WO1990004179A1 - Method for assaying immunologically active substance and reagent therefor - Google Patents

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Shoichi Shutoh
Akinori Suginaka
Mikio Akita
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Nippon Oil And Fats Co., Ltd.
Hoechst Japan Limited
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an immunologically active substance utilizing an antigen-antibody reaction which is widely applied in the field of clinical testing, and a reagent for immunological measurement used therefor. More specifically, the present invention relates to a method for measuring an immunologically active substance, which comprises adding a specific polyether compound to a liquid in which such an antigen-antibody reaction is performed, and to promote the antigen-antibody reaction in this method.
  • Background art on reagents containing specific polyether compounds which comprises adding a specific polyether compound to a liquid in which such an antigen-antibody reaction is performed, and to promote the antigen-antibody reaction in this method.
  • JP-B-60-4938 polyethylene glycol and HO (CH 2 CH 2 0) "(CH 3 CHCH 2 0) b (CH 2 CH 2 0) blocks I Table by structure of the C H
  • a nonionic surfactant such as a copolymer is described in JP-A-59-43362.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-47256 discloses that polyethylene glycol is used in a system in which an antigen or an antibody is carried on insoluble fine particles and an antigen-antibody reaction is carried out in a solution. Has been described.
  • the present inventors have conducted intensive studies to overcome the drawbacks of the conventional method. As a result, surprisingly, by adding a specific polyether compound to a liquid in which an antigen antibody reaction is performed, a non-specific reaction is performed. It has been found that the measurement of immunologically active substances can be achieved very accurately by optical measurement methods such as turbidimetry and light scattering without causing the prozone phenomenon.
  • a method for measuring an immunologically active substance using an antigen-antibody reaction in a liquid comprising adding a compound represented by the following formula (I) to the liquid:
  • the present invention provides a method for measuring an immunologically active substance, and a reagent for immunological measurement containing a compound represented by the following formula [I].
  • R 1 0 - ⁇ (CH z CH 2 0) m (AO) n ⁇ -R 2 CO where hydrocarbon radicals R 1 and R 2 each represents a hydrogen atom or a C 5, AO is 3 carbon atoms 4, the oxyalkylene group, m and n indicate the numbers of the oxyethylene group and the oxyalkylene group, respectively.
  • the oxyshethylene group and the xyalkylene group described above are randomly copolycondensed, and their molecular weight is 1000 to 20000, and the ratio of m to n is in the range of 60/40 to 90/10.
  • R 1 and R z are each a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 5 carbon atoms
  • AO is an oxyalkylene group having 3 to 4 carbon atoms
  • m and n are an oxyethylene group and an oxyalkylene group, respectively.
  • the above-mentioned oxyshethylene group and oxyalkylene group are randomly co-polymerized and have a molecular weight of 1,000 to 20,000 and a ratio of m to n of 60/40 to 90/10. is there. )
  • a reagent for measuring an immunologically active substance comprising the compound represented by the formula: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing the measurement results of CPR by the method of the present invention, wherein a straight line A relates to a ⁇ concentration sample and a straight line B relates to a low concentration sample.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the presence or absence of a nonspecific reaction due to fat in a sample.
  • R 1 and R 2 when one or both of R 1 and R 2 are a hydrogen atom, the compound is poly (oxyethyleneoxyalkylene) ethanol or alkynol or poly (oxyethyleneoxy). Alkylene) glycol.
  • R 1 and R z are hydrocarbon groups, R 1 may be the same or different from R 2 and is usually aliphatic or aliphatic and has 15 carbon atoms. Selected from the groups that have.
  • R 1 and R 2 are preferably selected from linear or plate-like alkyl groups having 5 carbon atoms.
  • hydrocarbon group examples include a methyl group, an ethyl group, an aryl group, a propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a tertiary butyl group, an n-amyl group, and an isoamyl group.
  • Examples of the oxyalkylene group -OA- include a substituted oxypropylene group, an oxybutylene group, and an oxytetramethylene group.
  • the number of the oxechylene group —CH 2 —CH 2 —0— and the number of the oxalkylene group —AO— are limited to 60/40 to 90/10 (at an m / n ratio).
