BR122020024124B1 - Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina - Google Patents

Agentes para tratamento de doenças cancerosas expressando claudina Download PDF

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Özlem Türeci
Christiane Stadler
Julia Holland
Hayat Bähr-Mahmud
Tim Beissert
Laura Plum
Fabrice Le Gall
Arne Jendretzki
Markus Fiedler
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Abstract

a presente invenção fornece agentes de ligação que contêm um domínio de ligação que é específico para cd3 permitindo ligação a células t e um domínio de ligação que é específico para uma molécula de claudina associada a tumor e métodos de uso destes agentes de ligação ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos para tratamento de câncer.

Description

[0001] Dividido do pedido de patente BR 11 2015 010740 0 depositado em 12/11/2013”.
[0002] Claudinas são proteínas integrais à membrana localizadas dentro das junções herméticas de epitélios e endotélios. Considera-se que as claudinas têm quatro segmentos transmembrana com duas alças extracelulares e Ne C-términos localizados no citoplasma. A família claudina (CLDN) de proteínas transmembrana desempenha um papel crítico na manutenção de junções herméticas epiteliais e endoteliais e pode também desempenhar um papel na manutenção do citoesqueleto e em sinalização celular.
[0003] A molécula claudina 18 (CLDN18) é uma proteína transmembrana integral (tetraspanina) tendo quatro regiões hidrofóbicas que abrangem a membrana e duas alças extracelulares (alça1, abrangida pela região hidrofóbica 1 e região hidrofóbica 2; alça2, abrangida pelas regiões hidrofóbicas 3 e 4). A CLDN18 existe em duas variantes de splicing diferentes, as quais são descritas em camundongo e em seres humanos (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001). As variantes de splicing (número de acesso Genbank: variante de splicing 1 (CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, e variante de splicing 2 (CLDN18.2): NM_001002026, NP_001002026) têm um peso molecular de aproximadamente 27,9/27,72 kD. As variantes de splicing CLDN18.1 e CLDN18.2 diferem quanto à porção N-terminal, a qual compreende a primeira região transmembrana (TM) e alça1, enquanto que a sequência primária de proteínas do C-término é idêntica.
[0004] Em tecidos normais, não há expressão detectável de CLDN18.2, com exceção do estômago, onde CLDN18.2 é exclusivamente expressa em células epiteliais gástricas diferenciadas de vida curta. CLDN18.2 é mantida no curso de transformação maligna e, assim, frequentemente aparece sobre a superfície de células humanas de câncer gástrico. Além disso, este antígeno pan-tumoral é ectopicamente ativado em níveis significativos em adenocarcinoma esofageal, pancreático e pulmonar. A proteína CLDN18.2 também está localizada em metástases de nódulos linfáticos de adenocarcinomas gástricos e em metástases distantes, especialmente para o ovário (os assim denominados tumores de Krukenberg).
[0005] CLDN6 é expressa em uma série de diferentes células cancerosas humanas, enquanto que expressão em tecidos normais está limitada à placenta.
[0006] A expressão diferencial de claudinas, tais como CLDN18.2 e CLDN6, entre câncer e células normais, sua localização na membrana e sua ausência da grande maioria dos tecidos normais relevantes para toxicidade torna estas moléculas alvos atraentes para imunoterapia de câncer e o uso de produtos terapêuticos com base em anticorpos para objetivação de claudinas em terapia de câncer promete um nível elevado de especificidade terapêutica.
[0007] Abordagens que usam o potencial de células T para o tratamento de câncer incluem vacinação com proteínas derivadas de tumor, RNA ou antígeno peptídico, infusão de células T derivadas de tumor expandidas ex vivo (a assim denominada transferência adotiva), transferência de gene do receptor de células T ou acoplamento direto de células T por anticorpos bi- ou triespecíficos. Da mesma forma, muitos estimulantes de respostas de células T são clinicamente testados em combinação ou como monoterapia, tais como ligantes para receptores de tipo Toll, anticorpos que bloqueiam CTLA-4 sobre células T, citocinas estimuladoras imunes ou anticorpos que neutralizam moléculas envolvidas em evasão imune de células cancerosas, tais como TGF-beta ou B7-H1. O intenso desenvolvimento de terapias com base em células T é motivado pela observação de que os pacientes parecem viver significativamente mais se seus tumores estão infiltrados por células T. Além disso, inúmeros modelos com camundongos têm mostrado que o envolvimento de células T através de vários meios pode erradicar até mesmo grandes tumores e uma série de terapias com células T recentemente fizeram progresso significativo no tratamento de várias indicações cancerosas.
[0008] Um objetivo da invenção é proporcionar novos agentes e métodos para a terapia de doenças cancerosas.
[0009] A solução do problema subjacente à invenção se baseia no conceito de geração de um agente de ligação que contém um domínio de ligação que é específica para uma molécula de claudina associado a tumor, isto é, células cancerosas. O outro domínio de ligação é específico para CD3, permitindo ligação às células T, e permite puxar as células T para o complexo, assim, tornando possível objetivar o efeito citotóxico das células T para as células cancerosas. A formação deste complexo pode induzir à sinalização de células T citotóxicas, quer em si ou em combinação com células acessórias, o que leva à liberação de mediadores citotóxicos.
[0010] A presente invenção reporta, pela primeira vez, que agentes de ligação que em que a claudina e CD3 são alvos podem induzir à lise mediada por células T potente e são eficazes no tratamento de doenças tumorais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Em um aspecto, a invenção se refere a um agente de ligação que compreende pelo menos dois domínios de ligação, em que um primeiro domínio de ligação se liga à claudina e um segundo domínio de ligação se liga à CD3. O agente de ligação da invenção pode se ligar a uma célula citotóxica (por meio de acoplamento ao receptor de CD3) e uma célula cancerosa que expressa CLDN a ser destruída como um alvo.
[0012] Em uma concretização, o agente de ligação é uma molécula biespecífica, tal como um anticorpo biespecífico, em particular um anticorpo biespecífico com uma única cadeia. Em uma concretização, a dita claudina é expressa em uma célula cancerosa. Em uma concretização, a dita claudina é expressa sobre a superfície de uma célula cancerosa. Em uma concretização, a dita claudina é selecionada do grupo que consiste em claudina 18.2 e claudina 6. Em uma concretização, o dito primeiro domínio de ligação se liga a um domínio extracelular da dita claudina. Em uma concretização, o dito primeiro domínio de ligação se liga a epítopos nativos de CLDN presentes sobre a superfície de células vivas. Em uma concretização, o dito primeiro domínio de ligação se liga à primeira alça extracelular de CLDN. Em uma concretização, o dito segundo domínio de ligação se liga à cadeia épsilon de CD3. Em uma concretização, a dita CD3 é expressa sobre a superfície de uma célula T. Em uma concretização, ligação do dito agente de ligação à CD3 sobre células T resulta em proliferação e/ou ativação das ditas células T, em que as ditas células T ativadas, de preferência, liberam fatores citotóxicos, por exemplo, perforinas e granzimas, e iniciam citólise e apoptose de células cancerosas. Em uma concretização, a dita ligação à claudina e/ou a dita ligação à CD3 é uma ligação específica.
[0013] Em uma concretização, o agente de ligação está no formato de um anticorpo de comprimento total ou um fragmento de anticorpo. Em uma concretização, o agente de ligação compreende quatro domínios variáveis de anticorpo com pelo menos dois domínios de ligação, em que pelo menos um domínio de ligação se liga à claudina e pelo menos um domínio de ligação se liga à CD3. Em uma concretização, o agente de ligação compreende um domínio variável de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina (VH) com uma especificidade por um antígeno claudina (VH(CLDN)), um domínio variável de uma cadeia leve de uma imunoglobulina (VL) com uma especificidade por um antígeno claudina (VL(CLDN)), um domínio variável de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina (VH) com uma especificidade por CD3 (VH(CD3)) e um domínio variável de uma cadeia leve de uma imunoglobulina (VL) com uma especificidade por CD3 (VL(CD3)).
[0014] Em uma concretização, o agente de ligação está no formato de um diacorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada conectado a um domínio variável da cadeia leve sobre a mesma cadeia polipeptídica, de modo que os dois domínios não emparelham. Em uma concretização, o diacorpo compreende duas cadeias polipeptídicas, em que um polipeptídeo compreende VH(CLDN) e VL(CD3) e a outra cadeia polipeptídica compreende VH(CD3) e VL(CLDN).
[0015] Em uma concretização, o agente de ligação está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que consiste em duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondente são arranjadas, de preferência, do N- término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)- VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)—VL(CD3)—VH(CLDN)—VL(CLDN) ou VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN). Em uma concretização, as ditas regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão ligadas através de um ligante peptídico longo, de preferência, um ligante peptídico que compreende as sequências de aminoácidos (GGGGS)3 ou VE(GGGGS)2GGVD. Em uma concretização, as ditas duas unidades VH-VL ou VL-VH de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico curto, de preferência um ligante peptídico compreendendo a sequência de aminoácidos SGGGGS ou GGGGS.
[0016] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN18.2 e o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0017] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN18.2 e o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0018] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN6 e o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0019] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN6 e o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 97, 98, 99 ou 100 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0020] Em uma concretização, o dito VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36, 94 ou 95 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou 96 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0021] Em uma concretização, o dito VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO : 37 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0022] Em uma concretização, o dito VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0023] Em um aspecto, o agente de ligação da invenção está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que compreende duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondente estão arranjadas, do N- término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)- VH(CD3)-VL(CD3). Em uma concretização, os ditos VH(CD3) e VL(CD3) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)4. Em uma concretização, os ditos VH(CLDN) e VL(CLDN) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)4. Em uma concretização, as ditas duas unidades VH- VL de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS. Uma ou ambas das ditas duas unidades VH-VL de scFv podem compreender uma ou mais pontes de dissulfeto na interface.
[0024] Em um aspecto, o agente de ligação da invenção está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que compreende duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão arranjadas, do N- término para o C-término, na ordem VL(CLDN)-VH(CLDN)- VH(CD3)-VL(CD3). Em uma concretização, os ditos VH(CD3) e VL(CD3) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)4. Em uma concretização, os ditos VL(CLDN) e VH(CLDN) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 20 a 25, de preferência 20 ou 25 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)5. Em uma concretização, as ditas unidades VL-VH e VL-VH de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS. Uma ou ambas das ditas duas unidades VL-VH ou VH-VL de scFv podem compreender uma ou mais pontes de dissulfeto na interface.
[0025] Em um aspecto, o agente de ligação da invenção está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que compreende duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão arranjadas, do N- término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)- VL(CD3)-VH(CD3). De preferência, as ditas unidades VL(CD3) e VH(CD3) de scFv compreendem uma ou mais pontes de dissulfeto na interface. Em uma concretização, os ditos VL(CD3) e VH(CD3) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 20 a 25, de preferência 20 ou 25 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)5. Em uma concretização, os ditos VH(CLDN) e VL(CLDN) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)4. Em uma concretização, ditas unidades VH-VL e VL- VH de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS. As ditas unidades VH(CLDN)-VL(CLDN) de scFv podem compreender uma ou mais pontes de dissulfeto na interface.
[0026] Em um aspecto, o agente de ligação da invenção está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que compreende duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão arranjadas, do N- término para o C-término, na ordem VL(CLDN)-VH(CLDN)- VL(CD3)-VH(CD3). De preferência, as ditas unidades VL(CD3) e VH(CD3) de scFv compreendem uma ou mais pontes de dissulfeto na interface. Em uma concretização, os ditos VL(CD3) e VH(CD3) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 20 a 25, de preferência 20 ou 25 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)5. Em uma concretização, os ditos VL(CLDN) e VH(CLDN) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 20 a 25, de preferência 20 ou 25 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)5. Em uma concretização, as ditas duas unidades VL- VH de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS. As ditas unidades VH(CLDN)-VL(CLDN) de scFv podem compreender uma ou mais pontes de dissulfeto na interface.
[0027] Em uma concretização de qualquer um dos aspectos acima, a dita CLDN é CLDN18.2. De preferência, o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento. Alternativamente, o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento. Em uma concretização, o dito VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO : 96 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0028] Em um aspecto, o agente de ligação da invenção está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que compreende duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante, em que as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão arranjadas, do N- término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)- VH(CD3)-VL(CD3) ou na ordem VH(CD3)—VL(CD3)—VH(CLDN)— VL(CLDN). Em uma concretização, os ditos VH(CLDN) e VL(CLDN) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos (GGGGS)3. Em uma concretização, os ditos VH(CD3) e VL(CD3) estão ligados através de um ligante peptídico que consiste em 15 a 20, de preferência 15 ou 20 aminoácidos, de preferência glicina e/ou serina e, de preferência, estão ligados através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos GGGGS(GGS)3GGGS. Em uma concretização, as ditas duas unidades VH-VL de scFv estão ligadas através de um ligante peptídico que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS.
[0029] Em uma concretização do aspecto acima, a dita CLDN é CLDN6. De preferência, o dito VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento. De preferência, o dito VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 98, 99 ou 100 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento. Mais preferencialmente, o dito VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento. Em uma concretização, o dito VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento e o VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma ou uma variante da dita sequência de aminoácidos ou fragmento.
[0030] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN18.2 e o dito agente de ligação da invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 38, 39, 40 e 41 ou um fragmento ou variante das mesmas.
[0031] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN18.2 e o dito agente de ligação da invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 e 93 ou um fragmento ou variante das mesmas. Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN18.2 e o dito agente de ligação compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 e 93 ou um fragmento ou variante das mesmas, em que a dita sequência de aminoácidos carece de sinais de secreção, tais como sinais de secreção N-terminal, em particular a sequência de acordo com SEQ ID NO: 51, e/ou carece de marcadores de histidina, tais como marcadores de histidina C-terminais, em particular a sequência Gly-Gly-Ser-(His)6 ou (His)6, se presente.
[0032] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN6 e o dito agente de ligação da invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42, 43, 44 e 45 ou um fragmento ou variante das mesmas.
[0033] Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN6 e o dito agente de ligação da invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 e 65 ou um fragmento ou variante das mesmas . Em uma concretização, a dita CLDN é CLDN6 e o dito agente de ligação compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 e 65 ou um fragmento ou variante das mesmas, em que a dita sequência de aminoácidos carece de sinais de secreção, tais como sinais de secreção N-terminal, em particular a sequência de acordo com SEQ ID NO: 51, e/ou carece de marcadores de histidina, tais como marcadores de histidina C-terminais, em particular a sequência Gly-Gly-Ser-(His)6 ou (His)6, se presente.
[0034] Em uma concretização, as ditas células cancerosas que expressam CLDN18.2 são células cancerosas de um câncer selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), câncer de mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço, câncer da vesícula biliar e a metástase do mesmo, um tumor de Krukenberg, metástase peritoneal e/ou metástase para nódulo linfático.
[0035] Em uma concretização, as ditas células cancerosas que expressam CLDN6 são células cancerosas de um câncer selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga urinária, câncer ovariano, em particular adenocarcinoma ovariano e teratocarcinoma ovariano, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de pequenas células (Small Cell Lung Cancer - SCLC) e câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), em particular carcinoma e adenocarcinoma de pulmão de células escamosas, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma maligno pleomórfico, sarcoma, em particular sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer de bexiga urinária, em particular carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células renais claras e carcinoma de células renais papilares, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumores de células germinais, tal como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular tumores de células germinativas do testículo e as formas metastáticas dos mesmos.
[0036] Em uma concretização, o agente de ligação tem um sinal de secreção N-terminal e/ou um marcador de epítopo de histidina C-terminal, de preferência um marcador de epítopo de seis histidinas.
[0037] Em um aspecto, a invenção se refere a um ácido nucleico recombinante que codifica um agente de ligação da invenção. Em uma concretização, o ácido nucleico recombinante está na forma de um vetor. Em uma concretização, o ácido nucleico recombinante é RNA.
[0038] Em um aspecto, a invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico recombinante da invenção.
[0039] Em um aspecto, a invenção se refere ao agente de ligação da invenção, ao ácido nucleico recombinante da invenção ou à célula hospedeira da invenção para uso em terapia, em particular para uso no tratamento ou prevenção de câncer.
[0040] Em um aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende o agente de ligação da invenção, o ácido nucleico recombinante da invenção ou a célula hospedeira da invenção.
[0041] Em um aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença cancerosa compreendendo administração, a um paciente, da composição farmacêutica da invenção.
[0042] Em uma concretização, células que o dito câncer expressam uma claudina à qual o dito agente de ligação é capaz de se ligar.
[0043] Em uma concretização, a dita claudina é CLDN18.2 e o dito câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), câncer de mama, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço, câncer da vesícula biliar e a metástase do mesmo, um tumor de Krukenberg, metástase peritoneal e/ou metástase para nódulo linfático.
[0044] Em uma concretização, a dita claudina é CLDN6 e o dito câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga urinária, câncer ovariano, em particular adenocarcinoma ovariano e teratocarcinoma ovariano, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de pequenas células (Small Cell Lung Cancer - SCLC) e câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), em particular carcinoma e adenocarcinoma de pulmão de células escamosas, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma maligno pleomórfico, sarcoma, em particular sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer de bexiga urinária, em particular carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células renais claras e carcinoma de células renais papilares, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumores de células germinais, tal como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular tumores de células germinativas do testículo e as formas metastáticas dos mesmos.
[0045] Em um aspecto, a invenção fornece um agente de ligação ou ácido nucleico que codifica o mesmo ou uma célula hospedeira conforme descrito aqui para uso nos métodos de tratamento descritos aqui. Em uma concretização, a invenção fornece uma composição farmacêutica conforme descrito aqui para uso nos métodos de tratamento descritos aqui.
[0046] De acordo com a invenção, a CLDN18.2 tem, de preferência, a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1 e a CLDN6 tem, de preferência, a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 ou 3.
[0047] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0048] FIGURA 1. Esquema modular que ilustra a construção de proteínas bi-scFv recombinantes com alvo em TAA CLDN18.2.
[0049] A construção dos bi-scFvs nas posições (A) N-terminal e (B) C-terminal sobre as regiões variáveis do anticorpo anti-TAA. Regiões VH e VL do anticorpo anti- CLDN18.2 são geradas a partir da sequência de um anticorpo monoclonal à CLDN18.2 (mCLDN18.2ab). Anti-CD3 significa, de forma abrangente, as regiões VH e VL geradas a partir das sequências de seguintes anticorpos monoclonais à CD3: UCHT1-HU (mAb humanizado), UCHT1, CLB-T3, TR66, 145-2C11. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; His, marcador de hexa-histidila; HU, humanizado; LL, ligante longo (15-18 aminoácidos); Sec, sinal de secreção; SL, ligante curto (5-6 aminoácidos); AT, antígeno associado a tumor; V, região variável de cadeia pesada (H) e de cadeia leve (L) do anticorpo.
[0050] FIGURA 2. Efeito da orientação de domínio e seleção de anti-CD3-scFv-sobre a lise específica de células alvo: bi-scFvs 1BiMAB 5'-mCLDN18.2ab VH-VL TR66 VH-VL-3' e no.15 são as variantes mais potentes.
[0051] Diversas variantes bi-scFv dirigidas contra CLDN18.2 e CD3 foram transitoriamente expressas em células HEK293T e purificadas em pequena escala com colunas de Ni- NTA para a comparação de sua potência em um ensaio citotóxico. Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2, as quais expressam estavelmente luciferase, foram tomadas como células alvo. Células T humanas e células alvo foram incubadas em uma proporção E:T de 5:1 com 5 ng/mL de cada proteína bi-scFv em um formato de 96 cavidades. Como controles negativos, no.35 que objetiva um TAA não expresso, no.11 e no.16 - ambos objetivam células T de murino, mas não células T humanas - foram tomadas. Cada amostra de teste foi colocada em placas seis vezes, a amostra de controle para Lmin foi colocada em placas nove vezes. Os tempos de co-incubação antes de análise foram 8h, 16h e 24h. Após a adição de solução de luciferina nos pontos de tempo indicados, a luminescência foi medida em um leitor Infinite M200 TECAN. Lise específica de células alvo foi calculada pela normalização das amostras com bi-scFv de controle no.35 (Lmin). As proteínas bi-scFv mais potentes - 1BiMAB e no.15 - compartilham a orientação de domínio e a origem anti-CD3 do mAb TR66, mas diferem quanto à sua otimização de códons (HS e CHO, respectivamente) e as sequências ligantes longas. CHO indica Ovário de Hâmster Chinês; mAb, anticorpo monoclonal; HU, humanizado; AT, antígeno associado a tumor.
[0052] FIGURA 3. Análise de gel Coomassie e Western blot da proteína 1BiMAB bi-scFv.
[0053] O sobrenadante sem FCS de células HEK293 monoclonais que expressam estavelmente 1BiMAB foi purificado através de cromatografia de afinidade Ni-NTA (IMAC). Alíquotas de diferentes etapas de purificação foram carregadas em géis de Bis-Tris a 4-12%. (A) Coloração com Coomassie do sobrenadante de células, fluxo passante e oito frações do eluato. As frações do primeiro pico eluído foram descartadas, frações do segundo pico eluído foram reunidas para estudos posteriores, submetidas à diálise contra PBS e subsequentemente contra tampão de arginina a 200 mM. (Linha 1: HEK293/1BiMAB SN; linha 2: fluxo passante da fração de IMAC; linhas 3-4: frações do pico de eluição 1 (descartada); linhas 5-10: frações do pico de eluição 2 (reunidas)) (B) análise Western blot de 0,5 μg de 1BiMAB de três purificações independentes (linhas 1, 2, 3). A detecção foi realizada com anticorpo monoclonal primário anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com peroxidase. IMAC indica cromatografia de afinidade de metal imobilizado; PBS, solução salina tamponada com fosfato; SN, sobrenadante; WB, Western blot.
[0054] FIGURA 4. Proteína 1BiMAB bi-scFv se liga eficiente e especificamente a células alvo que expressam CLDN18.2 e células T humanas.(A) 2,5x105 células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram incubadas com 50 μg/ml de 1BiMAB ou 10 μg/ml de mCLDN18.2ab como controle positivo e anticorpos secundários conjugados com APC correspondentes. Colorações de controle incluíam anticorpos secundários conjugados com APC apenas (g-a-h, g-a-m), anti-His e g-a-m APC ou 1BiMAB e g-a-m APC. A análise foi realizada por meio de citometria de fluxo. MFI do sinal de APC foi calculada pelo software FlowJo. (B) 1x105 células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram coradas com concentrações crescentes de 1BiMAB (20 pg/mL - 20 μg/ml), anti-His e g-a-m APC. Como controle negativo, as células foram incubadas com anti-His e g-a-m APC. Como controle positivo, mCLDN18.2ab e g-a-h APC foram usados. MFI do sinal de APC foi calculada pelo software FlowJo. (C) 1x106 células T humanas foram incubadas com concentrações crescentes de 1BiMAB (2 ng/ml-2 μg/ml), anti-His e g-a-m APC. Como controle negativo, as células foram incubadas com anti-His e g-a-m APC ou g-a-m APC apenas. MFI do sinal de APC foi calculada pelo software FlowJo. (D) 1x105 células PA-1 negativas para CLDN18.2 foram incubadas com concentrações crescentes de 1BiMAB (10 ng/mL - 10 μg/ml), anti-His e g-a-m APC. Como controle negativo, as células foram marcadas com anti-His apenas e g-a-m APC ou g-a-h APC apenas. 10 μg/ml de mCLDN18.2ab e g- a-h APC foram usados para confirmar a negatividade de células para CLDN18.2. g-a-h indica anticorpo de cabra anti-humano; g-a-m, anticorpo de cabra anti-camundongo; MFI, intensidade média de fluorescência; TL, linfócitos T.
[0055] FIGURA 5. Proteína 1BiMAB bi-scFv leva à agregação de células T sobre células alvo positivas para CLDN18.2.
[0056] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram incubadas durante 24 horas com 1 ng/ml e 1 μg/ml de 1BiMAB e células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades. Células T apenas (TL), células alvo apenas (NugC4) e células T humanas com células alvo (-ctrl) foram escolhidas como amostras de controle. Após 24, as amostras foram fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse Ti com ampliação de 200x. Setas brancas apontam para aglomerados de células T sobre células alvo. TL indica linfócitos T.
[0057] FIGURA 6. 1BiMAB medeia a ativação de células T de uma forma dependente da dose.
[0058] Células NugC4 células que expressam endogenamente CLDN18.2 foram incubadas durante 24 h e 48 h com concentrações crescentes de proteína 1BiMAB bi-scFv (0,001-1000 ng/ml) e células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em duplicata em um formato de 24 cavidades. Como controle, células T humanas foram incubadas com 1-1000 ng/ml de 1BiMAB sem células alvo NugC4 para verificar a ativação de células T dependente do alvo mediada por 1BiMAB. Após 24 h (A) e 48h (B), as células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC e analisadas por citometria de fluxo. TL indica linfócitos T.
[0059] FIGURA 7. 1BiMAB medeia estritamente a ativação de células T dependente de alvo, mesmo após incubação a longo prazo com linhagens de células que expressam fortemente CLDN18.2, células que expressam fracamente CLDN18.2 e células que não a expressam.(A) Dados de RT-PCR gerados a partir de RNA total de seis linhagens de células tumorais são mostrados. Valores- Ct de expressão de CLDN18.2 normalizados para o gene HPRT "housekeeping" foram calculados a partir de dois experimentos independentes. A linhagem de células de câncer de mama MCF7 (barra cinza) foi escolhida como linhagem de células de controle que expressa CLDN18.2 negativo. (B) Linhagens de células cancerosas de (A) foram incubadas durante 144 h com 5 ng/ml de proteína 1BiMAB bi-scFv com ou sem células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em duplicata em um formato de 6 cavidades. As células T foram marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC para analisar a população total de células T (CD3), ativação precoce (CD69) e ativação tardia (CD25) de células T por citometria de fluxo. TL indica linfócitos T.
