UA125029C2 - Спосіб ліофілізації, який забезпечує стабільно дегідратовані найпростіші для застосування як ефективних живих вакцин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу ліофілізації Neospora та інших найпростіших, в якому під час операції заморожування регулюють зародженням кристаликів криги, підвищуючи тиск та знижуючи тиск інертного газу або повітря.

Description

Галузь винаходу

Винахід стосується, зокрема, способів ліофілізації та збереження життєздатності Меозрога сапіпит. Винахід також може застосовуватися зазвичай для покращення процесів консервації (стабілізації) щодо підтримування життєздатності, імуногенності та інфекційності ліофілізованих найпростіших.

Передумови створення винаходу

Меозрога сапіпит - це облігатний, внутрішньоклітинний, кокцидійний, протозойний паразит.

Таксономічна класифікація Меозрога виглядає наступним чином: таксономічна група -

Арісотріеха; клас - Соссідіа; порядок - Еисоссідіогіда; родина - Загсосузіідає; рід - Меозрога.

Таксономічна група, Арісотрієха, включає декілька чітко визначених груп, які грунтуються на фенотипічних характеристиках, включаючи: кокцидії (Меозрога; Тохоріахта; Наттопаїа,

Стгуріозрогідіит); грегарини (наприклад, І апкКезіегіа), та гемоспоридії (наприклад, Ріазтоаіи); піроплазми (наприклад, ТПеїйегіа).

М. сапіпит є здатним інфікувати домашніх та диких птахів, а також жуйних тварин. У собачих, неоспороз проявляється як нервово-м'язове захворювання. У Норвегії в середині 1980-х років інфекція М. сапіпит у собак викликала широко відомі випадки нервово-м'язової дегенерації, яка призводила до паралічу задніх кінцівок. Неоспороз, як в м'ясному, так і в молочному тваринництві, є економічно витратним захворюванням та є найбільш часто діагностованою причиною викидня у великої рогатої худоби. Інший вид Меозрога-Меозрога пиаНезі- може інфікувати коней, та є пов'язаним з ембріональним мієлоенцефалітом (Ризіегпіа еї а!., у. Рагавійо!., 97:281-5; 2011).

До 1988 року, М. сапіпит було неправильно класифіковано як Тохоріата допаіїї, через структурні подібності між ними (Юиреу, пі У Рагавйої. 29(10):1485-8; 1999). Обидва види кокцидій, які живуть в тканинах, мають багато загальних біологічних та морфологічних особливостей. Навіть початкове розпізнавання М. сапіпит як виду, однак, було поставлено під сумнів, внаслідок екстремальної подібності, яку він поділяє з Наттопаїйа Ппеудогпі (Юибеу еї аї.,

Тгепаз Рагавій!., 18:66-9; 2002). Хоча існують генетичні відмінності між двома організмами, вони фізично є дуже подібними; та ооцисти Н. пеудогпі морфологічно не відрізняються від тих, які у

М. сапіпит (МсСАЇЇвтег евї аї, У Рагазйоі., 28:1473-9; 1998).

Зо Життєвий цикл Меозрога сапіпішт включає як статеву реплікацію в господарі родини собачих (дефінітивний господар), так і безстатеву реплікацію в проміжному господарі, такому як велика рогата худоба. Ооцисти, які пройшли у фекаліях дефінітивного господаря можуть потрапити в організм великої рогатої худоби, після чого вивільняються рухливі тахізоїти, які, у свою чергу, поширюються по тканинах інфікованої великої рогатої худоби. Тахізоїти, у свою чергу, розвиваються у форми брадизоїтів, які утворюють кісти в м'язах. Представники родини собачих стають інфікованими через вживання зараженого м'яса, та викидають ооцисти в свої власних фекалії. Ооцисти є по суті товстостінними спорами, та їх міцна стіна, яка складається в основному з протеїна (67-90 95), дозволяє їм виживати протягом тривалого періоду часу поза господаря. Стіна ооцисти, хоча і стійка до механічних та хімічних ушкоджень, однак, є схильною до впливу заморожування та відтавання. Частково це пояснюється згубними наслідками розширення та стиснення жорсткої стінки ооцисти, що виникають під час заморожування та відтавання. Тахізоїти, однак, швидко діляться, є рухливими та більш текучими в структурі мембрани, ніж ооцисти. (Веїїї еї аї., Тгепах Рагазійої., 22(9):416-23, 2006; Маї єї а!., Мет. Інпві.

Овулаідо Сти?, 104(2):281-9, 2009; Соодзууеп вї аї., Іптесійоп, С1епеїїсв, ЕмоЇшіоп, 13:133-50, 2013).

Навіть з тахізоїтами, однак, пошкоджуючі ефекти можуть виникати внаслідок утворення внутрішньоклітинних та позаклітинних кристалів криги. Це необхідно звести до мінімуму та контролювати, особливо під час процесу ліофілізації. Процедури ліофілізації та стабілізації за винаходом загалом є застосовуваними до всіх фаз життєвого циклу протозойних Арісотріеха.

Ліофілізація (висушування заморожуванням) Є загальноприйнятою технікою видаленнооперації стадії: (1) водну композицію заморожують при низькій температурі; (2) більшість води видаляють сублімацією в умовах зниженого тиску та низької температури; та (3) залишкову зв'язану воду далі видаляють шляхом десорбції в умовах зниженого тиску та більш високих температур. Висушений заморожуванням продукт містить дуже низьку кількість залишкової води (приблизно 0,5-5,0 95 мас./мас.), та сухий матеріал знаходиться в аморфній формі. Перед використанням висушені продукти повинні бути повторно гідратовані.

Пошкодження висушених заморожуванням продуктів, включаючи втрату життєздатності, зменшену імуногенність, а також порушення / знищення інфекційності, можуть відбуватися під час будь-якої 3 описаних вище операцій. Відповідно, стабілізуючі інгредієнти (кріопротектори/ліопротектони) та буфери часто додаються до композицій перед тим, як їх піддають ліофілізації, та величина та кінетика кожної операції, особливо операції повторної гідратації, повинні бути точно визначеними (Мійе еї аї., Віотесі Віоепод. 83, 578; 2003).

Імуногенні композиції, що включають біологічні інгредієнти, включаючи найпростіші, такі як

Меозрога, є помітно чутливі до умов, в яких їх отримують, формулюють та зберігають. В дослідженні, в якому велика рогата худоба була імунізована М. сапіпит їаспугойев, було продемонстровано, що захист був зменшений, якщо тахізоїти були заморожені при -80 "С в

ДМСО, порівняно з такими, які не були замороженими (У/ебег еї аї.; Сіїп Массіпе Іттипої., 20(1)1:99-105, 2013). Хоча велика кількість сполук було перевірено щодо їх здатності стабілізувати різні композиції, які містять живі аттенуйовані біологічні інгредієнти, все ще залишається потреба в нових консерваційних розчинах, а також вдосконалених процесах висушування заморожуванням для збереження життєздатності, імуногенності та інфекційності найпростіших, включаючи Меозрога, та всі вищезгадані Арісотіеха.

Суть винаходу

Заявники несподівано виявили, та розкрили в даному документі, більш ефективні стабілізуючі композиції, а також покращені способи ліофілізації найпростіших, включаючи

Меозрога.

