KR101978865B1

KR101978865B1 - Plga로 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101978865B1
Application number: KR1020160160247A
Authority: KR
Inventors: 박세창; 윤새길
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2019-05-15
Also published as: KR20180060583A

Abstract

본 발명은 면역 효과가 향상된 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 기존의 포르말린 사균 백신의 단점을 보완하기 위해 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 종래의 포르말린 사균 백신에 비해 면역능 및 면역 지속시간이 현저하게 증진되어, 백신이 투여되는 개체의 면역력을 보다 효과적으로 향상시킬 수 있다.

Description

PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물 및 이의 제조방법{Vaccine composition comprising PLGA encapsulated inactivated microbial cell and method for preparing the same}

본 발명은 면역 효과가 향상된 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 기존의 포르말린 사균 백신의 단점을 보완하기 위해 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

우리나라 해산어 양식은 양식기술의 발달과 더불어 지속적인 생산성 향상을 가져왔다, 그러나, 현재 양식 산업은 연안 양식 환경의 악화, 장기간의 집약적인 양식으로 인한 어장의 노화, 양식품종의 열성화 및 질병 발생 등을 원인으로 양식 생산성이 저하되고 있다.

어류는 변온동물로서 환경에 대한 적응력을 어느 정도 갖고 있지만 그 한계를 넘어버리면 생리적 장해를 일으키게 된다. 어류에 있어서 질병은 육상동물과 같이 내적·외적 환경에 대해 더 이상 건강상태를 유지할 수 없는 상태를 말한다. 어류의 체내에 병원체가 침입하는 경로는 피부, 아가미, 비강 또는 소화관 등이 있다. 이들 기관은 점액, 효소, 항균성 물질, 항체, 백혈구 또는 대식세포 등의 분비 및 작용에 의해 침입하는 세균으로부터 보호된다. 그러나, 어류의 선별 시에 입는 기계적인 손상 또는 기생충에 의한 상처, 또는 사육관리의 부실 등에 의해 이들 보호 물질이 손상을 입게 된다. 이를 통해 병원체가 체내에 침입하게 되고, 이후 병원체가 혈류를 타고 장기나 조직에 도달하여 병소를 형성하게 된다.

양식어의 세균성 질병은 병원성 세균 또는 다른 원인에 의한 2차적인 감염에 의해 발생한다. 양식장의 사육수는 유기질을 많이 함유하여 세균이 잘 번식할 수 있는 환경이므로, 어류가 건강하지 못하거나 방어력이 약해졌을 때 질병이 발생할 가능성이 높다. 세균성 질병은 감염세균의 종류 및 증상에 따라 질병의 종류가 구분되며, 발생빈도가 높고 전염성이 강하며 일단 감염이 되면 누적 폐사량이 많기 때문에 양식장에 큰 경제적 손실을 가져온다.

어류에 피해를 입히는 병원생물은 원생동물(기생충), 진균류(곰팡이), 세균 또는 바이러스 등이 있다. 기생충은 수십 ㎝에서부터 수백 ㎛, 세균은 수 ㎛, 바이러스는 수천분의 1 ㎛ 정도로 매우 작으며, 이들이 어류에 피해를 주는 방법 및 대책법은 서로 상이하다. 특히 어류 양식산업에서 가장 문제가 되고 있는 대표적인 질병은 스쿠티카증, 세균성 질병인 연쇄구균증, 비브리오증 또는 활주세균증 등이 있다. 종래에 어류 질병은 주로 항생제를 사료와 함께 양식탱크에 투입하여 어류에 경구 투여함으로써 치료하였다. 이러한 치료 방법은 조기 치료 시에는 효과가 높지만, 병원균이 장관 내에 정착 및 증식하여 치료가 잘 되지 않으며, 다양한 항생제의 사용은 다제내성 병원체를 양산할 가능성이 높은 단점이 있다.

어종에 빈발하는 각종 감염증 또는 이들의 합병증에 대하여 화학요법제를 빈번하게 사용하게 되면, 약제 내성균의 출현을 초래한다. 또한 상기 어류 감염증은 양식어의 품질을 저하시키고, 폐사어 또는 병어의 폐기에 의한 생산비용의 상승을 초래한다. 따라서, 어류 양식업계의 주요 과제는 경제적 손실을 막기 위해 어류 감염증을 사전에 예방하는 것이다.