[0060] FIGURA 8. 1BiMAB induz à proliferação de células T e regulação positiva de granzima B apenas na presença de células alvo positivas para CLDN18.2.(A) Células T humanas foram coradas com CFSE e cultivadas individualmente (TL) ou na presença de 1 ng/ml de 1BiMAB (TL + 1 ng/ml de 1BiMAB), células NugC4 (TL + NugC4) ou células NugC4 e 1 ng/ml de 1BiMAB (TL + 1 ng/mL de 1BiMAB + NugC4) durante 120h. Uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 foi selecionada. Diminuição do sinal de CFSE, a qual indica proliferação de células T, foi analisada por citometria de fluxo. (B) Células T humanas foram incubadas com ou sem células alvo NugC4 e com ou sem 5 ng/ml de proteína 1BiMAB bi-scFv. A proporção de efetuador para alvo foi de 5:1 em um formato de 6 cavidades. Após 96h de co-incubação, as células T foram coletadas e intracelularmente marcadas com anti-GRB-PE e analisadas por citometria de fluxo. MFI do sinal de anti- GrB-PE foi calculada pelo software FlowJo. O sinal da amostra de TL + NugC4 + 5 ng/ml de 1BiMAB não corada foi subtraído de todas as amostras. CFSE indica succinimidil éster de carboxifluoresceína; GrB, Granzima B; MFI, intensidade média de fluorescência; PE, ficoeritrina; TL, linfócitos T.
[0061] FIGURA 9. EC50 de 1BiMAB para células alvo de lise específica após 48 horas é de cerca de 10 pg/ml.
[0062] Células NugC4 células que expressam endogenamente CLDN18.2 , as quais expressa estavelmente luciferase, foram incubadas durante 24 h e 48 h com proteína 1BiMAB bi-scFv em concentrações crescentes (0,001- 1000 ng/ml) com células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em triplicata em um formato de 96 cavidades. Como controle de lise mínima (Lmin), células efetuadoras e células alvo foram colocadas em placas sem bi-scFv 1BiMAB. Lise máxima (Lmax) para a normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 às cavidades de controle contendo células efetuadoras e alvo na ausência de bi-scFv pouco antes da adição de luciferina. Após adição da solução de luciferina, a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan após 24h e 48h. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula: % de lise específica = [1 - (luminescênciaamostra de teste -Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100. Os valores foram representados graficamente contra o log10 da concentração de 1BiMAB. EC50 indica a metade da concentração eficaz máxima; L, lise.
[0063] FIGURA 10. 1BiMAB mostra eficácia terapêutica in vivo em um modelo de tumor SC avançado.
[0064] Camundongos NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) foram injetados SC com 1x107 células HEK293 que expressam estavelmente CLDN18.2. Cinco dias depois, 2x107 células efetoras PBMCs humanas foram injetadas IP nos grupos G3 e G4, grupos de controle (G1 e G2) receberam PBS. Aplicação IP diária de 5 μg de proteína 1BiMAB bi-scFv por animal ou veículo como controle começou no dia seguinte. A terapia foi administrada durante 22 dias, o volume do tumor foi medido usando um calibrador e calculado pela fórmula mm3 = comprimento mm x largura mm x (largura mm/2). (A) O volume do tumor de camundongos individuais e a mediana por grupo são mostrados para os dias de tratamento 0 a 15 (linha superior) e 3 e 13 dias após o final do tratamento (linha inferior). (B) O volume médio do tumor dos dois grupos de tratamento enxertados com células efetuadoras humanas é mostrado. Traços indicam animais sacrificados. (C) Curva de sobrevivência de Kaplan-Meier apresentando todos os grupos do dia da inoculação do tumor até o dia 41. Os animais foram sacrificados logo que o volume do tumor excedeu 500 mm3. Após o dia 41, todos os animais restantes foram sacrificados para analisar o enxerto de células efetuadoras humanas nos baços dos camundongos. (D) Esplenócitos de todos os camundongos foram isolados e marcados com anti-CD45-APC e anti-CD3-FITC para detectar células T humanas por citometria de fluxo. Enxerto mediano é mostrado em um diagrama de gráfico de caixa. G indica grupo; IP, intraperitoneal; PBMC, células mononucleares de sangue periférico; PBS, solução salina tamponada com fosfato; SC, subcutânea.
[0065] FIGURA 11. Esquema modular que ilustra a construção de proteínas bi-scFv recombinantes que objetivam o TAA CLDN6.
[0066] Construção dos bi-scFvs na (A) posição N- terminal e (B) posição C-terminal em relação às regiões variáveis anti-TAA. Regiões VH e VL anti-CLDN6 são geradas a partir da sequência de um anticorpo monoclonal CLDN6 (mCLDN6ab). Regiões VH e VL anti-CD3 são geradas a partir da sequência do anticorpo monoclonal à CD3, TR66. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; His, marcador de hexa-histidila; LL, ligante longo (15-18 aminoácidos); Sec, sinal de secreção; SL, ligante curto (5 aminoácidos); AT, antígeno associado a tumor; V, região variável de cadeia pesada (H) e de cadeia leve (L) do anticorpo.
[0067] FIGURA 12. Proteínas 6PHU5 e 6PHU3 bi-scFv levam à agregação de células T em células alvo positivas para CLDN6.
[0068] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram incubadas durante 24 h com 50 ng/ml de 6PHU5 ou 6PHU3 e células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades. Células T apenas (TL), células alvo apenas (PA-1) e células T humanas com células alvo (-ctrl) foram escolhidas como amostras de controle. Após 24 h, as amostras foram fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse Ti com ampliação de 200x. Setas brancas apontam para aglomerados de células T sobre células alvo. TL indica linfócito T.
[0069] FIGURA 13. Efeito de orientação de domínio sobre a eficácia: proteína 6PHU3 bi-scFv é ligeiramente mais eficiente na indução de ativação de células T do que 6PHU5.
[0070] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram incubadas durante 44h com concentrações crescentes (5-200 ng/ml) de 6PHU5 ou 6PHU3 e células T humanos em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em duplicata em um formato de 6 cavidades. Como controle, células T humanas foram incubadas com 100 e 200 ng/ml de 6PHU5 ou 6PHU3 sem células alvo. Após 44h, as células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC. A ativação de células T dependente da dose foi analisada por citometria de fluxo. Hu indica humano; TL, linfócitos T.
[0071] FIGURA 14. Análise com gel Coomassie e Western blot de proteínas 6PHU3.
[0072] O sobrenadante sem FCS de células HEK293 policlonais que expressam estavelmente 6PHU3 foi purificado através de cromatografia por afinidade Ni-NTA (IMAC). Alíquotas de diferentes etapas de purificação foram carregadas em géis de Bis-Tris a 4-12%. (A) Coloração com Coomassie de sobrenadante celular, fluxo passante e nove frações de eluato. Frações do primeiro pico eluído foram descartadas, frações dos segundo e terceiro picos eluídos foram agrupadas para estudos posteriores, submetidas à dialise contra PBS e subsequentemente contra tampão de arginina a 200 mM. (Linha 1: HEK293/6PHU3 SN; linha 2: fração de fluxo passante IMAC; linhas 3-5: frações de pico de eluição 1 (descartadas); linhas 6-11: frações de picos de eluição 2 e 3 (agrupadas)). (B) Análise Western blot de 0,5 μg de 6PHU3 de duas purificações independentes. A detecção foi realizada com anticorpo primário monoclonal anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com peroxidase. IMAC indica cromatografia de afinidade de metal imobilizado; PBS; solução salina tamponada com fosfato; SN, sobrenadante; WB, western blot.
[0073] FIGURA 15. Proteína 6PHU3 bi-scFv se liga eficiente e especificamente a células alvo que expressam CLDN6 e células T humanas. (A) 1x105 células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 e células OV-90 foram incubadas com concentrações crescentes de 6PHU3 ou bi-scFv de 1BiMAB de controle (10 ng/ml - 10 μg/ml) e 10 μg/ml de mCLDN6ab ou mAb de controle mCLDN18.2ab com os anticorpos secundários conjugados com APC correspondentes. Colorações de controle foram anticorpos secundários conjugados com APC apenas (g-a-h, g- a-m). Análise foi realizada por meio de citometria de fluxo. MFI do sinal de APC foi calculada pelo software FlowJo. (B) 5x105 células T humanas foram incubadas com concentrações crescentes de 6PHU3 (100 ng/ml - 10 μg/ml), anti-His e g-a-m PE. Como controle negativo, as células foram incubadas com anti-His e g-a-m PE ou g-a-m PE apenas. MFI do sinal de PE foi calculada pelo software FlowJo. (C) 1x105 células NugC4 negativas para CLDN6 foram incubadas com concentrações crescentes de 6PHU3 e 1BiMAB (10 ng/ml - 10 μg/ml), anti-His e g-a-m APC apenas. Como controle negativo, as células foram incubadas com g-a-m APC apenas. 10 μg/ml de mCLDN6ab e g-a-h APC foram usados para confirmar a negatividade das células para CLDN6. Como controle positivo, mCLDN18.2ab e g-a-h APC foram usados. MFI do sinal de APC foi calculada pelo software FlowJo. APC indica aloficocianina; g-a-h, anticorpo de cabra anti- humano; g-a-m, anticorpo de cabra anti-camundongo; mAb, anticorpo monoclonal; MFI, intensidade média de fluorescência; PE, ficoeritrina; TL, linfócitos T.
[0074] FIGURA 16. 6PHU3 medeia a ativação de células T de uma maneira dose dependente.
[0075] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram incubadas durante 24 h e 48 h com concentrações crescentes de proteína 6PHU3 bi-scFv (0,001-1000 ng/ml) e células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em duplicata em um formato de 24 cavidades. Como controle, células T humanas foram incubadas com 1 - 1000 ng/ml de 6PHU3 sem células alvo PA-1 para verificar a ativação dependente de alvo de células T mediada por 6PHU3. Após 24 h (A) e 48h (B), as células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC e analisadas por citometria de fluxo. TL indica linfócito T.
[0076] FIGURA 17. EC50 de 6PHU3 para lise de células alvo específica após 48 horas é de aproximadamente 10 pg/ml.
[0077] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6, as quais expressam estavelmente luciferase, foram incubadas durante 24 h e 48 h com proteína 6PHU3em concentrações crescentes (0,001-1000 ng/ml) com células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em triplicata em um formato de 96 cavidades. Como controle mínimo de lise (Lmin), células efetuadoras e alvo foram colocadas em placas sem bi-scFv 6PHU3. Lise máxima (Lmax) para a normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 às cavidades de controle contendo células efetuadoras e alvo na ausência de bi-scFv pouco antes da adição de luciferina. Após adição da solução de luciferina, a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan após 24h e 48h. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula: % de lise específica = [1 - (luminescênciaamostra de teste - Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100. Os valores foram representados graficamente contra o log10 da concentração de 6PHU3. EC50 indica metade da concentração eficaz máxima; L, lise.
[0078] FIGURA 18. 6PHU3 mostra eficácia terapêutica in vivo em um modelo de tumor SC avançado.
[0079] Camundongos NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) foram injetados SC com 1x107 células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6. 15 dias depois, 2x107 PBMCs humanas foram injetadas IP nos grupos G3 e G4, grupos de controle (G1 e G2) receberam PBS. Aplicação IP diária de 5 μg de 6PHU3 por animal ou bi-scFv de 1BiMAB de controle ou veículo apenas como controle começou cinco dias após injeção de PBMCs. Terapia foi administrada durante 25 dias, o volume do tumor foi medido usando um calibrador e calculado pela fórmula mm3 = comprimento mm x largura mm x (largura mm/2). (A) O volume do tumor de camundongos individuais e a mediana por grupo são mostrados para os dias de tratamento 0 a 14 (linha superior) e 21 e 25 (linha inferior). (B) O volume médio do tumor de todos os grupos de tratamento é mostrado. Traços indicam animais sacrificados. (C) Uma curva de sobrevivência de Kaplan- Meier de todos os grupos do dia de inoculação do tumor até o dia 45 é mostrada. Os animais foram sacrificados em volume de tumor > 1500 mm3. Após o dia 45, todos os animais restantes foram sacrificados para analisar o enxerto de células efetuadoras humanas nos baços de camundongos. (D) Esplenócitos de todos os camundongos foram isolados e marcados com anti-CD45-APC e anti-CD3-FITC para detectar células T humanas por citometria de fluxo. Enxerto mediano é mostrado em um diagrama de gráfico de caixa. IP indica intraperitoneal; PBMC, células mononucleares de sangue periférico; PBS, solução salina tamponada com fosfato; SC, subcutânea.
[0080] FIGURA 19. Infiltração de células T aumentada em tumores PA-1 SC em resposta ao tratamento com 6PHU3.
[0081] Camundongos NSG foram injetados SC com 1x107 células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6. 15 dias depois, 2x107 PBMCs humanas foram injetadas IP nos grupos G3 e G4, grupo controle (G1 e G2) receberam PBS apenas. Aplicação IP diária de 5 μg de 6PHU3 por animal ou bi-scFv de 1BiMAB de controle ou veículo apenas como controle começou cinco dias após a injeção de PBMCs. Os tumores foram dissecados em um tamanho de 1500 mm3 ou no final do experimento e conservados em solução de formaldeído tamponada a 4% para inclusão em parafina.
[0082] Tecidos de tumor incrustados em parafina de tumores PA-1 SC foram submetidos à colorações imuno- histoquímicas. Seções consecutivas foram coradas com anticorpo policlonal ou anticorpo primário anti-Claudina 6 ou anti-CD3 humana. Os anticorpos primários foram detectados usando anticorpos secundário anti-coelho conjugados com HRP. Linhas superiores de A-E mostram a coloração de CLDN6, linhas inferiores a coloração de CD3. As imagens foram tiradas com um scanner Mirax. (A) e (B) mostram os grupos de controle G1 e G2 com PBS que não receberam células efetuadoras humanas e veículo ou bi-scFv 6PHU3, respectivamente, (C) mostra o grupo de controle G3 que recebeu células efetuadoras humanas e veículo como tratamento, (D) mostra o grupo G4 que recebeu células efetuadoras humanas e bi-scFv 6PHU3 como o tratamento e (E) mostra grupo de controle G5 que recebeu células efetuadoras humanas e bi-scFv de 1BiMAB de controle. Sinais positivos aparecem como coloração vermelha. Pontas de seta pretas apontam para exemplos de sinais de CD3. IP indica intraperitoneal; PBMC, células mononucleares de sangue periférico; PBS, solução salina tamponada com fosfato; SC, subcutânea.
[0083] FIGURA 20. Representação esquemática de moléculas de IVT-RNA que codificam anticorpos bi-scFv que objetivam o TAA CLDN18.2.
[0084] Esquema de sequências de RNA transcritas in vitro que codificam anticorpos bi-scFv anti-CLDN18.2. (A) IVT-mRNA nas posições 5' e 3' em relação às regiões variáveis anti-TAA. (B) Replicon alfaviral IVT na posição 5' em relação às regiões variáveis anti-TAA. Regiões VH e VL anti-CLDN18.2 foram geradas a partir da sequência de um anticorpo monoclonal à CLDN18.2 (mCLDN18.2ab). "Cap" é uniformemente usado para ARCA, beta-S-Arca (D1) ou beta-S- Arca (D2). Em (A) "anti-CD3" significa, abrangentemente, as regiões VH e VL geradas a partir das sequências dos seguintes anticorpos monoclonais à CD3: UCHT1-HU (mAb humanizado), UCHT1, CLB-T3, TR66, 145-2C11, em (B) "anti- CD3" descreve apenas VH e VL de TR66. A indica adenina; bi- scFv, fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; hAg, 5'-UTR de alfa globina humana; hBg, 3'-UTR de beta globina humana; His, marcador de hexa-histidila; IVT, transcrito in vitro; LL, ligante longo (15-18 aminoácidos); nsP1-4, proteínas não estruturais 1-4; Sec, sinal de secreção; sgP, promotor subgenômico; SL, ligante curto (5-6 aminoácidos); TAA, antígeno associado a um tumor; UTR, região não traduzida; V, região variável de cadeia pesada (H) e cadeia leve (L) do anticorpo.
[0085] FIGURA 21. Efeito de orientação de domínio e seleção anti-CD3-scFv-sobre a ativação de células T dependente de alvo e lise de células alvo específica.
[0086] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram transfectadas transitoriamente com diversas variantes de bi-scFv dirigidas contra CLDN18.2 e CD3 para a comparação de sua potência em um ensaio citotóxico. Por variante, 5x106 células NugC4 foram eletroporadas com 20 μg/ml de IVT-mRNA. Células alvo transfectadas foram contadas, 1x105 células cultivadas por placa com 6 cavidades e incubadas com células T citotóxicas humanas (células T CD8+ selecionadas) em uma proporção E:T de 5:1. Como controles negativos, um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (ctrl) e o mAb de IgG precursor chCLDN18.2ab (IgG ctrl) que objetiva CLDN18.2, mas não células T, foram escolhidos. Proteína 1BiMAB serviu como controle positivo na concentração de 5 ng/ml. Como referência de base de células mortas, células alvo eletroporadas foram cultivadas sem células T e, como referência de ativação de base, as células T foram cultivadas sem células alvo. Cada amostra foi cultivada em duplicata. Após 48 h, as células T e células alvo foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE, anti- CD69-APC e 7-AAD para coloração de células vivas/mortas e analisadas por citometria de fluxo. (A) Ativação de células T mediada por bi-scFv dependente de TAA foi observada com todas as variantes de bi-scFv anti-CLDN18.2. (B) Lise de células alvo específica foi determinada subtraindo-se a população de referência 7-AAD da população de células alvo na amostra de 7-AAD. Os anticorpos bi-scFv que levam a uma maior lise marginal de células alvo - 1BiMAB e no. 5 - compartilham a orientação de domínio e a origem anti-CD3 do mAb TR66, mas diferem quanto à sua otimização de códons (HS e CHO, respectivamente) e a longo das sequências ligantes. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; ctrl, controle; IgG, imunoglobulina G; FPI, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0087] FIGURA 22. Co-incubação de células alvo transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB e células T humanas leva à agregação de células T.
[0088] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram transitoriamente transfectadas por eletroporação com 80 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB e coincubadas com células humanas T citotóxicas (células T CD8+ selecionadas) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 96 cavidades. Como amostra de controle negativo, células alvo NugC4 transfectadas com IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (-ctrl) coincubadas com células T citotóxicas humanas foram usadas (linha superior, à esquerda). A linha inferior mostra células NugC4 transfectadas com bi-scFv de controle (esquerda) ou IVT-mRNA de 1BiMAB (direita) sem células T humanas. Após 24 h de co-incubação, as amostras foram fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse Ti em uma ampliação de 200x. Setas brancas apontam para aglomerados de células T sobre as células alvo. CTL indica linfócitos T citotóxicos; ctrl, controle; hu, humano.
[0089] FIGURA 23. 1BiMAB secretada por células alvo após transfecção de IVT-mRNA medeia a ativação de células T de uma maneira dependente da concentração.
[0090] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram transitoriamente transfectadas por eletroporação com um total de 40 μg/ml de IVT-RNA contendo 0,4-40 μg/ml de IVT-RNA de 1BiMAB mais quantidades apropriadas de IVT-mRNA de luciferase. Células alvo transfectadas foram coincubadas com células T humanas citotóxicas (células T CD8+ selecionadas) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades em duplicata. Como referência de ativação de células T, células T humanas foram coincubadas com células alvo NugC4 transfectadas com 40 μg/ml de IVT-mRNA de luciferase (0,0 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB). Após 24 h (A) e 48 h (B), as células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC e analisadas por citometria de fluxo. Os gráficos demonstram a percentagem de células T citotóxicas humanas coradas positivamente, conforme determinado com o software FlowJo. IVT indica transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0091] FIGURA 24. 1BiMAB secretada por células alvo após transfecção de IVT-mRNA leva a uma lise de células alvo dependente de concentração.
[0092] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com um total de 40 μg/ml de IVT-RNA contendo 0,4-40 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB mais quantidades apropriadas de IVT-mRNA de luciferase ou 40 μg/ml de IVT- mRNA de luciferase apenas como amostra de referência. Células alvo transfectadas foram cultivadas com células T humanas citotóxicas (células T CD8+ selecionadas) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 ou sem células efetuadoras para determinar a percentagem de base de células alvo mortas por cada eletroporação individual. Todas as amostras foram cultivadas em placas com 6 cavidades em duplicata. Após 24 h (A) e 48 h (B), as células T foram coletadas, marcadas com iodeto de propídio (PI) para coloração de células vivas/mortas e analisadas por citometria de fluxo. A percentagem de células alvo PI(+) mortas foi determinada pelo software FlowJo. Os valores foram ainda normalizados para cada amostra de base individual e para a amostra de referência. IVT indica transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0093] FIGURA 25. Proliferação de células T é especificamente induzida em resposta à secreção de 1BiMAB por células alvo na presença de CLDN18.2.
[0094] Células T humanas foram coradas com CFSE para o ensaio. As células T foram cultivadas sem células alvo (células T) em combinação com 5 μg/ml de OKT3 e 2 μg/ml de αCD28 como controle de ativação positivo (+ctrl), com 5 ng/ml de bi-scFv de controle de não objetivação (proteína -ctrl) ou com 5 ng/ml de proteína 1BiMAB (proteína 1BiMAB). Células T e células alvo NugC4 que superexpressam CLDN18.2 foram incubadas juntas (células T + células alvo positivas para CLDN18.2) sem nada (simulado) ou com 5 ng/ml de proteína 1BiMAB (proteína 1BiMAB). Para testar o IVT-mRNA, células NugC4 foram transfectadas com 20 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB (mRNA de 1BiMAB) ou um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (mRNA -ctrl) e incubadas com as células T. Além disso, células NugC4 transfectadas com um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso foram combinadas com 5 ng/ml de proteína 1BiMAB (-ctrl mRNA + proteína 1BiMAB). Como controle adicional de especificidade, amostras com a linhagem de células alvo MDA-MB-231 que não expressa CLDN18.2, juntamente com as células T, foram incluídas (células T + células alvo CLDN18.2 negativas). Células MDA-MB-231 foram usadas não tratadas e incubadas sem nada (simulado), com 5 ng/ml de proteína de bi-scFv de controle (proteína -ctrl) ou 5 ng/ml de proteína 1BiMAB (proteína 1BiMAB) ou células MDA-MB-231 foram transfectadas com 20 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB (mRNA de 1BiMAB) ou um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (mRNA -ctrl). O ensaio foi realizado em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em 96 cavidades, com cada amostra em triplicata e tempos de incubação de 72 h. Diminuição do sinal de CFSE que indica proliferação de células T foi analisada por citometria de fluxo, calculada pelo software FlowJo e representada como proliferação % de células T. CFSE indica succinimidil éster de carboxifluoresceína; FPI, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro.
[0095] FIGURA 26. Ativação de células T e lise de células alvo mediada por células T em resposta à secreção de 1BiMAB começa com uma proporção de efetuador para alvo de 0,3:1.
[0096] Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com 40 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB. Células alvo transfectadas foram coincubadas com células humanas T citotóxicas (células T CD8+ selecionadas) nas proporções de efetuador para alvo indicadas de 0,3:1 a 10:1 em placas com 6 cavidades em duplicata. Como referência, células T humanas foram cultivadas na ausência de células alvo ((A) 1:0) e células alvo de controle transfectadas com IVT-mRNA foram cultivadas na ausência de células efetuadoras ((B) 0:1). Como controle negativo, células T humanas foram coincubadas com células alvo NugC4 transfectadas com 40 μg/ml de IVT-mRNA de luciferase (ctrl IVT-mRNA) em uma proporção E:T de 10:1 ((A) e (B) ctrl IVT-mRNA (10:1). Após 48 h, as células foram coletadas e marcadas com anti-CD3- FITC, anti-CD25-PE, anti-CD69-APC e iodeto de propídio (PI) para coloração de células vivas/mortas e analisadas por citometria de fluxo. (A) Mostra a percentagem de células T citotóxicas humanas positivamente coradas. (B) Mostra a percentagem de células alvo mortas (PI+). Todos os valores foram determinados através do software FlowJo. E:T indica efetuador para alvo; FPI, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0097] FIGURA 27. Células T citotóxicas humanas são capazes de servir como células receptoras e produtoras de IVT-mRNA de bi-scFv.
[0098] Células citotóxicas T humanas foram recentemente isoladas de PBMCs por meio de seleção positiva com CD8 e subsequentemente transfectadas transitoriamente por eletroporação com 80 ou 240 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB. As células efetuadoras transfectadas foram coincubadas com células alvo NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades em duplicara. Como referência, células T humanas não tratadas foram cultivadas com células alvo. Como controle negativo, células T humanas transfectadas com 80 ou 240 μg/ml de IVT-mRNA de eGFP de controle foram coincubadas com células alvo NugC4. Após 48 h, as células foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE, anti-CD69-APC e iodeto de propídio (PI) para coloração de células vivas/mortas e analisadas por citometria de fluxo. (A) mostra a percentagem de células T citotóxicas humanas positivamente coradas. Em (B), a percentagem de células alvo (PI+) mortas normalizada para a amostra de referência é representada. Todos os valores foram determinados através do software FlowJo. Ctrl indica controle; IVT; transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0099] FIGURA 28. Células alvo CLDN18.2 negativas transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB não são submetidas à lise por células T.
