WO1991007416A1

WO1991007416A1 - Nouveau derive de glucosamine et liposome le contenant en tant que composant de membrane

Info

Publication number: WO1991007416A1
Application number: PCT/JP1990/001458
Authority: WO
Inventors: Koichiro Miyajima; Kaoru Fuji
Original assignee: Japan Tobacco Inc.
Priority date: 1989-11-09
Filing date: 1990-11-09
Publication date: 1991-05-30
Also published as: CA2045550A1; EP0457910A1; EP0457910A4

Description

明細書

新規ダルコサミン誘導体およびこれを

膜構成成分として含有するリポソーム

〔技術分野〕

本発明は、カチオン性リボソームの膜構成成分、カチオン性界面活性剤および抗体産生用アジュバントとして有用な新規ダルコサミン誘導体に関する。

また、本発明は、膜構成成分として上記新規ダルコサミン誘導体を含有するリボソームに関する。

〔背景技術〕

リポソ一ムは脂質二分子膜からなる中空の閉鎖小胞であり、リン脂質等の極性脂質薄膜を水溶液中に懸濁させることによつて形成される。リボソームは、その脂質二分子構造が生体膜のそれと基本的に同じであるため、生体適合性に優; }τている。このような特徵を利用して、リボソームをドラッグデリバリーシステムに応用する研究が盛んに行われている。この用途において、リボソームは生体適合性を有するマイクロ力プセルとして用いられる。即ち、種々の薬物や酵素等は、リポソームの中に封入されたリポソ一ム製剤として生体に投与される。

リポソーム中に封入される薬剤の種類は、リポソ一ム製剤の投与目的に応じて多種多用であるが、その一例としては、スーパ一ォキシドジスムターゼ（超 -化的不均化酵素； S O D ) が挙げられる。この酵素は、スーパーォキシドア二オン（o ₂ - ) を不活性化する酵素である。スーパーォキシドアニォンは、抗原抗体複合体が形成されるような外的刺激に応じて、生体内での分子状酸素の還元により生じるもので、食細胞が貪食した異物を酸化分解する作用を有するため、殺菌および解毒に役立っている。しかし、スーパーォキシドア二オンのような活性酸素は、過剰に産生されると、組織障害や炎症を惹起する強力な因子として作用するため、リウマチ、ベーチュッ卜病およびクローン氏病等の炎症性疾患や、糖尿病、癌疾患の原因になることが知られている（ドラッグデリバリ一システム； Drug De l i very System , 2 (1) . 1987) 。従つて、スーパーォキシドアニォンを不活性化する S 0 Dの投与は、これら疾患の治療に有用である。

しかし、 S 0 Dは生体内での安定性に欠け、その血中半減期は 6分程度と短い欠点がある。この S O Dの欠点を補う手段として、 S O Dをリボソームに封入して安定化し、徐放化する試みも種々行われている（例えば、特開昭 6 3 - 2 1 1 222号公報、特開平 1-175944号公報、特開平 1-238537号公報、特開平 1-246225号公報）。

—方、リボソームの膜構成成分としては、脂質、特にレシチンのようなリン脂質が用いられている。リン脂質は、一般にリン酸エステル残基からなる親水性部分と、高級脂肪酸残基からなる疎水性部分とを有している。この脂肪酸残基部分の炭素数が 8以下、特に 4以下のリン脂質は、もはや分子集合体を形成しない。従って、このようなリン脂質からリポソームを形成することはできない。リン脂質から形態的に明確なリポソ一ムを形成するためには、その脂肪酸残基の炭素数は 10以上、好ましくは 12〜24でなければならない。なお、 ― 般にはリボソーム形成のための助剤として、トリグリセリド、コレステロ一ノレ、コレステロールエステル、 a - トコフエ口ール等のリン脂質以外の脂質を添加することが多い。

ところで、ドラッグデリバリーシステムに適用されるリポソームでは、ステアリルァミン等の荷電物質を助剤として少量添加することにより、リボソームの膜表面に正電荷を付与することが提案されている。その目的は、リボソーム中への薬物封入率を向上することと、細胞へのリボソームの接着性を向上させることである。また、これらカチオン性リポソ一ムは、中性又はァニオン性リボソームに比べて、血中滞留性が良いことも示唆されている（Eur. J. Biochera.. 47. 179- 185 (1974) ) 。このようなカチオン性リボソームの従来技術として、例えば次の二つの刊行物が挙げられる。

第一は、特開昭 63-77824号公報である。ここには、 S O D を封入したカチオン性リボソーム製剤（ L- S O D) が開示されている。この L - S O Dでは、リボソームの膜構成成分としてジパルミトイルフォスファチジルコリン及びコレステロールに加え、ステアリルアミンが用いられている。

第二は、. 「ドラッグデリバリーシステム」（2(1), 41-52 (1987)) である。ここにも、ステアリルアミンを配合した力チオン性のリボソーム製剤（ L - S O D ) が開示されている。

しかしながら、上記のステアリルアミンを配合したカチォン性 L- S O Dは、生体系に適用した場に、痙攣等の副作用を生じる等、毒性が強いという重大な欠点を有している ( J . Neuro l . Sci . , 31 , 173-179 (1977 ) ) 。このため、リポソ一ム製剤として実用に供し得るものではなかった。

〔発明の開示〕

本発明の第一の目的は、リボソームの膜構成成分として使用でき、且つリボソームに対する正電荷付与剤として作用する毒性の無い新規なダルコサミン誘導体を提供することであ 0

本発明の第二の目的は、上記の新規ダルコサミン.誘導体を膜構成成分としたリポソームを提供することである。

本発明の第三の目的は、優れた血中滞留性により薬物の血中半減期を延長することができ、且つ毒性の低いカチオン性リボソームを提供することである。

上記第一の目的は、下記一般式〔 I〕で示されるダルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩によって達成され ο

0R3 〔 I〕

上記式において、 R R R ³ および mは夫々次のものを表す。

• R ¹ 、 R ² ；

水素原子又は C O ( C H 2 ) _n C H 但し、 nは 10 ~ 22の整数を意味し、また R ¹ および R ² が同時に水素原子であることはない。

• R 3 ；

水素原子又は低級アルキル基

♦ m ； 0〜 3の整数

本発明の第二の目的は、膜構成成分の一つとして、上記式〔 I〕で表されるグルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩を含有するリポソ一ムによって達成される。

本発明の第三の目的は、上記式〔 I〕で表されるグルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩を膜構成成分の —つとして含有するリボソームと、該リポソ一ムの小胞内に含有された薬理的ないし生理的活性物質とを具備したリポソ —ムによって達成される。以下に、本発明の詳細を説明する。

発明者等は、上記式〔 I〕で表されるダルコザミン誘導体およびその薬学的に許容される塩が、リボソームの膜構成成分のための配合剤、特に正電荷付与剤として有用であることを見出した。更に、このダルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩を用いて調製されたカチオン性リボソームは、血中滞留性に優れるため薬物の血中期を延長することができ、且つ低毒性であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

なお、上記式〔 I〕のダルコサミン^ およびその薬学的に許容される塩は、リポソームに ¾する I ! vl 荷付与剤としてのみならず、抗体産生用に用いられるァジュバントまたはカチォン性界面活性剤としても有用であると考えられる。式〔 I〕における R³ の低級アルキル基とは、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等、炭素数 1〜4のアルキル基であり、特に好ましくはメチル基であまた、化合物〔 I〕は、例えば塩酸、硫酸もしくはリン酸等の無機酸、或いは酒石酸、マレイン酸、フマル酸もしくはコハク酸等の有機酸との間で薬理学的に許容される得る塩類を生成することができる。

