UA117799C2 - Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6) - Google Patents

Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6) Download PDF

Info

Publication number
UA117799C2
UA117799C2 UAA201207057A UAA201207057A UA117799C2 UA 117799 C2 UA117799 C2 UA 117799C2 UA A201207057 A UAA201207057 A UA A201207057A UA A201207057 A UAA201207057 A UA A201207057A UA 117799 C2 UA117799 C2 UA 117799C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
cancer
cell
antibody
omb
cells
Prior art date
Application number
UAA201207057A
Other languages
English (en)
Inventor
Угур Сахін
Езлем Тюречі
Міхаель Козловскі
Корден ВАЛЬТЕР
Штефан Вйоль
Марія Кройцберґ
Бернд ХУБНЕР
Міхаель Ердельян
Original Assignee
Ґанімед Фармасьютікалз Аґ
Йоханнес Ґутенберґ - Університет Майнц
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP09014136A external-priority patent/EP2322555A1/en
Application filed by Ґанімед Фармасьютікалз Аґ, Йоханнес Ґутенберґ - Університет Майнц filed Critical Ґанімед Фармасьютікалз Аґ
Publication of UA117799C2 publication Critical patent/UA117799C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Abstract

Винахід стосується моноклонального антитіла, яке специфічно зв’язується з CLDN6, і де антитіло не зв'язується з CLDN9, з'єднаним з поверхнею клітини, яка експресує CLDN9, гібридоми, що продукує вказане антитіло, кон’югата, що його містить, фармацевтичної композиції, способу інгібування росту клітини, яка експресує CLDN6, способу знищення клітини, що експресує CLDN6, способу лікування або запобігання хворобі або порушенню у суб’єкта, при яких задіяна клітина, яка експресує CLDN6, та способу інгібування метастатичного порушення клітини, що експресує CLDN6.

Description

Протягом останнього десятиліття в клінічну практику для лікування раку успішно упроваджені антитіла, які є найбільш перспективними терапевтичними засобами в онкології.
Лікування раку, яке грунтується на використанні антитіл має вищу специфічність і дає менше побічних ефектів в порівнянні з традиційними лікарськими засобами. Причина полягає в тому, що антитіла точно відрізняють нормальні від неопластичних клітин, а також в тому, що спосіб їх впливу грунтується на менш токсичних імунологічних протипухлинних механізмах дії, таких як активація комплементу і рекрутування цитотоксичних імунних клітин.
Клаудини є інтегральними мембранними білками, розташованими в місцях щільного контакту епітелію і ендотелію. Відомо, що клаудини мають чотири трансмембранних сегменти з двома позаклітинними петлями, при цьому М і С-кінці розташовуються в цитоплазмі. Родина трансмембранних білків клаудинів (СОМ) грає вирішальну роль в збереженні епітеліальних і ендотеліальних щільних контактів, а також в підтримці цитоскелету і в сигнальній системі клітини. Різниця в експресії цих білків пухлинними і нормальними клітинами, на додачу до їх мембранної локалізації, робить їх привабливою метою для імунотерапії раку, а застосування при лікуванні раку терапевтичних засобів на основі антитіл для націлювання на СІ ОМ обіцяє високий рівень терапевтичної специфічності.
Проте клінічне застосування терапевтичних засобів, націлених на СІОМ, стикається з деякими перешкодами. При повсюдній експресії СІ ОМ в організмі і вирішальній ролі СОМ в збереженні щільних контактів, для того, щоб збільшити до межі специфічність лікування і звести до мінімуму загальну токсичність, потрібна специфічність мішені для терапевтичних засобів, націлених на СІ ОМ.
УМО 2009/087978 має відношення до анти-СГОМб антитіл та їх застосування як протипухлинних засобів. Зокрема, описуються моноклональні антитіла, позначені АВЗ-1, АЕ1- 16, АЕ49-11 і АЕ3-20. Проте жодне з цих антитіл не було специфічним до СІ ОМб, як показано за допомогою ЕРАСсС5-аналізу в прикладі 5. Антитіло АЕЗ3-20 вступало в реакцію з СІ ОМ, тоді як антитіла АЕ1-16 ії АЕ49-11 показували значну здатність вступати в реакцію з СГОМО ї також вступали в реакцію з СІ ОМА. Зв'язок антитіла АВЗ3-1 з СІ ОМб був таким же сильним, як його зв'язок з СГОМОУ. У Прикладі 7 описано, що при введенні антитіл АЕ49-11 на мишачій моделі пухлини спостерігається тенденція до інгібування зростання пухлини і збільшення тривалості
Зо життя. Проте зважаючи на неспецифічність використаного антитіла, залишається неясним, чи є описані ефекти результатом зв'язування антитіла з СІ ОМб.
Таким чином, до цих пір не описане СІ ЮОМб-специфічне антитіло, яке селективно зв'язується з поверхнею клітин, які експресують СІ ОМб. Проте, таке специфічне антитіло було б необхідне для терапевтичних підходів на основі антитіл, які використовують СІ ОМб як мішень.
Вирівнювання послідовностей СІ ОМ3, СІ ОМ4, СІ ОМ і СІ ОМО, показане на Фіг. 1, ілюструє, що існує високий ступінь консервативності СГ ОМбЄ у відношенні до інших білків клаудинів. Ця висока гомологія СІ ОМ з іншими білками клаудинами, зокрема СІ ОМ і СІ ОМА, і той факт, що
МО 2009/087978 виявився не в змозі забезпечити СІ ЮОМб-специфічні антитіла, показують, що може бути неможливим отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з СІ ОМб.
Розкриття винаходу
Експериментальні результати, розкриті в описі, підтверджують, що СІ ОМб експресується в різних ракових клітинах людини, тоді як експресія в нормальних тканинах обмежується плацентою.
Крім того, даний винахід вперше описує успішне отримання СІ ОМб-специфічних антитіл, здатних зв'язуватися з поверхнею інтактних клітин, які експресують СІ ОМб6. РАСзЗ-аналіз інтактних клітин, які експресують СІ ОМб, показав специфічне зв'язування анти-СІ ОМб антитіл, тоді, як з клітинами, які експресують інші білки-клаудини, зокрема, С ОМ3, СІ ОМА і СІ ОМ, або з клітинами, які не експресують будь-які з цих СІ ОМ-білків, зв'язок не спостерігався. Таким чином, даний винахід несподівано показує, що може бути отримане антитіло, яке здійснює специфічну взаємодію антиген-антитіло з СІ ОМб на поверхні клітин, які експресують СГ ОМб, але яке практично не демонструє взаємодії антиген-антитіло з іншими високогомологічними клаудинами.
Загалом, даний винахід пропонує антитіла, придатні як терапевтичні засоби, для лікування іабо запобігання хворобам, які мають відношення до клітин, які експресують СІ ОМБб, і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, включаючи пухлинні захворювання, зокрема рак, наприклад, рак яєчника, зокрема аденокарциному яєчника і тератокарциному яєчника, рак легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІС) і недрібноклітинний рак легень(МЗСІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, рак шлунку, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема бо базальноклітинну карциному і плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови і шиї,
зокрема злоякісну плеоморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому і карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідно-клітинну карциному і папілярний рак, рак нирки, зокрема нирковоклітинний рак, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, рак товстої кишки, рак тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка і ембріональний рак яєчка, рак матки, герміному, таку як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально- клітинну пухлину яєчка, та їх метастатичні форми.
У одному аспекті винахід має відношення до антитіла, здатного зв'язуватися з СІ ОМб, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМб6. Бажано антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМО, пов'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СГОМО. Бажано антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМ4, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує
СІГОМ4, і/або практично нездатне зв'язуватися з С ОМ3З, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує СІГОМ3. Найкраще, антитіло практично нездатне зв'язуватися з СІ ОМ-білком, відмінним від СІ ОМб, зв'язаним з поверхнею клітини, яка експресує вказаний СІ ОМ-білок, і є специфічним для СІ ОМб. Бажано вказана клітина, яка експресує вказаний СІ ОМ-білок, є інтактною клітиною, зокрема непермеабілізованою клітиною (клітиною з непорушеною проникністю мембрани), і вказаний СІ ОМ-білок, зв'язаний з поверхнею клітини, має нативну, тобто неденатуровану конформацію. Краще антитіло здатне зв'язуватися з одним або більш епітопами СІ ОМб, в їх нативній конформації.
У одному варіанті здійснення антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, розташованим на позаклітинній ділянці С ОМб, причому вказана позаклітинна ділянка СОМб бажано містить будь-яку амінокислотну послідовність з числа 5ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 14 і ЗЕО
ІЮО МО: 15, бажано амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: б або 5ЕБЕО ІЮО МО: 7, краще амінокислотну послідовність 5Е0О ІЮО МО: 6. Краще антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, розташованим в межах будь-якої амінокислотної послідовності з числа 5ЕО ІЮ МО: 6, ЗЕО ІО
МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 14 і 5ЕО ІО МО: 15, бажано амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6 або
ЗЕО ПО МО: 7.
У одному варіанті здійснення антитіло здатне зв'язуватися з СІ ОМб шляхом взаємодії, щонайменше, з однією, бажано більше ніж однією, наприклад, 2, 3, 4 або 5, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Тпг33, Рпез35, сСіІуЗ37, Зег39, Пе40 і
Ї ен151, бажано шляхом взаємодії, щонайменше, з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Тпг33, Рпез35, СіуЗ37, Зег39 і Пе40, краще шляхом взаємодії, щонайменше, з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Рпе35, сіу37, бБег39 і Пе40, або яка складається з Тпг33, Рпез5, СІуЗ37 і 5ег39, і зокрема, шляхом взаємодії, щонайменше, з однією, бажано більше ніж однією, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Рпез35, сСіІу37 і бег39. Краще антитіло не взаємодіє з однією або більше, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з СішіІ54, АПаІ55, АгоІ58 і СІу161, і бажано не взаємодіє з однією або більше, бажано зі всіма амінокислотами, вибраними з групи, яка складається з Агоі/58 і СІу161.
Взаємодія між антитілом і СІ ОМб, зокрема в його нативній конформації, може бути дослідженою за допомогою скануючого аланіном мутагенезу амінокислот. Мутанти СІ ОМб можна визначити за їх здатністю зв'язуватися із специфічними моноклональними антитілами.
Зменшене зв'язування специфічного моноклонального антитіла з СІ ОМб-мутантом означає, що амінокислота, яка зазнала мутації (видозмінена), є важливим зв'язуючим залишком. Зв'язок можна проаналізувати, наприклад, за допомогою проточної цитометрії.
У одному варіанті здійснення антитіло отримують способом, який передбачає стадію імунізації тварини пептидом, який має будь-яку амінокислотну послідовність з поміж 5ЕО ІЮ МО: б, 5ЕО ІО МО: 7, ЗЕО ІЮ МО: 14 ії 5ЕО ІЮО МО: 15, бажано амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 6 або 5ЕО І МО: 7, або імунологічно еквівалентним пептидом або нуклеїновою кислотою або клітиною-господарем, яка експресує вказаний пептид.
У різних варіантах здійснення СІОМб, з яким антитіло здатне зв'язуватися, має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2 або амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 8.
Особливо бажано, щоб антитіло було здатне зв'язуватися з С ОМб, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2, і здатне зв'язуватися з СІОМб, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, 60 який містить, щонайменше, одну, бажано дві, краще всі три СОВ-послідовності важкого ланцюга антитіла, вибрані з поміж ЗЕО ІЮ МО: 34, 36, 38 і 40 або їх варіанту. У вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла, приведених на Фіг. 25, СОВ-послідовності помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Хааї сСіу Хаа2 Ммаї ХааЗз, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Рпе або Туг, найкраще Туг, Хаа?2 є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Ре або Туг, найкраще Тутг, і ХааЗ є будь-якою амінокислотою, бажано ей або Ре, краще Гей. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність
Ар Хааї Су Хаа2 Маї Хааз або Хааї Сіу Хаа? маї Хааз Азр, де Хааї, Хаа? і Хааз є, як описано вище. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Ар Хааї СіІу Хаа2 Маї Хааз Азр, де Хааї, Хаа2 і Хааз є таким, як описано вище. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Аа Агуд Ар Хааї Су Хаа2 Маї Хааз Азр Туг, де Хааї, Хааг2 і Хааз є таким, як описано вище.
У одному варіанті здійснення антитіло згідно вищенаведеним варіантам здійснення містить важкий ланцюг антитіла, який включає послідовність СОНІ відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 47 або її варіантів або СОВ2 послідовність відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 48 або її варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, який включає послідовність важкого ланцюга, вибрану з поміж ЗЕО ІЮО МО: 34, 36, 38 і 40 або їх варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить легкий ланцюг, який містить, щонайменше, одну, бажано дві, краще всі три СОВ-послідовності легкого ланцюга антитіла, вибрані з поміж 5ЕО ІЮ МО: 35, 37, 39 їі 41 або їх варіантів. У вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла, приведені на Фіг. 26 СОВ-послідовності, помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить легкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Агу Хааї Хаа2 Хааз Рго, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Азп, найкраще 5ег, Хаа2 є будь-якою амінокислотою, бажано Туг, 5ег, Пе, Авп
Ко) або Тпг, краще Туг, бег, або Азвп, найкраще Авп, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Туг, краще Туг. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить легкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Сіп Агу Хааї Хаа2 Хааз Рго Рго, де Хааї, Хаа?2 і ХааЗз є таким, як визначено вище. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить легкий ланцюг, який включає СОВЗ послідовність Сіп Сіп Агуд Хааї Хаа2 Хааз
Рго Рго Тгр ТНг, де Хааї, Хаа?г2 і Хааз є такими, як визначено вище. У одному варіанті здійснення антитіло, яке відповідає вищенаведеним варіантам здійснення містить легкий ланцюг антитіла, який включає послідовність СОНІ відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 52 або її варіант і/або СОВ2 послідовність відповідно до ЗЕО ІЮО МО: 53 або її варіант.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить легкий ланцюг, який містить послідовність легкого ланцюга, вибрану з поміж 5ЕО ІЮО МО: 35, 37, 39 і 41 або їх варіантів.
У різних варіантах здійснення антитіло запропоноване винаходом містить важкий ланцюг, як обговорювалося вище, і легкий ланцюг, який також обговорювався вище.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить, щонайменше, одну, бажано дві, краще всі три СОВ- послідовності послідовності важкого ланцюга антитіла 5ЗЕО ІО МО: х, або їх варіант, і (її) легкий ланцюг антитіла, який містить, щонайменше, одну, бажано дві, краще всі три СОВ- послідовності послідовності легкого ланцюга антитіла ЗЕО ІЮ МО: х1, або їх варіант; де х вибирають з поміж 34, 36, 38 і 40.
СОВ-послідовності у вищезазначених послідовностях важкого ланцюга антитіла і послідовностях легкого ланцюга антитіла, приведених на фіг. 25 і Фіг. 26, відповідно, помічені прямокутником.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить СОВЗ послідовність, вибрану з групи, яка складається з Хааї СІу Хаа2 Маї ХааЗз, Азр Хааї Су Хаа2 Ммаї Хааз, Хааї Су Хаа2 Маї Хааз Азр,
Ар Хааї Сіу Хааг МУаї Хааз Ар і АІа Агд Азр Хааї СІу Хаа2 Маї Хааз Азр Туг, де Хааї є будь- якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Рпе або Туг, найкраще Туг,
Хаа2 є будь-якою амінокислотою, бажано ароматичною амінокислотою, краще Рпе або Туг, найкраще Туг, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано І еи або Ріє, краще Г ен, і бо (і) легкий ланцюг антитіла, який містить СОВЗ послідовність, вибрану з групи, яка складається з Агд Хааї Хаа2 Хааз Рго, СіІп Агд Хааї Хаа2 Хааз Рго Рго, СіІп біп Агд Хааї Хаа?2
Хааз Рго Рго Тгр ТНг, де Хааї є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Азп, найкраще 5Зег,
Хаа2г є будь-якою амінокислотою, бажано Туг, Зег, Не, Азп або Тпг, краще Туг, Зег або Авп, найкраще Авп, і Хааз є будь-якою амінокислотою, бажано 5ег або Туг, краще Туг.
У одному варіанті здійснення антитіло згідно вищенаведеним варіантам здійснення містить () важкий ланцюг, який включає послідовність СОНІ відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 47 або її варіантів і/або послідовність СОВ2 відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 48 або її варіантів і/або (ії) легкий ланцюг, який включає послідовність СОНІ відповідно до ЗЕО ІЮ МО: 52 або її варіантів і/або
СОВ2 послідовність відповідно до 5ЕО ІО МО: 53 або її варіантів.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом містить: () важкий ланцюг антитіла, який містить послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: х або її варіант, і (ії) легкий ланцюг антитіла, який містить послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІЮО 5 МО: ха1 або її варіант; де х вибирають з поміж 34, 36, 38 і 40.
У кращих варіантах здійснення антитіло проявляє одне або більше із наступних дій: (і) знищення клітин, які експресують СІ ОМб, (ії) інгібування проліферації клітин, які експресують
СОМ, (іїї) інгібування колонієутворення клітин, які експресують СГ ОМб, (ім) опосередковані ремісії, тобто зменшення розміру, бажано повні ремісії, тобто повне зникнення розвинутих пухлин, (м) запобігання утворенню або повторному утворенню пухлин і (мі) інгібування метастазування клітин, які експресують СІ ОМб. Відповідно, антитіло може використовуватися для отримання одного або більше з поміж перерахованого вище, зокрема, при введенні пацієнтові. Таке знищення клітин і/або інгібування однієї або більше за функцій клітин може використовуватися з терапевтичною метою, як описано тут. Зокрема, знищення клітин, інгібування проліферації клітин і/або інгібування колонієутворення клітин може використовуватися для лікування або запобігання захворюванню на рак, включаючи метастази раку. Інгібування проліферації, колонієутворення і/або метастазування клітин може використовуватися, зокрема, для лікування або запобігання метастазам раку і метастатичного поширення ракових клітин. Краще антитіло запропоноване винаходом опосередковує знищення клітин, викликаючи лізис, опосередкований комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), лізис, опосередкований антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АОСС), апоптоз, гомотипічну адгезію і/або фагоцитоз, бажано, викликаючи СОС-опосередкований лізис і/або АОСС- опосередкований лізис. Проте даний винахід також включає варіанти здійснення, в яких антитіло діє описаним тут чином, знищуючи клітини і/або інгібуючи одну або більше функцій клітин, наприклад, клітинну проліферацію і/або колонієутворення, без індукції лізису, опосередкованого комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), лізису, опосередкованого антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АЮСС), апоптоз, гомотпічну адгезію і/або фагоцитоз. Наприклад, антитіло запропоноване винаходом також може діяти просто шляхом зв'язування з СІ ОМб на клітинній поверхні, таким чином, наприклад, зупиняючи проліферацію клітин. У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом не викликає СОС- опосередкований лізис клітин.
Бажано АОСсС-опосередкований лізис клітин відбувається у присутності ефекторних клітин, які в окремих варіантах здійснення вибирають з групи, яка складається з моноцитів, мононуклеарних клітин, МК-клітин і РММ (поліморфоядерних нейтрофілів), а фагоцитоз здійснюється макрофагами.
Активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням проліферації клітин, які експресують
СІГОМб, бажано ракових клітин, можна визначити іп міго шляхом визначення проліферації клітин, які експресують СІОМб за допомогою методу, який передбачає використання бромдезоксиуридіну (5-бром-2-дезоксиуридін, ВКОШ). ВКОИШ є синтетичним нуклеозидом, який є аналогом тимідину, який може включатися в новосинтезовану ДНК клітин, які відтворюються шляхом клітинного ділення (під час 5-фази клітинного циклу), заміщаючи тимідин під час реплікації ДНК. Виявлення включеної хімічної речовини, наприклад, за допомогою антитіл, специфічних до ВЕБ, вкаже на клітини, в яких відбувається активне відтворення своєї ДНК.
Активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням колонієутворення клітин, які експресують СІ ОМб, бажано ракових клітин, можна визначити іп мійго за допомогою дослідження колонієутворення. Оцінка здатності утворювати колонії є мікробіологічною методикою для вивчення ефективності дії окремих речовин на виживання і проліферацію клітин.
Ця методика часто використовується в лабораторіях, які вивчають рак, для визначення дії лікарських препаратів або опромінювання на проліферуючі пухлинні клітини. Експеримент бо включає три основні етапи: (ї) обробку зразка клітин, зокрема ракових клітин, (ії) висівання клітин в посудину для культивування та (ії) етап росту клітин. Отримані колонії фіксують, фарбують і підраховують. Утворення колоній має велике значення при утворенні метастазів, якщо окремі клітини пухлин проникають в органи. Інгібуюча активність антитіл показує їх здатність пригнічувати утворення метастазів. Антитіла, що продемонстрували активність, пов'язану з інгібуванням або зменшенням колонієутворення, при дослідженні методом колонієутворення, є зокрема придатними для лікування або запобігання метастазам і метастатичному поширенню ракових клітин, зокрема, згаданих в описі видів раку.
У кращих варіантах здійснення антитіло проявляє одну або більше імунних ефекторних функцій відносно клітин, які несуть СОМ, в нативній конформації, при цьому одну або більше імунних ефекторних функцій бажано вибирають з групи, яка складається з комплементзалежної цитотоксичності (СОС), антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОС), індукції апоптозу та інгібування проліферації, бажано ефекторними функціями є АОСС і/або СОС.
Бажано вказана одна або більше активностей або одна або більше імунних ефекторних функцій, які проявляються вказаним антитілом, викликаються зв'язком вказаного антитіла з
СІГОМб, бажано з епітопом, розташованим на позаклітинній ділянці СГОМбЄ, причому вказана позаклітинна ділянка СІ ОМб бажано містить будь-яку амінокислотну послідовність з числа ЗЕО
ІО МО: 6, 5ЗЕО ІЮО МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 14 і 5ЕО ІО МО:15, бажано амінокислотну послідовність
ЗЕО Ір: 6 або 5ЕО ІО МО: 7, краще амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6.
Згідно винаходу клітина, яка експресує СІ ОМб, бажано характеризується зв'язком СІ ОМб з клітинною поверхнею. Клітина, яка експресує СІ ОМб, або клітина, яка несе СГ ОМб, в нативній конформації, бажано є пухлинною клітиною, такою як ракова клітина, бажано клітиною злоякісної пухлини, вибраної з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легень, включаючи дрібноклітинний рак легень (5СІ С) і недрібноклітинний рак легень (МЗС С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциноми, раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирок, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи
Зо світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциноми тонкої кишки і аденокарциноми клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
Антитіло запропоноване винаходом може бути об'єднане з одним або більше терапевтичним ефекторним фрагментом (частинкою, молекулою), наприклад, радіоактивною міткою, цитотоксином, терапевтичним ферментом, агентом, який викликає апоптоз тощо, для того, щоб забезпечити прицільну цитотоксичність, тобто знищення пухлинних клітин.
У одному варіанті здійснення антитіло запропоноване винаходом (ії) зв'язується з клітинами, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і (ії) не зв'язується з клітинами, які не експресують СІ ОМб і які не характеризуються зв'язуванням
СІГОМб з клітинною поверхнею. Антитіло запропоноване винаходом бажано (ї) опосередковує знищення і/або інгібує проліферацію клітин, які експресують СГОМ6б і які характеризуються з'єднуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і (ії) не опосередковує знищення і/або не інгібує проліферацію клітин, які не експресують СІ ОМб і які не характеризуються з'єднуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею.
У окремих кращих варіантах здійснення антитіло запропоноване винаходом зв'язується з нативними епітопами СІ ОМб, присутніми на поверхні живих клітин, такими як ЗЕО ІЮ МО: 6 або 7. У додаткових кращих варіантах здійснення антитіло запропоноване винаходом є специфічним відносно ракових клітин, які експресують СІ ОМб і не зв'язується з раковими клітинами, які не експресують СІ ОМб.
Антитіла запропоновані винаходом можна отримати від різних видів тварин, включаючи, але не обмежуючись названими, мишей, щурів, кроликів, морських свинок і людину. Антитіла запропоновані винаходом також включають химерні молекули, в яких константна область антитіла, отримана від одного виду, бажано людини, об'єднана з ділянкою зв'язування антигену, отриманою від іншого виду. Більш того, антитіла запропоновані винаходом включають гуманізовані молекули, в яких антигензв'язуючі ділянки, отримані від виду, який не є людиною, об'єднуються з константними і каркасними ділянками людського походження. 60 Антитіла запропоновані винаходом включають поліклональні і моноклональні антитіла і включають антитіла до Ідс2а (наприклад, Ідсга, к, Л), 9526 (наприклад, Ідс2б, к, Х), (93 (наприклад, Іде, к, АХ) і ІМ. Проте, також розглядаються інші ізотипи Антитіл запропонованих даним винаходом, включаючи Ідсі, ІдАїЇ, ІдДА2, секреторні ІДА, ДО і ІДЕ антитіла. Антитіла можуть бути цілими антитілами або їх антигензв'язуючими фрагментами, включаючи, наприклад, Раб, Е(аб)2, Ем, одноланцюгові фрагменти або біспецифічні антитіла Ем. Крім того, антигензв'язуючі фрагменти включають домен зв'язування імуноглобулінових гібридних білків, який містить (ї) поліпептид-зв'язуючий домен (такий як варіабельна область важкого ланцюга або варіабельна область легкого ланцюга), який з'єднується з імуноглобуліновою шарнірною ділянкою поліпептиду, (ії) константну область СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну, сполучену з шарнірною ділянкою і (ії) константну область СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну, сполучену з
СН? константною областю. Такі домени зв'язування імуноглобулінових гібридних білків додатково розкриваються в 05 2003/0118592 ї 05 2003/0133939.
Антитіло запропоноване винаходом бажано є моноклональним, химерним людським або гуманізованим антитілом або фрагментом антитіла. Антитіла запропоновані винаходом включають повністю людські антитіла. Такі антитіла можуть бути отримані в трансгенній тварині, яка не є людиною, наприклад, в трансгенній миші, здатній продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ЮОМб за допомогою проведення МУ-0О-) рекомбінації і перемикання ізотипу. Така трансгенна тварина також може бути трансгенним кроликом для отримання поліклональних антитіл, наприклад, розкритих в 5 2003/0017534.
Бажано антитіла запропоновані даним винаходом відділяються від СІ ОМб з рівноважною константою дисоціації (Ко) приблизно 1-1400 нМ або менше. Бажано антитіла запропоновані винаходом не реагують перехресно із спорідненими антигенами клітинної поверхні і таким чином не інгібують їх функцію.
У кращих варіантах здійснення антитіла запропоновані даним винаходом можуть характеризуватися однією або більше із наступних властивостей: а) специфічністю до СІ ОМб;
Б) спорідненістю зв'язування з СІ ОМб близько 100 нМ або менше, бажано близько 5-10 нм або менше і краще близько 1-3 нМ або менше с) здатністю викликати СОС клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються
Зо зв'язуванням СІ ОМ6б з клітинною поверхнею; а) здатністю інгібувати ріст клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею; е) здатністю викликати апоптоз клітин, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею;
Ї) здатністю викликати гомотипічну адгезію клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею; 9) здатністю викликати АЮСС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею у присутності ефекторних клітин;
Р) здатністю збільшувати виживання суб'єкта, який має пухлинні клітини, які експресують
СГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею; ї) здатністю знищувати клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням
СГОМб з клітинною поверхнею; )) здатністю агрегувати СІ ОМ на поверхні живих клітин.
Краще антитіло, описане тут, є антитілом, продукованим клітиною гібридомою або отриманим від клітини гібридоми, депонованої в 05М2 (ІппойПепвіг. 7В, 38124 Вгайп5спмеїд,
Німеччина) і має одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1. Т512тиМмАВ 59А, реєстраційний номер О5М АССЗ3067, депонована 21 червня 2010; 2. 5Т512тиМмАВ 60ОА, реєстраційний номер О5М АССЗ3068, депонована 21 червня 2010; 3. Т512тимАВ 610, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3069, депонована 21 червня 2010; 4. аТ512тиМАВ 64А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3070, депонована 21 червня 2010; 5. СТ512тимАВ 65А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3071, депонована 21 червня 2010; 6. 5Т512тиМмАВ 668, реєстраційний номер О5М АССЗ3072, депонована 21 червня 2010; 7. СТ512тимАВ 67А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3073, депонована 21 червня 2010; 8. ЗТ512тиМАВ 55А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3089, депонована 31 серпня 2010; або 9. 5Т512тиМмАВ 85А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3090, депонована 31 серпня 2010.
Антитіла запропоновані винаходом позначаються в описі шляхом посилання на позначення антитіла і/або шляхом посилання на клон, який продукує антитіло, наприклад, тимАВ 59А.
Крім того, більш бажаними антитілами є антитіла, які мають специфічність антитіл, продукованих гібридомою або отриманих від описаної вище гібридоми, і зокрема, антитіла, які бо містять антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючий центр, зокрема варіабельну ділянку,
ідентичну або високогомологічну до ділянки антитіла, продукованого або отриманого від вищеописаної гібридоми. Передбачається, що кращими антитілами є антитіла, які мають СОВ ділянки або ідентичні або високогомологічні до ділянок антитіл, продукованих або отриманих від описаної вище гібридоми. Під "високогомологічним" слід розуміти, що можуть бути зроблені від 1 до 5, бажано від 1 до 4, наприклад від 1 до 3, або 1 або 2 замін в кожній СОК ділянці.
Особливо бажаними є химерні і гуманізовані форми антитіл, продуковані гібридомою або отримані від неї.
Таким чином, антитіло запропоноване винаходом можна вибрати з групи, яка складається з (ї) антитіла, продукованого або отриманого від клону, депонованого під реєстраційним номером
О5М АССЗО67 (СТ512тиМАВ 59А), ОМ АССЗ068 (сТ512тиМАВ б6ОА), ОМ АССЗО69 (йТ512тимМмАВ 610), ОМ АССЗ3070 (БТ512тимМАВ 64А), О5М АССЗ071 (сТ512тиМмАВ 65А),
О5М АССЗО72 (СТ512тимМАВ 668), О5М АССЗ3073 (сТ512тиМАВ 67А), О5М АССЗО089 (СТ512тимМАВ 55А) або ОБМ АССЗ3090 (5Т512тиМАВ 89 А), (ії) антитіла, яке є химерною або гуманізованою формою антитіла згідно (і), (ії) антитіла, яке має специфічність антитіла згідно (Її), і (ім) антитіла, яке містить антигензв'язуючу ділянку або антигензв'язуючий центр антитіла згідно (). Антигензв'язуюча ділянка або антигензв'язуючий центр антитіла згідно () може містити варіабельну ділянку антитіла згідно (Її).
Даний винахід також має відношення до клітини, такої як клітина гібридоми, яка продукує антитіло, як описано тут.
Кращими клітинами гібридоми є ті, що депоновані в 0О5М2 (ІппойПепвіг 7В, 38124
Вгашпоспугеїд, Німеччина) і мають одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1. 2Т512тиМмАВ 59А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3067, депонована 21 червня 2010; 2. 5Т512тиМмАВ 60ОА, реєстраційний номер О5М АССЗ3068, депонована 21 червня 2010; 3. Т512тимАВ 610, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3069, депонована 21 червня 2010; 4. Т512тиМАВ 64А, реєстраційний номер О5БМ АССЗ3070, депонована 21 червня 2010; 5. СТ512тимАВ 65А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3071, депонована 21 червня 2010; 6. 5Т512тиМмАВ 668, реєстраційний номер О5М АССЗ3072, депонована 21 червня 2010; 7. СТ512тимАВ 67А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3073, депонована 21 червня 2010; 8. ЗТ512тиМАВ 55А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3089, депонована 31 серпня 2010; або
Зо 9. 5Т512тиМмАВ 85А, реєстраційний номер ОБМ АССЗ3090, депонована 31 серпня 2010.
Анти-СГОМб антитіла запропоновані даним винаходом можуть утворювати похідні, зв'язуватися або спільно експресуватися з іншими специфічностями зв'язування. У окремому варіанті здійснення винахід пропонує біспецифічну або мультиспецифічну молекулу, яка містить, щонайменше, першу специфічність зв'язування для СІ ОМб (наприклад, анти-СІ ОМб- антитіло або його міметик) і другу специфічність зв'язування для ефекторної клітини, наприклад, специфічність зв'язування для рецептора Ес (наприклад, Ес-гамма-рецептора, такого як Ес-гамма-КІ, або будь-якого іншого Ес-рецептора) або Т-клітинного рецептора, наприклад, СОЗ.
Відповідно, даний винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, які зв'язуються і з СІОМб і з ЕРсо-рецептором або Т-клітинним рецептором, наприклад, СОЗ3.
Прикладами Ес-рецепторів є рецептор дос, Ро-гамма рецептор (Есук), такий як ЕсуКІ (СОб64),
ЕсСУКІІ (СО32) ії ЕсуАфПП (2016). Інші Ес-рецептори, такі як рецептори ІдДА (наприклад, ЕсСакКІ), також можуть бути метою. Рецептор Ес бажано розташовується на поверхні ефекторної клітини, наприклад, моноцита, макрофага або активованої мононуклеарної клітини. У кращому варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули зв'язуються з Ес-рецептором на ділянці, відмінній від імуноглобулінової Ес (наприклад, дО або ІдА) ділянки зв'язування рецептора.
Отже, зв'язування біспецифічних і мультиспецифічних молекул не блокується фізіологічними рівнями імуноглобулінів.
У іншому аспекті анти-СІ ОМ антитіла запропоновані винаходом є похідними, пов'язаними з або спільно експресованими з іншими функціональними молекулами, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, Барі фрагментом). Наприклад, антитіло запропоноване винаходом може бути функціонально пов'язаним (наприклад, за допомогою хімічної зв'язку, генетичного злиття, нековалетного зв'язку або іншого способу) з однією або більше іншими молекулярними частинками, наприклад, іншим антитілом (наприклад, для отримання біспецифічного або мультиспецифічного антитіла), цитотоксином, клітинним лігандом або антигеном (наприклад, щоб отримати імунокон'югат, такий як імунотоксин). Антитіло запропоноване даним винаходом може бути зв'язане з іншими терапевтичними частинками, наприклад, радіоїзотопом, невеликою молекулою протипухлинного лікарського засобу, рекомбінантним цитокіном або хемокіном. Відповідно, даний винахід включає цілий ряд бо кон'югатів антитіл, біспецифічні і мультиспецифічні молекули і гібридні білки, які зв'язуються з клітинами, які експресують СІ ОМ, і/або з клітинами, які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і які можна використовувати для націлювання інших молекул на ці клітини.
В цілому, для цілей даного винаходу всі похідні антитіл, такі як кон'югати антитіл, біспецифічні і мультиспецифічні молекули і гібридні білки, описані тут, охоплюються терміном "антитіло".
У додатковому аспекті винахід також передбачає СІ ОМб-зв'язуючі білки, отримані з доменів, які не є імуноглобуліновими, зокрема одноланцюгові білки. Такі зв'язуючі білки і способи їх отримання описані, наприклад, в роботі Віп; еї аї. (2005) Маїшге Віоїесппоіоду 23 (10): 1257- 1268, включеній до опису як посилання. Слід розуміти, що приведена в описі ідея відносно імуноглобуліну або похідних від імуноглобуліну зв'язуючих молекул, відповідно також може бути застосована до зв'язуючих молекул, отриманих з неімуноглобулінових доменів. Зокрема, використовуючи такі зв'язуючі молекули, отримані з неімуноглобулінових доменів, можливо блокувати СІ ОМ клітин, які експресують вказану мішень і які характеризуються зв'язуванням вказаної мішені з клітинною поверхнею, і таким чином, як розкрито в описі відносно антитіл запропонованих даним винаходом, здійснити терапевтичні ефекти, зокрема інгібування однієї або більше функцій клітин пухлин, розкритих в описі, наприклад, інгібування проліферації. Хоча не обов'язково, але можливо, таким неімуноглобуліновим зв'язуючим молекулам надати ефекторних функцій антитіл, наприклад, шляхом злиття з Ес ділянкою антитіл.
Даний винахід в цілому включає лікування і/або діагностування хвороб, зокрема пухлинних захворювань, шляхом "націлювання" на СІГОМб, експресований клітинами і сполучений з поверхнею клітин. Ці способи забезпечують селективне виявлення і/або знищення таких клітин, тим самим зводячи до мінімуму шкідливі дії на нормальні клітини, які не експресують СІ ОМб і які не характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею. Переважно хворобами для лікування і діагностування є хвороби, при яких задіяні клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, наприклад, пухлинні захворювання, зокрема ракові захворювання, такі як описані тут.
У одному аспекті винахід пропонує композиції, наприклад, фармацевтичні і діагностичні композиції/набори, які містять антитіло, або комбінацію антитіл запропонованих даним
Зо винаходом. Фармацевтична композиція запропонована винаходом може містити фармацевтично прийнятний носій і може необов'язково містити один або більше ад'ювантів, стабілізуючих речовин тощо. У окремому варіанті здійснення композиція включає комбінацію антитіл, які зв'язуються з різними епітопами, або які мають різні функціональні характеристики, наприклад, викликають СОС і/або АОСС і викликають апоптоз. У цьому варіанті здійснення винаходу антитіла можуть використовуватися в комбінації, наприклад, як фармацевтична композиція, яка містить два або більше анти-СІ ОМб моноклональних антитіла. Наприклад, анти-СІ ОМ антитіла, які мають різні, але комплементарні активності, можуть бути об'єднані в єдине лікування для досягнення бажаного терапевтичного ефекту. У бажаному варіанті здійснення композиція включає анти-СІ 0ОМб антитіло, яке опосередковує СОС, в комбінації з іншим анти-СІОМБб антитілом, яке викликає апоптоз. У іншому варіанті здійснення композиція включає анти-СІ ОМ6б антитіло, яке опосередковує високоефективне знищення клітин-мішеней у присутності ефекторних клітин, в комбінації з іншим анти-СІОМб антитілом, яке інгібує ріст клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею.
Даний винахід також включає одночасне або послідовне введення двох або більше анти-
СІГОМб антитіл запропонованих даним винаходом, причому бажано, щонайменше, одне з вказаних антитіл є химерним анти-СІ ОМб антитілом і, щонайменше, одне додаткове антитіло є людським анти-СІОМб антитілом, при цьому антитіла зв'язуються з одним і тим же або з різними епітопами СІ ОМб. Краще химерне СІГОМб антитіло запропоноване винаходом вводиться першим, з подальшим введенням людського анти-СІ ОМб антитіла запропонованого винаходом, причому людське анти-СІОМб антитіло бажано вводиться протягом тривалого періоду часу, тобто як підтримуюча терапія.
Антитіла, кон'югати, біспецифічні/умультиспецифічні молекули і композиції даного винаходу можуть використовуватися у ряді способів інгібування росту клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і/або селективного знищення клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, шляхом контакту клітин з ефективною кількістю антитіла, кон'югата, біспецифічної/мультиспецифічної молекули або композиції, так що зростання клітин інгібується і або клітина знищується. У одному варіанті здійснення спосіб включає знищення клітин, які бо експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею,
необов'язково у присутності ефекторних клітин, наприклад, шляхом СОС, апоптозу, АОСС, фагоцитозу або за допомогою комбінації двох або більше з цих механізмів. Клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, які можна інгібувати або знищити, використовуючи антитіла запропоновані винаходом, включають ракові клітини.
Антитіла, кон'югати, і біспецифічні/мультиспецифічні молекули і композиції запропоновані даним винаходом можна використовувати для лікування і/або запобігання цілому ряду хвороб, при яких задіяні клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, шляхом введення антитіл пацієнтам, які страждають на такі хвороби.
Приклади хвороб, які можна лікувати (наприклад, поліпшити стан) або запобігти, включають, але не обмежуються названими, онкологічні хвороби. Приклади онкологічних хвороб, які можна лікувати і/або запобігти, включають злоякісні захворювання, такі як рак яєчника, зокрема аденокарциному яєчника і тератокарциному яєчника, рак легень, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легень (МЗС С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, рак шлунку, рак молочної залози, рак печінки, рак підшлункової залози, рак шкіри, зокрема базальноклітинну карциному і плоскоклітинну карциному, злоякісну меланому, рак голови і шиї, зокрема злоякісну плеоморфну аденому, саркому, зокрема синовіальну саркому і карциносаркому, рак жовчної протоки, рак сечового міхура, зокрема перехідно- клітинну карциному і папілярний рак, рак нирки, зокрема нирковоклітинний рак, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, рак товстої кишки, рак тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональну карциному яєчка, плацентарну хоріокарциному, рак шийки матки, рак яєчка, зокрема семіному яєчка, тератому яєчка і ембріональний рак яєчка, рак матки, герміному, таку як, тератокарциному або ембріональну карциному, зокрема ембріонально- клітинну пухлину яєчка та їх метастатичні форми.
У додатковому аспекті винахід має відношення до способу лікування або запобігання хворобі або порушенню, у яких залучені клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СГОМб з клітинною поверхнею, який передбачає введення суб'єктові антитіла, кон'югата, біспецифічної/мультиспецифічної молекули або композиції винаходу. Бажано хвороба або порушення є хворобою, пов'язаною з пухлиною і в конкретних варіантах здійснення її вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (ЗСІ С) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинної карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярної раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріональної раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм. Переважно на поверхні вказаних клітин експресується СІ ЮМб6.
Винахід передбачає застосування описаних тут засобів і композицій для профілактичного іабо терапевтичного лікування пухлинних хвороб, тобто для лікування пацієнта, який має пухлинне захворювання або який має ризик розвитку пухлинного захворювання. У одному аспекті винахід пропонує способи інгібування зростання пухлин, які передбачають введення одного або більше з поміж описаних тут засобів і композицій.
Бажано описані тут засоби і композиції вводяться у такий спосіб, що терапевтично активна субстанція не доставляється або практично не доставляється до тканини або органу, в якому клітини експресують СІ ОМб і характеризуються зв'язуванням СІ ОМ6б з клітинною поверхнею, тоді як тканина або орган вільні від пухлин, наприклад в тканину плаценти або плаценту. Для цього засобу і композиції, описані тут, вводяться місцево.
У одному аспекті винахід пропонує описане тут антитіло для застосування в описаних тут способах лікування. У одному варіанті здійснення винахід пропонує описану тут фармацевтичну композицію для застосування в описаних тут способах лікування.
У окремому варіанті здійснення винаходу суб'єкта, якому вводиться антитіло, додатково 60 лікують за допомогою засобу хіміотерапії, опромінювання або засобу, який модулює, наприклад,
який підсилює або інгібує, експресію або активність Ес-рецептора, наприклад, Ес-гамма рецептора, такого як цитокін. Типові цитокіни для введення під час лікування включають гранулоцитарний колонієстимулюючий чинник (05-С5Е), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий чинник (ЗМ-С5Е), інтерферон-у (ІЕМ-у) і чинник некрозу пухлини (ТМРЕ).
Типові терапевтичні засоби включають, серед інших, протипухлинні засоби, такі як доксорубіцин, цисплатін, таксотер, 5-фторурацил, метотрексат, гемцитабін і циклофосфамід.
У наступному аспекті винахід має відношення до імунізації тварин, які не є людиною, наприклад, мишей, людським СІ ОМ6 або його пептидним фрагментом, для отримання антитіл.
Кращими пептидами для імунізації є пептиди, вибрані з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 6,
ЗЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 14 і БЕО ІО МО: 15 та імунологічно еквівалентних пептидів.
Також як і трансгенні тварини, які не є людиною, тварини дикого типу можуть бути імунізовані очищеним або збагаченим препаратом СГОМб антигену або його пептидним фрагментом і/або нуклеїновими кислотами і/або клітинами, які експресують СІ ОМб або його пептидний фрагмент. Переважно трансгенна тварина, яка не є людиною, здатна продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ОМб (наприклад, Ід, ІдА і/або ІЗ9М) за допомогою проведення М-О-) рекомбінації і перемикання ізотипу. Перемикання ізотипу може відбуватися за допомогою, наприклад, класичного або некласичного перемикання ізотипу.
Відповідно, в ще одному аспекті винахід пропонує виділені з тварини, які не є людиною, В- клітини, як описано вище. Потім виділені В-клітини можна імунізувати шляхом злиття з імморталізованою клітиною для отримання джерела (наприклад, гібридоми) антитіл запропонованих даним винаходом. Такі гібридоми (тобто продукуючі антитіла запропоновані винаходом) також охоплюються рамками винаходу.
У додатковому аспекті даний винахід має відношення до методів діагностування, виявлення і моніторингу пухлинної хвороби, що включає встановлення і/або визначення кількості СІ ОМб або клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, в біологічному зразку, узятому у пацієнта, за допомогою антитіла запропонованого винаходом. Біологічний зразок може бути узятий у пацієнта, який має пухлинне захворювання, або у якого підозрюють захворювання або який захворює або такого, у якого є ймовірність розвитку пухлинного захворювання.
Зо У одному варіанті здійснення способу діагностування, виявлення або моніторингу пухлинної хвороби згідно винаходу біологічний зразок і/або контрольний/еталонний зразок походить з тканини або органу, які відповідають тканині або органу, який слід продіагностувати, виявити або проконтролювати щодо ураження пухлинним захворюванням, наприклад, злоякісною хворобою, яку слід діагностувати, виявити або проконтролювати, є карцинома яєчника, а біологічний зразок і/або контрольний/еталонний зразок є тканиною яєчника. Такі тканини і органи описуються тут, наприклад, у зв'язку з різними пухлинними захворюваннями і видами раку.
У одному варіанті здійснення способів діагностування, виявлення і моніторингу пухлинної хвороби біологічний зразок є зразком тканини або органу, в якому клітини, у тому випадку, коли в тканині або органі відсутня пухлина, практично не експресують СІ ОМб і не характеризуються значним зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею. Бажано вказана тканина є тканиною, відмінною від тканини плаценти.
Як правило, рівень молекули-мішені в біологічному зразку порівнюється з еталонним рівнем, причому відхилення від вказаного еталонного рівня указує на наявність і/або стадію пухлинного захворювання у суб'єкта. Еталонний рівень може бути таким же, як рівень, визначений в контрольному зразку (наприклад, зразку здорової тканини або від здорового суб'єкта), або середнім рівнем у здорових суб'єктів. "Відхилення" від вказаного еталонного рівня означає будь-яку значущу зміну, наприклад, збільшення або зменшення, щонайменше, на 10 95, 20 95, або 30 9565, бажано, щонайменше, на 40 95 або 50 95, або навіть більше. Збільшена наявність
СІОМб або клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, у вказаному біологічному зразку або збільшена кількість СІ ОМб або клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, в біологічному зразку в порівнянні з еталонним рівнем указує на наявність пухлинного захворювання.
В більшості випадків виявлення і/або визначення кількості в способах запропонованих винаходом включає використання мічених антитіл, які специфічно зв'язуються з молекулою- мішенню.
У окремому аспекті винахід має відношення до способу виявлення, тобто визначення положення або місця розташування пухлини, наприклад, в конкретній тканині або органі, який 60 передбачає введення антитіла запропонованого даним винаходом, яке з'єднується з детектованою міткою у пацієнта. Мічення тканини або органу у вказаного пацієнта може вказувати присутність пухлини або наявність ризику розвитку пухлинної хвороби у вказаній тканині або органі.
Наприклад, антитіла запропоновані винаходом можна безпосередньо отримати від гіоридоми, яка експресує антитіло, або можна клонувати і рекомбінантно експресувати в клітині - господарі (наприклад, СНО клітині або лімфоцитарній клітині). Додатковими прикладами клітин- господарів є мікроорганізми, такі як Е. соїї ії гриби, наприклад, дріжджі. Альтернативно, вони можуть проводитися рекомбінантно в трансгенних, таких, що не є людиною, тваринах і рослинах. Проте даний винахід також передбачає варіанти здійснення, в яких антитіла виробляються іп зи шляхом імунізації або вакцинації пацієнта, як розкрито в описі.
Даний винахід також має відношення до нуклеїнових кислот, які містять гени або нуклеїновокислотні послідовності, які кодують антитіла або їх ділянки, наприклад, ланцюг антитіла, як описано тут. Нуклеїнові кислоти можуть входити до складу вектора, наприклад, плазміди, косміди, вірусу, бактеріофага або іншого використаного вектора, наприклад, прийнятого в генній інженерії. Крім того, вектор може містити гени, наприклад, маркерні гени, які дають можливість відбирати вектор у відповідній клітині-господарі та за відповідних умов. Крім того, вектор може містити елементи контролю експресії, що забезпечують належну експресію закодованих ділянок у відповідних господарях. Такі елементи контролю відомі фахівцеві і можуть включати промотор, касети сплайсингу і кодон ініціації трансляції.