[0100] A linhagem de células PA-1 negativa para CLDN18.2 que expressa estavelmente luciferase serviu como linhagem de células alvo. 5x106 células PA-1/luc foram transfectadas por eletroporação com um total de 40 μg/ml de IVT-mRNA. 4 e 40 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB ou 6RHU3 que objetiva CLDN6 endogenamente expresso como controle positivo foram transfectados. Como bi-scFv de controle negativo, 40 μg/ml de IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (- ctrl) foram transfectados. Este IVT- mRNA serviu também como RNA de enchimento nas amostras de IVT-mRNA de 4 μg/ml (4 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB, 4 μg/ml de IVT-mRNA de 6RHU3). Amostras de controle de proteína com 1BiMAB e 6PHU3 em combinação com células PA-1/luc de controle negativo bi-scFv transfectadas e células efetuadoras foram incluídas.
[0101] Células alvo transfectadas foram cultivadas com células T citotóxicas humanos (células Pan-T) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1. Todas as amostras foram cultivadas em triplicata em um formato de 96 cavidades e coincubadas durante 72 h. Como controle mínimo de lise (Lmin), cada amostra de células alvo transfectadas individual foi cultivada sem células efetuadoras. Lise máxima (Lmax) para a normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 às cavidades de controle contendo células efetuadoras e células alvo não tratadas (Lmax1) ou células alvo não tratadas isoladamente (Lmax2) antes da adição de luciferina. 30 minutos após adição da solução de luciferina, a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan. Lise específica para células alvo foi calculada pela fórmula: lise específica % = [1 - (luminescênciaamostra de teste Lmax2)] x 100. Ctrl indica controle; IVT; transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro.
[0102] FIGURA 29. Prova de produção de 1BiMAB por células de mamífero transfectadas com IVT-mRNA de bi-scFv ou RNA de replicon.(A) 5x106 células BHK21 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com 40 μg/ml de IVT- mRNA de 1BiMAB ou RNA de replicon. Como controle simulado, as células foram eletroporadas sem RNA. 18 h após transfecção, o sobrenadante e as células foram coletados. As células foram submetidas à lise e os sobrenadantes foram submetidos a uma concentração de ~50 vezes. Os sobrenadantes não tratados e concentrados foram analisados por ELISA usando placas Ni-NTA, mAB idiotípico anti- chCLDN18.2ab e um anticorpo secundário conjugado com AP. Proteína 1BiMAB purificada em uma série de diluições que varia 2,3 a 37,5 ng/mL em etapas de 2 foi usada como padrão. (B) Sobrenadante concentrado, lisatos celulares de (A) e 0,1 μg de proteína 1BiMAB purificada como controle positivo foram separados através de SDS-PAGE. Análise Western Blot foi realizada com anticorpo primário monoclonal anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à peroxidase. (C) 5x106 células BHK21 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com 40 μg/ml de 1BiMAB ou IVT-mRNA no.25. Como controle simulado, as células foram eletroporadas sem RNA. 48 h após transfecção, o sobrenadante foi coletado e submetido a uma concentração de 40 vezes. SN e 0,1 μg de proteína 1BiMAB purificada como controle positivo foram separados através de SDS-PAGE. Análise Western Blot foi realizada com anticorpo primário monoclonal anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à peroxidase. Ctrl indica controle; mAb, anticorpo monoclonal; SN, sobrenadante; WB, Western blot.
[0103] FIGURA 30. Injeção de IVT-mRNA de bi-scFv 1BiMAB ou RNA de replicon leva à produção in vivo e moléculas scFv bi-1BiMAB detectáveis em camundongos.
[0104] 10 μg de IVT-mRNA de 1BiMAB com ou sem IVT- mRNA de EBK ou 10 μg de IVT-replicon de 1BiMAB foram injetados IM em camundongos NSG. Soro de sangue, coletado 2, 4 e 7 dias após injeção, foi aplicado em um ensaio citotóxico in vitro. Células alvo CLDN18.2 e que expressam estavelmente luciferase NugC4-LVT-CLDN18.2/luc foram coincubadas com células T humanas em uma proporção E:T de 30:1 com 20 μl de soro de amostra durante 48 h. Controle de proteína 1BiMAB padrão, Lmin e Lmax, continha 20 μl de soro simulado de NSG. EBK indica coquetel de proteínas E3, B- 18R, K3 do vírus vaccinia; IM, intramuscular.
[0105] FIGURA 31. Representação esquemática de moléculas de IVT-RNA que codificam anticorpos bi-scFv que objetivam TAA CLDN6.
[0106] Esquema de sequências de RNA transcritas in vitro que codificam anticorpos bi-scFv anti-CLDN6. (A) IVT mRNA nas posições 5'- e 3'- em relação às regiões variáveis anti-TAA. (B) Replicon alfaviral IVT na posição 3' em relação às regiões variáveis de anti-TAA. Regiões VH e VL de anti-CLDN6 são geradas a partir da sequência de um anticorpo monoclonal CLDN6 (mCLDN6ab). "Cap" é usado uniformemente para ARCA beta-S-ARCA (D1) or beta-S-ARCA (D2). Regiões VH e VL de anti-CD3 são geradas a partir da sequência do anticorpo monoclonal à CD3, TR66. A indica adenina; bi-scFv, fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; hAg, 5'-UTR de alfa globina humana; hBg, 3'- UTR de beta globina humana; His, marcador de hexa- histidila; IVT, transcrito in vitro; LL, ligante longo (1518 aminoácidos); nsP1-4, proteínas 1-4 não estruturais; Sec, sinal de secreção; sgP, promotor subgenômico; SL, ligante curto (5-6 aminoácidos); TAA, antígeno associado a tumor; UTR, região não traduzida; V, região variável de cadeia pesada (H) e cadeia leve (L) do anticorpo.
[0107] FIGURA 32. Co-incubação de células alvo transfectadas com IVT-mRNA de bi-scFv anti-CLDN6 e células T humanas leva à agregação de células T.
[0108] Células PA-1 que expressa endogenamente CLDN6 foram transitoriamente transfectadas por eletroporação com 20 μg/ml de 6RHU5 ou IVT-mRNA de 6RHU3 e coincubadas com células T humanas (células Pan-T) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades. Como amostra de controle negativo, células PA-1- alvo transfectadas com um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (- ctrl) coincubadas com células T humanas foram usadas (linha superior, foto à esquerda). A linha do meio mostra células PA-1 não tratadas e células T humanas sem proteína como controle negativo (simulado, foto à esquerda) ou com 50 μg/ml de proteínas 6PHU5 bi-scFv anti-CLDN6 purificadas (meio) ou 6PHU3 (direita) como controles positivos . A linha inferior mostra células PA-1 não tratadas (esquerda) e células T humanas apenas (direita). Após 24 h de coincubação, as amostras foram fotografadas com um microscópio Nikon Eclipse Ti em uma ampliação de 200x. Setas brancas apontam para agrupamentos de células T sobre células alvo. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; ctrl, controle; hu, humano; IVT, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0109] FIGURA 33. Efeito de orientação de domínio sobre a eficácia: transfecção de células alvo com anticorpos 6RHU3 bi-scFv anti-CLDN6 leva a uma maior percentagem de células T ativadas do que com 6RHU5.
[0110] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram transitoriamente transfectadas com as duas variantes bi-scFv, 6RHU5 e 6RHU3, dirigidas contra CLDN6 e CD3 para comparação de sua potência em um ensaio de ativação de células T. Por variante, 5x106 células PA-1 foram eletroporadas com 20 μg/ml de IVT-mRNA. Células alvo transfectadas foram novamente contadas, 1x105 células cultivadas por placa com 6 cavidades e incubadas com células T humanas citotóxicas (células T CD8+ selecionadas) em uma proporção E:T de 5: 1. Como controles negativos, células alvo não tratadas (hu TL + PA-1 não tratadas) e células alvo transfectadas com um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (hu TL + PA-1 - ctrl) foram escolhidos. Proteína 6PHU5 serviu como controle positivo em uma concentração de 50 ng/ml (proteína hu LT + PA-1 ctrl). Além disso, as células T foram cultivadas sem células alvo, com ou sem proteína 6PHU5 como referência de ativação de base. Cada amostra foi cultivada em duplicata. Análise foi realizada após 24 h e 48 h: células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE, anti-CD69-APC e 7-AAD para coloração de células vivas/mortas e analisadas por meio de citometria de fluxo. Ativação de células T mediada por bi-scFv dependente de TAA foi observada com ambas as variantes de bi-scFv anti-CLDN6 após 24 h (A) e 48 h (B) de co-incubação. Transfecção com 6RHU3 bi-scFv levou a uma ativação de células T aproximadamente 20% maior em ambos os pontos de tempo. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; ctrl, controle; hu, humano; IVT, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0111] FIGURA 34. Secreção de 6RHU3 medeia a ativação de células T de um modo dependente da concentração.
[0112] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram transitoriamente transfectadas por eletroporação com um total de 20 μg/ml de IVT-RNA contendo 0,2-20 μg/ml de IVT-RNA de 6RHU3 mais quantidades apropriadas de um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso. Transfecção de 20 μg/ml de IVT-mRNA de bi- scFv que objetiva um TAA não expresso (0,0 μg/ml de IVT- mRNA de 6RHU3) serviu como controle de especificidade. Células alvo transfectadas foram coincubadas com células T citotóxicas humanas (células Pan-T) em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em placas com 6 cavidades em duplicata. Como referência de ativação de células T, células T humanas foram cultivadas isoladamente sem proteína 6PHU5 (hu TL -) ou com proteína 6PHU5 (proteína hu TL ctrl). Como controle negativo, células T foram coincubadas com células alvo PA-1 não tratadas (hu TL + PA- 1 - ctrl). Proteína 6PHU5 serviu como controle positivo em uma concentração de 50 ng/ml (proteína hu LT + PA-1 ctrl). Após 48 h, as células T foram coletadas e marcadas com anti-CD3-FITC, anti-CD25-PE e anti-CD69-APC e analisadas por meio de citometria de fluxo. Os gráficos demonstram as percentagens de células T humanas positivamente coradas, conforme determinado através do software FlowJo. Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; ctrl, controle; hu, humano; IVT, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro; TL, linfócitos T.
[0113] FIGURA 35. EC50 de 6RHU3 para lise de células alvo específica após 48 h é de aproximadamente 200 ng/ml.
[0114] Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6, as quais expressam estavelmente luciferase, foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com uma concentração total de 13,3 μg/ml de IVT-RNA de bi-scFv contendo 0,004-13,3 μg/ml de 6RHU3 e uma quantidade apropriada de um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso. Células alvo transfectadas foram cultivadas com células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em triplicata em um formato de 96 cavidades. Como controle mínimo de lise (Lmin), cada amostra de células alvo transfectadas individual foi cultivada sem células efetuadoras. Lise máxima (Lmax) para a normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 às cavidades de controle contendo células efetuadoras e alvo não tratadas pouco antes da adição de luciferina. 30 minutos após adição da solução de luciferina, a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan após 24 h e 48 h. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula: lise específica % = [1 - (luminescênciaamostra de teste - Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100. Os valores foram representados contra o log10 da concentração de 6RHU3. EC50 indica metade da concentração eficaz máxima; L, lise.
[0115] FIGURA 36. Proliferação de células T é especificamente induzida em resposta à secreção de 6RHU3 pelas células alvo na presença de CLDN6.
[0116] Células T humanas foram coradas com CFSE para o ensaio. As células T foram cultivadas sem células alvo (células T) em combinação com 5 μg/ml de OKT3 e 2 μg/ml de αCD28 como controle de ativação positivo (+ctrl), com 5 ng/ml de bi-scFv de controle não alvo (proteína - ctrl) ou com 5 ng/ml de proteína 6PHU3 (proteína 6PHU3). Células T e células alvo PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram incubadas juntas (células T + células alvo CLDN6 positivas) sem nada (simulado) ou com 5 ng/ml de proteína 6PHU3 (proteína 6PHU3). Para testar IVT-mRNA, células PA-1 foram transfectadas com 20 μg/ml de IVT-mRNA de 6RHU3 (mRNA de 6RHU3) ou um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expresso (mRNA -ctrl) e incubadas com células T. Além disso, células PA-1 transfectadas com um IVT-mRNA de scFv que objetiva um TAA não expresso foram combinadas com 5 ng/ml de proteína 6PHU3 (mRNA -ctrl + proteína 6PHU3). Como controle adicional de especificidade, amostras com a linhagem de células alvo MDA-MB-231 que não expressa CLDN6, juntamente com células T, foram células (células T + células alvo CLDN6 negativas). MDA-MB-231 foi ou usada não tratada e incubada sem nada (simulado), com 5 ng/ml de proteína bi-scFv de controle (proteína -ctrl) ou 5 ng/ml de proteína 6PHU3 (proteína 6PHU3) ou MDA-MB-231 foi transfectada com 20 μg/ml de IVT-mRNA de 6RHU3 (mRNA de 6RHU3) ou um IVT-mRNA de bi-scFv que objetiva um TAA não expressos (mRNA -ctrl). O ensaio foi realizado em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em 96 cavidades, com cada amostra em triplicata e tempos de incubação de 72 h. Diminuição do sinal de CFSE que indica a proliferação de células T foi analisada por meio de citometria de fluxo, calculada pelo software FlowJo e representada como proliferação % de células T. CFSE indica succinimidil éster de carboxifluoresceína; IVT, transcrito in vitro; mRNA, RNA mensageiro.
[0117] FIGURA 37. Prova de tradução de 6RHU3 por células de mamífero transfectadas com IVT-mRNA bi-scFv de scFv ou - RNA de replicon.(A) 5x106 células BHK21 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com 40 μg/ml de IVT-mRNA de 6RHU3 ou RNA de replicon. Transfecção de 40 μg/ml de IVT-mRNA no.25 foi incluída como amostra adicional. Como ctrl simulado, as células foram eletroporadas sem RNA. 18 h após transfecção, o sobrenadante e as células foram coletados. As células foram submetidas à lise e os sobrenadantes foram submetidos a uma concentração de ~ 50 vezes. Os sobrenadantes não tratados e concentrados foram analisados por ELISA usando placas Ni-NTA, mAB idiotípico anti-mCLDN6ab e um anticorpo secundário conjugado com AP. Proteína 6PHU3 purificada em uma série diluições que varia de 2,3 a 150 ng/mL em etapas de 2 foi usada como padrão. (B) Sobrenadante concentrado e lisatos celulares de (A) e 0,1 μg de proteína 6PHU3 purificada como controle positivo foram separados através de SDS-PAGE. Análise Western Blot foi realizada com anticorpo primário monoclonal anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à peroxidase. (C) 5x106 células BHK21 foram transfectadas transitoriamente por eletroporação com 40 μg/ml de 6RHU3 ou IVT-mRNA no.25. Como controle simulado, as células foram eletroporadas sem RNA. 48 h após transfecção, o sobrenadante foi coletado e submetido a uma concentração de ~ 40 vezes. SN e 0,1 μg de proteína 6PHU3 purificada como controle positivo foram separados através de SDS-PAGE. Análise Western Blot foi realizada com anticorpo primário monoclonal anti-His e anticorpo secundário anti-camundongo conjugado à peroxidase. Ctrl indica controle; mAb, anticorpo monoclonal; SN, sobrenadante; WB, Western blot.
[0118] FIGURA 38. Injeção de IVT-mRNA bi-scFv 6RHU3 ou - RNA de replicon leva à tradução in vivo e moléculas bi-scFv detectáveis em camundongos.
[0119] 10 μg IVT-mRNA de 6RHU3 com ou sem IVT-mRNA de EBK ou 10 μg de IVT-replicon de 6RHU3 foram injetados IM em camundongos NSG. Soro de sangue, coletado 7 dias após injeção, foi aplicado em um ensaio citotóxico in vitro. Células alvo PA-1/luc que expressam endogenamente CLDN6 e estavelmente luciferase foram coincubadas com células T humanas em uma proporção E:T de 30:1 com 20 μl de soro de amostra durante 48 h. Controle de proteína 6PHU3 padrão, Lmin e Lmax, continha 20 μl de soro de NSG simulado. EBK indica coquetel de proteínas E3, B-18R, K3 do vírus vaccinia; IM, intramuscular.
[0120] FIGURA 39. Resultados citotóxicos de proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 contendo o domínio de ligação de scFv anti-CD3 na parte C-terminal da proteína.
[0121] Variantes de bi-scFv dirigidas contra CLDN18.2 e CD3 foram transitoriamente expressas em células CHO e purificadas com resina de Proteína-L para a comparação de sua potência em um ensaio citotóxico. Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2, as quais expressam estavelmente luciferase, foram tomadas como células alvo. Células T humanas e células alvo foram incubadas em uma proporção E:T de 5:1 com 5000, 1000, 200 e 40 ng/ml de cada uma das proteínas bi-scFv no formato de 96 cavidades. Cada amostra de teste foi colocada em placa em triplicata, a amostra de controle para Lmin foi colocada em placa em triplicata. Os tempos de co-incubação antes de análise foram 24h e 48h. Após adição de solução de luciferina nos pontos de tempo indicados, a luminescência foi medida em um leitor Infinite M200 TECAN. Lise específica para células alvo foi calculada para cada concentração e reportada. a. Os domínios variáveis de anti-CD3 estão na ordem domínio VH - VL e separados pelo ligante peptídico LL4. b. Os domínios variáveis de anti-CD3 estão na ordem VH - VL e separados pelo ligante peptídico LL4. O scFv anti-CD3 contém uma ponte de dissulfeto na interface entre os domínios VH e VL. c. Os domínios variáveis de anti-CD3 estão na ordem VL - VH e separados pelo ligante peptídico LL5. d. Os domínios variáveis de anti-CD3 estão na ordem VL - VH e separados pelo ligante peptídico LL5. O scFv anti-CD3 contém uma ponte de dissulfeto na interface entre os domínios VL e VH.
[0122] FIGURA 40. Comparação intraensaio de valores EC50 obtidos no ensaio citotóxico de luciferase com proteínas bi-scFv anti-CLDN6.
[0123] Ensaios citotóxicos de luciferase foram realizados com três doadores diferentes para preparo de células T. Os valores de EC50 calculados, calculados com as 6 proteínas bi-scFv anti-CLDN6 testadas após 24h e 48h de incubação, são reportados para cada ensaio independente (A, B e C). Células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram incubadas durante 24 h e 48 h com concentrações crescentes (0,025-50000 ng/ml para A e B, 0,0025-5000 ng/ml para C) de proteínas bi-scFv anti-CLDN6 e células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em triplicata em um formato de 96 cavidades. Como controle mínimo de lise (Lmin), células efetuadoras e alvo foram colocadas em placas sem proteínas bi-scFv. Lise máxima (Lmax) para a normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 às cavidades de controle contendo células efetuadoras e alvo na ausência de bi-scFv pouco antes da adição de luciferina. 30 minutos após adição de solução de luciferina, a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan após 24 h e 48 h de incubação de células alvo e efetuadoras. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula: lise específica % = [1 - (luminescênciaamostra de teste - Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100. EC50 indica metade da concentração eficaz máxima; L, lise; NA, não aplicável.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0124] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, deverá ser entendido que a presente invenção não está limitada às metodologias, protocolos e reagentes particulares descritos aqui, uma vez que estes podem variar. Deverá também ser entendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição apenas de concretizações particulares e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção, o qual estará limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme normalmente entendido por aqueles versados na técnica.
[0125] A seguir, os elementos da presente invenção serão descritos. Estes elementos são listados com concretizações específicas, no entanto, deverá ser entendido que eles podem ser combinados em qualquer forma e em qualquer número para criar concretizações adicionais. Os exemplos variadamente descritos e concretizações preferidas não devem ser interpretados como limitando a presente invenção apenas às concretizações explicitamente descritas. A presente descrição deverá ser entendida como suportando e abrangendo concretizações as quais combinam as concretizações explicitamente descritas com qualquer número dos elementos descritos e/ou preferidos. Além disso, quaisquer permutas e combinações de todos os elementos descritos no presente pedido deverão ser consideradas descritas pela descrição do presente Pedido, a menos que o contexto indique o contrário.
[0126] De preferência, os termos usados aqui são definidos conforme descrito em "A Multilingual Glossary of Biotechnological Terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel e H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça, (1995).
[0127] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia celular, imunologia e técnicas de DNA recombinante os quais são explicados na literatura da área (vide, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0128] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreende" e variações, tais como "compreendem" e "compreendendo", deverão ser entendidas como implicando a inclusão de um elemento, inteiro ou etapa ou grupo de elementos, inteiros ou etapas designado, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa ou grupo de elementos, inteiros ou etapas embora, em algumas concretizações, este outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de elementos, inteiros ou etapas podem ser excluídos, isto é, o assunto consiste na inclusão de um elemento, inteiro ou etapa ou grupo de elementos, inteiros ou etapas designado. Os termos "um" e "uma" e "o" e "a" e referência similar usados no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser entendidos como abrange tanto o singular quanto o plural, a menos que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Citação de faixas de valores aqui se destina apenas a servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa. A menos que de outro modo indicado aqui, cada valor individual é incorporado no relatório descritiva como se fosse individualmente citado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de quaisquer e todos os exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecido aqui se destina apenas a ilustrar melhor a invenção e não constitui uma limitação do âmbito da invenção de outro modo reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.
[0129] Vários documentos são citados ao longo do texto do presente relatório descritivo. Cada um dos documentos citados aqui (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), quer supra ou infra, é aqui incorporado por referência na íntegra. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antecipar tal descrição em virtude de invenção anterior.
[0130] Claudinas são uma família de proteínas que são os componentes mais importantes de junções herméticas, onde elas estabelecem a barreira paracelular que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre as células do epitélio. As claudinas são proteínas transmembrana que abrangem a membrana 4 vezes com as extremidades N-terminal e C-terminal de ambas localizadas no citoplasma. A primeira alça extracelular, denominada EC1 ou ECL1 consiste, em média, de 53 aminoácidos, e a segunda alça extracelular, denominada EC2 ou ECL2, consiste em cerca de 24 aminoácidos. Proteínas na superfície celular da família claudina, tais como CLDN6 e CLDN18.2, são expressas em tumores de diferentes origens e são particularmente adequadas como estruturas alvo em relação à imunoterapia de câncer mediada por anticorpos em virtude de sua expressão seletiva (nenhuma expressão em um tecido relevante para toxicidade) e localização na membrana plasmática.
[0131] No contexto da presente invenção, as claudinas preferidas são CLDN6 e CLDN18.2. CLDN6 e CLDN18.2 foram identificadas como diferencialmente expressas em tecidos tumorais, com o único tecido normal que expressa CLDN18.2 sendo o estômago e o único tecido normal que expressa CLDN6 sendo a placenta.
[0132] CLDN18.2 é seletivamente expressa em tecidos normais em células epiteliais diferenciadas da mucosa gástrica. CLDN18.2 é expressa em cânceres de diversas origens, tais como carcinoma pancreático, carcinoma esofageal, carcinoma gástrico, carcinoma brônquico, carcinoma de mama e tumores ENT. CLDN18.2 é um alvo valioso para a prevenção e/ou tratamento de tumores primários, tais como câncer gástrico, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), câncer ovariano, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer de vesícula biliar e metástases dos mesmos, em particular metástase de câncer gástrico, tais como tumores de Krukenberg, metástase peritoneal e metástase para nódulo linfático.
[0133] Descobriu-se que CLDN6 é expressa, por exemplo, em câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer da pele, melanoma, câncer do pescoço, sarcomas, câncer do duto biliar, câncer de células renais e câncer de bexiga urinária. CLDN6 é um alvo particularmente preferido para a prevenção e/ou tratamento de câncer ovariano, em particular adenocarcinoma ovariano e teratocarcinoma ovariano, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de pequenas células (Small Cell Lung Cancer - SCLC) e câncer de pulmão de células não pequenas (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC), em particular carcinoma e adenocarcinoma de pulmão de células escamosas, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular sarcoma e carcinossarcoma sinovial, câncer do duto biliar, câncer de bexiga urinária, em particular carcinoma de células de transição e carcinoma papilar, câncer de rim, em particular carcinoma de células renais, incluindo carcinoma de células renais claras e carcinoma de células renais papilares, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumores de células germinativas, tal como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular tumores de células germinativas do testículo e as formas metastáticas dos mesmos. Em uma concretização, a doença cancerosa associada à expressão de CLDN6 é selecionada do grupo que consiste em câncer ovariano, câncer de pulmão, câncer ovariano metastático e câncer de pulmão metastático. De preferência, o câncer ovariano é um carcinoma ou um adenocarcinoma. De preferência, o câncer de pulmão é um carcinoma ou um adenocarcinoma e, de preferência, é câncer brônquico, tal como um carcinoma brônquico ou adenocarcinoma brônquico.
[0134] O termo "CLDN", conforme usado aqui, significa e inclui claudina CLDN18.2 e CLDN6. De preferência, uma claudina é uma claudina humana.
[0135] O termo "CLDN18" se refere à claudina 18 e inclui quaisquer variantes, incluindo a variante 1 de splicing de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) e a variante 2 de splicing de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)).