式〔 I〕で示される化合物は、基本的には高級脂肪酸残基からなる疎水性部分（R¹ および R² ) と、ダルコサミン残基からなる親水性部分とから構成されている。即ち、 3-位および 6-位の高級脂肪酸残基 R ¹ , R² は、分子に疎水性を付与するための基であるから、これらは疎水性を付与するに十分な炭素鎖であればよい。例えば、リボソームの大部分を構成するリン脂質と同様、 R ¹ , R² は炭素数 10以上、好ましくは 12〜24 ( n 10〜22) の高級脂肪酸残基であるのが望ましい。一方、ダルコサミン残基部分は、分子に親水性を付与するためのものであるから、リボソームの形成能を妨げない限りにおいて、この部分は何量体であってもよい。しかし、好適には単量体（m= 0) 、 2量体（m= l ) 、 3量体（m = 2) 、あるいは 4量体（m= 3) であり、特に好ましいのは単量体および 2量体である。なお、 1 -位の -O R³ 基はリポソームの形成や、リポソームに対する正電荷付与に直接関与するものではない。従って、 R ³ は水素原子または低級ァルキル基の何れであってもよい。

—般式〔 I 〕で示される化合物の代表例を例示すれば次の通りであるが、これらに限定されるものではない。

• 6 - ーラウロイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシド、

• 6 — O - リストイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシド

• 6 — ^一ノ、⁰ルミトイルー D —ダルコサミンメチルグリコシド

• 6 — ーステアロイノレ一！）一ダルコサミンメチルダリコシド

• 3 , 6 —ジーーラウロイノレ一 D —ダルコサミンメチルグリコシド

• 3 , 6 —ジー O— リストイノレー D —グルコサミンメチノレグリコシド

• 3 , 6 — ジ一一ノ、。ルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチノレグリコシド

• 3 , 6 — ジーーステアロイノレ一 D — グルコサミンメチノレグリコシド

• 6 ， 6 ' ージーーパルミトイルー D — ダルコサミノー

( 1→ 4 ) - yS - D 一ダルコサミンメチルグリコシド

• 3 - ^—パルミトイノレ一 D — グルコ卄 Ϊ ンメチノレグリコシド

• 6一 O—ノヽ。ノレミ卜イノレー D — グルコサミン _g

本発明による上記ダルコサミン誘導体〔 I 〕は、レシチンなどのリン脂質との親和性に俊れている。また、 2-位にアミノ基を有するため、レシチン等のリン脂質に配合してリポソ —ムの膜構成成分に用いることにより、形成されたリポソ一ムに正電荷を付与することができる。従って、ダルコサミン〔 I〕はリボソーム形成のための助剤、特に正電荷付与剤として極めて有用である。また、ダルコサミン誘導体〔 I〕は高級脂肪酸残基からなる疎水性部分と、ダルコサミン残基からなる親水性部分とで構成されているから、カチォン性界面活性剤、或いは抗体産生用のアジュバントとしての有用性も期待される。

次に、本発明のダルコサミン誘導体〔 I〕を製造する方法について説明する。この製造方法は特に限定されるものではないが、その一例を示せば次の通りである。なお、下記の合成フローにおいて、 R ¹ ， m , πは既述したと同じ意味を有している。また、 Zはべンジルォキシカルボニル基であり、アミノ基の保護基として用いられている。

第 1工程 PhCH₂0C0Cl

上記の合成フローは、下記の R¹ および R² を有するダルコサミン誘導体〔 I〕を製造する方法を例示したものである。

R ¹ ： -C 0 (C H₂ ) n C H₃

R ² ：水素原子

R ¹ および R² の両者が -C O ( C H 2 ) n C H 3 基であるダルコサミン誘導体〔 I〕を製造したい場合には、第 3工程において、化合物〔IV〕の N-ベンジルォキシカルボ二ルグルコサミン残基 1個当り、 Cj? C O ( C H 2 ) „ C H 3 を 2倍モル以上使用すればよい。また、 R ¹ と R² が異なるァシル基であるグルコサミン誘導体〔 I〕を製造したい場合には、第 3工程に示した反応の終了後、更に別の R² C£ を反応させればよい。更に、上記フローに示した例とは逆に R ¹ が水素原子で、 R ² 力 - C 0 ( C H ₂ ) _n C H ₃ 基であるダルコサミン誘導体〔 I〕を製造したい場合には、第 3工程において、化合物〔IV〕の 6位の水酸基を適切な保護基で保護した後、 R² C J? を反応させればよい。

上記フローに示した合成例を、各工程ごとに詳細に説明すれば次の通りである。

第 1工程

—般式〔Π〕で示される公知のアミノ糖またはその塩酸塩を、ピリジン等の溶媒中において、ベンジルォキシカルボニルクロリド（P h C H₂ 0 C 0 C £ ) と反応させる。これにより、アミノ糖〔 Π〕における 2位のアミノ基はべンジルォキシカルボニル基（Ζ) で保護され、化 Γί物〔ΙΠ〕が得られる。第 2工程

第 1工程で得られた化合物〔Π〕を、 Ρ— トルエンスルホン酸等を触媒としてメタノールと反応させる。これにより、化合物〔Π〕の 1位がメトキシ化されて化合物〔IV〕が得られ D o

なお、 m = 0の単量体化合物〔IV〕は公知、ないしは当業者が常法に従って極めて容易に誘導できる化合物である。

また、化合物〔ΠΙ〕が m = l〜 3のオリゴマーである場合には、これを上記のように直接メトキシ化すると、各ダルコサミン単量体間のダリコシド結合が切断されるおそれがある。従って、このグリコシド結合の切断を防止するために、次の方法を用いるのが好ましい。まず、化合物〔m〕と無水酢酸とをピリジン等の溶媒中で反応させることにより、化合物

〔m〕の全ての水酸基をァセチル基で保護する。铳いて、少量の臭化水素酸 Z酢酸溶液を加えて反応させ、更にメタノール溶媒中で炭酸銀の存在下に反応させることにより、 1位のァセトキシル基を選択的にメ卜キシ基に置換する。その後、この 1位がメトキシ化された化合物を、メタノ一ル溶媒中において、炭酸ナトリゥムの存在下に反応させる。この反応により、残りのァセチル基が脱離され、水酸基に転化される結果、化合物〔IV〕が得られる。この一連の操作は、次の反応式で示される。化合物〔III〕

Ac₂0/Pyr

• 化合物〔IV〕

第 3工程

第 2工程で得られた化合物〔IV〕と高級脂肪酸クロリド ( C H 3 ( C H 2 ) n C O C j? ) とを、ピリジン等の溶媒中で反応させることにより、化合物〔IV〕の 6位の水酸基をェステル化し、化合物〔V〕を得る。高級脂肪酸の量は、化合物〔 IV〕の N-ベンジルォキシカルボニルダルコサミン残基 1 個当たり 1モルとする。但し、同時に 3位の水酸基も同時にエステル化したいときは、既述したように、 N-ベンジルォキシカルボニルダルコサミン残基 1個当たり 2倍モル以上の高級脂肪酸ク口リドを用いる。