Бажано нуклеїнова кислота винаходу функціонально прикріпляється до вищезазначеної послідовності, яка контролює експресію, забезпечуючи експресію в еукаріотичних і прокаріотичних клітинах. Елементи контролю, які забезпечують експресію в еукаріотичних і прокаріотичних клітинах, добре відомі фахівцям в даній галузі техніки.
Способи конструювання нуклеїновокислотних молекул відповідно до даного винаходу з метою створення векторів, які містять вищезгадані нуклеїновокислотні молекули, введення векторів у відповідні обрані клітини-господарі, індукції (викликання) або досягнення експресії добре відомі в даній галузі техніки.
Додатковий аспект даного винаходу має відношення до клітини-господаря, яка містить нуклеїнову кислоту або вектор, розкриті тут.
Зо Інші ознаки і переваги даного винаходу стануть зрозумілими з наступного докладного опису і пунктів формули винаходу.
Короткий опис креслень
Фіг. 1. Вирівнювання послідовностей СІ ОМ3, СІ ОМ4, СІ ОМб і СІ ОМ.
Фіг. 2. Імунофлуоресцентний аналіз сироватки, отриманої від мишей, імунізованих з метою отримання СІ ЮОМб-специфічних антитіл. (А) Неприкріплені клітини СНО-КІ1, котрансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують людські СГ ОМ6б і СЕР, відповідно, були досліджені за допомогою анти-СІ ОМб моноклональних мишачих антитіл (КО Зубзієт5, МАВЗ656). СІ 0ОМб розташовується на плазматичній мембрані трансфікованих клітин і може бути ціллю для специфічних антитіл на живих клітинах. (В) Сироватка мишей, на основі якої була отримана гібридома Е3-6С3-НВ, містила антитіла, які зв'язуються з СІОМб вна поверхні неприкріплених клітин СНО-КІ, котрансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують людський СІ ОМб і СЕР.
Фіг. 3. Аналіз ендогенної експресії білків-клаудинів в клітинах НЕК293Т методом Вестерн- блотінгу.
Білкові лізати НЕК293ЗТ-клітин, трансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують СІ ОМ,
СГ ОМм4, СІ ОМмб і СГ ОМО, відповідно, або фіктивно трансфіковані (контроль) були досліджені за допомогою Вестерн-блотінгу з використанням комерційно доступних анти-СІ ОМЗ(А) (Іпуйтодеп,
Саї Мо. 34-1700), анти-СІ ОМА(А) (7утейа, 32-9400), анти-СІ ОМб(А) (АВР, 01-8865) і анти-
СІ ОМУ(А) (Запіа Сти7, 5с-17672) антитіл. Антитіла виявляли експресію своїх відповідних мішеней тільки у відповідних НЕК293Т трансфектантах. У нетрансфікованих НЕК293Т клітинах не спостерігалося ендогенної експресії яких-небудь з цих клаудинів.
Фіг. 4. Оцінка специфічності комерційно доступних анти-СІЇОМ-антитіл за допомогою проточної цитометрії.
Зв'язування комерційно доступних анти-СЇ ОМ-антитіл з клітинами НЕК293Т, трансфікованими нуклеїновими кислотами, які кодують СІГОМ3, С1О0М4, СІОМб ії СГОМО, відповідно, або нетрансфікованими клітинами визначали за допомогою проточної цитометрії.
Для цієї мішені специфічним є тільки комерційно доступне анти-СІ ОМЗ-антитіло.
Фіг. 5. Оцінка специфічності анти-СІ ОМ-антитіл, отриманих згідно винаходу, за допомогою проточної цитометрії. бо За допомогою проточної цитометрії було визначене зв'язування антитіл в супернатантах від моноклональних субклонів гібридоми з НЕК293Т клітинами, котрансфікованими вектором, який кодує СГ ОМб, СІ ОМ, СІ ОМА 5 або СІ ОМО, і вектором, який кодує флуоресцентний маркер. (А) Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-603-Н8 специфічно зв'язувалися з СІ ОМб-трансфікованими клітинами, але не з клітинами, трансфікованими
СІГОоМ3, СГОМ4 ії СГОМО, відповідно. Навпаки, антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е4-4Е7-Е2 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими СГ ОМб або СІ ОМ.
Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-6С3-НВ також зв'язувалися з клітинами, трансфікованими (1143МУ) -5МР варіантом СІ ОМб. (В) Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-783-84 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими СІ ОМб, СІ ОМ3З або СІ ОМО. Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-ЗЕ7-А5 зв'язувалися з клітинами, трансфікованими
СІ ОМб, СІ ОМА або СІ ОМ.
Фіг. 6. Специфічність зв'язування анти-СЇ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимМмАВ
БОА, бОА, 610, 644А, 65А, 668 і 67А.
Зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з людськими СІ ОМб, 3, 4, 9 і СІ ОМб МР (одиночний нуклеотидний поліморфізм) варіантом 1143М було проаналізовано проточною цитометрією за допомогою НЕК293Т клітин, які короткочасно експресують відповідний людський клаудин.
НЕК293Т були котрансфіковані флуоресцентним маркером, щоб розрізнити нетрансфіковані (01 ї ОЗ популяція) і трансфіковані (02 і 04 популяція) клітини. Використовували концентрацію антитіл, яка насищала зв'язування з СІ ОМб (25 мкг/мл). Експресію людських СІ ОМб, 3, 4, 9 і
СІ ОМ6-5МР(Н4ЗМ) підтверджували за допомогою комерційно доступних моноклональних антитіл до людського клаудину-б (НО Бузіет5, МАВЗ3656), людського клаудину-3 (НО
БЗузіет5, МАВ4620) і людського клаудину-4 (НО бувієт5, МАВ 4219).
Фіг. 7. Відносна спорідненість анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А.
Для визначення відносної спорідненості за допомогою проточної цитометрії досліджували зв'язування анти-СІОМб-антитіл з людським ГОМб, стабільно експресованим на поверхні
НЕК29З-клітин. У експерименті із насичення зв'язування концентрацію антитіл наносили на графік проти РАСб-сигналів (середня інтенсивність флуоресценції). ЕСбзхо (концентрація
Зо антитіла, яка зв'язується з половиною місць зв'язування у стані рівноваги) обчислювали за допомогою нелінійної регресії. СІ ОМб-специфічні антитіла тимАВ 59А, 60А, 610, 64А, 65А, 668 і 67А показали дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 200-500 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій.
Фіг. 8. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СЇ ОМ мишачих моноклональних антитіл тимАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А.
СОб-активність анти-СІОМб антитіл проаналізували, використовуючи люцифераза- залежний метод аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього
СНО-КІ клітини, які стабільно експресують людський СІ ОМб, обробили різними концентраціями тиИМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 66В і 67А. МиМАВ 59А, б60А, 610, 64А, 65А, 66В і 67А продемонстрували дозозалежну СОС-активність і викликали СОС за низьких концентрацій.
Фіг. 9. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СЇ ОМ мишачих моноклональних антитіл тимАВ 65А і 66В на клітини МЕС8 і МЕС8 І МТ52 54 (СІ ЮОМб нокаутні), які ендогенно експресують СІ ОМб.
Анти-СІ ОМб-антитіла тимАВ 65А і 66В викликали СОС на клітинах МЕС8 дозозалежним чином. Мішень-специфічність тимАВ 65А і 66В забезпечувалася використанням МЕС8 І МТ52 54 клітин (СІ ОМ нокаутні).
Фіг. 10. Терапевтичний ефект раннього лікування антитілами тимАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А на моделі ксенотрансплантату мишей з прищепленою лінією пухлинних клітин
МЕС8.
Використовували модель ксенографтів МЕС8, які ендогенно експресують СГОМб, на безтімусних Миде-Рохпі"" мишах. В порівнянні з контрольною групою (фізіологічний розчин) тиМАВ 59А, 60бА, 610, 64А, 65 А, 66В і 67А показали інгібування росту пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕС8.
Фіг. 11. Специфічність зв'язування анти-СЇ ОМб химерних моноклональних антитіл спітАВ 6ІП, 64А, 67А і 89А.
Зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з людським СІ ОМ, 3, 4 і 9, відповідно, проаналізували за допомогою проточної цитометрії, використовуючи клітини НЕК293, які стабільно експресують відповідний людський клаудин. Використаною концентрацією антитіл була концентрація, яка насичує зв'язування (25 мкг/мл). Експресію людських СІ ОМ3, 4, 6 ії 9 підтверджували за 60 допомогою комерційно доступних моноклональних антитіл до людського клаудину-З3 (НО зузіет5, МАВ4620) і людського клаудину-4 (КО Зузіет5, МАВ 4219) і СІ ОМб6/9-реактивних мишачих моноклональних антитіл тиМАВ 5Е202, відповідно. Негативний контроль здійснювався за ідентичних умов без первинного антитіла.
Фіг. 12. Відносна спорідненість анти-СІ 0ОМб6 химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А до клітин НЕК293-СЇ ОЮМб.
Для визначення відносної спорідненості зв'язування анти-СОМб антитіл з людським
СІ ОМб, стабільно експресованим на поверхні НЕК293, клітини досліджували за допомогою проточної цитометрії. У експериментах із насичення зв'язування концентрацію антитіл наносили проти ЕАС5-сигналів (середня інтенсивність флуоресценції). ЕСво (концентрація антитіл, яка зв'язує половину місць зв'язування в рівновазі) обчислювали шляхом нелінійної регресії.
СІ ОМб-специфічні антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення ЕСвзо (ЕСво 450-600 нг/мл), при цьому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СпітАВ 67А ї 610 показали низькі (ЕСво 1000 нг/мл) і середні (ЕСво 2300 нг/мл) значення ЕСово, відповідно.
Фіг. 13. Відносна спорідненість анти-СІ 0ОМб6 химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 61А і 89А до клітин МЕС8.
Для визначення відносної спорідненості анти-СІ ОМб антитіл до пухлинних клітин, які ендогенно експресували СІ ОМб, зв'язування з лінією клітин раку яєчка МЕС8 досліджували за допомогою проточної цитометрії. Антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення
ЕСво (ЕСво 600-650 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій, тоді як спітАВ 610 і 67А показали середні (ЕСво 1700 нг/мл) і високі (ЕСво 6100 нг/мл) значення
ЕсСоо, відповідно.
Фіг. 14. Відносна спорідненість анти-СІ 0ОМб6 химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А до клітин ОМ90.
Для визначення афінності зв'язування анти-СІ ОМб-антитіл з пухлинними клітинами, які ендогенно експресують людський СІ ОМб, досліджували зв'язування з лінією клітин карциноми яєчника ОМ90 за допомогою проточної цитометрії. СІ ОМб-специфічні антитіла спітАВ 64А і 89А показали дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 550-600 нг/мл) і насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СНІМАВ 610 і 67А показали середні значення ЕСво (ЕСво 1500 нг/мл і
ЕСвхо 2300 нг/мл, відповідно).
Зо Фіг. 15. Активність, пов'язана з комплементзалежною цитотоксичністю (СОС), анти-СІ ОМб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А на клітинах дикого типу МЕС8 і нокаутних клітинах МЕСЗ8.
СОб-активність анти-СІ ОМб-антитіл проаналізували за допомогою люцифераза-залежного методу аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього клітини дикого типу МЕС8 (МЕС8 І МТ52 77), які ектопічно експресують люциферазу, обробили різними концентраціями спітАВ бі, 64А, 67А і 89А. На клітинах МЕС-8 спітАВ бІЮ, 64А, 67А і 89А показали дозозалежну СОС -активність, тоді як жодні з цих антитіл не викликали неспецифічний лізис СГ ОМб-нокаутних клітин МЕС-8 (МЕС8 І МТ52 54). Цей результат продемонстрував мішень-специфічні ефекторні функції спітАВ 6 І, 64А, 67А і 89А.
Фіг. 16. Активність, пов'язана з антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (АОСС), анти-
СІ ОМб химерних моноклональних антитіл спітАВ 610, 64А, 67А і 89А на клітинах дикого типу
МЕСЗ8 і нокаутних клітинах МЕС8.
Арсб-активність анти-СІ ОМ антитіл проаналізували за допомогою люцифераза-залежного методу аналізу для визначення ендогенної АТФ в нелізованих клітинах. Для цього клітини МЕС- 8 дикого типу (МЕС8 І МТ52 77) обробили різними концентраціями спітАВ 610, 64А, 67А і 89А.
СНІМАВ 610, 64А, 67А і 89А показали дозозалежну АОСС -активність, і викликали АОСС навіть за низьких концентрацій антитіл. Щоб продемонструвати мішень-специфічність використовували клітини МЕСЗ8 із стабільно нокаутним СІ ОМ6б (МЕС8 І МТ52 54).
Фіг. 17. Довгостроковий терапевтичний ефект раннього лікування анти-СЇ ОМб мишачими моноклональними антитілами тимАВ 610, 64А і 67А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Використовували модель ксенотрансплантатів МЕС8, які ендогенно експресують СІ ОМ, на безтімусних Миде-БРохпі"" мишах. Протягом 46 днів мишей лікували СІ ЮМб-специфічними антитілами. Після лікування контролювали зростання пухлини протягом 60 днів. Навіть після припинення імунотерапії у мишей, яких лікували мишачими моноклональними антитілами тиМмАВ 610, 64А і 67А, не спостерігалося зростання пухлини.
Фіг. 18. Терапевтичний ефект раннього лікування анти-СЇ ОМб мишачими моноклональними антитілами тимАВ 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8. бо Використовували модель ксенотрансплантатів МЕС8, які ендогенно експресують СІ ОМб, на безтімусних Миде-Рохпі"" мишах. Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин в різні моменти часу протягом раннього лікування МЕС8 ксенотрансплантатів у безтімусних мишей Миде-Рохпі"". У порівнянні з контрольною групою (фізіологічний розчин) тиМмАВ 89А показали інгібування росту пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕС8 (А).
Протягом 47 днів мишей обробляли РВЗ (контрольну групу) і СІ ОМб-специфічними антитілами, відповідно. Зростання пухлин контролювали протягом 51 дня. В порівнянні з РВ5-контролем у мишей, яких лікували тимАВВ8ОА, в кінці дослідження (В) пухлині не були виявлені.
Фіг. 19. Терапевтичний ефект анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 64А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин в різні моменти часу під час лікування розвинених ксенотрансплантатів МЕС8 у безтімусних мишей Миде-Рохп1"ч,
Імунотерапія мишачими моноклональними анти-СІ/ОМбЄ антитілами тимМАВ 64А продемонструвала інгібування росту солідних МЕС8-ксенотрансплантатів у порівнянні з контрольними групами і з антитілом і з фізіологічним розчином.
Фіг. 20. Довгостроковий терапевтичний ефект лікування анти-СЇ ОМб мишачими моноклональними антитілами тиМАВ 64А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Через 15 днів після приживання трансплантата протягом 45 днів мишей лікували СІ ОМб- специфічним антитілом тимАВ 64А. Зростання пухлин контролювали протягом додаткових 49 днів (А). На графіку видно збільшення тривалості життя мишей, яких лікували СІ ОМб- специфічним антитілом тимАВ 64А (В).
Фіг. 21. Терапевтичний ефект анти-СЇ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 610, 67А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин
МЕС8.
Діаграми розсіювання представляють об'єми прищеплених пухлин МЕС8 в різні моменти часу під час лікування розвинених ксенотрансплантатів МЕС8. За допомогою мишачих моноклональних анти-СІ ОМб антитіл тимМАВ 610, 67А і 89А було досягнуте інгібування росту пухлин у порівнянні з контрольними групами (фізіологічний розчин і антитіло).
Фіг. 22. Довгостроковий терапевтичний ефект анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл
Зо тиМмАВ 610, 67А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин МЕС8.
Через 17 днів після приживання трансплантата протягом 42 днів мишей лікували СІ ОМб- специфічними антитілами тимАВ 61Ір, 67А і 89А. Зростання пухлини контролювали протягом додаткових 49 днів (А). На графіку видно збільшення тривалості життя мишей, яких лікували
СІ ОМб-специфічними антитілами тимАВ 610 і 67А (В).
Фіг. 23. Терапевтичний ефект анти-СІ ОМб мишачих моноклональних антитіл тимАВ 64А і 89А на моделі ксенотрансплантату у мишей з прищепленою пухлинною лінією клітин дикого типу МЕС8 і МЕС8-клітинами із стабільно нокаутним СІ ОМб.
МиМАВ 64А ії 89А показали терапевтичну дію тільки у мишей з прищепленою пухлиною дикого типу МЕС8, але не у мишей з прищепленими клітинами МЕС8 з нокаутним СГОМ6б, що показує специфічність антитіл до мішені іп мімо.
Фіг. 24. Картування епітопів спітмАВ 610, 64А, 67А і 89А з високим розрізненням.
Аланінові мутанти називаються "залишок дикого типу число аланін" або "залишок дикого типу число гліцин" у випадку аланіну дикого типу, де амінокислоти даються у вигляді однобуквенного коду. Амінокислоти ЕЗ5, (337, 539 і можливо Т33 першого позаклітинного домену СГОМ6б важливі для взаємодії з СІ ОМб-специфічними химерними антитілами спітАВ бІЮ, 64А, 67А і 89А. Залишок 140 необхідний для зв'язування спітАВ 89А, причому він сприяє скріпленню спітАВ 610 і 67А. Крім того, 1151 другого позаклітинного домену СГ ОМб сприяє взаємодії з спітАВ 67А. Хоча експерименти із застосуванням імунофлуоресценції підтвердили експресію СІ ОМб у мутантів Р28А, МУЗОА, 49А, І 50А, МУ51А, С54А і СбАА, вони не показали фарбування мембран. З цієї причини ми не могли виключити взаємодію наших антитіл з цими амінокислотами. Загалом, як встановлено тут, епітоп відповідає нашій стратегії імунізації за допомогою ДНК і пептидів ЕСІ-домену СГ ОМ.
Фіг. 25. Вирівнювання варіабельної області важкого ланцюга амінокислотних послідовностей
СІ ОМб-специфічних антитіл запропонованих даним винаходом.
СОВ-послідовності (НСОВІ, НСОНВ2 і НСОВЗ) виділені прямокутником.
Фіг. 26. Вирівнювання варіабельної області легкого ланцюга амінокислотних послідовностей
СІ ОМб-специфічних антитіл запропонованих даним винаходом.
СОВ-послідовності (СОВА, І СО і Її СОВ3) виділені прямокутником. бо Визначення термінів
Для того, щоб даний винахід був зрозумілішим, спочатку даються визначення термінів.
Додаткові визначення висловлюються протягом всього докладного опису.
На протягом всього докладного опису і подальших пунктів формули винаходу, якщо контекст не вимагає іншого, слід розуміти, що слово "містить" і його варіанти, такі як "утримує" і "який містить", припускає включення певного члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого члена, цілого числа або стадії або групи членів, цілих чисел або стадій. Терміни в однині, використані в контексті опису винаходу (особливо в контексті формули винаходу) слід тлумачити як такі, що включають і однину і множину, якщо в описі не вказано інакшого або інше явно не продиктоване контекстом.
Перераховування меж значень в описі служить тільки як спосіб скорочення згадування окремо кожного окремого значення, яке потрапляє в межі. Якщо не вказане іншого, кожне окреме значення включається в докладний опис, неначебто воно було окремо перераховане в описі.
Всі описані тут методи можуть здійснюватися в будь-якому відповідному порядку, якщо в описі не вказано інакше або інше явним чином не протирічить контексту. Використання всіх без виключення прикладів або характерних виразів (наприклад, "такий як"), наданих в описі, має на меті тільки краще ілюструвати винахід і не обмежує рамки винаходу, заявлені в іншій формі.
Формулювання докладного опису не повинно тлумачитись, як такі, що означають який-небудь незаявлений елемент, істотний для здійснення винаходу на практиці.
Клаудини є білками, які є найбільш важливими компонентами щільних контактів, де вони створюють трансклітинний бар'єр, який контролює потік молекул в міжклітинному просторі між клітинами епітелію. Клаудини є трансмембранними білками, які перетинають мембрану 4 рази, при цьому і М-кінець і С-кінець розташовуються в цитоплазмі. Перша позаклітинна петля складається в середньому з 53 амінокислот і друга петля із близько 24 амінокислот. СІ ОМб і
СІГОМО є найбільш схожими членами родини СІ ОМ.
Термін "СІ ОМ", як він використовується в описі, означає клаудин і включає СІ Мб, СГ ОМО,
СГОмМаА і СІ ОМ3. Переважно СІ ОМ є людським СІ ОМ.
Термін "СГОМ6" бажано має відношення до людського СІ ОМб ії зокрема до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 2 або яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 8, наприклад, до
Зо нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність «ЕО ІЮО МО: 1, або (ії) білка, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2 або який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8. Перша позаклітинна петля СІ ОМб бажано містить амінокислоти з 28 до 80, краще амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в зЕО ІЮ МО: 2, або амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО І МО: 8, наприклад, амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО І МО: 7. Друга позаклітинна петля С ОМб бажано містить амінокислоти з 138 до 160, бажано амінокислоти з 141 до 159, краще амінокислоти з 145 до 157 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО І МО: 2, або амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІЮ МО: 8, такої як амінокислотна послідовність, вказана в 5ЕО ІЮ МО: 6. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ЮМб.
Термін "СІ ОМО" бажано має відношення до людського СІ ОМ і, зокрема, до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 9, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 9. Перша позаклітинна петля СІГОМУ бажано містить амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІО МО: 9. Друга позаклітинна петля СОМУ бажано містить амінокислоти з 141 до 159 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕБЕО ІЮО МО: 9. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ЮМО.
Термін "СГОМ4" бажано має відношення до людського СІ ОМА ії зокрема до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ МО: 10, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 10. Перша позаклітинна петля СІОМ4 бажано містить амінокислоти з 28 до 76 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІЮ МО: 10. Друга позаклітинна петля СІ ОМА бажано містить амінокислоти з 141 до 159 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІЮ МО: 10. Вказані перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМА.
Термін "СІ ОМ3" бажано має відношення до людського СІ ОМЗ і, зокрема, до (ї) нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїновокислотну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮО МО: 11, або (ії) білок, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11. Перша позаклітинна петля СІГОМ3 бажано містить амінокислоти з 27 до 75 амінокислотної послідовності, вказаної в ЗЕО ІЮ МО: 11. Друга позаклітинна петля СІ ОМА бажано містить амінокислоти з 140 до 158 амінокислотної послідовності, вказаної в 5ЕО ІЮО МО: П. Вказані бо перша і друга позаклітинні петлі бажано утворюють позаклітинну ділянку СІ ОМ3.
Описані вище послідовності СОМ включають будь-які варіанти вказаних послідовностей, зокрема мутанти, сплайс-варіанти, конформації, ізоформи, алельні варіанти, видові варіанти і видові гомологи, зокрема наявні в природі. Алельний варіант має відношення до зміни в нормальній послідовності гена, значення якого часто є незрозумілим. Повне генетичне секвенування часто визначає численні алельні варіанти для даного гена. Видовий гомолог є нуклеїновокислотною або амінокислотною послідовністю, джерелом походження яких є інший вид ніж у даної нуклеїновокислотної або амінокислотної послідовності. Термін "СОМ" включає (М СгГОМ сплайс-варіанти, (ії) СГОМ-посттрансляційно модифіковані варіанти, зокрема включаючи варіанти з різним глікозилюванням, наприклад статусом М-глікозилювання, (ії) СІ ОМ конформаційні варіанти, (ім) варіанти СІ ОМ, пов'язаного з раком, і СІ ОМ не пов'язаного з раком.
Бажано СІ ОМ перебуває в його нативній конформації.
Було виявлено, що СІ 0ОМб експресується при раку, наприклад, раку яєчника, раку легень, раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, меланомі, раку голови і шиї, саркомі, раку жовчних шляхів, нирковоклітинному раку і раку сечового міхура. Зокрема, СГОМб є бажаною мішенню для запобігання і/або лікування раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легені, включаючи дрібноклітинний рак легень (5СІС) і недрібноклітинний рак легень (МЗСІС), зокрема плоскоклітинного раку легень і аденокарциноми, раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинной карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм. У одному варіанті здійснення ракове захворювання, пов'язане з
Зо експресією СІ ОМб, вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, раку легень, метастатичного раку яєчника і метастатичного раку легень. Переважно рак яєчника є карциномою або аденокарциномою. Переважно рак легень є карциномою або аденокарциномою, і переважно є бронхіолярним раком, наприклад, бронхіолярною карциномою або бронхіолярною аденокарциномою. У одному варіанті здійснення пухлинна клітина, пов'язана з експресією СІ ОМб, є клітиною такого раку.
Термін "частина" відноситься до ділянки. Відносно окремої структури, наприклад, амінокислотної послідовності або білка, термін "ч-астина" може позначати неперервну або перервану ділянку вказаної структури. Бажано частина амінокислотної послідовності містить, щонайменше, 1 95, щонайменше 595, щонайменше 1095, щонайменше 2095, щонайменше 30 95, бажано, щонайменше, 40 956, бажано, щонайменше, 50 95, краще, щонайменше, 60 95, краще, щонайменше, 70 9о, ще краще, щонайменше, 80 95 і найкраще, щонайменше, 90 9о амінокислот вказаної амінокислотної послідовності. Бажано, якщо частина є перерваною ділянкою, вказана перервана ділянка складається з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше частин структури, причому кожна частина є неперервним елементом структури. Наприклад, перервана ділянка амінокислотної послідовності може складатися з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше, бажано не більше ніж 4 частин вказаної амінокислотної послідовності, при цьому кожна частина бажано містить, щонайменше, 5 неперервних амінокислот, щонайменше, 10 неперервних амінокислот, бажано, щонайменше, 20 неперервних амінокислот, бажано, щонайменше, 30 неперервних амінокислот амінокислотної послідовності.
Терміни "частина" і "фрагмент" використовуються тут як взаємозамінні та відносяться до неперервного елементу. Наприклад, частина структури, така як амінокислотна послідовність або білок відноситься до неперервного елементу вказаної структури. Ділянка, частина або фрагмент структури бажано включає в собі одне або більше функціональних властивостей вказаної структури. Наприклад, ділянка, частина або фрагмент епітопу або пептиду бажано є імунологічно еквівалентним (рівнозначним) до епітопу або пептиду, з якого він отриманий.
Термін "позаклітинна ділянка СОМ" в контексті даного винаходу відноситься до частини
СІ ОМ, оберненої до позаклітинного простору клітини і доступної із зовнішньої частини вказаної клітини, що є бажаним, наприклад, для антитіл, розташованих зовні клітини. Бажано термін відноситься до однієї або більше позаклітинних петель або їх частини або будь-якої іншої 60 позаклітинної частини СІ ОМ, яка бажано є специфічною для вказаного СІ ОМ. Бажано вказана частина містить, щонайменше 5, щонайменше 8, щонайменше 10, щонайменше 15, щонайменше 20, щонайменше 30, або щонайменше 50 амінокислот або більше.
Необхідно розуміти, що термін "СОМ, зв'язаний з поверхнею клітини" відноситься до нативного СОМ, тобто СГОМ в його неденатурованому, бажано природно згорнутому стані.
Бажано термін "СОМ, зв'язаний з поверхнею клітини" означає, що СГОМ зв'язується 3, і розташовується на плазматичній мембрані вказаної клітини, при цьому, щонайменше, частина
СІ ОМ, бажано позаклітинна ділянка, обернена до позаклітинного простору вказаної клітини і є доступною із зовнішньої частини вказаної клітини, наприклад, для антитіл, розташованих зовні клітини. Зв'язок може бути прямим або непрямим (опосередкованим). Наприклад, зв'язок може здійснюватися одним або більше трансмембранними доменами, одним або більше ліпідними якорями і/або шляхом взаємодії з будь-яким іншим білком, ліпідом, сахаридом або іншою структурою, яка знаходиться на зовнішній стороні плазматичної мембрани клітини. Наприклад,
СІ ОМ, зв'язаний з поверхнею клітини, може бути трансмембранним білком, тобто інтегральним мембранним білком, який має позаклітинну ділянку, або може бути білком, зв'язаним з поверхнею клітини, за допомогою взаємодії з іншим білком, який є трансмембранним білком.
СІГОМб є з'єднаним з поверхнею клітини, якщо він розташовується на поверхні вказаної клітини і є доступним для зв'язування СІ ЮОМб-специфічними антитілами, доданими до клітини. У кращих варіантах здійснення клітина, яка характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, є клітиною, яка експресує СГОМб. Слід розуміти, що у випадку, коли клітини експресують СІ ОМб, сполучений з поверхнею вказаних клітин, СІ ОМб може бути тільки частиною експресованого СІ ОМб.
Термін "клітина, яка несе СГОМ", переважно означає, що вказана клітина несе СОМ на своїй поверхні, тобто що СІ ОМ з'єднується з поверхнею вказаної клітини.
Термін "клітинна поверхня" або "поверхня клітини" використовується відповідно до його звичайного значення в даній області і відповідно включає зовнішню поверхню клітини, доступну для зв'язування з білками і іншими молекулами.
Вираз "СОМ, експресований на поверхні клітини" означає, що СІОМ, експресований клітиною, входить до складу поверхні вказаної клітини.
Відповідно до винаходу СІ ОМб є частково експресованим в клітині і є частково сполученим
Зо з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є нижчим у порівнянні з експресією і з'єднанням в клітинах плаценти або в тканині плаценти. Бажано рівень експресії і з'єднання є менше ніж на 10 95, бажано менше ніж на 595, З 95, 2 96, 1 Зо, 0,596, 0,1 95 або 0,05 95 від експресії і з'єднання в клітинах плаценти або в тканині плаценти або навіть нижче. Бажано,
СІГОМб є частково експресованим в клітині і є частково сполученим з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання перевищує рівень експресії і з'єднання в неканцерогенній, доброякісній тканині, відмінній від тканини плаценти, не більше ніж в 2-рази, бажано 1,5-рази і бажано не перевищує рівень експресії і з'єднання у вказаній неканцерогенній, доброякісній тканині. Бажано СІ ОМб є частково експресованим в клітині і є частково сполученим з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є рівнем нижчим від межі виявлення і/або якщо рівень експресії і з'єднання є дуже низьким для здійснення зв'язування СІ ОМб-специфічними антитілами, доданими до клітин.
Відповідно до винаходу СІ ОМб експресується в клітині і з'єднується з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання перевищує рівень експресії і з'єднання в неканцерогенній іншій доброякісній тканині, відмінній від тканини плаценти, бажано більше ніж в 2-рази, бажано в 10- разів, 100-разів, 1000-разів або 10000-разів. Бажано СІ ОМб експресується в клітині і з'єднується з клітинною поверхнею, якщо рівень експресії і з'єднання є вищим від межі виявлення і/або якщо рівень експресії і з'єднання є достатньо високим для здійснення зв'язування Сі 0Мб- специфічними антитілами, доданими до клітин. Бажано СІГОМб, експресований в клітині, експресується або експонується на поверхні вказаної клітини.
Термін "плот" відноситься до мікродоменів мембрани, багатим на сфінголіпіди і холестерин, розташованим в просторі зовнішнього "листка" (шару) плазматичної мембрани клітини.
Здатність деяких білків з'єднуватися усередині таких доменів та їх здатність утворювати "агрегати" або "фокальні агрегати" може впливати на функцію білків. Наприклад, переміщення молекул СІ ОМ в такі структури після зв'язування антитілами даного винаходу, створює високу щільність комплексів СІ ОМб-антиген-антитіло в плазматичних мембранах. Така висока щільність комплексів СІ ОМб-антиген-антитіло може дати поштовх ефективній активації системи комплементу під час СОС.
Відповідно до винаходу термін "хвороба" відноситься до будь-якого патологічного стану, включаючи рак, зокрема, описані тут форми раку. бо "Хвороби, які торкаються клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням
СІГОМб з клітинною поверхнею" означає згідно винаходу, що експресія і з'єднання в клітинах ураженої тканини або органу переважно є збільшеними в порівнянні з показниками для здорової тканини або органу. Під збільшенням розуміють збільшення, щонайменше, на 10 95, зокрема, щонайменше, 20 95, щонайменше 50 95, щонайменше 100 95, щонайменше 200 95, щонайменше 50095, щонайменше 100095, щонайменше 1000095 або навіть більше. У одному варіанті здійснення експресія і з'єднання з клітинною поверхнею виявляється тільки в ураженій тканині, тоді як експресія в здоровій тканині пригнічується. Відповідно до винаходу, хвороби, пов'язані з клітинами, які експресують СГ ОМб і які характеризуються з'єднанням СІ ОМ6б з їх клітинною поверхнею, включають пухлинні захворювання, такі як ракові захворювання. Більше того, відповідно до винаходу, пухлинні захворювання, такі як ракові захворювання переважно є тими хворобами, при яких клітини пухлини або ракові клітини експресують СІ Мб і характеризуються з'єднанням СІ ОМ з їх клітинною поверхнею.
Терміни "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба", як вони використовуються в описі, включають хворобу, яка відрізняється неправильно регульованим клітинним ростом, проліферацією, диференціюванням, адгезією і/або міграцією, що може приводити до утворення або схильності до утворення пухлини і/або пухлинних метастазів. Під "пухлинною клітиною" мають на увазі клітину, яка розмножується шляхом швидкого, неконтрольованого клітинного ділення і продовжує рости після припинення надходження стимулу, який ініціює нове зростання.
Під "пухлиною" мають на увазі аномальну групу клітин або тканину, яка росте в результаті швидкої неконтрольованої клітинної проліферації і продовжує рости після припинення надходження стимулу, який ініціює нове зростання. У пухлин спостерігається часткова або повна відсутність структурної організації і функціональної узгодженості з нормальною тканиною і зазвичай формується окрема маса тканини, яка може бути доброякісною, передзлоякісною або злоякісною.
Переважно "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба" відповідно до винаходу є раком, тобто злоякісним захворюванням, а пухлинна клітина є раковою клітиною. Переважно "пухлинна хвороба", "хвороба, пов'язана з пухлиною" або "онкогенна хвороба" характеризується наявністю клітин, які експресують СІОМб і які
Зо характеризуються зв'язуванням СІГОМб з клітинною поверхнею, причому пухлинна клітина експресує СІ ОМ і характеризується зв'язуванням СІ ОМ6б з клітинною поверхнею.
Клітина, яка експресує СГ ОМб і яка характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, переважно є пухлинною клітиною або раковою клітиною, переважно клітиною пухлин і видів раку, описаних тут. Переважно така клітина є відмінною від клітин плаценти.
Переважно ракові хвороби або види раку відповідно до винаходу вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, зокрема аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легенів, включаючи дрібноклітинний рак легень (5СІ С) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С), зокрема плоскоклітинний рак легень і аденокарциному, раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, зокрема базальноклітинной карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, зокрема злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, зокрема синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, зокрема перехідно-клітинної карциноми і папілярного раку, раку нирки, зокрема нирковоклітинного раку, включаючи світлоклітинний рак нирки і папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, включаючи рак клубової кишки, зокрема аденокарциному тонкої кишки і аденокарциному клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, зокрема семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, такої як, тератокарцинома або ембріональна карцинома, зокрема ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
Основними видами раку легень є дрібноклітинний рак легень (5СІ С) і недрібноклітинний рак легень (М5СІ С). Існує три основні підтипи недрібноклітинного раку легень: плоскоклітинний рак легень, аденокарцинома і крупноклітинний рак легень. Аденокарциноми складають приблизно 10 95 випадків раку легень. Зазвичай цей вид раку спостерігається на периферії легень, на противагу до дрібноклітинного раку легень і плоскоклітинного раку легень, які мають тенденцію розташовуватися більш центрально.
Рак шкіри є злоякісним утворенням на шкірі. Найпоширенішими видами раку шкіри є базальноклітинний рак, плоскоклітинна карцинома і меланома. Злоякісна меланома є тим типом раку шкіри, який викликає найбільше занепокоєння. Вона пов'язана з неконтрольованим ростом пігментних клітин - меланоцитів. бо Відповідно до винаходу "карцинома" є раком, який починається у вистилаючому шарі
(епітеліальних клітинах) органів. "Бронхіолярна карцинома" є карцдиномою легень і, як вважається, виникає в епітелії термінальних бронхіол, де неопластична тканина тягнеться по ходу альвеолярних стінок і росте в невеликих кількостях усередині альвеоли. Муцин може бути видно у деяких клітинах і в речовині в альвеолі, куди також включаються голі клітини. "Аденокарцинома" є раком, який виникає в залозистій тканині. Ця тканина до того ж є частиною великої групи тканин, відомих як епітеліальні тканині. Епітеліальна тканина включає шкіру, залози і цілий ряд інших тканин, які вистилають порожнини і органи тіла. З погляду ембріології епітелій походить з ектодерми, ендодерми і мезодерми. Щоб відноситися до аденокарциноми, клітини необов'язково повинні бути частиною залози, якщо тільки вони проявляють секреторні властивості Ця форма карциноми може виникати у деяких вищих тварин, включаючи людей. Добре диференційовані аденокарциноми мають тенденцію бути схожим на залозисту тканину, з якої вони походять, тоді як погано диференційовані не можуть.
За допомогою фарбування клітин з матеріалу біопсії патолог визначає, чи є пухлина аденокарциномою або іншим типом раку. Аденокарциноми можуть виникати в багатьох тканинах організму унаслідок широкого поширення залоз в організмі. Разом з тим, що кожна залоза не може секретувати одну і ту ж речовину, коли у клітини існує зовнішньосекреторна функція, вона вважається залозистою, і тому її злоякісна форма називається аденокарциномою.
Злоякісні аденокарциноми вторгаються в інші тканини і дають метастази, які також проникають в інші тканини. Аденокарцинома яєчника є найбільш поширеним типом карциноми яєчника.
Сюди включаються серозні і слизисті аденокарциноми, світлоклітинна аденокарцинома і ендометриоїдна аденокарцинома. "Цистаденокарцинома" є злоякісною формою поверхневої епітеліально-стромальної пухлини, типу карциноми яєчника.
Вважають, що поверхневі епітеліально-стромальні пухлини є класом новоутворень, які походять з поверхневого епітелію яєчника (зміненого репйопешт (очеревина)) або з ектопічного ендометрію або тканини фалопієвої (маткової) труби. Ця група пухлин складає більшість всіх пухлин яєчника.
Тератокарцинома відноситься до герміногенної пухлини, яка є сумішшю тератоми з
Зо ембріональною карциномою або з хоріокарциномою або з обома. Хоріокарцинома є злоякісною трофобластичною і таким раком, зазвичай плаценти, який швидко розвивається. Він характеризується раннім поширенням в легені з потоком крові.
Саркома є раком сполучної тканини (кісткової, хрящової, жирової), яка призводить до проліферації мезодерми. Цей вид раку протилежний до карцином, які мають епітеліальне походження. Синовіальна саркома є рідкісною формою раку, яка зазвичай зустрічається біля суглобів рук і ніг. Вона є одним з видів сарком м'яких тканин.
Нирково-клітинна карцинома, відома також як нирково-клітинний рак або нирково-клітинна аденокарцинома, є раком нирки, який походить з вистилання проксимальних звитих канальців, дуже маленьких трубочок в нирці, які фільтрують кров і видаляють продукти життєдіяльності.
Нирково-клітинна карцинома є поза всяких сумнівів найбільш поширеним типом раку нирок у дорослих і найбільш летальним зі всіх урогенітальних пухлин. Окремими підтипами нирково- клітинної карциноми є світлоклітинний рак нирок і папілярний рак нирок. Світлоклітинний рак нирок є найбільш поширеною формою нирково-клітинної карциноми. Під мікроскопом клітини світлоклітинного раку здаються дуже блідими або світлими. Папілярний рак нирок є другим найбільш поширеним підтипом. При деяких, якщо не при більшості, з цих форм раку утворюються невеликі пальцеподібні вирости (які називаються сосочками, папіломами).
Герміногенна пухлина є новоутворенням, яке походить з ембріональних клітин. Герміногенні пухлини можуть бути раковими і нераковими пухлинами. Зазвичай ембріональні клітини зустрічаються усередині гонад (яєчника і яєчка). Герміногенні пухлини, які виникають зовні гонад (наприклад, на голові, в роті, на шиї, нирковій мисці; у зародках, у немовлят і маленьких дітей найчастіше виявляються на середній лінії тіла, зокрема на кінчику куприка) можуть бути вродженими вадами розвитку, які виникають унаслідок помилок під час розвитку ембріона.
Двома основними класами герміногенних пухлин є семіноми і несеміноми, при цьому несеміноми включають тератокарциному, ембріональну карциному, пухлини жовткового мішка, хоріокарциному і диференційовану тератому. Більшість клітинних ліній від несеміном рівноцінні ембріональним карциномам, тобто вони майже повністю складаються із стволових клітин, які не диференціюються за початкових умов, хоча деякі можуть реагувати на індукуючі чинники диференціювання, такі як ретиноєва кислота.
Під "метастазуванням" мають на увазі поширення ракових клітин з первинного бо місцеположення в іншу частину організму. Утворення метастаз є дуже складним процесом і залежить від відділення злоякісних клітин від первинної пухлини, інвазії позаклітинного матриксу, проникності ендотеліальних базальних мембран для проникнення в порожнину тіла і судин, а потім, після транспортування кровотоком, інфільтрації органів-мішеней. Нарешті, зростання нової пухлини в місці-мішені залежить від ангіогенезу. Метастази пухлини можуть виникати навіть після видалення первинної пухлини, оскільки пухлинні клітини або компоненти можуть залишитися і розвинути метастатичний потенціал. У одному варіанті здійснення термін "метастази" відповідно до винаходу має відношення до "віддаленої метастази", тобто метастази, віддаленої від первинної пухлини і системи регіональних лімфатичних вузлів.
Клітини вторинної або метастатичної пухлини є такими ж, як в первинній пухлині. Це означає, наприклад, що, якщо карцинома яєчника метастазує в печінку, вторинна пухлина складається з анормальних клітин яєчника, а не з анормальних клітин печінки. Пухлину в печінці потім називають метастатичною карциномою яєчника, а не раком печінки.
Під терміном "лікувати" розуміють введення суб'єктові сполуки або композиції, розкритих тут, для запобігання або усунення хвороби, включаючи зменшення розмірів пухлини або кількості пухлин у суб'єкта; затримки або уповільнення хвороби у суб'єкта; інгібування або уповільнення розвитку нової хвороби у суб'єкта; зменшення частоти і тяжкості симптомів і/або рецидивів у суб'єкта, який має в даний час або що раніше мав захворювання; і/або подовження, тобто збільшення тривалості життя суб'єкта.
Термін "лікування хвороби" передбачає зцілення, скорочення тривалості, поліпшення, запобігання, уповільнення або придушення прогресу або погіршення або запобігання або затримку початку хвороби або її симптомів.
Під тим, "який має ризик" мають на увазі суб'єкт, тобто пацієнт, який має вищий, ніж зазвичай, шанс розвитку хвороби, зокрема раку, в порівнянні з основною популяцією. Крім того, суб'єкт, який мав або в даний час має хворобу, зокрема рак, є суб'єктом з підвищеним ризиком розвитку хвороби, оскільки хвороба у суб'єкта може продовжувати розвиватися. У суб'єктів, які мають рак в даний час або що мали рак, також є підвищений ризик утворення метастазів раку.
Термін "імунотерапія" має відношення до лікування, яке зачіпає специфічну імунну реакцію.
У контексті даного винаходу такі терміни як "оберегти (захистити)», "запобігти", "профілактичний", "превентивний" або "запобіжний" мають відношення до запобігання або
Зо лікування і виникнення і/або поширення пухлини у індивідуума. Термін "імунотерапія" в контексті даного винаходу бажано відноситься до активної пухлинної імунізації або протипухлинної вакцинації. Профілактичне введення імунотерапії, наприклад профілактичне введення композиції винаходу, бажано оберігає реципієнта від розвитку пухлинного зростання.
Терапевтичне проведення імунотерапії, наприклад терапевтичне введення композиції винаходу, може привести до придушення прогресування/зростання пухлини. Сюди включається зменшення швидкості прогресування/зростання пухлини, зокрема переривання прогресування пухлини, яке бажано веде до усунення пухлини. Терапевтичне проведення імунотерапії може захистити індивідуума, наприклад, від поширення або метастазування існуючих пухлин.
Термін "імунізація" або "вакцинація" описує процес введення антигену суб'єктові з метою викликати імунну відповідь через терапевтичні або профілактичні причини.
Терміни "суб'єкт", "Індивідуум", "організм" або "пацієнт" використовуються як взаємозамінні і мають відношення до хребетних, бажано ссавців. Наприклад, ссавці в контексті даного винаходу є людьми, приматами, тваринами, які не є людьми, домашніми тваринами, такими як собаки, кішки, вівці, велика рогата худоба, кози, свині, коні тощо, лабораторними тваринами, такими як миші, щури, кролики, морські свинки тощо, а також тваринами, яких утримують, наприклад, в зоопарку. Термін "тварина" як він використовується в описі також включає людей.
Термін "суб'єкт" також може включати пацієнта, тобто тварину, краще людину, яка має хворобу, переважно хворобу, пов'язану з експресією СІ ОМб, переважно онкогенну хворобу, таку як рак.
Термін "ад'ювант" відноситься до сполук, які подовжують або підсилюють або прискорюють імунну відповідь. Композиція даного винаходу бажано впливає без додавання ад'ювантів.
Проте, композиція даної заявки може містити будь-який відомий ад'ювант. Ад'юванти включають різнорідну групу сполук, таких як олійні емульсії (наприклад, ад'юванти Фрейнда), мінеральні сполуки (такі як галун), бактерійні продукти (такі як токсин ВогавєїіеНа репиввів), ліпосоми та імуностимулюючі комплекси. Прикладами ад'ювантів є монофосфорил-ліпід-А (МРІ.
ЗтйНКіїпе Вееспат), сапоніни, такі як 0521 (ЗтйНКіїпе Вееспат), 00521 (5тійКіїпе Вееспат;
УМО 96/33739), 057, 020517, 0518 і 05-11 (50 еї аї., 1997, Мої. Сеїїв 7: 178-186), неповні ад'юванти Фрейнда, повні ад'юванти Фрейнда, вітамін Е, монтанід, галун, СРО олігонуклеотиди (Кхієд єї аї., 1995, Маштге 374: 546-549) і різні емульсії вода-в-олії, які отримують з олій, які піддаються біологічному розкладанню, таких як сквалеон і/або Токоферол. 60 Відповідно до винаходу зразок може бути будь-яким зразком, придатним згідно даному винаходу, зокрема, біологічним зразком, наприклад зразком тканини, включаючи рідини організму, і/або клітинним зразком, і може бути отриманий звичайним способом, наприклад шляхом біопсії тканини, включаючи біопсію пункції і шляхом узяття крові, бронхіального аспірата, слини, сечі, калу або інших рідин організму. Відповідно до винаходу термін "біологічний зразок" також включає фракції біологічних зразків.
Термін "антитіло" відноситься до глікопротеїну, який містить, щонайменше, два важкі (Н) ланцюги і два легкі (Г) ланцюги, взаємно-сполучені дисульфідними зв'язками, і включає будь- яку молекулу, яка містить антигензв'язуючу ділянку. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла та їх фрагменти або похідні, включаючи, без обмеження, людські моноклональні антитіла, гуманізовані моноклональні антитіла, химерні моноклональні антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад, 5сЕм5 і антигензв'язуючі фрагменти антитіл, такі як Рар і баб1 фрагменти, а також включає всі рекомбінантні форми антитіл, наприклад, антитіла, експресовані в прокаріотах, неглікозильовані антитіла і будь-які антигензв'язуючі фрагменти антитіл і похідні, як описується тут. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (позначається в описі МН) і константної області важкого ланцюга. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (позначається в описі МІ) ї константної області легкого ланцюга. Області МН і Мі можна додатково підрозділити на області гіперваріабельності, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОР), які чергуються з ділянками, консервативнішими, які називаються каркасними ділянками (ЕК). Кожна
МН і Мі. складається з трьох СОВ і чотирьох ЕК, розташованих від амінокінця до карбоксикінця в наступному порядку: ЕК1, СОВІ, ЕВ2, СОВ2, ЕВЗ, СОВЗ, ЕК4. Варіабельні області важкого і легкого ланцюга містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередкувати зв'язування імуноглобуліну з тканиною-«хазяїном" або чинниками, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (Сід) класичної системи комплементу.