[0136] O termo "CLDN18.2" se refere, de preferência, à CLDN18.2 humana e, em particular, a uma proteína que compreende, de preferência que consiste em, a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1 da listagem de sequências ou uma variante da dita sequência de aminoácidos. A primeira alça extracelular de CLDN18.2 compreende, de preferência, os aminoácidos 27-81, mais preferivelmente os aminoácidos 29-78 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1. A segunda alça extracelular de CLDN18.2 compreende, de preferência, os aminoácidos 140 a 180 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1. As ditas primeira e segunda alças extracelulares formam, de preferência, a porção extracelular de CLDN18.2.
[0137] O termo "CLDN6" se refere, de preferência, à CLDN6 humana e, em particular, a uma proteína que compreende, de preferência que consiste em, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 da listagem de sequências ou uma variante da dita sequência de aminoácidos. A primeira alça extracelular de CLDN6 compreende, de preferência, os aminoácidos 28 e 80, mais preferivelmente os aminoácidos 28-76 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3. A segunda alça extracelular de CLDN6 compreende, de preferência, os aminoácidos 138 a 160, de preferência os aminoácidos 141159, mais preferivelmente os aminoácidos 145-157 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3. As ditas primeira e segunda alças extracelulares forma, de preferência, a porção extracelular de CLDN6.
[0138] O termo "variante", de acordo com a invenção se refere, em particular, a mutantes, variantes de splicing, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular aqueles os quais estão naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração na sequência normal de um gene, a significância da qual é frequentemente pouco clara. Sequenciamento gênico completo muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Um homólogo de espécie é uma sequência de ácidos nucleicos ou aminoácidos com uma espécie diferente de origem daquela de uma dada sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos. O termo "variante" abrange todas as variantes pós-traducionalmente modificadas e variantes de conformação.
[0139] A segunda molécula alvo dos agentes de ligação descritos aqui é CD3 (aglomerado de diferenciação 3). O complexo CD3 designa um antígeno que é expresso em células T humanas maduras, timócitos e um subconjunto de células assassinas naturais como parte do complexo de receptor de células T (T Cell Receptor - TCR) multimolecular. O correceptor de células T é um complexo de proteínas e é composto de quatro cadeias distintas. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3Y, uma cadeia CD3δ e duas cadeias CD3ε. Estas cadeias se associam com uma molécula conhecida como o receptor de células T (T Cell Receptor - TCR) e a cadeia Z para gerar um sinal de ativação em linfócitos T. O TCR, cadeia Z e moléculas de CD3 juntos compreendem o complexo de TCR.
[0140] A CD3 humana épsilon é indicada no número de acesso GenBank NM_000733 e compreende SEQ ID NO: 4. A CD3 humana gama é indicada no número de acesso GenBank NM 000073. A CD3 humana delta é indicada no número de acesso GenBank NM_000732. CD3 é responsável pela transdução de sinal do TCR. Conforme descrito por Lin e Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001), ativação do complexo de TCR pela ligação de epítopos antígeno específicos apresentados ao MHC resulta na fosforilação de motivos de ativação com base em tirosina de imunorreceptor (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs - ITAMs) por quinases da família Src, provocando o recrutamento de outras quinases, o que resulta em ativação de células T, incluindo liberação de Ca2+. Aglomeração de CD3 sobre as células T, por exemplo, por anticorpos anti-CD3 imobilizados, leva à ativação de células T similar ao acoplamento do receptor de células T, mas independente de sua especificidade clonal típica.
[0141] Conforme usado aqui, "CD3" inclui CD3 humana e indica um antígeno que é expresso sobre células T humanas como parte do complexo de receptor de células T multimolecular.
[0142] Em relação à CD3, o agente de ligação da invenção reconhece, de preferência, cadeia épsilon de CD3, em particular reconhece um epítopo que corresponde aos primeiros 27 aminoácidos N-terminais de CD3 épsilon ou fragmentos funcionais deste trecho de 27 aminoácidos.
[0143] De acordo com a invenção, o termo "câncer positivo para claudina" ou termos similares significa um câncer que envolve células cancerosas que expressam um claudina, de preferência, sobre a superfície das ditas células cancerosas.
[0144] "Superfície celular" é usado de acordo com seu significado normal na técnica e, assim, inclui a parte externa da célula a qual está acessível para ligação de proteínas e outras moléculas.
[0145] Uma claudina é expressa sobre a superfície de células se ela está localiza na superfície das ditas células e está acessível para ligação por anticorpos específicos para claudina adicionados às células.
[0146] O termo "porção extracelular", no contexto da presente invenção, se refere a uma parte de uma molécula, tal como uma proteína, que está voltada para o espaço extracelular de uma célula e, de preferência, é acessível a partir do exterior da dita célula, por exemplo, por moléculas de ligação a antígeno, tais como anticorpos localizados no exterior da célula. De preferência, o termo se refere a uma ou mais alças ou domínios extracelulares ou um fragmento dos mesmos.
[0147] Os termos "parte" ou "fragmento" são usados aqui alternadamente aqui e se referem a um elemento contínuo. Por exemplo, uma parte de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína, se refere a um elemento contínuo da dita estrutura. Uma porção, uma parte ou um fragmento de uma estrutura compreende, de preferência, uma ou mais propriedades funcionais da dita estrutura. Por exemplo, uma porção, uma parte ou um fragmento de um epítopo ou peptídeo é, de preferência, imunologicamente equivalente ao epítopo ou peptídeo do qual ele é derivado. Uma parte ou fragmento de uma sequência de proteína compreende, de preferência, uma sequência de pelo menos 6, em particular pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50 ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos da sequência da proteína.
[0148] De acordo com a invenção, CLDN18.2 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão é menor comparado com a expressão em células do estômago ou tecido do estômago. De preferência, o nível de expressão é menor do que 10%, de preferência menor do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressão em células do estômago ou tecido do estômago ou ainda menor. De preferência, CLDN18.2 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão excede o nível de expressão em outro tecido não canceroso que não o estômago em não mais do que 2 vezes, de preferência 1,5 vezes e, de preferência, não excede o nível de expressão no dito tecido não canceroso. De preferência, CLDN18.2 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão está abaixo do limite de detecção e/ou se o nível de expressão é muito baixo para permitir ligação por anticorpos específicos para CLDN18.2 adicionados às células.
[0149] De acordo com a invenção, CLDN18.2 é expressa em uma célula se o nível de expressão excede ao nível de expressão em outro tecido não canceroso que não o estômago, de preferência em mais de 2 vezes, de preferência 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De preferência, CLDN18.2 é expressa em uma célula se o nível de expressão está acima do limite de detecção e/ou se o nível de expressão é suficientemente alto para permitir ligação por anticorpos específicos para CLDN18.2 adicionados às células. De preferência, a CLDN18.2 expressa em uma célula é expressa ou está exposta sobre a superfície da dita célula.
[0150] De acordo com a invenção, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão é menor comparado com expressão em células da placenta ou tecido de placenta. De preferência, o nível de expressão é menor do que 10%, de preferência menor do que 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressão em células da placenta ou tecido de placenta ou mesmo menor. De preferência, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão excede o nível de expressão em outro tecido não canceroso que não a placenta em não mais do que 2 vezes, de preferência 1,5 vezes e, de preferência, não excede o nível de expressão no dito tecido não canceroso. De preferência, a CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula se o nível de expressão está abaixo do limite de detecção e/ou se o nível de expressão é muito baixo para permitir ligação por anticorpos específicos para CLDN6 adicionados às células.
[0151] De acordo com a invenção, CLDN6 é expressa em uma célula se o nível de expressão excede o nível de expressão em outro tecido não canceroso que não a placenta, de preferência em mais de 2 vezes, de preferência 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De preferência, a CLDN6 é expressa em uma célula se o nível de expressão está acima do limite de detecção e/ou se o nível de expressão é suficientemente alto para permitir ligação por anticorpos específicos para CLDN6 adicionados às células. De preferência, a CLDN6 expressa em uma célula é expressa ou está exposta sobre a superfície da dita célula.
[0152] De acordo com a invenção, o termo "doença" se refere a qualquer estado patológico, incluindo câncer, em particular aquelas formas de câncer descritas aqui. Qualquer referência aqui a câncer ou formas particulares de câncer também inclui metástase cancerosa das mesmas. Em uma concretização preferida, uma doença a ser tratada de acordo com o presente Pedido envolve células que expressam claudina (CLDN), tais como CLDN18.2 e/ou CLDN6.
[0153] "Doenças associadas a células que expressam CLDN" ou expressões similares significam, de acordo com a invenção, que CLDN é expressa em células de um tecido ou órgão doente. Em uma concretização, a expressão de CLDN em células de um tecido ou órgão doente é aumentada comparado com o estado em um tecido ou órgão saudável. Um aumento se refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10000% ou mesmo maior. Em uma concretização, expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, as doenças associadas a células que expressam CLDN incluem doenças cancerosas. Além disso, de acordo com a invenção, doenças cancerosas são, de preferência, aquelas em que as células cancerosas expressam CLDN.
[0154] Conforme usado aqui, uma "doença cancerosa" ou "câncer" inclui uma doença caracterizada por um crescimento, proliferação, diferenciação, adesão e/ou migração celular anormal regulados. Por "célula cancerosa" entenda-se uma célula anormal que cresce por meio de uma proliferação celular rápida, descontrolada e continua a crescer após os estímulos que iniciaram o novo crescimento cessarem. De preferência, uma "doença cancerosa" é caracterizada por células que expressam CLDN e uma célula cancerosa expressa CLDN. Uma célula que expressa CLDN é, de preferência, uma célula cancerosa, de preferência dos cânceres descritos aqui.
[0155] O termo "câncer", de acordo com a invenção, compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer adrenal, câncer da tiroide, câncer sanguíneo, câncer de pele, câncer cerebral, câncer cervical, câncer intestinal, câncer de fígado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrintestinal, câncer linfático, câncer esofageal, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de ouvido, nariz e garganta (Ear, Nose, Throat - ENT), câncer de mama, câncer de próstata, câncer uterino, câncer ovariano e câncer de pulmão e as metástases dos mesmos. Exemplos destes são carcinomas de pulmão, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de cólon, carcinomas de células renais, carcinomas de colo do útero ou metástases dos tipos de câncer ou tumores descritos acima. O termo câncer, de acordo com a invenção, também compreende metástases cancerosas.
[0156] De acordo com a invenção, um "carcinoma" é um tumor maligno derivado de células epiteliais. Este grupo representa os cânceres mais comuns, incluindo as formas comuns de câncer de mama, próstata, pulmão e cólon.
[0157] "Adenocarcinoma" é um câncer que se origina no tecido glandular. Este tecido é também parte de uma categoria maior de tecidos conhecida como tecido epitelial. O tecido epitelial inclui a pele, glândulas e uma variedade de outros tecidos que revestem as cavidades e órgãos do corpo. O epitélio é derivado embriologicamente do ectoderma, endoderma e mesoderma. Para ser classificado como adenocarcinoma, as células não têm necessariamente de ser parte de uma glândula, contanto que elas tenham propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo seres humanos. Adenocarcinomas bem diferenciados tendem a se assemelhar ao tecido glandular do qual eles são derivados, enquanto que adenocarcinomas pobremente diferenciados não. Através de coloração das células a partir de uma biópsia, um patologista determinará se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer. Os adenocarcinomas podem surgir em muitos tecidos do corpo em virtude da natureza abundante das glândulas dentro do corpo. Embora cada glândula possa não secretar a mesma substância, uma vez que há uma função exócrina à célula, ela é considerada glandular e a forma maligna da mesma é, portanto, denominada adenocarcinoma. Adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e muitas vezes produzem metástase dado tempo suficiente para fazê-lo. O adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de câncer de ovário. Ele inclui os adenocarcinomas seroso e mucinoso, o adenocarcinoma de células claras e o adenocarcinoma endometrioide.
[0158] Por "metástases" entenda-se a disseminação de células cancerosas de seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende de desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade corporal e vasos e, então, após serem transportadas pelo sangue, infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende da angiogênese. Metástase de tumor muitas vezes ocorre mesmo após remoção do tumor primário porque as células tumorais ou componentes podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma concretização, o termo "metástase", de acordo com a invenção, se refere a "metástase distante", a qual se refere a uma metástase que é remota do tumor primário e do sistema de nódulo linfático regional. Em uma concretização, o termo "metástase", de acordo com a invenção, se refere à metástase para os nódulos linfáticos. Uma forma particular de metástase a qual é tratável usando a terapia da invenção é a metástase originária de câncer gástrico como local primário. Em concretizações preferidas, tal metástase de câncer gástrico é um tumor de Krukenberg, metástase peritoneal e/ou metástase para nódulo linfático.
[0159] O tumor de Krukenberg é um tumor metastático incomum do ovário que responde por 1% a 2% de todos os tumores de ovário. O prognóstico do tumor de Krukenberg ainda é muito pobre e não há tratamento estabelecido para tumores de Krukenberg. O tumor de Krukenberg é um adenocarcinoma de células de anel em sinete metastático do ovário. O estômago é o local primário na maioria dos casos de tumor de Krukenberg (70%). Carcinomas do cólon, apêndice e mama (principalmente carcinoma lobular invasivo) são os próximos locais primários mais comuns. Casos raros de tumor de Krukenberg que se originam de carcinomas da vesícula biliar, trato biliar, pâncreas, intestino delgado, ampola de Vater, colo do útero e bexiga urinária/uraco foram reportados.
[0160] Por "tratar" entenda-se a administrar um composto ou uma composição ou uma combinação de compostos ou composições a um paciente a fim de prevenir ou eliminar uma doença, incluindo reduzir o tamanho de um tumor ou número de tumores em um indivíduo; interromper ou retardar uma doença em um indivíduo; inibir ou retardar o desenvolvimento de uma nova doença em um indivíduo; diminuir a frequência ou gravidade dos sintomas e/ou recorrências em um indivíduo que tem atualmente ou que já teve uma doença; e/ou prolongar, isto é, aumentar a expectativa de vida do indivíduo.
[0161] Em particular, o termo "tratamento de uma doença" inclui cura, reduzir a duração, melhorar, prevenir, retardar ou inibir a progressão ou piora ou impedir ou retardar o aparecimento de uma doença ou dos sintomas da mesma.
[0162] No contexto da presente invenção, termos tais como "proteger", "prevenir", "profilática", "prevenção" ou "protetor" se referem à prevenção ou tratamento ou ambos da ocorrência e/ou da propagação de uma doença em um indivíduo e, em particular, à minimização da possibilidade de que um indivíduo desenvolva uma doença ou retardo de desenvolvimento de uma doença. Por exemplo, uma pessoa em risco de câncer seria um candidato para terapia para prevenir câncer.
[0163] Por "estando em risco" entenda-se um indivíduo que é identificado como tendo uma maior probabilidade do que o normal de desenvolver uma doença, em particular câncer, comparado com a população em geral. Além disso, um indivíduo que teve ou que tem atualmente uma doença, em particular câncer, é um indivíduo que tem um risco aumentado de desenvolvimento de uma doença, uma vez que tal indivíduo pode continuar a desenvolver uma doença. Indivíduos que têm atualmente ou que tiveram um câncer também têm um risco aumentado de metástases de câncer.
[0164] O termo "paciente" significa, de acordo com a invenção, um indivíduo para tratamento, em particular um indivíduo doente, incluindo seres humanos, primatas não humanos ou outros animais, principalmente mamíferos, tais como vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos ou roedores, tais como camundongos e ratos. Em uma concretização particularmente preferida, um paciente é um ser humano.
[0165] "Célula alvo" significará qualquer célula indesejável, como uma célula cancerosa. Em concretizações preferidas, a célula alvo expressa CLDN.
[0166] O termo "antígeno" se refere a um agente, tal como uma proteína ou peptídeo, que compreende um epítopo contra o qual uma resposta imune é dirigida e/ou está sendo dirigida. Em uma concretização preferida, um antígeno é um antígeno associado a tumor, tal como CLDN18.2 ou CLDN6, isto é, um constituinte de células cancerosas o qual pode ser derivado do citoplasma, da superfície celular e do núcleo celular, em particular aqueles antígenos os quais são produzidos, de preferência em grande quantidade, intracelularmente ou como antígenos sobre a superfície de células cancerosas.
[0167] No contexto da presente invenção, o termo "antígeno associado a tumor" se refere, de preferência, a proteínas que são, sob condições normais, especificamente expressas em um número limitado de tecidos e/ou órgãos ou em fases específicas do desenvolvimento e são expressas ou anormalmente expressas em um ou mais tecidos tumorais ou cancerosos. No contexto da presente invenção, o antígeno associado a tumor está, de preferência, associado à superfície celular de uma célula cancerosa e, de preferência, não é ou apenas raramente expresso em tecidos normais.
[0168] O termo "epítopo" se refere a um determinante antigênico em uma molécula, isto é, à parte de uma molécula que é reconhecida pelo sistema imune, por exemplo, que é reconhecida por um anticorpo. Por exemplo, epítopos são os sítios distintos tridimensionais sobre um antígeno os quais são reconhecidos pelo sistema imune. Os epítopos consistem normalmente em agrupamentos na superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação ao primeiro, mas não ao último, é perdida na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo de uma proteína compreende, de preferência, uma porção contínua ou descontínua da dita proteína e tem, de preferência, entre 5 e 100, de preferência entre 5 e 50, mais preferivelmente entre 8 e 30, ainda mais preferivelmente entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ter, de preferência, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento.
[0169] O termo "anticorpo" se refere a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por pontes de dissulfeto. O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade designadas regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas denominadas regiões de estrutura (FR - framework structures). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas, do terminal amino para o terminal carboxila, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis de cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetuadoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico.
[0170] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, se refere a um preparado de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Um anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade de ligação e afinidade. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano, por exemplo, camundongo, fundido a uma célula imortalizada.
[0171] O termo "anticorpo recombinante", conforme usado aqui, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como: (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico em relação a genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos recombinante, combinatória e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvem splicing de sequências de genes de imunoglobulina a outras sequências de DNA.
[0172] O termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, se destina a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo).
[0173] O termo "anticorpo humanizado" se refere a uma molécula contendo um sítio de ligação a antígeno que é substancialmente derivado de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, em que a estrutura de imunoglobulina restante da molécula é baseada na estrutura e/ou sequência de uma imunoglobulina humana . O sítio de ligação a antígeno pode compreender domínios variáveis completos fundidos a domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR) enxertadas em regiões de estrutura adequadas nos domínios variáveis. Sítios de ligação a antígeno podem ser de tipo selvagem ou modificados por substituições de um ou mais aminoácidos, por exemplo, modificados para se parecer mais com imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado o qual contém todas as seis CDRs do anticorpo de camundongo). Outras formas têm uma ou mais CDRs que são alteradas em relação ao anticorpo original.
[0174] O termo "anticorpo quimérico" se refere a anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma determinada classe correspondente, enquanto que o segmento restante da cadeia é homólogo às sequências correspondentes em outra. Tipicamente, a região variável tanto das cadeias leves quanto pesadas imita as regiões variáveis de anticorpos derivadas de uma espécie de mamífero, enquanto que as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivadas de outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que a região variável pode, convenientemente, ser derivada de fontes presentemente conhecidas usando células B ou hibridomas prontamente disponíveis de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparados de células humanas. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparo e a especificidade não seja afetada pela fonte, é menos provável que uma resposta imune seja provocada em um indivíduo humano quando a região constante é humana quando os anticorpos são injetados do que a região constante de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular.
[0175] Anticorpos podem ser derivados de diferentes espécies incluindo, porém sem limitações, camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia e ser humano.
[0176] Os anticorpos descritos aqui incluem anticorpos de IgA, tais como IgA1 ou IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. Em várias concretizações, o anticorpo é um anticorpo de IgG1, mais particularmente um anticorpo de IgG1 isotipo kapa ou lambda (isto é, IgG1, K, À), um anticorpo de IgG2a (por exemplo, IgG2α, K, À), um anticorpo de IgG2b (por exemplo, IgG2β, K, À), um anticorpo de IgG3 (por exemplo, IgG3 k, À) ou um anticorpo de IgG4 (por exemplo, IgG4 k, À).
[0177] Conforme usado aqui, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação a um organismo transgênico que produz tal anticorpo. Este termo se refere a um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos de codificação que corresponde àquela encontrada em um organismo que não consiste no organismo transgênico e sendo geralmente derivada de uma outra espécie que não o organismo transgênico.
[0178] Conforme usado aqui, um "anticorpo hetero- híbrido" se refere a um anticorpo tendo cadeias leves e pesadas de diferentes organismos fonte. Por exemplo, um anticorpo tendo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve de murino é um anticorpo hetero-híbrido.
[0179] Os anticorpos descritos aqui são, de preferência, isolados. Um "anticorpo isolado", conforme usado aqui, se destina a referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à CLDN18.2 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antígenos que não CLDN18.2). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de CLDN18.2 humana pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécies de CLDN18.2). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos. Em uma concretização da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" se refere a anticorpos que têm diferentes especificidades e são combinados em uma composição ou mistura bem definida.
[0180] Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação") ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "fragmento de ligação") ou termos similares se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem nos domínios VL, VH, CL e CH;(11) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) fragmentos Fd, os quais consistem nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv, os quais consistem nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) fragmentos dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), os quais consistem em um domínio VH; (vi) regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR) isoladas e (vii) combinações de duas ou mais CDR isoladas que podem, opcionalmente, ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma única cadeia de proteína, na qual as regiões VH e VL emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv com uma única cadeia (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos com uma única cadeia também se destinam a ser abrangidos no termo "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo. Um outro exemplo são proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídeo com domínio de ligação que é fundido com um polipeptídeo da região de dobradiça de imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de dobradiça e (iii) uma região constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina fundida à região constante CH2. O polipeptídeo com domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. Proteínas de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação são ainda descritas nos documentos US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica e os fragmentos são rastreados, quanto à utilidade, da mesma maneira conforme anticorpos intactos.
[0181] O termo "domínio de ligação" caracteriza, em relação à presente invenção, uma estrutura, por exemplo, de um anticorpo, a qual se liga a/interage com uma dada estrutura/antígeno/epítopo alvo. Assim, o domínio de ligação, de acordo com a invenção, designa um "sítio de interação antigênico".
[0182] Todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tais como fragmentos de anticorpo conforme descrito aqui, para fins da presente invenção, são abrangidos pelo termo "anticorpo". O termo "derivados de anticorpos" se refere a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjugado de anticorpo e outro agente ou anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Além disso, os anticorpos e derivados de anticorpos, conforme descrito aqui, são úteis para produção de agentes de ligação da invenção, tais como fragmentos de anticorpos.
[0183] Anticorpos que ocorrem naturalmente são geralmente monoespecíficos, isto é, eles se ligam a um único antígeno. A presente invenção fornece agentes de ligação que se ligam a uma célula citotóxica (por meio de acoplamento ao receptor de CD3) e uma célula cancerosa (por meio de acoplamento à CLDN). Os agentes de ligação da presente invenção são pelo menos biespecíficos ou multiespecíficos, tal como triespecíficos, tetraespecíficos e assim por diante.
[0184] O agente de ligação da invenção pode estar na forma de uma molécula de anticorpo ou uma molécula de tipo anticorpo ou um esqueleto de proteína com propriedades de tipo anticorpo ou um peptídeo cíclico com pelo menos duas especificidades de ligação. Assim, o agente de ligação pode compreender um ou mais anticorpos conforme descrito aqui ou fragmentos dos mesmos.
[0185] De acordo com a invenção, uma molécula biespecífica, em particular uma proteína biespecífica, tal como um anticorpo biespecífico, é uma molécula que tem duas especificidades de ligação diferentes e, assim, pode se ligar a dois tipos diferentes de antígenos, tais como CLDN e CD3. Em particular, o termo "anticorpo biespecífico", conforme usado aqui, se refere a um anticorpo compreendendo dois sítios de ligação a antígeno, um primeiro sítio de ligação tendo afinidade por um primeiro antígeno ou epítopo e um segundo sítio de ligação tendo afinidade de ligação por um segundo antígeno ou epítopo distinto do primeiro. Em particular, um anticorpo biespecífico é uma proteína artificial que é composta de fragmentos de dois anticorpos diferentes (os ditos fragmentos de dois anticorpos diferentes formando dois domínios de ligação) e, consequentemente, se liga a dois tipos diferentes de antígenos. Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é manipulado para se ligar simultaneamente a uma célula imune, tal como uma célula efetuadora imune, em particular uma célula T, tal como uma célula citotóxica (através de ligação à CD3) e uma célula alvo, tal como uma célula cancerosa (através de ligação ao antígeno associado a tumor CLDN), a ser destruída.
[0186] O termo "anticorpo biespecífico" também inclui diacorpos. Diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas usando um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, deste modo, forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação a antígeno (vide, por exemplo, Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
[0187] "Agentes de ligação multiespecíficos" são moléculas que têm mais de duas especificidades de ligação diferentes.
[0188] Particularmente preferidos de acordo com a invenção são anticorpos biespecíficos, incluindo fragmentos de anticorpos biespecíficos, em particular anticorpos biespecíficos com uma única cadeia, incluindo fragmentos de anticorpos biespecíficos com uma única cadeia. O termo "anticorpo biespecífico com uma única cadeia" indica uma única cadeia polipeptídica que compreende dois domínios de ligação. Em particular, o termo "anticorpo biespecífico com uma única cadeia" ou "anticorpo com uma única cadeia biespecífico " ou termos relacionados de acordo com a presente invenção significam, de preferência, estruturas de anticorpos resultantes da união de pelo menos duas regiões variáveis de anticorpo em uma única cadeia polipeptídica desprovida da(s) porção(ões) constante e/ou Fc presente(s) em imunoglobulinas completas.