第 4工程

第 3工程で得られた化合物〔V〕に対し、 P d - C等の触媒の存在下で水素添加することにより Z基を脱離し、最終目的化合物〔 I ' 〕を得る。

なお、上記の製造例は、 1位が低級アルコキシ基（即ち、 R ³ が低級アルキル基）である化合物〔 I〕に関するものである。しかし、上記のようにして得られた 1位が低級アルコキシ基である化合物〔 I〕を、加水分解酵素等の公知の適当な手段を用いて加水分解することにより、 1位が水酸基（即ち、 R ³ が水素原子）である目的化合物〔 I〕を容易に製造することができる。また、場合によっては 1位の水酸基を適当な保護基で保護しておいて上記と同様の合成反応を行ない、最後にその保護基を脱離させる方法を用いてもよい。

次に、本発明によるリポソームについて説明する。

一般に、脂質 2分子膜で構成されるリボソームは、その構造に基づいて、例えば次の三種類に分類される。しかし、本発明のリポソームはこの何れの構造であつてもよい。

①多重同心円状のラメラ構造を有するリボソーム（多重ラメラヽ)]包； inul t i I aoiel I ar vesicle； M L V ) 、

②小さな単ラメラ構造を有するリポソ一ム（小さな単ラメラ小胞； smal I uni I amel l ar vesicl e ； S U V )

③大きな単ラメラ構造を有するリボソーム（大きな単ラメラ小胞、 L U V、 I arge uni l amel l ar vesicl e ) 既述したように、本発明によるリボソームの特徴は、新規ダルコサミン誘導体〔 I〕を膜構成成分として含有することである。しかし、それ以外の膜構成成分として、通常のリポソ一ム形成に使用される脂質の何れを用いてもよい。このような脂質として、例えば、'フォスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジノレコリン、フォスファチジルエタノーノレアミン、フォスファチジノレセリン、フォスファチジルイノシトール、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然若しくは合成のリン脂質、並びに水素添加リン脂質、グリセ口糖脂質等を挙げることができる _t これらは夫々を単独で用いてもよく、 2種以上の混合物として用いてもよい。

更に、膜構造を安定化させるために、コレステロール等のステロール系安定化剤を配合してもよい。また、トコフユ口ールゃ - カロチン等の酸化防止剤、並びにその他の配合剤を適宜選択して配合することも可能である。

本発明のリボソームにおいて、膜構成成分の間の比率は特に限定されない。一般に、リン脂質 100 重量部に対するダルコサミン誘導体〔 I〕の使用量は、 0 . 5 〜 30重量部、好ましくは 1〜25重量部である。ダルコサミン誘導体が 0 . 5 重量部未満の場合は、カチオン性リボソームとしての十分な効果が得られない。逆に、ダルコサミン誘導体〔 I〕の配合量が 30 重量部を超えると、リポソーム形成能が低下することがあるしかも、 30重量部より多くのダルコサミン誘導体〔 I〕を使用してもカチオン性リボソームとしての効果はそれほど増大しないから、このように多量に使用することはコスト的に無意味である。コレステロール等の安定化剤の配合量は、一般に、リン脂質 100 重量部に対し 30重量部以下である。また、酸化防止剤等のその他の配合剤の使用量は、一般に 5重量部以下である。

本発明のリポソームの粒径は特に限定されず、個々の具体的な用途に応じて適宜選択すればよい。しかし、好ましくは 0 . 3 β in 以下、更に好ましくは 0 . 2 m 以下である。

本発明のリボソームは、上記リボソームのラメラ構造内部に、種々の有用な薬理的ないし生理的活性物質を含有させたものである。本発明のリポソ一ムに保持させる薬剤については、先に S 0 Dについ T例示的に述べた力 <、これに制限されるものではなく、種々の水溶性又は脂溶性薬物が使用され得る。但し、リボソーム自体が正電荷を有するから、電気的に中性あるいはァニオン性の薬物が好ましい。このような好ましい薬物としては、前記 S 0 Dの他に、インドメタシン等の抗炎症剤、ヘモグロビン等の酸素運搬剤、ゥロキナーゼ等の酵素剤、塩酸ドキシサイクリンゃ硫酸ゲンタマイシン等の抗生物質、並びにインシュリン、 A C T H (副腎皮質刺激ホルモン）、カルシトニン等のホルモン剤が挙げられる。加えて、血中滞留時間が長いという長所を特に活かせるものとして抗癌剤等を挙げることができる。

本発明のリボソームは、当該分野において通常用いられている公知の方法に従い調製することができる。その一例を以下に説明する。

まず、リン脂質、ダルコサミン誘導体、必要によりその他の膜安定化剤、荷電物質、酸化防止剤等の膜構成成分を有機溶媒に溶解し、これをフラスコ容器に入れる。続いて、減圧下に溶媒を留去することにより、フラスコ内面に脂質薄膜を形成せしめ、更に真空乾燥を行なう。このフラスコに、トリス- 塩酸のような適切な緩衝液に所望の薬物を含有させた薬物溶液を添加することにより、フラスコ内面の脂質薄膜を膨潤させる。同時に、振蘯（好ましくは超音波処理）を施すことにより分散液を形成する。この分散液中において、前記脂質薄膜は薬物溶液が封入されたリボソームを形成している。その後、遠心分離、ゲル濾過、または限外濾過を行なうことにより、リボソームに封入されなかった残余の薬物溶液を除去する。こうして得られた薬物封入リボソームを、等張緩衝液中にに再び分散させる。この薬物封入リボソーム分散液は、そのまま注射.剤として使用することができる。しかし、必要に応じて凍結乾燥し、使用時に媒質中に ^散して注射剤に調製され得るような剤形を採用してよい。また、リボソームの粒径調節が望まれる場合には、加圧濾過法（ェクストルーダ一法）、ゲル濾過、遠心分離等の公知の方法を適宜選択して用いることにより、粒径調節を行えばよい。

〔実施の最良の形態〕

以下、実施例に基いて本発明を更に具体的に説明する。実施例 1 ( 6 — ^—パルミトイルー D ―グルコサミンメチルグリコシドの製造）

(1) N —ベンジルォキシカルボニル— 6 — ーパルミトイルー D —ダルコサミンヌチルグリコシドの製造

CH₃(CH₂)i4COCl

Pyr

D 一ダルコサミンカ、ら、公知の手法に従って N —ベンジルォキシカルボ二ルー D —ダルコサミンメチルダリコシド 1 を得た。この N —ベンジルォキシカルボ二ルー D —ダルコサミンメチルダリコシド 1 ( 9. 3 g ) と、パルミトイノレクロリド 2_ (8mJ2 ) とをピリジン（50 inj? ) 中に加え、窒素ガス棼囲気下に室温で 24時間撹拌して反応させた。反応混合物を 10% 氷冷塩酸中に注入し、酢酸ェチルで抽出した。その後、抽出液を飽和炭酸水素ナトリウム（N a H C 0₃ ) およびブライン（食塩水）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム（N a ₂ S 0₄ ) で乾燥した後、溶媒を除去して粗生成物を得た。更に、この粗生成物を酢酸ェチル溶液から再結晶することにより、 N— ベンジルォキシカルボニル一 6— ーパルミトイルー D ―グルコサミンメチルダリコシド 3 (7.65 g ) を得た。収率は 52 %であった。該生成物の物理データは次の通りである。

m P · 96〜97°C

I R ( K B r ) : 3330cm—¹. 3030cm—¹. 2920cm—

2850cm— ¹, 1735cm— ¹, 1690001^{- 1}.