Відповідно до винаходу термін "щонайменше, одна з СОВ послідовностей" бажано означає, щонайменше, СОВЗ послідовність. Термін "СОВА послідовності ланцюга антитіла" переважно має відношення до СОВІ, СОН2 і СОВЗ важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла.
Згідно винаходу посилання на ланцюг антитіла, який містить конкретну СОВ-послідовність,
Ко) таку як окрема СОВЗ-послідовність, означає, що вказана окрема СОВ-послідовність або утворює СОВ-ділянку, таку як СОВЗ-ділянка вказаного ланцюга антитіла, тобто СОВ-ділянка складається з вказаної окремої СОВ-послідовності, або утворює частину СОВ-ділянки, таку як
СОВЗ- ділянка вказаного ланцюга антитіла, тобто СОВ-ділянка містить вказану конкретну СОВ- послідовність.
Якщо згідно винаходу робиться посилання на антитіло, яке містить окремий важкий ланцюг антитіла і/або окремий легкий ланцюг антитіла, наприклад, ланцюг, який містить конкретні СОВ- послідовності, бажано, щоб обидва важкі ланцюги і/або обидва легкі ланцюги антитіла кожен складаються з окремого важкого ланцюга антитіла і/або окремого легкого ланцюга антитіла.
Термін "гуманізоване антитіло" відноситься до молекули, яка має ділянку зв'язування антигену, отриману в основному від імуноглобуліну тварини, яка не є людиною, при цьому в основі решти структури імуноглобулінової молекули лежить структура і/або послідовність людського імуноглобуліну. Ділянка зв'язування антигену може або містити повні варіабельні домени, приєднані до константних доменів, або тільки гіперваріабельні ділянки (СОР), приєднані до відповідних каркасних ділянок у варіабельних доменах. Ділянки зв'язування антигену можуть бути дикого типу або модифікованими однією або більше амінокислотними замінами, наприклад, модифікованими, щоб бути більше схожими на людський імуноглобулін.
Деякі форми гуманізованих антитіл зберігають всі СОВ-послідовності (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить всі шість СОВ від мишачого антитіла). Інші форми мають один або більше СОВ, змінених відносно первинного антитіла.
Термін "химерне антитіло" відноситься до антитіл, в яких одна частина кожної з амінокислотних послідовностей важкого і легкого ланцюгів є гомологічною до відповідних послідовностей в антитілі, отриманому від конкретного виду або яке належить до певного класу, тоді як решта сегменту ланцюга є гомологічним до відповідних послідовностей іншого виду.
Зазвичай варіабельна ділянка і легкого і важкого ланцюгів копіює варіабельні ділянки антитіл, отриманих від одного виду ссавців, тоді як константні частини є гомологічними до послідовностей антитіл, отриманих від іншого виду. Однією очевидною перевагою таких химерних форм є те, що варіабельну ділянку можна легко отримати із відомих на даний час джерел, використовуючи досяжні В-клітини або гібридоми від організмів-господарів, які не є людиною, в комбінації з константними областями, отриманими, наприклад, з препаратів клітин бо людини. Притому, що варіабельна область має перевагу легкості отримання, а джерело не впливає на специфічність, константна область, будучи людською, менш ймовірно викличе імунну відповідь у суб'єкта-людини при введенні антитіл, ніж викликала б константна область з джерела, яке не є людиною. Проте визначення не обмежується цим окремим прикладом.
Термін "антигензв'язуюча ділянка" антитіла (або просто "ділянка зв'язування"), як він використовується в описі, відноситься до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном. Показано, що антигензв'язуюча функція антитіла може здійснюватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язуючих фрагментів, охоплені терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла, включають (ї) Еар фрагменти, одновалентні фрагменти, які складаються з МІ, МН, СІ ї СН доменів; (ії) Е(ар)2 фрагменти, двовалентні фрагменти, які містять два БГаб-фрагмента сполучені дисульфідним містком в шарнірній області; (ії) Ба фрагменти, які складаються з МН і СН доменів; (ім) Ем фрагменти, які складаються з МІ ії МН доменів одноланцюгових антитіл, (м) ЧАБ фрагменти (Ууага еї аї, (1989) Маїште 341: 544-546), які складаються з МН домену; (мі) ізольовані гіперваріабельні ділянки (СОР) і (мії) комбінації двох або більше ізольованих СОВА, які необов'язково можуть з'єднуватися синтетичним лінкером. Крім того, хоча два домени Ем фрагмента, МІ ії МН, кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, використовуючи рекомбінантні методи, за допомогою синтетичних лінкерів, що дає їм можливість бути єдиним білковим ланцюгом, в якому Мі і МН області розташовуються парами, щоб утворити одновалентні молекули (відомі як одноланцюгові Ем (5сЕм); дивися, наприклад, Віга еї аї. (1988)
Зсіепсе 242: 423-426; і Нивіоп еї аЇ. (1988) Ргос. Май. Асай. Зсі. ЮБА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також охоплені терміном "антигензв'язуюча ділянка" антитіла.
Додатковим прикладом є домен-зв'язуючі гібридні імуноглобуліни, які містять (ї) поліпептидний домен зв'язування, який приєднується до шарнірної області імуноглобуліну, (її) константну область СН2 важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до шарнірної області і (ії) константну область СНЗ важкого ланцюга імуноглобуліну, приєднану до константної області СНІ.
Зв'язуючий домен поліпептиду може бути варіабельною областю важкого ланцюга або варіабельною областю легкого ланцюга. Домен-зв'язуючі імуноглобулінові гібридні білки додатково розкриваються в 5 2003/0118592 ї 05 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл отримують за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки, при цьому фрагменти піддаються скринінгу щодо придатності, також, як і інтактні антитіла.
Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти в молекулі, тобто частини в молекулі, яка розпізнається імунною системою, наприклад, яка розпізнається антитілом.
Наприклад, епітопи є окремими, тривимірними ділянками на антигені, які розпізнаються імунною системою. У контексті даного винаходу епітоп бажано походить від більуа СОМ. Зазвичай епітопи складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і зазвичай мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і неконформаційні епітопи розрізняються тим, що зв'язування з першим, але не з другим, втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп білка, такого як СОМ, бажано містить неперервну або перервану частину вказаного білка і складає бажано від 5 до 100, бажано від 5 до 50, краще від 8 до 30, найкраще від 10 до 25 амінокислот в довжину, наприклад, епітоп може мати бажано 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислот в довжину.
Термін "перерваний епітоп", як він використовується в описі, позначає конформаційний епітоп на білковому антигені, який утворюється, щонайменше, з двох окремих областей в первинній послідовності білка.
Термін "біспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад, білок, пептид, або білковий або пептидний комплекс, який має дві різних специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні, і (Б) Ес- рецептором на поверхні ефекторної клітини. Термін "мультиспецифічна молекула" або
БО "гетероспецифічна молекула" включає будь-який агент, наприклад, білок, пептид, або білковий або пептидний комплекс, який має більше ніж дві різних специфічності зв'язування. Наприклад, молекула може зв'язуватися з або взаємодіяти з (а) антигеном клітинної поверхні і (5) Ес- рецептором на поверхні ефекторної клітини і (с), щонайменше, з одним іншим компонентом.
Відповідно, винахід включає, але не обмежується цим, біспецифічні, триспецифічні, тетраспецифічні та інші мультиспецифічні молекули, спрямовані до СІ ОМб, і до інших мішеней, таких як Ес-рецептори на ефекторних клітинах. Термін "біспецифічні антитіла" також включає діабоди (аіабодіе5). Діабоди є двовалентними біспецифічними антитілами, в яких МН і МІ. домени експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є дуже коротким, щоб дати можливість утворити пару двом доменам на одному і тому ж ланцюзі, 60 таким чином, змушуючи домени утворювати пару з комплементарними доменами іншого ланцюга і породжує дві антигензв'язуючих ділянки (дивися, наприклад, , Ноїідег, Р., еї а. (1993)
Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90: 6444-6448; РоЦак, В. .., єї аї. (1994) біписішге 2: 1121-1123).
Термін "гетероантитіла", як він використовується в описі, відноситься до двох або більше антитіл, їх похідним або антигензв'язуючим ділянкам, з'єднаним разом, щонайменше, двоє з поміж яких мають різні специфічності. Ці різні специфічності включають специфічність зв'язування для Ес-рецептора на ефекторній клітині і специфічність зв'язування для антигену або епітопу на клітині-мішені, наприклад, пухлинній клітині.
Антитіла, описані тут, можуть бути людськими антитілами. Термін "людське антитіло", як він використовується в описі, включає антитіла, які мають варіабельну і константну області, отримані від імуноглобулінових послідовностей людських зародкових ліній (дегтіїпе). Людські антитіла, відповідно до винаходу, можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються імуноглобуліновими послідовностями людських зародкових ліній (наприклад, мутації, введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або за допомогою соматичної мутації іп мімо).
Термін "моноклональне антитіло", як він використовується в описі, відноситься до препарату молекул антитіл з однорідним молекулярним складом. Моноклональне антитіло проявляє одну специфічність зв'язування і спорідненість до окремого епітопу. У одному варіанті здійснення моноклональні антитіла виробляються за допомогою гібридоми, яка включає В-клітину, отриману від тварини, яка не є людиною, наприклад, миші, сполучену з імморталізованою клітиною.
Термін "рекомбінантні антитіла" як він використовується в описі включає всі антитіла, які виходять, експресуються, створюються або виділяються за допомогою рекомбінантних способів, наприклад, (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною відносно генів імуноглобулінів, або гібридоми, отриманої з них, (Б) антитіла, виділені з клітини-господаря, трансформованої для того, щоб вона експресувала антитіла, наприклад, з трансфектоми, (с) антитіла, виділені з комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл, і (4) антитіла отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими способами, які зачіпають сплайсинг послідовностей генів імуноглобулінів з іншою ДНК- послідовністю.
Зо Термін "трансфектома", як він використовується в описі, включає рекомбінантні еукаріотичні клітини-господарі, які експресують антитіло, такі як клітини СНО, клітини М5/О, клітини НЕК293, клітини НЕК293Т, рослинні клітини або клітини грибів, включаючи клітини дріжджів.
Термін "гетерологічне антитіло, як він використовується в описі, визначається з огляду на трансгенний організм, який продукує таке антитіло. Цей термін відноситься до антитіла, яке має амінокислотну послідовність або кодованого нуклеїновокислотною послідовністю, яка відповідає послідовності, виявленій в організмі, який не є трансгенним організмом, і як правило, отриманому від іншого виду, ніж трансгенний організм.
Термін "гетерогібридне антитіло", як він використовується в описі, відноситься до антитіла, яке має легкий і важкий ланцюги від різних організмів. Наприклад, антитіло, яке має важкий ланцюг людини, сполучений з мишачим легким ланцюгом, є гетерогібридним антитілом.
Винахід включає всі антитіла і похідні антитіл, описані тут, які для цілей винаходу охоплюються терміном "антитіло". Термін "похідні антитіл" відноситься до будь-якої модифікованої форми антитіла, наприклад, кон'югату антитіла і іншого агента або антитіла або фрагмента антитіла.
Описані тут антитіла бажано є ізольованими. Термін "ізольоване антитіло", як він використовується в описі, відноситься до антитіла, яке в основному є вільним від інших антитіл, які мають інші антигенні специфічності (наприклад, ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з СІ ОМб, є в основному вільним від антитіл, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від СІ ОМб). Проте ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізоформою або варіантом людського СІ ОМб, може мати перехресну реактивність до інших споріднених антигенів, наприклад, від інших видів (наприклад, видовими гомологами СІ ОМб).
Більш того, ізольоване антитіло може бути в основному вільним від іншого клітинного матеріалу іМабо хімічних речовин. У одному варіанті здійснення винаходу комбінація "ізольованих" моноклональних антитіл має відношення до антитіл, які мають різні специфічності і об'єднані в чітко визначену композицію.
Згідно із даним винаходом антитіло здатне зв'язуватися з певною мішенню, якщо воно має значну спорідненість із зазначеною певною мішенню й зв'язується із зазначеною певною мішенню в стандартних методах дослідження, таких, як описуються тут. Краще коли антитіло здатне зв'язуватися з мішенню, якщо його зв'язування із зазначеною мішенню можна виявити за бо допомогою проточної цитометрії (за допомогою РАСЗ аналізу), за допомогою якої визначають зв'язування зазначеного антитіла із зазначеною мішенню, експресованою на поверхні інтактних клітин. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок можливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації 10 мкг/мл або нижче, 5 мкг/мл або нижче або 2 мкг/мл або нижче. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок можливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації 50 нМ або нижче, 30 нМ або нижче або 15 нМ або нижче. "Спорідненість" або "спорідненість зв'язування" часто оцінюється рівноважною константою дисоціації (Ко). Бажано термін "значна спорідненість" відноситься до зв'язування з певною мішенню з константою дисоціації (Ко) 107 М або нижче, 105 М або нижче, 10-7 М або нижче, 1038
М або нижче, 109 М або нижче, 10-79 М або нижче, 10-! М або нижче або 10-72 М або нижче.
Антитіла запропоновані даним винаходом бажано мають значення ЕСв5о для зв'язування з
СІГОМб 6500 нг/мл або нижче, 3000 нг/мл або нижче, 2500 нг/мл або нижче, 2000 нг/мл або нижче, 1500 нг/мл або нижче, 1000 нг/мл або нижче, 500 нг/мл або нижче, 400 нг/мл або нижче, 300 нг/мл або нижче, 200 нг/мл або нижче, або 100 нг/мл або нижче.
Антитіло не є здатним (значно) зв'язуватися 3з мішенню, якщо воно не має значної спорідненості із зазначеною мішенню й не зв'язується значно із зазначеною мішенню в стандартних методах. Краще антитіло не здатне (значно) зв'язуватися з мішенню, якщо його зв'язування із зазначеною мішенню не виявляється за допомогою проточної цитометрії (за допомогою ЕАС5 аналізу), за допомогою якої визначають зв'язування зазначеного антитіла із зазначеною мішенню, експресованою на поверхні інтактних клітин. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, але цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації до 2 мкг/мл, бажано до 5 мкг/мл, бажано до 10 мкг/мл, бажано до 20 мкг/мл, більш бажано до 50 мкг/мл, зокрема до 100 мкг/мл або до 150 мкг/мл, до 200 мкг/мл або вище. Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації до 15 нМ, бажано до 30 нМ, бажано до 50 нМ, бажано до 100 нм, бажано до 150 нМ або до 170 нМ, до 300 нМ, до 600 нМ, до 1000 нМ, до 1300 нМ або вище.
Краще антитіло зв'язується із зазначеною мішенню, і цей зв'язок неможливо зафіксувати, якщо воно присутнє у концентрації, яка насичує зв'язування з мішенню, з якою зв'язується антитіло, тобто СІ ОМб. Краще антитіло не має значної спорідненості до мішені, якщо воно зв'язується із зазначеною мішенню з Ко, яка щонайменше, в 10-разів, 100-разів, 103-разів, 104-разів, 105-
Зо разів або 106-разів є вищою, ніж Ко зв'язування з певною мішенню, з якою здатне зв'язуватися антитіло. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з мішенню, з якою здатне зв'язуватися антитіло, становить 10-7 М, тоді Ко зв'язування з мішенню, до якої антитіло не має значної спорідненості, становила б, щонайменше, 106 М, 105 М, 102 М, 103 М, 102 М або 10- М.
Антитіло є специфічним для певної мішені, якщо воно здатне зв'язуватися із зазначеною певною мішенню, тоді як воно не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, тобто має незначну спорідненість до інших мішеней і незначно зв'язується з іншими мішенями при стандартних методах аналізу. Згідно з винаходом антитіло є специфічним до СІ ОМб, якщо воно здатне зв'язуватися з СІОМб, але не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, зокрема, білками клаудинами, відмінними від СІ ОМб, такими як СГОМО, СІ ОМ4, СІ ОМ3 ії СГОМ1. Краще антитіло є специфічним до СІ ОМб, якщо спорідненість і зв'язування з білком клаудином, відмінним від
СІ ОМб, таким як СГОМО, СГ ОМ4, СГ ОМ ії СОМ, не перевищує значно спорідненості до або зв'язування з білками, неспорідненими із клаудином, такими як бичачий сироватковий альбумін (В5А), казеїн, людський сироватковий альбумін (НБА) або трансмембранні білки, які не є клаудинами, такі як молекули МНС або рецептор трансферину або будь-який інший специфічний поліпептид. Краще антитіло є специфічним для певної мішені, якщо воно зв'язується із зазначеною мішенню з Ко, яка щонайменше, в 10-разів, 100-разів, 103-разів, 104- разів, 105-разів або 106-разів є нижчою, ніж Ко зв'язування з мішенню, яка не є специфічною.
Наприклад, якщо Коб зв'язування антитіла з мішенню, яка є специфічною становить 10 М, то Ко зв'язування з мішенню, яка не є специфічною, має бути, щонайменше, 102 М, 1025 М, 102 М, 103
М, 102 М або 107 М.
Зв'язування антитіла з мішенню можна визначити експериментально, використовуючи будь- який придатний метод, див., наприклад, Веггої5Ку еї аї., "Апіроду-Апіїдеп Іпіегасіопе" п
Еипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ. Е., Ед., Намеп Ргебз5 Мем мок, М М (1984), Киру, дЧат'5
Іпптипоіоду, УМ. Н. Егеетап і Сотрапу Мем мок, М МУ (1992), і описані тут методи. Спорідненість можна легко визначити за допомогою звичайних методів, таких як рівноважний діаліз; за допомогою приладу Віасоге 2000, використовуючи загальні методи, запропоновані виробником; за допомогою радіоімунологічного аналізу з використанням міченого радіоактивним ізотопом цільового антигену або іншими методами, відомими фахівцям. Дані про спорідненість можна проаналізувати, наприклад, за допомогою методу зсаїснага еї аї,, Апп М.У. Асад. зсі, 51:660 бо (1949). Визначена спорідненість окремої взаємодії антитіло-антигсен може варіювати, якщо вимірювання проводилося за різних умов, наприклад, концентрації солі, рН. Таким чином, вимірювання спорідненості й інших параметрів зв'язування антигену, наприклад, Ко, ІСво, бажано проводяться за допомогою стандартизованих розчинів антитіла й антигену й стандартизованого буфера.
Унікальною властивістю антитіла запропонованого даним винаходом є здатність зв'язуватися із клаудином б на клітинній поверхні. Це продемонстровано за допомогою проточної цитометрії на клітинах, які експресують клаудин 6.
Для перевірки зв'язування моноклональних антитіл 3 живими клітинами, які експресують клаудини, використовували проточну цитометрію. Коротко, клітинні лінії, які експресують мембранозв'язані клаудини (вирощені за стандартних умов росту), змішуються з різними концентраціями антитіл в РВ5, що містить 2 95 інактивованої нагріванням ЕС5 і 0,1 95 МамМз при 4 "С протягом 30 хвилин. Після промивання клітини вступали в реакцію із вторинним антитілом, міченим флуоресцентною міткою за тих же самих умов, за яких проводилося фарбування первинного антитіла. Зразки досліджували методом БАС5З з використанням висвітлення й параметрів бічного світлорозсіювання для пропущення одиничних клітин, при цьому визначається зв'язування мічених антитіл.
Термін "зв'язування" відповідно до винаходу бажано має відношення до специфічного зв'язування, як визначено тут.
Термін "ізотип", як він використовується в описі, відноситься до класу антитіл (наприклад,
І9М або Ід 1), які кодуються генами константної області важкого ланцюга.
Вираз "перемикання ізотипу", як він використовується в описі, відноситься до явища, за допомогою якого клас або ізотип антитіла змінюється від одного класу Ід до одного з інших класів Ід.
Термін "природний", як він використовується в описі відносно до об'єкта, стосується тієї обставини, що об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, яка є присутньою в організмі (включаючи віруси), яка може бути виділена із природного джерела, і яка не була навмисно модифікована людиною в лабораторії, є природною.
Термін "перегрупована", як він використовується в описі, відноситься до конфігурації
Зо важкого ланцюга або легкого ланцюга імуноглобулінового локусу, у якому М сегмент розташовується безпосередньо поруч із Ю-) або у) сегментом у конформації, яка кодує фактично повний МН або МІ. домен, відповідно. Перегрупований генний локус імуноглобуліну (антитіла) може бути встановлений шляхом порівняння із зародковою ДНК; перегрупований локус буде мати, щонайменше, один рекомбінований семичленний/дев'ятичленний гомологічний елемент.
Термін "перегрупована" або "зародкова конфігурація", як він використовується в описі, у відношенні М сегмента стосується конфігурації, у якій М сегмент є нерекомбінованим для того, щоб знаходитися безпосередньо поруч із О або у сегментом.
Термін "нуклеїновокислотна молекула", як він використовується в описі, включає молекули
ДНК і молекули РНК. Нуклеїновокислотна молекула може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але бажано є дволанцюговою ДНК. Нуклеїновокислотна молекула може використовуватися для введення в клітину, тобто трансфекцфії клітини, наприклад, у формі
РНК, яку можна одержати за допомогою транскрипції іп міго з матриці ДНК. Більше того, РНК може бути модифікована перед використанням шляхом стабілізації послідовності, кепінгу й поліаденілювання.
Нуклеїнові кислоти, описані згідно з винаходом, бажано є ізольованими. Термін "ізольована нуклеїнова кислота" означає згідно з винаходом, що нуклеїнова кислота була (ї) ампліфікована іп міо, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), (ії) отримана рекомбінантно шляхом клонування, (ії) очищена, наприклад, за допомогою розщеплення й гель- електрофоретичного фракціонування або (ім) синтезована, наприклад, за допомогою хімічного синтезу. Ізольована нуклеїнова кислота є нуклесновою кислотою, яка є доступною для маніпуляцій за допомогою технології рекомбінантних ДНК.
Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом присутні окремо або в комбінації з іншими нуклеїновими кислотами, які можуть бути гомологічними або гетерологічними. У кращих варіантах здійснення нуклеїнові кислоти є функціонально пов'язаними з послідовностями, які контролюють експресію, які можуть бути гомологічними або гетерологічними у відношенні зазначеної нуклеїнової кислоти, при цьому термін "гомологічні" означає, що нуклеїнова кислота також є функціонально зв'язаною з послідовністю, яка природно контролює експресію, а термін "гетерологічні" означає, що нуклеїнова кислота не є функціонально зв'язаною з послідовністю, яка природно контролює експресію. 60 Нуклеїнова кислота, така як нуклеїнова кислота, що експресує РНК і/або білок або пептид, і послідовність, яка контролює експресію, є "функціонально" зв'язаними один з одним, якщо вони ковалентно зв'язані один з одним таким чином, що експресія або транскрипція зазначеної нуклеїнової кислоти перебуває під контролем або під впливом зазначеної послідовності, що контролює експресію. Якщо нуклеїнова кислота повинна транслюватися у функціональний білок, тоді, за наявності послідовності, що контролює експресію, пов'язаної з кодуючою послідовністю, індукція зазначеної послідовності, що контролює експресію, викликає транскрипцію зазначеної нуклеїнової кислоти, не викликаючи зрушення рамки в кодуючій послідовності, або зазначена кодуючи послідовність не здатна транслюватися в бажаний білок або пептид.
Термін "послідовність, яка контролює експресію" включає згідно з винаходом промотори, ділянки зв'язування рибосом, енхансери та інші елементи контролю, які регулюють транскрипцію гена або трансляцію мРНК. В окремих варіантах здійснення винаходу послідовності, які контролюють експресію, можуть регулюватися. Точна структура послідовності, яка контролює експресію, може змінюватися залежно від виду або типу клітин, але як правило, містить 5'-нсетранскибовану й 5'- і 3'-нетрансльовані послідовності, які задіяні в ініціації транскрипції й трансляції, відповідно, такі як ТАТА-бокс, кепінг-послідовність, СААТ послідовність тощо. Конкретніше, 5'-нетранскибовані послідовності, які контролюють експресію, містять промоторну область, яка включає промоторну послідовність для транскрипційного контролю функціонально зв'язаної нуклеїновой кислоти. Послідовності, які контролюють експресію, також можуть містити енхансерні послідовності або послідовності активації.
Згідно з винаходом термін "промотор"' або "промоторна область" має відношення до нуклеїновокислотної послідовності, яка розташовується вище (ирзігеат) (5) відносно експресованої нуклеїновокислотної послідовності й контролює експресію послідовності, забезпечуючи розпізнавання й сайт зв'язування для РНК-полімерази. "Промоторна область" може включати додатковий сайт розпізнавання й зв'язування для додаткових факторів, які залучені в процес регуляції транскрипції гена. Промотор може контролювати транскрипцію прокаріотичного або еукаріотичного гена. Крім того, промотор може бути "ІіІндуцибельним" і може ініціювати транскрипцію у відповідь на індукуючий агент або може бути "конститутивним", якщо транскрипція не контролюється індукуючим агентом. Ген, який перебуває під контролем
Зо індуцибельного промотору, не експресується або експресується тільки в невеликому ступені, якщо відсутній індукуючий агент. У присутності індукуючого агента включається ген або збільшується рівень транскрипції. Загалом, це опосередковує зв'язуванням специфічного фактора транскрипції.
Промотори, які згідно з винаходом є кращими, включають промотори для 5Рб, ТЗ і 77 полімерази, людський Об РНК промотор, СММ-промотор та їх штучні гібридні промотори (наприклад, СМУ), де частина або частини з'єднуються із частиною або частинами промоторів генів інших клітинних білків, наприклад, таких як людський САРОН (гліцеральдегід-3-фосфат- дегідрогеназа), і включаючи або не включаючи додатковий інтрон(и).
Згідно з винаходом термін "експресія" використовується в його найбільш загальному значенні й включає продукування РНК або РНК і білка/пептиду. Він також включає часткову експресію нуклеїнових кислот. Більше того, експресія може здійснюватися тимчасово або стабільно. Згідно з винаходом термін експресія також включає "аберантну експресію" або "аномальну експресію". "Аберантна експресія" або "аномальна експресія" означає згідно з винаходом, що експресія є зміненою, бажано підвищеною, у порівнянні з еталонною, бажано в порівнянні зі станом у неонкогенній нормальній клітині або у здорового індивідуума. Збільшення експресії розуміють як збільшення, щонайменше, на 10 95, зокрема, щонайменше, на 20 95, щонайменше, на 50 95 або, щонайменше, на 100 95. В одному варіанті здійснення експресії виявляється тільки в порушеній хворобою тканині, у той час як експресія в здоровій тканині пригнічується.
У кращому варіанті здійснення нуклеїновокислотна молекула згідно з винаходом присутня у векторі, у відповідних випадках із промотором, який контролює експресію нуклеїнової кислоти.
Термін "вектор" використовується тут у його самому загальному значенні й включає будь-який проміжний переносник нуклеїнової кислоти, який дає можливість зазначеній нуклеїновій кислоті, наприклад, бути внесеній в прокаріотичні й/або еукаріотичні клітини й, за необхідності, інтегруватися в геном. Вектори цього сорту бажано є реплікованими й/або експресуються в клітинах. Вектори включають плазміди, фагміди, бактеріофаги або вірусні геноми. Термін "плазміда" як він використовується в описі, загалом, має відношення до конструкта екстрахромосомного генетичного матеріалу, звичайно дуплекса кільцевої ДНК, який може реплікуватися незалежно від хромосомної ДНК. бо Як вектор для експресії антитіла може використовуватися або тип вектора, у якому важкий ланцюг антитіла й легкий ланцюг присутні в різних векторах, або тип вектора, у якому важкий ланцюг і легкий ланцюг присутні в тому самому векторі.
Запропоновану в описі ідею у відношенні нуклегновокислотної і амінокислотної послідовностей, наприклад, зазначених у списку послідовностей, слід також відносити до модифікацій (тобто варіантів) зазначених специфічних послідовностей, які дають у результаті послідовності, які Є функціонально еквівалентними до зазначених специфічних послідовностей, наприклад, амінокислотних послідовностей, які проявляють властивості, ідентичні або подібні до властивостей специфічних амінокислотних послідовностей і нуклеїновокислотні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності, які проявляють властивості, ідентичні або подібні до властивостей амінокислотних послідовностей, які кодуються специфічними нуклеїновокислотними послідовностями. Однією важливою властивістю є збереження зв'язування антитіла з його мішенню або забезпечення ефекторних функцій антитіла, таких як
СОС і/або АОСС. Бажано послідовність, модифікована у відношенні специфічної послідовності, коли вона заміняє специфічну послідовність в антитілі, зберігає зв'язування зазначеного антитіла з мішенню й бажано функції зазначеного антитіла, як описано тут.
Подібним чином, наведену тут ідею відносно специфічних антитіл або гібридом, які продукують специфічні антитіла, слід тлумачити таким чином, щоб також відносити її до антитіла, що характеризується амінокислотною послідовністю й/або нуклеїновокислотною послідовністю, яка є модифікованою в порівнянні з амінокислотною послідовністю й/або нуклеїновокислотною послідовністю специфічних антитіл, але є функціонально еквівалентною.
Однією важливою властивістю є збереження зв'язування антитіла з його мішенню або здійснення ефекторних функцій антитіла. Бажано послідовність, модифікована у відношенні специфічної послідовності, коли вона заміняє специфічну послідовність в антитілі, зберігає зв'язування зазначеного антитіла з мішенню й бажано функції зазначеного антитіла, як описано тут, наприклад, СОС-опосередкований лізис або АОСС-опосередкований лізис.
Зокрема, фахівцям ясно, що послідовності СОК, гіперваріабельні й варіабельні області можуть бути модифіковані без втрати здатності зв'язуватися з мішенню. Наприклад, СОБК- ділянки будуть або ідентичними або високогомологічними до областей антитіл, перерахованих тут. Під "високогомологічною" мають на увазі, що в СОК може бути зроблено від 1 до 5, бажано
Ко) від 1 до 4, наприклад, від 1 до З або 1 або 2 заміни. На додачу до цього гіперваріабельні й варіабельні ділянки можуть бути модифіковані таким чином, щоб вони демонстрували значну гомологію з ділянками антитіл, спеціально розкритих тут.
Слід розуміти, що описані тут специфічні нуклеїнові кислоти також включають нуклеїнові кислоти, модифіковані заради оптимізації частоти використання кодону в окремій клітині-хазяїні або організмі. Відмінності в частоті використання кодону між організмами може приводити до ряду проблем, які стосуються гетерологічної генної експресії. Оптимізація кодону зміною одного або більше нуклеотидів первісної послідовності може дати в результаті оптимізацію експресії нуклеїнової кислоти, зокрема, оптимізацію ефективності трансляції, у гомологічному або гетерологічному хазяїні, у якому повинна експресуватися зазначена нуклеїнова кислота.
Згідно з винаходом варіант, похідне, модифікована форма або фрагмент нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотна послідовність або пептид бажано має функціональну властивість нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотної послідовності або пептиду, відповідно, з якого він був отриманий. Такі функціональні властивості включають взаємодію з або зв'язування з іншими молекулами. В одному варіанті здійснення варіант, похідне, модифікована форма або фрагмент нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотна послідовність або пептид є імунологічно еквівалентним до нуклеїновокислотної послідовності, амінокислотної послідовності або пептиду, відповідно, з якого він був отриманий.
Бажано ступінь ідентичності між специфічною нуклеїновокислотною послідовністю й нуклеїновокислотною послідовністю, яка є модифікованою у відношенні або яка є варіантом зазначеної специфічної нуклеїновокислотної послідовності, становить, щонайменше, 70 95, бажано, щонайменше, 75 95, більш бажано, щонайменше, 80 95, ще краще, щонайменше, 90 95 або найкраще, щонайменше, 95 95, 9695, 97 95, 98595 або 99965. Що стосується СІ ОМ 6- нуклеїновокислотних варіантів, то ступінь ідентичності бажано становить, щонайменше, близько 300, щонайменше, близько 400, щонайменше, близько 450, щонайменше, близько 500, щонайменше, близько 550, щонайменше, близько 600 або, щонайменше, близько 630 нуклеотидів. У кращих варіантах здійснення ступінь ідентичності дається для повної довжини еталонної нуклеїновокислотної послідовності, наприклад, нуклеїновокислотних послідовностей, наведених у переліку послідовностей. Бажано дві послідовності є здатними гібридизуватися й утворювати стабільний дуплекс один з одним, коли гібридизацію бажано проводять за умов, які бо забезпечують специфічну гібридизацію між полінуклеотидами (жорсткі умови). Жорсткі умови описуються, наприклад, в МоїІесціаг Сіопіпд: А І арогаїгу Мапиаї, У. затьгоок еї а!., Еайогв, 2па
Еайоп, Соїй бргіпд Нагбог І абогагогу рге55, Соїй Зргіпд Нагброг, Мем/ МогК, 1989 або Сигтепі
Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Е.М. А!йзибеї еї аї., Едйог5, Чопп УМіеу б 5Ооп5, Іпс., Мем/ МогкК і стосуються, наприклад, гібридизації при 65 "С у буфері для гібридизації (3,5 х 55С, 0,02 95 фіколу, 0,02 95 полівінілпіролідону, 0,02 96 бичачого сироваткового альбуміну, 2,5 мМ Мапй2РО4 (ри 7), 0,595 505, 2 мМ ЕОТА). 55С є 0,15М хлоридом натрію/0,15М цитратом натрію, рН 7.
Після гібридизації мембрану, на яку була перенесена ДНК, промивають, наприклад, в 2 х 550 за кімнатної температури, а потім в 0,1-0,5 х 55С/0,1 х 505 за температур до 68 760.
Термін "варіант" згідно з винаходом також включає мутанти, сплайс-варіанти, конформації, ізоформи, алельні варіанти, видові варіанти й видові гомологи, зокрема ті, які присутні від природи. Алельний варіант має відношення до зміни в нормальній послідовності гена, значення якої часто є неясним. Повне генетичне секвенування часто встановлює численні алельні варіанти для даного гена. Видовий гомолог є нуклеїновою кислотою або амінокислотною послідовністю, джерелом походження яких є інші види, ніж у нуклеїновокислотної або амінокислотної послідовності.
Для цілей даного винаходу "варіанти" амінокислотної послідовності включають варіанти амінокислотних вставок, варіанти амінокислотних добавок, варіанти амінокислотних делецій і/або варіанти амінокислотних замін. Варіанти амінокислотних делецій, що містять делецію на
М-кінці й/або С-кінці білка, також називаються М-кінцевими й/або С-кінцевими укороченими варіантами.
Варіанти амінокислотних вставок включають вставки однієї або двох або більше амінокислот в окрему амінокислотну послідовність. У випадку варіантів, які мають вставку, амінокислотної послідовності в окрему ділянку амінокислотної послідовності вставляється один або більше амінокислотних залишків, хоча при відповідному скринінгу отриманого продукту також можна виявити випадкові вставки.
Варіанти амінокислотних добавок включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття однієї або більше амінокислот, такі як 1, 2, 3, 5,10, 20, 30, 50 або більше амінокислот.
Варіанти амінокислотних делецій характеризуються видаленням однієї або більше амінокислот з послідовності, наприклад, видаленням 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше
Зо амінокислот. Делеції можуть відбуватися в будь-якому місці білка.
Варіанти амінокислотних замін характеризуються, щонайменше, видаленням одного залишку в послідовності й вставкою іншого залишку на його місце. Перевага надається модифікаціям, які перебувають у положеннях амінокислотної послідовності, які не є консервативними між гомологічними білками або пептидами, і/або замінам амінокислот на інші амінокислоти, які мають подібні властивості. Бажано амінокислотні зміни в білкових варіантах є консервативними амінокислотними змінами, тобто замінами так само заряджених або незаряджених амінокислот. Консервативна зміна амінокислоти стосується заміни однієї із родини амінокислот, які є спорідненими за структурою бічного ланцюга. Природні амінокислоти підрозділяються на чотири родини: кислі (аспартат, глутамат), основні (лізин, аргінін, гістидин), неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин) амінокислоти. Фенілаланін, триптофан і тирозин іноді класифікуються разом як ароматичні амінокислоти.
Бажано ступінь подібності, краще ідентичності між специфічною амінокислотною послідовністю й амінокислотною послідовністю, яка є модифікованою у відношенні до або яка є варіантом зазначеної специфічної амінокислотної послідовності, наприклад, між амінокислотними послідовностями, що демонструють істотну гомологію, буде становити, щонайменше, 70 95, бажано, щонайменше, 80 95, ще краще, щонайменше, 90 95 або найкраще, щонайменше, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95. Ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться для амінокислотної області, яка становить, щонайменше, близько 10 95, щонайменше, близько 2095, щонайменше, близько 3095, щонайменше, близько 40 9, щонайменше, близько 5095, щонайменше, близько 6095, щонайменше, близько 70 95, щонайменше, близько 80 96, щонайменше, близько 90 95 або близько 100 95 повної довжини еталонної амінокислотної послідовності. Наприклад, якщо еталонна амінокислотна послідовність складається з 200 амінокислот, ступінь подібності або ідентичності бажано приводиться, щонайменше, приблизно для 20, щонайменше, приблизно 40, щонайменше, приблизно 60, щонайменше, приблизно 80, щонайменше, приблизно 100, щонайменше, приблизно 120, щонайменше, приблизно 140, щонайменше, приблизно 160, щонайменше, приблизно 180 або приблизно для 200 амінокислот, бажано неперервних амінокислот. Що 60 стосується СОМ б-поліпептидних варіантів, ступінь подібності або ідентичність приводиться бажано для ділянки, щонайменше, близько 100, щонайменше, близько 120, щонайменше, близько 140, щонайменше, близько 160, щонайменше, близько 180, щонайменше, близько 200 або, щонайменше, близько 210 амінокислот. У кращих варіантах здійснення ступінь подібності або ідентичності приводиться для повної довжини еталонної амінокислотної послідовності, наприклад, амінокислотних послідовностей, наведених у списку послідовностей. Вирівнювання для визначення подібності послідовності, бажано ідентичності послідовності, можна виконати відомими в даній галузі техніки способами, бажано з використанням найкращого способу вирівнювання послідовності, наприклад, АЇдп з використанням стандартних налаштувань, бажано ЕМВО55:пеедіє, Матриця: Віозитб2, Штраф за відкриття пробілу 10.0, Штраф за продовження пробілу 0.5. "Подібність послідовності" указує відсоток амінокислот, які або є ідентичними або які представляють консервативні амінокислотні заміни. "Ідентичність послідовності" між двома поліпептидними або нуклеїновокислотними послідовностями вказує відсоток амінокислот або нуклеотидів, які є ідентичними між послідовностями. "Відсоток ідентичності" отримують після виконання оптимального вирівнювання, цей відсоток є чисто статистичним, а відмінності між двома послідовностями розподіляються випадково і вздовж повної їх довжини. Порівняння послідовності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями зазвичай здійснюється шляхом порівняння /- цих послідовностей після їх оптимального вирівнювання, вказане порівняння проводиться за допомогою сегменту або "вікна порівняння" для того, щоб встановити і порівняти локальні області схожості послідовності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, окрім способу вручну, за допомогою алгоритму локальної гомології тій і
Умаїегтап, 1981, Ааз Арр. маїйй. 2, 482, за допомогою алгоритму локальної гомології МеааІетаг і
Уучп5сп, 1970, 9. Мої. Віої. 48, 443, за допомогою методу пошуку схожості Реагхоп апа Гіртап, 1988, Ргос. Май Асай. Зсі. ОБА 85, 2444, або за допомогою комп'ютерних програм із застосуванням цих алгоритмів (ЗАР, ВЕ5ТРІТ, ЕАБЗТА, ВІАБТ Р, ВІАБТ М їі ТЕА5ТА іп
МУівсопвіп Сієпеїйс5 боймаге РасКаде, Сепеїйсз Сотриїєг Стор, 575 Зсієпсе Огіме, Мадізоп,
Мів.).
Відсоток ідентичності обчислюється шляхом визначення числа ідентичних положень між двома послідовностями при порівнянні, діленням цього числа на число порівнюваних положень і множенням отриманого результату на 100 для того, щоб отримати відсоток ідентичності між цими двома послідовностями. "Консервативні заміни" можуть бути зроблені, наприклад, на основі схожості полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності і/або аліфатичної природи залучених залишків. Наприклад, (а) неполярні (гідрофобні) амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін; (б) полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін; (с) позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають аргінін, лізин і гістидин; їі (4) негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Як правило, заміни можуть бути зроблені в групах (а) -(4). Крім того, гліцин і пролін можуть бути заміщені один іншим, виходячи з їх здатності розривати а-спіралі. Деякі кращі заміни можуть бути зроблені серед наступних груп: () З іт; (і) Рі с; і (ії) А, М, І їі І. Якщо генетичний код відомий, за допомогою технології рекомбінантних і синтетичних ДНК кваліфікований учений легко може створити ДНК, яка кодує консервативні амінокислотні варіанти.
Даний винахід включає антитіла, в яких можуть бути зроблені зміни в Ес-ділянці для зміни функціональних і фармакокінетичних властивостей антитіл. Такі зміни можуть привести до зменшення або збільшення Сід-зв'язування і СОС або ЕсукК-зв'язування і АОСС. Заміни можуть бути зроблені, наприклад, в одному або більше амінокислотних залишках константної області важкого ланцюга, тим самим викликаючи зміну ефекторної функції, і одночасно зберігаючи здатність зв'язуватися з антигеном в порівнянні з модифікованим антитілом, див. 05 5,624,821 і 5 5,648,260.
Час напівжиття антитіла іп мімо може бути покращений шляхом модифікації епітопу рятувального (заіїмаде) рецептора константного домену Ід або Ід-подобного константного домену, так що молекула не містить інтактний домен або інтактну Ід Ес СН2 ділянку, див. О5 6,121,022 ії О5 6,194,551. Час напівжиття іп мімо може бути додатково збільшений за допомогою здійснення мутацій на Ес ділянці, наприклад, шляхом заміни треоніну на лейцин в положенні 252, шляхом заміни треоніну на серин в положенні 254, або шляхом заміни треоніну на фенілаланін в положенні 256, див. 05 6,27,375.
Більше того, з метою зміни ефекторної функції антитіл може бути модифікований бо глікозильований варіант антитіл. Наприклад, антитіла можуть експресуватися в трансфектомі,
яка не приєднує фукозну одиницю, зазвичай приєднану до Азвп в положенні 297 Ес-ділянки, для того, щоб підсилити спорідненість Ес- ділянки із Ес-рецептором, яка, у свою чергу, приводитиме до підвищеної АОСС антитіл у присутності МК-клітин, див. Зпієїй еї а!І. (2002) УВС, 277: 26733.
Більше того, галактозилювання може бути зроблене з метою модифікувати СОС.
Альтернативно, в іншому варіанті здійснення мутації можуть бути введені випадково уздовж всієї або частини послідовності, яка кодує анти-СОМб антитіло, наприклад, за допомогою насичу вального мутагенезу і може бути проведений скринінг отриманих модифікованих анти-
СОМ антитіл відносно активності зв'язування.
Згідно винаходу термін "клітина" або "клітина-господар" бажано має відношення до інтактної клітини, тобто клітини з інтактною мембраною, яка не вивільняє нормальні внутрішньоклітинні компоненти, такі як ферменти, органели або генетичний матеріал. Інтактна клітина бажано є живою клітиною, тобто живою клітиною, здатною виконувати свої нормальні метаболічні функції. Бажано вказаний термін згідно винаходу має відношення до будь-якої клітини, яка може бути трансформована або трансфікована екзогенною нуклеїновою кислотою. Термін "клітина" включає згідно винаходу прокаріотичні клітини (наприклад, Е. соїї) або еукаріотичні клітини (наприклад, дендритні клітини, В-клітини, СНО клітини, СО клітини, К562 клітини, НЕК293 клітини, клітини НЕГА, дріжджові клітини і клітини комах). Усередині клітини можна виявити екзогенну нуклеїнову кислоту (ї) окремо як таку у вільно диспергованому вигляді, (ії) введену в рекомбінантний вектор або (ії) інтегровану в геном клітини-господаря або мітохондріальну ДНК.
Особливо бажаними є клітини ссавців, наприклад, клітини людини, мишей, хом'яків, свиней, кіз і приматів. Клітини можуть бути отримані з цілого ряду типів тканин і включають первинні клітини і клітинні лінії. Конкретні приклади включають кератиноцити, лейкоцити периферійної крові, стволові клітини кісткового мозку і ембріональні стволові клітини. У додаткових варіантах здійснення клітина є антиген-презентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною, моноцитом або макрофагом. Термін "клітина-господар" як він використовується в описі бажано призначається для вказування клітини, в яку може бути введений рекомбінантний вектор експресії.
Клітина, яка містить нуклеїновокислотну молекулу, бажано експресує пептид або білок, закодований нуклеїновою кислотою.
Термін "трансгенна тварина" відноситься до тварини, яка має геном, який містить один або більше трансгенів, бажано трансгенів важкого і/або легкого ланцюга, або трансхромосом (або інтегрованих або неінтегрованих в природну ДНК генома тварини), бажано здатних експресувати трансгени. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген людського легкого ланцюга і або трансген людського важкого ланцюга або трансхромосому людського важкого ланцюга, так що миша продукує людські анти-СІ ОМ антитіла, коли вона імунізована СІ ОМб- антигеном і/або клітинами, які експресують СІ ОМб. Трансген людського важкого ланцюга може бути інтегрований в хромосомну ДНК миші, як у випадку трансгенної миші, наприклад, НИМАБ миші, наприклад НСо7 або НсСої2 миші, або трансген людського важкого ланцюга може бути збережений екстрахромосомно, як у випадку трансхромосомних (наприклад, КМ) мишей, як описано в МО 02/43478. Такі трансгенні і трансхромосомні миші можуть бути здатні продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до СІ ОМб (наприклад, дос, ІдА і/або ІДЕ) при проведенні М-О-.) рекомбінації і перемикання ізотипу.
Термін "зменшити" або "інгібувати", як він використовується в описі, означає здатність викликати повне зменшення, бажано на 5 95 або більше, 10 95 або більше, 20 95 або більше, краще 50 95 або більше і найкраще на 75 95 або більше рівня, наприклад, рівня проліферації клітин. Термін "інгібувати" або подібні вирази включають повне або практично повне інгібування, тобто зменшення до нуля або практично до нуля.
Такі терміни як "збільшення" або "посилення" переважно відносяться до збільшення або посилення, щонайменше, приблизно на 1095, бажано, щонайменше, на 20 95, бажано, щонайменше, на 30 95, краще, щонайменше, на 40 95, краще, щонайменше, на 50 95, ще краще, щонайменше, на 8095 і найкраще, щонайменше, на 100 95. Ці терміни також можуть мати відношення до обставин, за яких під час початку відліку (у точці нуль) не існує помітного сигналу відносно певного з'єднання або умови, а в певний момент часу, пізніше, ніж початок відліку, є помітний сигнал або умова.
Термін "імунологічно еквівалентний" означає, що імунологічно еквівалентна молекула, наприклад, імунологічно еквівалентна амінокислотна послідовність, проявляє однакові або в основному однакові імунологічні властивості і/або має однаковий або в основному однаковий імунологічний вплив, наприклад, відносно типу імунологічної дії, такої як індукція гуморальної іабо клітинної імунної відповіді, сили і/або тривалості індукованої імунної реакції або бо специфічності імунної реакції. У контексті даного винаходу термін "імунологічно еквівалентний"
Зо переважно використовується відносно імунологічних дій або властивостей пептиду або пептидного варіанту, використаного для імунізації. Конкретною імунологічною властивістю є здатність зв'язуватися з антитілами і, якщо буде потрібно, викликати імунну відповідь, бажано шляхом стимулювання продукування антитіл. Наприклад, амінокислотна послідовність є імунологічно еквівалентною до еталонної амінокислотної послідовності, якщо вказана амінокислотна послідовність при контакті з імунною системою суб'єкта викликає імунну реакцію, бажано продукування антитіл, які проявляють специфічність вступу в реакцію з еталонною амінокислотною послідовністю, такою як еталонна амінокислотна послідовність, яка утворює частини СІ ОМб.
Термін "імунні ефекторні функції" в контексті даного винаходу включає будь-які функції, опосередковані компонентами імунної системи, які призводять до інгібування зростання пухлини і/або інгібуванню розвитку пухлини, включаючи інгібування поширення пухлини і метастазування. Бажано імунні ефекторні функції призводять до знищення клітин пухлини.