[0189] Por exemplo, um anticorpo com uma única cadeia biespecífico pode ser um construto com um total de duas regiões variáveis de anticorpo, por exemplo, duas regiões VH, cada uma capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado e conectadas uma à outra através de um espaçador polipeptídico curto, de modo que as duas regiões variáveis de anticorpo com seu espaçador interposto existam como uma única cadeia polipeptídica contígua. Outro exemplo de um anticorpo com uma única cadeia biespecífico pode ser uma única cadeia polipeptídica com três regiões variáveis de anticorpos. Aqui, duas regiões variáveis de anticorpos, por exemplo, uma VH e uma VL, podem se tornar um scFv, em que as duas regiões variáveis de anticorpo são conectadas uma à outra através de um ligante polipeptídico sintético, o último muitas vezes sendo geneticamente manipulado de modo a ser minimamente imunogênico, ao mesmo tempo em que permanece maximamente resistentes à proteólise. Este scFv é capaz de se ligar especificamente a um antígeno particular e está conectado a uma outra região variável de anticorpo, por exemplo, uma região VH, capaz de se ligar a um antígeno diferente daquele que é ligado pelo scFv. Ainda outro exemplo de um anticorpo com uma única cadeia biespecífico pode ser um polipeptídeo com uma única cadeia com as quatro regiões variáveis de anticorpo. Aqui, as duas primeiras regiões variáveis de anticorpo, por exemplo, uma região VH e uma região VL, podem formar um scFv capaz de se ligar a um antígeno, enquanto que a segunda região VH e região VL podem formar um segundo scFv capaz de se ligar a outro antígeno. Dentro de uma única cadeia polipeptídica contígua, as regiões variáveis de anticorpo individuais de uma especificidade podem, vantajosamente, ser separadas por um ligante polipeptídico sintético, enquanto que os respectivos scFvs podem, vantajosamente, ser separados por um espaçador polipeptídico curto, conforme descrito acima.
[0190] De acordo com uma concretização da invenção, o primeiro domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreende um domínio variável de anticorpo, de preferência um domínio VHH. De acordo com uma concretização da invenção, o primeiro domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreende dois domínios variáveis de anticorpo, de preferência um scFv, isto é, VH-VL ou VL-VH. De acordo com uma concretização da invenção, o segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreende um domínio variável de anticorpo, de preferência um domínio VHH. De acordo com uma concretização da invenção, o segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreende dois domínios variáveis de anticorpo, de preferência um scFv isto é, VH-VL ou VL-VH. Em sua forma mínima, o número total de regiões variáveis de anticorpo no anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é, assim, apenas dois. Por exemplo, tal anticorpo poderia compreender dois domínios VH ou VHH.
[0191] De acordo com uma concretização da invenção, o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreendem, cada um, um domínio variável de anticorpo, de preferência um domínio VHH. De acordo com uma concretização da invenção, o primeiro domínio de ligação e o segundo domínio de ligação do anticorpo biespecífico compreendem, cada um, dois domínios variáveis de anticorpo, de preferência um scFv, isto é, VH-VL ou VL-VH. Nesta concretização, o agente de ligação da invenção compreende, de preferência (i) um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um anticorpo à CLDN, (ii) um domínio variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo à CLDN, (iii) um domínio variável de cadeia pesada (VH) de um anticorpo à CD3 e (iv) um domínio variável de cadeia leve (VL) de um anticorpo à CD3.
[0192] Anticorpos biespecíficos de comprimento completo podem ser obtidos por meio de ligação covalente de dois anticorpos monoclonais ou através de técnicas de híbrido-hibridoma convencionais. Ligação covalente de dois anticorpos monoclonais é descrita em Anderson, Blood 80 (1992), 2826-34. No contexto da presente invenção, um dos anticorpos é específico para CLDN e o outro para CD3.
[0193] Em uma concretização, o agente de ligação biespecífico está no formato de uma molécula de tipo anticorpo com uma cadeia pesada contendo os dois domínios variáveis consecutivos N-terminais com diferentes especificidades e uma cadeia leve com dois domínios variáveis consecutivos com diferentes especificidades, resultando em quatro domínios de ligação com duas especificidades diferentes (Wu et al., Nat. Biotechnology, 2007, 25 (11)), em que uma especificidade é pela CD3 e a outra especificidade é pela CLDN.
[0194] Em uma concretização preferida, o agente de ligação biespecífico da invenção está no formato de um fragmento de anticorpo.
[0195] Em uma concretização, as moléculas biespecíficas de acordo com a invenção compreendem duas regiões Fab, uma sendo dirigida contra uma CLDN e a outra sendo dirigida contra CD3. Em uma concretização, a molécula da presente invenção é um complexo de fragmento de ligação a antígeno (Fab)2. O complexo de Fab2 é composto por dois fragmentos Fab, um fragmento Fab compreendendo um domínio Fv, isto é, os domínios VH e VL, específico para um antígeno CD3, e o outro fragmento Fab compreendendo um domínio Fv específico para CLDN. Cada um dos fragmentos Fab pode ser composto de duas cadeias únicas, um módulo VL-CL e um módulo VH-CH. Alternativamente, cada um dos fragmentos Fab individuais pode ser arranjado em uma única cadeia, de preferência, VL-CL-CH-VH, e os domínios variáveis e constantes individuais podem ser ligados com um ligante peptídico. Em geral, as cadeias únicas individuais e fragmentos Fab podem ser ligados através de ligações de dissulfeto, domínios adesivos, quimicamente ligados e/ou através de um ligante peptídico. A molécula biespecífica pode também compreender mais de dois fragmentos Fab, em particular, a molécula pode ser um Fab3, Fab4 ou um complexo multimérico de Fab com especificidade por 2, 3, 4 ou mais antígenos diferentes. A invenção também inclui Fabs quimicamente ligados.
[0196] Em uma concretização, o agente de ligação de acordo com a invenção inclui vários tipos de fragmentos variáveis com uma única cadeia bivalentes e trivalentes (scFvs), proteínas de fusão que imitam os domínios variáveis de dois anticorpos. Um fragmento variável com uma única cadeia (scFv) é uma proteína de fusão das regiões variáveis de cadeias pesadas (VH) e cadeias leves (VL) de imunoglobulinas conectadas com um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é, em geral, rico em glicina para flexibilidade, bem como resíduos de serina ou treonina para solubilidade, e pode conectar o N-término da VH com o C-término da VL ou vice-versa. Fragmentos variáveis com uma única cadeia divalentes (ou bivalentes) (di-scFvs, bi-scFvs) podem ser manipulados ao unir dois scFvs. Isto pode ser feito através da produção de uma única cadeia peptídica com duas regiões VH e duas VL, proporcionando scFvs contíguos. A invenção também inclui moléculas multiespecíficas que compreendem mais de dois domínios de ligação de scFv. Isto torna possível que a molécula compreenda múltiplas especificidades antigênicas e seja uma molécula triespecífica, tetraespecífica ou multiespecífica ou a molécula é uma molécula biespecífica compreendendo mais de um domínio de ligação de scFv com especificidade pelo mesmo antígeno. Em particular, a molécula da presente invenção pode ser um Fv com uma única cadeia multiespecífico.
[0197] Outra possibilidade é a criação de scFvs com peptídeos ligantes que são muito curtos para que as duas regiões variáveis dobrem juntas (cerca de cinco aminoácidos), forçando os scFvs a dimerizar. Este tipo é conhecido como diacorpos. Ligantes ainda mais curtos (um ou dois aminoácidos) levam à formação de trímeros, denominados triacorpos ou tricorpos. Tetracorpos também foram produzidos. Eles exibem uma afinidade ainda maior por seus alvos do que diacorpos.
[0198] Um exemplo particularmente preferido de um fragmento de anticorpo biespecífico é um diacorpo (Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772) o qual é um pequeno fragmento de anticorpo bivalente e biespecífico. Diacorpos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) sobre a mesma cadeia polipeptídica (VH-VL) conectado por um ligante peptídico que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Isto obriga o emparelhamento com os domínios complementares de outra cadeia e promove a montagem de uma molécula dimérica com dois sítios de ligação a antígeno funcionais. Para construir os diacorpos biespecíficos da presente invenção, os domínios V de um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CLDN podem ser fundidos para criar as duas cadeias VH(CD3)-VL(CLDN), VH(CLDN)-VL(CD3). Cada cadeia em si não é capaz de se ligar ao respectivo antígeno, mas recria os sítios de ligação a antígeno funcionais de um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CLDN quando de emparelhamento com a outra cadeia. Para esta finalidade, um ligante peptídico que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia é usado. As duas moléculas de scFv, com um ligante entre o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve que é muito curto para dimerização intramolecular, são coexpressas e se auto arranjam para formar moléculas biespecíficas com os dois sítios de ligação em extremidades opostas.
[0199] Em uma concretização, a molécula multiespecífica de acordo com a invenção compreende os domínios variáveis (VH, VL) e constantes (C) de imunoglobulinas. Em uma concretização, a molécula biespecífica é um minicorpo, de preferência, um minicorpo compreendendo duas cadeias únicas VH-VL-C que estão conectadas uma à outra através dos domínios constantes (C) de cada cadeia. De acordo com este aspecto, as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) correspondentes, as regiões variáveis de cadeia leve (VL) e os domínios constantes (C) são arranjados, do N-término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)-(C) e VH(CD3)-VL(CD3)-C, em que C é, de preferência, um domínio CH3. O emparelhamento dos domínios constantes resulta na formação do minicorpo.
[0200] De acordo com outro aspecto particularmente preferido, o agente de ligação biespecífico da invenção está no formato de um construto de anticorpo com uma única cadeia biespecífico, pelo que o dito construto compreende ou consiste em pelo menos dois domínios de ligação, em que um dos ditos domínios se liga à CLDN e um segundo domínio se liga à CD3. Tais moléculas, também denominadas "agentes de acoplamento à células T biespecíficos" (BiTEs; o termo se refere apenas a moléculas biespecíficas, das quais um braço é específico para CD3), consistem em duas moléculas de scFv conectadas através de um peptídeo ligante.
[0201] Conforme usado aqui, um "anticorpo biespecífico com uma única cadeia" indica uma cadeia polipeptídica única que compreende dois domínios de ligação. Cada domínio de ligação compreende uma região variável de uma cadeia pesada de anticorpo ("região VH"), em que a região VH do primeiro domínio de ligação se liga especificamente à CLDN e a região VH do segundo domínio de ligação se liga especificamente à CD3. Os dois domínios de ligação são opcionalmente ligados um ao outro por um espaçador polipeptídico curto. Um exemplo não limitativo de um espaçador polipeptídico é Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) e repetições do mesmo. Cada domínio de ligação pode compreender, adicionalmente, uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo ("região VL"), as regiões VH e VL dentro de cada um dos primeiro e segundo domínios de ligação sendo ligadas umas às outras através de um ligante polipeptídico longo o bastante para permitir que a região VH e a região VL do primeiro domínio de ligação e a região VH e a região VL do segundo domínio de ligação emparelhem umas às outras.
[0202] De acordo com este aspecto, as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) correspondentes e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão dispostas, do N-término para o C-término, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)—VL(CD3)- VH(CLDN)-VL(CLDN) or VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CLDN)-VH(CLDN). No entanto, considera-se também que os anticorpos com uma única cadeia biespecíficos da invenção compreendam outras configurações de domínios, tais como VL(CLDN)-VH(CLDN)- VH(CD3)-VL(CD3), VL(CLDN)—VH(CLDN)—VL(CD3)—VH(CD3),VH(CLDN)-VL(CLDN)-VL(CD3)-VH(CD3), VL(CD3)—VH(CD3)- VH(CLDN)-VL(CLDN), VL(CD3)—VH(CD3)—VL(CLDN)—VH(CLDN).
[0203] Um ligante longo geralmente conecta as regiões de cadeia pesada variável (VH) correspondentes e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes para criar um domínio de ligação de scFv, enquanto que um ligante curto geralmente conecta dois domínios de ligação de scFv. O ligante é, em geral, concebido para conferir flexibilidade e resistência à protease e, de preferência, o ligante compreende os resíduos de aminoácido glicina e/ou serina. Ligantes peptídicos curtos podem consistir em 12 ou menos, tal como 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 aminoácidos e, de preferência, 5 ou 6 aminoácidos. Ligantes peptídicos curtos compreendem, de preferência, as sequências de aminoácidos SGGGGS ou GGGGS. Ligantes peptídicos longos podem consistir em 12 ou mais, tal como 15 a 25 ou 15 a 20 ou 15 a 18 aminoácidos. Ligantes peptídicos longos compreendem, de preferência, as sequências de aminoácidos (GGGGS)3 ou VE(GGSGGS)2GGVD. Outros ligantes peptídicos longos podem compreender as sequências de aminoácidos (GGGGS)4, (GGGGS)5 ou GGGGS(GGS)3GGGS.
[0204] Agentes de ligação de acordo com a invenção podem também compreender uma sequência de aminoácidos para facilitar a secreção da molécula, tal como um sinal de secreção N-terminal, e/ou um ou mais marcadores de epítopo facilitar a ligação, detecção ou purificação da molécula.
[0205] De preferência, o sinal de secreção é uma sequência sinalizadora (por exemplo, selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55) que permite uma passagem suficiente através da via de secreção e/ou secreção do agente de ligação para o ambiente extracelular. De preferência, a sequência sinalizadora de secreção é clivada e é removida do agente de ligação maduro. A sequência sinalizadora de secreção é, de preferência, escolhida em relação à célula ou organismo no qual o agente de ligação é produzido.
[0206] A sequência de aminoácidos de um marcador epitópico pode ser introduzida em qualquer posição dentro da sequência de aminoácidos do agente de ligação e pode tomar a forma de uma alça dentro da estrutura da proteína codificada ou pode ser N-terminal ou C-terminalmente fundido ao agente de ligação. De preferência, o marcador epitópico é C-terminalmente fundido ao agente de ligação. O marcador epitópico pode conter um sítio de clivagem que permite remoção do marcador do agente de ligação. O dito marcador epitópico pode ser qualquer tipo de marcador epitópico que é funcional sob condições nativas e/ou desnaturantes, de preferência um marcador de histidina, mais preferivelmente um marcador que compreende seis histidinas.
[0207] O agente de ligação biespecífico da invenção pode conter, além dos ditos primeiro e segundo domínios de ligação, um domínio de ligação adicional que serve, por exemplo, para melhorar a seletividade por células tumorais. Isto pode ser conseguido, por exemplo, fornecendo domínios de ligação que se ligam a outros antígenos expressos em células tumorais.
[0208] No contexto da presente invenção, os agentes de ligação gerados são, de preferência, capazes de desencadear funções efetuadoras imunes, conforme descrito aqui. De preferência, as ditas funções efetuadoras imunes são dirigidas contra as células que trazem o antígeno associado a tumor CLDN sobre sua superfície.
[0209] O termo "funções efetuadoras imunes", no contexto da presente invenção, inclui todas as funções mediadas por componentes do sistema imune que resultam, por exemplo, na inibição de crescimento do tumor e/ou inibição de desenvolvimento do tumor, incluindo inibição de disseminação de tumores e metástases. De preferência, as funções efetuadoras imunes resultam na morte de células tumorais. Tais funções compreendem citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity - ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (Antibody Dependent Cellular Phagocytosis - ADCP), indução de apoptose nas células que trazem o antígeno associado a tumor, citólise de células que trazem o antígeno associado a tumor e/ou inibição de proliferação de células que trazem o antígeno associado a tumor. Os agentes de ligação também podem exercer um efeito simplesmente pela ligação a antígenos associados a tumor sobre a superfície de uma célula cancerosa. Por exemplo, anticorpos podem bloquear a função do antígeno associado a tumor ou induzir à apoptose ao se ligar apenas ao antígeno associado a tumor sobre a superfície de uma célula cancerosa.
[0210] Os agentes de ligação descritos aqui podem ser conjugados a uma porção terapêutica ou agente, tal como uma citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para e, em particular, mata células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos adequados para formação de conjugados incluem, porém sem limitações, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC) e agentes antimitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Em uma concretização preferida, o agente terapêutico é um agente citotóxico ou um agente radiotóxico. Em outra concretização, o agente terapêutico é um imunossupressor. Em ainda outra concretização, o agente terapêutico é GM-CSF. Em uma concretização preferida, o agente terapêutico é doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.
[0211] Os agentes de ligação podem também ser conjugados a um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio- 90 ou índio-111, para gerar produtos radiofarmacêuticos citotóxicos.
[0212] Técnicas para conjugação de tais porções terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas; vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results and Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), páginas 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation and Cytotoxic Properties of AntibodyToxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
[0213] O termo "ligação", de acordo com a invenção se refere, de preferência, a uma ligação específica.
[0214] De acordo com a presente invenção, um agente, tal como um anticorpo, é capaz de se ligar a um alvo predeterminado se ele tem uma afinidade significativa pelo dito alvo predeterminado e se liga ao dito alvo predeterminado em ensaios convencionais. A "afinidade" ou "afinidade de ligação" é, muitas vezes, medida pela constante de dissociação em equilíbrio (KD). De preferência, o termo "afinidade significativa" se refere à ligação a um alvo predeterminado com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 M ou menor, 10-6 M ou menor, 10-7 M ou menor, 10-8 M ou menor, 10-9 M ou menor, 10-10 M ou menor, 10-11 M ou menor ou 10-12 M ou menor.
[0215] Um agente não é capaz de se ligar (substancialmente) a um alvo se ele não tem uma afinidade significativa pelo dito alvo e não se liga significativamente, em particular não se liga detectavelmente, ao dito alvo, em ensaios convencionais. De preferência, o agente não se liga detectavelmente ao dito alvo se ele está presente em uma concentração de até 2, de preferência 10, mais preferivelmente 20, em particular 50 ou 100 μg/ml ou maior. De preferência, um agente não tem afinidade significativa por um alvo se ele se liga ao dito alvo com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes maior do que a KD para ligação ao alvo predeterminado ao qual o agente é capaz de se ligar. Por exemplo, se a KD para ligação de um agente ao alvo ao qual o agente é capaz de se ligar é de 10-7 M, a KD para ligação a um alvo ao qual o agente não tem afinidade significativa seria de pelo menos 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M ou 10-1 M.
[0216] Um agente, tal como um anticorpo, é específico para um alvo predeterminado se ele é capaz de se ligar ao dito alvo predeterminado, embora não seja capaz de se ligar a outros alvos, isto é, não tem qualquer afinidade significativa por outros alvos e não se liga significativamente a outros alvos em ensaios convencionais. De acordo com a invenção, um agente é específico para CLDN se ele é capaz de se ligar à CLDN, mas não é (substancialmente) capaz de se ligar a outros alvos. De preferência, um agente é específico para CLDN se a afinidade por e a ligação a estes outros alvos não excede significativamente a afinidade ou ligação a proteínas não relacionadas à CLDN, tais como albumina sérica bovina (Bovine Serum Albumin - BSA), caseína, albumina sérica humana (Human Serum Albumin - HSA) ou proteínas transmembrana que não claudina, tais como moléculas do MHC ou receptor de transferrina ou qualquer outro polipeptídeo especificado. De preferência, um agente é específico para um alvo predeterminado se ele se liga ao dito alvo com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes menor do que a KD para ligação a um alvo para o qual ele não é específico. Por exemplo, se a KD para ligação de um agente ao alvo para o qual ele é específico é de 10-7 M, a KD para ligação a um alvo para o qual ele não é específico seria de pelo menos 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M ou 10-1 M.
[0217] A ligação de um agente a um alvo pode ser determinada experimentalmente usando qualquer modo adequado; vide, por exemplo, Berzofsky et al., "AntibodyAntigen Interactions" em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) e os métodos descritos no mesmo. As afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise em equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000 empregando procedimentos gerais definidos pelo fabricante; através de radioimunoensaio usando o antígeno alvo radioativamente marcado; ou qualquer outro método conhecido por aqueles versados na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann NY Acad. Sci., 51: 660 (1949). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antígeno particular pode variar se medida sob diferentes condições, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno, por exemplo, KD, IC50 são, de preferência, feitas com soluções de anticorpo e antígeno e um tampão padronizados.
[0218] Conforme usado aqui, "isotipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgG1) que é codificada por genes da região constante de cadeia pesada.
[0219] Conforme usado aqui, "troca de isotipo" se refere o fenômeno pelo qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe de Ig para uma das outras classes de Ig.
[0220] O termo "de ocorrência natural", conforme usado aqui, quando aplicado a um objeto, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e a qual não foi intencionalmente modificada pelo homem em laboratório é de ocorrência natural.
[0221] O termo "rearranjada", conforme usado aqui, se refere a uma configuração de um locus de cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J ou em uma conformação que codifica essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Um locus de genes de imunoglobulina rearranjado (anticorpo) pode ser identificados através de comparação com o DNA de linhagem germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia heptamérico/nonamérico recombinado.
[0222] O termo "não rearranjado" ou "configuração de linhagem germinativa", conforme usado aqui em referência a um segmento V, se refere à configuração na qual o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
[0223] Em uma concretização, um agente de ligação da invenção tem a capacidade de se ligar à CLDN18.2, isto é, a capacidade de se ligar a um epítopo presente em CLDN18.2, de preferência um epítopo localizado dentro dos domínios extracelulares de CLDN18.2, em particular a primeira alça extracelular, de preferência as posições de aminoácidos 29 a 78 de CLDN18.2. Em concretizações particulares, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 se liga a um epítopo sobre a CLDN18.2 que não está presente sobre a CLDN18.1.
[0224] Um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 se liga, de preferência, à CLDN18.2, mas não à CLDN18.1. De preferência, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 é específico para CLDN18.2. De preferência, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 se liga à CLDN18.2 expressa sobre a superfície celular. Em concretizações preferidas particulares, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 se liga a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes sobre a superfície de células vivas.
[0225] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9, 10 e um fragmento das mesmas.
[0226] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e um fragmento das mesmas.
[0227] Em determinadas concretizações preferidas, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 compreende uma combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionada das possibilidades (i) a (ix) a seguir:(i) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 ou um fragmento da mesma, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11 ou um fragmento da mesma, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 13 ou um fragmento da mesma, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 9 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16 ou um fragmento da mesma, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 ou um fragmento da mesma, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 17 ou um fragmento da mesma, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18 ou um fragmento da mesma, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 19 ou um fragmento da mesma.
[0228] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0229] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 15 ou um fragmento da mesma.
[0230] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN18.2 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0231] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 11 ou um fragmento da mesma.
[0232] O termo "fragmento" se refere, em particular, a uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR), de preferência pelo menos a região variável de CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL). Em uma concretização, as ditas ums ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são selecionadas de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3. Em uma concretização particularmente preferida, o termo "fragmento" se refere às regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL).
[0233] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende a dita CDR juntamente com as suas regiões de estruturas intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas as primeira e quarta regiões de estrutura, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de estrutura e os 50% N- terminais da quarta região de estrutura. Construção de agentes ligantes feitos por meio de técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais nas regiões variáveis codificadas pelos ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir regiões variáveis da invenção a outras sequências de proteína, incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína.
[0234] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende as ditas CDRs em uma estrutura de anticorpo humano.
[0235] Em uma concretização, um agente de ligação da invenção tem a capacidade de se ligar à CLDN6 isto é, a capacidade de se ligar a um epítopo presente na CLDN6, de preferência um epítopo localizado dentro dos domínios extracelulares de CLDN6, em particular a primeira alça extracelular, de preferência as posições de aminoácidos 28 a 76 de CLDN6, ou a segunda alça extracelular, de preferência as posições de aminoácidos 141 a 159 de CLDN6. Em concretizações particulares, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga a um epítopo sobre a CLDN6 o qual não está presente na CLDN9. De preferência, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga a um epítopo sobre a CLDN6 o qual não está presente em CLDN4 e/ou CLDN3. Mais preferivelmente, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga a um epítopo sobre a CLDN6 o qual não está presente em uma outra proteína CLDN que não CLDN6.
[0236] Um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga, de preferência, à CLDN6, mas não à CLDN9 e, de preferência, não se liga à CLDN4 e/ou CLDN3. De preferência, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 é específica para CLDN6. De preferência, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga à CLDN6 expressa sobre a superfície celular. Em concretizações preferidas particulares, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 se liga a epítopos nativos de CLDN6 presentes sobre a superfície de células vivas.
[0237] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26 e um fragmento das mesmas.
[0238] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 27, 28, 29, 97, 98, 99, 100 e um fragmento das mesmas.
[0239] Em determinadas concretizações preferidas, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende uma combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionada das possibilidades (i) a (xi) a seguir: (x) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21 ou um fragmento da mesma, (xi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 ou um fragmento da mesma, (xii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 24 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 25 ou um fragmento da mesma, (xiii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 26 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 27 ou um fragmento da mesma, (xiv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 21 ou um fragmento da mesma, (xv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28 ou um fragmento da mesma, (xvi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 29 ou um fragmento da mesma, (xvii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 97 ou um fragmento da mesma, (xviii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 98 ou um fragmento da mesma, (xix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 ou um fragmento da mesma, (xx) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 100 ou um fragmento da mesma.
[0240] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0241] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 23 ou um fragmento da mesma.
[0242] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0243] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 97 ou um fragmento da mesma.
[0244] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0245] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 98 ou um fragmento da mesma.
[0246] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0247] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 ou um fragmento da mesma.
[0248] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0249] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 100 ou um fragmento da mesma.