Один варіант здійснення винаходу передбачає спосіб ліофілізації найпростіших, причому зазначений спосіб включає застосування стабілізуючого буфера, який містить компонент, вибраний з групи, яка складається з бичачого сироваткового альбуміну, полісорбату 80, та ембріональної бичачої сироватки.

Інший варіант здійснення передбачає, що буфер з попереднього варіанта здійснення містить бичачий сироватковий альбумін, полісорбат 80, та ембріональну бичачу сироватку.

Інший варіант здійснення передбачає, що буфер з попереднього варіанта здійснення додатково містить: трегалозу; лимонну кислоту; та галат епігалокатехіна (ЕССО), який також може бути замінений на аскорбінову кислоту (для всіх варіантів здійснення винаходу).

Наступний варіант здійснення передбачає спосіб ліофілізації найпростіших, причому зазначений спосіб включає, під час операції заморожування, контроль за зародженням кристаликів криги, підвищуючи тиск та знижуючи тиск інертного газу або повітря.

Інший варіант здійснення передбачає, що під час способу з попереднього варіанта

Зо здійснення, зародження кристаликів криги регулюють, підвищуючи тиск та знижуючи тиск інертного газу.

Інший варіант здійснення передбачає, що інертним газом є азот або аргон.

Наступний варіант здійснення передбачає, що спосіб ліофілізації полягає у:

А. Завантаженні суміші клітин, найпростіших та стабілізуючого буфера в камеру висушування, яка знаходиться приблизно при 5 "С та приблизно 1 бар;

В. Зниженні температури камери до від -1 "С до -15 "С, та утримуванні протягом приблизно 5 хв;

С. Підвищенні тиску в камері до від 1,2 до 2 бар, та утримуванні протягом приблизно 45 хв, при цьому підтримуючи температуру камери при від -1 "С до -15 С;

ЮР. Швидкому зниженні тиску камери до приблизно 1 бар, при цьому утримуючи температуру при від -1 "С до -15 С;

Е. Утримуванні тиску в камері приблизно 1 бар, знижуючи температуру до -50 "С протягом приблизно 45 хв;

Е. Утримуванні тиску в камері приблизно 1 бар, температури -50 "С протягом ще приблизно 90 хв; б. Утримуванні температури в камері -50 "С, знижуючи тиск в камері до приблизно 0,1 мбар, протягом приблизно 30 хв;

Н. Утримуванні температури в камері -50 "С, знижуючи тиск в камері до приблизно 0,01 мбар, протягом приблизно 60 хв;

І. Утримуванні тиску в камері приблизно 0,01 мбар, підвищуючи температуру в камері до - 35 "С, протягом приблизно 60 хв;

У. Утримування тиску в камері приблизно 0,01 мбар та температури на більш високому рівні -35 "С протягом додаткових 3500 хв;

К. Зниженні тиску в камері до приблизно 0,005 мбар; підвищуючи температуру до 20 "с, протягом додаткових 360 хв;

І. Утримуванні тиску в камері приблизно 0,005 мбар та температури на більш високому рівні 20 "С протягом додаткових 900 хв.

Інший варіант здійснення передбачає, що найпростіші є з таксономічної групи Арісотріеха.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші вибирають з класу Соссіаіа.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші вибирають з порядку

Еисоссідіогіда.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші вибирають з родини

Загсосузіідає.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші вибирають з роду, яка складається з Меозрога, Наттопаїйа, та Тохоріазта.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші є з роду Меозрога.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що найпростіші є Меоз5рога сапіпит.

Наступний варіант здійснення передбачає, що спосіб з попереднього варіанта здійснення є кінцевою стадією в отриманні вакцини.

Наступний варіант здійснення передбачає, що спосіб з попереднього варіанта здійснення є проміжною стадією в отриманні вакцини.

Наступний варіант здійснення передбачає, що Меозрога сапіпит є інактивованим.

Наступний варіант здійснення передбачає, що Меозрога сапіпит є живим ослабленим.

Наступний варіант здійснення передбачає, що Меозрога сапіпит є вибраним з групи, що складається з: Мо-5раїп 7, МСТ5-8, Мо-Момгта, МО-1, та МЕТ.

Наступний варіант здійснення передбачає, що живий, ослаблений Меозрога сапіпит має мутацію в протеїні, вибраному з групи, що складається з: РТ5, МІС-1, МІС-3, ІМР-1, СВА1,

СКАб, ОКА7, АМАТ, ЗАСІ, 5АС4, СКА2, сортилін-подібного рецептора, СР ІІ, КОМ2, дигалактоліпідного антигена; СуУР; МоР20 та ОНЕК.

Додатковий варіант здійснення передбачає, що Меозрога сапіпит є ліофілізованим за способом з попередньо розкритого варіанта здійснення.

Наступний варіант здійснення передбачає, що вакцину проти Меозрога сапіпит отримують за процесом, який включає спосіб з попередньо розкритого варіанта здійснення.

Детальний опис винаходу

Всі публікації, патентні заявки, патенти та інші посилання, згадані в даному документі, є включеними у вигляді посилання у всій їх повноті.

Наступні визначення можуть бути застосовані до термінів, які застосовано в описі варіантів здійснення. Наведені нижче визначення замінюють будь-які суперечливі визначення, які

Зо містяться в кожному окремому посиланні, включеному в даний документ у вигляді посилання.

Якщо інше не визначено в даному документі, наукові та технічні терміни, які застосовано у зв'язку з представленими варіантами здійснення, мають значення, які зазвичай розуміються фахівцями в даній галузі техніки. Крім того, якщо інше не вимагається контекстом, терміни в однині включають в себе множину, а терміни в множині включають однину.

Терміни "містить", "який містить", "який включає" та "який має" та подібні, як застосовано в даному документі, можуть мати значення, приписане їм у Патентному законодавстві США та можуть означати "включає", "включаючи", та подібні; "який складається по суті з" або "складається по суті" також має значення, яке приписується в Патентному законодавстві США, та цей термін є відкритим, дозволяючи присутність більшого, ніж те, що згадується, доки основні або нові характеристики того, що цитується не змінюється присутністю більше, ніж зазначене, але виключає варіанти здійснення з попереднього рівня техніки.

Термін "ад'ювант", як в застосовано в даному документі, означає фармакологічний або імунологічний агент, який модифікує дію інших агентів, таких як лікарський засіб або імуногенна композиція. Ад'юванти часто є включеними в імуногенні композиції для посилення імунної відповіді реципієнта на антиген, що постачається.

Термін "антиген", як застосовано в даному документі, означає речовину, яка розпізнається імунною системою та індукує імунну відповідь. Антиген може містити цілий організм, убитий, ослаблений або живий; субодиницю або частину організму; рекомбінантний вектор, який містить вставку з імуногенними властивостями; частину або фрагмент нуклеїнової кислоти, здатний індукувати імунну відповідь при проявленні в тварині-господарі; протеїн, поліпептид, пептид, глікопротеїн, епітоп, гаптен, вуглевод, цукор або будь-яку їх комбінацію. Альтернативно, антиген може містити токсин або антитоксин. Аналогічний термін, застосований взаємозамінно в даному контексті, - це "імуноген".