Бажано імунні ефекторні функції в контексті даного винаходу є антитіло-опосредованими ефекторними функціями. Такі функції включають комплементзалежну цитотоксичність (СОС), антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС), індукцію апоптозу в клітинах, які несуть асоційований з пухлиною антиген, наприклад, шляхом з'єднання антитіла з поверхнею антигену, іабо інгібування проліферації клітин, які несуть асоційований з пухлиною антиген, бажано
АрСС і/або СОС. Таким чином, антитіла, здатні опосередкувати один або більше імунних ефекторних функцій бажано є здатними опосередкувати знищення клітин, викликаючи СОС- опосередкований лізис, АЮСС-опосередкований лізис, апоптоз, гомотипічну адгезію і/або фагоцитоз, бажано викликаючи СОС-опосередкований лізис і//"або АОСС-опосередкований лізис.
Крім того, антитіла можуть діяти просто шляхом зв'язування з пухлинно-асоційованими антигенами на поверхні пухлинної клітини. Наприклад, антитіла можуть блокувати функцію антигену, який асоціюється з пухлиною, або викликати апоптоз тільки шляхом зв'язування з пухлинно-асоційованим антигеном на поверхні пухлинної клітини.
Докладний опис винаходу
Механізми дії тАр
Не дивлячись на те, що наступний опис представляє аналіз механізму, який лежить в основі терапевтичної ефективності антитіл запропонованих даним винаходом, він не повинен розглядатися як такий, що обмежує винахід яким би то не було чином.
Описані тут антитіла можуть взаємодіяти з компонентами імунної системи, бажано через
АрСС або СОС. Антитіла запропоновані винаходом також можуть використовуватися для "цільового навантаження" (наприклад, радіоіїзотопами, лікарськими засобами або токсинами),
З5 для того, щоб безпосередньо знищувати пухлинні клітини, або можуть використовуватися синергійно разом з традиційними засобами хіміотерапії, впливаючи на пухлини за допомогою додаткових механізмів дії, включаючи протипухлинні імунні відповіді, які можуть бути порушені внаслідок побічних цитотоксичних ефектів препаратів хіміотерапій на Т-лімфоцити. Проте антитіла запропоновані винаходом також можуть діяти просто шляхом зв'язування з СІ ОМб на клітинній поверхні, таким чином, наприклад, блокуючи проліферацію клітин.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність
АрСС є здатністю ефекторних клітин (зокрема лімфоцитів) знищувати клітини, при цьому для функціонування лімфоцитів необхідно, щоб клітина-мішень була помічена антитілом.
Бажано АОСС спостерігається, коли антитіла зв'язуються з антигенами на пухлинних клітинах, а Ес-домени антитіл зв'язують Ес-рецептори (ЕСК) на поверхні імунних ефекторних клітин. Було встановлено декілька родин Ес-рецепторів, при цьому характерно, що специфічні популяції клітин експресують певні Ес-рецептори. АОСС можна розглядати як механізм прямої індукції руйнування (різного ступеню) пухлини, який приводить до презентації антигену та індукції Т-клітинних відповідей, направлених на пухлину. Бажано індукція АОСС іп мімо призводить до Т-клітинної відповіді, направленої на клітини пухлин і відповіді антитіл господаря.
Комплементзалежна цитотоксичність.
Іншим способом знищення клітин, який може бути опосередкований антитілами, є СОС.
Найефективнішим ізотипом для активації комплементу є (ЯМ. Також дуже ефективними при спрямовуванні СОС через класичний шлях активації комплементу є ІДсІ і ІдОеЗ3. Бажано, утворення комплексів антиген-антитіло в цьому каскаді призводить до розкриття численних місць зв'язування Сід в безпосередній близькості на СН2 доменах задіяних молекул антитіл, наприклад, молекул дсС (Сід є одним з трьох субкомпонентів комплементу СІ). Бажано ці розкриті місця зв'язування Сід перетворюють взаємодію Сід - дс до цього з низькою спорідненістю на спорідненість з високою авидністю, яка запускає каскад подій, які залучають 60 ряд інших білків комплементу, і призводить до протеолітичного вивільнення хемотаксичних/активуючих агентів ефекторних клітин СЗа і Сба. Бажано каскад комплементу закінчується утворенням мембрано-атакуючого комплексу, який створює пори в клітинній мембрані, які сприяють вільному проходженню води і розчинених речовин в клітини і з клітин.
Продукування антитіл
Антитіла запропоновані винаходом можна отримати за допомогою ряду методів, включаючи звичайну методику отримання моноклональних антитіл, наприклад, методом гібридизації стандартних соматичних клітин КопПіег і Міїбтеїп, Майшге 256: 495 (1975). Не дивлячись на те, що методи гібридизації соматичних клітин є бажаними, в принципі можна використовувати інші методи отримання моноклональних антитіл, наприклад, шляхом вірусної або онкогенної трансформації В-лімфоцитів, або методом фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл.
Бажаною тваринною системою для отримання гібридоми, яка секретує моноклональні антитіла, є мишача система. Отримання гібридоми в миші є загальноприйнятим методом.
Протоколи імунізації і методики виділення імунізованих спленоцитів для злиття добре відомі в даній галузі техніки. Клітини (наприклад, мишачі клітини мієломи), які зливаються і процедури злиття також добре відомі.
Іншими кращими тваринними системами для отримання гібридом, які секретують моноклональні антитіла, є щури або кролики (наприклад, система, описана в ЗріеКег-Ро!еї еї аї.,
Ргос. Май. Асай. сі. О.5.А. 92:9348 (1995), дивися також Козв5і еї аІ., Ат. У. Сііп. 35 Раїйої. 124:295(2005)).
У іншому кращому варіанті здійснення людські моноклональні антитіла, спрямовані до
СІГОМб, можна отримати за допомогою трансгенних або трансхромосомних мишей, які несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Ці трансгенні або трансхромосомні миші включають мишей, відомих як миші НиМАБб і миші КМ, відповідно, і разом згадуються в описі як "трансгенні миші". Отримання людських антитіл в таких трансгенних мишах можна здійснити, як детально описано для СО2О в М/О2004 035607
Іншою стратегією отримання моноклональних антитіл є пряме виділення генів, які кодують антитіла, з лімфоцитів, які продукують антитіла, наприклад, див. Варсоск еї єї!., 1996; А помеї! взігаїеду Тог депегаїйпа топосіопа! апіїродіє5 їїтот віпдіє, ізоїаїед Іутрпосуїез ргодисіпа апіїбоїе5
Зо ої деїпеа 5ігаїеду. Подробиці розробки рекомбінантних антитіл дивися також в УмеІ5спої і Кгашйв,
Весотбіпапі апіроде5 їог сапсег Шегару І5ВМ-0-89603-918-8 і Веппу К.С. Го Антитіло
Епдіпеегтіпд ІЗВМ 1-58829-092-1.
Імунізація
Для отримання антитіл до СІ ОМб, мишей можна імунізувати кон'югованими з носієм пептидами, отриманими з СІ ОМб-послідовності, препаратом, збагаченим рекомбінантно експресованим СІ ОМб-антигеном або його фрагментами і/або клітинами, які експресують
СІГОМб або його фрагменти, як описано. Альтернативно, мишей можна імунізувати ДНК, яка кодує людський повнорозмірний СІ ОМб або його фрагменти. У тому випадку, коли імунізація з використанням очищеного або збагаченого препарату антигену СГОМб не приводить до утворення антитіл, мишей також можна імунізувати клітинами, які експресують СІ ОМб, наприклад, клітинною лінією, щоб сприяти імунній відповіді.
Імунну відповідь можна контролювати впродовж виконання протоколу імунізації, відбираючи зразки плазми і сироватки з хвостової вени або ретроорбітально. Миші з достатнім титром анти-
СОМ імуноглобуліну можуть використовуватися для злиття. Мишей можна піддати стимуляції внутрішньочеревно і внутрішньовенно клітинами, які експресують СІ ОМб, і за 3-5 днів до забою і видалення селезінки для того, щоб збільшити швидкість секретування специфічних антитіл гібридомами.
Отримання гібридом, які продукують моноклональні антитіла
Для отримання гібридом, які продукують моноклональні антитіла до СІ ОМб, з лімфатичних вузлів або селезінки, отриманих від імунізованих мишей, можуть бути виділені клітини і злиті з відповідною імморталізованою клітинною лінією, наприклад, лінією клітин мієломи миші. Потім можна відібрати отримані гібридоми із продукування антиген-специфічних антитіл. У такому випадку за допомогою методу ЕГІЗА можна відібрати окремі комірки з гібридомами, які секретують антитіла. За допомогою імунофлуоресценції і ЕАС5-аналізу з використанням клітин, які експресують СІ ОМб, можна встановити антитіла із специфічністю до СІ ОМб. Гібридоми, які секретують антитіла, можна знов висіяти, провести відбір і позитивні за анти-СІОМб моноклональними антитілами можна субклонувати за допомогою серійного розведення. Потім стабільні субклони культивують іп міго в середовищі для культури тканини, щоб отримати і охарактеризувати антитіла. бо Отримання трансфектом, які продукують моноклональні антитіла
Антитіла запропоновані винаходом також можна отримати в клітинах-господарях, таких як, трансфектоми, використовуючи, наприклад, комбінацію методів рекомбінантних ДНК і методів трансфекції генів, добре відомих в даній галузі техніки (Моїтізоп, 5. (1985) Зсіепсе 229: 1202).
Наприклад, в одному варіанті здійснення гени(ген), які представляють інтерес, наприклад, гени антитіл, можуть лігувати у вектор експресії, такий як еукаріотична експресуюча плазміда, яка, наприклад, використовується системою експресії гена 55, розкритою в УМО 87/04462, МО 89/01036 і ЕР 338 841, або інші системи експресії, добре відомі в даній галузі. Очищена плазміда з клонованими генами антитіла може бути введена в еукаріотичну клітину-господаря, таку як СНО клітини, М5/0О клітини, НЕК293Т клітини або НЕК293 клітини або альтернативно інші еукаріотичні клітини, подібні до клітин рослин, грибів або дріжджів. Методами, які використовується для введення цих генів можуть бути методи, описані в даній галузі техніки, такі як електропорація, ліпофектин, ліпофектамін або інші. Після введення цих генів антитіл в клітини-господарі, клітини, які експресують антитіло можуть бути пізнані і відібрані. Ці клітини є трансфектомами, які потім можна ампліфікувати і масштабувати для продукування антитіл.
Рекомбінантні антитіла можуть бути ізольовані і очищені з цих культуральних супернатантів і/або клітин.
Альтернативно, клоновані гени антитіла можуть бути експресованими в інші системи експресії, включаючи прокаріотичні клітини, такі як мікроорганізми, наприклад, Е. соїї. Більше того, антитіла можуть продукуватися в трансгенних організмах, які не є людиною, і бути присутніми, наприклад, в молоці овець і кроликів або в яйцях курей, або в трансгенних рослинах; дивися, наприклад, Мепта, К., еї аї. (1998) 9. Іттипої. Ме. 216: 165-181; РоПоскК, єї а!. (1999) 3. Іттипої. Меїй. 231: 147-157; і Різспег, К., еї аї. (1999) ВіоїЇ. Спет. 380: 825-839.
Використання часткових послідовностей антитіл для експресії інтактних антитіл (тобто гуманізація і химеризація). а) Химеризація
Мишачі моноклональні антитіла можуть використовуватися як терапевтичні антитіла для людей, у тому випадку, коли до них прикріпляється токсин, або коли їх мітять радіоактивними ізотопами. При повторному застосуванні немічені мишачі антитіла є високо імуногенними для людини, що приводить до зменшення терапевтичного ефекту. Основна імуногенність
Зо опосередкована константними областями важкого ланцюга. Імуногенність мишачих антитіл у людини можна зменшити або повністю її уникнути, якщо відповідні антитіла зробити химерними або гуманізованими. Химерні антитіла є антитілами, різні частини яких походять від різних видів тварин, наприклад, антитіла мають варіабельну область, отриману від мишачого антитіла і константну область людського імуноглобуліну. Химерізація антитіл досягається з'єднанням варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів мишачих антитіл з людською константною областю важкого і легкого ланцюга (наприклад, як описано Кгацз еї аї., у Меїподз іп МоїЇІесшіаг
Віооду зепез, Весотрбіпапі апіродієз ог сапсег Шегару ІЗВІМ-0-89603-918-8). У бажаному варіанті здійснення химерні антитіла отримують з'єднанням людської константної області каппа- легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. У бажаному варіанті здійснення хімерні антитіла отримують з'єднанням людської константної області лямбда-легкого ланцюга з мишачою варіабельною областю легкого ланцюга. Кращими константними областями важкого ланцюга для отримання химерних антитіл є ІдС1, ІдсЗ ії ІдсС4. Іншими кращими константними областями важкого ланцюга для отримання химерних антитіл є Ідс2, ІдА, дО і
І9М. р) Гуманізація
Антитіла взаємодіють з цільовими антигенами бажано через амінокислотні залишки, розташовані в шести гіперваріабельних ділянках (СОВА) важкого і легкого ланцюга. З цієї причини амінокислотні послідовності в СОВА є більш різними між окремими антитілами, ніж послідовності зовні СОВ. Оскільки СОВ-послідовності відповідають за більшість взаємодій антитіло-антиген, є можливою експресія рекомбінантних антитіл, які наслідують властивостям специфічних природних антитіл, шляхом конструювання векторів експресії, які включають СОВ- послідовності від специфічних природних антитіл, пересаджені на каркасні послідовності від іншого антитіла з іншими властивостями (див., наприклад, Кіесптапп, І, еї а. (1998) Майшге 332: 323-327; допев, Р. єї аї. (1986) Майшге 321: 522-525; і Оцееп, З еї аї. (1989) Ргос. Маї! Асай. 5сі. 0.
З. А. 86: 10029-10033). Такі каркасні послідовності можна отримати з публічних баз даної ДНК, яка включає зародкові послідовності генів антитіл. Ці зародкові послідовності відрізнятимуться від зрілих послідовностей генів антитіл, оскільки вони не включають повністю зібрані мінливі гени, які формуються при М (0) У з'єднанні під час дозрівання В-клітини. Зародкові генні послідовності також відрізнятимуться від послідовностей високоафінного антитіла з вторинного бо репертуару окремою рівномірною варіабельною областю. Наприклад, соматичні мутації є відносно рідкісними в амінокінцевій частині каркасної ділянки 1 і в карбоксикінцевій частині каркасної ділянки 4. Більше того, багато соматичних мутацій значно не змінюють зв'язуючі властивості антитіла. З цієї причини, необхідно отримати повну послідовність ДНК окремого антитіла, для того, щоб наново створити (відновити) інтактне рекомбінантне антитіло, яке має властивості, схожі з властивостями первинного антитіла (див. УМО 99/45962). З цією метою, як правило, достатньо часткових послідовностей важкого і легкого ланцюга, які сполучають СОВ ділянки. Часткова послідовність використовується, щоб визначити які зародкові варіабельні і сполучаючі генні сегменти сприяють рекомбінуванню мінливих генів антитіла. Потім використовується зародкова послідовність, щоб заповнити ті частини варіабельних ділянок, яких бракує. Лідерні послідовності важкого і легкого ланцюга розщеплюються під час дозрівання білка і не вносять внесок до властивостей антитіла. Щоб додати відсутні послідовності, клоновані КДНК-послідовності можна з'єднати з синтетичними олігонуклеотидами за допомогою лігування або ПЛР-ампліфікації. Альтернативно, повна варіабельна область може бути синтезована як набір коротких, олігонуклеотидів, які перекриваються, і об'єднана за допомогою
ПЛР-ампліфікації щоб створити клон з повністю синтетичною варіабельною областю. Цей процес має певні переваги, такі як елімінація, або включення, або окремі сайти рестрикції, або оптимізація окремих кодонів.
Нуклеотидні послідовності транскриптів важкого і легкого ланцюга з гібридом використовуються для складання перекриваючого набору синтетичних олігонуклеотидів, щоб створити синтетичні М-послідовності з можливістю кодування тих же самих амінокислот, як в природній послідовності. Послідовності синтетичного важкого і каппа-ланцюга можуть відрізнятися від природних послідовностей в трьох варіантах: нитки повторних нуклеїнових основ перериваються, щоб полегшити синтез олігонуклеотидів і ПЛР ампліфікацію; оптимальні сайти ініціації трансляції включаються згідно правилам Колак (Колак, 1991, 9. ВіоІ. 5 Спет. 266: 19867-19870); і сайти Ніпапї створюються вище від сайтів ініціації трансляції.
Що стосується варіабельних областей і важкого і легкого ланцюгів, оптимізовані кодуючі і відповідні некодуючі ділянки послідовностей розділяються на 30-50 нуклеотидів приблизно в серединній точці відповідного некодуючого олігонуклеотиду. Таким чином, для кожного ланцюга олігонуклеотиди можуть бути зібрані в двониткові набори, які перекриваються, які охоплюють
Зо сегменти із 150-400 нуклеотидів. Ці пули (клястери, групи) потім використовуються як матриці для отримання продуктів ПЛР-ампліфікації з 150-400 нуклеотидів. Як правило, одна варіабельна область олігонуклеотидного набору розділятиметься на два пули, які окремо ампліфікуються, щоб виробити два ПЛР-продукта, що перекриваються. Потім ці продукти, що перекриваються, потім об'єднують за допомогою ПЛР -ампліфікації, щоб створити повну варіабельну область. Також може бути бажане включення фрагмента варіабельної області важкого або легкого ланцюга, що перекривається, в ПЛР-ампліфікацію для створення фрагментів, які можна легко клонувати в конструкти векторів експресії.
Потім реконструйовані химерну і гуманізовану варіабельні області важкого і легкого ланцюга об'єднують з клонованими послідовностями промоторної ділянки, лідерної ділянки, ділянки ініціації трансляції, константної області, 3" нетрансльованих ділянки, ділянка поліаденілювання і ділянки термінації транскрипції, щоб утворити конструкти вектора експресії. Конструкти експресії важкого і легсого ланцюга можуть бути об'єднані в один вектор, ко-трансфіковані, послідовно трансфіковані або окремо трансфіковані в клітини-господарі, які потім зливаються з утворенням клітини-господаря, яка експресує обидва ланцюги. Описані плазміди, які використовуються в створенні векторів експресії для людського ЇдОк. Плазміди можуть бути створені так, що ПЛР-ампліфіковані кКДНК-послідовності М важкого і М каппа легкого ланцюга можуть використовуватися для реконструювання мінігенів повного важкого і легкого ланцюга. Ці плазміди можуть використовуватися для експресії повністю людського або химерного ІдсС1, каппа або ІдсС4, каппа антитіл. Можуть бути створені подібні плазміди для експресії інших ізотипів важкого ланцюга або для експресії антитіл, що містять лямбда-легкі ланцюги.
Таким чином, в іншому аспекті винаходу структурні ознаки анти-СОМб антитіл запропонованих даним винаходом використовуються для створення структурно-споріднених гуманізованих анти-СОМб антитіл, які зберігають, щонайменше, одну функціональну властивість антитіл запропонованих даним винаходом, наприклад, зв'язування з СІ ОМб.
Конкретніше, одна або більше СОВ-ділянок мишачого моноклонального антитіла може бути рекомбінантно об'єднана з відомими людськими каркасними ділянками і СОВ для створення додаткових рекомбінантно-сконструйованих гуманізованих анти-СІ ОМб антитіл запропонованих даним винаходом.
Зв'язування з клітинами, які експресують антиген 60 Здатність антитіла зв'язуватися з СІ ОМб можна визначити за допомогою стандартних методів аналізу, таких як, методи, представлені в прикладах (наприклад, ЕГІ5ЗА, Вестерн- блотінг, імунофлуоресценція і проточна цитометрія).
Ізолювання і характеристика антитіл
З метою очищення моноклональних анти-СІ ОМб антитіл відібрані гібридоми вирощують в дволітровій ролерній колбі. Альтернативно анти-СІ ОМб антитіла можна отримати в біореакторі на основі діалізу. За необхідності супернатанти можна профільтрувати, концентрувати перед проведенням афінної хроматографії з протеїн-Сс-сефарозою або протеїн-А-сефарозою. Чистоту елюйованого дб можна проконтролювати за допомогою сгель-електрофорезу (Іі високоефективної рідинної хроматографії. Буферний розчин можна поміняти на РВ5, а концентрацію можна визначити при 00280 з використанням коефіцієнта екстинції 1,43.
Моноклональні антитіла можна розділити на аліквоти і зберігати при -80 "С.
Для того, щоб визначити, чи зв'язуються відібрані анти-СІ 0ОМб моноклональні антитіла з єдиним епітопом, може бути застосований сайт-направлений або мульти-сайт-направлений мутагенез.
Встановлення ізотипу
Для встановлення ізотипу очищених антитіл проводили аналіз ЕГІ5А з різними комерційними наборами (наприклад, 2утей, Коспе Оіадпобвіїс5). Комірки титраційних мікропланшетів покривають анти-мишиним Ід. Після блокування проводили реакцію з моноклональними антитілами або очищеними ізотипними контролями за кімнатної температури протягом двох годин. Потім проводили реакцію або з мишачим досі, Ідс2а, Ідо25 або ІдО3, ІА або із специфічним мишачим ІдМ, кон'югованим з пероксидазою. Після промивання планшети обробляють АВТ5 субстратом (1 міліграм/мл) і досліджують при 00 405-650. Альтернативно, можна використовувати набір для ізотипування Ізобігір Моизе Мопосіопа! Апіїбоду Ізоїуріпуд Кії (Коспе, Саї. Мо. 1493027), як описано виробником.
Проточний цитометричний аналіз
Для того, щоб продемонструвати наявність анти-СІ ОМб антитіл в сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують СІ ОМб, можна використовувати проточну цитометрію. Лінії клітин, які експресують СОМ в нормі або після трансфекції, і негативні контролі, які втратили експресію СІ ОМ (вирощені за стандартних
Зо умов), змішують з різними концентраціями моноклональних антитіл в супернатантах від гібридоми або в РВ5, що містить 195 ЕВ5, та інкубують при 4 "С протягом 30 хв. Після промивання мічені АРС або АїЇехаб47 анти-ІдсС антитіла можуть зв'язуватися з СІ ОМб- связанними моноклональними антитілами за таких же умов, як умови для фарбування первинних антитіл. Зразки можна проаналізувати за допомогою проточної цитометрії на приладі
ЕАС5, використовуючи параметри прямого і бічного розсіювання світла, щоб пропускати окремі живі клітини. Для того, щоб відрізнити СІ ОМб-специфічні моноклональні антитіла від неспецифічних зв'язуючих речовин в одному вимірюванні, можна використовувати метод ко- трансфекції. Клітини тимчасово трансфіковані плазмідами, які кодують СІОМ6 і флуоресцентним маркером, можна пофарбувати, як описано вище. Трансфіковані клітини можна встановити в іншому діапазоні флуоресценції, ніж антитіло-зафарбовані клітини.
Оскільки більшість трансфікованих клітин експресують обидва трансгени, СІ ОМб-специфічні моноклональні антитіла зв'язуються переважно з клітинами, які експресують флуоресцентний маркер, тоді як неспецифічні антитіла зв'язуються в співрозмірному співвідношенні з нетрансфікованими клітинами. Можна застосовувати альтернативний метод аналізу з використанням флуоресцентної мікроскопії на додачу до або замість проточної цитометрії.
Клітини можна пофарбувати так, як описано вище, і досліджувати за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
Імунофлуоресцентна мікроскопія
Для того, щоб продемонструвати наявність анти-СІ ОМб антитіл в сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, які експресують СІ ОМб, можна використовувати імунофлуоресцентну мікроскопію. Наприклад, клітинні лінії, які експресують СГОМб або спонтанно або після трансфекції, і негативні контролі, які втратили експресію СГОМб6, вирощують на предметних скельцях за стандартних умов вирощування в середовищі ОМЕМ/Е12 з додаванням 10 95 ембріональної телячої сироватки (ЕС5), 2 мМ /- глутаміну, 100 мкг/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Потім клітини фіксують метанолом або параформальдегідом або залишають необробленими. Потім проводять реакцію клітин з моноклональними антитілами до СІ ОМб протягом 30 хвилин при 25 "С. Після промивання проводять реакцію клітин з міченими АІеха555 анти-мишачими Ідс вторинними антитілами (МоїІесшаг Ргобев) за тих же самих умов. Після цього можна досліджувати клітини за допомогою бо флуоресцентної мікроскопії.
Загальні рівні СІОМ6б в клітинах можна спостерігати, коли клітини зафіксовані метанолом або зафіксовані параформальдегідом і пермеабілізовані Тритоном Х-100. В живих клітинах і непермеабілізованих, фіксованих параформальдегідом клітинах можна досліджувати поверхневу локалізацію СІ ОМб. Крім того, націлювання СГ ОМб на щільні контакти можна вивчати за допомогою спільного фарбування з маркерами щільних контактів, наприклад, 20О-1.
Більше того, можна вивчати результати зв'язування антитіл і локалізацію СІ ОМб в клітинній мембрані.
Вестерн-блотінг
Анти-СІГ ОМб до можна додатково протестувати на реакційну здатність з С ОМб антигеном за допомогою Вестерн-блотінгса. Коротко, можна приготувати клітинні екстракти клітин, які експресують СІОМб, і відповідні негативні контролі і провести електрофорез в поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфата натрію (505). Після електрофорезу відокремлені антигени переносять на мембрани нітроцелюлози, блокують і досліджують за допомогою тестованих моноклональних антитіл. Ідс-зв'язування можна визначити за допомогою анти-мишачого ІдС міченого пероксидазою і виявити за допомогою ЕСІ. субстрату.
Імуногістохімія
Анти-СГОМб мишачі (дб можна додатково протестувати на реакційну здатність з СІ ОМб6 антигеном за допомогою імуногістохімічного аналізу добре відомим фахівцеві в даній галузі способом, наприклад, з використанням кріо-зрізів, фіксованих параформальдегідом або ацетоном, або фіксованих параформальдегідом парафінових зрізів зразків неракових тканин або ракових тканин, узятих у пацієнта під час звичайних хірургічних процедур, або у мишей з ксенотрансплантатів пухлин, інокульованих за допомогою ліній клітин, які експресують СІ ОМб спонтанно або після трансфекції. Для імунофарбування антитіла, які реагують з СІ ОМб, можуть бути проінкубовані, а потім кон'юговані з міченими пероксидазою хріну козячими анти- мишачими або козячими анти-кроликовими антитілами (САКОС) згідно інструкціям продавця.
Активність антитіл іп міїго, пов'язана з фагоцитозом і здатністю знищувати клітини
На додачу до специфічності зв'язування з СІ ОМб, анти-СІ ОМб антитіла можна перевірити щодо їх спроможності опосередковувати фагоцитоз і знищення клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІГОМб з клітинною поверхнею. Перевірка активності
Зо моноклональних антитіл іп міго забезпечує первинний скринінг до тестування на моделях іп мімо.
Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮОСС):
Коротко, поліморфоядерні клітини (РММ), МК-клітини, моноцити, мононуклеарні клітини або інші ефекторні клітини від здорових донорів можна очистити центрифугуванням в градієнті щільності фікол-гіпака, з подальшим руйнуванням забруднюючих еритроцитів. Промиті ефекторні клітини суспендують в КРМІ з додаванням 1095 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки або альтернативно з 5 95 інактивованої нагріванням людської сироватки і змішують з 9'Сі-міченими клітинами-мішенями, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, в різних співвідношеннях ефекторних клітин до клітин-мішеней. Альтернативно, клітини-мішені можна помітити лігандом, який підсилює флуоресценцію (ВАТРА). Високо флуоресцентний хелат європію з підсилюючим лігандом, який вивільняється з мертвих клітин, можна визначити за допомогою флуориметра. У іншому альтернативному способі може використовуватися трансфекція клітин-мішеней люциферазою. При цьому доданий люцифер жовтий може окислюватися тільки живими клітинами. Потім можна додати очищені анти-СІ ОМб Ід в різних концентраціях. Як негативний контроль можна використовувати нерелевантний людський дб. Дослідження проводиться протягом від 4 до 20 годин при 37 "С залежно від типу використовуваних ефекторних клітин.
Цитоліз в зразках можна оцінити шляхом вимірювання вивільнення г'Сг або наявність хелату
ЕОТОА в культуральному супернатанті. Альтернативно, можна виміряти люмінесценцію живих клітин, що є результатом окислення люцифера жовтого.
Також можна перевірити різні комбінації анти-СОМбЄ моноклональних антитіл, щоб визначити чи посилюється цитоліз при дії складів моноклональних антитіл.
Комплементзалежна цитотоксичність (СОС):
Моноклональні анти-СІ ОМ антитіла можна перевірити щодо їх здатності опосередковувати
СОС за допомогою ряду відомих методів. Наприклад, сироватку для отримання комплементу можна отримати з крові відомим фахівцям способом. Для визначення СОС-активності моноклональних антитіл можна використовувати різні методи. Наприклад, можна визначити вивільнення 5(Ст або можна оцінити підвищену проникність мембран за допомогою методу виключення пропідіум йодидом (РІ). Коротко, цільові клітини промивають 5 х 10»/мл і інкубують з бо різними концентраціями тМАБ протягом 10-30 хвилин за кімнатної температури або при 37 "С.
Потім додають сироватку або плазму до остаточної концентрації 20 95 (06./06.) і клітини інкубують при 37 "С протягом 20-30 хвилин. До всіх клітин кожного зразка додають розчин РІ в пробірку для ЕАС5-аналізу. Після цього суміш негайно аналізують за допомогою проточної цитометрії, використовуючи ЕАСсЗ-набір.
У альтернативному способі дослідження індукцію СОС можна встановити на прикріплених клітинах. У одному варіанті здійснення цього методу аналізу клітини висівають за 24 години до дослідження з щільністю З х 10"/комірку в плоскодонні титраційні мікропланшети для культур тканин. Наступного дня культуральне середовище видаляють і клітини інкубують з антитілами (три повтори). Контрольні клітини інкубують в культуральному середовищі або культуральному середовищі, яке містить 0,2 до сапоніну для визначення фонового лізису і максимального лізису, відповідно. Після інкубації протягом 20 хвилин за кімнатної температури супернатант видаляють і додають до клітин 2095 (06./06б.) людської плазми або сироватки в ОМЕМ (заздалегідь нагрітої до 37 "С) і інкубують протягом наступних 20 хвилин при 37 "С. До клітин додають розчин пропідій йодиду (10 мкг/мл). Потім супернатанти замінюють РВ5, що містить 2,5 мкг/мл етидіум броміду і вимірюють випускання флуоресценції після збудження при 520 нм при 600 нм за допомогою Тесап 5аїге. Відсоток специфічного лізису обчислюють як вказано далі:
Фо специфічного лізису - (флуоресценція зразка - фонова флуоресценція)/ (флуоресценція за максимального лізису- фонова флуоресценція) х 100.
Інгібування клітинної проліферації моноклональними антитілами:
Наприклад, щоб перевірити здатність моноклональних анти-СІОМб антитіл ініціювати апоптоз, їх інкубують з пухлинними клітинами, позитивними за СІГОМб, або СІ рМб- трансфікованими пухлинними клітинами при 37 С протягом приблизно 20 годин. Клітини збирають, промивають в анексин-М зв'язуючому буфері (ВО бБіозсіепсе5), та інкубують з анексином М, сполученим з РІТС або АРС (ВО Біозсіепсе5) протягом 15 хвилин в темноті. До всіх клітин кожного зразка додають розчин РІ (10 мкг/мл в РВ5) в пробірку для ГАСсС5-аналівзу і відразу оцінюють за допомогою проточної цитометрії (як описано вище). Альтернативно, загальне інгібування клітинної проліферації моноклональними антитілами можна визначити за допомогою комерційно доступних наборів. За допомогою набору для визначення клітинної проліферації ОЕГНРІА (РегкКіп-ЕІтег, Саї. Мо. АБО200) можна провести неїзотопний імунсоаналіз в
Зо мікропланшетах, заснований на вимірюванні включення 5-бром-2'-дезоксиуридіну (ВКОЮ) під час синтезу ДНК проліферуючими клітинами. Включені ВКОШ визначають за допомогою мічених європієм моноклональних антитіл. Щоб зробити можливим виявлення антитіл, клітини фіксують і проводять денатурацію ДНК, використовуючи Ріх (фіксуючий) розчин. Незв'язані антитіла змивають і додають в розчин індуктор ОБГ РІА, щоб відокремити іони європію від мічених антитіл, де вони утворюють високо флуоресцентні хелати з компонентами індуктора ОБЇ РІА.
Флуоресценція, виміряна в кожній комірці за допомогою флуориметрії з часовим розрізненням є пропорційною до синтезу ДНК в клітині.
Доклінічні дослідження
Моноклональні антитіла, які зв'язуються з СІ ОМб, також можуть бути перевірені на моделі іп мімо (наприклад, на імунодефіцитних мишах з ксенотрансплантатом пухлин, інокульованих клітинними лініями, які експресують СІ ОМб6, можливо після трансфекції) для встановлення їх ефективності при контролі зростання клітин пухлин, які експресують СІ ОМб.
Дослідження антитіл запропонованих даним винаходом іп мімо можна провести після ксенотрансплантації пухлинних клітин, які експресують СГ ОМб, імунодефіцитним мишам або іншим тваринам. Щоб визначити дію антитіл на запобігання утворенню пухлин або симптомів, пов'язаних з пухлиною, антитіла можна ввести мишам, вільним від пухлини, з подальшою ін'єкцією пухлинних клітин. Щоб встановити терапевтичну ефективність відповідних антитіл відносно зменшення росту пухлин або симптомів, пов'язаних з пухлиною, антитіла можна ввести мишам - носіям пухлин. Застосування антитіл можна комбінувати із застосуванням інших речовин, таких як цитостатичні засоби, інгібітори чинників зростання, блокатори клітинного циклу, інгібітори ангіогенезу або іншими антитілами, щоб визначити синергійну ефективність і потенційну токсичність комбінацій. Щоб проаналізувати токсичні побічні явища, опосередковані антитілами запропонованими винаходом, тварині можна інокулювати антитіла або контрольні реагенти і ретельно вивчити симптоми, можливо пов'язані з терапією антитілами до СІ ОМб6. Зокрема, можливі побічні явища від застосування іп мімо СІ ОМб-антитіл включають токсичний вплив на тканини, які експресують СІ ОМб, включаючи плаценту. Антитіла, які розпізнають СІ ОМ6б у людини і у інших видів, наприклад, мишей, є, зокрема, придатними для прогнозу можливих побічних явищ, опосередкованих застосуванням моноклональних СІ ОЮМб- антитіл, у людей. бо Картування епітопів
Картування епітопів, які розпізнаються антитілами запропонованими винаходом, можна провести, як детально описано в "Ерйоре Марріпд Ргоїосоїв5" (Меїпоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду) ру
Сієпп Е. Моїтіз ІЗВМ-089603-375-9 і в "Ерйоре Марріпод: А Ргасіїса! Арргоасі" Ргасіїса! Арргоасіп
Зегів, 248 Бу Оїмуп М. В. М/езімоса, Егапк с. Нау.
Ї. Біспецифічні/мультиспецифічні молекули, які зв'язуються з СІ ОМб
У іншому варіанті здійснення винаходу антитіла до СІ ОМб можуть утворювати похідне або можуть з'єднуватися з іншою функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, Бабі фрагментом), щоб утворити біспецифічну або мультиспецифічну молекулу, яка зв'язується з різними сайтами зв'язування або цільовими епітопами. Наприклад, антитіло запропоноване винаходом може бути функціонально зв'язане (наприклад, шляхом хімічного зв'язку, генетичного об'єднання (злиття), нековалентного зв'язку або іншим чином) з однією або більше іншими зв'язуючими молекулами, такими як інше антитіло, пептид або зв'язуючий міметик.
Відповідно, даний винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, які містять, щонайменше, одну першу специфічність зв'язування для СІОМб і другу специфічність зв'язування для другого цільового епітопу. У окремому варіанті здійснення винаходу другий цільовий епітоп є Ес-рецептором, наприклад, людським Ес-гаммакі (СОб4) або людським Ес- альфа рецептором (СО89) або Т-клітинним рецептором, наприклад, СОЗ. Отже, винахід включає біспецифічні і мультиспецифічні молекули, здатні зв'язуватися з ефекторними клітинами, які експресують Ес-гаммакК, Ес-альфак або Ес-епсилонК (наприклад, моноцитами, макрофагами або поліморфоядерними клітинами (РММ)) і з клітинами-мішенями, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею. Ці біспецифічні і мультиспецифічні молекули можуть націлювати ефекторні клітини на клітини, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, і можуть ініціювати активність ефекторних клітин, опосередковану Ес-рецептором, наприклад, фагоцитоз клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею, антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС), вивільнення цитокінів або продукування супероксид-аніону.
Біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу можуть додатково включати третю
Зо специфічність зв'язування, на додачу до анти-Ес-специфічності зв'язування і анти-СЇ ОМ6- специфічності зв'язування. У одному варіанті здійснення третя специфічність зв'язування є частиною анти-стимулюючого чинника (ЕЕ), наприклад, молекулою, яка зв'язується з поверхнею білка, задіяного в цитотоксичній активності і таким чином збільшує імунну відповідь проти клітини-мішені. "Частина анти-стимулюючого чинника" може бути антитілом, функціональним фрагментом антитіла або лігандом, який зв'язується з даною молекулою, наприклад, антиген або рецептор, і таким чином призводить до посилення ефекту зв'язування детермінант для Ес- рецептора або антигену клітини-мішені. "Частина анти-стимулюючого чинника" може зв'язувати
Ес-рецептор або антиген клітини-мішені. Альтернативно, частина анти-стимулюючого чинника може зв'язуватися з частинкою (епійу), яка відрізняється від частинки, з якою зв'язуються перша і друга специфічності зв'язування. Наприклад, частина анти-стимулюючого чинника може зв'язуватися з цитотоксичною Т-клітиною (наприклад, через СО2, СОЗ3, СО8, С028, С04, С040,
ІСАМ-1 або іншою імунною клітиною, що призводить до підвищення імунної відповіді проти клітини-мішені).
У одному варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу містять як специфічність зв'язування, щонайменше, одне антитіло, включаючи, наприклад, Раб, РаБ;,
ЕК(авф)2, Ем або один ланцюг Ем. Антитіло також може бути димером легкого ланцюга або важкого ланцюга, або будь-яким мінімальним його фрагментом, таким як Ем або одноланцюговий конструкт, як описано в і адпег єї аІ., 05 4,946,778. Антитіло також може бути доменом зв'язування химерного білка імуноглобуліну, як розкрито в 05 2003/0118592 і 05 2003/0133939.
У одному варіанті здійснення біспецифічні і мультиспецифічні молекули винаходу містять специфічність зв'язування для Есо-гаммак або Ес-альфак, присутніх на поверхні ефекторної клітини, і другу специфічність зв'язування для антигену клітини-мішені, наприклад, СІ ОМб.
У одному варіанті здійснення специфічність зв'язування для Ес-рецептора забезпечується моноклональним антитілом, зв'язування якого не блокується людським імуноглобуліном с (Ід).
Термін "Ідс рецептор", як він використовується в описі, відноситься до будь-якого з восьми генів гамма-ланцюга, розташованих на хромосомі 1. Ці гени кодують всі дванадцять трансмембранних або розчинних ізоформ рецептора, які розділені на три класи Ес-гамма рецепторів: Ес-гаммакіІ (СО64), Ес-гаммакі! (СО032) і Ес-гаммак! (СО016). У одному з кращих бо варіантів здійснення Ес-гамма рецептор є людським високоафінним Ес-гаммакі.
У інших кращих варіантах здійснення специфічність зв'язування для Ес-рецептора забезпечується антитілом, яке зв'язується з людським ІдА-рецептором, наприклад, Ес-альфа рецептором (Бс-альфак! (СО89)), зв'язування якого бажано не блокується людським імуноглобуліном А (ІдА). Термін "ДА рецептор" включає генний продукт одного альфа-гена (Ес- альфакі), розташованого на хромосомі 19. Відомо, що цей ген кодує декілька альтернативних трансмембранних сплайс-ізоформ від 55 до 110 Каа. Ес-альфак!І (СО89) конститутивно експресується на моноцитах/макрофагах, еозинофільних і нейтрофільних гранулоцитах, але не експресується на популяціях неефекторних клітин. Ес-альфакі має середню афінність і до ІДАЇ і до ІдА2, яка збільшується після дії цитокінів, таких як 5-С5Е або ЗМ-С5Е (Мопоп, Н. б. еї аї. (1996) Стйіса! ВНемієме іп Іттипоіоду 16: 423-440). Було описано чотири Ес-альфакі- специфічних моноклональні антитіла, які були названі АЗ, АБО, Аб2 і А77, які зв'язують Ес- альфакі зовні ІДА ліганд-зв'язуючого домену (Мопівїго, К. С. еї аї. (1992) 9У.Лттипої. 148: 1764).
У іншому варіанті здійснення біспецифічна молекула складається з двох моноклональних антитіл згідно винаходу, які мають комплементарні функціональні активності, наприклад, одне антитіло бажано індукує СОС, а інше антитіло бажано індукує апоптоз.
Термін "антитіло, специфічне до ефекторної клітини", як він використовується в описі, відноситься до антитіла або функціонального фрагмента антитіла, який зв'язується з Ес- рецептором ефекторних клітин. Кращі антитіла для застосування у винаході зв'язуються з Ес- рецептором ефекторних клітин в сайті, який не зв'язується ендогенним імуноглобуліном.
Термін "ефекторна клітина", як він використовується в описі, відноситься до імунної клітини, яка залучається у ефекторну фази імунної відповіді, на відміну від фази розпізнавання і фази активації імунної відповіді. Приклади імунних клітин включають клітини мієлоїдного і лімфоїдного походження, наприклад, лімфоцити (наприклад, В-клітини і Т-клітини, включаючи цитолітичні Т-клітини (СТІ), клітини-кілери, клітини природні (натуральні) кілери, макрофаги, моноцити, еозинофіли, нейтрофіли, поліморфоядерні клітини, мастоцити і базофіли. Деякі ефекторні клітини експресують специфічні Ес-рецептори і виконують специфічні імунні функції.
У кращих варіантах здійснення ефекторна клітина здатна індукувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АЮСС), наприклад, нейтрофіл, здатний індукувати АОСС. Наприклад, моноцити, макрофаги, які експресують ЕСЕ, беруть участь в специфічному знищенні клітин-
Зо мішеней і презентуванні антигенів іншим компонентам імунної системи або зв'язуються з клітинами, які презентують антигени. У інших варіантах здійснення ефекторна клітина може фагоцитувати антиген-мішень, клітину-мішень або мікроорганізм. Експресія конкретного ЕСК на ефекторній клітині може регулюватися гуморальними чинниками, такими як цитокіни.
Наприклад, було виявлено, що експресія Ес-гаммакіІ регулюється з підвищенням інтерфероном гамма (ІЕМ-у). Ця посилена експресія збільшує цитотоксичну активність Ес-гаммакКіІ-несучих клітин проти мішеней. Ефекторна клітина може фагоцитувати або лізувати антиген-мішень або клітину-мішень. "Клітина-мішень" позначає будь-яку небажану клітину у суб'єкта (наприклад, людини або тварини), на яку може націлюватися антитіло запропоноване винаходом. У кращих варіантах здійснення клітина-мішень є клітиною, яка експресує або яка гіперекспресує СІГОМб і яка характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею. Клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СГОМб з клітинною поверхнею, як правило, включають пухлинні клітини.
ІЇ. Імунокон'югати
У іншому аспекті даний винахід визначає властивість анти-СІ ОМб антитіла, кон'югованого з терапевтичною частинкою або засобом, таким як цитотоксин, лікарський засіб (наприклад, імуносупресор) або радіоїзотоп. Такі кон'югати називаються в описі "імунокон'югати".
Імунокон'югати, які включають один або більше цитотоксинів, називаються "імунотоксини".
Цитотоксин або цитотоксичний засіб є будь-яким засобом, який має негативний вплив на клітини, зокрема, убиває клітини. Приклади включають таксол, цитохалазин В, граміцидин 0, етидіум бромід, еметин, мітоміцин, етопозид, теніпозид, вінкристін, вінбластін, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксиантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин О, 1-дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол, пуроміцин та їх аналоги або гомологи.
Відповідні терапевтичні засоби для утворення імунокон'югатів винаходу включають, але не обмежуються цим, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, б-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5-фторурацил, декарбазин), алкілюючі засоби (наприклад, хлорметин, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МО) і ломустин (ССМІО), циклофосфамід, бусулфан, дибромманітол, стрептозотоцин, мітоміцин С ії цис-дихлордиамінплатина (І) (ОР) бо цисплатин), антрациклінові антибіотики (наприклад, даунорубіцин (раніше дауноміцин) і доксорубіцин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин і антраміцин (АМС), і антимітотичні засоби (наприклад, вінкристін і вінбластин). У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є цитотоксичним засобом або радіотоксичним засобом. У іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є імуносупресором. У іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб є М-С5ЗЕ (гранулоцитарно-макрофагальним колонієсєтимулюючим чинником). У кращому варіанті здійснення терапевтичний засіб є доксорубіцином, цисплатіном, блеоміцином, сульфатом (5ийїгаїеє), кармустіном, хлорамбуцилом, циклофосфамідом або рициною А.
Антитіла запропоновані даним винаходом також можна з'єднати з радіоїзотопом, наприклад, йодом-131, ітрієм-90 або індієм-111, щоб отримати цитотоксичні радіофармацевтичні кошти для лікування порушення, пов'язаного з СІ ОМб, такого як рак. Кон'югати антитіл запропонованих даним винаходом можна використовувати для того, щоб модифікувати дану біологічну відповідь, при цьому лікарська частинка не повинна розглядатися як така, що обмежує класичні хімічні терапевтичні лікарські засоби. Наприклад, лікарська частинка може бути білком або поліпептидом, який проявляє бажану біологічну активність. Такий білок може включати, наприклад, ферментативний активний токсин, або його активний фрагмент, такий як абрин, рицину А, екзотоксин синегнійної палички або дифтерійний токсин; білок, такий як чинник некрозу пухлини або інтерферон-у; або модифікатори біологічної відповіді такі як, наприклад, лімфокіни, інтерлейкін-1 ("П--1"), інтерлейкін-2 ("П--2"), інтерлейкін-б ("7-6"), гранулоцитарно- моноцитарний колонієстимулюючий чинник ("ЯМ-С5Е"), гранулоцитарний колонієстимулюючий чинник ("5-С5Е") або інші чинники росту.
Методи кон'югування (з'єднання) такої терапевтичної частинки з антитілом добре відомі, див., наприклад, Агпоп еї аї, "Мопосіопа! Апіїбодіе5 Рог Іттипоїагдейпуд ОЇ Огид5 Іп Сапсег
Тпегару", іп Мопосіопа! Апіїбодіез апа Сапсег Тпегару, ВНеївієїй еї аї. (едв5.), рр. 243-56 (АІап В.
І ів5, Іпс. 1985); НеїЇвігот еї аї., "Апіїродієз Бог ЮОгиа Оеїїмегу", іп СопітоПїеєй Огид Оеєїїмегу (2па
Еа.), Вобіпзоп еї аї. (едв5.), рр. 623-53 (Магсе! ОеккКег, Іпс. 1987); Тпогре "Апіїбоду Саїгтієтв ОЇ
Суїюхіс Адепів Іп Сапсег ТПнегару: А Немієм/", іп Мопосіопа! Апіїбодієв "84: Віоіодіса! апа Сіїпісаї
Арріїсайопв, РіпсНегаві аї. (єдв.), рр. 475-506 (1985); "Апаїузів, Незиїйїв, апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ
Тне Тнегарешіс О5е ОГ РадіоїареІєд Апіїбоду Іп Сапсег Тнегару", іп Мопосіопа! Апіїбодіеєв. Гог
Зо Сапсег Оеїесіп апа Тнегару, Ваїдм/іп еї аї. (еад5.), рр. 303-16 (Асадетіс Рге55 1985) і Трогре еї аІ., "Пе Ргерагаїоп апа Суююхіс Ргорепіє5з ОЇ Апіїроду-Тохіп Сопіндаїев", Іттипої. ВНем., 62: 119-58 (1982).
У додатковому варіанті здійснення антитіла запропоновані винаходом приєднується до лінкера-хелатора, наприклад, тіуксетану, який дозволяє антитілу кон'югувати з радіоіїзотопом.