백신은 사균화시킨 미생물(세균 또는 바이러스), 약화시킨 유기체 등을 체내에 투여함으로써, 특정 질병에 대한 항체를 형성시켜 면역력을 증진시키기 위해 사용된다. 한편, 어류 대상 백신에 대해 다양한 연구가 진행되고 있으며, 예를 들어 DNA 백신, 서브유닛(subunit) 백신 또는 포르말린 사균 백신(formalin-killed cell-cultured) 등이 연구 및 사용되고 있다. 그러나, DNA 백신 또는 서브유닛 백신은 제조 시 비용이 많이 소요되는 단점이 있어, 포르말린 사균 백신이 많이 사용된다. 포르말린 사균 백신의 단점을 보완하기 위해 다양한 어쥬번트(adjuvant) 들이 개발 및 사용되고 있으나, 아직까지 면역능 및 면역 지속시간이 현저하게 향상된 불활성화 균체를 포함하는 백신 조성물의 개발은 미흡한 실정이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 기존의 포르말린 사균 백신의 단점을 개선하여, 면역능 및 면역 지속시간이 향상된 백신 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하고 백신의 면역 효과를 향상시키기 위해 예의 연구 노력한 결과, 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)을 폴리 (d,l)-락티드-코-글리콜산[Poly (d,l)-lactide-co-glycolic acid, PLGA]으로 캡슐화하는 경우 백신 조성물의 면역능 및 면역 지속시간이 현저하게 증진되는 것을 발견하였다. 또한, 상기 백신 조성물의 면역 증진 효과를 더욱 향상시키기 위해, 캡슐화된 항원의 입자의 크기를 최대한 크게 제조함으로써 면역 효과의 지속 시간이 증진되는 놀라운 발견을 하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 PLGA[Poly (d,l)-lactide-co-glycolic acid]는 생체 내에서 젖산과 글리콜산으로 분해되고, 최종적으로 이산화탄소와 물로 배출되는 생분해성 및 생체 적합성을 갖고 있으며, 미국 식품의약품안전청에서 승인된 고분자 물질이다. 상기 불활성화 균체의 캡슐화는 W/O/W 이중 에멀전 미세 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 백신 조성물은 양식 어류에 사용될 수 있는 어류용 백신 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화 균체는 세균성 또는 기생충성 질병의 병원체를 불활성화시킨 것이 사용될 수 있다. 상기 불활성화 균체는 동결 처리, 열 처리 또는 포르말린 처리 등을 통해 불활성화 될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 불활성화 균체는 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)이 사용될 수 있다. 상기 포르말린 처리는 0.3%~2%의 포르말린으로 4℃ 또는 상온에서 2시간 이상 또는 24~48 시간 동안 수행될 수 있으며, 상기 동결 처리는 -80 내지 0℃에서 수행될 수 있다. 상기 세균성 질병의 병원체는 열처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리될 수 있으며, 상기 기생충성 질병의 병원체는 동결처리 또는 포르말린 처리 방법에 의하여 불활성화 처리될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 균체는 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 스트렙토코커스 이니애(Streptococcus iniae) 및 테나시바쿨럼 마리티멈(Tenacibaculum maritimum) 등으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세균을 포함하는 어류 병원체 또는 이리도바이러스(Irodovirus) 등과 같은 바이러스성 어류 병원체 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체는 에어로모나스 하이드로필라의 불활성화 균체가 사용될 수 있다. 상기 에어로모나스 하이드로필라는 어류 등 수생동물의 병원균이며, 사람에게 병원성을 나타내는 종일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 어류는 미꾸라지,　넙치, 농어, 송어, 우럭 및 돔류 등으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 어류일 수 있으며, 바람직하게 상기 어류는 잉엇과 미꾸라지(cyprinid loach)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체의 입자 크기는 1 내지 100 ㎛, 바람직하게 5 내지 50 ㎛, 더욱 바람직하게 10 내지 45 ㎛, 가장 바람직하게 15 내지 40 ㎛일 수 있다. 본 발명의 PLGA로 캡슐화된 불활성화 균체는 상기 범위의 입자 크기의 범위를 가짐으로써, 면역능 및 면역 지속 시간이 현저하게 향상된다. 상기 불활성화 균체의 입자 크기가 10 ㎛ 미만일 경우에는 면역 효과의 지속 시간이 감소할 우려가 있으며, 상기 입자의 크기가 100 ㎛ 초과일 경우에는 조성물의 제형 안정성이 저해될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 W/O 제형, O/W 제형 또는 W/O/W 제형 등으로 제조될 수 있으며, 바람직한 입자 크기를 고려하여 W/O/W 이중 에멀전 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명은 (s1) 불활성화 균체 및 PLGA를 혼합하는 단계; 및 (s2) 상기 혼합물을 W/O/W 이중 에멀전으로 제조하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 백신 조성물의 제조 방법은 (a) 불활성화 균체를 포함하는 수용액상을 제조하는 단계; (b) PLGA를 용매에 용해한 후, 수상 및 유상을 혼합 및 교반하여 W/O 에멀전을 제조하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 수용액상에 상기 (b) 단계의 W/O 에멀전을 첨가하고 교반하여 W/O/W 이중 에멀전을 제조하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 생성물의 용매를 제거하고 경화시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 용매 제거 과정은 교반 또는 증발에 의해 수행될 수 있으며, 상기 용매 제거 과정 및 경화 과정은 90 ~ 400 rpm, 바람직하게는 300 rpm의 교반에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 (d) 단계 후에 경화 과정을 거친 PLGA 미립자를 액체 질소를 이용하여 동결 건조하거나, 진공 중에 24시간 이상 건조하는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 불활성화 균주, 바람직하게 사멸 균주의 세포 용해물 또는 세포 외 산물(extracellular products, ECPs) 등을 추가로 포함할 수 있다. 이를 통해 백신 조성물의 면역력 향상 효과를 더욱 증진시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 면역 보조제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제 또는 면역 증강제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 면역 증강제는 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 스쿠알렌 및 키토산 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 상기 폴리솔베이트계 비이온성 계면활성제의 예는 트윈 80, 트윈 60 또는 트윈 20일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트윈 80일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 불활성화 균체의 함량은 적용 대상 어류 또는 병원체 등에 따라 적절히 조절하여 설정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 어류 1 마리당 주입되는 불활성화 균체의 함량을 고려하여 제조될 수 있으며, 상기 균체의 함량은 일괄 또는 수회 나누어 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 어류에 처리하여 어류의 세균성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 예방 또는 치료 방법은 백신 조성물을 어류의 복강에 투여하거나, 근육 주사를 통해 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 종래의 포르말린 사균 백신에 비해 면역능 및 면역 지속시간이 현저하게 증진되어, 백신이 투여되는 개체의 면역력을 보다 효과적으로 향상시킬 수 있다.