Термін "ослаблений", як застосовано в даному документі, стосується штаму мікроорганізму, патогенність якого є зниженою, таким чином, що вона буде ініціювати імунну відповідь без продукування конкретного захворювання. Ослаблений штам є менш вірулентним, ніж батьківський штам, з якого він був отриманий. Ослаблені мікроорганізми можуть бути скриніровані іп міго або іп мімо для підтвердження того, що вони є менш патогенними, ніж його батьківський штам. Звичайні засоби використовуються для введення ослаблюючих мутацій, бо таких як пасирування іп міго, а також хімічний мутагенез. Альтернативний спосіб ослаблення включає в себе внесення попередньо визначених мутацій з використанням сайт-спрямованого мутагенезу, де може бути введена одна або декілька мутацій. Термін "більш ослаблений", як застосовано в даному документі, стосується штаму, який був додатково модифікований за межами ослабленого штаму, з якого він був отриманий. Дане подальше ослаблення може бути досягнуто з допомогою додаткового пасирування іп міго або додаткових раундів хімічного або сайт-спрямованого мутагенезу.

Термін "зародження кристаликів криги", як застосовано в даному документі, означає початок заморожування або перетворення крапель води в кригу.

Термін "імуногенна композиція" або "імунізуюча кількість? як застосовано в даному документі, означає композицію, яка генерує імунну відповідь (тобто, має імуногенну активність), коли вводиться самостійно, або з фармацевтично прийнятним носієм, тварині. Імунною відповіддю може бути клітинна імунна відповідь, опосередкована в першу чергу цитотокКсичними

Т-клітинами, або гуморальна імунна відповідь, опосередкована в першу чергу хелперними Т- клітинами, які в свою чергу активують В-клітини, що призводить до продукування антитіл. Крім того, згенерованими можуть бути специфічні Т-лімфоцити або антитіла, щоб забезпечити подальший захист імунізованого господаря.

Термін "інертний газ", як застосовано в даному документі, означає газ, який не зазнає хімічних реакцій при наборі заданих умов. Азот може використовуватись як інертний газ; інертні гази також можуть використовуватись як інертні гази, включаючи аргон.

Термін "виділений", як застосовано в даному документі, означає, що згаданий матеріал видаляється з середовища, в якому воно зазвичай знаходиться. Таким чином, виділений біологічний матеріал може бути вільним від клітинних компонентів, тобто компонентів клітин, в яких матеріал є виявленим або продукованим. Виділений матеріал може, але не повинен, бути очищений.

Терміни "ліофілізувати" або "ліофілізація", як застосовано в даному документі, означають процес, що складається з двох основних операцій: заморожування (затвердівання) та висушування, остання з яких може бути розділений на дві фази - первинна сушка (сублімація криги) та вторинна сушка (десорбція вологи).

Термін "паразит", як застосовано в даному документі, означає організм, який живе в або на

Зо організмі іншого виду. Деякі паразити розмножуються тільки в організмі господаря (облігатні внутрішньоклітинні), але інші можуть вільно розмножуватися в навколишньому середовищі (факультативно внутрішньоклітинні). Паразити можуть складатися з однієї клітини, як у випадку

Сіагаїіа, або багатьох клітин, як з паразитарними черв'яками.

Термін "патоген", як застосовано в даному документі, означає конкретний збудник захворювання, такий як бактерія, гриб, найпростіші, або вірус.

Терміни "запобігати", "запобігання" або "профілактика", та тому подібне, як застосовано в даному документі, означають інгібування реплікації мікроорганізму, інгібування передачі мікроорганізму, або інгібування мікроорганізму щодо адаптування самого у його господаря. Дані терміни та тому подібне, можуть також означати інгібування або блокування одного або більше ознак або симптомів інфекції.

Термін "найпростіший" або "найпростіші" як застосовано в даному документі, означає різноманітну групу одноклітинних еукаріотичних організмів. Терміни також застосовано неофіційно для позначення одноклітинних, не-фотосинтетичних найпростіших, таких як інфузорії, амеби та жгутикові. Історично, найпростіші були визначені як одноклітинні організми з твариноподібною поведінкою, такою як рухливість та хижацтво. Меозрога є важливим протозойним патогеном, та має життєвий цикл, подібний до Тохоріазта.

Термін "стабілізатор", як застосовано в даному документі, означає сполуку або композицію, який при додаванні до фармацевтичного продукту запобігає або зменшує фізичну та/або хімічну деградацію при зберіганні продукту. Що стосується ліофілізації, стабілізатори можуть запобігати або зменшувати пошкодження лабільних продуктів (наприклад, мікроорганізмів), викликаних зародженням кристаликів криги під час процесу заморожування.

Термін "суб'єкт", як застосовано в даному документі, означає хребетну тварину, таку як ссавець, птах, рептилія, амфібія або риба; більш переважно людину, тварину-компаньйон або домашню тварину; тварину, що виробляє продукти харчування, або тварину, що виробляє корми; сільськогосподарську тварину, мисливсько-промислову тварину, гончу або спортивну тварину, таку як, але не обмежуючись ними, велика рогата худоба, собачі, кошачі, козині, овечі, свинячі, коні, та птиця. Переважно, хребетна тварина є великою рогатою худобою або собакою.

Термін "тахізоїт", як застосовано в даному документі, означає стадію швидкого розмноження в розвитку тканинної фази деяких кокцидій, включаючи Меозрога та Тохоріазта. Тахізоїти є рухливими, діляться на ендодіогени та ендополігени, на відміну від брадизоїтів, які є "сидячими" та є такими, що повільно ростуть.

Терміни "вакцина" та "вакцинна композиція", як застосовано в даному документі, означають будь-яку композицію, яка індукує захисну імунну відповідь проти антигену, який викликає зацікавленість, та/або яка ефективно захищає від антигену.

Нижченаведений опис надається для допомоги фахівцям в даній галузі щодо практичного здійснення винаходу. Незважаючи на це, даний опис не повинен тлумачитися як непомірне обмеження винаходу, оскільки модифікації та варіації в варіантах здійснення, які обговорюються в даному документі, можуть бути здійсненими звичайними фахівцями в даній галузі, не відступаючи від духу або обсягу винаходу.

Імуногенні композиції

Активний иммуногенний компонент може бути найпростішим. Найпростіші можуть включати, але не обмежуватися цим, вид Меозрога (наприклад, Меозрога сапіпит; Меозрога пидпеві), вид

Тохоріазхта (наприклад, Тохоріазта допаїйїї), вид Наттопаїйа (наприклад, Наттопаїйа Пеудогпі), вид Вехпойіа, вид Сузіоізозрога, вид ЕгепКеїїа, вид Мерпгоізозрога, вид Загсосувії5, та вид

Нуа!оКіІоззіа. Інші найпростіші, які можуть використовуватися відповідно до практичного здійснення винаходу з метою отримання імуногенних композицій, включають вид ТПеїйегіа, вид

Ріазтоаішт, вид Тгурапозоте, вид Сіагаіа, вид Воорпйй5, вид Варезіа, вид Епіатоебра, вид

Еїтегіа, вид Іеї5птапіа, вид Зспізіозота, вид Вгидіа, вид РЕавзсіда, вид Оігойагіа, вид умиспегегіа, вид Опспосегеа, вид Тгеропета, вид Стгуріососси5, вид Соссіадіа, вид Нізіотопіавів, вид Нехатійавів, та всі види Стуріозрогіаійт, такі як С. рагмит та С. потіпив.