[0250] O termo "fragmento" se refere, em particular, a uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR), de preferência pelo menos a região variável de CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL). Em uma concretização, as ditas umas ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são selecionadas de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3. Em uma concretização particularmente preferida, o termo "fragmento" se refere às regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL).
[0251] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende a dita CDR juntamente com as suas regiões de estrutura intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas as primeira e quarta regiões de estrutura, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de estrutura e os 50% N- terminais da quarta região de estrutura. Construção de agentes ligantes feitos por meio de técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais nas regiões variáveis codificadas pelos ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir regiões variáveis da invenção a outras sequências de proteína, incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína.
[0252] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende as ditas CDRs em uma estrutura de anticorpo humano.
[0253] Anticorpos anti-CD3 os quais são úteis para fornecimento de agentes ligantes de acordo com a invenção incluem, porém sem limitações, UCHT1-HS (mAb humanizado), UCHT1-MM (mAb de murino), CLB-T3, TR66, 145-2C11.
[0254] UCHT1 é um anticorpo monoclonal de IgG1 anti-CD3 o qual detecta CD3 em tipos de amostras humanas e de primatas. CLB-T3 é um anticorpo monoclonal anti-CD3 o qual é dirigido contra o antígeno CD3 e reage com 80-90% de linfócitos T periféricos humanos e timócitos medulares. TR66 é um anticorpo monoclonal de IgG1 de camundongo anti- CD3 o qual reconhece a cadeia épsilon de CD3 humana. 1452C11 é um anticorpo monoclonal anti-CD3 de camundongo de hâmster armênio.
[0255] De preferência, as regiões VH e VL do domínio de ligação à CD3 são derivadas de anticorpos/moléculas de anticorpos e moléculas de tipo anticorpo as quais são capazes de reconhecer especificamente a CD3 humana no contexto de outras subunidades de TCR presentes sobre células T humanas primárias ativadas que expressam o TCR em sua configuração nativa. Regiões VH e VL derivadas de um anticorpo específico para a cadeia CD3-épsilon são mais preferidas e os ditos anticorpos (precursores) serão capazes de ligação especificamente a epítopos que refletem a estrutura nativa ou quase nativa ou um epítopo conformacional de CD3 humana apresentado no contexto do complexo de TCR. Em uma concretização preferida da invenção, as regiões VH e VL do domínio de ligação à CD3 são derivadas de um anticorpo específico para CD3 selecionado do grupo que consiste em UCHT1-SH, UCHT1-MM, CLB-T3 e TR66, de preferência TR66.
[0256] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 94, 95 e um fragmento das mesmas.
[0257] Em uma concretização preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 96 e um fragmento das mesmas.
[0258] Em determinadas concretizações preferidas, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende uma combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionada das possibilidades (i) a (ix) a seguir: (i) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 ou um fragmento da mesma, (ii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33 ou um fragmento da mesma, (iii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 ou um fragmento da mesma, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma, (v) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 94 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma, (vii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma, (viii) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 94 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma, (ix) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma.
[0259] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0260] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma.
[0261] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0262] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 94 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 37 ou um fragmento da mesma.
[0263] Em uma concretização particularmente preferida, um agente tendo a capacidade de se ligar à CD3 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL):
[0264] a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 95 ou um fragmento da mesma e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96 ou um fragmento da mesma.
[0265] O termo "fragmento" se refere, em particular, a uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (Complementarity Determining Region - CDR), de preferência pelo menos a região variável de CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL). Em uma concretização, as ditas umas ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são selecionadas de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3. Em uma concretização particularmente preferida, o termo "fragmento" se refere às regiões determinantes de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e/ou da região variável de cadeia leve (VL).
[0266] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende a dita CDR juntamente com as suas regiões de estruturas intervenientes. De preferência, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas as primeira e quarta regiões das estrutura, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de estrutura e os 50% N- terminais da quarta região de estrutura. Construção de agentes ligantes feitos por meio de técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminais nas regiões variáveis codificadas pelos ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir regiões variáveis da invenção a outras sequências de proteína, incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína.
[0267] Em uma concretização, um agente de ligação que compreende uma ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDRs, conforme descrito aqui, compreende as ditas CDRs em uma estrutura de anticorpo humano.
[0268] De acordo com a invenção, um agente de ligação preferido que objetiva CLDN18.2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 38, 39, 40 e 41 ou uma variante das mesmas.
[0269] De acordo com a invenção, um outro agente de ligação preferido que objetiva CLDN18.2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 103, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 e 93 ou um fragmento ou variante das mesmas. Em uma concretização, a dita sequência de aminoácidos carece de sinais de secreção, tais como sinais de secreção N- terminal, em particular a sequência de acordo com SEQ ID NO: 51, e/ou carece de marcadores His, tais como marcadores His C-terminais, em particular a sequência Gly-Gly-Ser- (His)6 ou (His)6, se presente.
[0270] De acordo com a invenção, um agente de ligação preferido que objetiva CLDN6 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42, 43, 44 e 45 ou uma variante das mesmas.
[0271] De acordo com a invenção, um outro agente de ligação preferido que objetiva CLDN6 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 101, 102, 60, 61, 62, 63, 64 e 65 ou um fragmento ou variante das mesmas. Em uma concretização, a dita sequência de aminoácidos carece de sinais de secreção, tais como sinais de secreção N-terminal, em particular a sequência de acordo com SEQ ID NO: 51, e/ou carece de marcadores His, tais como marcadores His C-terminais, em particular a sequência Gly-Gly-Ser-(His)6 ou (His)6, se presente.
[0272] Deverá ser entendido que os agentes de ligação descritos aqui podem ser administrados a um paciente por meio de administração de um ácido nucleico, tal como RNA, que codifica o agente e/ou através da administração de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico, tal como RNA, que codifica o agente. Assim, um ácido nucleico que codifica um agente de ligação, quando administrado a um paciente, pode estar presente na forma pura ou em um veículo de administração adequado, tal como na forma de lipossomas ou partículas virais ou dentro de uma célula hospedeira. O ácido nucleico fornecido pode produzir o agente durante períodos de tempo prolongados em uma forma sustentada que alivia a instabilidade, pelo menos parcialmente, observada para anticorpos terapêuticos, em particular anticorpos biespecíficos. Os ácidos nucleicos a serem administrados a um paciente podem ser produzidos por meios recombinantes. Se um ácido nucleico é administrado a um paciente sem estar presente dentro de uma célula hospedeira ele é, de preferência, captado pelas células do paciente para expressão do agente de ligação codificado pelo ácido nucleico. Se um ácido nucleico é administrado a um paciente enquanto está presente dentro de uma célula hospedeira ele é, de preferência, expresso pela célula hospedeira dentro do paciente, de modo a produzir o agente de ligação codificado pelo ácido nucleico.
[0273] O termo "recombinante", no contexto da presente invenção, significa "feito por meio de engenharia genética". De preferência, um "objeto recombinante", tal como um ácido nucleico recombinante, no âmbito da presente invenção, não é de ocorrência natural.
[0274] O termo "de ocorrência natural", conforme usado aqui, se refere ao fato de que um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem em laboratório é de ocorrência natural.
[0275] O termo "ácido nucleico", conforme usado aqui, se destina a incluir DNA e RNA, tal como DNA genômico, cDNA, mRNA, moléculas recombinantemente produzidas e quimicamente sintetizadas. Um ácido nucleico pode ser fita simples ou fita dupla. RNA inclui RNA transcrito in vitro (IVT RNA) ou RNA sintético.
[0276] Os ácidos nucleicos podem estar compreendidos em um vetor. O termo "vetor", conforme usado aqui, inclui quaisquer vetores conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo vetores de plasmídeo, vetores de cosmídeo, vetores de fagos, tais como fagos lambda, vetores, virais tais como vetores adenovirais ou de baculovírus, ou vetores de cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais bacterianos (Bacterial Artificial Chromosome - BAC), cromossomas artificiais de levedura (Yeast Artificial Chromosome - YAC) ou cromossomas artificiais P1 (P1 Artificial Chromosome- PAC). Os ditos vetores de expressão incluem também vetores de clonagem. Vetores de expressão incluem plasmídeos, bem como vetores virais e contêm, em geral, uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA necessárias para expressão adequada da sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insetos ou mamíferos) ou em sistemas de expressão in vitro. Vetores de clonagem são, em geral, usados para manipular e amplificar um determinado fragmento de DNA desejado e podem carecer de sequências funcionais necessárias para expressão dos fragmentos de DNA desejados.
[0277] No contexto da presente invenção, o termo "RNA" se refere a uma molécula que compreende os resíduos de ribonucleotídeos e, de preferência, é inteira ou substancialmente composta de resíduos de ribonucleotídeo. "Ribonucleotídeo" se refere a um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2' de um grupo β-D-ribofuranosila. O termo inclui RNA fita dupla, RNA fita simples, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de forma recombinante, bem como RNA modificado que difere do RNA de ocorrência natural mediante adição, eliminação, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como na(s) extremidade(s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos em moléculas de RNA também podem compreender nucleotídeos não convencionais, tais como nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou nucleotídeos ou desoxinucleotídeos quimicamente sintetizados. Estes RNAs alterados podem ser ditos como análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.
[0278] De acordo com a presente invenção, o termo "RNA" e inclui e, de preferência, se refere a "mRNA", o qual significa "RNA mensageiro" e se refere a um "transcrito" o qual pode ser produzido usando como modelo de DNA e codifica um peptídeo ou proteína. mRNA compreende, tipicamente, uma região não traduzida 5' (5'-UTR), uma região de codificação de proteína ou peptídeo e uma região não traduzida 3' (3'-UTR). mRNA tem uma meia-vida limitada em células e in vitro. De preferência, o mRNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo de DNA. Em uma concretização da invenção, o RNA é obtido por meio de transcrição in vitro ou síntese química. A metodologia de transcrição in vitro é conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, há uma variedade de kits de transcrição in vitro comercialmente disponíveis.
[0279] Em uma concretização da presente invenção, o RNA é RNA de autorreplicação, tal como RNA de autorreplicação fita simples. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação é RNA fita simples de orientação positiva. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação é RNA viral ou RNA derivado de RNA viral. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação é RNA genômico alfaviral ou é derivado de RNA genômico alfaviral. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação é um vetor de expressão de gene viral. Em uma concretização, o vírus é o vírus Semliki Forest. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação contém um ou mais transgenes, pelo menos um dos ditos transgenes codificando o agente de ligação descrito aqui. Em uma concretização, se o RNA é RNA viral ou derivado de RNA viral, os transgenes podem substituir parcial ou completamente as sequências virais, tais como sequências que codificam proteínas estruturais virais. Em uma concretização, o RNA de autorreplicação é RNA transcrito in vitro.
[0280] O genoma do alfavírus é RNA com fita simples de orientação positiva (ssRNA(+)) que codifica dois quadros de leitura aberta (Open Reading Frame - ORF) para grandes poliproteínas. O ORF na extremidade 5' do genoma codifica as proteínas não estruturais nSP1 a nSP4 (nsP1-4), as quais são traduzidas e processadas em uma RNA polimerase dependente de RNA (replicase); o ORF na extremidade 3' codifica as proteínas estruturais - capsídeo e glicoproteínas. Ambos os ORFs são separados pelo assim denominado promotor subgenômico (SubGenomic Promoter - SGP), o qual regula a transcrição do ORF estrutural. Quando exploradas como vetores gênicos, as proteínas estruturais por trás do DGP são comumente substituídas por transgenes. De modo a engolfar tais vetores em partículas virais, as proteínas estruturais são comumente expressas in trans a partir de construções auxiliares. Alfavírus se reproduzem no citoplasma de células infectadas exclusivamente ao nível do RNA. Após infecção, o genoma ssRNA(+)funciona como mRNA para tradução do precursor de poliproteína nsP1234 o qual, em estágios iniciais do ciclo de vida viral, é autoproteoliticamente processado aos fragmentos nsP123 e nsP4. Os fFragmentos nsP123 e nsP4 formam o complexo de replicase fita (-)que transcreve o RNA fita (-)a partir do modelo de RNA genômico. Em estágios mais avançados, a poliproteína nsP1234 é completamente clivada em proteínas individuais as quais montam o complexo de replicase fita (+) que sintetiza novos genomas fita (+), bem como os transcritos subgenômicos que codificam as proteínas estruturais outransgenes. RNA subgenômico, bem como o novo RNA genômico, sofrem "capping" e são poliadenilados e, assim, reconhecidos como mRNA após infecção de células alvo. Apenas o novo RNA genômico contém um sinal de engolfamento o qual assegura engolgamento exclusivo de RNA genômico em vírions em crescimento. A atratividade de replicons alfavirais para a tecnologia de vetores se baseia na orientação positiva do genoma de RNA "capped" e poliadenilado. RNA de replicon traduzível pode ser facilmente sintetizado in vitro, pelo que "capping" pode ser obtido com análogos de "capping" adicionados à reação de transcrição in vitro e caudas poli-A podem ser codificadas como trilhas poli-T nos modelos de plasmídeo. Replicons transcritos in vitro (IVT) são transfectados por meio de técnicas de transfecção convencionais e mesmo pequenas quantidades de IVT RNA de iniciação são rapidamente multiplicadas. Dentro de algumas horas após transferência, os transgenes que são colocados a jusante do SGP são transcritos em um número muito elevado de cópias de cerca de 40.000 a 200.000 cópias de RNA subgenômico por célula, assim, não é surpreendente que proteínas recombinantes são fortemente expressas. Dependendo do objetivo específico, replicons IVT podem ser transfectados diretamente em células alvo ou engolfados em partículas alfavirais com vetores auxiliares que fornecem genes estruturais in trans. Transferência para a pele ou músculos leva à expressão local elevada e prolongada, acompanhada por uma forte indução de resposta imune humoral e celular.
[0281] A fim de aumentar a expressão e/ou a estabilidade do RNA usado de acordo com a presente invenção, ele pode ser modificado, de preferência sem alterar a sequência do peptídeo ou proteína expressos.
[0282] O termo "modificação", no contexto de RNA, conforme usado de acordo com a presente invenção, inclui qualquer modificação de RNA a qual não está naturalmente presente no dito RNA.
[0283] Em uma concretização da invenção, o RNA usado de acordo com a invenção não tem 5'-trifosfatos sem "capping". Remoção de tais 5'-trifosfatos sem "capping" pode ser obtida por meio de tratamento do RNA com uma fosfatase.
[0284] O RNA de acordo com a invenção pode ter ribonucleotídeos de ocorrência natural modificados ou sintéticos a fim de aumentar sua estabilidade e/ou diminuir a citotoxicidade. Por exemplo, em uma concretização, no RNA usado de acordo com a invenção, 5-metilcitidina é substituída parcial ou completamente, de preferência completamente, por citidina. Alternativa ou adicionalmente, em uma concretização, no RNA usado de acordo com a invenção, pseudouridina é substituída parcial ou completamente, de preferência completamente, por uridina.
[0285] Em uma concretização, o termo "modificação" se refere ao fornecimento de um RNA com um 5'-cap ou análogo de 5'-cap. O termo "5'-cap" se refere a uma estrutura de "capping" encontrada sobre a extremidade 5' de uma molécula de mRNA e, em geral, consiste em um nucleotídeo guanosina ligado ao mRNA através de uma ligação 5' incomum ao 5'-trifosfato. Em uma concretização, esta guanosina é metilada na posição 7. O termo "5'-cap convencional" se refere a um 5'-cap de RNA de ocorrência natural, de preferência um "cap" de 7-metilguanosina (m7G). No contexto da presente invenção, o termo "5'-cap" inclui um análogo de 5'-cap que se assemelha à estrutura de "cap" de RNA e é modificado para possuir a capacidade de estabilizar o RNA se ligado ao mesmo, de preferência in vivo e/ou em uma célula.
[0286] Fornecimento de um RNA com uma 5'-cap ou um análogo de 5'-cap pode ser obtido por meio de transcrição in vitro de um modelo de DNA na presença dos ditos 5'-cap ou análogo de 5'-cap, em que o dito 5'-cap e cotranscricionalmente incorporado na fita de RNA gerada ou o RNA pode ser gerado, por exemplo, por meio de transcrição in vitro e o 5'-cap pode ser ligado ao RNA pós- transcricionalmente usando enzimas de "capping", por exemplo, enzimas de "capping" do vírus da vaccinia.
[0287] O RNA pode incluir outras modificações. Por exemplo, uma modificação adicional do RNA usado na presente invenção pode ser uma extensão ou truncamento da cauda poli(A) de ocorrência natural ou uma alteração das regiões não traduzidas 5' ou 3' (UTR), tal como a introdução de uma UTR que não está relacionada à região de codificação do dito RNA, por exemplo, a inserção de uma ou mais, de preferência duas, cópias de uma 3'-UTR derivada de um gene de globina, tal como alfa2-globina, alfa1-globina, beta- globina, de preferência beta-globina, mais preferivelmente beta-globina humana.
[0288] Portanto, a fim de aumentar a estabilidade e/ou expressão do RNA usado de acordo com a presente invenção, ele pode ser modificado de modo a estar presente em conjunto com uma sequência poli-A, de preferência tendo um comprimento de 10 a 500, mais preferivelmente 30 a 300, ainda mais preferivelmente 65-200 e, especialmente, 100 a 150 resíduos de adenosina. Em uma concretização especialmente preferida, a sequência poli-A tem um comprimento de cerca de 120 resíduos de adenosina. Além disso, a incorporação de duas ou mais regiões 3' não traduzidas (UTR) na região 3' não traduzida de uma molécula de RNA pode resultar em um aumento na eficiência de tradução. Em uma concretização particular, a 3'-UTR é derivada do gene de β globina humana.
[0289] De preferência, o RNA, se distribuído, isto é, transfectado em, uma célula, em particular uma célula presente in vivo , expressa a proteína, peptídeo ou antígeno que ele codifica.
[0290] O termo "transfecção" se refere à introdução de ácidos nucleicos, em particular RNA, em uma célula. Para fins da presente invenção, o termo "transfecção" inclui também a introdução de um ácido nucleico em uma célula ou a absorção de um ácido nucleico por tal célula, em que a célula pode estar presente em um indivíduo, por exemplo, um paciente. Assim, de acordo com a presente invenção, uma célula para transfecção de um ácido nucleico descrito aqui pode estar presente in vitro ou in vivo, por exemplo, a célula pode fazer parte de um órgão, um tecido e/ou um organismo de um paciente. De acordo com a invenção, a transfecção pode ser transitória ou estável. Para algumas aplicações de transfecção, é suficiente que o material genético transfectado seja expresso apenas transitoriamente. Uma vez que o ácido nucleico introduzido no processo de transfecção geralmente não é integrado no genoma nuclear, o ácido nucleico estranho será diluído através de mitose ou degradado. Células que permitem a amplificação de ácidos nucleicos epissomais reduzem significativamente a taxa de diluição. Se for desejado que o ácido nucleico transfectado, na verdade, permaneça no genoma da célula e suas células filhas, uma transfecção estável deverá ocorrer. RNA pode ser transfectado em células para expressar transitoriamente sua proteína codificada.
[0291] O termo "estabilidade" do RNA se refere à "meia-vida" do RNA. "Meia-vida" se refere ao período de tempo o qual é necessário para eliminar metade da atividade, quantidade ou número de moléculas. No contexto da presente invenção, a meia-vida de um RNA é indicativa de estabilidade do dito RNA. A meia-vida do RNA pode influenciar o "duração de expressão" do RNA. Pode-se esperar que um RNA tendo uma meia-vida longa será expresso por um período de tempo prolongado.
[0292] No contexto da presente invenção, o termo "transcrição" se refere a um processo em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito em RNA. Subsequentemente, o RNA pode ser traduzido em proteína. De acordo com a presente invenção, o termo "transcrição" compreende "transcrição in vitro", em que o termo "transcrição in vitro" se refere a um processo em que o RNA, em particular mRNA, é sintetizado in vitro em um sistema isento de células usando, de preferência, extratos de células adequados. De preferência, vetores de clonagem são aplicados para a geração de transcritos. Estes vetores de clonagem são, em geral, designados como vetores de transcrição e são, de acordo com a presente invenção, abrangidos pelo termo "vetor".
[0293] O termo "tradução", de acordo com a invenção, se refere ao processo, nos ribossomos de uma célula, pelo qual uma fita de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para produzir um peptídeo ou proteína.
[0294] O termo "expressão" é usado, de acordo com a invenção, em seu significado mais geral e compreende a produção de RNA e/ou peptídeos ou proteínas, por exemplo, por meio de transcrição e/ou tradução. Em relação ao RNA, o termo "expressão" ou "tradução" se refere, em particular, à produção de peptídeos ou proteínas. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser transitória ou estável. De acordo com a invenção, o termo expressão também inclui uma "expressão aberrante" ou "expressão anormal".
[0295] "Expressão aberrante" ou "expressão anormal" significa, de acordo com a invenção, que a expressão é alterada, de preferência aumentada, comparado com uma referência, por exemplo, um estado em um indivíduo que não tem uma doença associada à expressão aberrante ou anormal de uma determinada proteína, por exemplo, um antígeno tumoral. Um aumento na expressão se refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100% ou maior. Em uma concretização, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que expressão em um tecido saudável é reprimida.
[0296] O termo "expressa especificamente" significa que uma proteína é essencialmente expressa apenas em um tecido ou órgão específico. Por exemplo, um antígeno tumoral expresso especificamente em mucosas gástricas significa que a dita proteína é expressa principalmente na mucosa gástrica e não é expressa em outros tecidos ou não é expressa de forma significativa em outros tipos de tecidos ou órgãos. Assim, uma proteína que é exclusivamente expressa em células da mucosa gástrica e, em uma extensão significativamente menor, em qualquer outro tecido, tal como testículo, é especificamente expressa em células da mucosa gástrica. Em algumas concretizações, um antígeno tumoral pode também ser expresso especificamente sob condições normais em mais de um tipo de tecido ou órgão, tal como em dois ou três tipos de tecidos ou órgãos mas, de preferência, em não mais do que três diferentes tipos de tecidos ou órgãos. Neste caso, o antígeno tumoral é, então, expresso especificamente nestes órgãos. Por exemplo, se um antígeno tumoral é, de preferência, expresso sob condições normais em uma quantidade aproximadamente igual no pulmão e no estômago, o dito antígeno tumoral é especificamente expresso no pulmão e no estômago.
[0297] De acordo com a invenção, o termo "RNA de codificação" significa que o RNA, se presente no ambiente adequado, de preferência dentro de uma célula, pode ser expresso para produzir uma proteína ou um peptídeo que ele codifica.
[0298] Alguns aspectos da invenção se baseiam na transferência adotiva de células hospedeiras que são transfectadas in vitro com um ácido nucleico, tal como RNA que codifica um agente de ligação descrito aqui, e transferidas para recipientes, tais como pacientes, de preferência após expansão ex vivo de precursores de baixas frequências de precursor para números clinicamente relevantes de células. As células hospedeiras usadas para tratamento de acordo com a invenção podem ser autólogas, alogeneicas ou singeneicas para um recipiente tratado.
[0299] O termo "autóloga" é usado para descrever qualquer coisa que é derivada da mesma matéria. Por exemplo, "transplante autólogo" se refere a um transplante de tecidos ou órgãos derivados do mesmo indivíduo. Tais procedimentos são vantajosos porque eles superam a barreira imunológica o que, de outra forma, resulta em rejeição.
[0300] O termo "alogeneica" é usado para descrever qualquer coisa que é derivada de diferentes indivíduos da mesma espécie. Dois ou mais indivíduos são ditos alogeneicos um ao outro quando os genes em um ou mais loci não são idênticos.
[0301] O termo "singeneica" é usado para descrever qualquer coisa que é derivada de indivíduos ou tecidos tendo genótipos idênticos, isto é, gêmeos idênticos ou animais da mesma espécie endógama ou seus tecidos.
[0302] O termo "heteróloga" é usado para descrever qualquer coisa que consiste em vários elementos diferentes. Como um exemplo, a transferência de medula óssea de um indivíduo para um indivíduo diferente constitui um transplante heterólogo. Um gene heterólogo é um gene derivado de uma fonte diferente do indivíduo.
[0303] O termo "peptídeo", de acordo com a invenção, compreende oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias que compreendem dois ou mais, de preferência três ou mais, de preferência 4 ou mais, de preferência 6 ou mais, de preferência 8 ou mais, de preferência 9 ou mais, de preferência 10 ou mais, de preferência 13 ou mais, de preferência 16 mais, de preferência 21 ou mais e, mais preferivelmente, até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular 100 aminoácidos covalentemente ligados através de ligações peptídicas. O termo "proteína" se refere a peptídeos grandes, de preferência peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos mas, em geral, os termos "peptídeos" e "proteínas" são sinônimos e são usados aqui alternadamente.
[0304] O ensinamento fornecido aqui em relação a sequências de aminoácidos específicas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequências, deverá ser interpretado de modo a se referir também a variantes das ditas sequências específicas que resultam em sequências que são funcionalmente equivalentes às ditas sequências específicas, por exemplo, sequências de aminoácidos que exibem propriedades idênticas ou similares àquelas das sequências de aminoácidos específicas. Uma propriedade importante é reter a ligação a um alvo ou manter as funções efetuadoras. De preferência, uma sequência a qual é uma variante se refere a uma sequência específica quando ela substitui a sequência específica em um anticorpo e retém a ligação do dito anticorpo à CLDN e/ou CD3 e, de preferência, funções do dito anticorpo, conforme descrito aqui, por exemplo, lise mediada por CDC ou lise mediada por ADCC.