도 1은 전자현미경(SEM)으로 관찰한 항원이 로드된 PLGA 마이크로스피어의 사진이다.
도 2는 레이저 회절법을 사용하여 항원이 로드된 PLGA 마이크로스피어의 입도 분포에 따른 유체 역학적 직경을 측정한 분포 데이터를 나타낸다.
도 3은 A 그룹(PLGA) 및 B 그룹(FKC)에서 백신 접종 이후 시간에 따른 응집 역가를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실험예 1: 실험 재료의 준비

(1) 폴리머 및 어류의 준비

폴리 (d,l)-락티드-코-글리콜산(PLGA, MW 66,000-107,000) 및 폴리비닐 알코올(PVA, 평균 MW 89,000-98,000)는 Sigma-Aldrich 사(St Louis, MO 63195, USA)로부터 구매하였다. 5.8 g 내지 8.7 g의 평균 개체량을 가지며 정상인 300마리의 잉엇과 미꾸라지(cyprinid loach, Misgurnus anguillicaudatus)를 경기도의 상업 양어장으로부터 구매하였고, 실험 시작 20일 전 서울대학교 수의학 대학에 순응시켰다. 상기 어류는 일정한 통기와 함께 인위적 식단으로 급이하였고, 하루에 1-3 번 물을 교환하였다.

(2) 박테리아 균주 및 포르말린 사멸된 전세포의 준비

잉엇과 미꾸라지로부터 분리된 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) JUNAH (2009, Korea)를 연구실 내 동결 건조된 상태로 보관하고, 본 실험에 전반적으로 사용하였다. 실험을 위해, 상기 박테리아를 트립신 콩 한천 (TSA, Difco) 배지에 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 에어로모나스 하이드로필라 균주 (JUNAH)를 트립신 콩 (TSB, Difco) 브로스에 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 박테리아를 0.5% 포르말린으로 처리하고 25℃에서 48시간 동안 유지하였다. 포르말린-처리된 배양물을 10분 동안 10,000 x g로 원심분리한 후, 멸균 인산염 버퍼 식염수(PBS)에 두번 세척하고, 멸균 PBS에 재현탁하였다. 상기 현탁액을 분광광도계를 통해 0.6의 O.D 값으로 조정하였다.

