bis 88 der Aminosäuresequenz von NGF (entsprechend der Nomenklatur von Angeletti und Bradshaw (1970), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 68, 2417-2421). Bei Behandlung von Oligodendrocyten in Zellkultur mit NGF (NGF 2,5S oder humaner rekombinanter NGF) wurde die Faserre¬ generation der OL ähnlich wie bei Behandlung mit Phorbol- estern, aber mit einem etwas anderen zeitlichen Verlauf verbessert. So wurde bei Behandlung von OL mit Phorbolester ein Fasernetzwerk bereits nach 24 Stunden erzeugt, während dafür in Gegenwart von NGF 48 Stunden erforderlich waren. Die NGF-Wirkung wurde durch Anti-NGF-Antikörper inhibiert.
Steigende NGF-Wirkungskonzentrationen ergaben keine schnelle¬ re Regeneration der OL-Fasern, es wurde jedoch gefunden, daß das Ausmaß der Fasereϊongation und -Verzweigung konzentra¬ tionsabhängig war. Durch NGF konnte die Faserproduktion in allen Oligodendrocyten verbessert werden, welche mindestens für die Untersuchungsdauer (2 Wochen) überlebten.
Zusätzlich wurde festgestellt, daß NGF 2,5S die Proliferation einer Subklasse von kultivierten reifen OL induziert. Mit humanem rekombinantem NGF wurden ähnliche Resultate erhalten. Diese Wirkung war konzentrationsabhängig und trat erst auf, wenn die Zellen länger als 24 Stunden mit NGF behandelt wur¬ den. Die Induzierung der Proliferation wurde durch Anti-NGF- Antikörper blockiert. Die höchste Rate der NGF-Proliferation wurde bei Behandlung der Zellen mit einer Kombination von Phorbolester und NGF gefunden.
Die Wirkung von NGF kann auch verbessert werden, wenn die Behandlung der Oligodendrocyten mit einer Kombination von NGF und einem oder mehreren Proteasehemmstoffen erfolgt. Ein Beispiel für einen geeigneten und bevorzugten Proteasehemm¬ stoff ist Aprotinin, das beispielsweise unter dem Handelsna¬ men "Trasylol" von Bayer-Leverkusen vertrieben wird. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krankhei¬ ten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, und die als Wirkstoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln enthält. Vorzugsweise enthält die pharmazeutische Zusammensetzung humanen NGF, vorzugsweise humanen rekombinaten NGF-ß. Weiterhin kann die Zusammensetzung einen oder mehrere pharmazeutisch verträgli¬ che Proteasehemmstoffe, beispielsweise Aprotinin enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, die als Wirkstoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln enthält, wobei man vorzugsweise als Wirkstoff humanen NGF, besonders bevor¬ zugt humanen rekombinanten NGF-ß verwendet.
Für die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten können die erfindungsgemäß n Zusammensetzungen mit therapeutisch akzeptablen Trägersubstanzen verarbeitet werden. Geeignete Träger für die Herstellung von derartigen Lösungen sind Was¬ ser, Polyole, Saccharose, Invertzucker und Glucose. Geeignete Träger für Injektionslösungen sind Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerin und pflanzliche Öle.
Die pharmazeutischen Präparate können ferner Konservierungs¬ mittel, Lösungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffer sowie gegebenenfalls andere therapeutische Wirkstoffe enthalten.
Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt und die mit Hilfe der erfindungsgemäßen pharmazeuti- sehen Zusammensetzung behandelbar sind, können etwa durch Entzündungen, autoimmunologische Prozesse, Enzyme oder Toxine hervorgerufen werden. Beispiele für solche Krankheiten sind etwa Multiple Sklerose, Slow Virus Enzephalie, verschiedene Formen der Myelitis oder Schwermetallvergiftungen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird vorzugsweise syste¬ misch appliziert. Die Applikation kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intrazisternal C, intravenös oder peripher. Zur intrazisternalen oder intra¬ venösen Applikation kann NGF, beispielsweise in physiologi¬ scher Kochsalzlösung, suspendiert sein.