І. Фармацевтичні композиції
У іншому аспекті даний винахід пропонує композицію, наприклад, фармацевтичну композицію, яка містить одне або комбінацію антитіл даного винаходу. Фармацевтичні композиції можуть бути уведені в склад з фармацевтично прийнятними носіями або розчинниками, а також будь-якими іншими добре відомими ад'ювантами (допоміжними засобами) і ексципієнтами відповідно до звичайних методів, розкритих в Кетіпдіоп: Тпе Зсіепсе і Ргасіїсе ої Рпаптасу, 191 Еайіоп, Сеппаго, Ед., Маск Рибріїєпіпуд Со., Еабіоп, РА, 1995. У одному варіанті здійснення композиції включають комбінацію декількох (наприклад, двох або більше) ізольованих антитіл запропонованих даним винаходом, які діють за допомогою різних механізмів дії, наприклад, одне антитіло, яке бажано діє викликаючи СОС, в комбінації з іншим антитілом, яке бажано діє викликаючи апоптоз.
Крім того, фармацевтичні композиції винаходу можуть вводитися при комбінованій терапії, тобто, у поєднанні з іншими засобами. Наприклад, комбінована терапія може включати композицію даного винаходу, щонайменше, з одним протизапальним засобом або, щонайменше, з одним імуносупресорним засобом. У одному варіанті здійснення такі
БО терапевтичні засоби включають одне або більше протизапальних засобів, таких як стероїдний лікарський засіб або М5АЇЮ (нестероїдний протизапальний лікарський засіб). Кращі засоби включають, наприклад, аспірин і інші саліцилати, інгібітори Сох-2, такі як рофекоксиб (віокс) і целекоксиб (целебрекс), М5ЗАЇО, такі як ібупрофен (мотрин, адвіл), фенопрофен (налфон), напроксен (напросин), суліндак (клінорил), диклофенак (волтарен), піроксикам (фелден), кетопрофен (орудис), дифлунізал (долобід), набуметон (релафен), етодолак (лодин), оксапрозин (дейпро) та індометацин (індоцин).
У іншому варіанті здійснення такі терапевтичні засоби включають засоби, які призводять до виснаження або функціональної інактивації регуляторних Т-клітин, такі як циклофосфамід в низькій дозі, анти-СТІ А4 антитіла, анти-І/ 2 або анти-ІІ 2-рецепторні антитіла. 60 У іншому варіанті здійснення такі терапевтичні засоби включають однин або більше засобів хіміотерапії, таких як похідні таксолу, таксотер, гемцитабін, 5-фторурацил, доксорубіцин (адриаміцин), цисплатин (платінол), циклофосфамід (цитоксан, процитокс, неосар). У іншому варіанті здійснення антитіла запропоновані даним винаходом можуть вводитися в комбінації із засобами хіміотерапії що бажано демонструють терапевтичну ефективність у пацієнтів, які страждають на рак, наприклад, описаний тут тип раку.
У іншому варіанті здійснення антитіла запропоновані винаходом можуть вводитися у поєднанні з радіотерапією і/або аутологічною периферійною стволовою клітиною або трансплантацією кісткового мозку.
Термін "фармацевтично прийнятний носій", як він використовується в описі, включає всі і будь-які розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні засоби і засоби, які затримують всмоктування, і тому подібне, які є фізіологічно сумісними. Бажано носій є придатним для внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спінального або епідермального введення (наприклад, за допомогою ін'єкції або вливання). Залежно від способу введення активна сполука, наприклад, антитіло, біспецифічна і мультиспецифічна молекула, може бути покрита речовиною, яка захищає сполуку від дії кислот та інших природних умов, які можуть інактивувати сполуку. "Фармацевтично прийнятна сіль" відноситься до солі, яка зберігає бажану біологічну активність початкової сполуки і яка не має якого-небудь небажаного токсичного впливу (див. наприклад, Вегде, 5. М., єї аї. (1977) 9. Ріапт. осі. 66: 1-19).
Приклади таких солей включають солі приєднання кислоти і солі приєднання основи. Солі приєднання кислоти включають солі, отримані з нетоксичних неорганічних кислот, таких як соляна кислота, азотна кислота, фосфорна, сірчана, бромисто-воднева кислота, йодистоводнева кислота, фосфориста і тому подібні, а також з нетоксичних органічних кислот, таких як аліфатичні моно- і дикарбонові кислоти, феніл-заміщені алканові кислоти, гідрокси- алканові кислоти, ароматичні кислоти, аліфатичні і ароматичні сульфонові кислоти і тому подібні. Солі приєднання основи включають солі отримані з лужноземельних металів, таких як, натрій, калій, магній, кальцій тощо, а також з нетоксичних органічних амінів, таких як М, М'- дибензилетилендиамін, М-метилгюкамін, хлорпрокаїн, холін, діетаноламін, етилендіамін,
Зо прокаїн тощо.
Композиція даного винаходу може бути введена за допомогою цілого ряду способів, відомих в даній галузі техніки. Фахівцеві в даній області зрозуміло, що шлях і/або спосіб введення варіюватиме залежно від бажаних результатів. Активні сполуки можна приготувати разом з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді композицій з контрольованим вивільненням, включаючи імплантати, трансдермальні пластирі (і мікроіїнкапсульовані системи доставки. Можна використовувати біодеградовані, біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколієва кислота, колаген, поліортоефіри і полімолочна кислота. Як правило, способи приготування таких композицій відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, Зивіаіїпей і СопігоїПйей Кеїеазе Огид
Оеїїмегу Зузіетв, у). В. Вобіпзоп, єд., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем Моїк, 1978.
Для введення сполуки запропонованої винаходом певними способами може бути потрібним покрити сполуки речовиною, або спільно ввести сполуку з речовиною, яка запобігає її інактивації. Наприклад, сполуки можна ввести суб'єктові у відповідному носієві, наприклад, ліпосомах, або розчиннику. Фармацевтично прийнятні розчинники включають сольові і водні буферні розчини. Ліпосоми включають СОР емульсії вода-в-олії-у-воді, а також звичайні ліпосоми (5іге)зап еї а. (1984) 93. Меигоіїттипої. 7: 27).
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних розчинів для ін'єктції, або дисперсій.
Використання таких середовищ і компонентів для фармацевтично активних речовин відоме в даній галузі техніки. За винятком випадків, коли будь-яке звичайне середовище або засіб є несумісним з активною сполукою, розглядається їх використання у фармацевтичних композиціях винаходу. Крім того, до композиції можуть бути включені додаткові активні сполуки.
Як правило, терапевтичні композиції повинні бути стерильними і стійкими за умов виробництва і зберігання. Композиції можуть бути складені у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої упорядкованої структури, придатної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути розчинником або дисперсійним середовищем, яке містить, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і тому подібне) та їх відповідні суміші. Належну текучість можна зберегти, наприклад, використовуючи покриття, таке як лецитин, зберігаючи бажаний розмір часточок у випадку дисперсії і 60 використовуючи поверхнево-активні речовини. У багатьох випадках бажаним є включення до композиції ізотонічних засобів, таких як, цукор, поліспирти, такі як манітол, сорбітол або хлорид натрію. Тривале всмоктування композицій для ін'єкцій, може досягатися включенням до композиції засобу, який затримує всмоктування, наприклад, моностеарату і желатину.
Стерильні розчини для ін'єкції можна приготувати шляхом введення у відповідний розчинник активної сполуки у необхідній кількості з одним або комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, як буде потрібно, з подальшою стерилізацією мікрофільтрацією.
Як правило, дисперсії готують шляхом введення активної сполуки в стерильний носій, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, з числа перерахованих вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкції, кращими способами приготування є вакуумне висушування і висушування (ліофілізація) сублімацією, які дають порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з його заздалегідь стерильно-профільтрованого розчину.
Режими дозування підбирають так, щоб забезпечити оптимальну бажану відповідь (наприклад, терапевтичну відповідь). Наприклад, може бути введена єдина доза, може бути введено декілька окремих доз протягом деякого часу або дозування може бути пропорційно зменшене або збільшене, як диктує гостра необхідність терапевтичної ситуації. Особливо вигідно розробляти парентеральні композиції в стандартній лікарській формі для простоти введення і одноманітності дозування. Стандартна лікарська форма при використанні тут відноситься до фізично дискретних одиниць, придатних як одиничні дозування для суб'єктів, яким потрібне лікування; кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість активної сполуки, підраховану так, щоб отримати бажаний терапевтичний ефект, у поєднанні з необхідним фармацевтичним носієм.
Приклади фармацевтично прийнятних антиоксидантів включають: (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, цистеїн гідрохлорид, бісульфат натрію, натрій метабісульфіт, сульфіт натрію і тому подібне; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як, аскорбілпальмітат, бутильований гідроксианізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і тому подібне; і (3) металеві хелатуючі агенти, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕЮТА), сорбітол, винна кислота, фосфорна кислота тощо.
Зо Композиції запропоновані даним винаходом включають терапевтичні композиції, придатні для орального, назального, місцевого, (включаючи щокове і під'язикове), ректального, вагінального і/або парентерального введення. Композиції можуть бути зручно представлені в стандартній лікарській формі і можуть бути приготовані будь-якими відомими в області фармацевтики способами. Кількість активного інгредієнта, яку необхідно об'єднати з носієм для отримання стандартної лікарської форми, варіюватиме залежно від суб'єкта, якого необхідно лікувати, і конкретного способу введення. Кількість активного інгредієнта, яку необхідно об'єднати з носієм для отримання стандартної лікарської форми, в більшості випадків буде такою кількістю композиції, яка дає терапевтичний ефект.
Композиції запропоновані даним винаходом, придатні для вагінального застосування, також включають вагінальні супозиторії, тампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, які містять придатні носії відомі в даній галузі техніки. Лікарські форми для місцевого або трансдермального введення композицій даного винаходу включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластирі і засоби для інгаляції. Активна сполука може бути змішаною в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм і з будь-якими консервантами, буферами або пропелентами, які можуть бути потрібними.
Фрази "парентеральне введення" і "введений парентерально", як вони використовується в описі, означають відмінні від ентерального і місцевого введення способи введення, зазвичай за допомогою ін'єкції і включають, без обмеження, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, підоболонкову, внутрішньокапсульну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, підшкірну, внутрішньошкірну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію і вливання.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях винаходу, включають воду, етанол, поліоли (такі як, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь тощо) та їх відповідні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і складні органічні ефіри для ін'єкції, такі як етилолеат. Належну текучість можна збере!ти, наприклад, використовуючи покриття, таке як лецитин, зберігаючи бажаний розмір часточок у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини.
Ці композиції також можуть містити ад'юванти, такі як консерванти, зволожуючі засоби, бо емульгуючі речовини і диспергуючі речовини. Запобігання присутності мікроорганізмів можна забезпечити методами стерилізації а також включенням різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолсорбінової кислоти і тому подібного. Також може бути бажаним включення до композиції ізотонічних засобів, таких як цукру, хлориду натрію тощо. Крім того, тривале всмоктування фармацевтичної форми, яка ін'єккгується, може досягатися включенням засобів, які затримують всмоктування, таких як алюміній моностеарат і желатин.
Незалежно від обраного способу введення сполуки даного винаходу, яка може використовуватися у придатній формі гідрату, і/або фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом входять до складу фармацевтично прийнятних лікарських форм за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям в даній галузі техніки.
Фактичні рівні дозувань активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях даного винаходу можуть варіювати так, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для окремого пацієнта, композиції і способу введення, але не є токсичними для пацієнта. Вибраний рівень дозування залежатиме від цілого ряду фармакокінетичних чинників, включаючи активність окремих застосованих композицій даного винаходу, спосіб введення, час введення, швидкість виведення конкретної використаної сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або речовини, які використовуються в комбінації з конкретними застосованими сполуками, вік, стать, вагу, стан, загальний стан здоров'я і попередню історію хвороби пацієнта, якого необхідно лікувати, і подібних чинників, добре відомих в медицині.
Лікар або ветеринар, який є фахівцем в даній галузі, може легко визначити і призначити потрібну ефективну кількість фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати призначати дозування сполук винаходу, які вживаються у фармацевтичній композиції, З рівнів нижчих, ніж необхідні для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово збільшувати дозування до досягнення бажаного результату. Загалом, придатна щоденна доза композиції винаходу буде такою кількістю сполуки, яка є найнижчим дозуванням, ефективним для отримання терапевтичного ефекту. Як правило, така ефективна доза залежатиме від чинників, описаних вище. Бажано, щоб введення було внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочеревинним або підшкірним введенням, бажано введенням, розташованим
Зо проксимально щодо місцеположення мішені. За необхідності ефективна щоденна доза терапевтичної композиції може бути введена у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше субдоз, введених окремо з відповідними інтервалами впродовж всього дня, необов'язково в стандартних лікарських формах. Не дивлячись на те, що можливе введення сполуки даного винаходу окремо, бажаним є введення сполуки у вигляді фармацевтичної композиції.
У одному варіанті здійснення антитіла запропоновані винаходом можуть бути введені за допомогою вливання (інфузії), бажано повільного неперервного вливання протягом тривалого періоду, наприклад, більше 24 годин, для того, щоб зменшити токсичні побічні дії. Введення також може здійснюватися шляхом неперервного вливання протягом періоду від 2 до 24 годин, наприклад, від 2 до 12 годин. Такий режим може повторюватися один або більше разів, за потреби, наприклад, через б місяців або 12 місяців. Дозування можна визначити і відрегулювати, вимірюючи кількості циркулюючих моноклональних анти-СГОМб антитіл після введення в біологічному зразку, використовуючи анти-ідіотипові антитіла, націлені на анти-
СГОМб антитіла.
У іншому варіанті здійснення антитіла вводяться як підтримуюча терапія, наприклад, один раз на тиждень протягом періоду з 6 місяців або більше.
У іншому варіанті здійснення антитіла згідно винаходу можуть вводитися за допомогою режиму, який передбачає одне вливання антитіл проти СІ ОМб, а потім вливання антитіл проти
СГОМб, кон'югованого з радіоїзотопом. Цей режим можна повторити, наприклад, через 7-9 днів.
У одному варіанті здійснення винаходу терапевтичні сполуки винаходу введені в ліпосоми. У кращому варіанті здійснення ліпосоми включають націлюючий фрагмент (частку). У найкращому варіанті здійснення терапевтичні сполуки в ліпосомах доставляються шляхом болюсного вливання в місце, розташоване проксимально відносно бажаної області, наприклад, місцеположення пухлини. Композиція може бути текучою до такого ступеня, щоб легко вводитися за допомогою шприца. Композиція повинна бути стійкою в умовах виробництва і зберігання і повинна бути захищена від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби.
У додатковому варіанті здійснення антитіла запропоновані винаходом можуть бути розроблені так, щоб запобігти або зменшити їх транспорт крізь плаценту. Це можна зробити за 60 допомогою відомих в даній галузі техніки методів, наприклад, шляхом пегілювання антитіла або шляхом використання Е(абр) 2" фрагментів. Як додаткові посилання можна згадати "Сиппіпоапат-
АВипаієз С, 2йцо 7, СиИййН В, Кеєпап у. (1992) Віоіодіса! асіїмйіез ої роїуеїНуІепе-діусо! іпттітиподіобиїїп сопіддасе5. Кезічтапсе (о епгутаїйс дедгадайоп.» 9. Іттипої. Меїпоад5, 152: 177- 190; ї о "Гапдої М. (1995) Маїегпаї!-теїаІ іапеїег ої іттиподіорийййб5, Апп. АПегду Абвітта
Ітітипої.» 74: 279-283. "Терапевтично ефективну дозу" для лікування пухлин можна оцінити (визначити) за реальною відповіддю пухлини, при цьому відповідь може бути повною або частковою. Повна відповідь (СК) визначається як відсутність клінічного, радіологічного або іншого наочного підтвердження хвороби. Часткова відповідь (РЕ) - це зменшення загального розміру пухлини більше, ніж на 50 95. Середній час прогресу є мірою, яка характеризує тривалість об'єктивної відповіді пухлини. "Терапевтично ефективну дозу" для лікування пухлин можна також оцінити за її можливістю стабілізувати прогрес хвороби. Здатність сполуки інгібувати (припиняти) рак можна оцінити за допомогою тваринної моделі, яка прогнозує ефективність на пухлинах людини. Альтернативно, цю властивість композиції можна оцінити, вивчивши можливість сполуки інгібувати ріст клітин або (викликати) апоптоз за допомогою методів дослідження іп міго, відомих кваліфікованим практикам. Терапевтично ефективна кількість терапевтичної сполуки може зменшити розмір пухлини або іншим чином поліпшити симптоми у суб'єкта. Фахівець в даній галузі буде здатний визначити такі кількості, виходячи з таких чинників, як розмір суб'єкта, тяжкість симптомів у суб'єкта і обраної конкретної композиції або способу введення.
Композиція повинна бути стерильною і текучою до такого ступеня, щоб її можна було ввести за допомогою шприца. Окрім води, носій може бути ізотонічним, забуференним сольовим розчином, етанолом, поліолом (наприклад, гліцерином, пропіленгліколем і рідким поліетиленгліколем тощо) та їх відповідними сумішами. Належну текучість можна зберегти, наприклад, використовуючи покриття, такі як лецитин, зберігаючи бажаний розмір частинок у випадку дисперсії і використовуючи поверхнево-активні речовини. У багатьох випадках бажаним є включення до композиції ізотонічних засобів, таких як, цукри, поліспирти, такі як манітол, сорбітол або хлорид натрію. Тривале всмоктування композицій, для цій може досягатися включенням до композиції засобу, який затримує всмоктування, наприклад, алюмінію
Зо моностеарата і желатину.
Коли активна сполука відповідним чином захищена, як описано вище, сполуку можна вводити перорально, наприклад, з інертним розчинником або засвоєним їстівним носієм.
ЇМ. Застосування і способи винаходу
Антитіла (включаючи імунокон'югати, біспецифічні/умультиспецифічні молекули, композиції та інші похідні, описані тут) даного винаходу мають численні можливості терапевтичного застосування, які стосуються лікування порушень, які торкаються клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІОМб з клітинною поверхнею. Наприклад, антитіла можуть бути введені в клітини в культурі, наприклад, іп міго або ех мімо, або суб'єктові-людині, наприклад, іп мімо, з метою лікування або запобігання цілому ряду порушень, таких як описані тут. Переважно суб'єкти включають пацієнтів-людей, які мають порушення, які можна скоректувати або поліпшити, знищивши уражені хворобою клітини, зокрема, клітини, які характеризуються зміненою експресією СІ ОМб і/або зміненим зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею в порівнянні з нормальними клітинами.
Наприклад, в одному варіанті здійснення антитіла запропоновані даним винаходом можна використовувати для лікування суб'єкта з онкогенним порушенням, наприклад, порушенням, яке характеризується наявністю пухлинних клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СГ ОМ6 з клітинною поверхнею. Приклади онкогенних хвороб, які можна лікувати і/або запобігти, включають всі види раку, які експресують СІ ОМб, і пухлинні форми, включаючи, описані тут.
Фармацевтичні композиції і способи лікування, описані згідно винаходу, також можуть використовуватися для імунізації або вакцинації з метою запобігти хворобі, описаній тут.
У інших варіантах здійснення антитіла запропоновані винаходом можуть використовуватися для встановлення рівнів СОМЄ або конкретних форм СІ ОМб, або рівнів клітин, які містять
СІГОМб на поверхні мембран, причому потім рівні можна пов'язати з певними хворобами або симптомами хвороб, таких як описані вище. Альтернативно, антитіла можна використовувати для виснаження або впливу на функціонування клітин, які експресують СІОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, показуючи тим самим, що ці клітини є важливими посередниками хвороби. Це може досягатися шляхом контакту зразка і контрольного зразка з анти-СІ ОМ антитілом за умов, які допускають утворення комплексу між бо антитілом і СГОМб. Будь-які утворені антитілом і СГОМб комплекси виявляють і порівнюють в зразку і в контрольному зразку, тобто еталонному зразку.
На початку антитіла запропоновані винаходом можна протестувати щодо їх активності зв'язування, співвіднесеної з терапевтичним або діагностичним застосуванням іп міїго.
Наприклад, антитіла можна протестувати за допомогою проточної цитометрії, як описано тут.
Антитіла запропоновані винаходом можна використовувати для виявлення іп мімо або іп міго однієї або більше з поміж наступних біологічних активностей: інгібувати зростання і/або диференціювання клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ6 з клітинною поверхнею; знищувати клітини, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею; опосередкувати фагоцитоз або АОСС клітин, які експресують СІГОМ6б ії які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, у присутності ефекторних клітин; опосередкувати СОС клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, у присутності комплементу; опосередкувати апоптоз клітин, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням
СОМ з клітинною поверхнею; індукувати гомотипічну адгезію і/або викликати переміщення в ліпідні "плоти" після зв'язування СІ ОМб.
У окремому варіанті здійснення антитіла використовуються іп мімо або іп міго для того, щоб лікувати, запобігати або діагностувати ряд хвороб, пов'язаних з СІ ОМб. Приклади хвороб, пов'язаних з СІ ОМб, включають, серед інших типи раку, такі як описані тут.
Як описано вище, анти-СІ ОМб антитіла запропоновані винаходом можуть бути введені спільно з одним або більше іншими терапевтичними засобами, наприклад, цитотоксичним засобом, радіотоксичним засобом, антиангіогенним засобом або і імуносупресорним засобом, щоб зменшити індукцію імунних відповідей проти антитіл запропонованих даним винаходом.
Антитіло може бути пов'язаним із засобом (як імунокомплекс) або може вводитися окремо від засобу. У останньому випадку (окреме введення) антитіло може бути введене до, після або одночасно із засобом або може бути введено спільно з іншими відомими методами лікування, наприклад, протираковою терапією, наприклад, опромінюванням. Такі терапевтичні засоби включають, серед інших, анти-неопластичні засоби, як перераховані вище. Спільне введення анти-СІ ОМ антитіл даного винаходу із засобами хіміотерапії надає два протиракові засоби, які діють за допомогою різних механізмів, які цитотоксично впливають на пухлинні клітини. Таке
Зо спільне введення може вирішити проблеми, пов'язані з розвитком резистентності до лікарських засобів або зміною антигенності пухлинних клітин, коли вони не вступають в реакцію з антитілом.
Композиції (наприклад, антитіла, мультиспецифічні і біспецифічні молекули і імунокон'югати) винаходу, які мають сайти зв'язування комплементу, такі як частини ІдсІ-2 або -3 або ІдМ, які зв'язують комплемент, також можуть використовуватися у присутності комплементу. У одному варіанті здійснення обробка ех мімо популяції клітин, що містять клітини-мішені, зв'язуючим засобом винаходу і відповідних ефекторних клітин може доповнюватися додаванням комплементу або сироватки, яка містить комплемент. Фагоцитоз клітин-мішеней, покритих зв'язуючим агентом винаходу, може бути покращено зв'язуванням білків комплементу. У іншому варіанті здійснення клітини-мішені, покриті композиціями винаходу, також можуть бути лізовані комплементом. У ще одному варіанті здійснення композиції винаходу не активують комплемент.
Крім того, композиції винаходу також можуть бути введені разом з комплементом.
Відповідно, в рамках винаходу знаходяться композиції, які містять антитіла, мультиспецифічні або біспецифічні молекули і сироватку або комплемент. Ці композиції вигідні тим, що комплемент розташовується в безпосередній близькості до антитіл, мультиспецифічних або біспецифічних молекул.
Альтернативно, антитіла, мультиспецифічні або біспецифічні молекули винаходу і комплемент або сироватка можуть бути введені окремо. Зв'язування композицій даного винаходу з клітинами-мішенями може викликати переміщення комплексу СГОМб антиген- антитіло в ліпідні "плоти" клітинної мембрани. Таке переміщення створює високу щільність комплексів антиген-антитіло, що може ефективно активувати або підсилити СОС.
Крім того, в рамках даного винаходу знаходяться набори, які містять композиції антитіл запропонованих даним винаходом (наприклад, антитіла і імунокон'югати) та інструкції щодо їх застосування. Набір може додатково містити один або більше додаткових реагентів, таких як імуносупресорний засіб, цитотоксичний засіб або радіотоксичний засіб, або одне або більше додаткових антитіл запропонованих даним винаходом (наприклад, антитіло, яке має комплементарну активність).
Відповідно, пацієнтам, яких лікують композиціями антитіл запропонованих даним винаходом, додатково може вводитися (до, одночасно або після введення антитіла бо запропонованого винаходом) інший терапевтичний засіб, такий як цитотоксичний або радіотоксичний засіб, який підсилює або підвищує терапевтичний ефект антитіл запропонованих даним винаходом.
У інших варіантах здійснення суб'єкта можна додатково лікувати модулюючими засобами, наприклад, які підсилюють або інгібують, експресію і активність Ес-гамма або Ес-альфа рецепторів, наприклад, лікувати суб'єкта цитокінами. Кращі цитокіни включають гранулоцитарний колонієстимулюючий чинник (05-С5Е), гранулоцитарно-макрофагальний колонієсєтимулюючий чинник (ЗМ-С5Е), інтерферон-у (ІЕМ-у) і чинник некрозу пухлин (ТМЕ).
Іншими важливими засобами для підвищення терапевтичної ефективності антитіл і фармацевтичних композицій, описаних тут, є ДВ-глюкани, гомополісахариди розгалужених залишків глюкози, які продукуються цілим рядом рослин і мікроорганізмів, наприклад, бактеріями, водоростями, грибами, дріжджами і хлібними злаками. Також можуть використовуватися фрагменти ДВ-глюканів, які продукуються організмами. Бажано р-глюкан є полімером ВДВ(1,3) глюкози, в якому, щонайменше, деякі з глюкозних одиниць скелету, наприклад, 3-6 95 глюкозних залишків скелету, мають гілки, такі як В-(1,6) відгалуження.
У окремому варіанті здійснення винахід пропонує способи виявлення наявності СІ ЮОМб антигену в зразку, або вимірювання кількості СІ ОМб-антигена, які передбачають контакт зразка і контрольного зразка з антитілом, яке специфічно зв'язується з СІ ОМб, за умов, що допускають утворення комплексу між антитілом або його частиною і СІ ОМб. Потім визначається утворення комплексу, при цьому відмінність між утворенням комплексу в зразку в порівнянні з контрольним зразком служить ознакою наявності СІ ОМб-антигена в зразку.
У іншому варіанті здійснення винахід пропонує спосіб визначення наявності або визначення кількості клітин, які експресують СІ ОМб і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею іп мімо або іп міго. Спосіб передбачає (ї) введення суб'єктові композиції винаходу, сполученої з виявленим маркером, і (її) проведення виявлення у суб'єкта вказаного виявленого маркера за допомогою засобів виявлення, щоб встановити області, які містять клітини, які експресують СІГОМб і які характеризуються зв'язуванням СІГОМб з клітинною поверхнею.
Описані вище способи є придатними, зокрема, для діагностування хвороб, пов'язаних з СІ ЮМб, і або локалізації хвороб, пов'язаних з СІ ОМб, таких як ракові хвороби. Збільшена кількість
СГОМб в зразку, вища, ніж кількість СГОМбЄ в контрольному зразку, служить ознакою наявності хвороби, пов'язаної з СІ ОМб, у суб'єкта, зокрема людини, від якої отриманий даний зразок.
При використанні в описаних вище способах описане тут антитіло може бути надане з міткою, яка функціонує щоб: (ї) надати виявлений сигнал; (ії) взаємодіяти з іншою міткою, щоб модифікувати виявлений сигнал, який надається першою або другою міткою, наприклад, ЕКЕТ (флуоресцентне резонансне перенесення енергії); (ії) впливати на рухливість, наприклад, електрофоретичну рухливість, за допомогою заряду, гідрофобності, форми або інших фізичних параметрів, або (ім) забезпечити захоплення частинки, наприклад, афінність (спорідненість), антитіло/"антиген або іонне комплексоутворення. Придатними мітками є такі структури, як флуоресцентні мітки, люмінесцентні мітки, хромофорні мітки, радіоізотопні мітки, ізотопні мітки, бажано стабільні ізотопні мітки, ізобарні мітки, ферментні мітки, мітки у вигляді часточок, зокрема металічних часточок, магнітних часточок, полімерних часточок, невеликі органічні молекули, такі як біотин, ліганди рецепторів або зв'язуючі молекули, такі як білки клітинної адгезії або лектини, мічені послідовності, які містять нуклеїновокислотні і/або амінокислотні залишки, які можна виявити, використовуючи зв'язуючі агенти тощо. Мітки включають, без обмеження, сульфат барію, йоцетамову кислоту, іопаноєву кислоту, іподат кальцію, натрію диатризоат, меглумін диатризоат, метризамід, натрію тиропаноат і радіодіагностичні, включаючи випромінювачі позитронів, такі як фтор-18 і вуглець-11, гамма-випромінювачі, такі як йод-123, технецій-99т, йод-131 і індій-111, нукліди для ядерного магнітного резонансу, такі як фтор і гадоліній.
У іншому варіанті здійснення імунокон'югати винаходу можуть використовуватися для націлювання сполук (наприклад, терапевтичних засобів, міток, цитотоксинів, радіотоксинів, імуносупресорів тощо) на клітини, які мають СІОМб сполучений з поверхнею, шляхом зв'язування таких сполук з антитілом. Таким чином, винахід також пропонує способи локалізації ех мімо або іп міго клітин, які експресують СІ ОМ6б і які характеризуються зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею, наприклад, циркулюючих пухлинних клітин.
Даний винахід додатково проілюстрований за допомогою наступних прикладів, які не слід тлумачити як такі, що обмежують рамки винаходу.
Приклади
Використані тут процедури і методи описуються і здійснюються власне відомим способом і як описано, наприклад, в Затрбгоок еї аї., МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї, 2714 Еайіоп бо (1989) Со 5ргіпд Нагбог І арогаїогу Ргез5, Соїй 5ргіпд Нагброг, М.У. Всі методи, включаючи використання наборів і реагентів, здійснюються відповідно до інструкцій виробника, якщо спеціально не вказане інше.
Приклад 1. Кількісне визначення експресії СІ ОМб в нормальних тканинах, ракових тканинах і лініях клітин за допомогою ПЛР із зворотною транскрипцією в масштабі реального часу (ВТ-
ПЛР)
Загальну клітинну РНК екстрагували із заморожених зразків тканини і ліній ракових клітин за допомогою набору КМеазу Міпі Кії (Оіадеп), гібридизували (ргітеа м/йй) аТв олігонуклеотидом і піддавали реакції зворотної транскрипції з еирегв5огірі Її (С5ІВСО/ іїесесі) відповідно до рекомендацій виробника. Цілісність отриманої кДНК перевіряли шляхом ампліфікації транскриптів р5З3 протягом 30 циклів ПЛР. Після нормування по НРКТ кількісно визначили експресію СІ ОМ6б за допомогою обчислення 55 :Т.
Був протестований кожен нормальний тип тканини від трьох індивідуумів. У нормальних тканинах можна було виявити тільки кількості слідів транскриптів СІ ОМбЄ після проведення 40 циклів КТ-ПЛР. Єдиною нормальною тканиною, яка трохи перевершує мінімальну експресію, була плацента.
На відміну від нормальних тканин, висока експресія СІ ОМб була виявлена в зразках карциноми яєчника (аденокарциноми), раку легенів (М5СІ С, з найвищою частотою і рівнями експресії в аденокарциномі), раку шлунку, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри (базальноклітинна карцинома і плоскоклітинна карцинома), злоякісної меланоми, раку голови і шиї (злоякісна плеоморфна аденома), саркоми (синовіальна саркома і карциносаркома), раку жовчних проток, нирковоклітинного раку (світлоклітинна карцинома і папілярна карцинома), раку матки і ракових клітинних ліній А2780 (карцинома яєчника), МІН-«ОМСАКЗ (карцинома яєчника), НСТ-116 (рак товстого кишечника), ЕБО-27 (карцинома яєчника), СРС-М (ЗСІ С), МСІ-НЬ52 (М5СІ С), 5МО-1 (рак шлунку), КАТОЇІЇ (рак шлунку), ХАРС (рак підшлункової залози), ЛОБ (рак шлунку), РО9У7 (рак шлунку), МКМ7 (рак шлунку).
Приклад 2. Кількісне визначення експресії СІ ОМб в нормальних тканинах, тканинах раку і лініях клітин за допомогою Вестерн-блотінга
Для Вестерн-блотінга використовували 20 мкг загального білка, виділеного з клітин,
Зо лізованих за допомогою лізуючого буфера Лемлі. Екстракти розводили в відновлюючому буфері для зразка (Коїй), проводили 505-РАСЕ і потім переносили електроблотінгом на РМОБ- мембрану (Раї). Імунофарбування проводили з використанням поліклональних антитіл до
СІГОМб (АЕР) і бета-актину (Абсат) з подальшим виявленням первинних антитіл за допомогою кон'югованих з пероксидазою хріну козячих антимишачих і козячих антикролячих вторинних антитіл (Юако).
Був протестований лізат кожної нормальної тканини від п'яти індивідуумів. Експресія білка
СІОМб не була виявлена ні в одній з досліджених нормальних тканин. На відміну від нормальних тканин, висока експресія білка СІ ОМб була виявлена в зразках карциноми яєчника і раку легені. Експресія СІ ОМб була виявлена в МІН-ОМСАКЗ (карцинома яєчника), МКМ7 (рак шлунку), ЛОБ (рак шлунку), СРО-М (ЗОЇ С), НСТ-116 (рак товстої кишки), РО97 (рак шлунку),
МЕС8 (ембріональна карцинома яєчка), УАК (плацентарна хоріокарцинома), УЕСЗ (плацентарна хоріокарцинома), ВЕУМО (плацентарна хоріокарцинома) і РА-1 (тератокарцинома яєчника).
Приклад 3. Імуногістохімічний (ІНС) аналіз експресії СІ ОМ6 в нормальних тканинах і ракових тканинах
Зрізи тканин (4 мкм), залитих в парафін, інкубували протягом 1 години при 58 "С на платформі з підігрівом (НІ 1220, І еіса). Парафін видаляли із зрізів, інкубуючи зрізи в Коїїсієаг (Коїй) протягом 2 х 10 хвилин за кімнатної температури. Потім зрізи регідрували в наборі спиртів із ступінчастою концентрацією (99905, 2 х 9695, 80 9о і 7095, 5 хвилин в кожному).
Вилучення антигену здійснювали кип'ятінням мікроскопічних препаратів (слайдів) при 120 "С (15 р5і) протягом 15 хвилин в 10 мМ цитратному буфері (рН 6,0) ж 0,05 95 Твін-20. Відразу після кип'ятіння препарати інкубували в РВ5 протягом 5 хвилин. Активність ендогенної пероксидази блокували 0,3 95 пероксидом водню в МЕОН протягом 15 хвилин за кімнатної температури. Щоб уникнути неспецифічного зв'язування, препарати блокували 10 95 козячою сироваткою в РВ5 протягом 30 хвилин за кімнатної температури. Після цього, препарати інкубували з СІ ОМб- специфічними поліклональними антитілами (1 мкг/мл) (АКР) протягом ночі при 4 "С. Наступного дня препарати промили РВ5 за кімнатної температури (3 х 5 хвилин) і інкубували з 100 мкл вторинних антитіл (Роуегмізіоп полі НЕКР-анти-кролик дс, готові до використання (Іттипо! одіс)) протягом 1 години за кімнатної температури. Після цього, препарати промили
РВЗ за кімнатної температури (3 х 5 хвилин). Остаточне фарбування проводили, бо використовуючи набір МЕСТОК МОМАКЕЮО Бибзігагє Кий 5К-4800 від Месіог Іарогаїйогіє5
(Вигіпдате). Зрізи дофарбовували гематоксиліном протягом 90 сек за кімнатної температури.
Після зневоднення в наборі спиртів із зростаючою концентрацією (70 95, 80 95, 2 х 96 95 і 99 9, 5 хвилин в кожному), і 10 хвилинної інкубації в ксилолі препарати покривали за допомогою набору
Х-на Кії (Меадіїе Нізюїеснпіс).
Експресія білка СІОМ6Є не була виявлена в нормальних тканинах легені, яєчника, шлунку, товстої кишки, підшлункової залози, печінки, дванадцятипалої кишки або нирки. На відміну від нормальних тканин, сильне або, щонайменше, значне фарбування спостерігалося в зрізах уражених тканин, таких як тканини з карциномою яєчника, раком легені, раком шкіри, раком підшлункової залози, раком шлунку, раком молочної залози, раком сечового міхура (перехідно- клітинна карцинома), раком шийки матки, раком яєчка (семінома) і раком матки. Виразно акцентоване фарбування спостерігалося на плазматичних мембранах епітеліальних клітин злоякісної популяції, тоді як прилеглі стромальні і незлоякісні епітеліальні клітини не забарвлювалися. Ці результати демонструють, що білок СІОМб розташовується на плазматичній мембрані злоякісних клітин.
Приклад 4. Отримання мишачих антитіл до СІ 0ОМб а. Отримання векторів експресії, які кодують повнорозмірний СІ ОМб і фрагменти СІ ОМб
Штучна кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕ ІО МО: 3), яка кодує повнорозмірний
СІ ОМ6 (МСВІ реєстраційний номер МР 067018.2, ЗЕО ІО МО: 2), була отримана за допомогою хімічного синтезу (ЗЕМЕАКТ АС, Німеччина) і клонована у вектор рсоОМАЗ.1/тус-НІів (Іпмйтодеп,
США), утворивши вектор р3953. Вставка стоп-кодона давала можливість експресії білка СІ ОМб без з'єднання з вектором, який кодує тус-Ні5 їад. Експресію СГ ОМбЄ перевірили за допомогою
Вестерн-блотінга, проточної цитометрії і імунофлуоресцентного аналізу з використанням комерційно доступних анти-СІ ОМб антитіл (АКР, 01-8865; НО Зузієтв, МАВЗ656).
Крім того, була отримана кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 4), яка кодує очікуваний позаклітинний фрагмент домену 2 (ЕС2) СГ ОМ6б (5ЕО ІЮО МО: 6) при об'єднанні з М- кінцевою Ід каппа лідерною послідовністю, отриманою від сигнального пептиду, а потім 4 додатковими амінокислотами, щоб забезпечити відповідну ділянку рестрикції сигнальною пептидази (ЗЕО ІО МО: 5), і клонована в рсрОМАЗ.1/тус-Нів вектор, утворюючи вектор р3974. До імунізації експресія фрагмента ЕС2 була підтверджена за допомогою імунофлуоресцентної
Зо мікроскопії на транзиєнтно трансфікованих і фіксованих параформальдегідом (РЕА) клітинах
СНО-КІ за допомогою комерційно доступних анти-тус антитіл (Сеї! Зідпаїїпа, МАВ 2276).
Б. Отримання клітинних ліній, які стабільно експресують СІ ОМб
Клітинні лінії НЕК293 і РЗ х 63АдВи.І, які стабільно експресують СІ ОМ, були отримані за допомогою стандартних методів з використанням вектора р3953. с. Імунізація.
Мишей Ваїр/с імунізували 25 мкг плазмідною ДНК р3974 разом з 4 мкл РЕІ-манози (РЕІ-Мап; іп мімо-їеїРЕІ! м-Мап від компанії РоїуРіи5 Тгапетесіоп) (150 мМ РЕЇІ-Мап в НО з 5 95 глюкози) шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції в 0, 16 і 36 днів. На 48 день і 62 день мишей імунізували шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції мієломними клітинами РЗ х 63ЗАд8И.І, трансфікованими вектором р3953 для стабільної експресії СІ ОМб. Клітини, введені на 62 день, до ін'єкції опромінювали 3000 радій. Наявність антитіл проти СГОМЄ в сироватці мишей контролювали за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії між днями 20 ї 70, використовуючи СНО-К1 клітини, ко-трансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують СІ ОМб і СЕР. Для цього через 24 години після трансфекції РЕА-фіксовані або нефіксовані клітини інкубували з сироваткою від імунізованих мишей при розведенні 1:100 протягом 45 хвилин за кімнатної температури (КТ).
Клітини промивали, інкубували з міченими АІеха555 анти-мишачими Ід антитілами (МоіІесшаг
Ргобевз) і досліджували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.
У зразках сироватки, отриманої від миші, на основі якої була отримана гібридома Е3-6С3-
Н8, були виявлені анти-СІ ЮОМб специфічні антитіла; див. Фіг. 2.
Для отримання моноклональних антитіл мишей з виявленими анти-СІОМб імунними відповідями стимулювали за чотири дні до спленектомії за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2 х 107 клітин НЕК293, стабільно трансфікованих вектором р3953. а. Отримання гібридом, які продукують мишачі моноклональні антитіла до СІ ОМб
Спленоцити (б х 107), виділені з імунізованої миші, були сполучені з клітинами (3 х 107) мієломи мишей РЗ х 63А98.653 (АТСС, СКІ 1580) за допомогою РЕС 1500 (Коспе, СК. 10783641001). Клітини висівали приблизно 5 х 102 клітин на комірку в титраційні мікропланшети з плоским дном і культивували приблизно протягом двох тижнів в селективному середовищі
ЕРМІ, яке містить 10 95 інактивованої нагріванням ембріональної телячої сироватки, 1 95 добавок для зростання клітин (пубгідота їи5іоп апа сіопіпд зирріетеп) (НЕС5, Коспе, СК. 60 11363735), 10 мМ НЕРЕЗ5, 1 мМ пірувату натрію, 4,5 956 глюкози, 0,1 мМ 2-меркаптоетанол, 1 х пеніцилін/стрептоміцин і ї х НАТ добавки (Іпмігодеп, СК 21060). Через 10-14 днів окремі комірки скринували за допомогою проточної цитометрії на анти-СГ ОМ моноклональні антитіла.
Секретуючі антитіла гібридоми були субклоновані методом серійних розведень і знову протестовані на анти-СОМб моноклональні антитіла. Стабільні субклони культивували в середовищі для культури тканини, щоб отримати невеликі кількості антитіл для характеристики.
Від кожної гібридоми був вибраний, щонайменше, один клон, який зберіг реакційну здатність материнських клітин (перевірену за допомогою проточної цитометрії). Для кожного клону були створені панелі з дев'яти ампул, які зберігали в рідкому азоті.
Приклад 5. Характеристики зв'язування супернатантів, отриманих від гібридом і моноклональних антитіл. а. Контроль якості тимчасово трансфікованих клітин НЕК293Т за допомогою (ії) Вестерн- блотінга і (ії) проточної цитометрії () Клітини НЕК293Т були трансфіковані нуклеїновими кислотами, які кодують СІОМЗ3,
СІ ОмМ4, СІ ОМб, ії СГ ОМО, відповідно, або фіктивно-трансфіковані. Експресію СГОМ3, СІ ОМ,
СІ ОМб або СІ ОМУ9 в клітинах НЕК293Т визначали за допомогою Вестерн-блотінга. Для цього клітини збирали через 24 години після трансфекції і лізували. Лізат піддавали ДСН- електрофорезу (505-РАСЕ), переносили на мембрану нітроцелюлози і фарбували анти-СІ ОМ (А) (Іпмйгодеп, 34-1700), анти-СІ ОМА(А) (7утеа, 32-9400), анти-СОІ Мб(А) (АВР, 01-8865) або анти-СІ ОМОУ(А) (Запіа Сти7, 5с-17672) антитілами, які специфічно зв'язувалися з С-кінцем відповідного клаудину за денатуруючих умов. Після інкубації з міченими пероксидазою вторинними антитілами і проявлення реагентом ЕСІ. використовували барвник ІГАЗ-3000 (Рції) для візуалізації. Смуги очікуваних молекулярних мас СІГОМ3, СІОМ4, СІОМб їі СГОМО, відповідно, спостерігалися тільки в трансфікованих клітинах, але не в контрольних клітинах (Фіг. 3), показуючи, що клітини НЕК293Т не експресують ендогенно який-небудь з досліджених клаудинів і, таким чином, є придатним інструментом для визначення перехресної реактивності
СІ ОМб-антитіл. (і) Клітини НЕК293Т (ї) були додатково проаналізовані методом проточної цитометрії з використанням анти-СІ ОМ-антитіл, які розпізнають нативні епітопи (анти-СІ ОМЗ Ідб2а миші (КО, МАВ4620), анти-С ОМА Ідб2а миші (К85О0, МАВ4219), анти-СОМб Ід625 миші (КО,
Зо МАВЗ656)). Антитіла, отримані від компанії Зідта під серійними номерами МУ9144 і М8894, служили контролями ізотипу. Специфічність цих анти-СІ ОМ-антитіл була проаналізована за допомогою клітин НЕК293Т, тимчасово трансфікованих нуклеїновими кислотами, які кодують
СІГОоМ3, СГОМ4, СІОМб, і СГ ОМО, відповідно. Анти-СГОМб антитіла проявляли перехресну реактивність щодо СІГОМ3, СІ ОМ4 ії СГОМУ. Анти-СОМ4 антитіла проявляли перехресну реактивність щодо СІ ОМ3, СІ ОМб і СГОМУ. Анти-СІ ОМЗ антитіла специфічно зв'язувалися з
СІ ОМ (Фіг. 4). р. Визначення специфічності моноклональних антитіл, отриманих відповідно до винаходу, за допомогою проточної цитометрії
Клітини НЕК293Т були ко-трансфіковані вектором, який кодує різні білки СІ ОМ, і вектором, який кодує флуоресцентний маркер. Через 24 години після трансфекції клітини зібрали за допомогою 0,05 95 розчину трипсин/ЕДТА і промили буфером БАС (РВБ, що містить 2 95 ЕС5 і 0,1 95 азиду натрію). Клітини перенесли в титраційні мікропланшети з О-подібним дном в кількості 2 х 105 клітин на комірку і інкубували протягом 60 хвилин при 4 "С з супернатантами від гібридоми. Після промивки буфером БГАСЗ (три рази) клітини інкубували з кон'югованими з алофікоцианіном (АРС) анти-миша Ідс Індан2р-3 специфічними вторинними антитілами (Оіапома, 115-135-164). Після цього клітини двічі промили, а величину зв'язування оцінили методом проточної цитометрії за допомогою ВО БАСЗАЇ!гтау (Фіг. 5). Експресію флуоресцентного маркера наносили на вісь абсцис відносно зв'язування антитіл по осі ординат. Як позитивний контроль використовували комерційно доступні анти-С ОМб Ідш2Ь антитіла миші (К80О,
МАВЗ656), а антитіла від компанії Зідта під серійним номером М8894 служили контролем ізотипу.
Антитіла в супернатантах від моноклональних субклонів гібридоми Е3-6С3-Н2, Е3-6С3-НВ,
Е3-6С3-НО, Е3-6С3-08 і Е3-6С3-04, всі отримані від гібридоми Е3-6С3, були специфічними до
СІ ОМ і не зв'язувалися з СІ ОМО, СІ ОМ3З і СІ ОМ4. Наприклад, Фіг. БА показує результати для моноклонального субклону гібридоми Е3-6С03-Н8. Антитіла в супернатантах від моноклонального субклону гібридоми Е3-6С03-Н8 також зв'язувалися з клітинами, трансфікованими варіантом (1143М) -«5МР СІ ОМ. Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е4-4Е7-Б2 зв'язувалися як з СГ ОМб, так і з СІ ОМО (фіг. 5А). Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-783-84 зв'язувалися з СІ ОМб, СІ ОМЗ3 бо і СІ ОМ (Фіг. 58). Антитіла в супернатанті від моноклонального субклону гібридоми Е3-3Е7-А5 зв'язувалися з СІ ОМб, СІ ОМа4 і СІ ОМ (Фіг. 58).