  • the molecular weight of the polycondensate of an oxyethylene group and an oxaalkylene group is also limited to 1,000 to 20,000. If the molecular weight is less than 1000, the object of the present invention cannot be achieved, and if it exceeds 20000, the synthesis becomes difficult. Also, the ratio of m and n is limited to 60/40 ⁇ 90 This is because the object of the present invention cannot be achieved outside the range of / 10.
  • the compound represented by the formula [I] is known, and its production method and the like are described in JP-B-35-7594, JP-B-57-17008 and the like. Some of these compounds are commercially available from Nippon Oil & Fats Co., Ltd. as a series, and are widely used as bases for metal processing oils and cosmetics.
  • the compound of the formula (I) is disclosed in JP-B-60-4938.
  • HO (CH 2 CH 2 0) g (CH 3 CHCH 2 0) b (CH 2 CH Z 0) is a random copolycondensate different from the block copolycondensate having the formula: Exhibits completely different physical properties.
  • immunologically active substance examples include plasma such as C-reactive protein (CRP), rheumatoid factor (RF), anti-streptolysin 0 (AS0) and transferrin protein, thyroid stimulating hormone (THS), Toryodosai ⁇ Nin (T 3), serum total thyroxine (T 4), thyroxine-binding protein (TBG), silo globulin, insulin, Bok trypsin, elastase, S.
  • CRP C-reactive protein
  • RF rheumatoid factor
  • AS0 anti-streptolysin 0
  • transferrin protein thyroid stimulating hormone
  • T 3 thyroid stimulating hormone
  • T 4 serum total thyroxine
  • TBG thyroxine-binding protein
  • silo globulin insulin
  • Bok trypsin elastase
  • triol (E 3) chorionic gonadotropin (HCG), human placental la click preparative one plasminogen (HPL) hormones such as carcinoembryonic antigen (CEA), ⁇ 2 - micro globulin, alpha - tumor-related substances such as Fuwetopurotein (AFP), Viral hepatitis antigens such as HBs antigen, HBs antibody, HBe antigen, HBe antibody, antibodies, antibodies such as mumps, herpes, measles, rubella, cytomegalo, and anti-AIDS antibodies (HIV )).
  • the reagent for immunological measurement of the present invention contains the compound of the above formula (I).
  • a reaction using an antigen and an antibody not supported on a carrier such as latex particles (2) a reaction using an antigen and an antibody supported on a carrier such as latex particles, and (3) a tube, It can be used for any reaction using antigens and antibodies carried on carriers such as beads and plates.
  • the antigen or antibody is allowed to react with the antibody or antigen in the test solution, and then an optical method such as a light scattering method or a spectrophotometric method is used. Measure the change in turbidity of the reaction product with.
  • the reaction with the antibody or the antigen in the test solution is performed, the test solution is removed, and then labeled with an enzyme or a radioactive element.
  • the amount of bound enzyme or radiation is measured by reacting a secondary antibody or the like, or the amount of unbound enzyme is measured.
  • the reagent of the present invention is used when reacting a test liquid or when reacting a labeled secondary antibody or the like.
  • the measurement principle, measurement procedure, and measurement apparatus when using the reagent of the present invention are not different from those of conventional EIA, RIA, ELISA, light scattering method and spectrophotometry. Serum is usually used as a test solution, but other body fluid components such as crevicular fluid and urine are also used.
  • Assay reagents used in the antigen-antibody reaction include reagents containing antisera, reagents containing antibodies corresponding to the antigens to be measured, reagents containing antigens corresponding to the antibodies to be measured, reaction buffer reagents, and There are diluents and the like for diluting the sample, and the compound of formula [I] exhibits its effect when added to any of these reagents.
  • the compound of formula (I) may be, for example, saline, phosphate-buffered saline or It is desirable to use it by dissolving it in a buffered saline such as Tris-HCl buffered saline or a conventional buffer. This buffer solution can also be added to a reagent containing antiserum.
  • the pH of the buffer is 5 to 10, preferably 6.5 to 8.5.