실험예 2: PLGA로 캡슐화된 FKC 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조

(1) PLGA 마이크로스피어 캡슐화된 FKC의 제조

PLGA 폴리머와 함께 포르말린 사멸된 전세포가 로드된 마이크로스피어를 Perez C, De Jesus P, Griebenow K. Preservation of lysozyme structure and function upon encapsulation and release from poly(lactic-co-glycolic) acid microspheres prepared by the water-in-oil-in-water method. Int J Pharm 2002;248(1-2):193-206에 개시된 방법을 일부 변형하여 이중유화법, 즉 W/O/W 제형으로 제조하였다. 본 실험에서, 500 ul의 인산염 버퍼 식염수(PBS, pH 7.4)에 용해된 항원 및 210 mg의 PLGA를 3 ml의 디클로로메탄에 용해하였다. 상기 용액을 일차 W/O 에멀전으로 만들기 위해 실온에서 1분 동안 12,000 rpm의 균질기(HG-15D, Daihan, 한국)로 유화시켰다. 상기 에멀전을 이후 50 ml의 4% PVA 용액에 따르고, 1분 동안 6,000 rpm에서 균질화시켰다. 2분 후, 추가적으로 50 mL의 탈이온수를 30분 동안 현탁액에 천천히 첨가하였다. 유기 용제를 증발시키기 위해, 상기 에멀전을 실온에서 추가로 8시간 동안 300 rpm으로 교반하였다. 이후 마이크로스피어를 10분 동안 5000 x g에서 PBS (pH 7.4)로 두번 세척하였다. 수득된 마이크로스피어를 이후 사용하기 위해 48시간 동안 동결건조하였다.

(2) 입자 크기 및 분포 분석

입도 분포에 따른 유체 역학적 직경을 측정하기 위해 레이저 회절법을 사용하였다 (ISO 13320). 실험은 LS13 320 (Beckman Coulter, USA)을 사용하여 수행하였다. 레이저 회절 분석 결과, 제조된 마이크로스피어는 36.83 ± 3.53 um의 평균 직경을 갖는 것으로 나타났다 (도 1).

(3) 전자 현미경(SEM)을 통한 스캐닝

5 kV의 가속 전압에서 작동하는 전자현미경(SEM) [JEOL, JSM-7500F]으로 스캐닝하여, 마이크로스피어의 표면 형태를 관찰하였다. SEM 분석을 통해 마이크로스피어의 형태 및 크기를 관찰한 결과, FKC-로드된 PLGA 마이크로스피어는 부드럽고(smooth) 구형인 특성을 갖는 것으로 확인되었다 (도 2).

실험예 3: 백신 조성물의 면역 효과 실험

(1) 백신 접종 실험

A 그룹은 0.1 ml의 PLGA 백신으로 복강 내 경로(i.p.)를 통해 백신 접종되었고, B 그룹은 0.1 ml의 FKC 백신으로 백신 접종되었다. 0.1 ml 백신의 전체 항원은 2 x 10⁸ CFU로 조절하였다. C 그룹은 0.1 ml의 멸균 PBS로 복강 내 주사되었다. 백신 접종 12주 및 20주 이후, 세 그룹 모두 A. hydrophila 균주로 접종하였고, 접종 투여량은 5.0 x 10⁶ CFU/fish의 치사량 (LD50)이었다. 본 접종 실험은 세 번 반복하였다.

(2) 임상 징후 및 상대적 생존율(RPS)

임상 징후 및 누적 사망은 2주 동안 하루에 두번 관찰하였다. 박테리아의 동정을 위해, 죽은 어류의 내장을 TSA 배지에 스트리크(streaked)하고, 24시간 동안 25℃에서 배양하고, Rapid Aeromonas hydrophila identification by TaqMan PCR assay: comparison with a phenotypic method에 설명된 방법으로 PCR을 통해 식별하였다. 백신의 효율은 하기 일반식에 따라 상대적 생존율(relative percent survival, RPS)로 측정하였다.