Ізолят Меозрога сапіпит може бути ослабленим або інактивованим. Ослаблені ізоляти М. сапіпит можуть бути вибрані з будь-якого з наступних: Мо-Зраїп 7 (ССАР депозит Ж 2051/1; 05 2010/0255577), МСТ5-8 (5 6,656,479), як ослаблена форма МС-1, Мо-Можмга (05 7,361,359), або ослаблений мутант будь-якого зі штамів ССАР депозит Ж 2051/2 (Нірга І арогайогієз), ВРАТ1,

ВРА2, ВРАЗ, ВРА4, ВРА5, або ВРАб (05 5,707,617), МС-1 (05 6,787,146), або МЕТ (коневий ізолят; АТСС депозит Ж 209,622). Ослаблений штам також може бути мутантом, в якому конкретний ген або гени були модифіковані таким чином, що штам більше не експресує конкретний протеїн або протеїни, або функціональні еквіваленти зазначеного(их) протеїна(ів).

Зо Зазначений(і) протеїн або протеїни можуть включати один або декілька з наступних: фосфатидилтреонінсинтазу (РТ); мікронемний протеїн 1 (МІС-1); мікронемний протеїн З (МІС- 3); імунний картований протеїн-1 (ІМР-1); щільні гранульовані протеїни 1, 6, або 7 (СКАТ, ОКАб,

СКАТ); апікальний мембранний антиген (АМАТ); поверхневий антиген-1 або 4 (5АС1, ЗАС);

СКА2 (гомолог антигену Тохоріаєта допаї 28 кДа); сортилін-подібного рецептора; карбамоїлфосфатсинтазу ПП (СРЗ І); роптрия шийний протеїн (КОМ2); дигалактоліпідний антиген; протеїн циклофіліну (СуР); МоР20о (05 2004/0131633); або дигідрофолатредуктазу (ОНЕВ).

Способи отримання імуногенів, отриманих з найпростіших, є відомими в даній галузі.

Найпростіші можуть бути ослаблені або інактивовані перед застосуванням як імуногена.

Способи ослаблення та інактивації є добре відомими фахівцям в даній галузі. Способи ослаблення можуть включати, але не обмежуються цим, послідовний пасаж в культурі клітин, ультрафіолетове опромінення та хімічний мутагенез. Способи ослаблення також можуть включати цілеспрямовані генетичні маніпуляції, в яких певний ген, гени, або регуляторні ділянки в зворотному напрямку або в прямому напрямку, є порушеними або видаленими. Такі способи генетичної маніпуляції є добре відомими фахівцям в даній галузі.

Способи інактивації включають, але не обмежуються цим, обробку формаліном, бетапропріолактоном (ВРІ) або бінарним етиленіміном (ВЕЇ), або іншими способами, відомими кваліфікованим фахівцям ов даній галузі такими як обробка ультразвуком, обробка пептидазами, тепловий шок, та шок заморожування. Інактивація формаліном може проводитися шляхом змішування найпростіших з 3790 формальдегідом, до кінцевої концентрації формальдегіду 0,05 95. Протозойно-формальдегідну суміш постійно перемішують протягом приблизно 24 годин при кімнатній температурі. Потім інактивовану суміш досліджують на залишкові живі найпростіші шляхом аналізу на життєздатність. Інактивація з використанням ВЕЇ може проводитися шляхом змішування суспензії із найпростіших з 0,1 М ВЕЇ (2-брометиламін в 0,175 М Маон), до кінцевої концентрації ВЕЇ 1 мМ. Суміш найпростіші-ВЕЇ! постійно перемішують протягом приблизно 48 годин при кімнатній температурі з наступним додаванням 1,0 М тіосульфату натрію до кінцевої концентрації 0,1 мМ. Змішування продовжують ще протягом двох годин. Потім інактивованою суміш досліджують щодо залишкових живих найпростіших шляхом аналізу на життєздатність.

Імуногенні композиції винаходу можуть включати один або декілька ветеринарно- прийнятних носіїв. Такі носії включають, без обмежень, воду, фізіологічний розчин, буферний фізіологічний розчин, фосфатний буфер, спиртові/водні розчини, емульсії або суспензії. Інші звичайно використовувані розріджувачі, ад'юванти та наповнювачі можуть бути додані у відповідності з традиційними методами. Такі носії можуть включати етанол, поліоли та відповідні їх суміші, рослинні олії та ін'єкційні органічні складні ефіри. Крім того, використані можуть бути буфери та агенти, які регулюють рН. Буфери включають, без обмежень, солі, отримані з органічної кислоти або основи. Репрезентативні буфери включають, без обмеження, солі органічних кислот, такі як солі лимонної кислоти, наприклад, цитрати, аскорбінової кислоти, глюконової кислоти, гістидин-Неї, вуглекислоти, винної кислоти, бурштинової кислоти, оцтової кислоти, фталевої кислоти, Ттіх, триметанаміну гідрохлорид, або фосфатні буфери.

Парентеральні носії можуть включати розчин хлориду натрію, декстрози Рінгера, декстрози, трегалози, сахарози, лактату Рінгера, або фіксованих олій. Внутрішньовенні носії можуть включати текучі та поживні поповнювачі, електролітні наповнювачі, такі як ті, які грунтуються на декстрозі Рінгера та подібних. Консерванти та інші добавки, такі як, наприклад, антимікробні засоби, антиоксиданти, хелатоутворюючі агенти (наприклад, ЕДТО), інертні гази, тощо, також можуть надаватися в фармацевтичних носіях. Винахід не обмежується вибором носієм.

Приготування даних фармацевтично прийнятних композицій, з описаних вище компонентів, які мають відповідний рН, ізотонічність, стабільність та інші загальноприйняті характеристики, знаходиться в межах кваліфікації фахівця в даній галузі техніки. Дивіться, наприклад, тексти, такі як Кетіпдіоп: Тпе Зсієпсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, 201 ей, Гірріпсой УмМіШат»е 8 УМІЇКіпв5, рир., 2000; та Тпе НапароокК ої Рпаптасешіса! Ексципієнти, 4.5!1р.й еаіїї., еа5. К. С. Коуе еї аї,

АРПА Рибіїсайоп5, 2003. Ветеринарно-прийнятні носії можуть також включати будь-які та всі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, ад'юванти, стабілізуючі агенти, розріджувачі, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти, затримуючі адсорбцію агенти, тощо. Розріджувачі можуть включати воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин, тощо. Ізотонічні агенти можуть включати хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт та лактозу, серед інших відомих кваліфікованим фахівцям в даній галузі. Стабілізатори включають альбумін, серед інших відомих кваліфікованим фахівцям. Консерванти включають метіолат,

Зо серед інших відомих кваліфікованим фахівцям.