Die Zugabe von Proteasehemmstoffen, z.B. Aprotinin, ist bei täglicher Verabreichung von NGF nicht zwingend erforderlich, bietet aber einen Schutz gegenüber Proteasen, die NGF unwirk¬ sam machen könnten. Die bevorzugte Untergrenze der täglich verabreichten NGF-Dosis liegt bei einer Konzentration von 10 ng NGF/ l Blut, während die bevorzugte Obergrenze bei 300 ng NGF/ l liegt. Die Verabreichung von NGF erfolgt vorzugsweise über einen längeren Zeitraum, d.h. mindestens 48 Stunden.
Die vorliegende Erfindung soll weiterhin durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Figuren 1 und 2 verdeutlicht werden. Es zeigen:
Figur 1 das Faserwachstum von Oligodendrocyten in Gegenwart von NGF und
Figur 2 den Einbau von [3H] Thymidin in kultivierte Oligo¬ dendrocyten in Gegenwart verschiedener Wachstums¬ faktoren. Beispiel 1
Kultivierung von Oligodendrocyten
Oligodendrocyten wurden aus dem Corpus callosum von ca. 1- j hrigen Schweinen über einen Dichtegradienten gewonnen und anschließend in Kultur gebracht (Gebicke-Harter et al. (1984), J.Neurochem. 42, 357-368). Die Zellen wurden auf Poly-D-lysin beschichtete Petrischalen ausgesät und in einem Medium bestehend aus MEM/HAM's F-10 (1:1 v/v), 10 % fötalem Kälberserum sowie Transferrin (10 μg/ml), Insulin 5 μg/ml und Mezlocillin (40 μg/ml) bei üblichen Kulturbedingungen (5 % C02 , 37°C) kultiviert. Aufgrund ihrer Oberflächencharakteri- stika handelte es sich bei den Zellen um reife Oligodendrocy¬ ten, sie waren immunocytochemisch GC+ , WP+ (Marker für reife OL), A2B5" (Marker für OL-Vorlauferzellen) und 0X42" (Marker für Mikrogliazellen) . Als Marker wurden monoklonale Antikör¬ per und polyklonale Antiseren verwendet.
Beispiel 2
Wachstum von Oligodendrocytenfasern in Gegenwart von NGF
Zu Oligodendrocyten aus Beispiel 1 wurden nach 6 Tagen Kulti¬ vierung in vitro NGF (humaner rekombinanter NGF-ß, 100 ng/ml) und Trasylol (1000 U/ml, Bayer Leverkusen) zum Kulturmedium gegeben, das täglich erneuert wurde. Die durch Trasylol ver¬ ursachte Proteasehemmung sorgte für einen konstanteren NGF- Spiegel während der Kultivierung. Nach zweitägiger Behandlung wurden die Zellen fixiert und elektronenmikroskopisch unter¬ sucht. Figur 1 zeigt einen Vergleich der Faserlänge zwischen unbehandelten Kontrollzellen, NGF-behandelten Zellen und Phorbolester (TPA)-behandelten Zellen. Die Faserlänge, die anhand vergrößerter Phasenkontrastphotographien ermittelt wurde, zeigte in Kontrollkulturen und NGF-behandelten Kultu¬ ren einen statistisch signifikanten Unterschied (t-Test, Faserlänge/Zellzahl, p < 0,001), wie es auch bei TPA-behan- delten Kulturen der Fall war. Beispiel 3
Proliferation von reifen Oligodendrocyten in Gegenwart von
NGF
Oligodendrocyten- wurden auf Poly-D-Lysin-beschichteten Multi- well-Kulturplatten (160.000 Zellen/Well) nach 6 Tagen in vitro mit verschiedenen Wachstumsf ktoren (plus Trasylol) mit den in Tabelle' 1 gezeigten Konzentrationen behandelt, wobei das Kulturmedium täglich erneuert wurde. Die Proliferation der Oligodendrocyten wurde über den Einbau von [3 H]-Thymidin in 24-stündigen Intervallen gemessen. Jede Behandlung wurde doppelt durchgeführt und mindestens zweimal wiederholt. Die Standardabweichung zwischen den einzelnen Proben war im Be¬ reich von 20 bis 25 %.