丄 540cm— 1460cm—¹, 1260cm"¹.

M S (F A B ) ： 566 (M+1) ⁺

XH- N R (DM S O- e )

δ (ppm) ： 7.36(s. 5H)； 7.丄 2 (d ,ノ -8Hz .1H) ;

5.25(d ,j =7.4Hz.lH)； 5.03(s,2H)

4.90(d ,ノ -4HZ.1H) :4.58(d ,ゾ =2.4Hz, 1H)； 4.32(d,/=12.4Hz,lH);

4.07(dd, /-6.2Hz, /=6.6Hz,lH)；

3.40〜3.6(m.2H) : 3.24(s.3H)；

3.15(πι,1Η)； 2.31 (t , / =7Hz .2H)；

1.51(m,21])； 1.24(b.24H)；

0.86(t , /-6.2Hz.3H) ^XH- N M R ( C D Cj? 3 )

δ (PPDI) :7.36(s, 5H)； 5.18(d ,/-8.8Hz.lH)；

4.71(d,/-3.6Hz.lH) ;4.50(dd, / -4Hz,lH)； 4.25(d,ノ-丄 2.4Hz,lH) ; 3.6 〜3.9(ra,2H) ; 3.35(s,3H)； 2.37(t ,/ -7.4Hz.2H)； . 1.63(m,2H)； 1.25(b.24H)；

0.88(t ,ノ ·6Ηζ,3Η)

(2) 6— ーパルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチルグリコシドの製造

H2/Pd-C

MeOH す

ά

上記で得た N—ベンジルォキシカルボ二ルー 6 - —パルミトイルー D —ダルコサミンメチルダリコシド (1.35 g ) をメタノール（50 DiJ? ) に溶解し、触媒量の 5 % Pd-C を加え、常温、常圧下で 24時間接触還元を行なった。反応終了後これを濾過して溶媒を除去した。続いて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、目的化合物である 6— ^—パルミトイルー！）一ダルコサミンメチルダリコシド ( 874 nig) を得た。収率は 85%であつた。

m. p . ： 70.5〜71.5。C

元素分析： C H N

実測値 64.24% 10.84% 3.04%

計算値 64.00% 10.51% 3.25%

(水 C 23H 43 O 6 Nとしての計算値） I R (K B r ) ： 3350CD)- ¹. 2920cm-¹. 2850cm-¹,

1730cm"¹ , 1460cm—¹

M S (F A B ) ： 432(M+1) +

XH- NMR (D M S O- d )

δ (ppin) ： 5.15(m, 1H) ; 5.00 (m .1H)；

4.5i(d ,ノ -3.4Hz, JLH)；

4.30(d,ノ -10.6Hz.lH)；

4.04(dd. /-6.6Hz, /-6.8Hz.1H)；

3.53(m.lH) ;3.26(s,3H) ;3.10(πι.2Η)； 2.40(πι.1Η) ;2.29(t, / -7.2Hz.2H)； i.51(ui.2H) ;1.24(b.24H)；

0.86(t,/-6.0Hz.3H) 実施例 2 ( 6 — ーラウロイル— D —ダルコサミンメチルグリコシドの製造）

パルミトイノレクロリドの代わりにラウ口イルク口リドを用いた点を除き、実施例 1 と同様にして油状の標記化合物を得た。生成物の元素分析値は次の通りであった。

元素分析： C H N

実測値 60.34% 9.95% 3.63%

計算値 60.80% 9.87% 3.73¾

(* C ι₉Η ₃₇06 Nとしての計算値）実施例 3 ( 6— ーミリストイルー D —ダルコサミンメチルグリコシドの製造）

パルミトイノレクロリドの代わりにミリストイノレクロリドを用いた点を除き、実施例 1 と同様にして標記化合物を得た生成物の融点および元素分析値は次の通りであった

m . p . ： 6 5〜 7 0。C

元素分析： C H N

実測値 62.18% 10.27% 3.33%

計算値木 62.53% 10.17% 3.47 0

C ₂₁H₄₁06 Nとしての計算値）

実施例 4 ( 6— ^—ステアロイルー D —ダルコサンメチルグリコシドの製造）

パルミトイノレクロリドの代わりにステアロイノレクロリドを用いた点を除き、実施例 1 と同様にして標記化合物を得た , 生成物のマススぺクトル分析値は次の通りであった。

M S ： 459.3542(M⁺⁾

( C ₂₅Η₄9 θ 6 Νとしての計算値； 459.3559) 実施例 5 ( 6， 6 * —ジーーパルミトイルー D —グルコサミノ一（ 1—4 ) 一 5— D —ダルコサミンヌチルダリコシドの製造）

(1) Ν , Ν ' — ジベンジルォキシカルボニル — D —グルコサミノー（ 1—4 ) - β - d 一ダルコサミンの製造

D—グルコサミノー（ 1—4) 一 S— D —ダルコサミン塩酸塩丄 (2.5 g ) と炭酸水素ナトリウム（2.1 g ) とを、混合溶媒 (水：メタノール = 3 ·· 4 v/v, 70 Βίΰ ) 中に溶解した。更に、この溶液にベンジルォキシカルボニルク口リド ( P h C Η 2 0 C 0 C £ ) (2.4 g； 2oiJ2 ) を加え、室温で 2時間撹拌した。生成物を濾別し、これを精製水とジクロロメタンとで各 2回洗浄した後、真空乾燥を行なった。この生成物をメ夕ノールから再結晶させることにより、 N , N ' ージベンジルォキシカルボニル— D —ダルコサミノ一 ( 1→4 ) - β - Ό -ダルコサミン _ (62mg) を得た。収率は 72.6%であった。また、その物理データは次の通りであつた。

' Ε - N M R (D M S O- )

δ (ppm) ： 3.il~3.72(m.lOH)；

4.5(tetra. / -5.34Hz.iH)；

4.32(d,ノ -7.04Ηζ,1Η) : 4.45(s,lH);

4.55(s,lH) ;4.71(s,lH)；

4.94〜5.13(m,8H)； 6.56 (d , / -4.3Hz .1H)； 7.20(d ,ノ -8.36Hz,2H) ; 7.36(s,10H)

I R ( K B r ) : 3325cm—¹, 2940cm— ¹, 1680cm^-1.