Імуногенний компонент також може включати ад'ювант. Ад'юванти включають, але не обмежуються цим, ад'ювантну систему КІВІ (КіБбі Іпс.; Натікоп, МТ), алюмокалієві квасці, гель гідроксиду алюмінію, емульсії олія-у-воді, емульсії вода-в-олії, такі як, наприклад, повні та неповні ад'юванти Фрейнда, блок спів-полімер (СуїЕх; АЦапіа, СА), БАЕ-М (Спігоп; ЕтегуміПе,

СА), ад'ювант АМРНІСЕМЄЕ, сапонін, ОиїЇ А, 95-21 (Сатргдде Віоївсні Іпс.; Сатьгідде, МА), СРІ- 0100 (СаІепіса Рпагтасеціїіса!5, Іпс.; Віптіпдпат, АГ) або інші фракції сапоніну, монофосфорил- ліпід А, авридин-ліпід-амінний ад'ювант, термолабільний ентеротоксин з ЕзспПегісніа сої (рекомбінантний або інший), холерний токсин або токсин коклюшу. Ряд цитокінів або лімфокінів можуть використовуватись як ад'юванти, включаючи інтерлейкіни 1-а, 1-8, 2,4, 5,6, 7, 8, 10, 12 (дивіться, наприклад, патент США Мо 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 та 18, інтерферони-а, В та у, гранулоцитарний-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (дивіться, наприклад, патент

США Мо 5,078,996 та АТСС номер доступу 39900), макрофагальний колонієстимулюючий фактор, гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор, О5Е, та фактори некрозу пухлини а та

В. Ще інші ад'юванти включають хемокін, включаючи, без обмеження, МСР-1, МІР-1а, МІР-1В, та

КАМТЕ5. Молекули адгезії, такі як селектин, наприклад, І -селектин, Р-селектин та Е-селектин, також можуть бути прийнятними як ад'юванти. Ще інші прийнятні ад'юванти включають муциноподібну молекулу, наприклад, СО34, СІУСАМ-1 та МайсСАМ-Ї1, член родини інтегрина, такий як ГЕА-1, МІ А-1, Мас-1 та р150.95, член надродини імуноглобулінів, такий як РЕСАМ,

ІСАМ5, СО02 та І ЕА-3, спів-стимулюючі молекули, такі як СО4О та СО40ІЇ, фактори росту, включаючи фактор росту судин, фактор росту нервів, фактор росту фібробластів, епідермальний фактор росту, В7.2, РОСЕ, ВІ-1, та судинний ендотеліальний фактор росту, рецепторні молекули, включаючи Раз, ТМЕ рецептор, РІЇ, Аро-1, роб, М/51-1, ОВЗ, ТВАМР, Аро- 3, ПОВІТРЯМ, ГАКО, МОКЕ, ОК4, ОК5, КПТЕК, ТКА -К2, ТКІСК2, та ОКб. Додаткові ад'юванти включають МРІ "м (3-О-деацильований монофосфорильний ліпід А; Согіха, Натіноп,

МТ). Крім того, прийнятними для застосування, як ад'юванти, є синтетичні аналоги ліпідів А або сполуки аміноалкілтглюкозамінфосфата (АСР), або їх похідні або аналоги, які є доступними від

Согіха (Натійоп, МТ) Ще інші адюванти включають 1121/сквален, Ю-лактид- полілактид/глікозид, плюронілові поліоли, мурамілдипептид, убиті ВогаєїейїПа, сапоніни, такі як зітшоп'Мм 05-21 (Апіїдепіс5, Егатіпупат, МА.), та частинки, які утворюються з них, такі як бо ІЗСОМ5 (імуностимулюючі комплекси).

Для його застосування та введення суб'єкту, ліофілізована імуногенна композиція або вакцинна композиція може відновлюватися шляхом регідратації розчинником. Розчинником зазвичай є вода, така як демінералізована або дистильована вода, вода для ін'єкцій, але також може містити фізіологічні розчини або буфери, такі як, наприклад, фосфатний буферний розчин (РВ5).

Загальний вміст компонентів у відновленій готовій до ін'єкції імуногенній композиції або вакцинній композиції за винаходом може використовуватись для забезпечення ін'єкції в ізотонічній концентрації, наприклад, в діапазоні приблизно 100-1200 мОсм, зазвичай в межах приблизно 250-600 моОсм, та переважно приблизно 330 моОсм.

Дозування живих мікроорганізмів в імуногенних композиціях або вакцинних композиціях, або у відтвореній готовій до ін'єкції імуногенній композиції або вакцинній композиції, може становити від приблизно 102 до приблизно 107 ССІЮзхо/доза.

Відтворену готову до застосування імуногенну композицію або вакцинну композицію можуть вводити тварині шляхом ін'єкції парентеральним або мукозальним шляхом, переважно внутрішньом'язово та підшкірно. Однак, введення такої відтвореної готової до вживання імуногенної композиції або вакцинної композиції може також включати інтраназальне, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне, інтратекальне, внутрішньошлуночкове, інтрауретральне, інтрастернальне, інтракраніальне, внутрішньошкірне, місцеве або пероральне введення. Об'єм дози для ін'єкції може становити від приблизно 0,1 мл до приблизно 2,0 мл, та переважно приблизно 1,0 мл.

Стабілізатори

Винахід стосується способу висушування заморожуванням найпростіших, включаючи внутрішньоклітинні найпростіші з таксономічної групи Арісотріеха, такої як Меозрога сапіпит.

Перед висушуванням заморожуванням, найпростіші можуть бути об'єднані з або ресуспендовані в, щонайменше одному стабілізаторі. Дані стабілізатори можуть зберігати або сприяти збереженню імуногенності, інфекційності та життєздатності біологічних інгредієнтів до, під час та після процесу висушування заморожуванням, з допомогою чого біологічні інгредієнти можуть включати, але не обмежуватися цим, найпростіші, віруси, бактерії, гриби, протеїни, поліпептиди, серед інших. Стабілізатори, які використовуються в представлених способах

Зо висушування заморожуванням можуть мати корисний(ї) аспект(и), включаючи, наприклад, однорідну форму та колір, та бути безпечними для введення суб'єкту.

Стабілізація біологічних інгредієнтів у сухому вигляді зазвичай передбачає збереження антитоксинів, антигенів та бактерій (Ріозодогі еї а! (1935) 9. Іттипої. 29, 389). Однак, обмеження даного процесу включало часткову денатурацію протеїнів при висушуванні з водного стану при температурах навколишнього середовища. Висушування із замороженого стану допомогло зменшити денатурацію та призвело до кращого, хоча і неповного збереження біологічних інгредієнтів, включаючи бактерії та віруси (біатр еї аї. (1947) 9. Сеп. Місгобіої. 1, 251; Кіднпівеї еї а!І. (1967) Стуобіоіоаду 3, 423; Воме вії а!. (1971) Стуобріоіоду 8, 251).

Велику кількість сполук досліджували щодо їх здатності стабілізувати різні вакцини, які містять живі ослаблені біологічні інгредієнти. Такі сполуки включають ЗРОА (сахарозу, фосфат, глутамат, та альбумін; ВоматіскК еї аї!. (1950) 9. Васіегіо!І. 59, 509-522; патент США Мо 4,000,256), бичачий або людський сироватковий альбумін, солі лужних металів глутамінової кислоти, солі алюмінію, сахарозу, желатин, крохмаль, лактозу, сорбіт, Тгіє-ЕДТО, гідролізат казеїну, лактобіонат натрію та калію, та фосфат монометалевого або диметалевого лужного металу.