Приклад 6: Отримання і тестування моноклональних антитіл до СІ ОМб а. Отримання вектора експресії, який кодує позаклітинний домен СІ ОМ
Кодон-оптимізована послідовність ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 12), яка кодує очікуваний позаклітинний фрагмент домену 1 (ЕС1) СГ ОМб (ЗЕО ІО МО: 7), об'єднана з М-кінцевою Ід каппа лідерною послідовністю, отриманою від сигнального пептиду, а потім 4 додатковими амінокислотами, щоб забезпечити відповідну ділянку рестрикції сигнальної пептидази (ЗЕО ІЮО МО: 13), була отримана і клонована в рсОМАЗ.1/тус-Ніз вектор, утворюючи вектор р3973. До імунізації експресія фрагмента ЕС1 була підтверджена за допомогою імунофлуоресцентної мікроскопії на тимчасово трансфікованих і фіксованих параформальдегідом (РЕА) клітинах СНО-КІ за допомогою комерційно доступних анти-тус антитіл (Сеї! Зідпаїпо, МАВ 2276). р. Імунізація
Мишей Ваїр/с імунізували 25 мкг плазмідною ДНК р3973 разом з 4 мкл РЕІ-манози (РЕІ-Мап; іп мімо-|(еєРЕ! гм-Мап від компанії РоїуРіи5 ТгапетТесійоп) (150 мМ РЕЇІ-Мап в Н2О з 5 95 глюкози) за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції на 0 ії 14 день. На 28 і 44 день мишей імунізували підшкірно КІСН-кон'югованими пептидами ЗЕО ІО МО: 14 ії 5ЕО ІЮО МО: 15 (100 мкг кожного в
РВ5, УРТ Рерііде Тесппоїодіез ЗМВН, Німеччина) разом з очищеним за допомогою ВЕЖХ РТО-
Сра-орМ (25 мкг в РВ5; 5-ТССАТОАСОСТТССТОАСОТТ; Єигоїп5 МУ Орегоп, Німеччина). На 64, 77 і 97 день мишей імунізували за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2 х 107 РЗ х 6ЗАдви.І клітин мієломи, трансфікованих вектором р3953 для стабільної експресії СІ ОМб.
Перед введенням клітини були оброблені мітоміцином С (2,5 мкг/мл, Зідта-Аїагіспй, М4287). На 64 і 97 день клітини були введені разом з очищеним за допомогою ВЕЖХ РТО-Сра-орм (50 мкг в РВ5), а на 77 день разом з неповним ад'ювантом Фрейнда. Для продукування моноклональних антитіл, мишей з детектованою анти-СІ ОМб6 імунною відповіддю стимулювали за чотири дні до спленектомії за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції 2 х 107 клітин
НЕК293, стабільно трансфікованих вектором р3953. с. Тестування моноклональних антитіл до СІ ОМб
Проточна цитометрія
Для тестування зв'язування моноклональних антитіл з СГ ОМб і його гомологами, клітини
Зо НЕК293Т були тимчасово трансфіковані відповідною кодуючою клаудин плазмідою, при цьому експресію аналізували проточною цитометрією. Щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітини, клітини НЕК293Т були котрансфіковані флуоресцентним маркером як репортер. Через 24 години після трансфекції клітини збирали за допомогою 0,05 95 трипсин/ЕОТА, промивали буфером ЕГАСЗ5 (РВ5, який містить 2 95 ЕС і 0,1 95 азиду натрію) і ресуспендували в ЕАС5- буфері в концентрації 2 х 105 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з відповідними антитілами у вказаних концентраціях протягом 30 хвилин при 4 "С. Антитіла, які проявляють перехресну реакційну здатність, використовували для детекції експресії СГОМб їі СІ ОМ.
Комерційно доступні мишачі анти-клаудин антитіла анти-СІ ОМЗ (850, МАВ4620) і анти-СІ ОМА (К80О, МАВ4219) служили позитивним контролем, тоді як мишачі Ід9с2а (5ідта, МУ9144) і Ід652Б (Зідта, М8894), відповідно, служили контролем ізотипу. Клітини тричі промивали ЕАС5- буфером і інкубували з АРС-кон'югованими анти-мишачими ІдсС Ін2ан2бянЗа специфічними вторинними антитілами (Оіапома, 115-135-164) протягом 30 хвилин при 4 "С. Клітини двічі промивали і ресуспендували в РЕАС5З-буфері. Зв'язування аналізували за допомогою проточної цитометрії з використанням ВО ЕГАСЗАЇІтау. Експресію флуоресцентного маркера наносили на графік по осі абсцис відносно зв'язування антитіла по осі ординат. (Ф/в)о;
Комплемент-залежну цитотоксичність (СОС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутріклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського комплементу до клітин- мішеней, які інкубуються з анти-СОМб антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
Клітини СНО-КІ, стабільно трансфіковані СІ ОМб (СНО-К1-СІ ОМб), збирали за допомогою 0,0595 трипсин/ЕЮТА, двічі промивали середовищем Х-Мімо 15 (І0опга, ВЕО04-4189) і ресуспендували в концентрації 1 х 107 клітин/мл в середовищі Х-Мімо 15. 250 мкл клітинної суспензії переносили в 0,4 см кювету для електропорації і змішували 3з 7 мкг іп мійго транскрибованої РНК, яка кодує люциферазу (Іссітегазе ІМТ ЕММА). Проводили електропорацію клітин при 2008ЩВ ії 300 мкФ за допомогою Сепе Риїзег Хсеї! (Віо Кай). Після електропорації клітини ресуспендували в 2,4 мл теплого середовища Ю-МЕМ/Е12 (11) з Сішамах-ї (Іпмігодеп, 31331-093), яке містить 1095 (06/06) ЕС5, 195 (о06б./06.) пеніциліну/стрептоміцину і 1,5 міліграм/мл 5418. Висіювали 50 мкл клітинної суспензії на комірку в прозорий 96-комірковий РР- бо планшет і інкубували при 37 "С і 7,595 СО». Через 24 години після електропорації до клітин 5О0 додавали 50 мкл моноклональних мишачих анти-СІ ОМб антитіл в 60 95 ЕРМІ (що містить 20 мМ
НЕРЕЗ) і 40 95 людської сироватки (суміш сироваток, отримана від шести здорових донорів) у певних концентраціях. 10 мкл 8 95 (06./06.) Тритону Х-100 в РВ5 на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків
Б додали 10 мл РВ5 на комірку. Після інкубації протягом 80 хвилин при 37 "С і 7,5 96 СО» додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл ЮО-люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ
НЕРЕЗ в аанго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 45 хв. за кімнатної температури. Люмінесценцію вимірювали за допомогою люминометра (Іпіїпйе М200, ТЕСАМ).
Результати дані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ 0).
Проводили електропорацію МЕС8 клітин при 2008 і 400 мкФ і культивували в КРМІ 1640 в середовищі СІ ЮТАМАХ-Ї (Іпмігодеп, 61870), яке містить 10 95 (06./06.) ЕС 5.
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізис (9в| - 100 - (зразок -- загальний лізис)/ (максимум життєздатних клітин -- загальний лізис) х 100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (06./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл
Раннє лікування
Для раннього лікування антитілами 2 х 107 МЕС8 клітин в 200 мкл РВ5 підшкірно інокулювали в бік безтімусних мишей Миде-Рохп1"». Кожна експериментальна група складалася з самок мишей 6-8 тижневого віку. Через три дні після інокуляції протягом 46 днів вводили 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тимАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А двічі на тиждень, почергово, за допомогою внутрішньовенних і внутрішньоочеревинних ін'єкцій.
Експериментальні групи, оброблені РВ5, служили негативним контролем. Об'єм пухлин (ТМ - (довжина х ширинаг2)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Коли пухлина досягала об'єму більше ніж 1500 мм3у, мишей забивали. й. Результати
Мишачі моноклональні антитіла тимАВ 59А, б6бА, 610, 64А, 65А, 668В і 67А показали сильне зв'язування з людським СІ ОМб і СІ ОМ6 ЗМР (одиночний нуклеотидний поліморфізм) варіантом
Зо І143М, але не спостерігалося зв'язування з СІ ОМ, 4 і 9 (Фіг. 6).
МиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А показали дуже низькі значення ЕСвзо (ЕСво 200- 500 нг/мл), при цьому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій (Фіг. 7).
МиМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 668 і 67А продемонстрували дозозалежну СОС -активність і викликали СОС за низьких концентрацій (Фіг. 8). Анти-СІ ОМб-антитіла тимАВ 65А і 668 викликали СОС на клітинах МЕС8 дозозалежним чином (Фіг. 9). Специфічність до мішені тиМАВ 65А і 66В поліпшувалася при використанні клітин МЕС8 І МТ52 54 (СІ ОМ6б нокаутні).
Крім того, тимМАВ 59А, бОА, 610, 64А, 65А, 66В і 67А показали інгібування зростання пухлини у мишей з прищепленими клітинами МЕСЗ8 (Фіг. 10).
Приклад 7. Отримання і тестування химерних моноклональних антитіл до СІ ОМб а. Отримання мишиних/людських химерних моноклональних антитіл
Для химеризації варіабельну область мишачого важкого ланцюга і легкого ланцюга, включаючи лідерні послідовності, ампліфікували за допомогою ПЛР і праймерів, перерахованих в таблиці нижче. Мишачі важкі ланцюги об'єднували за допомогою сайту рестрикції АРАЇ (5'- асасасоо-3) з М-кінцевою частиною людського ланцюга Есгамма!, який кодується вектором експресії. Варіабельні домени мишачого каппа ланцюга, включаючи лідерні послідовності, клонували попереду константної області з використанням сайту рестрикції В5ІММІ. Відповідну орієнтацію константної області у векторі, тобто відповідну для попереднього промотора вектора, підтвердили секвенуванням. Унаслідок положення сайту рестрикції АРАЇ, будь-яка ампліфікація варіабельної області, включаючи лідерну послідовність, з цією метою повинна включати перші 11 нуклеотидів послідовності людської гамма-1 константної області на додачу до послідовності сайту АРАЇ. Нуклеотидна послідовність людської константної області гамма-1 важкого ланцюга числиться як ЗЕО ІЮ МО: 24, амінокислотна послідовність експресованої людської гамма-1 константної області числиться як 5ЕО ІЮ МО: 25. Нуклеотидна послідовність, яка кодує константну частину каппа легкого ланцюга, числиться як ЗЕО ІЮ МО: 26, відповідна амінокислотна послідовність числиться як ЗЕО ІЮ МО: 27.
Таблиця 1. Мишачі лінії клітин гібридоми, які використовувались для клонування антитіл
Важкий ланцюг
Легкий ланцюг
Відповідно до мишачих аналогів хімерні моноклональні антитіла називаються, наприклад, спітАВ 64А, тобто додається префікс "світ".
Ампліфікація мишачих варіабельних областей легкого і важкого ланцюгів, включаючи лідерні послідовності, проводиться згідно методу "Зіер-оці ПЛР" описаному в Маї? еї аї. (Мисієїс
Асід5 Кезеагсп, 1999, Мої. 27, Мо. 6). Для цього отримують загальну РНК з моноклональних гібридомних клітинних ліній (див. таблицю 1) стандартними способами, відомими фахівцям в даній галузі техніки, наприклад, з використанням набору КМеазу Міпі КИ (Оіадеп).
Одноланцюгову кКДНК отримують відповідно до методу "перемикання матриці (ептріаге-5м/йсп)» також описаному в Маї? еї аї. (Мисієїс Асіа5 Кезеагсй, 1999, Мої. 27, Мо. 6, 1558). На додачу до (ат) 30 олігомера (5ЕО ІО МО: 28), вона включала ДНК/РНК гібридний олігомер (ЗЕО ІО МО: 29), який служить 5" адаптором перемикання матриці під час полімеризації нитки кКДНК. У цьому адапторному олігомері останні три нуклеотиди були рибо- замість дезоксирибонуклеотидів.
Подальша "З(ер-оцї ПЛР" використовувала антисмисловий олігомер, націлений на константну область мишачого каппа ланцюга або на константну область підкласу 2а гамма ланцюга (ЗЕО
ІО МО: З0 ї 31, відповідно). Підклас ЇД мишачих моноклональних антитіл, продукованих лінією клітин гібридоми, був раніше імунологічно проаналізований за допомогою Ізозігір (Коспе), і таким чином був вибраний відповідний антисмисловий олігомер (див. таблицю 1). Суміш праймерів служила як смисловий олігомер в "Зіер-оші ПЛР", причому вона містила два олігомери, які відносяться до ЗЕО ІЮО МО: 32 ії 33.
Встановлені мишачі варіабельні області, включаючи лідерні послідовності, потім були ампліфіковані за допомогою ПЛР, не включаючи 5' ШТ і 3" мишачу константну область, з додаванням сайтів рестрикції до кінців, які давали можливість субклонування в отримані вектори експресії, які несуть людські константні області. Крім того, смислові олігомери, які забезпечили консенсусну послідовність Козак (5-Я4ССИаССАССО-3) і антисмислових олігомерів для варіабельних областей важкого ланцюга, включали перші 11 нуклеотидів людською гамма- 1 константної області на додачу до сайту рестрикції АРАЇ (див. таблицю 1, 5ЕО ІЮ МО5: 17 10
Зо 23). Варіабельні області каппа легкого ланцюга, включаючи лідерні послідовності, були клоновані за допомогою ферментів рестрикції Ніпап ї ВБІМ/, варіабельні області гамма важкого ланцюга вимагали Ніпан ії АРАЇ ферменти рестрикції.
Крім того, були ампліфіковані мишачі варіабельні області легкого і важкого ланцюгів, включаючи лідерні послідовності, і були отримані додаткові хімерні моноклональні антитіла до
СГОМб відповідно до протоколу, розкритого вище.
Б. Отримання химерних моноклональних анти-СІ ОМб антитіл
Химерні моноклональні антитіла тимчасово експресувались в клітинах НЕК293Т (АТСС
СВІ -11268), трансфікованих плазмідною ДНК, яка кодує легкий і важкий ланцюги відповідного антитіла. За 24 години до трансфекції 8 х 10 клітин висівали на 145 мм чашки для культивування клітин і культивували в 25 мл середовища НЕК293Т (ОМЕМ/Е12-0І ОТАМАХ-Ї, 10 95 ЕС5, 1 95 пеніцилін/стрептоміцин). 20 мкг плазмідної ДНК розчинили в 5 мл середовища
НЕК293Т без добавок на чашку. Після додавання 75 мкл лінійного поліетиленіміну (РЕЇ) (1 міліграм/мл) (Роїузсіепсе, 23966) (ДНК:РЕЇ) -суміш інкубували 15 хвилин за кімнатної температури. Після цього до клітин краплями додавали суміш для трансфекції. Через 24 години після трансфекції НЕК293Т-середовище замінили Рго29З3а-середовищем (ІГопла, ВЕ12-7640), яке містить 1 95 пеніцилін/стрептоміцину. Для оптимальної експресії трансфіковані клітини культивували при 37 "С і 7,5 95 СО» протягом додаткових 96-120 годин. Супернатант збирали, очищали хімерні антитіла за допомогою ЕРІ С, використовуючи білок-А-колонки. Концентрацію антитіл визначали за допомогою 505-РАСЕ. с. Тестування химерних моноклональних антитіл до СІ ОМб
Проточна цитометрія
Щоб перевірити специфічність і афінність зв'язування СІ ОМб-специфічних химерних моноклональних антитіл з клітинами НЕК293, стабільно трансфікованими СІ ОМ3, 4, 6 або 9, відповідно, лінії пухлинних клітин, які ендогенно експресують СІ ОМб, були досліджені за допомогою проточної цитометрії. Для цього клітини збирали 0,0595 трипсином/ЕОТА, промивали ЕАС5ЗОбуфером (РВ5, який містить 2 95 ЕСЗ і 0,1 95 азиду натрію) і ресуспендували в ЕАС5-буфері за концентрації 2 х 106 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з відповідним антитілом за вказаних концентрацій протягом 60 хвилин при 4 "С. Химерне перехресно-реактивне антитіло (спітАВ 5202) використовували для визначення експресії
СІОМб ії СГ ОМУ. Комерційно доступні мишачі анти-клаудин антитіла анти-СІОМЗ3 (ВО,
МАВ4620) і анти-СГ ОМА (КО, МАВ4219) використовувались як позитивні контролі, тоді як людський ІдсС1і-каппа (Зідта, 15154) служив негативним контролем. Клітини три рази промивали РАС5З-буфером і інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С з АРС-кон'югованим козиним анти-людина дО Ес-гамма (Оіапома, 109-136-170) або АРС-кон'югованими анти-миша
Ід І-ган2бЗа (Оіапома, 115-135-164) специфічними вторинними антитілами, відповідно.
Клітини двічі промивали і ресуспендували в ЕАСЗ-буфері. Зв'язування аналізували за допомогою проточної цитометрії, використовуючи ВО ЕАСЗА!гтау. (Ф/в)о;
Комплемент-залежну цитотоксичність (СОС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутріклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського комплементу до клітин- мішеней, що інкубуються з анти-СІ ОМб антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
У цьому дослідженні використовували клітини дикого типу МЕС8 (СІ ОМб позитивні) і МЕС8
СІ ОМб-нокаутні клітини (СІ ОМ негативні), котрі, як ті, так і інші, були стабільно трансдуковані конструктом експресії люциферази. Клітини збирали 0,05 96 трипсином/ЕЮОТА і доводили до концентрації 2 х 105 клітин/мл в КРМІ середовищем СішамМах-! (Іпийгодеп, 61870-010), яке містить 10 95 (06./06.) ЕС5. 1 х 107 клітин висівали в прозорі 96-коміркові РР-планшети та інкубували протягом 24 годин при 37 "С і 595 СО». Після інкубації до клітин додали 50 мкл моноклональних химерних анти-СІ ОМб-антитіл в 60 95 ЕРМІ (що містить 20 мМ НЕРЕЗ) і 40 95 людської сироватки (суміш сироваток, отримана від шести здорових донорів) у певних
Зо концентраціях. 10 мкл 8 95 (06б./06.) Тритона Х-100 в РВ5З на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків додали 10 мл РВ5 на комірку. Після інкубації протягом 80 хвилин при 37 "С і 5 95 СО» додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл О-люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ НЕРЕ5 в аанго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 45 хв. за кімнатної температури.
Люмінесценцію вимірювали за допомогою люмінометра (Іпїпйе М200, ТЕСАМ). Результати подані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ 0).
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізисі9о|1-100-Кзразок -- загальний лізис)Хмаксимум життєздатних клітин -- загальний лізис)х100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (06./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл
АрСС
Антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС) визначали шляхом вимірювання вмісту внутрішньоклітинного АТФ в нелізованих клітинах після додавання людського РВМС до клітин- мішеней, які інкубуються з анти-СІ ОМб антитілами. Для вимірювання АТФ використовували люмінесцентну реакцію люциферази, як дуже чутливий аналітичний метод.
У цьому дослідженні використовували клітини дикого типу МЕС8 (СІ ОМб позитивні) і МЕС8
СІ ОМб-нокаутні клітини (СІ ОМб негативні), які, як ті, так ії інші, були стабільно трансдуковані конструктом експресії люциферази. Клітини збирали 0,05 96 трипсином/ЕЮОТА і доводили до концентрації 2 х 105 клітин/мл в ЕРМІ середовищем Сішамах-! (Іпмйгодеп, 61870-010), яке містить 10 95 (06./06.) ЕС5 і 20 мМ Нерев. 1 х 107 клітин висівали в прозорі 96-коміркові РР- планшети і інкубували 4 години при 37 "С і 5 95 СО».
РВМС (мононуклеарні клітини периферичної крові) виділяли із зразків людської донорської крові центрифугуванням в градієнті щільності з використанням Рісоїї! Нурадие (СЕ Неайвсаге, 17144003). Були виділені РМВС, як містять інтерфазу, клітини двічі промивали РВЗ/ЕОТА (2
ММ). 1 х 108 РВМС висівали в 50 мл середовища Х-Мімо 15 (опа, ВЕ0О4-4180)), що містить 5 95 інактивованої нагріванням людської сироватки (І опга, О514-402Е), та інкубували протягом 2 годин при 37 "С і 5 96 СО.
Через 4 години після висівання клітин-мішеней (МЕС-8) до клітин додавали 25 мкл бо моноклональних химерних анти-СІ ОМб антитіл в РВЗ5 у вказаних концентраціях. Неприкріплені
РВМС, які відокремилися від прикріплених моноцитів протягом 2 годин інкубації, зібрали і відрегулювали концентрацію до 8 х 1056 клітин/мл в середовищі Х-мімо 15. 25 мкл цієї клітинної суспензії додали до клітин-мішеней і моноклональних химерних анти-СІ ОМ антитіл. Планшети інкубували протягом 24 годин при 37 "С і 5 95 СО".
Через 24 години інкубації 10 мкл 8 95 (об./06.) Тритона Х-100 в РВ5 на комірку додали до контролів загального лізису, тоді як до контролів максимуму життєздатних клітин і до поточних зразків додали 10 мл РВ5 на комірку. Додали 50 мкл люциферинової суміші (3,84 міліграм/мл О- люциферину, 0,64 О/мл атфази і 160 мМ НЕРЕЗ в айанго) на комірку. Планшет інкубували в темноті протягом 30 хв. за кімнатної температури. Біолюмінесценцію вимірювали за допомогою люмінометра (Іпіпйе М200, ТЕСАМ). Результати дані у вигляді інтегрованих чисельних відносних світлових одиниць (КІ 0).
Специфічний лізис обчислювали таким чином:
Специфічний лізис (до| - 100-(зразок -- загальний лізис)//максимум життєздатних клітин -- загальний лізис)х100) максимум життєздатних клітин: 10 мкл РВ5, без антитіл загальний лізис: 10 мкл 8 95 (06./06.) Тритон Х-100 в РВ5, без антитіл й. Результати
Анти-СГОМб хімерні моноклональні антитіла спітАВ 610, 64А, 67А і 89А показали сильне зв'язування з людським СІ ОМб, тоді як зв'язування з СІ ОМ, 4 і 9 не спостерігалося (Фіг. 11).
Що стосується зв'язування з людським СІ ОМб, стабільно експресованим на поверхні клітин
НЕК293, анти-СІ ОМ хімерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 450-600 нг/мл) і насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СпітАВ 67А і 610 показали низьке (ЕСво 1000 нг/мл) і середнє (ЕСво 2300 нг/мл) значення ЕсСово, відповідно (Фіг. 12).
Що стосується зв'язування з СІ ОМб, ендогенно експресованим на клітинах МЕС8, анти-
СІГОМб хімерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 600-650 нг/мл), причому насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій, тоді як спітАВ 610 і 67А показали середнє (ЕСзо 1700 нг/мл) і високе (ЕСзо 6100 нг/мл) значення ЕсСобо, відповідно (Фіг. 13).
Зо Що стосується зв'язування з СІГОМб, ендогенно експресованим на клітинах ОМ90, анти-
СІГОМб хімерні моноклональні антитіла спітАВ 64А і 89А продемонстрували дуже низькі значення ЕСво (ЕСво 550-600 нг/мл), а насичення зв'язування досягалося за низьких концентрацій. СНІМАВ 610 і 67А показали середні значення ЕСво (ЕСво 1500 нг/мл і ЕСво 2300 нг/мл, відповідно) (Фіг. 14).
Анти-СІ ОМ хімерні моноклональні антитіла спітАВ 610, 644А, 67А і 89А продемонстрували дозозалежну СОС-активність на клітинах МЕС-8 (Фіг. 15).
Анти-СІГ ОМ хімерні моноклональні антитіла спітАВ 6бІЮ, 64А, 67А і 89А продемонстрували дозозалежну АЮСсС-активність на клітинах МЕС-8 і викликали АЮОСС навіть за низьких концентрацій антитіл (Фіг. 16).
Ці результати демонструють специфічність цих химерних моноклональних антитіл до
СІ ОоМб.
Приклад 8. Лікування за допомогою моноклональних антитіл до СІ 0ОМб
Раннє лікування
Для дослідження раннього лікування антитілами 2 х 107 МЕС8 клітин в 200 мкл РВ5 (бірсо) підшкірно інокулювали в бік безтімусних мишей Миде-Рохпі"ч. Кожна експериментальна група складалася з самок мишей 6-8 тижневого віку. Через три дні після інокуляції протягом семи тижнів вводили 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тимМАВ 89А двічі на тиждень, почергово, шляхом внутрішньовенних і внутрішньоочеревинних ін'єкцій.
Експериментальна група, оброблена РВ5, служила негативним контролем. Об'єм пухлини (ТМ - (довжина х ширина?г)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Коли пухлина досягала об'єму більше ніж 1500 мм3у, мишей забивали.
Лікування на прогресуючій стадії
Для лікування за допомогою антитіл розвинених ксенотрансплантатів пухлин 2 х 107 клітин
МЕС8 в 200 мкл середовища КРМІ (сірсо) підшкірно інокулювали в бік самок безтімусних мишей Миде-Бохпі"е 6-8 тижневого віку. Об'єм пухлини (ТМ - (довжина х ширина?г)/2) вимірювали двічі на тиждень. ТМ виражався в мм3, що давало можливість побудувати криві зростання пухлини залежно від часу. Через 15 - 17 днів після інокуляції клітин пухлини мишей розділили на лікувальні групи по вісім тварин в групі з однорідними розмірами пухлин вище 80 60 мм3. 200 мкг очищених мишачих моноклональних антитіл тиМмАВ 6ІО, 64А, 67А і 89А застосовували протягом п'яти тижнів, чергуючи внутрішньовенні і внутрішньоочеревинні ін'єкції, двічі на тиждень. Експериментальні групи, оброблені РВ5 і неспецифічними антитілами, служили негативними контролями. Коли пухлини досягали об'єму більше ніж 1500 мм3, мишей забивали.
На мишачій моделі ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин
МЕС8 було показано, що при ранньому лікуванні мишачими моноклональними антитілами тиМмАВ 610, 64А і 67А, не спостерігалося якого-небудь зростання пухлини у мишей навіть після припинення імунотерапії (Фіг. 17).
На мишачій моделі ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин
МЕС8 було показано, що раннє лікування тимАВ 85А викликає інгібування зростання пухлини, при цьому у мишей, яких лікували тимАВВ89А, в кінці дослідження пухлина не була виявлена (Фіг. 18).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, тимМАВ 64А продемонстрували інгібування зростання пухлини (Фіг. 19).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, у мишей, яких лікували тимАВ 64А, спостерігалося збільшення тривалості життя (Фіг. 20).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, інгібування зростання пухлини досягалося за допомогою мишачих моноклональних анти-СІ ОМб антитіл тимАВ 610, 67А і 89А (Фіг. 21).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого лінією пухлинних клітин МЕС8, у мишей, яких лікували СІ ОМб-специфічними антитілами тимАВ 6І0 або 67А, спостерігалося збільшення тривалості життя (Фіг. 22).
При лікуванні на прогресуючій стадії мишачого ксенотрансплантату пухлини, прищепленого клітинами МЕС8 дикого типу і клітинами МЕС8 із стабільним нокаутним СГ ОМб, тимАВ 64А і 89А показали терапевтичний ефект тільки на мишах, прищеплених клітинами МЕС8 дикого типу, але не у мишей, прищеплених МЕС8 СІ ОМб-нокаутними клітинами, що показує СІ ОМб- специфічность антитіл іп мімо (Фіг. 23).
Приклад 9. Високодозвільне картування епітопів моноклональних антитіл до СІ Мб
СОМ специфічні моноклональні антитіла показали тільки дуже слабке (за його наявності) зв'язування з лінійними пептидами в ЕГІЗА-досліджені картування епітопів, маючи на увазі що їх епітопи є конформаційними. Щоб проаналізувати взаємодію між антитілами, описаними тут, і
СІГОМб ов його внативній конформації як метод картування епітопів використовували сайтнаправлений мутагенез на культурі клітин ссавців. Був проведений аланін-скануючий мутагенез амінокислот 27-81 і 137-161 в першому і другому позаклітинному домені, відповідно.
Після транзієнтної експресії в клітинах НЕК293Т, мутанти СІ ОМб були оцінені за їх здатністю зв'язуватися із специфічними моноклональними антитілами. Зменшене зв'язування специфічних моноклональних антитіл з СІ ОМб-мутантом означає, що амінокислота, яка мутує, є важливим зв'язуючим і/або конформаційним залишком. Зв'язування проаналізували за допомогою проточної цитометрії. Для того, щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітинні популяції, клітини ко-трансфікували флуоресцентним маркером.
Амінокислотні залишки СІ ОМб, які є важливими для взаємодії з СІ 0ОМб-специфічними химерними антитілами, були методично встановлені за допомогою сканування аланіном.
Мутації аланіну і гліцину були викликані за допомогою сайтнаправленого мутагенезу (ЗЕМЕАКТ
Ас, Німеччина). Щоб перевірити зв'язування моноклональних химерних антитіл з СІ ОМб дикого типу і його мутантами, клітини НЕК293Т були транзиєнтно трансфіковані відповідною клаудин- кодуючою плазмідою, а експресію аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для того, щоб розрізнити трансфіковані і нетрансфіковані клітини НЕК293Т клітини як репортером ко- трансфікували флуоресцентним маркером. Через 24 години після трансфекції клітини зібрали 0,05 96 трипсином/ЕЮТА; промили РАС5-буфером (РВ5З, що містить 295 РОЗ і 0,1 95 азид натрію) і ресуспендували в ЕАС5-буфері при концентрації 2 х 106 клітин/мл. 100 мкл клітинної суспензії інкубували з 10 мкг/мл антитіл протягом 45 хвилин при 4 "С. Комерційно доступні мишачі анти-СІ ОМ (КО, МАВЗ656) використовували як контроль для визначення експресії на клітинній поверхні мутантів СІ ОМб. Клітини три рази промивали ЕАСЗ-буфером і інкубували з
АРС-кон'югованим козиним анти-людина Ідс Ес-гамма (Оіапома, 109-136-170) або АРС- кон'югованим анти-мишачим дос Ін2ан2раЗа специфічним вторинним антитілом (Оіапома, 115- 135-164) протягом 30 хвилин при"С. Клітини промивали двічі і ресуспендували в ЕАС5-буфері.
Зв'язування з трансфікованою клітинною популяцією аналізували за допомогою проточної бо цитометрії з використанням ВО ЕАСсЗА!тау. Відповідно, експресію флуоресцентного маркера наносили на графік по осі абсцис відносно зв'язування антитіл по осі ординат. Середня інтенсивність сигналу зв'язування моноклонального химерного антитіла СІ ЮОМб-специфічного з мутантом СІГОМб була виражена у вигляді відсотка від зв'язування 3 диким типом.
Амінокислоти, необхідні для зв'язування, не показали зв'язування після мутації, тоді як амінокислоти, які підтримують зв'язування, показали тільки зменшене зв'язування у порівнянні з диким типом.
Картування епітопів з високим розрізненням показало, що амінокислоти ЕЗ5, (337, 539 і можливо Т33 першого позаклітинного домена СГ ОМб є важливими для взаємодії з СІ ОМб- специфічними химерними антитілами спітАВ 610, 64А, 67А і 89А. Залишок 140 є необхідним для зв'язування спітАВ 89А, і він сприяє скріпленню спітАВ 610 і 67А. Крім того, ГІ51 другого позаклітинного домена СІ ОМб є важливим для взаємодії з спітАВ 67А (Фіг. 24).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ГАНІМЕД ФАРМАСЬЮТІКАЛЗ АГ та ін. -120з Антитіла для лікування раку «1302 342-529 ВСТ «150» БЕ 09 014 155.7 кхібі» 2005-31-35 «150» БЕР 310 006 956.6 «15іх 2510-07-06 «150» 05 61/351,6518 Й -151з:3 2015-57-06 «15025 05 51/260,292 «1532 2903-11-31 «їійБ0» 53 «170» Рабевсію зтекщіоп 3,5 «21ї10» її «231» 3659 «212» ДНК «2135 Людина «Об» 1 спачасасссяа ссбвазаваєс бсссвсбассо ссрессусаче зсадсссосто саассьсясс І асчдссестЯ ссоуаасаса здассссрудза збсяасссеуа сассуссоуу стасчуваває 120 ччассечаесс ссгчсасссї щдесосасувач аавадсдассс срсЕсаєсзу савсвасасс 180 чесччсвассс зачсоусаса саадодсста сочасасссс чссачевса чЧазсассуде 258 садасчсачс чесзазчсзга счасесастя сроачедстас сасаччаєсть дсадастуса зва сусасесест Чдседесаєсяс сесссогчсу чдсссеЧссосз чесоБасечЯас ссассстаЯсо 360 ччдассзачі здбассассоя сасучачввч ааочассссав вачусссуссє дабодстгсасс 420 ксеоочаєсу сессссдесає сесачосаєс ссоозвзсаЯассва бссссчбасу ссачзасядед 580 сасчссзсса гсосдууастї сбагавссосо сечавразссу асасссзаза чсадзачека 54АО здасдссросе бсбасссачу срдчЧчсуяпсо садасессес бассасссзч седазачсЕо ОО січічсраса секцсоессс зчЗаЗзччсс сачуЗссоса чссассасаєб учсссастає вай саастасєстояа ссссгассав сесссодаоу состосуазчє асеостассаза завсбасасе 72а ссасабсдчач соааєсасач адссссосбоач сасрвчачсо асссадаває дасадсоссо 780 аасазесєваЯ счасячассс засос сУ босссасссс срасевесто сссЕсссасе вай чачаасассс зазаєссаєс сдазаасьда чесазачеес счасссачдас єсесасскач зо зосссусраЯає ббсісасесї содаєзаєоч адсеааачач чазасасько чачзаєссссаз 965 ацсссцчасає чессасссса даазссачіс аачссабсоаза ассваєоасоя ачуссастсу 1620
Раце 1 що за2-52рСтТ ве БТ25.ЕХхЕ сечсдсваас єссасаасаваа засадассяє сссосавуазаЄ сСестоасбЯасе осгочччЯсе 1080 чазссссосе вачабсдссасе счасадсобЯс сссссаєсссої асссаачвсє ссачаусксс 1149 кЕсескусасо ссідузадаа сзааєчаєсе чЕбазсазаач дассясссвс сессоЗаасе 1200 седасстсюв зд сссрсся бЄсесчасазу асчеЕссассс сссададсса чабссссадесє 12650 акчкздассс ссдссесссас сіссвасасе чсасссссоЄ десседсссс сессувсеса 3320 сесссссрас асесасаєес гбзссааваєа азасаєсзсеЕе состачсує 1368 «2302» 2 «21ї» 220 е5» Дюдина «400» 2
Меє діа бех Аїз біу Мес біп Ііе пе сіу Уві уаї ей Тк Бей ем ї 5 хо 15 сФіу Тур Уаі Авп обіу це уаї Бек Сув Аіїа Пем Рхо Меї Тюкр цуз Уа1 25 Зо
Тйх Аіїва Бе тіеєе біу Авю бек ї1е уаї Чаї А1з бій уаї Уаї Ткр ії ав сСіу ем Ткр Меї бек Сув Уві чаї бів Зех ТВх с031у біз Меє біп Суб
З 0
Пув Уві Тух Авр Бек Шдем реп Аза Пец Рко біп Авр оПйем сів Аза Аза 65 7о 75 во
Ака діа їем Су Ммаї Ії Аіа Пец їєв Маї Аїа без Ре біу цео Бей й 85 зо з5 уаї тує цес діа біу Аїя Мзув Сув ТП Твк Су Маії б1й бій Був Авр 109 105 110
Шех цув Аїа Ахтз гей уаії їез ТВу бек спіу Тіє уаї Рре уаї ї1є Бек 115 129 125 сіу уві Гей Тік Гец І1іє Рко Уаї Сув Тгр ТВЕх Аза Нів Аїа ЇТі1е Ще 135 1358 149
Адхч Авр Ре Тух Авп Рко Гей уаї Атїа бі Аза бу) ув Аха бій Те 1145 155 їі55 ї5а сіу діа бек пе тук пец біу Тхр Аіа Аза бех Біу ем цез цем Гей 155 170 | 175
Радче 27
342-5БЗРСТ пед 525. хЕ сіу піу сіу без їй Сув Сув ТВх Сув Рко беж Сіу біу бек бів щ1у 1890 185 190
РКО Бех Нів Тух Мебс Аза Акч Тут Бех ТПпх бек Аїа Рко Аза ті Бек 195 200 295
Ака біу Рко Бек сіц Тух Рго ТВк Буя Авав оТулх ха) 210 215 Ка «810 3 «211» ВО5 «Вій» «213» днк
Штучна «220 " «223» кодан-оптимізована нуклеотидна послідовність, яка кодує людський клаудин б «Ф00ж З савзусасуєс авссадосесє сассазаацчуз засавазясс чссаассаас Свачокасся БО ачсісчссас сагодссаус чссочдсасуєс ачассссося засавсчста асеседесвад 120 зссччасдза судсстчабя сссбусассс басссаєчся зчазадсваасе ядсосссаєса 180 чсаасацесв; сука Уусс сазуссясас чадсадчадесо дсодасдаче сзЕчзсзчсас 240 ачзасассдя ссаечаєасач сдсааучеу асуасвассє чссадчесска ссссасчаєс 300 гчсазуссяс сачачесстЯа счсассчассу состястуаЄ соссссЯясевс сдасссассоуу ЗО гасасстьсяас судсоссвач ЄФдсассассс зсчсаЧчадоа авазоасвує заззусссаче го саассседас зачсузсабс ЗзчсссасЧча ссадсозсує зоссузсассу аксесосоясує во чсгачдассос ссасуссаєс абсссчучасе сссасазссс сстояадчсадсс дачасссацча зай зчачачачеї чдодсочссачс ссасасссза засчдцссас сосачзаєся ссяссассує 800 сечачассї зссзсасраЯаЄ асасоассссвз зсздсчдесс ссазуусєссє адссвобаса БО
ЕЧЧасосочса садсассазус дссссгасса ссазчсачаячо ссссазочау бассосасса 729 ззаассасаї ссдасаууаа сссзчазессє сзЕдодсасас ссааєтссясс спасачевач 780 ссЯсассвеч бсясасссас баасс во5 «2102 4 «211» 185 «пійм днк т «13 Штучна «20» «223» кодон-оптимізована нухлеотидна послідовність, яка кодує дві очікувані позакдітинні петлі (ЕС2) людського клаудину 6 «900» 4 суездсчссаа зчсассзаас Есассассає зчзчавассчас ассссуссчс сегачУсоасе 5о чсісскосоа десссадасі ссасасдсуа сассусссад сссачачасо Ссбасавоссс 120
Раце З за2-52РСТ вед ви. ссічЧчсудсс чЗадасссача засссчачсс баодзазчста арсам 155 «ній» 5 «-311ї5 38 «тій» фр х «Вї3» Штучна - «220» «223» очікувані 2 позаклітинні летлі людського клаудину б, які містять Ів каппа лідерну послідовність «220» «й2ї» ЗІСМАХ «3235 (1)..421) «27235 |в каппа лідерна послідовність «Вих «221ї1з ПОМАТМ «222» (26)..138) -и83з очікувані 2 позаклітинні петлі (ЕС?) людського клаудину б «а00з 5 меє сій Тіж Авр Тйх Пеп ей Бем Тхр о уаії їй Пем Гей Тур Уаії Рко і 5 о 15
Зіу беж тік біу Авр А13з Аза а1п Рго АхкчЧ Авр Ре Тук АБп орРКОо Ббеч 2о 25 за уаі Аіа с1іц діа бір був «710» 6 «83323 3 «й3и5 Фрт «2132 Людина «800» 6 джхч Авр ре тТук о АБа РрРхо Без чаї Аіїа січ Аза біб Був ї 5 10 «2103 Д 7 «211» 53 «212» фр «2132 Людина «400» 7
Рго Мес Ткр ШМув уаї Твх Аїа Бде їіє біу Авпобех Тіє баї уаї Віа 1 З 10 5 сіп уві Маї Тер зіцш б1іу рез Тхр Мебє Бех Сув Уаії Уаіїі бів Бек Тік о 5 30 сіу біп Мес бів Суз Бу Уа1ї Тух Др бек Гей цем Аїа ей Рха ціп
БтТздае 4 бо
342-58РІОТ ве 525. СХ 35 40 ав вар ес віп Азіа дід 50 «210х 8 «21їх 220 каі2» фр «213» Людина «аз «ії» ЧУАВІАНТ - «йВ22 (143)..1343) «2239 людський клаудин 6 1143М поліморфізм «400» 8
Меїс Аіз Бех Аза сіу Меб іп Їіе без с1їу Маї Уві ем ТВжх Бей рей не 5 10 15 біу Тхр чаї Авз біу без уаі Бех Сув діа цем Рхо Меб Тхр був уаї о 25 за тв діа вБе ї112 01у Авп о бек тів Уаї Маіїі Аїа біп уві уаї Ттр чів 35 20 85 біу ей тр о Меї Зех Суп чаї Уві бів Бек ТПх Зіу сі» Меб біб Сув о 55 ва
Був Уві Тут Авр бек цей Пес Аіїа Бе» рко сіп Авр цей сіп А1з Аза ак 70 75 ва
Ахч Аїа Пе) Сув уаї Ії Аіз Пес бей уві Аїа без Рів біу цем Бей 85 зо 55
Уаї Тут Гей Діа зЗІУу Віз Пув Суз ТВж Ттвх Су Заї С010 бій Був Авр 100 105 ї30 бек Був діа ка Пец уаї це) Тпх беж сСіу Ііе Уазї Рне Ув3і Її бег 122 125
Сіу уаї бе) ТБх цем І) ро чаї Сув Ткр ТВх Аза ів Аза МУаї їЇїе 130 135 140
Ажха Авр о рпе Тух Авип рхо цез аю в1а сів Аа бів Був Акч пів Бей 145 150 155 150 с1Уу Аїа бек пен Тух цем сіу Ткр Аза Аза бек сту бай пцеп Пей цем 165 170 і78
Баде 5
3а2-52РСТ вед ЄТ25.схе сіу піу п1у Пем цев Сув Сув Тк Сув Рко бех піу біу бек біп 51у 180 185 190
Рхо Бех Нів Тухкх Мек Аза Ату Тук Бек Тпх Бек Аза Рко Аза ї1е Бек 185 200 205 .
Ака біу Рхо Бех шій Тук рРто Тітї Гу АвпотТух Маї 210 215 2720 «гій» з «21їз 217 «812» Фр «813 Людива «400з 8
Мес Аіїа Бек ТВж с1іу Пехзі бій Пе) Бей біу Меб Три Бем Аїа уві ей ї 5 1ї0 15 біу Ткр їец біу ТБх Пед Маї Бек Сув Аза тем Рко Пец Ткр о Пув Уаї о 25 Зо
Тих: о Аіа рпе ї12е біу Авп обех Тіе Уаї Уаії Аїа біп Уаї Уві Тер Щі о 45 сіу без Ткр Мей: бет Сув чаї уві бів бек Трх сіу бів Мебє біз сСув 5О 55 ва пув уаї Тух Ввр Бек ей Гео Аіа Бем Рхо біп Авр пе біп А1з Аїа вь 70 75 ва
Аха діа пев Суя чаї І1е Ата їв пев без діа Бех рей біу ем Шем 85 зо 25 уві Аіїа їїе Тпх б1іу Аіїа біп Сує Тих Тйжх Сув уаї 515 Двр бїй сіту 150 105 1350
Віа цув Азїа Ака ї11іе Маіїі Без Тпх Віз сіу Маї їЇіїе цей цем бем Айа 115 120 125 біу ІЇіе пем Ууаї Пец І1е Рхо уаі Сув Ттр тах Аза Мів Аїа тТіє т11е 130 135 140 сів Авр о вБбе Тук АБпоРхо цем уаї Аза Бій Аїа пеп Був Акч сій Бец 145 150 155 180
Зіу А1із Бек Пец Тухк без п1іу Ткр Аіа Аіїз Аза Аіа ех рем Меб цей тїе5 1750 175 а1іу піу біу їей Бей Сув Сув ТБх Сув Рхо Рко рхо сіп уаї січ Ахо
Расче Б за2-5ЗРОТ Беф БТ. ХЕ
Мо ї85 1959 рго Ака біу рхо АхЯ Бе біу Тух Бех І1є рко Бех АкЯ Бех б5іу А1а 1935 2959 255 бек спіу рей Авр Гуз Аха Авр тух чаї 239 215 «-10з 10 «211з 253 «2122 фер «2132» Дю дина «ай» 10 мес діа Бек мек піу Пец піп Уаї Меб піу Тіе Аза ей Аізїа уаї ем 1 5 10 ї15 буу Тур Пец Аїа уаї Мес Меп Сув Сув Аіїа цей Рхо Меї Тур Акч Уві 22 25 зо
ТвВЕ від Рпе їі біу йех Ав Т1е Уаї Тк Бек бію тТпх Ті Ткр ої 35 о 45
Сіу пеп Тгр Меєс Авп о Сув Уаії Уаїі біп Чет Тпх сіу біп Мек бів Сув о Б 53 їуз Уді Тух Авр Беж ПцЦем Гео Аза Пец Рхо бів Авр Без зів Аїа Аїа 7 75 во
Ах Авіа БТей ді Ті Ії беж Ті ї1їе Уаї Аівз Аза їеп біу чаї рей 85 о 95
Пец бек Уаі уві біу сіу МДув Сув ТВвІ Авп о Сув еп біц Авр бій Бех 109 105 110
Аіа Був Аза їув Тих Меб І12е МУаії Аїа сіу Уаї Уаї Ре цеп цей діа 115 120 125 сіу йец Меє Уді т1е Узі руо уві Бех Ткр Тпх діа Нів Дяй Т1е ї1е 330 135 140
Зійп АвровРпе Тук Авп о рхо Пес Уаї Аза бех сіу біп Був Ака сій Меє 145 1590 155 160
Сіу діа бдежє цей Тук чаї біу Тгр Аїа Аїз бек с2іу цем Ццев ем пей 185 175 175 сіУу біу біу Гей без Сув Сув Зв о Сув Рко Рко АкчЧ тТпх Авр о цу РКО 189 ї85 130 тГТаче 7
342-528СТ зе ЗТО5.БХК
Тух Бех Аїа цув Тук бек А1а А1їа Ах Бех Аїа Аїа Аза бек АвБапотук 195 220 205 чаї «21йз 11 «211» 220 й «еі2» фр «213 Людина «а00з 11
Мег бех Ме сіу и бій їх1е Тв сіу тТВж Аза цем Аза Уаї Пем С1у й ї 5 10 15 ткр ем сіу Тих тІ)е уаї Сув Сув Аїа ей Рко Мебє Ткр Акд Узі Бех о 25 за дів Рие тіе піу бек дви Ії Ііїіє ТЬк Бех зії Авки ІЗе Тхр січ щ51у а 45 їз Ткр Мебє Авп оСув аз Уаї біп Бек Тпх: біу бів Меб бів Сув Був 5О 55 БО уаї Тук Авр беж Тех йец Аіа бен Рка з1іп Авробей бій Аза Аїз Акад 65 70 75 во
Аза це хї1і Уаї Узі Азїа ї1е рем Ге) Атїа Аза Ре б1іу Бей без Уайх 85 о 95
Аіа пе уаї сіу діа біп Сув Тк АвпоСув Уаі сіп Авр о АвроТЬк А1а 100 105 110 пув діа Бук Ї1є Так ї1іє уаї Аза біу Уаї рем Рпе цей рей Аїа Аза 115 120 1235
Тем пе: тйх Бей Маї Рхо Уаї Зех Ткр Бех Аїз дво» Тах Ііе гі Ак 139 135 1420
Авр вне Тух Дяп РрРко уві Маі Рко біз Аза біп цуз Ах бій Меє б1іуУ 145 159 155 150 діа сіу без Тух уаї біу Ттр Аїа Аза А1аА Аїа без бів цей без 5іу 165 170 175 сі1у діа цей гей Сув Сув бек Сув Рго Рхко Акад біз Буз Був Тук так 188 185 185
Раце 8
342-5З8РСТ вед БТИБ.ЕхЕ
Віз тих Був чаї Уаїі Тух Бек Аіїа Рко Арч Бех тТВх б1у Рко біу Аза 1935 200 205
Зех Гей біу ТвВх б01у Тух Авр дк Був Авр Тут Уві 219 215 220 «210з 12 «ії» 158 «їй «піЗ» дик
Штучна «ад шо «й» кКодон-оптимізована нухлеотидна послідовність, яка кодує одну очікувану позаклітинну петлю (ЕС) людського клаудину 6 «4002 12 сесасчсоуа зачесцчасодс сббсабсдоас аасачсаєсу бачсСчассса часа 5 чаччасссчс ачасуаасьУ сябачсчсаз адсассоусс адасасаас3 сааачсЧчеас 120 чзасацесстчс Буусостасс ссзвзочассса саччсвбосо ї59 «210» 15 «21їз 106 «12» Фрт «213» Штучна «202 -3232 очікувана 14 позанлітинна петля людського клаудину б, яка містять Ів каппа лідерну послідовність «220 «22і» Бічвраї «ай» (31..423) «2235 іркаппа лідерна послідовність «и. «пліз Бощшазїнп «ПІ» (26)..478) «3235 очікувана 1 позаклітинна петля (ЕС1) людського клаудину 6 «400» 13
Меє сій Ту Бвр отак бе Пе Пез Ттроуаї Без їей Бем Тктр Уві рРго 1 5 19 15 сту Бех Тигр п1іу Авр Аза Аїа бій Рко бго Меє Тжр губ Уа) Тпх Аз 26 25 зо
Рпе ті с3іу Ана Зек Її Маї уаї Аїа біп Уаіїі Уаіїі Ткр січ сіу їі
Тур Ме бех Сув уаї уаї бів Бех тиж сіу біп Мек бів Сув Був Маї 5О 55 бо
Раце 8 зав-веРСТ Бец БТОВ. ХЕ
Тух Авр Бех Пец ев Аїа цем ро Зіп Авр оцеч піп Аза Аїа Пи би 70 75 во бех Ак Фіу Рго Ре біб біп Був це» Т31іе Бек 0100 бій Авр Бей Авп 85 зо 95
Меє Ні Тих біу Нів Нів нів Нів нів Нів 100 108 «210» 18 «вії 13 «8їі2з Ффрт й -3132 Людина «1005 14
Рко Меб Ткр о Гук уа1їі ТЬБх Аза Рре Т1е біу Авв бЗет ї1є ї 5 15 «210з У «211» 15 212» ФР 52132 Людина «300» 15 мес Ткр цув Уаї ТЬх Аіз Ре їі бО1іу Авв Бех Іі Уа)» Уві Аді 1 в хо 15 «Вій» 16 «231» 20 «їй» днк -2132
Штучна «220» «2235 Одігомуклеотиди «00» 16 єссаєдасяє сссгчасаєе 20 «810» 17 «Вії» 43 «812 днк
З заз» Штучна послідовність «20» «223» О)йлігтонуклеотиди «400» 17 чачазачссї удссассасса Сузчасчдчач стдчассеєс сс аз «210» 18 «211» 93 «тій» «ваз днк .