[0305] Por exemplo, as sequências apresentadas na listagem de sequências podem ser modificadas de modo a remover um ou mais, de preferência todos os resíduos de cisteína livres, em particular através de substituição dos resíduos de cisteína por outros aminoácidos que não cisteína, de preferência serina, alanina, treonina, glicina, tirosina, leucina ou metionina, mais preferivelmente alanina ou serina. Por exemplo, a cisteína na posição 103 da sequência mostrada em SEQ ID NO: 36 da listagem de sequências ou a cisteína correspondente em uma sequência compreendendo a dita sequência pode ser modificada desta forma. Outras cisteínas que podem ser modificadas desta forma são as cisteínas na posição 178 de SEQ ID NO: 42, na posição 197 de SEQ ID NO: 43, na posição 427 de SEQ ID NO: 44 ou na posição 446 de SEQ ID NO: 45.
[0306] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, em particular, as sequências de CDR, regiões hipervariáveis e variáveis possam ser modificadas sem perder a capacidade de se ligar à CLDN e/ou CD3. Por exemplo, regiões de CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões de anticorpos especificados aqui. Por "altamente homólogas" considera-se que de 1 a 5, de preferência de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas nas CDRs. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas de modo que elas mostrem homologia substancial com as regiões de anticorpos especificamente descritos aqui.
[0307] Para fins da presente invenção, "variantes" de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes com inserção de aminoácidos, variantes com adição de aminoácidos, variantes com eliminação de aminoácidos e/ou variantes com substituição de aminoácidos. Variantes com eliminação de aminoácidos que compreendem uma eliminação na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína são também denominadas de variantes de truncamento N-terminal e/ou C-terminal.
[0308] Variantes com inserção de aminoácidos compreendem inserções de um único ou dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos tendo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um local particular em uma sequência de aminoácidos através de inserção aleatória, com rastreio apropriado do produto resultante também sendo possível.
[0309] Variantes com adição de aminoácidos compreendem fusões amino e/ou carbóxi terminais de um ou mais aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos.
[0310] Variantes com eliminação de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tal como através de remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos. As eliminações podem ser em qualquer posição da proteína.
[0311] Variantes com substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência sendo removido e outro resíduo sendo inserido em seu lugar. Preferência é dada a modificações em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas ou peptídeos homólogos e/ou substituição de aminoácidos por outros tendo propriedades similares. De preferência, alterações de aminoácidos em variantes de proteínas são alterações de aminoácidos conservativas, isto é, substituições de aminoácidos similarmente carregados ou não carregados. Uma troca de aminoácidos conservativa envolve a substituição de um de uma família de aminoácidos os quais são relacionados quanto às suas cadeias laterais. Aminoácidos de ocorrência natural são, em geral, divididos em quatro famílias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e polares não carregados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano e tirosina são, algumas vezes, classificados juntos como aminoácidos aromáticos.
[0312] De preferência, o grau de similaridade, de preferência de identidade, entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da dita dada sequência de aminoácidos é de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de similaridade ou identidade é fornecido, de preferência, para uma região de aminoácidos que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a sequência de aminoácidos de referência consiste em 200 aminoácidos, o grau de similaridade ou identidade é fornecido, de preferência, para pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180 ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência aminoácidos contínuos. Em concretizações preferidas, o grau de similaridade ou identidade é determinado para todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. O alinhamento para determinar a similaridade de sequência, de preferência identidade de sequência, pode ser realizado com ferramentas conhecidas na técnica usando, de preferência, o melhor alinhamento de sequências, por exemplo, usando ALIGN, usando as configurações padrões, de preferência EMBOSS::needle, Matriz: Blosum62, Penalidade por lacuna de 10,0, Penalidade por extensão de lacuna de 0,5.
[0313] "Similaridade de sequência" indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências.
[0314] O termo "percentagem de identidade" se destina a denotar uma percentagem de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtido após o melhor alinhamento, esta percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências estando distribuídas aleatoriamente e ao longo todo seu comprimento. Comparações de sequências entre duas sequências de aminoácidos são, convencionalmente, realizadas comparando-se estas sequências após tê-las alinhado de forma ótima, a dita comparação sendo realizada pelo segmento ou pela "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser produzido, além manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad.Sci. USA 85, 244, ou por meio de programas computadorizados que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0315] A percentagem de identidade é calculada determinando-se o número de posições idênticas entre as duas sequências a serem comparadas, dividindo-se este valor pelo número de posições comparadas e multiplicando-se o resultado obtido por 100, de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.
[0316] Os agentes de ligação da invenção podem ser produzidos intracelularmente (por exemplo, no citossol, no periplasma ou em corpos de inclusão) e, então, isolados das células hospedeiras e, opcionalmente, adicionalmente purificados; ou eles podem ser produzidos extracelularmente (por exemplo, no meio onde as células hospedeiras são cultivadas) e, então, isolados do meio de cultura e opcionalmente ainda purificados. Métodos e reagentes usados para a produção recombinante de polipeptídeos, tais como vetores de expressão específicos adequados, métodos de transformação ou transfecção, marcadores de seleção, métodos de indução de expressão da proteína, condições de cultura e assim por diante, são conhecidos na técnica. Similarmente, métodos de isolamento e purificação de proteínas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0317] O termo "célula" ou "célula hospedeira" se refere, de preferência, uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não liberou seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelas ou material genético. Uma célula intacta é, de preferência, uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de desempenhar suas funções metabólicas normais. De preferência, o dito termo se refere, de acordo com a invenção, a qualquer célula que possa ser transfectada com um ácido nucleico exógeno. De preferência, a célula, quando transfectada com um ácido nucleico exógeno e transferida para um recipiente, pode expressar o ácido nucleico no recipiente. O termo "célula" inclui células bacterianas; outras células úteis são células de levedura, células de fungos ou células de mamíferos. Células bacterianas adequadas incluem células de cepas bacterianas Gram- negativas, tais como cepas de Escherichia coli, Proteus e Pseudomonas, e cepas bacterianas Gram-positivas, tais como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus e Lactococcus. Células de fungos adequadas incluem células de espécies Trichoderma, Neurospora e Aspergillus. Células de levedura adequadas incluem células de espécies Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia methanolic) e Hansenula. Células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, células HEK 293 e assim por diante. No entanto, células de anfíbios, células de insetos, células de plantas e quaisquer outras células usadas na técnica para expressão de proteínas heterólogas podem ser usadas também. Células de mamífero são particularmente preferidas para transferência adoptiva, tais como células humanas, de camundongos, hâmsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas de um grande número de tipos de tecidos e incluem células primárias e linhagens de células, tais como células do sistema imune, em particular células apresentadoras de antígeno, tais como células dendríticas e células T, células-tronco, tais como células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais, e outros tipos de células. Uma célula apresentadora de antígeno é uma célula que apresenta antígeno no contexto do principal complexo de histocompatibilidade sobre sua superfície. Células T podem reconhecer este complexo usando seu receptor de células T (T Cell Receptor - TCR).
[0318] "Reduzir", "diminuir" ou "inibir", conforme usado aqui, significa uma diminuição global ou a capacidade de causar uma diminuição global, de preferência de 5% ou maior, 10% ou maior, 20% ou maior, mais preferivelmente de 50% ou maior e, ainda mais preferivelmente, de 75% ou maior, no nível, por exemplo, no nível de expressão ou nível de proliferação celular.
[0319] Termos tais como "aumentar" ou "melhorar" se referem, de preferência, a um aumento ou melhora em cerca de pelo menos 10%, de preferência pelo menos 20%, de preferência pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 80% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10000% ou mesmo mais.
[0320] Citotoxicidade Mediada Por Células Dependente de Anticorpos
[0321] ADCC descreve a capacidade de matar células de células efetuadoras, conforme descrito aqui, particularmente linfócitos, a qual requer, de preferência, que a célula alvo seja marcada por um anticorpo.
[0322] ADCC ocorre, de preferência, quando os anticorpos se ligam a antígenos sobre células tumorais e os domínios Fc de anticorpo de acoplam a receptores de Fc (FcR) sobre a superfície de células efetuadoras imunes. Várias famílias de receptores de Fc foram identificadas e populações de células específicas expressam, de forma característica, receptores de Fc definidos. ADCC pode ser considerada como um mecanismo para induzir diretamente a um grau variável de destruição imediata do tumor que leva à apresentação de antígeno e à indução de respostas de células T dirigidas ao tumor. De preferência, indução in vivo de ADCC levará a respostas de células T dirigidas ao tumor e respostas de anticorpos derivados do hospedeiro.
[0323] Citotoxicidade Dependente de Complemento
[0324] CDC é outro método de matar células que pode ser comandado por anticorpos. O isotipo IgM é mais eficaz para ativação de complemento. IgG1 e IgG3 também são muito eficazes em comandar CDC através da via de ativação de complemento clássica. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos de antígeno-anticorpo resulta em revelação de múltiplos sítios de ligação a C1q em estreita proximidade sobre os domínios CH2 que participam em moléculas de anticorpo, tais como moléculas de IgG (C1q é um dos três subcomponentes do complemento C1). De preferência, estes sítios de ligação a C1q revelados convertem a interação C1q-IgG anteriormente de baixa afinidade para uma de avidez elevada, o que desencadeia uma cascata de eventos que envolvem uma série de outras proteínas do complemento e leva à liberação proteolítica de agentes quimiotácticos/de ativação de células efetuadoras C3a e C5a. De preferência, a cascata de complemento termina na formação de um complexo de ataque à membrana, o qual cria poros na membrana celular que facilitam a passagem livre de água e solutos para dentro e para fora da célula.
[0325] Os anticorpos descritos aqui, por exemplo, para fornecimento de regiões VH e VL, podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica convencional de hibridização de células somáticas de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora procedimentos de hibridização de células somáticas sejam preferidos, em princípio, outras técnicas podem ser usadas para produção de anticorpos monoclonais, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de phage display que usam bibliotecas de genes de anticorpos.
[0326] O sistema animal preferido para preparo de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema de murino. Produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.
[0327] Outros sistemas animais preferidos para preparo de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais são os sistemas de rato e coelho (por exemplo, descritos em Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9348 (1995); vide também Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
[0328] Em ainda outra concretização preferida, anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos que trazem partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos conhecidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente ditos aqui como "camundongos transgênicos". A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos pode ser realizada conforme descrito em detalhes para CD20 no documento WO2004/035607.
[0329] Ainda outra estratégia para geração de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes que codificam anticorpos de linfócitos que produzem anticorpos de especificidade definida; por exemplo, vide Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Para obter detalhes sobre a manipulação recombinante de anticorpos vide também Welschof e Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
[0330] Para gerar anticorpos, os camundongos podem ser imunizados com peptídeos conjugados a veículo derivados da sequência do antígeno, isto é, a sequência contra a qual os anticorpos estão sendo dirigidos, um preparado rico no antígeno recombinante expresso ou fragmentos do mesmo e/ou células que expressam o antígeno, conforme descrito. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica o antígeno ou fragmentos do mesmo. No caso em que imunizações usando um preparado purificado ou rico no antígeno não resultam em anticorpos, os camundongos podem ser imunizados com células que expressam o antígeno, por exemplo, uma linhagem de células, para promover respostas imunes.
[0331] A resposta imune pode ser monitorada ao longo do protocolo de imunização, com amostras de plasma e soro a sendo obtidas pela veia da cauda ou coleta de sangue retro-orbital. Camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina podem ser usado para fusões. Os camundongos podem receber um reforço por via intraperitoneal ou intravenosa com células que expressam o antígeno 3 dias antes de sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas que secretam anticorpos específicos.
[0332] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais, esplenócitos e células dos nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem de células imortalizada adequada, tal como uma linhagem de células de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem, então, ser rastreados quanto à produção de anticorpos específicos para o antígeno. As cavidades individuais podem, então, ser rastreadas por ELISA quanto a hibridomas que secretam anticorpos. Através de imunofluorescência e análise FACS usando células que expressam o antígeno, anticorpos com especificidade pelo antígeno podem ser identificados. Os hibridomas que secretam anticorpos podem ser novamente colocados em placas, rastreados e, se ainda positivos para anticorpos monoclonais, podem ser subclonados através de diluição limitativa. Os subclones estáveis podem, então, ser cultivados in vitro para gerar o anticorpo em meio de cultura tecidual para caracterização.
[0333] Os anticorpos também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênica, conforme bem conhecido na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
[0334] Por exemplo, em uma concretização, o(s) gene(s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpos, pode(m) ser ligado(s) em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariota, conforme usado pelo sistema de expressão gênica GS descrito nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841 ou outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucariotas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucariotas, tais como células derivadas de plantas, células fúngicas ou células de levedura. O método usado para introduzir estes genes pode ser os métodos descritos na técnica, tais como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após introdução destes genes de anticorpo nas células hospedeiras, células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas os quais podem, então, ser amplificados quanto ao seu nível de expressão e escalonados para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados destes sobrenadantes de cultura e/ou células.
[0335] Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressão, incluindo células procariotas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais não humanos transgênicos, tal como em leite de ovelhas e coelhos ou em ovos de galinhas ou em plantas transgênicas; vide, por exemplo Verma, R. et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181;Pollock et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R. et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839. Quimerização
[0336] Anticorpos de murino não marcados são altamente imunogênicos no homem quando aplicados repetidamente, levando à redução do efeito terapêutico. A principal imunogenicidade é mediada pelas regiões constantes de cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos de murino em seres humanos pode ser reduzida ou completamente evitada se os respectivos anticorpos são quimerizados ou humanizados. Anticorpos quiméricos são anticorpos cujas diferentes porções são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como aqueles que têm uma região variável derivada de um anticorpo de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. A quimerização de anticorpos é obtida pela união das regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpos de murino com a região constante de cadeias pesada e leve humanas (por exemplo, conforme descrito por Kraus et al., na série Methods in Molecular Biology, Recombinant Antibodies For Cancer Therapy ISBN-0-89603-918-8). Em uma concretização preferida, os anticorpos quiméricos são gerados unindo-se a região constante de cadeia leve kapa humana à região variável de cadeia leve de murino. Em uma concretização também preferida, anticorpos quiméricos podem ser gerados ao unir a região constante de cadeia leve lambda humana à região variável de cadeia leve de murino. As regiões constantes de cadeia pesada preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgG1, IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes de cadeia pesada preferidas para geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM.
Humanização
[0337] Anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDR) das cadeias pesada e leve. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações de anticorpo- antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específicas enxertadas sobre sequências de estrutura de um anticorpo diferente tendo propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Tais sequências de estrutura podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos que incluem sequências de genes de anticorpo de linhagem germinativa. Estas sequências de linhagem germinativa diferirão de sequências de genes de anticorpos maduros porque elas não incluirão genes variáveis completamente montados, os quais são formados pela união V (D) J durante maturação de células B. Sequências de genes de linhagem germinativa também serão diferentes de sequências de um anticorpo de reportório secundário de elevada afinidade individualmente, mesmo através da região variável.
[0338] A capacidade dos anticorpos e outros agentes de ligação de se ligar um antígeno pode ser determinada usando ensaios de ligação convencionais (por exemplo, ELISA, Western Blot, imunofluorescência e análise citométrica de fluxo).
[0339] Para purificar anticorpos, linhagens de células produtoras selecionadas podem ser cultivadas em frascos giratórios de dois litros para purificação de anticorpo recombinante. Alternativamente, os anticorpos podem ser produzidos com base em biorreatores de diálise. Os sobrenadantes podem ser filtrados e, se necessário, concentrados antes de cromatografia por afinidade com proteína L-Sepharose. A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia de líquido de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS e a concentração pode ser determinada pela OD280 usando o respectivo coeficiente de extinção. Os anticorpos recombinantes podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80 °C.
[0340] A fim de demonstrar a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam o antígeno, citometria de fluxo pode ser usada. Linhagens de células que expressam naturalmente, ou após transfecção, o antígeno e controles negativos que carecem de expressão do antígeno (cultivados sob condições de crescimento normais) podem ser misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em sobrenadantes de hibridoma ou em PBS contendo FBS a 1% e podem ser incubadas a 4 °C durante 30 min. Após lavagem, o anticorpo anti IgG marcado com Alexa647 ou APC pode se ligar ao anticorpo monoclonal ligado a antígeno sob as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um instrumento FACS usando luz e propriedades de dispersão lateral para ativar células vivas individuais. De modo a distinguir anticorpos monoclonais específicos para o antígeno de ligantes não específicos em uma única medição, o método de cotransfecção pode ser empregado. Células transfectadas transitoriamente com plasmídeos que codificam antígeno e um marcador fluorescente podem ser coradas, conforme descrito acima. As células transfectadas podem ser detectadas em um canal de fluorescência diferente das células marcadas com o anticorpo. Uma vez que a maioria das células transfectadas expressam ambos os transgenes, os anticorpos monoclonais específicos para o antígeno se ligam preferencialmente a células que expressam marcadores de fluorescência, enquanto que os anticorpos não específicos se ligam em uma proporção comparável a células não transfectadas. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado, além de ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exatamente conforme descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.
[0341] A fim de demonstrar a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam antígenos, análise por microscopia de imunofluorescência pode ser usada. Por exemplo, linhagens de células que expressam antígeno espontaneamente ou após transfecção e controles negativos que carecem de expressão do antígeno são cultivadas em lâminas com câmaras sob condições convencionais em meio DMEM/F12 suplementado com soro fetal de vitelo (Foetal Calf Serum - FCS) a 10%, L-glutamina a 2 mM, 100 UI/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina. As células podem, então, ser fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas sem tratamento. As células podem, então, ser reagidas com os anticorpos monoclonais contra o antígeno durante 30 min. a 25 °C. Após lavagem, as células podem ser reagidas com um anticorpo secundário anti-IgG de camundongo marcado com Alexa555 (Molecular Probes) sob as mesmas condições. As células podem, então, ser examinadas por microscopia de fluorescência.
[0342] Extratos celulares de células que expressam os antígenos e os controles negativos adequados podem ser preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate - SDS). Após eletroforese, os antígenos separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados e hibridizados com os anticorpos monoclonais a serem testados. Ligação à IgG pode ser detectada usando peroxidase anti-IgG de camundongo e revelada com substrato ECL.
[0343] Os anticorpos podem ser ainda testados quanto à reatividade com o antígeno por imuno-histoquímica de um modo bem conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, usando criosseções fixadas em paraformaldeído ou acetona ou seções teciduais embebidas em parafina fixadas com paraformaldeído de amostras de tecidos não cancerosos ou tecidos cancerosos obtidas de pacientes durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou de camundongos portadores de tumor xenoenxertados inoculados com linhagens de células que expressam o a invenção espontaneamente ou após transfecção. Para imunocoloração, anticorpos reativos ao antígeno podem ser incubados, seguido por anticorpos de cabra anti-coelho ou anticorpos de cabra anti-camundongo conjugados com peroxidase de rábano (DAKO) de acordo com as instruções do fabricante.
Estudos Pré-Clínicos
[0344] Os agentes de ligação descritos aqui também podem ser testados em um modelo in vivo (por exemplo, em camundongos imunodeficientes portadores de tumor xenoenxertados inoculados com linhagens de células que expressam CLDN) para determinar sua eficácia em controlar o crescimento de células tumorais que expressam CLDN.
[0345] Em estudos in vivo, xenoenxerto de células tumorais que expressam CLDN em camundongos imunocomprometidos ou em outros animais pode ser realizado usando os agentes de ligação descritos aqui. Os agentes de ligação podem ser administrados a camundongos sem tumor, seguido por injeção de células tumorais para medir os efeitos dos agentes de ligação de evitar a formação de tumores ou sintomas relacionados ao tumor. Os agentes de ligação podem ser administrados a camundongos portadores de tumor para determinar a eficácia terapêutica dos respectivos agentes de ligação de reduzir o crescimento do tumor, metástases do tumor ou sintomas relacionados. A aplicação de agentes de ligação pode ser combinada com a aplicação de outras substâncias, tais como medicamentos citostáticos, inibidores de fator de crescimento, bloqueadores do ciclo celular, inibidores de angiogênese ou anticorpos para determinar a eficácia sinérgica e toxicidade potencial de combinações. Para analisar os efeitos colaterais tóxicos mediados pelos agentes de ligação, os animais podem ser inoculados com agentes de ligação ou reagentes de controle e investigados quanto aos sintomas possivelmente relacionados à terapia com agente de ligação à CLDN.
[0346] Mapeamento de epítopos reconhecidos por agentes de ligação pode ser realizado conforme descrito em detalhes em "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)" por Glenn E. Morris, ISBN-089603-375-9, e em "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series 248 por Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay.
[0347] Os compostos e os agentes descritos aqui podem ser administrados na forma de qualquer composição farmacêutica adequada.
[0348] As composições farmacêuticas da presente invenção são, de preferência, estéreis e contêm uma quantidade eficaz dos agentes de ligação descritos aqui e, opcionalmente, outros agentes conforme discutido aqui, para gerar a reação desejada ou efeito desejado.
[0349] As composições farmacêuticas são, normalmente, fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de um modo conhecido per se. Uma composição farmacêutica pode, por exemplo, estar na forma de uma solução ou suspensão.
[0350] Uma composição farmacêutica pode compreender sais, substâncias tampão, conservantes, veículos, diluentes e/ou excipientes, todos os quais são, de preferência, farmaceuticamente aceitáveis. O termo "farmaceuticamente aceitáveis" se refere à inexistência de toxicidade de um material o qual não interage com a ação do componente ativo da composição farmacêutica.
[0351] Sais os quais não são farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis e estão incluídos na invenção. Sais farmaceuticamente aceitáveis deste tipo compreendem, de forma não limitativa, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, clorídrico e assim por diante. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino- terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.
[0352] Substâncias tampão adequadas para uso em uma composição farmacêutica incluem ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal.
[0353] Conservantes adequados para uso em uma composição farmacêutica incluem cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabenos e timerosal.
[0354] Uma formulação injetável pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como Lactato de Ringer.
[0355] O termo "veículo" se refere a um componente orgânico ou inorgânico, de natureza natural ou sintética, no qual o componente ativo é combinado para facilitar, melhorar ou permitir aplicação. De acordo com a invenção, o termo "veículo" também inclui um ou mais materiais de enchimento sólidos ou líquidos, diluentes ou substâncias de encapsulação compatíveis, os quais são adequados para administração a um paciente.
[0356] Substâncias veículo possíveis para administração parenteral são, por exemplo, água estéril, Ringer, lactato de Ringer, solução de cloreto de sódio estéril, polialquileno glicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros de lactídeo biocompativeis, copolímeros de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.
[0357] O termo "excipiente", quando usado aqui, se destina a indicar todas as substâncias que possam estar presentes em uma composição farmacêutica e as quais não são ingredientes ativos tais como, por exemplo, veículos, aglutinantes, lubrificantes, espessantes, tensoativos, conservantes, emulsificantes, tampões, aromatizantes ou colorantes.
[0358] Os agentes e composições descritos aqui podem ser administrados por qualquer via convencional, tal como através de administração parenteral, incluindo por injeção ou infusão. A administração é, de preferência, parenteral, por exemplo, intravenosamente, intra- arterialmente, subcutaneamente, intradermicamente ou intramuscularmente.
[0359] Composições adequadas para administração parenteral usualmente compreendem um preparado aquoso ou não aquoso estéril do composto ativo o qual é, de preferência, isotônico com o sangue do recipiente. Exemplos de veículos e solventes compatíveis são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, normalmente, óleos fixos estéreis são usados como solução ou meio de suspensão.
[0360] Os agentes e composições descritos aqui são administrados em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" se refere à quantidade a qual alcança uma reação desejada ou um efeito desejado individualmente ou junto com outras doses. No caso de tratamento de uma doença particular ou uma condição particular, a reação desejada se refere, de preferência, à inibição do curso da doença. Isto compreende diminuir o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doença. A reação desejada em um tratamento de uma doença ou uma condição pode também ser retardo do aparecimento ou prevenção do aparecimento da dita doença ou da dita condição.
[0361] Uma quantidade eficaz de um agente ou composição descrito aqui dependerá do estado a ser tratado, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo a idade, condição fisiológica, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de terapia associada (se presente), da via de administração específica e fatores similares. Consequentemente, as doses administradas dos agentes descritos aqui podem depender de vários de tais parâmetros. No caso onde uma reação em um paciente não é suficiente com uma dose inicial, doses maiores (ou doses eficazmente maiores obtidas por uma via de administração diferente, mais localizada) podem ser usadas.
[0362] Os agentes e composições descritos aqui podem ser administrados aos pacientes, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, tais como aqueles descritos aqui. Pacientes preferidos incluem pacientes humanos tendo doenças que podem ser corrigidas ou melhoradas através da administração dos agentes e composições descritos aqui. Isto inclui distúrbios que envolvem células caracterizadas por um padrão alterado de expressão de CLDN, tal como CLDN18.2 e/ou CLDN6.
[0363] Por exemplo, em uma concretização, os agentes descritos aqui podem ser usados para tratar um paciente com uma doença cancerosa, por exemplo, uma doença cancerosa conforme descrito aqui caracterizada pela presença de células cancerosas que expressam CLDN.
[0364] As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritos de acordo com a invenção também podem ser usados para imunização ou vacinação para prevenir uma doença descrita aqui.