  • the concentration of the compound of the formula (I) in the reagent varies depending on the method of separation, but when it is added to a reagent containing an antiserum, antibody or antigen or containing no antiserum, antibody or antigen, it is generally 0.01 to 0.01%. 10 (w / v), preferably 0 ⁇ 05 ⁇ 5.
  • the concentration of the compound of the formula [I] in the final reaction mixture is from 0.01 to 2, preferably from 0.05 to 1.
  • the immunological assay reagent of the present invention containing the compound of the formula [I] contains bovine serum albumin, gelatin or gelatin in order to eliminate the influence of interfering substances contained in the biological sample.
  • Polymeric proteins or sugars such as glucose and sucrose can be added.
  • the compound represented by the formula [I] can be used in combination with a conventionally used compound such as polyethylene glycol or poloxamer.
  • a general method of optically measuring the result of the antigen-antibody reaction is as follows.
  • an antigen or a reagent containing an antibody or an antigen specifically reacting with the antibody a buffer containing a compound of the formula [I]
  • a sample the antigen or the antibody to be measured in the sample
  • the sample is diluted with a buffer containing the compound of formula [I] or a conventional buffer, and mixed at a constant rate, and then mixed at a constant temperature (preferably at 25 ° C to 37 ° C). ° C).
  • a suitable instrument for example, in a nephelometer for nephelometry. Compare the results of the sample with those of the control sample to determine the unknown concentration.
  • the buffer containing the compound of the formula [I] of the present invention can be mixed with a reagent or a sample containing an antigen or an antibody in advance.
  • [ ⁇ ] m of this compound is 240, n is 60, m / n molar ratio is 80/20, and molecular weight is 14058.
  • the immunoassay reagent was inverted and mixed with the antiserum against the protein guest above, and mixed and diluted at a ratio of 1: 2, respectively, and this mixture was used as a second reagent.
  • the ⁇ concentration sample and the low concentration sample were respectively treated with W human albumin serum.
  • Dilution was performed in 10 steps to obtain a sample. Take 5 ⁇ of the diluted sample in a test tube, add 350 of the first reagent, react for 5 minutes, and measure the sample blank at two wavelengths of 340nm main wavelength and 700nm sub wavelength. The measurement was performed using a Hitachi 705 automatic biochemical analyzer manufactured by Hitachi, Ltd. The antiserum prepared first was added to the sample for which the sample blank was measured, and the mixture was allowed to react for 5 minutes after mixing.Measurement was performed at the same two wavelengths, and the value obtained by subtracting the sample blank from the result was the reaction change. It was decided. As a control serum for preparing a calibration curve, N-CRP standard serum manufactured by Beiling Belke was used.
  • Figure 1 shows the measurement results for CRP.
  • the vertical axis is the CRP concentration (mg / dfl)
  • the horizontal axis is the sample dilution ratio.
  • Line A is for a high concentration sample (concentration before dilution 36 mg / dfi)
  • line B is for a low concentration sample (concentration before dilution 3 mg / dfi).
  • the immunological reagent of the present invention used in this example substantially showed a wide range in the antigen antibody reaction, showed a linearity in further measurement, and showed a great sensitivity particularly in a low concentration range. You.
  • Transfurin X pre-dilution concentration of high concentration sample 750mg / d £, low dilution concentration sample 10mg / dfi), alpha-1-acid glycoprotein (220mg / d, 70mg / d £), haptoglobin (650mg / d
  • d £, 50 mg / dfi alpha 1-antitrypsin
  • alpha 1-antitrypsin 340ing / d £, 40 rag / dJ2
  • Example 2 Using an immunoassay reagent prepared by dissolving 0.075 (w / v) of the compound of formula (II) in phosphate buffer of PH 7.2 The presence or absence of the reaction was confirmed. Immunoassay reagent l. OmiH intratracheat (fat solution for intravenous injection) was added to 20 ⁇ and mixed well.