1540cm-¹, 1280CD1- ¹. 1245cm— ¹,

1030C0I"¹

M S ( F A B ) ： 609 (M+i) ⁺

(2) N , N ' —ジベンジルォキシカルボニル一 3 , 4 , 6：

1 ' , 3 ' , 6 ' —へキサ— ーァセチル— D —グルコサミノー（ 1—4 ) 一 S —D —ダルコサミンの製造

HO

HZ HZ 2

Acゥ OPyr

上記（1) で得た化合物（1.5 g ) をピリジン ⁵ mj? ) 中に溶解し、更に無水酢酸（10 mj? ；約 O.il Diol) を加えて室温で 12時間撹拌することにより反応させた。反応終了後、 10%塩酸を加え、酢酸チルで抽出した。飽和食塩水で抽出液を洗净し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。続いて、溶媒を除去することにより、 N , N ' —ジベンジルォキシカルボ二ルー 3， 4, 6, 1 ' , 3 ' , 6 ' —へキサー —ァセチルー D —グルコサミノー（ 1→4 ) — ? — 1) 一ダルコサミン 3 ( 1.88 g ) を得た。収率は 87.04 %てあった。生成物の H - N M Rは次の通りであった。

- NMR ( C D C£ 3 )

δ (ppm) ： 1.89(s.3H)； 1.92(s.3H)； 1.95(s.3H)； i.99(s.3H)； 2.07(s,3H)； 2.08(s,3H)； 3.61〜4.40(m,9H)： 4.·97〜 5.34 (m .10H) 6.13(d , /-3.66Hz, 1H)； 7.33(s, 10H) (3) N , N - —ジベンジルォキシカルボ二ルー 3 , 4 , 6

6 一ペン夕一クーアセチノレ一 D —ダルコサミノ ( 4 ) 一 ^ 一 D —ダルコサミンメチルダリコシドの製造

(DHBr/AcOH

(2)MeOH/Ag₂C0₃

上記（2) で得た化合物 (1.5 g ) を乾燥ジメチルクロリド（30 m£ ) に溶解した。 0 °Cにおいて 25%の臭化水素酸 Z 酢酸溶液（1.5πιΰ ) を加え、窒素ガス雰囲気下で 4時間撹拌した。反応終了後、臭化水素酸を除去するために反応混合物を氷水に入れ、ジ.クロロメタンで抽出した。次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ジクロロメタンを留去することにより粗生成物を得た。得られた粗生成物を、直ちに乾燥メ夕ノールに溶解した。更に炭酸銀を加え、室温で 24時間搅拌した。濾過により炭酸銀を除去した後、メタノールを留去した。得られた粗生成物（ 1.22 g ) をカラムクロマトグラフィ一で精製することにより、 N， Ν ' —ジベンジルォキシカルボニルー 3 , 4 , 6， 3 ' , 6 ' —ペンタークーアセチル - D —ダルコサミノ一（ 1—4 ) - β - d 一ダルコサミンメチルダリコシド (0.52g ) を得た。収率は 35.8%であった, 生成物の NM Rは次の通りであった。

'Η- N M R ( C D CJ2 ₃ )

δ (PPDI) ：丄.91(s,3H): 1.92(s,3H)； 1.99(s,3H) :

2.06(s,3H)； 2.08(s.3H)； 3.47(s,3H)； 3.52〜3.74(πι,4Η)； 3.98〜 4.37 (m , 6H)； 4.96〜5·28(ιη,10Η) ; 7.32(s,10H)

(4) N , N - — ジベンジルォキシカルボ二ルー D —ダルコサミノー（ 1→4 ) 一； S — D —グルコサミンヌチルダリコシドの製造 Ac

上記（3) で得た化合物 (1.0 g ) にメタノール（30 ) を加え、撹拌して懸濁液とした。この懸濁液に飽和炭酸ナトリウム（ 3 oii? ) を加え、 2 4時間反応させた後、酢酸ェチルで抽出することにより、 N , N ' —ジベンジルォキシカルボニルー D —ダルコサミノー（ 1 →4 ) — β — ϋ 一ダルコサミンメチルダリコシド (0.45 g ) を得た。収率は 60%であつた。生成物のェ！！- N M Rは次の通りであった。

lE- M R ( D M S O - d ₆ )

δ (ρρπι) : 3.06〜3.70(m'7H) ; 4.12〜 4. i 6 (m , 2H)： 3

4.99〜5.28(m,6H)； 4.52〜 4.68 (m , 1H)； 5.26〜5.28(m,2H) ; 7.36(s,10H)

(5) N, N —ジベンジルォキシカルボ二ルー 6 , 6

ジ一ーパルミトイノレ一 D —ダルコサミノー（ 1 4 ) — β — ϋ 一ダルコサミンメチルダリコシドの製造

CH₃(CH₂)IACOC1

上記 ) で得た化合物 (0.3 g ) をピリジン（ 5 mi? ) 中に溶解した。これを窒素ガス雰囲気下に撹拌しながら、パルミトイルクロリド（ 0.29 g ； 0 · 3mJ2 ) を加え、 0 °C〜室温で 12時間反応させた。反応終了後、 10%塩酸溶液を加え、酢酸ェチルで抽出した。更に、抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、溶媒を留去することにより粗生成物（0.58g ) を得た。この粗生成物を力ラムクロマトグラフィーで精製することにより、 N , N —ジベンジルォキシカルボニル— 6 , 6 ' ― ジ一 0-パルミトイル一 D —グルコサミノ — （ 1—4 ) — β — D —ダルコサミンメチルダリコシド ( 0.1 g ) を得た。収率は 19.17 %であつた。生成物の ΝλΙΙ は次の通りであった。

^XH- N M (D M S 0 - d 6 ) ：

δ (ppm) ： 0. Π〜0.88(ιη.6Η)； 1.23(s.54H)；

1. 51(m, 4H) : 2.27(DI,5H)；

3. 35〜3.48(m,llH)： 3.97 ~ 4.61 (m , 6H)；

4. 90〜5.05(πι,4Η)： 7.33(s,10H)

(6) 6 , 6 ' -ジ - 一パルミトイノレ一 D —ダルコサミノ - ( 1→4 ) — β — ϋ ーグノレコサミンヌチノレグリコシドの製造

上記（5) で得た化合物（0.16 g ) を混合溶媒（テトラヒドロフラン：メタノール = 1 ： 1 v/v. 10 mj? ) 中に添加し撹拌して溶解した。これに P d - Cを加えた後、室温で 12時間水素ガスと反応させた。反応終了後、反応混合物を濾過して P d - Cを除去し、溶媒を留去することにより粗生成物

(O.llg ) を得た。更に、 pre-T L Cで^ することにより最終生成物 6， 6 ' —ジー ^一パルミトイルー D —ダルコサミノ一（ 1→ 4 ) 一 3— D —ダルコサミメチルグリコシド Ί_ (0.02g ) を得た。収率は 16.7%であった。生成物のマススぺクトル分析および I Rの結果は次の通りであった。

M S (F A B ) ； 831(M+1) ⁺

I R ( K B r ) : 3420cm—¹, 2920cm—¹, 2850cm—¹,

1740cm"¹. 1470cm"¹

実施例 6 ( 3 , 6—ジ― —ラウロイル— D —グルコサミンメチルダリコシドの製造）

(1) N—ベンジルォキシカルボ二ルー 3 , らージ一 O - ラゥロイル— D —ダルコサミンメチルダリコシドの製造

CH₃(CH₂)i₀COCl

Pyr

D—ダルコサミン塩酸塩から公知の手法に従って得られた N—ベンジルォキシカノレボニルー D —ダルコサミンメチノレグリコシド 1 (10 g ； 30.58 oifflol) を、ピリジン（60 mj? ) 中に溶解した。ラウロイノレクロリド（14.71 ； 67.3DIDIO1) を室温下で加え、 24時間撹拌した。 10%塩酸を加えて酢酸ェチルで抽出し、酢酸ェチル層を飽和食塩水で洗浄した。この抽出液から酢酸ェチルを留去することにより、粗生成物（19.3 g ) を得た。更に、この粗生成物を力ラムクロマ卜グラフィ一で精製することにより、 N—べンジルォキシカルボ二ルー 3 , 6— ジー ^一ラウロイル一 D —グルコサミンメチルグリコシド 2 (2.7 g ) を得た。収率は 15.06 %であった。