Інші сполуки включають, наприклад, суміші 5РО-М2 аміну (наприклад, патент США Мо 3,783,098) та полівінілпіролідону (РУР) (наприклад, патент США Мо 3,915,794).

Стабілізатор може містити, щонайменше, один відновлюючий моносахарид, причому відновлюючий моносахарид може містити глюкозу, галактозу, фруктозу, маннозу, сорбозу або їх комбінації.

Стабілізатор може додатково містити, щонайменше один невідновлюючий олігосахарид, включаючи трегалозу, сахарозу, рафінозу або їх комбінації.

Додаткові прийнятні цукри включають декстрозу, глюкозу, лактозу та мальтозу.

Стабілізатор може містити щонайменше одну кислотну антиоксидантну сполуку, включаючи аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аскорбінову кислоту, або їх комбінації.

Стабілізатор може містити щонайменше один цукровий спирт, включаючи сорбіт, маніт, ксиліт, мальтит або їх комбінації.

Деякі компоненти, включаючи стабілізатори, можуть не бути легко розчинними. Однак, як відомо, кваліфікований фахівець є цілком здатним замінити відповідні аналогічні компоненти (наприклад, шляхом вибору більш розчинного компонента) та/(або адаптувати число або бо кількості нерозчинного компонента, присутнього в стабілізаторі, з метою отримання розчинний стабілізатор. Розчинність компонента легко перевіряється візуальним тестом на розчинність.

Тест на розчинність включає операції додавання всіх компонентів стабілізатора при температурі приблизно 55 "С, та перемішування протягом приблизно 30 хв. Приблизно через 24 години при кімнатній температурі та без будь-якого перемішування, стабілізатор може бути візуально перевірений на появу осадів. Якщо стабілізатор є безбарвним або прозорим, то всі компоненти стабілізатора є розчинними.

Структуроутворюючі агенти

Структуроутворюючі агенти є включеними в ліофілізовані протеїнові композиції для збільшення маси продукту, регулювання тонічності, покращення зовнішнього вигляду продукту, запобігання спаданню продукту, або допомоги в регідратації (Умапод, Іпї. У Ріапт., 203:1-60, 2000). Тим не менш, вважається, що структуроутворюючі агенти зазвичай мають незначний або ніякого впливу на стабільність протеїну. При цьому ексципієнти, такі як сахароза, додаються спеціально для підвищення стабільності протеїну (Сагрепіеєг еї а!., Рпагт. Кев., 14:969-75, 1997; та Сагрепіег еї аїЇ., Еиг. У РІагпт., 45:231-8, 2002), ступінь пошкодження протеїна під час висушування заморожуванням, та подальше зберігання потенційно знаходиться під впливом всіх ексципієнтів в композиції, включаючи структуроутворюючі агенти.

Значення "ТГ9д" визначають як температуру склування, що відповідає температурі, нижче якої заморожена матриця зазнає структурного переходу від в'язкопружного стану до склоподібного стану, даний перехід є пов'язаним з різким зниженням молекулярної рухливості та, отже, зменшенням реакцій розкладання. Структуроутворюючий агент підвищує значення 79 імуногенних композицій та вакцинних композицій, що дозволяє використовувати більш високі температури під час заморожування. Однією з переваг включення структуроутворюючого агента в висушених заморожуванням пастилках та таблетках є те, що це дозволяє зберігати тверду форму пастилок без створення гідрогенових зв'язків.

Структуроутворюючий агент може бути фармацевтично або ветеринарно прийнятним полімером, таким як, але не обмежуючись ним, декстран, маніт, мальтодекстрин, полівінілпіролідон (РМР), кросповідон, та гідроксіетил крохмаль. Інші похідні крохмалю включають, але не обмежуються цим, мікрокристалічну целюлозу, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу, гідроксипропілцелюлозу, гідроксіегилметилцелюлозу та

Зо гідроксипропілметилцелюлозу. Переважно, структуроутворюючий агент може бути манітом, декстраном або РМР. Крім того, передбаченими є комбінації з щонайменше двох структуроутворюючих агентів.

Якщо декстран використовується, як структуроутворюючий агент, його молекулярна маса може становити від приблизно 5000 Да до приблизно 70000 Да, переважно від приблизно 10 000 Да до приблизно 40 000 Да. Якщо РУР використовується як структуроутворюючий агент, його молекулярна маса може становити від приблизно 8 000 Да до приблизно 360 000 Да, переважно від приблизно 10 000 Да до приблизно 60 000 Да. Якщо мальтодекстрин використовується, як структуроутворюючий агент, то його еквівалентне значення декстрози (ОЕ, що є кількісною мірою ступеня гідролізу крохмального полімеру) може становити від приблизно

З до приблизно 20, переважно від приблизно 5 до приблизно 18, більш переважно від приблизно 10 до приблизно 15. Якщо гідроксіетилкрохмаль використовується, як структуроутворюючий агент, його молекулярна маса може становити від приблизно 70 000 Да до приблизно 450 000 Да, переважно від приблизно 130 000 Да до приблизно 200 000 Да.

Ступінь заміщення гідроксіетилкрохмаля може становити від приблизно 0,4 до приблизно 0,7, переважно від приблизно 0,4 до приблизно 0,6. Ступінь заміщення визначається як кількість гідроксіетильної групи на одиницю глюкози.

Процес ліофілізації

Процес ліофілізації (висушування заморожуванням) імуногенної композиції включає операції: (а) контактування суспензії або розчину зі стабілізатором, утворюючи тим самим стабілізовану імуногенну суспензію або розчин; (Б) охолодження, при атмосферному тиску, стабілізованої імуногенної суспензії або розчину до температури меншої, ніж приблизно значення Ту стабілізованої імуногенної суспензії; (с) висушування стабілізованої імуногенної суспензії або розчину шляхом сублімації криги при низькому тиску; та (4) видалення надлишку залишкової води шляхом подальшого зниження тиску та підвищення температури стабілізованої імуногенної суспензії або розчину.

Операція охолодження (Б) може відбуватися при температурах менших, ніж приблизно - 40 "С. Висушування стабілізованих імуногенних суспензій або розчину шляхом сублімації криги при низькому тиску (с) може відбуватися при, наприклад, тисках, менших, ніж або рівних приблизно 200 мікробар, тоді як подальше зниження тиску може відбуватися при тисках, 60 менших, ніж або рівних до приблизно 100 мікробар. На завершення, температура стабілізованої імуногенної суспензії або розчину під час видалення надлишку залишкової води (а) відбувається при, наприклад, температурах від приблизно 20 С до приблизно 37 С для біологічних продуктів.

Вміст вологи в ліофілізованому матеріалі може знаходитись в діапазоні від приблизно 0,5 95 до приблизно 5 95 мас./мас., переважно від приблизно 0,5 95 до приблизно З 95 мас./мас., та більш переважно від приблизно 1,0 95 до приблизно 2,6 95 мас./мас.