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Description

明 棚 免疫学的活性物質の測定方法及びそのための試薬 技術分野
本発明は臨床検査の分野において広く応用されている抗原抗 体反応を利用した免疫学的活性物質の測定方法及びそれに用い る免疫学的測定用試薬に関するものである。 さらに詳細には、 本発明は、 このような抗原抗体反応が行われる液体に特定のポ リエーテル化合物を添加することからなる免疫学的活性物質の 測定方法ならびにこの方法における抗原抗体反応を促進するこ とができる特定のポリエーテル化合物を包含する試薬に関する, 背景技術
近年、 病態と関連して生体液中に出現する蛋白等の免疫学的 活性物質を抗原抗体反応を利用して検出し、 この検出結果を診 断に利用することが広く行なわれている。 このような抗原抗体 反応を利用した測定法としては、 例えば放射免疫測定法（RIA)、 酵素免疫測定法（EIA)、 酵素標識ィムノソルベント法（ELISA)、 光散乱法、 比濁法等の各種の方法が開発されている。 これらの うち RIA、 EIA、 ELISAはいずれの場合も被検液との反応後反応 生成物を分離することが必要とされるため、 その測定は一般に 時間と手間が必要とされるが定量性に倭れている等の理由で広 く利用されている。
近年は、 免疫反応（抗原抗体反応）に伴って起きる光学的な変 化を測定する光散乱法、 比濁法等が注目されてきている。 これ は抗原と抗体が液体中で反応すると、 反応の前後において、 そ の反応量に応じて液体の濁度に変化が生ずるため、 これを光散 乱法、 吸光光度法等の適当な手段で測定しょうとするものであ リ、 RIA、 EIA、 ELISAよりもその操作が簡便であるという特徵 を有している。 これらの抗原抗体反応を利用した免疫学的活性物質の測定に 当って、 その反応を補助するために添加物を使うことが研究さ れている。 例えば、 特公昭 60-4938号には、 ポリエチレングリ コールと HO (CH2 CH20)„ (CH3 CHCH20) b (CH2 CH20) CHの構造式で表 わされるブロック共重合体等の非イオン界面活性剤を用いるこ とが記載されている。 特開昭 59-43362号には、 一般式
CH3
Figure imgf000004_0001
. 、
CH— O- CH2一 C H2— 0 ~ H
C¾ (C¾)mz x で表わされる化合物を用いることが記載されている。
また、 特開昭 5 8— 4 7 2 5 6号には、 抗原又は抗体を不溶 性微粒子に担持させて溶液中で抗原抗体反応を行わせる系にお いて、 ポリエチレングリコ一ルを用いることが記載されている。
しかし、 これらの公知の添加物では必ずしも満足する結果が 得られない。 例えば、 溶液中で抗原と抗体を反応させた反応混 合物を比濁法、 吸光度法等の光学的な方法で測定する際に、 前 記した如き公知の添加物を用いると、 被検液中に共存する測定 対象でない他の物質、 例えば脂肪あるいは蛋白による濁りを生 ずるいわゆる非特異反応が起きて誤差の原因となることがある。 また高漉度の被検物質が存在するにも拘わらず測定結果が低濃 度に出るいわゆるプロゾーン現象が起きたり、 更には非常に低 濂度領域の測定結果が不正確であったりすることがある。 また EIAや RIAの場合にも、 添加物が非特異反応の原因となったり、 プロゾーン現象が起きたりすることがある。 したがって、 この ような添加物は多少の反応促進があっても、 かえって面倒な問 題を包含する。
前記の事情から、 液体中で抗原抗体反応を利用して非常に正 確に免疫学的活性物質を測定するに当り従来方法に見られる欠 点がすべて克服された新しい方法ならびにこのような新しい方 法に利用される新しい試薬を開発することが大いに要望されて いた。
発明の開示
したがって、 従来方法の欠点がすべて克服された抗原抗体反 応を利用する免疫学的活性物質の測定方法を提供することが本 発明の一つの目的である。