Штучна послідовність «20»
Баче 10 заз-варРстТ вец бБтаз. ик «ваЗ» Одігонуклеотиди «а00О0» 18 чдачачачеосс Еспасодада ссозадачас соассауачка Зч 43 «210» 185 -21ї2 43 «8122 ДНК «213» : .
Штучна послідовність «ех «223» Оілігонунлеотиди «а00з 18 І - - чЧчачачччесс сгзоасачача сідадцачаєс сасчавсачсяа ак 43 -йїійз 50 «-21ї» 43 «їй» днк «213» - -
Штучна послідовність «220 «333» Олігонуклеотиди «200» 20 чззачачссс селасосачу сісавадчазас содбоачачвса са 43 «210: 21 «21їх 56 «дійх «2135 днк Й
Штучна послідовність «80» «223» Одігонуклеотиди «00 31 чачазачесеб дссуссасса Басаєсссса ачсчсазакєс кєжсазе аб «230» 25 каіїх» 33 «Рій днк «213» : й
Штучна послідовність «пай» «223з Олігонуклеотиди -300: 385 сасасзсася сечЧасстосазсесучкас сс за «210» 83 «ії» З «вій» «ії» днк , Й
Штучна послідовність «8202 «223» Олігонуклеотиди «400» 23 сасасчсася сЕсЧавсссос авасссазсяс ссе 33
Раче 11 за2-5арРСТ ве БТ. їХЕ «пійх 24 «21їз з93 «ій» «213» дек
Людина . «до» 24 честссасса аччуссосааз сФчсУусЕсссс стччсососса чсадсавауад сассавасуче 50 часасачсся ссссядадчссу сссчзгЧаву дастасевос ссодазсссчо чассясзаче 120 сучаавсацчеч дадсссобчас сгссадсасу сасасосеос ссассусасе дсачачсадчо 180 ччссЕЧсаса зссочазсач сУсзЗчедасс ясосссачса дсачссесаоау свостставчвос а гтасаєсгтчса асзсчааоса саачоссазцо аасаєссазоч бадасавзчац ачсазачсос зво азчачессасЯя асазачассса сасстяассос сссбассовя соссачавасе чесдадасача 3З6о сссачзсчсої сеосгассссс сессовачеосс авоачасаєсс Суаєцчаєссав сазчасосес 520 часчсчассв чечсоччоас Заасосзачс сасчаччасс сачадаєсваа Ядсссвасезу Зо їасобачасо зсчсодаччс чдсасвасасс зачассавуас ссачачачча зсачбасзаєс 540 ачсасстаса чачсоспіасс сагчссчасс чсодссцсаєсс взузассоасє даасчосаад 6оо чавсасзацчі здсзачасссс сзасаваччсс ссадссаосес ссассдаваз дассаєссацес ва задчоесаацча сессачосася дчадоссссвя чсЧсавсасос сассссссвза ссочавоачає 750 асздассавцча ассаччсчсс себдасссує стчусуаача чесесссассс сачсдасаєо 785 чесасучаАзе зучазачсваа сучесадсос дадаасавасс асавуассає ссосссачсФд 40 ссодазсачсо асосочсачссс сосостабас вусзазссаз ссасудеасач зсссавчзвач зо сачсвоачаса асасчессад сбасачсябо асспсасавоє сессоасасва ссассасасе зво сачазавссс гаадссвава ссссоассаза ба заз «210» 25 «211» 330 «21ї2з Фр «83132 Дюдина «а00» ЗБ
Аїа Беж ТВх пув сіу Рко беж уаї рі Рко ей віза Кхо Бех бек цув 1 5 зо ї5 бек Трк Бех біу пйіу тах Аза Аза цпеч спіу Сув ем уаї Був Авр тух о 25 зо тре Рко Січ рко уаї Тпх о уаї Бех Ткр Авлп о бет пі Аїа цем Тв Беж 20 45 сіу Уві Нів Тьху рде Рхо Аіа Уаії Бей бій бек бех П1у пед Тух Зех 5 БО
Баце 15 заг-52РСТ ве 5Т25. ХЕ
Пец бек Бек аз уді Тах Уа) Руо бех Бех бех Пез біу тпжх бів ТЕ 65 70 15 во тТух тіе Сув Авп уві АвпоНів був Рхо Бек АвпотТах БПув Уаї АвроПуг 85 зо 95
Ака Уаї бі вхо цу Бех Сув Авр Був Тпх Нів Ток о Сув Рхо Рхко Сув - 00 105 110
Бго Аіа Рго біб йец пец сіу сіу Рхо Бех Уаії Рбе без Рре Рко Рто 115 129 125 їув ржо Був Авр тТпг цей Мес І1е Вех Ах Тих Рхо са) Ууаї ТВх о Сув 130 135 140 . чаї Узі Уаі Авр уаї Бех Нів сій Авр Рко біз Уві Пув Ре АБ Ттр 145 159 155 160 тТук Ууаї Авр п1іу Уаї б1цй Уаї Нія вп о Аїа Пувє ТВх Пув Рхо АкЯ Бій 165 170 175 із бій Тух Авп Бех Тік Тух Ах Уаї Маі Бех Уаії Пей Тапх Уві Пец 180 185 190
Нів із Авротхр о бе) Аква о б3іу Ппув Зі Тух Був Сув був Маі Бек АБвип 155 209 205
Бу діа цем Рко Аїа рРІго Ії біч був ТБЕ їіе бЗех пуб Аіїа Був 51Уу 210 й 215 о
Сіп рРко Ак б3іц Рко біп Уаї Тух ТВх ей Ро Его Бех Ак сіб бій 225 238 238 280
Мек тТвх Гув АвБпобСіп Ууаї бек бе) Тк Сув бай Уаї Був бБіу Ре тТух 245 259 га
Рго Бех Авр Іїє Аїа уаї біо Тур зі бек Авп обіу бів Рко бій Авп 2550 255 27
Авп отут був ТБжЖ о ТВж Руо Рко Уаії Бей Авр Бех Авр б1у Бех Рре РНре 275 во 5
Пец Тук бек цув Бей Тр оуаї дяр Пуз ВЗех Ака Тхр біп біп ча1у Аво 280 2235 300
Уаї Бре бек Сув Бех Узі Меб Нів біц А1їа цецп Нів АБп Нів Тут ТВг 305 зо 15 320
Раце 13 заг-зевстТ зед ТВ. ХЕ біп Був Бех пе Бех цей Бех РРхо сіу Буш 325 339 «9102 56 «21їз: 324 «їй» дик -2132
Людина «400» 26 счсзсоачкад ссасксссад сезсасесасе сссссоссса чодасчачса чдссдчавассс 60 часассосса чсосачЕсса сссассадаас васусссасс сссодчачуєсє сазузсоасад 120 газаачасча асаасусссе зсадвусачс аваасаздссачу ачачезчесас сзазсаччас 180 зоасавоачаст ссасстасау ссідазчсазс ассседчассс бдазсозачас сузстсасуая о задсасазуч бабасоссса счазаєчасс сассаздвасс єдсосауєсо сусчассвад запо ачесссзаса часова ссацч 324 «30» 77 «211» 107 «ві2з фр «Вій» Людина «4002 27 дхо о тіх уаї діа Аїа Ржо бек уУаї Рле І11е Рпе Рко Рго Бех Авр біч 1 Б ї0 15 біп пе» був бек біу тих А1їа бек узі Уаї Сув йецй йей Авп оАБа Рпе 29 25 зо
Тух Ррко Ак б10 Аза Був Уаї біп Тер цув Уаі Авр Авп Аза Пен ід
ЗЕ 40 45
Бех сіу Авп бек піп біц бек уві трх сі) біп Авр обех Пув Авр бех 5о 55 во
Тр о Тухк Бех Мем Бех Бех ТБ бем Тк ем Бех Пув Аза Авр Тух ий 7о 75 во цув о Нія Тув уві ТУук Аїа Сув 0105 Ууаї ТЬБх Нів сіп біу ем Бех Бех 85 80 ЗЕ
Рхо УМаі ТОх Був Бек Ріе АДеп Акч пі1у Зі Сув 100 105 «230» 8 каії1ї» 38 «212» ДНК «2135 гучна послідовність
Баче 14
3142-52РСТ Бецч 5БТБ. ХЕ «220» «223» Одігонуклеотиди «229 ШИ Ш «22ї» вВізні функції к?йй» (31).,.(38) каг3» девний (будь-який) нуклеотид «002 28
ЕЕКЕКСЕСЕК ССС СЕСЕССЕСЮ пп 3 «8102 79 «її» 30 . . «йійх днк «2ї3» .
Штучна послідовність «220 «223» Олігонуклеотиди «400 29 азасачеуца ассвасчсач ачсасчсовоач 30 «2105 30 «2511ї1з 26 «йій»
НК
«13 Д . .
Штучна послідовність «гай» «223» Олігонуклеотиди «00» 30 срасссасса часчодсассча ачасас а «202 31 «211» 255 «вій» ДНИК «вії» Штучна послідовність «ай» «223» Одігонуклеотиди «ай» ЗІ асачззаччсса зсозчасачас сзчаєу 25 «2102 32 «2112 45 «її» днк «їй і - п
Штучна послідовність «гай» й «223» Олігонуклеотиди -800з 38 цсзасасчас ссастасачоа ддсавасавсч асассаасос вчазес 45 «-230з 23 «11» 22
Еаче 15
3з342-5БаРСТ ве 5Т25.хЕ «зі2» ДНК «іа» Штучна послідовність «из «та3» Олігануклеотиди - -4002 33 чІзагасчас бсасезеаау че 22 «210» 34 «23ї 17 «аа» ФРІ «2135 (Нтучна послідовність Щ «5902 . «27235 Послідовність МИ антитіла «400» 34 січ уаї бів пез піп бів бек зіу Бо біз беа Уаі Пув Ро п1іу Віа ї 8 10 15 бек Меє Був Ізїе Бех Сув був Аіа Зехк біу Тухк Бех Рпе Тк саіу Тух 28 25 Зо
ТвВк Меб АвпотТкр оуаіїі цув сів бек Нів 5Біу Шйув АвБп опей ЗІ Тер ї1е 35 сіу цем їіїє Авп Рхо Тух Авп піу біу тах Беж Тух Авп о бів Пув Рпе о 55 БО йув біу цу Аїа ТК Ппейш Тпх І18 Авр Пув бет Бех Бех Тих ліз тТук 70 75 во
Мес Сі пев Бец беїх гер Так Бек сіц Авр Бек Зіз Уві Тух Тухк Сув 85 Зо 5
Віва Ахо Авр Тут шіу Тук Уаі Пец Авр Тух Ткр сіу шів Біу Трх тТБх 160 105 110 їв Тк Уаі Бех бек 115 «2102 35 «-21ї» 107 «2122 Фр «Ж Штучна послідовність «ай» «223» Послідовність М. антипла «00» 35 бСіп ї1іе чаї цей тТпх біп бех рко Аза їіїіе Ме бех Аїа Бех рхо п1їу х 5 10 15
Раче 16 зЗ4а2-52РСТ вез 5725. ХЕ січ був Маї ТП ї1е Тк Сув Бех Азїа бек Бех беж Уаі Бех Тух їв 29 25 30
МНів Тер Ре піп бів був Рко сіу тТвВж Бек Рхо Пув Пе) Тхр и Ууа1ї тухк 35 40 45
Бек Тпж Бех Авпоїем ро Бех С1іу Уаї Рко Аза Аж Рпе піу біу бек 5О а «о біу бек сіу Тбжх бек Тук Бех Пес ТВк ї1е Бех ВЗга Меб сій Аїа 010 85 то 75 во
Авр віз А1т1а ТОК оТух Тух Сув 12 бів Аху беж Ії Тух Рко Рхо Тер в5 за 253
Тву ве піу біу Ф1у ТіжЖ Був ївм бій т16є Пув 100 105 «віх 36 «ії» 17 -2125 Фр «213» Штучна послідовність «220 «23» Послідовність УН антитіла Я -4100йз 36 біз уаї бій Печ біп біб бек біу рхо бій ей чаї Пув Ро біу діа 1 Б 10 15 бЗек Мес Був Ї1е Бек Сув Був А1а бек біу Тук Бех Рпе ТВх сіу Тух о 25 За
ТЬх Месє Двоп оТхр о Уві пу Сів Бех Нів біу Пув Авп оїез бій Тюкр Т1е 35 40 45 сіу цез ІчІ1е Ав орко Тух Авп обіу біу Тит ї1іве Тух Авпобівп Пув Ре 5О 55 вО
Пув сіу був Азїа тк ва ТВк о уві Авр оМПув бех Бех Бек ТК Аза Тух 65 70 75 во
Меє бій Тем со Бек опем Тахо Бек біз Авр бек Аїа Уві Тук Тук був зо з5
Віа Акач двр о Тухк Зіу Рбе Уаї Пей Авр Тух Тур біу йіп сіу тіж т: 159 105 110
Раче 17
343-52РСТ вед 6Т25.схЕ їви ТВт Уаї беж бег 115 «2102 37 «віїз 107 «ві2з фр «2і3з Штучна послідовність «Вам «223» Послідовність МІ антитіла «або» 37 сбіп ї11з чаї Пен Тв бів беж Ро Бех І1е Мебї Бек уаї Бех рхо 01Уу 1 5 ї9 15 сіб був а) ТвВк ї1іе Трх о Сув бек Аїз Бех бех Бек Маї Бек Тух Меї го 275 35
Нів Тхр Рбе біп бБіп Був Рго 5Біу Тих Бех Рко цув Пейп Сув тТіє Тух 35 40 45 бек Ту бех Авп о йей Аїа Бех біу маіїі Рхо Аїіа Ака Рі Бех спіу АФ 5 Ба сіу бек бСіу ТБх Бек Тук Бех Гей Ти ї1іе Зет Акад За) Аїа Азїа сій 55 70 75 о
АБр Аза Азїа Тих Тук Тук Сув сів біп Ахо Бек Ав тТух Рго Рхо ТЕр 85 0 | зв тТвВк ве піу біу 5іу тпх цув беш біш ї1е Пув 100 ща5 «40» 8 «21їіїі» 117 «218» фрт «2135 Нітучна послідовність «820» «223» Послідовність МН антитіла «-900з ЗВ бі уаї біп о без бів біп зех бБіу Рхо бій Пейп Уві МПув Рко біу Аза 1 5 10 15
Беї Меє туз Ті бек Сув Пув Аіа Бек бЗіу Тух Бек Ріе ТБжх біу Тух 3о
Тк Меб Ап о Тхроуаі Був іп Бех Ні біу Бу Авп оцем сій Тжр тТіє 49 45
Раце 158
343-52РСТ вед БТ25.сХхЕ сіу реч ї1е Авп о Бко Тух Авп біу біу Ї1е ї1є Тук Авп о біп Туз РПпе 5О 5 Бо
Був сіу пув Аза Тк опе) Тк о Уаії Авр обу бек Бех Бех Тапки Аїа Туг 55 70 78 во
Мес бій цем їви Бех тес ТВх Зехї 010 Авр Бек Аїа Уаїі Рпе Тук сСув в За 5 аіа вх Авр Ре піу Тук Ууаі Пен Авр Тух Ткр сіу бів с1у Тік ТК 100 105 110 їж Твхи Уаі Бех Бехї й 15 " «2302 39 «211» 167 «ий» ФРТ «2135 Цнтучна послідовність «220» каса» Послідовність Мі антитіла «00» 38 Я діп хів чаї рей тах бів Бех Бго Аіа ТІ1і Мес Бех Аіз Бех Рко біу х 5 10 її
Січ Буз уві ТО І1їе Тах Суз Бек Аза бек бек бек Маії бек Тух Меє
Ні Ттр Ре бів бів Пув Рко біу тах бек Рко цув Бей Ткр Іі Тух 35 40 45
Бек тиж Бет Ав цем Віа бек з1у Уаї Рко Азїа Ак Рпе Бех Сіу Бех зо 55 во сіу Бек сіу тих бек Тук бек йец Тут Т1е Бех Ак чаї Аіїа Аза Щи 65 70 75 ва
Ввр Аіа діва Твк Тух Тук Сув іп о бів Аха Бех Тих Тук Рхо Рко Ткр 85 ЗО ЗЕ
Тв пе зіу біу щіу Так Пув гей віч Іїїе Мув 150 105 «гі» 40 «ії» 317 «гій» ФР «2132 Штучна послідовність «2292 . Раце 19
342-588РОТ ве СТБ. ЕХ «283» Послідовність МН антитіла «400» 40
Сі уаї біп без бів біз Бек Аха Рко 51 бен уУаії Пув Рко б1у В1а ї 5 10 15
Зех Меб Гцув ї1е бек Су: Буш Аіа Бех біу Тук бЗетх Рпе ТБк сіу Тук 20 25 за
Тахо пес Авп Тхроуаї рМув сіп Бек Нів сіу пуб АБп о Бей біз тТхр 1182 35 0 5 сіу ей їІ1е Ар оРкго Тухк АБ) оЗіу біу Бек бек Тук АБп обіп був ЕВпе
Бо 55 во
Буш Авр Буз Ма Тр;х ей тТвВх Уаїі Авр о Тув Бех Бех Бек Тк Аїа Тук 25 70 75 во
Ме бі) Бей пе бек Пец ТВжх Бек січ Авдр бек Аіа Уаі Тук Тут Су 85 зо 5 ліа джу Авр отук біу Тук Уві рРпе Авр Тух Ткр с1у піп шщіу ТОх Тпх 105 ча5 110
Ге) Трх Уаї Бек ек 115 «і» 4 «241ї» 107 -2125 ФРТ «2313» : :
Штучна послідоввість «их «ей Послідовність МІ. антитіла «-4100» 81 сій ті1е уаї тез тру бЗіп бек Рко Аза Іїе Меб бек Аіз бех Рго с1у ії 2 14 15 біз цув Уаї Так її Тпк о Сув бех Аїа Бех Бех Бех Маї Авп тук меєс я 25 за
Нівз Тхр Ре бір Пец цув Рко Зіу Ту бег Рко Був ем Пец їіє Тук 35 40 ік
Сех Тигобех Ави пей Аза бек ту Уаії ро Аза Ака Ре бек 51Уу АкЧ 5О 55 ва сіу Зек б1іу Трі бек Тук Бех Пем ТВ Ії Бех Ако Меб біц Аза їй 70 75 о
Тацде 20
342-52РСТ вед БТІ5.їХЕ
Авр Віа Аїа тв тук тух Сув сів зіп Аха Авп о АвпоТух Рго рко ТЕр в зо з5 тТпх Ре с1у Шіу 51у ТвВх Пув Пец біз І1Т1е Гув 100 105 «210» 42 «2112 5 «2122 («(фррт -2132 Штучна послідовність «0» «223» Послідовність МН СОВЗ антитіла «20 й .. «221» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ваз (1Р,. (3 «2232 Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Ре або Туг, ще краще Туг «йо» й «2312 РІЗНЕФУНКЦІЇ «йай» 31... «283» Певна амінокислота, бажано зроматична амінокислота, краще Ре або Туг, ще краще Туг «220» й «331» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «й» (5)..15) «2232 Певна амінокислота, бажано ем або Ре, краще цей «400» 49
Хаа сзіу Хаа Уаі1і Хаа 1 5 «вій» 43 «11» Б «вї2» фФфрт -213з Штучна послідовність «20» х223» Послідовність МН СОКЗ антитіла ках Ці «23жхз РІЗНІ ФУНКЦІЇ «002» 493..І2) -223з Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще РНе або Туг, ще краще Туг сив бд «зз1» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ай» ї4а)р..4 «2235 певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще РНе або Туг, ще краще Туг «0»
ТтТаче 21 й 342-528СТ вед бта5. сх «221» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «вай» (81:61 «2235 ДПевна амінокислота, бажано (ец або ее, краще Сем «ай» аз
Авр о Хаа 2іу Хаа Уаіїі Хава ї 5 «2310 44 «21їїх 5 «ій» Фр «2135 Штучна послідовність «220» «233з Послідоввість МН СОКУ антитіла «ай - с «321» РІЗНЕФУНКЦІЇ «йди (1)р.. (1) «223» Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще РВе . або Туг, ще краще Туг «РО» . «221» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «222 (3)..(3 «2235 Девна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Рі або Тут, ще краще Туг «220» « «2231» РІЗНЕ ФУНКЦІЇ «Ваз (5)..5) х223» Певна амінокислота, бажано (ви або Ре, краще Гей «ВО» 48
Хаа сіу Хаз Увазі Хаа Авр і 5 «210» 45 «211» 7 «212» «Фр 2313 Штучна послідовність «220» «223» Послідовність МН СОКЗ антитіла «5202 - 2215 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ШЕ (2)..(2) «ййЗ» Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Рре або Тут, ше краще Туг «ВО» й «321» РІЗНЕФУНКЦІ! «222» (4)..418) «723» Певна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краше Ре або Туг, ще краще Туг «вий
Раче 22 щи з4аз-52вСстТ вед 5Т25.їХхЕ «2215» РІЗНЕ ФУНКЦІЇ «292» (5)..(51 «88232 Певна амінокислота, бажано Чен або РНе, краще 2 «00 45
Авр Хаа сіу Хаа Уаі Хаа Авр у 1 5 «230» «аб «21ї» 19 2125 Фр 13» Цітучна послідовність «ай» «232 Послідовність УН СОЮЗ антитіла «220 в «321» РІЗНІ ФУНКЦІЇ , «Ой» (4)..48) 5293» Девна амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Ре або Туг, ще краще Туг «2202 | М «з31з РІЗНЕ ФУНКЦІЇ «иа» ї81..4ї61 «8232 Девиз амінокислота, бажано ароматична амінокислота, краще Ріе або Туг, ще краще Туг «вах їй соді» РІЗНЕ ФУНКЦІЇ кара» 48)..8) х223» Девна амінокислота, бажано Ге або Рне, краще ен «400з 46
Аіз Ах Авр о хХваа сіу Хва Уаї Хаа Авр Тукг ї 5 10 «гій» 47 «вії» В «212» Фр 52132 Штучна послідовність «о» . Й й «2233» Послідовність УЯ СОВІ антитіла «-43002 47 зіу Тук Бех Ррпе Тих Зіу Тук Так 1 5 «ій» 48 «Вії» В «212» фр та» Штучна послідовність «иа» «233 Послідовність МН СОВ2 антитіла
Раче 23
342-53РСТ БеЕЧ 8Т25.їХхЄ «220 е «2215 РІЗНЕФУНКЦІЇ «282» (8)..:8, «аа» Певна амінокислота, бажано Тнг, Заг або Ме, краще Тіг «400з 48 й тТіе Ав Рхо Тух Авсп зіу Сіу Хаз ї У -8302 49 «ВЗ» 5 «2і2» фФфрт -2135 Цітучна послідовність «220» й «223х Послідовність МІ СВ антитіла «220» Й й - -22412 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «22» (2)..:2) -223з Девна амінокислота, бажано 5ег або Ахп, краще 5ег «20» Щ «2312 РІЗНІ ФУНКЦН «ИЙ» (3..43) «2и3з Певна амінокислота, бажано Туг, зег, Не, Азп або Ті, краще Туг, зег або
Ап, ще краще Аби ка» . . «за» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «222» (43... (8) «ля» Певна амінокислота, бажано бег вбо Ту, краще Туг «000» 45
Ак Хаа Хва Хаа РКО ї с «йі0з 50 «2115 7 «вій» фру «2135 гучна послідовність «За» «223» Послідовність М СОВЗ антитіла ци «ай» . «33ї1з РІЗНЕФУНКЦІЇ «ваз (31..3) «2232 Пенна амінокислота, бажано 5ег або Азп, краще Зег «220» | Й «353» РІЗНЕФУНКЦІЇ «Вайх (й)... «283» Певна амінокислота, бажано Тут, 5ог, Не, Ахп або Тіт, краще Туг, Зег або
Ахп, ще краще Аби «во»
Раче 24 й 342-52РСТ вез БТ25.ЕХЕ «зії» РІЗНІ ФУНКЦІЇ : «вах 15)..(5) «223» Певна амінокислота, бажано бег або Туї, краще Туг «00» Ва
БЗіп Аа Хаз Хаа Хаа Рхо Рхко 1 5 «21053: 51 «-811ї» 10 «их Фр «213» унучна послідовність «22йх «223» Послідовність МІ СОВЗ антитіла «гей» Й шк -3231з РІЗНІ ФУНКЦІЇ «ВВ ї41..14) «232 Певна амінокислота, бажано 5ег або Ап, краще бег «ВО» І й -3312 РІЗНЕФУНКЦІЇ «йшиз (5)..45) ожЖ235 Певма амінокислота, бажано Туг, бег, Не, Азп або Тіт, краще Туг, бег або
А5п, ще краще А5в «220» о 221» РІЗНІ ФУНКЦІЇ «2» (Б5)..56, «223 Певна амінокислота, бажано 5ег або Туг, краще Туг «А00» Бі іп біл Ака Хва Хаз Хаа Рко Ро Ткр Тк 1 5 10 «гій» 52 ще «211» 5 ків» Фр «вії3» (Цтучна послідовність «вай» «ва» Послідовність М. СОВКІ антитіла «20» . 22212 РІЗНІ ФУНКЦІЇ «2222 (4)..(4) «223» Певна амінокислота, бажано 5ег або А5п, краще 5ег «або» 5
Бех бек уаї Хаа Тук 1 5 «210» 55 «211 З «Вій» ФРТ
Раче 25 за2-52РСТ Бе 57Т25.їХхЕ «2135 Штучнарпослідовність «220» -223» Послідовність МІ СОВ2 антитіла «400» Д 53 бетх Типхк бекг 1
Рацче 25

Claims (29)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Моноклональне антитіло, яке зв'язується з СІ ОМб, де антитіло містить набір легких ланцюгів антитіла (СО) і набір важких ланцюгів антитіла (НСОК»5), які вибрані з групи, що містить: (а) НСОКТІ амінокислотної послідовності ЗУ5ЕТОУТ, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 34, НСОК2 амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 34, НСОКЗ амінокислотної послідовності АБОМОУМІ ОМ, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 34, І СОК амінокислотної послідовності 55У5У, визначеної 5ЗЕО ІЮО МО: 35, І СОК2 амінокислотної послідовності 5Т5, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 35, І СОКЗ амінокислотної послідовності ООКБІУРРУМТ, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 35; (б) НСОКТ амінокислотної послідовності ІЗУ5ЕТОУТ, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 36, НСОК2 амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 36, НСОКЗ амінокислотної послідовності АКНОМСОУМІ ОМ, визначеної 5ЕО ІЮО МО: 36, І СОК амінокислотної послідовності 55У5У, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 37, І СОК2 амінокислотної послідовності 5Т5, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 37, І СОКЗ амінокислотної послідовності ООКБІУРРУМ/Т, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 37; (с) НСОК'І амінокислотної послідовності ІЗУ5ЕТОУТ, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 38, НСОК2 амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ, визначеної 5ЕО ІЮ МО: 38, НСОКЗ амінокислотної послідовності АКНОМСОУМІ ОМ, визначеної 5ЕО І МО: 38, І СОВІ амінокислотної послідовності Б5У5У, визначеної 5ЗЕО ІЮО МО: 39, І СОК2 амінокислотної послідовності 5Т5, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 39, І СОКЗ амінокислотної послідовності ФООКБІУРРУМТ, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 39; (4) НСОКТ амінокислотної послідовності ЗУЗЕТОУТ, визначеної 5ЕО ІЮО МО: 40, НСОК2 амінокислотної послідовності ІМРУМОСТ, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 40, НСОКЗ амінокислотної послідовності АБОМОУМІ ОМ, визначеної ЗЕО ІЮО МО: 40, І СОК амінокислотної послідовності 55У5У, визначеної 5ЕО ІЮО МО: 41, І СОК2 амінокислотної послідовності 5Т5, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 41, Ко) І СОКЗ амінокислотної послідовності ООКБІУРРУМ/Т, визначеної ЗЕО ІЮ МО: 41, де антитіло не зв'язується детектованим чином з СІ ОМО, з'єднаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМ.
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що не зв'язується детектованим чином з СІ ОМА, з'єднаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМ4, або яке не зв'язується детектованим чином з СІ ОМЗ, з'єднаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМ3.
3. Антитіло за п. 1 або п. 2, яке відрізняється тим, що вказана клітина є інтактною клітиною.
4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що воно зв'язується з епітопом, розташованим в позаклітинній частині СІ ОМб.
5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що вказана позаклітинна частина СІ ОМб містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІЮ МО: 7.
6. Антитіло за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що зв'язування антитіла з СІ ОМб включає зв'язування з епітопом, розташованим в межах амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІО МО: 7.
7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-6, яке відрізняється тим, що СГОМб має амінокислотну послідовність БЕО ІЮО МО: 2 або амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 8.
8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що зв'язується з С ОМб, що має амінокислотну послідовність 562 ІЮ МО: 2, і яке зв'язується з СІ ОМб, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 8.
9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, яке відрізняється тим, що має наступну активність: () знищення клітини, яка експресує СІ ОМб, (і) інгібування проліферації клітини, яка експресує СІ ОМб, (ії) інгібування колонієутворення клітини, яка експресує СІ ОМб, (м) опосередкування ремісії розвинутих пухлин, (м) запобігання утворенню або повторному утворенню пухлин, і (м) інгібування метастазування клітини, яка експресує СІ ЮМб.
10. Антитіло за будь-яким з пп. 1-8, яке відрізняється тим, що проявляє імунні ефекторні функції проти клітини, яка несе СГ ОМб, в нативній конформації.
11. Антитіло за п. 10, яке відрізняється тим, що імунні ефекторні функції вибираються із групи, яка складається з комплементзалежної цитотоксичності (СОС), антитілозалежної клітинно- опосередкованої цитотоксичності (АОСС), індукції апоптозу та інгібування проліферації.
12. Антитіло за будь-яким з пп. 9-11, яке відрізняється тим, що вказана активність або імунна ефекторна функція індукуються зв'язуванням вказаного антитіла з епітопом, розташованим в межах позаклітинної частини СІ ОМб.
13. Антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що вказана позаклітинна частина СГ ОМ6б містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 6 або 5ЕО ІЮ МО: 7.
14. Антитіло за будь-яким з пп. 1-13, яке відрізняється тим, що вказана клітина, яка експресує СІГОМб, або клітина, яка несе СІ ОМб, в нативній конформації, є пухлинною клітиною.
15. Антитіло за будь-яким з пп. 2-14, яке відрізняється тим, що вказана клітина, яка експресує СОМ, або клітина, яка несе СІ ОМб, в нативній конформації, є раковою клітиною.
16. Антитіло за п. 15, яке відрізняється тим, що ракова клітина належить до раку, вибраного із групи, яка складається з раку яєчника, аденокарциноми яєчника, тератокарциноми яєчника, раку легенів, дрібноклітинного раку легень (ЗСІ С), недрібноклітинного раку легенів (МС С), Зо плоскоклітинного раку легень, аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, базальноклітинної карциноми і плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, синовіальної саркоми і карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, перехідно- клітинної карциноми, папілярного раку, раку нирки, нирковоклітинного раку, світлоклітинного раку нирки, папілярну карциному нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, раку клубової кишки, аденокарциноми тонкої кишки і аденокарциноми клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, семіноми яєчка, тератоми яєчка, ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, тератокарциноми, ембріональної карциноми, ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
17. Антитіло за будь-яким з пп. 1-16, яке відрізняється тим, що є химерним, людським або гуманізованим антитілом, або фрагментом антитіла.
18. Антитіло за будь-яким з пп. 1-17, яке відрізняється тим, що зв'язується з одним або більше епітопами СІ ОМ в нативній конформації.
19. Гібридома Мих Мивзсиив, депонована під реєстраційним номером ОЗМ АССЗ3067 (0Т512тимМАВ 59А), ОМ АССЗ3068 (5Т1512тимМАВ 60А), ОМ АССЗ3069 (51512тиМАВ 610), ОМ АССЗО0О70 (СТ512тиМАВ 64А) ОМ АССЗ071 (сТ512тиМАВ 65А) ОМ АССЗ072 (СТ512тиМАВ 668), ОМ АССЗ3073 (5Т512тиМАВ 67А), або О5БМ АССЗ3090 (5Т512тиМАВ 89А) в О5МА - Німецькій колекції мікроорганізмів та клітинних культур, де антитіло зв'язується з СОМ і не зв'язується з СІ ОМО, з'єднаним з поверхнею клітини, яка експресує СІ ОМ.
20. Кон'югат, який містить антитіло за будь-яким з пп. 1-18, сполучене з терапевтичним засобом.
21. Кон'югат за п. 20, який відрізняється тим, що терапевтичний засіб є токсином, радіоїзотопом, лікарським засобом або цитотоксичним засобом.
22. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-18 або кон'югат за п. 20 або п. 21 ї фармацевтично прийнятний носій.
23. Спосіб інгібування росту клітини, яка експресує СІ ОМб і характеризується зв'язуванням СОМ з клітинною поверхнею, який передбачає контакт клітини з антитілом за будь-яким з пп. 1-18 або кон'югатом за п. 20 або п. 21.
24. Спосіб знищення клітини, яка експресує СГ ОМб і характеризується зв'язуванням СІ ОМ з клітинною поверхнею, який передбачає контакт клітини з антитілом за будь-яким з пп. 1-18 або 60 кон'югатом за п. 20 або п. 21.
25. Спосіб лікування або запобігання хворобі або порушенню у суб'єкта, при яких задіяна клітина, яка експресує СІ ОМ і характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, який передбачає введення вказаному суб'єктові антитіла за будь-яким з пп. 1-18, кон'югата за п. 20 або п. 21 або фармацевтичної композиції за п. 22.
26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що хвороба або порушення є хворобою, пов'язаною з пухлиною.
27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що хвороба, пов'язана з пухлиною, є раком.
28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що рак вибирають з групи, яка складається з раку яєчника, аденокарциноми яєчника і тератокарциноми яєчника, раку легень, дрібноклітинного раку легень (ЗСІ С) і недрібноклітинного раку легень (МЗС С), плоскоклітинного раку легень, аденокарциноми, раку шлунка, раку молочної залози, раку печінки, раку підшлункової залози, раку шкіри, базальноклітинної карциноми, плоскоклітинної карциноми, злоякісної меланоми, раку голови і шиї, злоякісної плеоморфної аденоми, саркоми, синовіальної саркоми, карциносаркоми, раку жовчної протоки, раку сечового міхура, перехідно-клітинної карцином, папілярного раку, раку нирки, нирковоклітинного раку, світлоклітинного раку нирки, папілярної карциноми нирки, раку товстої кишки, раку тонкої кишки, раку клубової кишки, аденокарциноми тонкої кишки і аденокарциноми клубової кишки, ембріональної карциноми яєчка, плацентарної хоріокарциноми, раку шийки матки, раку яєчка, семіноми яєчка, тератоми яєчка і ембріонального раку яєчка, раку матки, герміноми, тератокарциноми, ембріональної карциноми, ембріонально-клітинної пухлини яєчка та їх метастатичних форм.
29. Спосіб інгібування метастатичного поширення клітини, яка експресує СІОМ6 і характеризується зв'язуванням СІ ОМб з клітинною поверхнею, який передбачає контакт клітини з антитілом за будь-яким з пп. 1-18 або кон'югатом за п. 20 або п. 21. Позакліткова петля 1 сорме (ББО ТО МО: 5 МАБТСОІКЬТМІБАУБОМЬОСТІУЗОАІВІНКУТАКІСМВІТУДОУУЮЕЬИМЕСТУВТо в сьрме (БО у Ка: МАВМСТАТМТЕАЬАУ СВУ ССВІ СМУТКОМ ІУТВОТІНЕСПЮМКОУЧОВТ: 60 сьому (БО ЇМО: З «МЕМСББІТОКАБАХЬСЯБОТІТССАТРМЕНеВКІСЕМІТТВОКТІМНКСЬКМИСИЧОЄТИ 59 Ж жі 17 Ж «тії: уж АтТКуЖІВАКК ЖІ «її уажкекж жжкжкжк сібме (КО Ір оМОг 7) ММК ТИТА ОАКВАБСУІАЦ УВК БУХ АСАКСТІСУЮВКОВОКАНВУЄТ 120 сЬОКЯ (БО Іо МО: 8) ПОСУХИ РОВБОААВАІСМУТАТ САВА ТСАИСТІСУКОвОВКАВІУКІ 130 СН (ЕФ Оїб МО: І ОМОСКУХОУБІВЬРОРБОААВАТУТТКІТМАВІЄУТЬ ТУ ВОКСТМСЬВОКЕВКАКТитУ 180 СМ ЗО Ір МО: 11) ОМОСКУХИВБІАБРОВІОААВАСІУУАТ ААУ ААШСТМСТОВОТАКАКІТІУ 315 в ен о о в о А С Я тії а 1.0.9, ух, їх: т. Позакліткова петля 2 сЬОМБ о ІБЕО Їб ОВО: 2) ЗОТУБКУТЗОМІТЬІРУСКІЖНАІІКЮРУЙНВУАКАОКВЕБОАБьтІсеААВСТЬКОвОСЬ 180 сьома (550 ІВ ОМО: З) ВСУ ДАСІТЬІРУСЄТАНАІІООКУНЕСВЕВІКВЕБОВВ Б ОМААВАТЬМЬСВОСЬ 180 сЬВМа с5ЕЮ ТО МО: 30) ВОУУКІВАЛЮМУКеРУВИТВНМИІІОБРУМРЕУДсВОКВЕМОоДВіхУЄКАВЕООЬЬСОШОЬ 150 сЬомЗ (5БО ХО ОКО: 4) АОТБКБЬААОТЬУРУЗНЕВАТІ ВОК УМРУУРЕАсККИМОоАсмУеАВАКрОЬООВі 378 І РІТ1уїті роті пІкежекух,,, ЖУХуІВЕ,ЖиуєктіІх ркта,х стома (ЗО ІВ ОВО: З) ІОСТСВВОСЛОсВНуМАВУТОАРАТОКОРОЕУВ--- ТКМУЄ 220 сьоМо (КО Іо МО: 5) МВОСТСРЕРОТЕВЕВИ- ВВА УВІВЕКВ- САВОМО---еКВОохУ 217 сЬОМІ (ЗЕ ІВ ОМО: 19) ВОСКСРЕНІТ» еОКРУВАКУ- УВААКОАВАДЦ ння ОВ сррмЗ (ЗЕО хром: 10 ІСЄБСВЕНО---ЕККУТАТКУТУВАРНяТИРОВЕБОТОТЮВКОХУ 220 жу я, х ж Ж аж ша Фіг
СЕР анти-С ОМ з'єднані ши жен я отити ре: си нативні я ше ше а не шо и фіг. 2А ОБР анти-СС ОМ з'єднані «й Беше - і; Ї 7. | т дея па - нативні | я т я й - Фіг еВ дити дити чнтих анти» сина СЬОМА СКЦОНАА СКОМНА 8 г З г З г з 5 ох ж ва З -ї Ж рак ик ши -й 9 я З о о 5 ро 5 5 5 55 55 ж ух МУ Ж х ж х Ш ш ВВ ві во ш и З чого ЩО сіоне сіркз сіома І сіоне че Фіг З їзотип анти «СОМ анти ССЦОМО анти-Сі 04 ОМ Я І. (З о г й Б ЕЕ, ши и Не Ва ВО ОО пох 58 В: із» В нетрансфіковані 5 п й о ЗВО їі ІБ ВОМ, І ОМ Н » ен вин і Се нн е ооо оон Й | -« кино і ко це зи ще А ОНИ ци й вози и кі цк ой цк мі ши аа ши я ЯеаА. 000100 вай ре ЖАН Щ разок ббвунка ї Г зразок, Вобячнка ою І Зразок ОЗ лунка ОФЙ; ОВ ВВ см: і М; ОО , фІОІ "ВО, і зв сим. и 0 ' шнЕ; /- й 0 ШЕ о. і і р 5 ж | Б 0000 транефіковані п 0. Е ШЕ (о Дейв СОВА -- Я С вевА. аншшнві Гбразоє бтбиунка 01! р Еетютьня ораек ВИК пунк я. | чи: и сіомо- - ши ше ше й А БЕ. за р б трансфіковані ЕЕ | Її | с с ВВА йсйй вай с -- Ве А Око МЕТЕКО СК ем бвИ 00 вуж з ДЦ і І «з ШОН з "ОВО 1, В-ВО т ОМВО " ВОВБОО ов - тав і 5» я т ВО і Бе ВОМ сіома шк | І 0, шо с трансфіковані я я | Б. Кай А ! Нед А 00 КА А -Мейй.. разок ОБОЛУЄИя ОО Ї звязок Возна В! | я "шщ «БО ко і і і "ІМ ви ИН 1 ПИШИ Н ПИ КЕН - й ОО іх зо іш В -. ВВНОМОВВЮВХ сім. 5 ВВ ї ее 5 Б ї В трансфіковані б НН с А сн ВВА КефА нн ВВ
Фіг. 4
ЗМ... ! і й сива 18 пунко З 1 БОМ їі юю ВЕ Я тунко ВІ не ИН : с пово вве зоповоея Н ЩІ й то п і дохо ККЗ лем. ще сом С Е Ка ПЕК ОВ : «ВВ СТУК і пн м о хм. ВН Де КО ПИШИ НН : храхюх пи 3-8С3-НВ Ж о рт 5 - Вова Що ак
5. ша РО ие ОО п ДО мова, нн зраю ОЗ не с І я ВВ в КІ с г "вовна і с п ше З ПО ї. о я хз. В сряяй АЯ У І Еш ДЕНВ по ї щі в НЕ са Й ви ЦО «є ВВХКХ КООКя Род ПН МЕН ма Б Н - Б Ко -ВНОе НОВО ши ШІШІШШТЩ ПКЕЕ яд под Н їх за І УВО ОЗ В ДОВ Ук ВВ форс Б і Я ВО Кок дини ех Ох ТОНН в і ОН пен ; ї ПЕ ооо вав ВЕН ВУ в 8 ЕЕ ВЕН і їе ВБОВ ово аа ВО ЕЕНООО п ті В де І ши шою о Не сан (З о З З вк як | кдшки 0 ШІ 4 ря с С ТИВ | ак Мк Ей Е МО, Ше в 1 ; й т о: в ОО й : й г "УвістА | Е хо й ке не і ВО сек КЕ птту рн скота і : си мини і М нн ьнн Її ж БЕК їі вини Гоеееееееннетвонсс, і и ; : І Н туя мис: он» ї і доли зала ств гі ! Був Є щі ве Н гам ВІЗ. пукках Трортт пл ше Й ї ї Б Болю РА вне і оком дов НОНОВтЯ СТВ. ! Може п іо КОН пом! Н зехих УЗА лу п нн Ба-Е7 їж п ЕН Б ТЕ оон онинння вн й іч пе м В КИПЛИИИИИИИ ПЕК І 2 пек о сокохов есе Н М "а ня в В с рт п ще совно: неви і Бге- МОВ В : дини КОКО У ве ло ВВинвавіввве званих С ,
1 п. р щі ЕЕ х п НИ: ОН Щі С Ії 55 п оо - Вк ви І ї що цк ен НН о І : пеня і ге-яа М: | В ОВ кі ВО О Пон ще 5. І : ви ЕІ о | Ноя Б «я п.