Переважно, стабілізована імуногенна суспензія або розчин, який містить щонайменше один структуроутворюючий агент, має високе значення 19 від приблизно -36 "С до приблизно -30 "С, але може бути нижче, ніж -36 "С та/або вище, ніж -30 "С, в залежності від складу та концентрації композиції. Високе значення 9 дозволяє більш високі температури під час операції заморожування води в процесі заморожування та/або процесі висушування заморожуванням, тим самим зменшуючи вплив стресу на активний імуногенний компонент, уникаючи істотної втрати активності. Тому дуже важливим є мінімізувати дані стреси, наскільки це можливо, під час процесу ліофілізації, наприклад, під час операції зародження кристаликів криги.

Для кращого контролю тиску під час процесу ліофілізації, інертний газ може бути введеним в камеру. Одним з прикладів інертного газу буде азот. Однак, також можуть використовуватись інертні гази - такі, що мають надзвичайно низьку реакційну здатність з іншими речовинами.

Аргон є ілюстративним інертним газом, який може використовуватись. Повітря, однак, оскільки воно містить 78 95 азоту, також може використовуватись для контролю тиску під час процесу ліофілізації.

Кожна операція, включаючи заморожування води, та її видалення під час первинних та вторинних операцій висушування, піддає біологічні інгредієнти в імуногенних суспензіях або розчинах за винаходом механічному, фізичному та біохімічному шоку. Вони можуть мати потенційно несприятливий вплив на структуру, зовнішній вигляд, стабільність, імуногенність, інфекційність та життєздатність біологічних інгредієнтів.

Стабілізатори та процес ліофілізації, розкриті в даному документі, всі можуть використовуватись для збереження будь-якого ізоляту Меозрога сапіпит або імуногенної композиції, або для будь-якого ізоляту найпростішого або імуногенної композиції. Імуногенна композиція може містити живий, ослаблений мікроорганізм, де представлений процес є

Зо останньою стадією в отриманні вакцини. Даний процес також може використовуватись для збереження вихідних культур М. сапіпит, забезпечуючи збереження максимальної життєздатності протягом зберігання. Даний процес також може бути проміжною стадією в процесі отримання інактивованої імуногенної композиції. Ізолят М. сапіпит, або будь-який інший ізолят найпростішого, може бути ліофілізованим з використанням даного способу, та потім пізніше регідратованим та необов'язково поєднаним з іншими регідратованими препаратами М. сапіпит. Потім він може бути інактивованим за будь-яким з декількох способів, добре відомих кваліфікованим фахівцям в даній галузі, та раніше описаним в даному документі.

Далі винахід далі буде описаний наступними необмежуючими прикладами, наведеними для ілюстрації різних варіантів здійснення винаходу. Однак, вони не призначені, обмежувати цей винахід будь-яким способом.

Приклади

Приклад 1. Композиції та протокол ліофілізації.

Після декількох раундів дослідження було отримано оптимальну композицію та концентрацію стабілізатора в розчині. Кінцева композиція (Таблиця 1) містила ВЗА, Тмееп 80, трегалозу, лимонну кислоту та ЕССО (галат епігалокатехіна; антиоксидант). Дана композиція не містила ДМСО, однак, уникаючи проблем з якістю кінцевої висушеної заморожуванням пелети, а також проблеми небезпеки (токсичності) для оператора та для обладнання (займистість; ризик вибуху). Кожен з реагентів, описаних в Таблиці 1, може варіюватися як її відсотковий внесок, такий як: ВЗА (5-2595 мабс./06б.); трегалоза (5-25 95 мас./об.); ТмеепФ 80 (Сгода

БО Атетісав) (0.5-25 95 об./06.); лимонна кислота (1-10 95 мас./об.); та ЕОСО (від 0,1 до 5 мг/мл) або еквівалентну аскорбінову кислоту (0,1 10 5 мг/мл). Взагалі кажучи, якщо трегалозу замінюють на інший цукор або цукровий спирт, вихідні концентрації в Таблиці 1 повинні становити 15-25 95. Стабілізуючий розчин, показаний в Таблиці 1, включає концентрацію лимонної кислоти 2,5 95, яка є переважною. Концентрація лимонної кислоти приблизно 1,5 95 також є особливо переважною. Інші протеїнові стабілізатори можуть використовуватись при заміні бичачого сироваткового альбуміну, як є добре відомим в даній галузі для включення, на людський сироватковий альбумін, наприклад, при аналогічних концентраціях.

Крім того, слід зазначити, що багато інших складних ефірів сорбітану, таких як "Зрапе" Ф (Стода Атегісає та Стгода Еигоре 1494), та їх етоксилати, такі як "Тмееп5"Ю (Стгода), є бо прийнятними в практиці винаходу щодо включення (також при концентраціях в розчині стабілізатора приблизно 0,5-25595 о0о6б./06.), Зрап 20, 40, 60, 80 та 120 (монолаурат, монопальмітат, моностеарат, моноолеат, та ізолстерат, відповідно) та Тмеєеп 20, 40 60 та 80 (монолаурат, монопальмітат, моностеарат, моноолеат ПЕГ-20 сорбітани, відповідно). Стосовно концентрацій Туеепт та ЗрапфФ, які є прийнятними, суттєва ефективність, як зазначено, становить щонайменше приблизно 0,5 95 об./об. від кінцевої концентрації. Стабілізатор розчину перемішували протягом 2 годин, та потім фільтрували через 0,2 мкм стерилізуючий фільтр.

Таблиця 1 . Лимонна : 15 96 15 95 12,5 96 2,5 90

Клітинна Мего культура, інфікована Меозрога, потім збирали механічно з використанням скребка для клітин. Оскільки інфіковані клітини є досить крихкими, більшість паразитів вивільняються в культуральне середовище, яке вже містило деякі клітини вільні від паразитів.

Багато з відновлених паразитів є тахізоїтами, хоча можуть відзначатися форми брадизоїтів та ооцистів. Клітини Маго-145 є альтернативною культурою клітинної лінії. Концентрацію найпростіших в зібраному культуральному середовищі визначали з допомогою гемоцитометра, яка становила 9,09 х 105/мл.

В репрезентативному прикладі кінцеву композицію збирають наступним чином. 45 мл зібраної культури клітин змішують з 5 мл ЕВ5 (ембріональної бичачої сироватки), в результаті чого отримують розчин, який в даний час становить 10 95 ЕВ5. 50 мл даного розчину змішують (171) з 50 мл вищевказаного розчину стабілізатора, хоча три компоненти не потрібно змішувати в даній точній послідовності. Як зазначено вище, процедури ліофілізації та стабілізації за винаходом зазвичай застосовуються для всіх фаз життєвого циклу найпростіших Арісотріеха.

Два мілілітри кожної з кінцевих композицій відмірювали в 15 мл флакони, частково закривали, та завантажували на попередньо охолоджені полиці, для підготовки до ліофілізації.

Невелика кількість суміші використовувалася для визначення температури склування, виміряної з використанням модульованої диференціальної скануючої калориметрії (ДСК). Потрібно ще раз відзначити, що аскорбінова кислота може використовуватись як заміна для ЕС, в розчині стабілізатора при концентрації 0,45 мг/мл або при будь-якій іншій концентрації, як зазначається, є функціональною для ЕССО (така як від приблизно 0,1 до приблизно 5,0 мг/мл).