また、 抗原抗体反応が行おれる液体中に特定のポリエーテル 化合物を添加し、 簡易な方法で測定を達成して極めて正確に結 果を得ることができる、 免疫学的に活性な物質を測定する新し い方法を提供することが本発明の他の目的である。
さらに、 特定のポリエーテル化合物を包含する、 前記の免疫 学的活性物質の測定方法のための試薬を提供することが本発明 の別の目的である。
本発明のさらに他の目的、 特徴および利点は以下の記載から 明白となる。
従来方法に見られる欠点を克服するため、 本発明者らは鋭意 研究を重ねた結果、 意外にも、 特定のポリエーテル化合物を抗 原抗体反応が行われる液体中に添加することによって非特異反 応ゃプロゾーン現象を起すことなく免疫学的活性物質の測定が 非常に正確に比濁法、 光散乱法などの光学的測定方法によリ達 成できることを見出した。
本発明の一態様によれば、 液体中での抗原抗体反応を利用し た免疫学的活性物質の測定方法において、 該液体中に下記〔I〕 式で示される化合物を添加することを特徴とする免疫学的活性 物質の測定方法が提供され、 また下記式〔I〕で表わされる化合 物を含む免疫学的測定用試薬が提供される。
R10-{(CHzCH20)m(AO)n}-R2 CO (ここで、 R1及び R2はそれぞれ水素原子又は炭素数 5の炭化 水素基、 AOは炭素数 3~4のォキシアルキレン基、 m及ぴ nはそれ ぞれォキシエチレン基及びォキシアルキレン基の数を示し、 前 記のォキシェチレン基と才キシアルキレン基はランダム共重縮 合しており、 その分子量は 1000〜20000で、 mと nの比率は 60/40 ~90/10の範囲である。 ）
本発明の他の態様によれば、 一般式
R10-{(CH2CH20)m(A0)n}-R2 〔I〕
(ここで、 R1及び Rzはそれぞれ水素原子又は炭素数卜 5の炭化 水素基、 AOは炭素数 3~4のォキシアルキレン基、 m及び nはそれ ぞれォキシエチレン基及びォキシアルキレン基の数を示し、 前 記のォキシェチレン基とォキシアルキレン基はランダム共重縮 合してぉリ、 その分子量は 1000〜20000で、 mと nの比率は 60/40 ~90/10の範囲である。 ）
で表おされる化合物を包含する、 免疫学的活性物質を測定する ための試薬が提供される。 図面の簡単な説明
第 1図は本発明の方法による CPRの測定結果を示すグラフであ リ、 直線 Aは髙濃度試料、 直線 Bは低濃度試料に関する。
第 2図は検体中の脂肪による非特異反応の有無を測定した結 果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
一般式〔I〕において、 R1および R2の一方または双方が水素原 子である場合は、 前記化合物はポリ（ォキシエチレンォキシァ ルキレン）エタノールまたはアル力ノールまたはポリ（ォキシェ チレンォキシアルキレン）グリコールである。 R1および Rzの双 方が炭化水素基である場合は、 R1は R2と同じか異つていてもよ く、 通常は脂肪族または璟状脂肪族で 1 5個の炭素原子を有す る基から選ばれる。 R1および R2は直鎖状または分板状で卜 5個 の炭素原子を有するアルキル基から選ぶのが好ましい。 炭化水 素基としては、 メチル基、 ェチル基、 ァリル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 n-ブチル基、 ターシヤ リブチル基、 n-ァミル 基、 イソアミル基等が挙げられる。
ォキシアルキレン基- OA-としては、 才キシプロピレン基、 ォ キシブチレン基、 ォキシテトラメチレン基等が挙げられる。 本発明においてォキシェチレン基- CH2 -CH2 -0-の数とォキサ アルキレン基- AO-の数は 60/40~90/10 (m/n比率で）に限定される。 またォキシエチレン基とォキサアルキレン基の重縮合体の分子 量も 1000~ 20000に限定される。 分子量が 1000未満では本発明の 目的が達成できず、 20000を超えるように'なると合成が困難と なるためである。 また、 mと nの比率が限定されるのは 60/40~90 /10の範囲外では本発明の目的が達成できないためである。