RPS = [1 - (백신 접종된 그룹의 사망 누적 수/ 대조군 그룹의 사망 누적 수)] x 100

백신 접종 12주 및 20주 이후, 모든 백신 접종 그룹(A 그룹 및 B 그룹)의 사망률은 대조군 그룹(C 그룹)에 비해 낮았다. 모든 그룹의 사망은 감염 18시간 후 시작되었고, 감염 후 72시간까지 계속되었다. 감염 72 시간 이후, 백신 접종된 어류는 전체 실험 기간 동안 생존하였고 증상을 보이지 않았다.

하기 표 1에 나타난 바와 같이, 평균 RPS 값은 백신 접종 12주 후 A 그룹 및 B 그룹에 대해 각각 62.5 및 18.5였고, 백신 접종 20주 후 A 그룹 및 B 그룹에 대해 각각 46.15 및 7.69였다.

그룹	12 주	20 주
그룹	RPS(%)
PLGA 그룹 (A 그룹)	62.5	46.15
FKC 그룹 (B 그룹)	18.5	7.69

죽은 어류는 A. hydrophila 감염의 전형적인 임상적 징후이다. 죽은 어류 모두로부터 박테리아 균주를 TSA 플레이트 상에 분리하였고, PCR 분석을 통해 확인하였다.

(3) 혈액 샘플링

각 그룹(A, B 및 C)에 다섯 마리 어류를 무작위로 선정하였으며, 응집 반응을 실험하기 위해 미정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플링을 백신 접종 후 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 20주에 반복하였다.

(4) 특이적 면역 반응 실험 - 박테리아 응집(agglutination) 활성

응집 실험은 'U' 형태의 마이크로티터 플레이트에서 수행하였다. 상기 혈청을 PBS 내 순차적으로 두배 희석하였고, 이후 동일한 부피의 상응하는 열 사멸된 A. hydrophila (HKC, 10⁷ cells ml^- ¹)를 각 웰(well)에 첨가하고, 실온에서 밤새 보관하였다. 응집 활성은 응집이 발생하지 않는 곳에서 첫번째 혈청 희석으로 결정하였고, 상기 희석의 역수로 나타내었다.

도 3에 나타난 결과를 볼 때, 백신 접종 전 모든 그룹에서 항체 역가가 검출되지 않았다. 백신 접종된 그룹에서, 항체 역가는 백신 접종 2주 이후 증가하는 것으로 나타났다. 응집 역가는 백신 접종 4주 이후 가장 높았고, 20주까지 서서히 감소하였다. A 그룹은 B 그룹에 비해 보다 완만한 곡선을 보였다. 상기 역가는 백신 접종 8주까지 두 백신 접종된 그룹에서 매우 유사하게 나타났으나, 실험의 초반 및 후반 사이에 현저한 차이가 있었다. 대조군 그룹(C 그룹)의 항체 역가는 전체 실험 동안 0 값으로 유지되었다.

(5) 통계 분석

모든 데이터는 SPSS 버전 19.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 분석하였다. 혈청 응집 데이터는 Student's t-test를 통해 분석하였고, 현저한 차이의 수준(p < 0.05)에서 다양한 면역 파라미터에 변화를 비교하기 위해 One-way 변량 분석 (ANOVA) 후 던컨의 다중 범위 테스트(Duncan's multiple range tests)를 수행하였다. 분석된 파라미터의 평균 표준 오차(±S.E)는 어류의 각 그룹에 대해 계산하였다.

Claims

PLGA로 캡슐화된 불활성화 세균을 유효성분으로 포함하며,
상기 PLGA로 캡슐화된 불활성화 세균의 입자 크기는 5 내지 50 ㎛인 어류용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 불활성화 세균은 포르말린 사균(formalin-killed cell-cultured)인 것을 특징으로 하는 어류용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 양식 어류용 백신인 것을 특징으로 하는 어류용 백신 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 W/O/W 제형인 것을 특징으로 하는 어류용 백신 조성물.
제2항에 있어서, 상기 불활성화 세균은 어류의 세균성 질병의 병원체인 것을 특징으로 하는 어류용 백신 조성물.
(s1) 불활성화 세균 및 PLGA를 혼합하는 단계; 및
(s2) 상기 혼합물을 W/O/W 이중 유형 에멀전으로 제조하는 단계를 포함하며,
PLGA로 캡슐화된 불활성화 세균을 유효성분으로 포함하며, 상기 PLGA로 캡슐화된 불활성화 세균의 입자 크기는 5 내지 50 ㎛인 어류용 백신 조성물의 제조 방법.
제1항의 어류용 백신 조성물을 어류에 처리하여 어류의 세균성 질병을 예방 또는 치료하는 방법.