Для того, щоб мінімізувати шкідливий вплив на життєздатність мікроорганізму, що може

Зо відбуватися під час операції заморожування ліофілізації, був розроблений модифікований протокол, що має спеціальну мету кращого контролю за температурою зародження кристаликів криги під час операції заморожування. Камера висушування знаходилась під тиском аж до 2 бар, з наступною швидкою розгерметизацією камери до атмосферного тиску. Температура в камері потім утримувалася на рівні від -1 "С до -15 "С. Температура потім була знижена до - 50 С під час первинного періоду висушування, та потім поступово підвищували до -35 "С. Це було нижче температури склування композиції, та запобігало усадці та розкладанню висушеній заморожуванням пелети. Температура потім піднімалася до 20 "С під час другої операції висушування; залишковий вміст вологи в ліофілізованому продукті ніколи не перевищував З 95.

Під час цього протоколу в камеру вводився газ, щоб допомогти краще контролювати тиск, оскільки він знижується.

Висушені заморожуванням найпростіші потім зберігалися при -70"С. Після 37 днів зберігання вони були регідратовані культуральними середовищами. Концентрація життєздатних найпростіших безпосередньо після регідратації, як було визначено, становить 7,0 х 105/мл, що дорівнює 77 95 виживаності. Регідратовані найпростіші також використовували для інфікування культури клітин Мего. Після 30 годин інкубування весь клітинний моношар був інфікований, та протягом «54 годин життєздатні тахізоїти завершили свій життєвий цикл в клітинах-господарях (дані не показані) Культуру найпростіших збирали через 54 години, та життєздатні мікроорганізми підраховували з використовуванням фарбування Тгурап Віце та гемоцитометра; концентрація, як визначено, становить 6,5х105 найпростіших/мл. Спосіб є застосовуваним до відповідних операції життєвого циклу всіх вищезгаданих додаткових найпростіших.

Приклад 2. Вплив концентрації стабілізатора на життєздатність тахізоїтів.

Використовуючи розчин стабілізатора Таблиці 1 при різних концентраціях, з або без присутності ембріональної бичачої сироватки (ЕВ5), оцінювали вплив на життєздатність ліофілізованих тахізоїтів М. сапіпит. Тахізоїти були ліофілізовані відповідно до протоколу

Приклада 1, та після зберігання при -80 "С протягом 37 днів, потім були регідратованими в культуральних середовищах. Життєздатні тахізоїти потім перераховували з використанням фарбування Тгурап Віце та підрахунку на гемоцитометрі. Результати (Таблиця 3) показують кореляцію між концентрацією стабілізатора та життєздатністю ліофілізованих тахізоїтів, де

Збільшення концентрації стабілізатора призвело до збільшення життєздатності.

Продемонстрованим також був позитивний ефект від включення ЕВ5 в стабілізаційний буфер, оскільки відсоток життєздатних тахізоїтів був вищим, коли ЕВ5 був присутній, ніж коли він не був.

Таблиця 2 (найпростіших/ті)

Концентрація після регідратації ліофілізованого матеріалу 7,0х105 5,0х105 4,0х105 2,5х105 (найпростіші/мл) - Фактор розбавлення - Загальний об'єм розчину / об'єм антигену

Claims (19)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб ліофілізації найпростіших, в якому під час операції заморожування регулюють зародження кристаликів криги, підвищуючи тиск та знижуючи тиск інертного газу або повітря.

2. Спосіб за п. 1, в якому зародження кристаликів криги регулюють, підвищуючи тиск та знижуючи тиск інертного газу.

3. Спосіб за п. 2, в якому інертний газ є азотом або аргоном.

4. Спосіб за п. 1, який полягає у: А) завантаженні суміші клітин, найпростіших та стабілізуючого буфера в камеру висушування, яка знаходиться при температурі приблизно 5 "С та тиску приблизно 1 бар, де стабілізуючий буфер складається з таких компонентів: бичачого сироваткового альбуміну, полісорбату 80, ембріональної (фетальної) бичачої сироватки, трегалози, лимонної кислоти та галату епігалокатехіну; В) зниженні температури камери до -1 - -15 "С та утримуванні протягом приблизно 5 хв; С) підвищенні тиску камери до 1,2-2 бар та утримуванні протягом приблизно 45 хв, при цьому підтримують температуру камери -1 - -15 С; р) швидкому зниженні тиску камери до приблизно 1 бар, при цьому утримуючи температуру -1 - -15 276; Е) утримуванні тиску в камері приблизно 1 бар, зниженні температури до -50 "С протягом Ко) приблизно 45 хв; Е) утримуванні тиску в камері приблизно 1 бар температури до -50 "С протягом ще приблизно 90 хв; с) утримуванні температури в камері -50 "С, зниженні тиску в камері до приблизно 0,1 мбар протягом приблизно 30 хв; Н) утримуванні температури в камері -50 "С, зниженні тиску в камері до приблизно 0,01 мбар протягом приблизно 60 хв; І) утримуванні тиску в камері приблизно 0,01 мбар, підвищуючи температуру в камері до -35 "С та утримуванні протягом приблизно 60 хв; У) утримуванні тиску в камері приблизно 0,01 мбар та температури до -35 "С протягом додаткових 3500 хв; К) зниженні тиску в камері до приблизно 0,005 мбар; підвищуючи температуру до 20 "С протягом додаткових 360 хв; Ї) утримуванні тиску в камері приблизно 0,005 мбар та температури до 20 "С протягом додаткових 900 хв.

5. Спосіб за п. 4, в якому найпростіші є з таксономічної групи Ар/сотріеха.

6. Спосіб за п. 5, в якому найпростіші вибирають з класу Соссіаіа.

7. Спосіб за п. б, в якому найпростіші вибирають з порядку Еисоссідіопаа.

8. Спосіб за п. 7, в якому найпростіші вибирають з родини багсосузіїйає.

9. Спосіб за п. 8, в якому найпростіші вибирають з роду, що складається з Меозрога, Наттопаїіа та Тохоріахта.

10. Спосіб за п. 9, в якому найпростіші є з роду Меозрога.

11. Спосіб за п. 10, в якому найпростіші є Меозрога сапіпит.

12. Спосіб за п. 4, який є кінцевою стадією в отриманні вакцини.

13. Спосіб за п. 4, який є проміжною стадією в отриманні вакцини.

14. Спосіб за п. 11, в якому Леозрога сапіпит є інактивованим.

15. Спосіб за п. 11, в якому Леозрога сапіпит є живим ослабленим.

16. Спосіб за п. 14 або 15, в якому Леозрога сапіпит вибирають з групи, що складається з: Мо- Зраїп 7, МСТ5-8, Ме-Момлта, МО-1 та МЕТ.

17. Спосіб за п. 15, в якому живий ослаблений Меозрога сапіпит має мутацію в протеїні, вибраному з групи, що складається з: РТ5, МІС-1, МІС-3, ІМР-1, аВАТ, СВАб, СВА?7, АМАТ, 5АС1, 5АС4, СОКА2, сортилінподібного рецептора, СРБЗ ЇЇ, КОМ2, дигалактоліпідного антигена; СУР; МоР20 та ОНЕК.

18. Меозрога сапіпит, ліофілізований за способом за п. 4.

19. Вакцина проти Меозрога сапіпит, отримана процесом, який включає спосіб за п. 4.