(2) 3 , 6—ジー —ラウロイル— D —ダルコサミンメチルグリコシドの製造

H2/Pd-C

CH₃(CH₂)ioO

上記（1) で得た化合物^ C2.7 g； 3.14DIDIO1) を、混合溶媒（メタノール：酢酸ェチル = 1 ： 1 v/v) に溶かした。この溶液に触媒の P d - Cを加えた後、水素ガスと 10時間反応させた。反応終了後、濾過により触媒を除去し、粗生成物 (1.85g ) を得た。これをカラムクロマトグラフィーで精製することにより、 3， 6—ジ— ^—ラウロイルー D —ダルコサミンメチルダリコシド 3— ( 0.5 g ) を得た。収率は 28.6% であった。生成物の物理データは次の通りであった。

m p . ： 50~54°C I R (K B r ) ： 3380cm-¹. 2940cm—¹. 2860cm—¹

1730cm"¹. 1580cm— ¹ , 1470cm"¹ 1190cm— ¹ , liOOcm"¹. 1060cm— ¹ ' - N M R ( C D C j? a )

δ (PPDI) ： 0.88(t , /-6.14Hz, 6H)； 1.26(s.36H)；

1.60〜1.66(m,'4H) 2.09(s,3H)；

2.31〜2.44(m,2H) 2.83〜2.90(m,_lH) 4.26〜4.49(m.lH) 4.74〜4.99(m,lH) 3.35〜3.45(m,4H) 3.77〜3·79(πι,1Η) 元素分析

C H Ν

実測値 66.40% 10.81 2.32%

計算値 66.78% 10.59% 2.51%

( C 3ΐ Η ₅₉0₇ Νとしての計算値）

実施例 7 ( 3 , 6— ジー ^一ミリストイルー D —ダルコサミンメチルグリコシドの製造）

ラウロイソレクロリドの代わりにミリストイノレクロリドを用いる以外は、実施例 6と同様にして標記化合物を得た。収率は 35.54 %であった。生成物の物理データは次の通りであつた

m P 47〜50。C

I R ( B r ) 3380cm"¹ 2940cm- 2860cm"¹

1730cm-¹ 1580CDT 1470cm—¹ 1190CDT ¹ HOOciD- 1060cm-¹ ^XH - N M R ( C D Cj? 3 )

δ (ppDi) :0.88(t ,ノ -6.16Hz, 6H) ; i.26(s,42H)；

丄.58〜： 1.70(m, 4H) , 1.87〜 1.93 (m , 2H)； 2.34〜2.45(m,4H)； 2.83〜 2.90 (m .1H)： 3.36〜3.45(DI,4H)； 3.77〜 3.84 (m .1H)； 4.26〜4.52(m,lH)； 4.75 (d , / -3.52Hz , 1H)； 4.94(t ,ノ -9·7Ηζ,1Η) .

元素分析： C Η Ν

実測値 68.43% 11.14% 2.02%

計算値 68.52% 10.93% 2.28%

( C ₃₅H ₆₇0₇ Nとしての計算値）

実施例 8 ( 3 , 6—ジ— ーステアロイルー D —ダルコサミンメチルダリコシドの製造）

ラウ口イルクロリドの代わりにステア口イルクロリドを用いた点を除き、実施例 6 と同様にして標記化合物を得た。収率は 22.27 %であった。生成物の物理データは次の通りであつた。

I R (K B r ) ： 3380cm一¹ 2940cm—¹ 2860cm"¹

1730cm-¹ 1580cm—¹ 1470CDI^{_ 1} 丄 i90cm— ¹ 1100cm—¹ 1060cm—¹ ^XH - N M R ( C D C 1 3 )

δ ( pm) :0.88(t ,/ -6.21Hz.6H)； 1.25(s,58H) ,

1.52〜1.65(m,4H) 2.00〜2.13(DI, 2H) 2.33~2.45(m.4H) 2.82〜2.89(m,lH) 3.35〜3.55(m,4H) 3.77〜3.83(m,lH) 4.27〜4.50(m,lH) 4.75(d,ノ -3.28Hz.lH) ; 4.94(t , /-9.52Hz, 1H)

M S 725.6155 (Μ⁺· )

( C ₄₃H ₈₃0₇ Nとしての計 :値； 725.6167) 実施例 9 ( 6 — ^一パルミトイノレ一 D - グルコサミンメチルグリコシドを膜構成成分として含有するリポソーム）

下記三種類の膜構成成分を、夫々クロ口ホルム溶液として容積 50 raj? のナス型フラスコに加え、混合した。

♦ フォスファチジルコリン（濃度 lOOmM) ； 840〃、 • コレステロール（濃度 lOOmM) ； 240 /i

• 6— 一パルミトイルー D —ダルコサミンメチルグリコシド（濃度 ΙΟοιΜ ) ； 1200 ^ J?

上記三成分間のモル比は 7 ： 2 ： 1である。更に、クロロホルム 10 m£ を加えた。

クロ口ホルムを留去した後、ー晚真空乾燥することによりブラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。次いで、 3940 μ の 300mMソルビトール ZiOmM卜リス- 塩酸緩衝液に溶解させた牛赤血球由来 S 0 D 60ju £ (30 g Z oij? 含有）をフラスコ中に加え、激しく振とう撹拌することにより、リボソーム (M L V) 分散液を得た。この分散液を遮光下に 2時間室温で放置した後、更に約 20°Cで一晚放置した。次に、 300mM ソルビトール ZlOmMトリスー塩酸緩衝液を用いて全量を 12 mj? に調節した後、遠心分離（約 120, 000 g、 70分間）を行なつた。上清をデカンテーションし、未封入の S O Dを除去することにより、リボソームのペレツトを得た。このペレツトを、 lOOmi の 300mM ソルビトール lOmMトリス- 塩酸緩衝液に分散することにより、 S O Dを保持した標記のリボソ一ム分散液を得た。

実施例 1 0 (6— ーラウロイルー D —ダルコサミンメチルグリコシド含有リボソーム）

6— ーパルミトイルー D —グルコサミンヌチルダリコシドの代わりに、 6— ーラウロイルー D —ダルコサミンヌ Λ1

チルグリコシドを用いた点を除き、実施例 9の方法に準じて標記リボソーム分散液を得た。

実施例 1 1 ( 6— - ミリストイルー D —グルコサミンメチルグリコシド含有リポソー厶）

6— ーパルミトイノレ一 D —ダルコサミンヌチルダリコシドの代わりに、 6— 0- リストイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシドを用いた点を除き、実施例 9の方法に準じて標記リポソーム分散液を得た。

実施例 1 2 (6-0- ステアロイル- D- グルコサミンメチルグリコシド含有リボソーム） 6- 0 - ノレミトイノレ- D— ダルコサミンメチルグリコシドの代わりに、 6-0- ステアロイル- D- ダルコサミンメチルグリコシドを用いた点を除き、実施例 9に準じて標記リポソ一ム分散液を得た。