〔I〕式で示される化合物は、 公知であり、 その製造方法等は 特公昭 35-7594号、 特公昭 57- 17008号公報等に記載されている。 またその化合物のあるものは、 日本油脂㈱からュニルーブシリ ーズとして市販され金属の加工油、 化粧品の基剤として広く使 用されている。 〔I〕式の化合物は、 特公昭 60-4938号公報に示 されている
HO (CH2 CH20) g (CH3 CHCH20) b (CH2 CHZ 0) なる式を有するブロック共重縮合体とは異なるランダム共重縮 合体であり、 このため界面活性作用を持たない全く異つた物性 を示す。
本発明方法で測定対象とする免疫学的活性物質（抗原又は抗 体）としては、 例えば、 C反応性蛋白（CRP)、 リューマチ因子（RF) 、 アンチストレプトリジン 0 (AS0)、 トランスフェリン等の血漿 蛋白、 甲状腺刺激ホルモン（THS)、 トリョードサイ□ニン（T3 )、 血清総サイロキシン（Τ4 )、 チロキシン結合性蛋白（TBG)、 サイ ログロブリン、 インスリン、 卜リプシン、 エラスターゼ、 エス トリオール（E3 )、 絨毛性ゴナドトロピン（HCG)、 ヒト胎盤性ラ ク ト一ゲン（HPL)等のホルモン、 癌胎児性抗原（CEA)、 β 2 -マイ クログロブリン、 α -フヱトプロテイン（AFP)等の腫瘍関連物質、 HBs抗原、 HBs抗体、 HBe抗原、 HBe抗体等のウィルス肝炎の抗原、 抗体、 厶ンプス、 ヘルぺス、 麻疹、 風疹、 サイ トメガロ等のゥ ィルス、 抗エイズ抗体（HIV)等の各種生体成分が挙げられる。 本発明の免疫学的測定用試薬は前記〔I〕式の化合物を含むも ので、 （1)ラテックス粒子のような担体に担持されていない抗 原及び抗体を用いる反応、 （2)ラテックス粒子のような担体に 担持させた抗原及び抗体を用いる反応、 および（3)チューブ、 ビーズ、 プレート等の担体に担持させた抗原及び抗体を用いる 反応のいずれにも用いることができる。 ラテックス粒子担体に 担持させないかもしくは担持させた抗原又は抗体を用いる場合 は、 この抗原又は抗体を被検液中の抗体又は抗原と反応させた 後、 光散乱法、 分光光度法等の光学的方法で反応生成物の濁度 変化を測定する。 チューブ、 ビーズ、 プレー卜等の担体に担持 させた抗原又は抗体を用いる場合は、 被検液中の抗体又は抗原 と反応させた後、 被検液を除去し、 ついで酵素もしくは放射性 元素で標識した 2次抗体等を反応させて、 結合された酵素量も しくは放射線董を測定するか、 結合されなかつた酵素量等を測 定する。 本発明の試薬は、 被検液を反応させる際にも、 また標 識された 2次抗体等を反応させるときにも使用される。 本発明 の試薬を用いる場合の測定原理、 測定手順、 測定のための装置 は、 従来の EIA、 RIA, ELISA, 光散乱法、 分光光度法と全く変 わらない。 また被検液としては、 通常血清が用いられるが、 他 の体液成分例えばせきずい液や尿等も用いられる。
抗原抗体反応に使用される測定用試薬には、 抗血清を含む試 薬、 測定すべき抗原に対応する抗体を含む試薬、 測定すべき抗 体に対応する抗原を含む試薬、 反応緩衝試薬、 及び試料を希釈 する為の希釈剤等があり、 〔 I〕式の化合物はこれらのどの試薬 に加えても、 その効果を示す。 しかしながら、 〔 I〕式の化合物 は、 例えば生理食塩水、 リン酸塩緩衝化生理食塩水あるいは、 トリス塩酸緩衝化生理食塩水のような緩衝化生理食塩水、 もし くは、 慣用の緩衝液に溶解して用いることが望ましい。 この緩 衝液は、 抗血清を含む試薬等に添加することもできる。 この緩 衝液の PHは 5~ 10、 好ましくは PH6. 5~8. 5を用いる。