Tabelle 1
Getestete Substanz OL-Faserbildung Herkunft der Substanz
l.NGF (2,5 S) Maus-Submaxillaris- (10-300ng/ml) Drüse
2. GF (2,5 S) (100 ng/ml)
+ anti-NGF/1:200) Kaninchen (polyklonal)
3.NGF-ß
(10-lOOng/ml) human, reko binant
4.Trasylol Händelsname von Apro- (lOOOU/ml) tinin, Bayer-Lever¬ kusen
5. nterleukin-2 (100-lOOOU/ml) human, rekombinant 6. EGF ( l-100ng/ml) Maus-Submaxillaris-
(Epidermal Growth Factor) Drüse
7.FGF (a/b) (l-200ng/ml) Rind (Fibroblast Growth Factor)
8.IGF I/II
(10-100ng/ml) human, rekombinant (Insulinlike Growth Factor)
9.PDGF (2-10ng/ml) humane Plättchenzellen (Platelet Derived Growth Factor)
Die verschiedenen Wachstumsfaktoren wurden von Sigma-St.Louis (1,2,5,7,9) und Boehringer Mannheim (1-3, 8) bezogen. Das täglich erneuerte Kulturmedium wurde mit 10 % fötalem Kälber¬ serum versetzt und enthielt die Wachstumsfaktoren in den jeweils oben angegebenen Endkonzentrationen + 1000 U/ml Tra¬ sylol. Bei IGF I und II wurde die gewöhnliche Insulinkonzen¬ tration von 5 μg auf 0,5 μg/ml verringert. Die Faserbildung wurde wie folgt klassifiziert:
= einige kurze (mit einer Länge von 3-4x des Körperdurch¬ messers) Fasern und sehr wenige Verzweigungen vorhanden, entspricht den Kontrollkulturen; + Fasernetzwerk mit verstärktem Stoffwechsel.
Figur 2 zeigt den Einbau von [3 H]-Thymidin in Gegenwart ver¬ schiedener Wachstumsfaktoren. Dabei ist ersichtlich, daß neben Phorbolester (TPA) nur NGF eine Wirkung auf die Proli- feration von OL zeigt. In Gegenwart von Anti-NGF-Antikörper wird die durch NGF erzeugte Zellproliferation vollständig inhibiert.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Verbesserung der Regeneration von Oligo¬ dendrocyten, insbesondere von humanen Oligodendrocyten, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Oligodendrocyten in Zellkultur mit Nerve Growth Factor (NGF) oder aktiven Fragmenten von NGF behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Behandlung mit humanem rekombinantem NGF-ß durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man weiterhin einen oder mehrere Proteasehemmstoffe zusetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man Aprotinin als Proteasehemmstoff verwendet.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfa¬ sern eintritt, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie als Wirkstoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch übli¬ chen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln ent¬ hält.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie als Wirkstoff humanes reko binantes NGF-ß ent¬ hält. - 1*0-
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie weiterhin einen oder mehrere Proteasehemmstoffe enthält.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß sie als Proteasehemmstoff Aprotinin enthält.
9. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusam¬ mensetzung zur Behandlung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, die als Wirkstoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebe¬ nenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man als Wirksto f humanes rekombinantes NGF verwen¬ det.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zusammensetzung weiterhin einen oder mehrere Proteasehemmstoffe enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Zusammensetzung als Proteasehemmstoff Aprotinin enthält.
13. Verfahren zur Bekämpfung von Krankheiten, bei denen eine Demyelinierung von Nervenfasern eintritt, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Zusammensetzung verabreicht, die als Wirk¬ stoff NGF oder ein aktives Fragment davon, gegebenen- falls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs-, Füll- und Verdünnungsmitteln enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Zusammensetzung intravenös verabreicht.
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