実施例 1 3 ( 6 6 ' —ジー ^一パルミトイルー D —グルコサミノ一（ 1—4) 一； S— D —ダルコサミンメチルグリコシド含有リボソーム）

6 。ルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシドの代わりに、 6 6 ' — ジー ^ 。ルミ卜イノレー D —グルコサミノー（ 1→ 4 ) . 一； S— D —グルコサミンヌチルダリコシドを用いた点を除き、実施例 9と同様にして標記リポソ — ム分散液を得た。

実施例 1 4 ( 3 , 6—ジー一ラウロイルー D — グルコサミンメチルダリコシド含有リボソーム） 6— 一パルミトイルー D —ダルコサミンヌチルダリコシドの代わりに、 3 , 6—ジ一一ラウロイノレ一 D —グルコサミンメチルダリコシドを用いた点を除き、実施例 9に準じて標記リポソーム分散液を得た。

実施例 1 5 ( 3 6 - ジー — ミリストイルー D —ダルコサミンメチルグリコシド含有リボソーム） 6— —パルミトイル— D —ダルコサミンヌチルダリコシドの代わりに、 3 , 6 -ジ一クーミリストイルー D —グルコサミンメチルグリコシドを用いた点を除き、実施例 9に準じて標記リボソーム分散液を得た。

実施例 1 6 ( 3 , 6 —ジー —パルミトイル— D —ダルコサミンメチルダリコシド含有リボソーム） 6 — —パルミトイルー D —ダルコサミンメチルダリコシドの代わりに、 3 , 6—ジー一パルミトイルー D —グルコサミンメチルダリコシドを用い、それ以外は実施例 9に準じて標記リポソーム分散液を得た。

実施例 1 7 ( 3 , 6 — ジーーステアロイルー D — ダルコサミンメチルグリコシド含有リボソーム） 6 。ルミノレ一 D —ダルコサミンヌチノレグシドの代わりに、 3 6—ジ一ーステアロイノレ一 D —グルコサミンメチルダリコ ':/ ドを用い、それ以外は実施例 9 に準じて標記リボソーム分散液を得た。

実施例 1 8 ( 6— —パルミトイルー ϋ —ダルコサミン含有リボソーム）

6 — 一 'ノレミトイノレ一 D — グルコサミンメチノレグリコシドの代わりに、 6— 一ルミ卜イノレー [) 一ダルコサミンを用い、それ以外は実施例 9に準じて標記リボソ -ム分散液を得た。

〔試験例〕

次に、本発明の効果を調べるために行なつた試験例を示す。なお、以下で使用する略号は次の意味を有する。

P c ：フォスファチジノレコリン

C h 0 1 ：コレステロール

G 1 u ： 6- 0 パルミトイノレ- D ダルコサミンメチルグリコシド

試験例 1 (封入率の測定）

<方法 > ：実施例 9において、使用した S 0 Dのリポソーム中への封入率を次のようにして求めた。まず、遠心分離した後の上清中における S 0 D活性を亜硝酸法で定量することにより、リポソーム中に封入されなかった S 0 D量を求めた。これを、リボソーム調製に当たって最初に添加した S 0 Dの総量と比較することにより、リボソーム中への S O Dの封入率を求めた。

比較のために、ダルコサミン誘導体を用いることなく、上記実施例と同様の方法で、 P c ： C h o 1 = 8 ： 2 (モル比）からなる中性リボソーム分散液を調製した。そして、上記と同様の方法で S 0 Dの封入率を求めた。

<結果 > ：下記の表— 1 に示す通りであった。表一 1

以上の結果から明らかな通り、ダルコサミン誘導体を含むカチオン性リポソ一ムは、これを含まない中性リポソ一ムに比べて、薬物の高い封入率を示した。

試験例 2 (体内動態）

<方法〉：ウレタンで麻酔された d d y系雄ラッ卜の大腿部静脈に、実施例 9に準じて作成された ³ H - 標識リポソ —ム分散液 500 i? を静注した。このラットの頸動脈から、経時的に、血液をエツベンドルフチューブに採取した。採取した血液を遠心分離し、上清を l O O J? バイアルに取った。ソルェン 350 を 700 £ 加えて溶解した後、 2 N塩酸丄 80 £ で中和した。更に、クリアゾル 6mJ? を加えた後、液体シンチレーシヨンカウンター（LS 5000TA BECKMAN ) を用いて放射活性を測定した。

対照として、本発明のダルコサミン誘導体を用いずに調製した、 P c ： C h o 1 = 3 ： 1 (モル比）からなる ³ H - 標識したリポソーム分散液について、上記と同様に放射活性を測定し、体内動態を調べた。

また、上記の結果に基づき、

夫々の血中濃度 ( ji g / mJ？ ) 、時間曲線下面積（A U C ：血中濃度 X時間（h r ) ) 、血中半減期（ t i ₂ ： h r ) を求めた。

なお、本試験で用いた ³H- 標識リポソ一ム製剤は、膜構成成分を混合する際に、 ³Hで標識したジパルミトイルフォスファチジルコリンを微量（ 1 Z 50万モル）加え、実施例 9に準じて作成した。

<結果 > ：下記の表一 2に示した通りであった。

表一 2

以上の結果から明らかな通り、膜構成成分としてダルコサミン誘導体〔 I〕を含有する本発明のリポソームは、グルコサミン誘導体を含有しないリポソー厶に比べて、 A U Cが約 4 . 1 倍に増大され、また t ？が約 2 . 5 に延長された。

試験例 3 (臓器分布） <方法〉：試験例 2 と同様にして、 ³ H - 標識カチオン性リボソームを、ウレタンで麻酔したラッ卜の大腿部静脈に静注した。 8時間後にラットの全血液を採取し、また各臓器を摘出した。採取した血液および摘出臓器の夫々について、液体シンチレ一ションカウンタ一で放射能を計測することにより、各臓器中へのリボソームの分布状況を測定した。

く結果 > ：表ー 3に示した。表— 3

( n = 3 ) 以上の結果から明らかな通り、ダルコサミン誘導体〔 I〕を膜構成成分として含有せしめた本発明のカチォン性リポソームは、それを含有しない中性リボソームに比べて、各臓器中への移行量が少ない。これは、本発明のリボソームは血中濃度が高く、体内中をより高濃度で循環することを示している。従って、本発明のリボソームは血液ターゲッティング性に俊れている。

試験例 4 (急性毒性；その 1 )

本発明による新規ダルコサミン誘導体〔 I〕を用い、マウスに対する致死毒性試験を行なった。被検物質としては下記の化合物を用いた。

① 6— ーパルミトイルー D —ダルコサミンメチルグリコシド

② 6 , 6 ' —ジー一ノヽ。ルミトイルー D —ダルコサミノー（ 1 ·→ 4 ) 一 ^ 一！）ーグルコサミンメチルグリつシド

③ステアリルァミン（比較例）

上記夫々の化合物を 0 . 5%-CMC♦ Na溶液中に混和、懸濁することにより披検溶液を調製した。夫々の被検溶液 l . OniJ? を、 5週齢の I C R雄性マウスの腹腔内に 1回投与した後、マウス死亡状況を観察した。'なお、溶媒対照群には 0 . 5%- CMC · Na 溶液 l . Omj? を同様に投与した。