式〔I〕の化合物の試薬中の濃度は分祈方法によって異なるが、 抗血清、 抗体又は抗原を含むあるいは、 抗血清、 抗体又は抗原 を含まない試薬に加える場合には、 一般に 0. 01~10 (w/v)、 好 ましくは 0 · 05~5 である。 最終的な反応混合物中における式〔 I〕 の化合物の濃度は 0. 01~ 2 、 好ましくは 0. 05~ 1 である。
式〔I〕の化合物を含む本発明の免疫学的測定試薬中には、 場 合によっては生体試料中に含まれる干渉物質の影響を除去する ために、 牛血清アルブミン、 ゼラチン、 あるいはゼラチンの再 重合体の蛋白質もしくは、 グルコース、 ショ糖などの糖類を添 加することができる。
〔I〕式で示される化合物は、 従来使用されてきたポリエチレ ングリコールやポロキサマーのような化合物と併用することも できる。
抗原抗体反応の結果を光学的に測定する測定法の一般的な手 段は以下の通りである。
先ず、 測定しょうとする抗原あるいは抗体に特異的に反応す る抗体あるいは抗原を含有する試薬、 式〔I〕の化合物を含有す る緩衝液及び試料（試料中の測定しょうとする抗原あるいは抗 体濃度によっては、 式〔 I〕の化合物を含有する緩衝液あるいは 慣用の緩衝液にて試料を希釈して用いる）を一定量の割合にて 混合後、 一定温度下（好ましくは 25 °C~37 °C )にて反応させ、 次 いで例えば比濁分析の場合比濁計のごとき、 適当な計装器上で 読む。 試料の結果を未知の濃度を定量する為に対照試料のもの と比較する。 本発明の式〔I〕の化合物を含有する緩衝液は、 あ らかじめ抗原あるいは抗体を含有する試薬、 もしくは試料と混 合することが可能である。
本発明の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において は、 検体中の夾雑蛋白、 脂肪等による望ましくない副反応であ るいわゆる非特異反応が抑制される。 また被検物の高濃度域に おけるプロゾーンの発生を抑えることができ、 更には被検物の 低濾度領域も精度良く測定できるという利点がある。
実施例
次に、 本発明を実施例によりさらに詳述する。
実施例 1
免疫学的測定試薬としては、 PH7. 2のリン酸塩緩衝液に 0. 075 /v)の〔Π〕式の化合物を溶解した溶液を用いた。
H0{ (CH2CH20)24O (CH2-CH-0)6O}H
〔Π〕 この化合物の mは 240、 nは 60、 m/nモル比は 80/20、 分子量は 14058である。 調製した免疫学的測定試薬を CRP、 トランスフエ リン、 アルファ 1-酸糖たんばく、 ハブトグロビン、 及びアルフ ァ 1-アンチ卜リプシンの別々の比濁ァッセィに使用し、 各ァッ セィを以下のごとく行なった。
上記蛋白賓に対する抗血清に免疫学的測定試薬を転倒混和し て、 それぞれ 1 : 2の割合で混合希釈し、 この混合物を第二試薬 とした。 調製した免疫学的試薬を反応緩衝液として第一試薬と した。 低濃度域及び高濃度域での直線性を確認する為に、 髙濃 度の試料と低濃度の試料をそれぞれ Wヒトアルブミン血清にて
10段階に希釈を行ない、 試料とした。 試験管に希釈した試料を 5 βとり、 第一試薬を 350 添加し、 5分間反応させ、 試料の ブランクを主波長 340nm、 副波長 700nmの 2波長で測定した。 測 定は日立製作所製日立 705型生化学自動分析装置によって行つ た。 試料のブランクを測定した試料に、 最初に調製した抗血清 を ΙΟΟ β添加し、 混合後 5分間反応させ、 同じ 2波長にて測定し、 その結果から試料のブランクを差し引いた値を反応変化量とし た。 なお、 検量線作成のための対照血清としてはべ一リングべ ルケ社製 N-CRP標準血清を用いた。 CRPに対する測定結果を第 1 図に示した。 第 1図において縦軸は CRP濃度（mg/dfl)であり、 横 軸は試料の希釈率である。 直線 Aは高濃度試料 （希釈前濃度 36m g/dfi)に関するものであり、 直線 Bは低濃度試料（希釈前濃度 3mg /dfi)に関するものである。