Е 1. НЕ у я а Б її ДО ен ї т ланвенно МОЇ НМ Б ЕНН во ОЦ же, ДЕ ПОТЕН і ДНК ЗАЩЕЯ рі БО Не ВО па ЕКОН ОО в зе ві. ПН В ЩА п | ев ооя ПЕК нн й Жейсус» Рі у ОХ ве у ПИ ння спі ВВ й ою ж ю Е Б ІНДЗ | --- ПО І ши : ЯК а ; ОКООК ОК ---2 УКВ У 1 Уаней Е я й ї 5 ППП ОЕНННВОО Кос НН, ! пан ї зашн мшн іиннн по ній - з гум а Н гий те ізотип с ВОНА дн шо рення сіомемазу) і. -Зяожй і сохеам ПОД поемою ЗЕ Ум п ЗМР ше ії «у ВІ свою пн і, - Хорове Махна 7 5 ЩА вас ве ! «в ви ОЦ нер пи, ях ЕЗВОЗНЕ ян В її с " їх ВВЕ Во т Па «Б ОО
Я. О В й ЇЇ ів еВ ПМ, і: 0 НН Денне її Б МО 18, ВУ 5 ло 3. я |і г яв ОВ тії Ве ЕЕ миши нинини 1. Я- ВЗ М я і првнвннн Дн зе НЕ славі | нення 1 левеА | и З ОТАК ноти і ння х -й Ав Ней ге пив сі Фіг БА зве Ва я Пи р й вого сь В; ння осоеоосн, - вот з : сірі «- ВВЕ за мах ВеВлУ ; ! г а Кен весквне ке фтттнннт сцом» Е ПЕ НКИ МБ ей пи рі мених ПТО. ПОМ ШЕ поммнововвивтнн й | Гу ОО п і Дона ПО : законною сфатуеке ЗД 1: 3-785Б4 їі БО шо ді: п і-й пен енее сне Гі пт Ей ДО и 51 »- ВВЕ о КН о і воганох Перо Мио ЕНН нос ПНО як Поу Де НО з БК рем свое ен Е Ек о --. В пам Ес ШЕ по Е пеАРБЕ ПЕК ДЕ с и В М На 0 ЕК о ; : По і 7 вавввовх ВЕВВН НЕ ІК м у їх БІ. Я Н зе С і : Вон зооовоюх МОХ 1 Ко Ве КІ ВЕЖ 55555555 Н дах ДПД Н іш ПВ ев | ше рова В. Н і це Ес КЕ ВВЙВЯ п ї 17 зввй ех Н Б ом шо Н і ох іш дення ве їі ЕЕ в ПОВЕ Я Н го ДІ я ще - Н ДН Во Н Уха В Я Б по З Ш ! свя ' я М. рт її хі и і соня ВОВНА ЕЕ ШУ КЕ п вм п :
до. ! і ше в | ' Пен и Н с ВВ, рі ве ши 533. о ДІ ко МН. МО нк Рой ї Н що зд те ПМ нти ПТО е | і Не рон й ш І вх Т Н рисові по Й ше нн сен Н дкнсроькою З пукке ЗИ | пн | 7 р Пр ввваен | ризик лу г с ЩА пана КАВИ поринете де о. Не «Ве ее ее; і зак ду КЕЗАЗЕ ЕНН о Е ї п з кн вне БЕ паєлуниютт Т-АВ КВ вн «ть ро - М, НЕ зрктює ман: ке о й Б і ПЕ 0. нон нен ! - п о ВО я У Ки ве НО ово ЗВНЕНННО вінкннння ДИ Н Кх о, Бе вн їі ее Її ТЕ шт о п | такі «мн. ! Й 5 що с рем 3 НЕ п 155 п ож» с Н пе ЕЕ ВО Н Те пе ОКУ п І Н ВО а РОБ овя Н щі я 5 Н з. шо і і п ен й щ п і се і їх 3 і і Кн за; КАН зи пи Н Ес Н ян ! Н ! км нн Кос с с: ОЗ ЕНОМОНН ОУН ЕХ в ШИ ши шк ще мкл ВЕ: п РЕ В СЕ і оБоеюнА | ! г в о ж і М ня Н Е- по мо Н іс: ще ! Мо : Ї ПИЛОК "У ВИНЕН ВЕ Он ' Я веж фо й Її оз ДИН і нний рі і ВО лячно м ДН ЗВ 5. ІПН гі ошие: нин й : Фі А ев ної і 5В нн
Е но: аз о4 теропег Сьоме сьо сьома СЦОм СЬКА : за Кв а В М ЯНКЯ ситу Ущ ти ЗІВ ЗЕ Я півосі ГУ зозюій зо зе се юю І ОВО р ННІ Ко ВВ ! лі З М св АЙ Я ко що юю Од овв й лююі ОК в'я. СО Сх т 1 | «Р оф ср 1 АН позитивні З зок ВЕ ЩЕ з де - Ф леді и вм ОВО По ЗМА що ШЕ тов й ч Кох м ї ох ки ов вана ч со ї Тов І Ге пи сек Уй мо « Ж: о АТМ по: НА Я я У: контролі х он й Її зо М 5 ча и. р: хе ВИ ї то. оку ЗИ БИ Ж от Е т і пев У т; АБИ ЕС лу Ес ИН: Вин СЯ ох ра | ма Бі а 30 305 свю юю пово пе збу НО хюоВ ВХОЮЮ хо цю зх цкйе кою У ЯхУ яю Кн КХЖЯ тб зп нюю химю зКоо ізотип тейМмАВ ЗА пШМмАВ ОА пишМмАВ ВО іє рела чввх пинллвивава че В очолюваний зх 0 СЯ ою ко тою Ї ев уко | ох айВе с Її ооо толь Рос ВН та ою: ШЕ а вне ВУ шен кх .- о ням су с Й КВ ОУЕквя -. р Не З ДМК ЗИ б ке сш З ві 0 сьоме ія ЕК ОКУ ооо ВОВВВВВИ х НЕК хх дво МО НК ме т кв 5: АЙ З ер: Фо в Ж ві КЗ БаЖЛІ й ди ! вона нні с й осв нн де, -ва4 Я Зб ою кухю кю. 10 ж ОБОВ ХК 36 здо ЗО НО НяХКЮ 16 а тролю КОЮ зоюроі? 0 оююфи Шо, зо ШЕ ше Мя ' Е Зі «и 7 ККУ хи ром ко ето ЦО ОНИ В ЕЙ рю Шини шк шани НН
М. 0 ЗОВ я КСВ МЕ У «ТОМ За . Е НЕК с ОоМмв- шк о окт МКЮ ФОНД ОКХ пек іо ОВК. мо 00 Керн еле В В ор сс вав 5000 ОД БМЕЧИАЗУ еВ НЮ ооо Ж о Ж хе КО: «ШИ з: ИН ШИ и Пиши ШИ Ше ШЕ ше СНИ ДЕ о арт Ж ові Яд лика ваза по ТА, ще оленя ща доз ї тб У НЕХІ АХ Ю НИК 55 зда. НИБУОКИК ІЙ та НО ких НКИ чк она ж чкХюЮ БУВ ї ох 1 . ЩІ 3 Я СТУ пух си син ни чккоб ше їх | 1 нки я заоуітв їй «сх Ж гр ; . си топою. : | Боко: ; й с ловоа | дохо . босоюрти в тай ЩО зво в ше В аю т Я ОВ но оадоно СМОМО й од вс МН М КО Меса Я ШІ А Я 5 ної АСУ са М зе КК ою пон Ж з ОНИ Ка С солний Ку Урни Із Мои ж 000 жо ИН жо с і КЕ жо и ЖАН КИ кад ТУ КЗ. вв ху ИН НН 3 ак НО ОА У ви их ТУ ТИ дл 3 ситне Воя Я СОСНИ ше, КИ МЕ 4328 т лоб ж КюЮЮ ЖКАХ ча ча чар м Оює то лзох ню ую за ню чюВБ'ЮЮЗ НОЮ
Я 5. Е хі она пн піде зе ИН нс заорваванн пенлнавнавнври кою 27 | З зді п зюх вк І о еВ шк й я Н і і Їх : Н Не якові ! ! Моно шою і Її дочко | і сни нн о и а Ве на Й Я юр тьяхс., 1СКОМ3 що СИС МКУ не ВО Ноя «Е модесоо Уа ї ою іш ! 5 МО » НИ Юсно сов ш НЕ о о ВМ Е. ПОМ я в ох с Ті явив вт вд фев. дея Кк ау в я яті тт ат ЗВ: ан аа дн а чо юю ох 10. лох 1о0о обо юю зо зе хяКю з нхю Нею дою їх: х 7 ШУ В я й БИ ; чкво р ча яко а 7? зовні ал 1 пююря І ї І ї ля ї - й Н ож реко) | вої ши ше ня ШИ Я р дою пок На Не на В ни о ПО ЗДУ пон КУ НЕБО я с ТК бою . о. : 5 з ПНО | вові ооо ов ї ке Вивих сс сов До: Й ПН: коки кн си ва ні и ж ей щі ко фр рТИИ шо фі вів оо ввж ТК Й АН ЗАЛ ПИ ев Х - пику АД хе туму КнАД УЮ, Аді КАН 5 Я сел иеучті я 3 - зе за ща в ХХ НяКХиХ з як ХюлКюю МКЖКИ 15 зах нювахха нях 1 Ух кою ню тмшиМмАВ БА тим АВ А тимАв ВВ тиМмАВ ТА ух АК ПЕВ и у т йду ивиеннніи зо ший зн т и зер си ню ОО - ІД ОВ ВІ І у в Я Ї ОК лм 3 Вот - и НУ ді Есе ков | 4 ДН ОВ око КАВУ і -о 0 ШЕН 00 ШШеє 00 ШЕ З Ве о о ДК зав с й Пон ОБО ОО о ві МС З дю ПО. 5 ех 5 5 пн й ї о; ев І В КУ в т. НОВ лляні 15 ПЕ, сом т за чк Не о « век Б НН М ПН З ноя ча ВАН й то ВО | « осо аа 1 х Лу З ня Квас в МИНЕ жк еВ і КУ 47 ві КЕШ ши 5 з З 19. ! тод ші сі кокс инннньс АННИ МИНА СЗШ с бро і ази то б 000 жКю То000ю а я о т я катета потоки ктнтун т за юю ОКО за же похо нямю ЗДОгОю 16 303 оо Зоо зОЖкю. т данінкчееовує нн реридене фени нвнненндтьці дк тртннннннттнтдтктт заожх! ще їз. зара ! Й м зак йиВ. ЩО «хо о УВІ їз пи ОН су АНННКВВ ся 1 п М - сор, ново | юмор. ря ку я опе я ШІ: ще п порве ун пі в 1сЦОоМ Фоюі т ФО дні. щ Он: 5 ро кое й ою А ХЛ ОВК і: КТ же 13 Пе - п пон ук ная МР аЗУ і ом Ко ЖАВ ММ ПО ем ДЕК сзу зо с ВВ І шк й Бр Ж зві и Я вх ПТ , Я роя ВИШ ок ке МИ з МЮУ Ж І ох не У ка НИ За да Зі ох ; р: ДИН : яр о я й пору етіднн поодокниняу в пккчннетннн ММА нан денне 5: А З мая с сечннттн 13 500 3030 З30Оба бю за З оз юво ою ча здо Зб айюх ЖККЮ. т ОО НяЮ 1000 юОвОю зорово еВ Я ду? ЖК дод ШИ ІК зов Я ре ІБ: Й зі ха ! і ї Е рої і бюзюї а І дах дою
1, . 1 ї я НІ - Е; . З юр ін ШО ню рені же сю В ек нини СІНОМ з НОВУ Ж оо вАа ТК З нс еще Ж НИКИ сна 5 ВК ! х Б ВН оо
Є. м ХО ; ПК Ки ЕК у КК КЗ ПЕН ПДВ М Г- Ко М гг ово МН Я ПИВО ех ЯН а МИ іди й звик Й РУ в зо аа КД 2: УМ от Я, веди Ек ту. Звд аб ЛЕ Мах я БОМ дні ттлстнтн ; зв ОК с яв Іза рих, дз ЩО МЮЮ МКЮ. 100 бвкію Зоо ою ЯЮМ іх "ою кю я Ї Кк вх ЯКю онко юю НКшКЮ за лою ЧО нкй на юю Зхкхю Обоє шт шину пууднннтннртня : рутууттт етері нання Комо шо Ї Бе тв 10 з ре: ВИШ пев , | ож - т : Н їжею таких Є ух дової | е р; Й ш КК - з ОО Фа ло ня ема и и КА Я и ву Є юю спис Ю и нини В ню шин остйтьн бою ху БОМ НН і Ж НК с й Шк пок А.
р. оо МВ 5 су 5 с МІ чо в в ВВ г Цен ес ОВ ОТ Вей « Псел оое 5 оо ові и МІ Же ТК, «БИК ід Б Як «Кри "фаза стро вв піфадосе у м ж вв фа хв Зір зву то Ти тооа п чо Зо 0 НАХЮ лЮсвЮ талии КАНОНИ і Об Ода мХю ЗА т МАКВКЕ тю ню ма нЖКю НКЮ зо АЮ тЮоМ 100000 - с ручна зонах спини оушннн лину поро Я сю І З мож З лою не - ! - І р і і ж нях НО у 2 нн ХЕН топку сце ни ие 55 5 нн ШИ ЕН НЕННЯ З М Ват мен Кк несх нн ВДВ НА Ссиюма « и Й ся ДН а ПК р Я о: зано т зо М Ос НК сН о Кр у 5 ПЕ ос Ка че тий І г що І З 10 ав ш вро Й їх пох око о осв о І. нос о ший фвргв ШК БЕ НВ Ме В юн КО да зн а еп БАЗИ ЗД Бу коні Вива ов щв Зб лаб чую ую ЗОюх з аб лроа юю ТОЛЮВІ за МК Нюх Зою ЗО т ЗО 1009 109 0000
-вк ТОМАВ БА - Дня че т -йк- ТиИМАВ БО Е ви й -к- ЯЮОМАВ ВТО і бо СЯ б и й "«в- пшШМАВ БА а с щ и Ф й --- МИМАВ ОА у І у сонне їй к 5 ОЇ В я в ЕИКя 2) 000 Ой Зоо Концентрація (нг/мл)
Фіг. 7 Узі «лок ЖК Ж тож дж аж аж ЖЖ: ЖЖ ЖЖ ХА УАФ А АА АВ АВ МК ЧА.» Фу фі од Зою ее. ехо феж ден дб. Ж. ж» у тк «ж «ж «ЖЖ ЖЖ дк ко кл ЧА ЖК ЖК Кох КЖи ЖЖ СА ЖЖ Жука пексолесно до ення кокютючня зкоузю пе чо нт пд АКТ тотннитечетотитьти си жевютетьснкнютютткокнко 0 МАВ ВВА Дн ни р упютввовлвевснюаопеонстеенатокетнно А «в лиМАВ ВВА те ВТ усною -е- ТВОМАВ 810 . ее ІВИМАВ ОА ця ней -в- тиМАВ ВБА су ота аа не нон нове сс сс я здо дак він дою моє есев ве ою як тиМмАВ во З се нн у Па а опи ї Ті НУ 3 х хе Ж «в І . ко т Ж ТЕ т Кф яке оф се век дю юю Ж КК, У «мм ок КК. ЖК ЖК, я ККУ яд зл, ТР ЛІ КА КР. У УРА РІ ФСК КР МК МВ РАСВВ, РРО МА НВ РВК ВО М Мг. ох ою Фе дю ФдЄ зе. ча т вд фе о ЕЕ ЕВ фонетичне тютюн пі пт течню птн п теснв пт пп тет постют т ті тестютюст т тенет а і нини й 50 зво чНЮ ОО ЯК Концентрація (нг/мл
Фіг. 8 нЕСа МЕС СУТО» БА в КО МАВЕЕВ Ж птомАНОВВ х ШІ х КУ З В Си я ншщ шщщ ее ХЕ нні і "Шо Е дження Я га ин в Б Б і. фаденннннннянтян ані тя яння нітнтня ві ій ій, І | - -е сс о 10 За ною 36000 ЗдО0о 1 зо то нюо НИКю 00000 Концентрація (нелял) концентрація (нг/мл Фіг 5 раннє пікування - МЕСВ раннє лікування - МЕС ВІН День 8 5 ван Девь 14 Е ж - - З - 49 Ж : в Є ! її і 5 шо 5 з іх ла г р о вл о ЦО дж й й ко р. чі Фе в ! ке 5 НЯ я ом ще 2 Но "т ж в а х ї « т є во ож ож й й 8 Б 5 5 8 5 5 й в 3 5 8 5 (233 5 ре Я я у І»; в В в щ В 5 я 5 ях 2 Е ЕЕ ЕЖЕ ЕЕ В ЕЕ Є Е ЕЕ ЖЕ ЕЕ Б Б раннє лікування - МЕС Я раннє лікування - МЕСВ День 21 День 38 Е Ж яв |: : ; 5 З Е | з он у З Зх Є і : Гог і ке з х як Й 5 п Ії ке іга Но ле. в ре В ї Я я: з ке па о 7- Й Й що ДН ст сненовдддднннннт нон одне дна дане дно мн и в ня ник ник нин сн нини пе и по и вени тшшЕ В аб: й з т 899 5 що юю в щ в в 5 а в З ЖЕ: 2 5 8 5 5 5 а 5 5 ЕЕ 5 ШЕ ше шк ШЕ. Е Ж ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ Є ЕЕ Е ЕЕ Ж ЕЕ Б Є
Фік. 10 в БЕ КЕ ! І ! а ; ! вс сОоМе сома соня оСомо поннмннннннннни Для вит ние а Н їжої і Ї оо х че яв, т, а ЙО негативний хе ше що | ТВ! контроль 5) ше т жк, оті 19 у хо В | Кей і; / Х Е х їз і й й ж о то тоже сов от ри що дхотккко ху Ж Зо 10 НКЮ ее тхе пумстокню нини пп пи НЄ: тт во
«о. ше ВИШ и ш й позитивний - Ї -ко ще що ше ни ' і й і Ї і контроль щі В що й з Її | зві І не В Крот дише у ГУ сейвва 5 денною -е лини 2 Я ; ; о Мн опдснетеніной зо 32» 109 НКЮ» ПК крокЕш опо? пххб'кою паз Зб лоб 1 кое хе золою пн и: с пн т 0 зов. КО Ж ві | в : і п, В | ; ; хе! рої НЯ ях І оо Н світАВ ВІ і | ово Я ! і. : : ГЕ. Те І: щі і тої По, зе Д ши і і ПО ШИ і і веселяться б й - » о М снячння ода рт чо зу Зб Ох НИК зо аб НКИ Зоб Трою та ж дю 1Хю МККОЄ Зоо хх 9000 150060 я ренти нненн Мк ) дя ек А ще і Її щ ше в ше о ше сСВІТАВ ЛА ж І: ! | І і ! «о | хі в / хо й зю Кк її г по скн ноті кнкя ян се БУ ї с т Оля дес пкавій їй ета сккнкеічжкженннняони м о 05 хо ХО ню ях» ЗОУхХОзмХо» и Ме зхе ож ХО моз ооо КОХ синя Дука покою дж мі жи м освятять ж чень, афект 4 Я тю ї ! зо Й Її БЖ. НІ ! ! і вою і | «о Ї і ї : і З КЗ | І спітАВ ТА пі шо! че і Ї. «ов, В; | за | і ї 1 ! Не жо Це ї р | : "ГГ кі А Ле ДВ. бус Іа І доня й т бою. кою й і ме моб іфоозоюх М та зоб й «шо зве е 30 305 3050 б їдою й І ще сх НИ ков. | 5 Й Не ве що чо і снітАвВаЗА и зх І і зо і а Я хо ! і І І зовн, А . / С ЩЕ В. по МИ о Хе збуж 2хю о ро змо ме о ще щу Те товх одн пруоой
Фіг. 11
Зв'язування з НЕК293-СІ ОМб6 т 120004 що
5. 10000- Дн - а- СПІТАВ СА З вою ДИТЯ -- спітАВ 67А 500 ИиХ Ж З 20604 у 0 2000 «4000 6обо вобо 010000 Концентрація (нг/мл)
Фіг. 12 Зв'язування з ОМ90 -- 250004 | -- спіптАВ 510 БОБ 0 -- спітАВ ТА Б о о 2000 4000 600о 8000 10000 Концентрація (нг/мл)
Фіг. 14
МЕСЯ дикий тип МЕС нокаутні (ОМА позитивні) ІСТОМ5 негативні) ке кю Й сваовазА В сплобваА В свлав ана Щ спав вн П свжевою ; П. спав Вій шщ- В снів буд д- ВО став УА в - Ж оч: ЕВ з що Я Б в то ВО Е ши х Ей ШЕ ш: Ся в - 8 8 8 Я Ку що 8 В я щ. В Б Яо що Кз шк в ОЗ ще: - Й В ВЕ я В а шик о що шив. зо ! Я пи м і як НЖКЕ НЕКУКЮ З 100 кю ККЗ Концентрація (нг/мл) | Концентрація (нг/мл Фіг 15 МЕСВ дикий тил МЕСВ ноквутні (СОМ позитивні) ТСЦОМЕ негатевні) З; Ще Ж сапаввд Ж сода Ж секай вад В спав ІП шктдВв ІД ЦП смцАВМ В став га т-- В о енанде Вуд, : ж З Ак Но Я Ж 8 я 8 В Е ГІ т Це 8 ж г Е: я В 4 8 КІ хе пи зн ЗИ ЕВ Е х ше шу їх я ж. рою х. х З 5 8 5 3. КУ т 5 шиший З а? 7 ж ши г шк и в в я 8 В в я В: ше сш ни ШЕ ї щ в Кот ще СІ. не ще ще Ж. Я ЩЕ Ж... пана Ю шшНши й 23 лу хай хх це я ліщ 1 Зо КВК ЧИЮ р: КК то000 ЗО00600 Концентрація (нг/мл І концентрація інемлі
Фіг. 16
Ріст пухлини - РВ5 контрольна група Ріст пухлини - тиМАВ 810 ко миша як миша 2ю ; з мишаЗ 2502 - маша й ж ; і х й Ї же мищай Шон і Щі , зе миша ВО ння ій ; тео мишей 5 ун -овиша й - ік й - сортах г чав і і шк -е мищшай ш Фо минаУ х ім Е.
Ж 8 мищаб - Я В яко мища 5 е і 1 х ЕЕ 3000 «БІ Ф миша? ге чалвві | ж ввшеу я : Ії ги Фе каша - і В мий їд х КО Є моз х Ж З ц кН ІВ кон миашщай о і Ж миша г) 5 о В Й Б День День Ріст пухпини - ти МАВ ЗА Ріст пухлини - ПОМАВ 67А : йо миша ї о миша 2509, в маша 25905 - миша Кох ; й шко мишаЗ бе і жо мжна З г і Я мищай в і й З мища 5 х ТБ 8 мишай З ок Ф кишай со зані ; Ж ндіва? 2 406 Шо миша 7 ї- З у х : й мищшаб 5 і і Фо мищав Х х . ї2 ; ; с В зо мкшай що 50 Я миша Я З Фо смийвїй о З Я миша їй ; пініненниннн , ні чі МОДИ ОВ КИ ДЯ ВЯВ ном інн ддрйдкю ке День День Фіг 17 (А) Раннє пікування - МЕСВ Раннє лікування - МЕСЯ Ранве лікування - МЕСВ День б ще День 17 День 45 й в я мо ВЕ Е: в: г х 5 Хояк гу З зво 2 хх и ро ке. - 2 доза ш д й ше з В 3 га : - заз Ї Сон ке г: Б п Ко ю сжибс тн Шо ОО З р о се а | 5 Її те-е0 ЛЕ сок у Те теевповпот ооо юде ді одіродіноєєьх ж Фе : х : ї КУ Е Ріст пухлини - РВО контроль РІСТ пухлини - ти МАВ ВЗА деоокацонії оо - ок яке мише 1 ся , міиз є - КВ зе жащей - ? зе мишей ї й х жов ухузшеня ФВ а пжузаних : зе мущша З Е пемлвсдна я о мшиз Я х ЗОЇ ррдддллиаалавнанввяфі як мхшай Ж чем й й і Зо йющай ге | як кжкої В г зу Є , Е Б зай Е ! комина Й Е М і "ле ЖОВ омищех - о і я лика? м Й ке тя Жомузо е ! іт 5; А К Н «фомізиз З З Бе: Як дик Ї Ж й - мит 8 і: Я суцщей сове ВО ванни во 48-88 85 миши і прщЩициции (Й й п Зковкою в гз и їх ; зіва вон вн Ша Демь Фіг 18
. . рек що пе тече Покращене лікування - МЕСЯ Покращена пікукання - МЕСЯ Покращене лікування « МЕСЯ День 15 початок імунотеранії День З Дезь 44 п ВЕ о ЗВО «. ЗЮщ х - - Н ак «ге що пер Ж яв Е шЕ пара а я ге х яБоб ш х - : Бе Й х щен я ї-к реч Кз Б й т г ж х і й - чи й 5 яких п г. й х ж 2 щі КУ й сення 0 ення зд до ві ення 5 я ах ма миочач м і т х поети рез де йди зах а і мя с щу ка и сс осн : щ в ней і: ї ї В г 3 в : 5 5 і: Е З щ Я і: ж ях х
Фіг. 19 в рив РЕЮт пухлини - Автитіза, контроль о. Віст пухлини - при МАН ЛА їст пукпиви - 7 КОНТраль. зе ща зе миша се жна ж дао: міхуканке я омишх? Ще Шк! іхикюно ями бе засо звкунаних ї жених х ші ж жа Е 1 зикюекккккннкиннкююф. вежа З 3 ооопокюю нки скоююту БУ козі ямка 4 Еш | ТЯ | тохишвя ОД / ! зе ідувонЯя й г ОКУ : я оменя й й Н Е 7 | я мнхах поле Ї, ; жеюнища 5 Я Гаї яко миша К і й дія : ; Злжахя х Ї омкщев к рай «А як мище? о | ій Ай : виз Жмищай Б : Щі ії кхище? г шк ай і с Якохеай х мам а у ток я й зв дк і Ме жутщай до | ЖЕ : ; ТЯ я Я ек Ф Хо Н о | КА я з я рія Її 8 дах, ши Дяк Дечь День (В) / виживання 4 г ДФ нонповоссосовотюосорово, з Датитіва, кантроапь КУ щ2ї з» ви АВ еЯА Ж « 5 0 фран сесесссссс ща 7 х : : : 5 55 бе - і М о онею ов 5 Б щ Я шк з и М Девь фіг 20
Покращене лікування - МЕС8 Покращене лікування - МЕСВ День 17 - початок імунотерапії День 24 бе ще а, зві Е - Е в ще з Ж Ко г КН в - їху Я ї «У х я Гах о се вх 2 - АВМ її Е зас в НА Ге; Зк й 4 ж с павдхнюютк З зах З г з вини Гн дк з на ще ди 225 3 У щ В ще щ ве 0 неайно и КТ о ба и зо м Би Ту - ще 5 Зв б а м й а і вЗ г Ге Ж 5 їй Е Е сЗ г: в В 5 5 5 Гея ш в в 2. ї - Ко Е Е Е 5 Е ї Е З Х Покращене лікування - МЕСВ Покращене лікування - МЕСВ День 38 День 45 су ЯКУ « - я ї ех тя 82 З КО КЗ б кортувіме 2 ЗНи ж | І як ; - Бя ША їш Б з 7 5 | з й ок в в) Є ох Бо.
Де як псввю - в ; їх їх - с те аж во | тен деникфалих Ф а й зе 2 снід ОО о з н ю й й о Ї З З од змбейіюк 2 5 в ве хх 5 4 а 8 5 Б 5 ши ши шк ше: о Є Е В Е Е - Фіг 21
Ріст пухлини - РВО контроль Во Вістпухпини - Антитіла, контроль монпої сеї с мо ФО пулу ї Ж ше х пкуалнма ж Во ОО охунасня ї свя ж шко осо сососоооо, мишія ж Ко ї нн о му г і їх ї ув, жо ; роя Ма Б ей і А 5 мини Бав, ЛИ мишей Б ході Б М ! он Я ех ВЖК І до ла шо ве зам, Мн о де я оду В |і в АЙ о ос уки нитка сон жирне ЕЗ ще о 5 а 5 КЗ ху С Ж Ден День Ріст пухлини - пи МАВ-Я1В Рют пукпини « мишачі Ат ТА Ріст пухлини - мишачі млт 8А ТАНЯ щої З З не яка - 3 мичиві -. Ва 2 яАжня 5 я Й Роже Ка ї-О Ген 3 ях - пуокомой як ай Ж Й Ж мим 5 пікуваних Мих х оооооооююсо сова оююю мив а зУхувеНя В омуноя Р: пхувкннх момоя. дао БЖ ще я Як мита - МОМ зосююсоооооососооо МеВ жо ак ШУ ! Я ді ; МИХ -е КЕ мишей ми: ж ЕК ; і КЕ. во г Я в А ку кищав ом КІ ех руд і З я ря ре й СИ: ее БО і вк шк. ук: 5 зи ; ку с Ї. » дани ек, 5 ск о мае Б кс Н о МВ олевивавво З ВО о овочу ий со ому вирує 5 КУ як Бо г хв ГУ т КЗ У - ще га шо 5 55 Во День Дань День Фіг 22 Покращене лікування - МЕСВ Покрашщене лікування - МЕСВ Покращене пікування - МЕСВ мк 5 почдтак імучетеваті гла г дозЗзЕ Данеії7-- початок імунотерапії День 28 День 35 тар ' тора : р ке ; ж Й - з : Б Н щш Ж г И х ц їх ро з Сх, с: : Ше ЕН ше рок і ' щабля Код в Е «а Н по р у ж її ХК як М кі дж Ж ж. У ї- Н и щі й да з і с й ТС аку Е ВО ОХ Ко Ж ху с хз і мч Е пото Н ; Е зх Н Ко ляля ДЕ х ян 7 ї ТУ одн що жав вх ОН дов В НИ Я й Ду же Н що? пе ро ШО М хх ду пере б дя од й я З - т х жу З ох у м нав що М Ж ше у БА МУ У зо де мЩЕз н о МО як Е зоре у у у М ех ли а З Я я | ши я х і МУ ЖЖ ОКО Ко Ос т нн фрснння за Ї ннуннннярнн пн ннадннннй ї К Ф КУ є - і 2 Я ж г Я ІЗ Е оз й хх 5 ЕЕ: ж: 35 ж ше ще ШИН ШЕ ЖЕ х Н В і Б з 5 пощ 5 ч- з їі ря Фе що. В і Е З З ; х їх Х і ЕЕ й 5 з я як р : Е Ж ж З 5, я В Н Е ГУ З рі х і Е роя 4 шк х ше Н зни Н ! не Н МЕ; В зснйени ж З МЕСЦИ астким шк Й МЕСЯ з спла Ро ЖК ОМОложвутм з СОМ москвутня Н СО Ме поедутом Фіг, 23
БО газ 2-8 ном зх ЗАД КН ул іі іі и 7 Я секти я Тв тет ув Ті Н і Та! ! ТОРІК У тА КИ вну А УЕ нм 5 спа З тоамеаскуУввьА РОН ААЯ Тназна Хо я за МУК ОЗВіВ Мнсвнозт ага явка но Ж ех БА Ко з ЗУ т певен а ва а я и у мету віх вв номкеня мом Ж за ннанни. 3 КІ КИТ МИ т КО ; у і ; 5 ї т ї ; у У ? ; ї я ь . ; ше які я 7 т ІБтеілентав вис ЖЖ: | І ВЕ БЖ Б 1, і БР Н І Н Ж НЕ НН ЖЕ МИ УНН і Гі НИ онуки шк щі ШИ Мне ШНМ А ШИ капи и не не ни и нин п и нин ни в не и ни и ни ШЕ дав ста м Ше чн и з СС: п В Во ОС зе У МИ 2 МИ ЗД ЗО ВО ЗЕ Я Сх НИК шк ЗЕ ДЕ ЗЕ ЗЕМНЕ ЯН порно щі ни мини нини и вени і шк нини ма мн им ми м не м нн вн КРиговАє А ни НЕ Я НИ НЯ З НН З МЕ ВО ЕВ МИ З Я НЕ ШО ЗД М У Є ХВ М ПЕ і ГУ вне жк шк Н 1 11 Н НИК 1: | Н тет прое ри и от ме ни мли МОСС нн шю ожини гне ше М ен и ше те Я ми мови жи ТТ есВупАЯ ОХ Ж: НЕ ЩО Б В БР Кі: і ТР Ж: Беррі, ве ША і КО на 137-481) пн мА спе зив ан пи пов пов ін ам й зме п ГОБ имя Ди І З ЗНО ЗАЧЕЯАВ й Що ЕМІТАТНТАТН вікі вівця А кА кін жо Назда рр пи тка міна ме зливі мар зааркарх ві кл во і сет пинини шина шшшшши стерня 1 НЕ МН і і й ж нин НЕ ЯН ко як Я шин ин нн и и и нн и кн нн и п В Ви В Ін: змінений трамопорт до мембовки птисгевтавцА: | 11 111 ща : й омани коуч ши ми о пий зи шини не шини нн и В ЗЕ НН їі немає впливу на зв'язування антитіла от ост.
НА ! Бі НИ НЕ ! 4 ї Н і й пон нн ши и ши и и и а рі зв'язуванню знтитіпе стетднн ява 11 ї Я ЩЕ ж ШИ МНЕ ШЕ і р борияє зв'язуванню знтитійа кор м ши ме ши маш Шк ши и нини шИ | суттєво для зв'язування вититіла Ячг 24 нн нин нен ЦІ І ЩЕ МОДУ рент ВОК І ДИ НИ ИН НН ИН збо їв Ко З НО ПЕРО БООБЕРЕБУКВОДОМАТІСКАНУВКТОСПМНКУКОВНОВНЬКИ БЦЕНРУНОСІУМОКЕКОКАТЬТ КОВО ТАХМЕВЬБУТ В ЗОНА Ж УМООБЕСРЕУКРОВЕМКІ СКАЛИ СКІСУ ННМІ ЯВНО УМОВ ЕКОКАТЬТЗОВЕЗІТа УВЕСЬ З ВА (ОБУМОВ БУКРВАВНКЕДСКАТОУСЕО КТ МВКУ ОВНС НЬЕІЦІКРЕНЕ І УМОКЕКОоКАТьІчВА ВАМ ВЕ ФО НА С) БТОБОСБАРЕБУХВОВМЕТОСКАТНЕІЕТСТКТОМКУКОКНОКВЬКК ТИЦІ КИМ ВОКРКОКАТЬТ УКВ АМЕБЬЕТВЕ СаО БУТ КВСРВЬУК ОА ИКІ ВСАА ТТ МИКУКОЗНО НЕНСІ ВВІВ ЕКО СКАТЬІ ОКО ІАТНЕКЬТХ плн хх в плжтт АНТ КВЧ не З спенннюієтнюннотюю т тт т тт тонн ння ятяттятя тт я п пЖя тт яятя тя ТАТА Ж ЕТ АААААААААТ ЮА ААААААНА весно ій НЕК Шон І.
Не (Ж рат АОС УУМО МО тТЬТУЕ НОЯА С ЕЗАУХ КВАСУ УЬОНИСОвІТЬУВУ НЕЛА (ЯН ПУАХКУВРоКОТЬМИОСТТЬТУ ВЕ НА С ОІАХЕ КВТ СТУКИ ВО Сом СИ ПЗАУК КОВО Фіг 25 он сок пуннучончнннлннкнньнї З ОВ пнюкчняяя СЕНД ЗВО Жх Я ВІ ВН ДЕ Ко; до Бо 3о йо. дудуцітанватмив они сн мо и тА и ОІКХш І у ВУ БО ПРОТТЬТООРАТКВАЄВЕЕКУТІ ТКАЧ НЬНКК КРОКВ БСУРАНКОСООВОІЯ ЕК ТОВМЕАВОАА ТОЮ З МА ПІФЕЖЬТОСРАТМНОАХРОБКМУІ ТВА ВУ.
ЕУМЕНРОДКРІТОРКВІ МОТО ЬАЖОУРАКР ВОВИХ ХЕУААКОААТ У О ЗР БА ПІІ УМТОВОІМЕУВВСЕКИТІТСВАКЕВУВ ТИНУ ООКРОТЕРЕЬКІ ТОН ЬАІКУВАНВОКО ВИТЬ «НУААЕВААТІ КОВО МОВА ПІФОТУЬТОХРАТМНЕАРОЕКУТ КОСТА ВУМЧЕКРЛВКВОТ КІВ ІЯ МЕАЖОТРАВРБСВОВИТВТВЬТІВАНЕВКОВЕТУ ТВО Сопеиже 1БОТУБТОЗУАТМЕЛЕРОЖКУТІТС КАВУН ООКОТЗРКМІ ІННА ХСУРАВЕВСОБСТВІЬТІВНКАКВАВТ МИ пиття ісопва Й ие нн ВН Кп гЙ човен «ка он ПИ МІВ ВИНИ ЗІТВея ЦСК ЦЕТК ЦА ЗИ КРК Ов КЬВЕ БА ПЮНЯВНУ КРЮБІВССТКЬЕІК ЦЮ (ОНЕНМТРРЕТеСоСІКОВІК суяженне СВОЯ СВВНКСВсТЕЬКІК фік 25
UAA201207057A 2009-11-11 2010-11-11 Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6) UA117799C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26020209P 2009-11-11 2009-11-11
EP09014136A EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2009-11-11 Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
US36161810P 2010-07-06 2010-07-06
EP10006956 2010-07-06
PCT/EP2010/006888 WO2011057788A1 (en) 2009-11-11 2010-11-11 Antibodies specific for claudin 6 (cldn6)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA117799C2 true UA117799C2 (uk) 2018-10-10

Family

ID=43480734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201207057A UA117799C2 (uk) 2009-11-11 2010-11-11 Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6)

Country Status (29)

Country Link
US (5) US9487584B2 (uk)
EP (3) EP2499161B8 (uk)
JP (3) JP5889196B2 (uk)
KR (4) KR102317098B1 (uk)
CN (4) CN106432500B (uk)
AU (3) AU2010318316B2 (uk)
BR (1) BR112012011143B1 (uk)
CA (2) CA2775373C (uk)
CY (2) CY1120300T1 (uk)
DK (2) DK3305813T3 (uk)
ES (2) ES2649389T3 (uk)
HK (1) HK1253300A1 (uk)
HR (2) HRP20171749T1 (uk)
HU (2) HUE049404T2 (uk)
IL (2) IL218628B (uk)
LT (2) LT2499161T (uk)
ME (1) ME02943B (uk)
MX (2) MX347150B (uk)
NO (1) NO2499161T3 (uk)
NZ (2) NZ734307A (uk)
PL (2) PL3305813T3 (uk)
PT (2) PT2499161T (uk)
RS (2) RS60168B1 (uk)
RU (1) RU2675997C2 (uk)
SG (2) SG10201500975YA (uk)
SI (2) SI2499161T1 (uk)
UA (1) UA117799C2 (uk)
WO (1) WO2011057788A1 (uk)
ZA (1) ZA201202418B (uk)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6358588A (ja) * 1986-08-29 1988-03-14 Toshiba Corp バ−コ−ド読取装置
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
LT2398902T (lt) 2009-02-20 2023-12-27 Astellas Pharma Inc. Vėžio diagnostikos ir gydymo būdai bei kompozicijos
LT2499161T (lt) 2009-11-11 2017-11-27 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Specifiniai antikūnai, skirti klaudinui 6 (cldn6)
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
LT3026064T (lt) * 2011-05-13 2019-01-25 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Antikūnai, skirti vėžio gydymui, ekspresuojantys klaudiną 6
SG10201911551RA (en) * 2011-05-13 2020-02-27 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
CN103320381B (zh) * 2012-03-23 2015-04-15 上海市儿童医院 一种多能干细胞表面标志物及其用途
MY181648A (en) 2012-08-24 2020-12-30 Univ California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
BR122020024124B1 (pt) * 2012-11-13 2024-01-30 Biontech Ag Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina
MX369276B (es) * 2012-11-13 2019-11-04 Biontech Ag Agentes para tratamiento de enfermedades cancerosas que expresan claudina.
EP3747465A1 (en) * 2013-07-31 2020-12-09 BioNTech AG Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2015014376A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
CN105813650A (zh) * 2013-11-06 2016-07-27 施特姆森特克斯股份有限公司 新型抗-密蛋白抗体和使用方法
CN113307873A (zh) 2013-11-11 2021-08-27 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
AU2015239683B2 (en) * 2014-04-01 2019-08-22 Astellas Pharma Inc. Claudin-6-Specific immunoreceptors and T cell epitopes
MA40921A (fr) * 2014-11-05 2017-09-12 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-cldn et procédés d'utilisation
TWI831044B (zh) 2014-11-11 2024-02-01 日商中外製藥股份有限公司 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法
CA3029003A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
JP6900051B2 (ja) * 2016-12-07 2021-07-07 国立大学法人大阪大学 Ｃｌａｕｄｉｎ ５抗体、及びその抗体を含有する医薬
CN110612310B (zh) 2017-05-08 2023-06-27 国立大学法人大阪大学 抗cldn-5抗体及含有该抗体的药物
WO2019048040A1 (en) * 2017-09-06 2019-03-14 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh ANTIBODIES USEFUL IN THE DIAGNOSIS OF CANCER
CN116999573A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体－药物偶联物及其制造方法、药物组合物及其在制备***的药物中的应用
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
EP3735463A4 (en) * 2018-01-05 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha THERAPEUTIC AGENT INDUCING CYTOTOXICITY
WO2020075325A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 公立大学法人福島県立医科大学 子宮体癌患者の予後予測バイオマーカー
KR20210128443A (ko) 2019-02-15 2021-10-26 인테그럴 몰큘러 인코포레이티드 클라우딘 6 항체 및 이의 용도
KR20210143237A (ko) 2019-03-25 2021-11-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
BR112021023173A2 (pt) * 2019-07-10 2022-01-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de ligação à claudin-6 e usos das mesmas
CN111087465B (zh) * 2019-12-24 2020-12-08 广州医科大学 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用
IL296478A (en) 2020-03-31 2022-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Claudin-6-targeted multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US20240150455A1 (en) * 2021-03-05 2024-05-09 Shanghai GenBase Biotechnology Co., Ltd. Anti-cldn6 antibody and use thereof
CA3212665A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
WO2023053282A1 (ja) 2021-09-29 2023-04-06 中外製薬株式会社 がんの治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
WO2024022512A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Claudin-6 binding moieties and uses thereof
CN116064622B (zh) * 2023-02-13 2023-10-13 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 Claudin6-mCherry报告基因CHO-K1稳转细胞株制备及应用

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5830755A (en) 1995-03-27 1998-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services T-cell receptors and their use in therapeutic and diagnostic methods
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO2002008284A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5928631A (en) 1997-06-09 1999-07-27 The Procter & Gamble Company Methods for controlling environmental odors on the body using compositions comprising uncomplexed cyclodextrins
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US5932445A (en) 1997-11-07 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Signal peptide-containing proteins
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
JP2003524384A (ja) * 1998-11-03 2003-08-19 アドヘレックス テクノロジーズ インコーポレイテッド クラウディン媒介機能を調節するための化合物および方法
JP2002532083A (ja) 1998-12-17 2002-10-02 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ４７個のヒト分泌タンパク質
AU3479700A (en) 1999-02-22 2000-09-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Genes associated with diseases of the colon
CA2373915A1 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
AU2883700A (en) 1999-06-23 2001-01-09 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1514933A1 (en) 1999-07-08 2005-03-16 Research Association for Biotechnology Secretory protein or membrane protein
WO2001003734A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 Genentech, Inc. Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
WO2001053312A1 (en) 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2001236470A1 (en) 2000-01-14 2001-07-24 Corixa Corporation Ovarian tumor-associated sequences
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1309620A2 (en) 2000-06-23 2003-05-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
CA2416456A1 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2634294A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002102854A2 (en) * 2001-06-20 2002-12-27 Morphosys Ag Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
CA2633171C (en) 2001-06-20 2012-11-20 Genentech, Inc. Antibodies against tumor-associated antigenic target (tat) polypeptides
CA2379661A1 (en) * 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
KR20040101502A (ko) 2002-04-16 2004-12-02 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료 방법 및 이를 위한 조성물
US20070224201A1 (en) 2002-10-02 2007-09-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2330130B1 (en) 2002-10-17 2014-08-27 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
EP1578996A4 (en) 2002-10-18 2007-12-19 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING AND TREATING TUMORS
AT500651B9 (de) 2003-05-27 2010-04-15 Altropus Gmbh Aktiv immunisierender antikörper
JP2007516693A (ja) 2003-06-09 2007-06-28 ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミシガン 癌の治療および診断のための組成物および方法
WO2006033664A1 (en) 2004-03-08 2006-03-30 Avalon Pharmaceuticals Determining cancer-linked genes and therapeutic targets using molecular cytogenetic methods
US7431927B2 (en) * 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
ITRM20050297A1 (it) * 2005-06-08 2006-12-09 Univ Siena Anticorpi diretti contro la proteina basica della mielina che riconoscono un epitopo del cd64 e uso di essi come immunodepressivi.
AU2006283532B2 (en) 2005-08-19 2012-04-26 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
US8450464B2 (en) * 2006-10-02 2013-05-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies that bind CXCR4
US8129502B2 (en) * 2006-11-13 2012-03-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cancerous disease modifying antibodies
WO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2008-09-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-4抗体
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
WO2009025759A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Tight junction proteins associated with infection and entry of hepatitis c virus (hcv), methods and uses thereof
WO2009028663A1 (ja) 2007-08-30 2009-03-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-3抗体
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
CN101918450A (zh) * 2008-01-11 2010-12-15 国立大学法人东京大学 抗cldn6抗体
EP2285392A4 (en) 2008-04-11 2012-06-06 Bionovo Inc PROCEDURE AGAINST CANCER WITH EXTRACTS FROM GLEDITSIA SINENSIS LAM
EP2352764B1 (en) 2008-10-14 2018-03-28 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES TARGETING HUMAN CD4 and CXCR4, CCR5, TLR4, ALPHAV INTEGRIN, BETA3-INTEGRIN,BETA1-INTEGRIN, HUMAN ALPHA2-INTEGRIN, CD81, SR-BI, CLAUDIN-1, CLAUDIN-6 AND/OR CLAUDIN-9, RESPECTIVELY, AND NEUTRALIZING VIRAL ENTRY
DE102009026966A1 (de) 2008-12-18 2010-07-01 Robert Bosch Gmbh Betrieb eines Bremskraftverstärkers als Pedalsimulator
LT2398902T (lt) 2009-02-20 2023-12-27 Astellas Pharma Inc. Vėžio diagnostikos ir gydymo būdai bei kompozicijos
EP2221063A1 (en) 2009-02-20 2010-08-25 Ganymed Pharmaceuticals AG Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
LT2499161T (lt) * 2009-11-11 2017-11-27 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Specifiniai antikūnai, skirti klaudinui 6 (cldn6)
EP2322555A1 (en) 2009-11-11 2011-05-18 Ganymed Pharmaceuticals AG Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6)
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
LT3026064T (lt) 2011-05-13 2019-01-25 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Antikūnai, skirti vėžio gydymui, ekspresuojantys klaudiną 6
EP2605017A1 (de) 2011-12-16 2013-06-19 Protagen AG Markersequenzen für gynäkologisches Malignom und deren Verwendung
AU2013292510A1 (en) 2012-07-19 2015-02-05 Amgen Inc. Human BTNL3 proteins, nucleic acids, and antibodies and uses thereof
MX369276B (es) * 2012-11-13 2019-11-04 Biontech Ag Agentes para tratamiento de enfermedades cancerosas que expresan claudina.
AU2015239683B2 (en) * 2014-04-01 2019-08-22 Astellas Pharma Inc. Claudin-6-Specific immunoreceptors and T cell epitopes

Also Published As

Publication number Publication date
US20240092896A1 (en) 2024-03-21
LT2499161T (lt) 2017-11-27
US10745477B2 (en) 2020-08-18
ME02943B (me) 2018-10-20
CA2775373C (en) 2019-10-29
HRP20171749T1 (hr) 2018-01-26
HK1253300A1 (zh) 2019-06-14
HUE049404T2 (hu) 2020-09-28
MX2020011790A (es) 2020-11-24
DK3305813T3 (da) 2020-04-20
AU2018201640B2 (en) 2020-04-30
RU2012123995A (ru) 2013-12-20
US9932401B2 (en) 2018-04-03
NZ734307A (en) 2020-05-29
KR20210130250A (ko) 2021-10-29
CN106432500A (zh) 2017-02-22
CN102741289B (zh) 2016-08-03
US20200339677A1 (en) 2020-10-29
US20180162938A1 (en) 2018-06-14
WO2011057788A1 (en) 2011-05-19
IL218628A0 (en) 2012-05-31
ES2649389T3 (es) 2018-01-11
IL218628B (en) 2018-12-31
SG10202110692WA (en) 2021-12-30
EP3305813B1 (en) 2020-01-15
BR112012011143B1 (pt) 2020-05-19
ES2784483T3 (es) 2020-09-28
CN105348389A (zh) 2016-02-24
CY1123192T1 (el) 2021-10-29
CN106432500B (zh) 2020-06-02
CN111875703A (zh) 2020-11-03
AU2010318316A1 (en) 2012-04-26
KR20190031335A (ko) 2019-03-25
HUE035516T2 (en) 2018-05-28
PL3305813T3 (pl) 2021-04-19
CN105348389B (zh) 2019-12-20
DK2499161T3 (da) 2017-11-27
KR20120115226A (ko) 2012-10-17
US11858988B2 (en) 2024-01-02
EP3689911A1 (en) 2020-08-05
MX347150B (es) 2017-04-17
AU2018201640A1 (en) 2018-04-05
KR101960509B1 (ko) 2019-03-20
EP2499161B8 (en) 2017-10-25
JP5889196B2 (ja) 2016-03-22
CA3050655A1 (en) 2011-05-19
JP2016047845A (ja) 2016-04-07
JP2013510808A (ja) 2013-03-28
RS60168B1 (sr) 2020-05-29
RU2675997C2 (ru) 2018-12-25
JP2017140041A (ja) 2017-08-17
SI3305813T1 (sl) 2020-07-31
KR102317098B1 (ko) 2021-10-25
US9487584B2 (en) 2016-11-08
KR20200075903A (ko) 2020-06-26
US20160222125A1 (en) 2016-08-04
ZA201202418B (en) 2013-06-26
PT2499161T (pt) 2017-12-05
HRP20200591T1 (hr) 2020-07-10
EP2499161A1 (en) 2012-09-19
CN102741289A (zh) 2012-10-17
SI2499161T1 (sl) 2017-12-29
AU2016202235B2 (en) 2017-12-07
CY1120300T1 (el) 2019-07-10
KR102126964B1 (ko) 2020-06-25
US20120308478A1 (en) 2012-12-06
AU2010318316B2 (en) 2016-01-14
LT3305813T (lt) 2020-05-11
NO2499161T3 (uk) 2018-02-03
PT3305813T (pt) 2020-04-22
IL246710A0 (en) 2016-08-31
NZ716587A (en) 2017-10-27
MX2012005444A (es) 2012-06-19
JP6125604B2 (ja) 2017-05-10
JP6502992B2 (ja) 2019-04-17
PL2499161T3 (pl) 2018-03-30
IL246710B (en) 2020-05-31
RS56502B1 (sr) 2018-02-28
SG10201500975YA (en) 2015-04-29
EP3305813A1 (en) 2018-04-11
EP2499161B1 (en) 2017-09-06
CA2775373A1 (en) 2011-05-19
BR112012011143A2 (pt) 2016-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA117799C2 (uk) Моноклональне антитіло, специфічне до клаудину 6 (cldn6)
US11859008B2 (en) Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
JP6748282B2 (ja) 癌の治療のための抗体
RU2816850C2 (ru) Антитела для лечения раковых заболеваний, при которых экспрессируется клаудин 6