結果は下記第 4表に示した通りであつた。表一 4

上記の表一 5に記載したように、化合物①、 ②については観察期間中に死亡例は認められなかった。また、投与後の一般状態に顕著な変化はなく、対照例と同様に体重増加も認められた。これに対して、比較例の化合物③では、投与直後から自発運動の低下が認められ、体重が徐々に減少し、死亡に至った。この結果から、本発明の新規ダルコサミン誘導体〔 I〕は、比較例のステアリルアミンよりも毒性が著しく低く、安全性が高いことがわかる。

試験例 5 (急性毒性；その 2 )

この試験の目的は、ダルコサミン誘導体〔 I〕を膜中に含有する本発明のカチオン性リポソ—ムの毒性が、ステアリルァミンを膜中に含有する従来のカチオン性リボソームと比較してどの程度であるかを知ることである。そのために、薬物未封入の状態で調製された本発明のリボソームと従来のリポソ一ムの夫々について、マウスに対する致死毒性試験を行つた。

1 . 被験液の調製

(1) 6— —パルミトイルー D —ダルコサミンメチルグリコシドを含有する本発明のリボソーム分散液

5 0 D溶液を加えなかった点を除き、実施例 9 と同様の方法で、 6— ^—パルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシドを膜構成成分として含有するリボソーム分散液を得た。これを限外濾過膜を用いて濃縮し、さらに必要に応じて注射用滅菌蒸留水で希釈して被験液とした。

(2) ステアリルアミンを含有する従来のリボソーム

分散液

6— ーパルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシドの代りにステアリルアミンを用いた点を除き、上記本発明のリボソーム分散液の場合と同様にして、ステアリルアミンを膜構成成分として含有するリボソーム分散液を得た。これを限外濾過膜により濃縮し、さらに必要に応じて注射用滅菌蒸留水で希釈して被験液とした。

モリブデン酸アンモニゥム法により、上記被験液中のリンを定量分析した。この分析値と、フォスファチジルコリンとの配合比から、 6— —パルミトイルー D —グルコサミンメチルダリコシドの濃度を求めた。

2 . 試験方法

検疫した 5週齡の I C R雄性マウスを 1群 2 〜 3匹に区分し、腹腔内に上記の被験液 2 . 0DI£ を 1回投与した。一方、溶媒対照群として、滅菌蒸留水 2 . 0Dij? を投与した。

被験液投与後、 16日間に亘つて少なくとも 1 日 1回、注意深く一般状態を観察して毒性徴候、死亡状況を記録した。

3 . 試験結果

下記の表一 5に示した通りであった。なお、表中における被験物質の欄の記号は次の通りである。

① 6 — ーノヽ。ルミトイルー D —ダルコサミンヌチルグリコシド含有リポソ —ム分散液

②ステアリルアミン含有リボソーム分散液

表一 5

*用堂は 6— 0 パルミトイルー D グルコサミンメチルグリコシドまたはステアリルァミンとしての童，

上記の試験結果に示したように、 6— —パルミトイルー D —ダルコサミンヌチルダリコシドを股- ½成成分として含有する本発明のカチオン性リボソームの分 K液については、観察期間中死亡例は無かった。その L D ₅ JiHは、 6— ί?—パルミトイノレ一 D —ダルコサミンヌチルグリコシドとして 1154 . 8 mg /k g以上であると推定される。

—方、ステアリルアミンを膜構成成分として含有する公知のカチオン性リボソ -ムの分散液では、低投与量でも死亡例がみられた。その L D ₅₀値は、約 157.9mg Z k g (146.0 - 170.8 m g / k g ) と推定される。

この試験結果から、本発明のカチオン性リボソームは、従来公知のカチオン性リボソ -ムに比べて極めて毒性が低く、安全性の高いカチオン性リポソームであると言える。以上詳細に説明したように、本発明の新規ダルコサミン誘導体〔 I〕は、カチオン性リボソームの製造に適している c 即ち、このダルコサミン誘導体〔 I〕を用いて製造された本発明のカチオン性リボソームは、従来のステアリルアミンを膜構成成分として含むカチオン性リポソ一ムに比べて毒性が極めて低い。しかも、本発明のカチオン性リボソームは、通常の中性又はァニオン性リポソ一ムに比べて、ァニオン性ないしは中性薬物の封入率が高い。加えて、血中半減期が長く . 臓器移行性も少ない。

このような特徴から、本発明のリポソ—ム製剤は、 S O D 等の生理活性物質や、抗炎症剤、ホルモン剤、抗癌剤など医薬品への応用が広く考えられる。特に、 S O Dを封入した場合は、様々な疾患（例えば慢性炎症性疾患、虚血- 再灌流傷害による心疾患及び脳疾患、消化器疾患どの治療）に有効であると考えられる。

Claims

請求の範囲

1 . 下記一般式〔 I〕で示されるダルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩。

〔 I )

上記式において、 R ¹ 、 R ² 、 R ³ および mは夫々次のものを表す。

• R ¹ 、 R ² ；

水素原子又は - C O ( C H ₂ ) „ C H 3 基。但し、 nは 10〜22の整数を意味し、また R ¹ および R ² が同時に水素原子であることはない。

• ³ ；

水素原子又は低級アルキル基

• m ； 0〜 3の整数

2 . 前記 R ³ が、炭素数 1〜4のアルキル基である請求の範囲第 1項に記載の化合物。

3 . 前記一般式（： I〕が、

♦ 6 — ーラウロイル一 D — ダルコサミンメチルダリコシド、

• 6 — 0- リストイノレ一 D — グルコサミンメチルグリコシド ♦ 6 — ーパルミトイノレ一 D —ダルコサミンメチルダリコシド

♦ 6 — ーステアロイルー D —グルコサミンメチルグリコシド

• 3 , 6 — ジ一ーラウロイノレ一 D — ダルコサミンメチルグリコシド

• 3 , 6 — ジー O— リストイルー D — ダルコサミンメチノレグリコシド

♦ 3 , 6 — ジー一ステアロイノレ一 D — ダルコサミンメチルグリコシド、及び

• 6 , 6 ' ージー。一パルミトイノレ一 D —ダルコサミノー

( 1→ 4 ) 一 β — ϋ — ダルコサミンメチルダリコシドからなる群から選択されるグルコサミン誘導体である、請求の範囲第 1項または第 2項に記載の化合物。

4 . 膜構成成分の一つとして、請求の範囲第 1項に記載のダルコサミン誘導体またはその薬学的に許容される塩を含有するリボソーム。

5 . 膜構成成分として、リン脂質 100 重量部に対して前記ダルコサミン誘導体 0 . 5 〜 30重量部を含有する請求の範囲第 4項に記載のリボソーム。

6 . その他の膜構成成分として、ステロール系安定化剤およびノまたは酸化防止剤が含まれる請求の範囲第 4項または第 5項に記載のリポソーム。

7 . 小胞内に薬理的ないし生理的活性物質を封入してなる請求の範囲第 4項〜第 6項の何れか 1項に記載のリボソーム

8 . 前記薬理的ないし生理的活性物質が、電気的に中性あもしくはァニオン性のものである請求の範囲第 7項に記載のリボソーム。

9 . 前記薬理的ないし生理的活性物質が、抗炎症剤、酸素運搬剤、酵素剤、抗生物質、ホルモン剤および抗癌剤からなる群から選択される請求の範囲第 8項に記載のリボソーム。

1 0 . 前記薬理的ないし生理的活性物質が S 0 Dである請求の範囲第 9項に記載のリボソーム。