この実施例で使用した本発明の免疫学的試薬は、 実質的に抗 原抗体反応において広範囲にわたリ、 いっそうの測定での直線 性を示し、 特に低濃度域における大いなる感度を示すことが解 る。
トランスフ Xリン（高濃度試料の希釈前濃度 750mg/d£、 低濂 度試料の希釈前濃度 10mg/dfi)、 アルファ 1-酸糖蛋白（220mg/d 、 70mg/d£)、 ハプトグロビン（650mg/d£、 50mg/dfi)及ぴアルファ 1 -アンチトリプシン（340ing/d£、 40rag/dJ2)を用いた場合も CRPと 全く同様に測定結果は広範囲にわたる直線性を示した。
実施例 2 PH7. 2のリン酸塩緩衝液に 0.075 (w/v)の〔Π〕式の化合物を溶 解して調製した免疫学的測定試薬を用いて、 反応緩衝液の検体 中の脂肪に対する非特異反応の有無を確認した。 免疫学的測定 試薬 l . OmiHこイン トラフア ツ ト（静注用脂肪轧剤）を 20 μ β添加し て、 よく混合した。
この混合溶液について 37 における 10分間の経時変化を波長 340nmで確認した。
対象として、 従来から用いられているポリエチレングリコー ル 6000を本化合物と置き換えて同様な試験をおこなった。 その 結果を第 2図に示した。 図中の縦軸は吸光度であり、 横軸は時 間（分）である。 ポリエチレングリコール 6000を用いた場合には, 時間の経過とともに吸光度が増加し、 脂肪に対する非特異反応 が観察される。 一方、 本発明の免疫学的試薬の場合には非特異 反応がみられない。 したがつて本発明の免疫学的試薬を用いて 未知の試料を測定する際は、 試料の測定結果からブランクを正 確に差し引くことができる。 したがって、 通常本試薬の用いら れる臨床検査で測定される検体について、 しばしば見られる髙 脂血漿などでも試料中に含有する蛋白濃度を正確に定量する事 ができる。
実施例 3
免疫反応試薬として用いられる化合物の範囲を調べる目的で 第 1表に示される化合物について実旅例 1に記載された方法に用 いたときの測定での直線性をテストした。 第 1表における化合 物番号 6のものは〔Π〕式の化合物と同様に良い直線性を示し た。 一方化合物番号 7~9のものは、 充分な直線性が得られなか つた。 この結果から、 分子量は 1000〜20000の範囲とし、 mと n の比率を 60/40~90/10の範囲とすべきことが結論づけられた。
第 1 表
Figure imgf000014_0001
*好^ i!Hgは GPCより求めた。

Claims

請求の範囲
(1) 液体中での抗原抗体反応を利用した免疫学的活性物質の測 定方法において、 該液体中に下記〔 I〕式で示される化合物を添 加することを特徴とする免疫学的活性物質の測定方法。
0 - {(CH2CH20)m(AO)n} - R2 U〕 (式中、 R1及び R2はそれぞれ水素原子又は炭素数卜 5の炭化水 素墓、 AOは炭素数 3~4のォキシアルキレン基、 m及び nはそれ ぞれォキシエチレン基及びォキシアルキレン基の数を示し、 前記のォキシエチレン基とォキシアルキレン基はランダム共 重縮合しており、 その分子量は 1000〜20000で、 mと nの比率 は 60/40~90 0の範囲である）
(2) 該免疫学的活性物貧の測定を光学的に行う請求の範囲第 1 項記載の測定方法。
(3) 下記〔I〕式で示される化合物を含有する免疫学的活性物質 の測定用試薬。
0 - {(CH2CH20)m(AO)n} - R2 〔I〕 (式中、 R1及び R2はそれぞれ水素原子又は炭素数 1~5の炭化水 素基、 AOは炭素数 3~4のォキシアルキレン基、 m及び nはそれ ぞれォキシェチレン基及びォキシアルキレン基の数を示し、 前記の才キシエチレン基とォキシアルキレン基はランダム共 重縮合しており、 その分子量は 1000〜20000で、 mと nの比率 は 60/40~90/10の範囲である）
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