[0365] A composição farmacêutica da invenção pode ser administrada junto com substâncias de suplementação que aumentam a imunidade, tais como um ou mais adjuvantes, e pode compreender uma ou mais substâncias que aumentam a imunidade para aumentar ainda mais sua eficácia, de preferência para atingir um efeito sinérgico de imunoestimulação. O termo "adjuvante" se refere a compostos que prolongam ou melhoram ou aceleram uma resposta imune. Vários mecanismos são possíveis a este respeito, dependendo dos vários tipos de adjuvantes. Por exemplo, compostos que permitem a maturação de DCs, por exemplo, lipopolissacarídeos ou ligante de CD40, formam uma primeira classe de adjuvantes adequados. Em geral, qualquer agente o qual influencia o sistema imune do tipo um "sinal de perigo" (LPS, GP96, dsRNA, etc.) ou citocinas, tal como GM- CSF, pode ser usado como um adjuvante o qual permite que uma resposta imune seja intensificada e/ou influenciada de uma maneira controlada. Oligodesoxinucleotídeos de CpG também podem opcionalmente ser usados neste contexto, embora seus efeitos secundários que ocorrem em determinadas circunstâncias, conforme explicado acima, tenham de ser considerados. Adjuvantes particularmente preferidos são citocinas, tais como linfocinas, monocinas, interleucinas ou quimioquinas, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INFα, INF—Y, GM—CSF, LT-α, ou fatores de crescimento, por exemplo, hGH. Outros adjuvantes conhecidos são adjuvantes de hidróxido de alumínio, adjuvante de Freund ou óleo, tal como Montanide®, mais preferivelmente Montanide® ISA51. Lipopeptídeos, tal como Pam3Cys, são também adequados para uso como adjuvantes na composição farmacêutica da presente invenção.
[0366] Os agentes e composições fornecidos aqui podem ser usados isoladamente ou em combinação com regimes terapêuticos convencionais, tais como cirurgia, radiação, quimioterapia e/ou transplante de medula óssea (autólogo, singeneico, alogeneico ou não relacionado).
[0367] O tratamento de câncer representa um campo onde estratégias combinadas são especialmente desejáveis uma vez que, frequentemente, a ação combinada de dois, três, quatro ou mesmo mais fármacos/terapias contra o câncer gera efeitos sinérgicos que são consideravelmente mais fortes do que o impacto de uma abordagem monoterapêutica. Assim, em outra concretização da presente invenção, um tratamento para câncer o qual utiliza mecanismos com base em vacinação ou imunes, tais como os métodos e as composições farmacêuticas da presente invenção, pode ser eficazmente combinado com vários outros fármacos e/ou métodos de objetivação similar ou outros mecanismos específico. Dentre estes estão, por exemplo, combinações com terapias antitumor convencionais, estratégias multiepitópicas, imunoterapia adicional e abordagens de tratamento que objetivam a angiogênese ou apoptose (para revisão vide, por exemplo, Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743). Administração sequencial de diferentes agentes pode inibir o crescimento de células cancerosas em diferentes pontos de verificação, enquanto que outros agentes podem, por exemplo, inibir a neoangiogênese, a sobrevivência de células malignas ou metástases, convertendo potencialmente o câncer em uma doença crônica. A lista a seguir fornece alguns exemplos não limitativos de fármacos anticâncer e terapias que podem ser usados em combinação com a presente invenção.
1. Quimioterapia
[0368] Quimioterapia é o tratamento padrão para vários tipos de câncer. Os agentes quimioterapêuticos mais comuns atuam ao matar células que se dividem rapidamente, uma das principais propriedades das células cancerosas. Assim, uma combinação com fármacos quimioterapêuticos convencionais tais como, por exemplo, agentes de alquilação, antimetabólitos, antraciclinas, alcaloides de plantas, inibidores de topoisomerase e outros agentes antitumor os quais afetam tanto a divisão celular quanto a síntese de DNA pode melhorar significativamente os efeitos terapêuticos da presente invenção ao eliminar células supressoras, reinicializar o sistema imune, tornar as células tumorais mais suscetíveis à morte mediada pelo sistema imune ou ativar adicionalmente células do sistema imune. A ação anticâncer sinérgica de fármacos quimioterapêuticos e imunoterapêuticos com base em vacinação foi demonstrada em vários estudos (vide, por exemplo, Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-smallcell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125-33; vide também Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979; vide também Hirooka et al. 2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74). Há centenas de fármacos quimioterápicos disponíveis, os quais são basicamente adequados para terapias combinadas. Alguns exemplos (não limitativos) de fármacos quimioterapêuticos que podem ser combinados com a presente invenção são carboplatina (Paraplatin), cisplatina (Platinol, Platinol-AQ), ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), docetaxel (Taxotere), doxorrubicina (Adriamycin), erlotinibe (Tarceva), etoposídeo (VePesid), fluorouracil (5-FU), gencitabina (Gemzar), imatinib mesilato (Gleevec), irinotecan (Camptosar), metotrexato (Folex, Mexate, Amethopterin), paclitaxel (Taxol, Abraxane), sorafinibe (Nexavar), sunitinibe (Sutent), topotecan (Hycamtin), vincristina (Oncovin, Vincasar PFS) e vinblastina (Velban).
2. Cirurgia
[0369] Cirurgia de câncer - uma operação para remover o tumor - permanece a base do tratamento de câncer. A cirurgia pode ser combinada com outros tratamentos contra o câncer a fim de eliminar quaisquer células tumorais remanescentes. Combinação de métodos cirúrgicos com subsequente tratamento imunoterapêutico é uma abordagem promissora, a qual foi demonstrada inúmeras vezes.
3. Radiação
[0370] Radioterapia continua a ser um componente importante do tratamento de câncer, com aproximadamente 50% de todos os pacientes com câncer recebendo radioterapia durante o curso da doença. O principal objetivo da radioterapia é privar as células cancerosas de seu potencial de multiplicação (divisão celular). Os tipos de radiação usada para tratar câncer são radiação de fótons (raios X e raios gama) e radiação de partículas (feixes de elétrons, prótons e nêutrons). Há duas maneiras de fornecer radiação ao local do câncer. Radiação de feixe externo é distribuída a partir do exterior do corpo ao objetivar raios de alta energia (radiação de fótons, prótons ou partículas) ao local do tumor. Radiação interna ou braquiterapia é distribuída a partir do interior do corpo por fontes radioativas, seladas em cateteres ou sementes diretamente ao local do tumor. Técnicas de radioterapia que são aplicáveis em combinação com a presente invenção são, por exemplo, fracionamento (radioterapia administrada em um regime fracionado, por exemplo, frações diárias de 1,5 a 3 Gy fornecidas ao longo de várias semanas), radioterapia conformal 3D (3DCRT; distribuição de radiação ao volume do tumor bruto), radioterapia de intensidade modulada (IMRT; modulação de intensidade controlada por computador de múltiplos feixes de radiação), radioterapia orientada por imagem (IGRT; uma técnica que compreende imagiologia pré- radioterapia, a qual permite correção) e radioterapia estereotática corporal (SRBT, distribui doses individuais muito altas de radiação durante apenas algumas frações de tratamento). Para uma revisão sobre radioterapia vide Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193199.
4. Anticorpos
[0371] Anticorpos (de preferência, anticorpos monoclonais) alcançam seu efeito terapêutico contra células cancerosas através de vários mecanismos. Eles podem ter efeitos diretos sobre a produção de apoptose ou morte celular programada. Eles podem bloquear os componentes de vias de transdução de sinal tais como, por exemplo, receptores de fator de crescimento, impedindo eficazmente a proliferação de células tumorais. Em células que expressam anticorpos monoclonais, eles podem provocar a formação de anticorpos anti-idiotipo. Efeitos indiretos incluem recrutamento de células as quais têm citotoxicidade, tais como monócitos e macrófagos. Este tipo de morte celular mediada por anticorpos é denominada citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity - ADCC). Os anticorpos também se ligam ao complemento, levando à toxicidade celular direta, conhecido como citotoxicidade dependente de complemento (Complement-Dependent Cytotoxicity - CDC). Métodos cirúrgicos combinados com fármacos ou métodos de imunoterapia é uma abordagem bem sucedida conforme, por exemplo, demonstrado em Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J. Immunother. 32(4): 333-40. A lista a seguir fornece alguns exemplos não limitativos de anticorpos anticâncer e os alvos potenciais de anticorpos (entre parênteses) que podem ser usados em combinação com a presente invenção: Abagovomabe (CA-125), Abciximabe (CD41), Adecatumumabe (EpCAM), Afutuzumabe (CD20), Alacizumabe pegol (VEGFR2), Altumomabe pentetato (CEA), Amatuximabe (MORAb-009), Anatumomabe mafenatox (TAG- 72), Apolizumabe (HLA-DR), Arcitumomabe (CEA), Bavituximabe (fosfatidilserina), Bectumomabe (CD22), Belimumabe (BAFF), Bevacizumabe (VEGF-A), Bivatuzumabe mertansina (CD44 v6), Blinatumomabe (CD19), Brentuximabe vedotina (CD30 TNFRSF8), Cantuzumabe mertansina (mucina CanAg), Cantuzumabe ravtansina (MUC1), Capromabe pendetida (células de carcinoma prostático), Carlumabe (CNTO888), Catumaxomabe (EpCAM, CD3), Cetuximabe (EGFR), Citatuzumabe bogatox (EpCAM), Cixutumumabe (receptor de IGF-1), Claudiximabe (Claudina), Clivatuzumabe tetraxetan (MUC1), Conatumumabe (TRAIL-R2), Dacetuzumabe (CD40), Dalotuzumabe (receptor de fator I de crescimento de tipo insulina), Denosumabe (RANKL), Detumomabe (linforma de células B), Drozitumabe (DR5), Ecromeximabe (gangliosídeo GD3), Edrecolomabe (EpCAM), Elotuzumabe (SLAMF7), Enavatuzumabe (PDL192), Ensituximabe (NPC-1C), Epratuzumabe (CD22), Ertumaxomabe (HER2/neu, CD3), Etaracizumabe (integrina αvβ3), Farletuzumabe (receptor 1 de folato), FBTA05 (CD20), Ficlatuzumabe (SCH 900105), Figitumumabe (receptor de IGF- 1), Flanvotumabe (glicoproteína 75), Fresolimumabe (TGF-β), Galiximabe (CD80), Ganitumabe (IGF-I), Gemtuzumabe ozogamicina (CD33), Gevokizumabe (IL-1β), Girentuximabe (anidrase carbônica 9 (CA-IX)), Glembatumumabe vedotina (GPNMB), Ibritumomabe tiuxetan (CD20), Icrucumabe (VEGFR- 1), Igovoma (CA-125), Indatuximabe ravtansina (SDC1), Intetumumabe (CD51), Inotuzumabe ozogamicina (CD22), Ipilimumabe (CD152), Iratumumabe (CD30), Labetuzumabe (CEA), Lexatumumabe (TRAIL-R2), Libivirumabe (antígeno na superfície de hepatite B), Lintuzumabe (CD33), Lorvotuzumabe mertansina (CD56), Lucatumumabe (CD40), Lumiliximabe (CD23), Mapatumumabe (TRAIL-R1), Matuzumabe (EGFR), Mepolizumabe (IL-5), Milatuzumabe (CD74), Mitumomabe (gangliosídeo GD3), Mogamulizumabe (CCR4), Moxetumomabe pasudotox (CD22), Nacolomabe tafenatox (antígeno C242), Naptumomabe estafenatox (5T4), Narnatumabe (RON), Necitumumabe (EGFR), Nimotuzumabe (EGFR), Nivolumabe (IgG4), Ofatumumabe (CD20), Olaratumabe (PDGF-R α), Onartuzumabe (quinase de receptor de fator de dispersão humano), Oportuzumabe monatox (EpCAM), Oregovomabe (CA- 125), Oxelumabe (OX-40), Panitumumabe (EGFR), Patritumabe (HER3), Pemtumoma (MUC1), Pertuzumabe (HER2/neu), Pintumomabe (antígeno de adenocarcinoma), Pritumumabe (vimentina), Racotumomabe (ácido N-glicolilneuramínico), Radretumabe (domínio-B extra de fibronectina), Rafivirumabe (glicoproteína do vírus da raiva), Ramucirumabe (VEGFR2), Rilotumumabe (HGF), Rituximabe (CD20), Robatumumabe (receptor de IGF-1), Samalizumabe (CD200), Sibrotuzumabe (FAP), Siltuximabe (IL-6), Tabalumabe (BAFF), Tacatuzumabe tetraxetan (alfa-fetoproteína), Taplitumomabe paptox (CD19), Tenatumomabe (tenascina C), Teprotumumabe (CD221), Ticilimumabe (CTLA-4), Tigatuzumabe (TRAIL-R2), TNX-650 (IL-13), Tositumomabe (CD20), Trastuzumabe (HER2/neu), TRBS07 (GD2), Tremelimumabe (CTLA-4), Tucotuzumabe celmoleucina (EpCAM), Ublituximabe (MS4A1), Urelumabe (4- 1BB), Volociximabe (integrina α5β1), Votumumabe (antígeno tumoral CTAA16.88), Zalutumumabe (EGFR), Zanolimumabe (CD4).
5. Citocinas, Quimiocinas, Moléculas Coestimuladoras, Proteínas de Fusão
[0372] O uso combinado das composições farmacêuticas que codificam antígeno da presente invenção com citocinas, quimiocinas, moléculas coestimuladoras e/ou proteínas de fusão das mesmas para estimular efeitos imunes benéficos de modulação ou inibição de tumor é outra concretização da presente invenção. Para aumentar a infiltração de células imunes no tumor e facilitar o movimento de células apresentadoras de antígeno para os gânglios linfáticos que drenam o tumor, várias quimiocinas com estruturas C, CC, CXC e CX3C podem ser usadas. Algumas das quimiocinas mais promissoras são, por exemplo, CCR7 e seus ligantes CCL19 e CCL21, além de CCL2, CCL3, CCL5 e CCL16. Outros exemplos são CXCR4, CXCR7 e CXCL12. Além disso, moléculas coestimuladoras ou reguladoras tais como, por exemplo, ligantes B7 (B7.1 e B7.2), são úteis. Também são úteis outras citocinas tais como, por exemplo, especialmente interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL17), interferons (por exemplo, IFNalfa1 IFNalfa8, IFNalfa10, IFNalfa13, IFNalfa14, IFNalfa16, IFNalfa17, IFNalfa21, IFNbeta1, IFNW, IFNE1 e IFNK), fatores hematopoiéticos, TGF (por exemplo, TGF-α, TGF-β e outros membros da família TGF), finalmente, membros da família de receptores de fator de necrose de tumor e seus ligantes, bem como outras moléculas estimuladoras compreendendo, porém sem limitações, 4-1BB, 4-1BB-L, CD137, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFR1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.beta.R, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn114, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT e CD95 (Fas/APO-1), proteína relacionada ao TNFR induzida por glucocorticoides, proteína de mediação de apoptose relacionada ao receptor de TNF (TRAMP) e receptor-6 de morte (DR6). Especialmente, CD40/CD40L e OX40/OX40L são alvos importantes para imunoterapia combinada em virtude de seu impacto direto sobre a sobrevivência e proliferação de células T. Para uma revisão vide Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340.
6. Tratamentos Bacterianos
[0373] Os investigadores têm usado bactérias anaeróbicas, tal como Clostridium novyi, para consumir o interior de tumores pobres em oxigênio. Estes deverão, então, morrer quando entram em contato com partes oxigenadas do tumor, significando que eles seriam inócuas para o resto do corpo. Outra estratégia é o uso de bactérias anaeróbicas que tenham sido transformadas com uma enzima que pode converter um pró-fármaco não tóxico em um fármaco tóxico. Com a proliferação das bactérias nas áreas necróticas e hipóxicas do tumor, a enzima é expressa apenas no tumor. Assim, um pró-fármaco sistemicamente aplicado é metabolizado em um fármaco tóxico apenas no tumor. Foi demonstrado que isto é eficaz com os esporogenes anaeróbicos de Clostridium não patogênicos.
7. Inibidores de Quinase
[0374] Outro grande grupo de alvos potenciais para terapia complementar de câncer compreende inibidores de quinase, uma vez que o crescimento e sobrevivência de células cancerosas estão estreitamente interligados à desregulação de atividade de quinase. Para restaurar a atividade normal de quinase e, portanto, reduzir o crescimento do tumor, uma ampla variedade de inibidores estão sendo usados. O grupo de quinases objetivadas compreende quinases de tirosina de receptor, por exemplo, CR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-2/ErbB2, IGF-IR, PDGFR-α, PDGFR-β, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFR1, FGFR3, FGFR4, CSF1R, c-Met, RON, c-Ret, ALK, quinases de tirosina citoplasmáticas, por exemplo, c-SRC, c-YES, Abl, JAK-2, quinases de serina/treonina, por exemplo, ATM, Aurora A & B, CDKs, mTOR, PKCi, PLKs, b-Raf, S6K, STK11/LKB1, e quinases de lipídios, por exemplo, PI3K, SK1. Inibidores de quinase de pequenas moléculas são, por exemplo, . PHA-739358, Nilotinibe, Dasatinibe e PD166326, NSC 743411, Lapatinibe (GW-572016), Canertinibe (CI-1033), Semaxinibe (SU5416), Vatalanibe (PTK787/ZK222584), Sutent (SU11248), Sorafenibe (BAY 43-9006) e Leflunomida (SU101). Para mais informações vide, por exemplo, Zhang et al. 2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39.
8. Receptores de Tipo Toll
[0375] Os membros da família do receptor de tipo Toll (TLR) são um elo importante entre a imunidade inata e adaptativa e o efeito de vários adjuvantes depende da ativação de TLRs. Um grande número de vacinas estabelecidas contra o câncer incorporam ligantes de TLR para aumentar a resposta à vacina. Além TLR2, TLR3, TLR4, especialmente TLR7 e TLR8 foram examinados para terapia de câncer em abordagens de imunoterapia passiva. TLR7 e TLR8 intimamente relacionadas contribuem para respostas antitumor ao afetar células imunes, células tumorais e o microambiente tumoral e podem ser ativados por estruturas análogas de nucleosídeos. Todos os TLR têm sido usado como produtos imunoterapêuticos independentes ou adjuvantes para vacinas contra o câncer e podem ser combinados sinergicamente com as formulações e métodos da presente invenção. Para mais informações vide van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49- 55.
9. Inibidores de Angiogênese
[0376] Além de terapias as quais objetivam receptores moduladores imunes afetados por mecanismos de evasão mediados por tumor e supressão imune, há terapias as quais objetivam o ambiente tumoral. Inibidores de angiogênese impedem o crescimento extensivo de vasos sanguíneos (angiogênese) que os tumores necessitam para sobreviver. A angiogênese promovida por células tumorais para satisfazer seus requisitos de nutrientes e oxigênio cada vez maiores, por exemplo, pode ser bloqueada por diferentes moléculas de objetivação. Exemplos não limitativos de moléculas mediadoras de angiogênese ou inibidores de angiogênese os quais podem ser combinados com a presente invenção são VEGF solúveis (isoformas VEGF121 e VEGF165 de VEGF, receptores de VEGFR1, VEGFR2 e correceptores Neuropilina-1 e Neuropilina-2) e NRP-1, angiopoietina 2, TSP-1 e TSP-2, angiostatina e moléculas relacionadas, endostatina, vasostatina, calreticulina, fator-4 de plaquetas, TIMP e CDAI, Meth-1 e Meth-2, IFN-α, -β e -y, CXCL10, IL-4, -12 e -18, protrombina (domínio kringle-2), fragmento de antitrombina III, prolactina, VEGI, SPARC, osteopontina, maspina, canstatina, proteína relacionada à proliferina, restina e fármacos tais como, por exemplo, bevacizumabe, itraconazol, carboxiamidotriazol, TNP-470, CM101, IFN-α, fator-4 de plaquetas, suramina, SU5416, trombospondina, antagonistas de VEGFR, esteroides angiostáticos + heparina, fator de inibição de angiogênese derivado de cartilagem, inibidores de metaloproteinase da matriz, 2-metoxiestradiol, tecogalan, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, inibidores de prolactina αVβ3, linomida, tasquinimod; para revisão vide Schoenfeld e Dranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9): 976-81.
10. Fármacos Para Terapia Objetivada de Pequenas Moléculas
[0377] Fármacos para terapia objetivada de pequenas moléculas são, em geral, inibidores de domínios enzimáticos em proteínas com mutação, superexpressas ou de outro modo críticas dentro da célula cancerosa. Exemplos proeminentes e não limitativos são os inibidores de quinase de tirosina imatinibe (Gleevec/Glivec) e gefitinibe (Iressa). O uso de pequenas moléculas, por exemplo, sunitinibe malato e/ou sorafenibe tosilato que objetivam algumas quinases em combinação com vacinas para terapia de câncer também é descrito no Pedido de Patente US2009004213 anterior.
11. Vacinas Com Base em Vírus
[0378] Há uma série de vacinas contra o câncer com base em vírus disponíveis ou em desenvolvimento, as quais podem ser usadas em uma abordagem terapêutica combinada em conjunto com as formulações da presente invenção. Uma vantagem do uso de tais vetores virais é sua capacidade intrínseca de iniciar respostas imunes, com reações inflamatórias que ocorrem como um resultado da infecção viral criando o sinal de perigo necessário para ativação imune. Um vetor viral ideal deverá ser seguro e não deverá introduzir uma resposta imune antivetor para permitir o reforço de respostas antitumor específicas. Vírus recombinantes, tais como o vírus da vaccinia, vírus do herpes simplex, adenovírus, vírus adeno-associado, retrovírus e vírus avipox, têm sido usados em modelos de tumores animais e, com base em seus resultados encorajadores, ensaios clínicos humanos foram iniciados. Vacinas com base em vírus Eespecialmente importantes são partículas de tipo vírus (Virus-Like Particles - VLPs), pequenas partículas que contêm determinadas proteínas do revestimento externo de um vírus. Partículas de tipo vírus não contêm qualquer material genético do vírus e não podem provocar uma infecção, mas elas podem ser construídas para apresentar antígenos tumorais sobre seu revestimento. As VLPs podem ser derivadas de diferentes vírus tais como, por exemplo, o vírus da hepatite B ou outras famílias de vírus, incluindo Parvoviridae (por exemplo, vírus adeno- associado), Retroviridae (por exemplo, HIV) e Flaviviridae (por exemplo, vírus da hepatite C). Para uma revisão geral vide Sorensen and Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11): 1177-93; partículas de tipo vírus contra o câncer são revistas em Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11): 1569-83; e em Guillén et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133.
12. Estratégias Multiepitópicas
[0379] O uso de múltiplos epítopos mostra resultados promissores para vacinação. Tecnologias de sequenciamento rápido combinadas com sistemas de algoritmos inteligentes permitem a exploração do mutanoma do tumor e podem fornecer múltiplos epítopos para vacinas individualizadas as quais podem ser combinadas com a presente invenção. Para mais informações vide 2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762-772; além de Castle et al. 2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5): 1081-91.
13. Transferência Adotiva de Células T
[0380] Por exemplo, uma combinação de vacinação com antígeno tumoral e transferência de células T é descrita em: Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3): 788-97.
14. Terapias Alvo com Base em Peptídeos
[0381] Peptídeos podem se ligar a receptores sobre a superfície celular ou matriz extracelular afetada ao redor do tumor. Radionuclídeos os quais estão presos a estes peptídeos (por exemplo, RGDS) eventualmente matam a célula cancerosa se o nuclídeo cai na proximidade da célula. Especialmente, oligo- ou multímeros destes motivos de ligação são de grande interesse, uma vez que isto pode levar à especificidade e avidez pelo tumor aprimoradas.Para exemplos não limitativos vide Yamada 2011: Peptide- based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61.
15. Outras Terapias
[0382] Há numerosas outras terapias para o câncer que podem ser combinadas com as formulações e métodos da presente invenção para criar efeitos sinérgicos. Exemplos não limitativos são tratamentos que objetivam a apoptose, hipertermia, terapia hormonal, terapia com telomerase, terapia de potencialização de insulina, terapia gênica e terapia fotodinâmica.
[0383] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitativos do âmbito da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: Geração e teste de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN18.2 e CD3 a. Origem de sequência, desenhos das construções de bi- scFv e clonagem em vetores de expressão
[0384] Construções de anticorpos com uma única cadeia em tandem biespecíficos (bi-scFv) que contém domínios de ligação específicos para o componente receptor de células T humanas CD3 e antígenos associados a tumor humano (Tumor Associated Antigen - TAA) foram preparados. As regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes para cada construção foram especificamente arranjadas do N- para o C-terminal na ordem consecutiva: N - VHαCLDN18.2 - VLαCLDN18.2 - VHαCD3 - VLαCD3-C (1BiMAB, 18PHU5, no.11-15) N - VHαCD3 - VLαCD3 - VHαCLDN18.2 - VLαCLDN18.2-C (18PHU3, no.16-20)
[0385] A Tabela 1 resume todas as construções de bi-scFv específicos para os TAAs CLDN18.2 e PLAC1 que foram gerados no curso da invenção. As construções de bi-scFv foram geradas por meio de síntese gênica pela GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Alemanha) usando as sequências de VH e VL dos anticorpos correspondentes. Otimizações de códons, tais como Homo sapiens (HS), Mus musculus (MM) ou Ovário de Hâmster Chinês (CHO), foram implementadas pelo software GeneOptimizer® da GeneArt e estão listadas na Tabela 1. Informações sobre a especificidade, origem de sequência de anticorpos monoclonais (mAB), uso de códons, características de sequência adicionais e referências de todos os domínios aplicados estão resumidas na Tabela 2. A origem de sequência do domínio variável dos respectivos anticorpos à CD3 está listada na Tabela 2. Em virtude da elevada homologia dos TAAs humano e de camundongo, as mesmas sequências de VH e VL anti-TAA podem ser usadas para a geração de construções de bi-scFv para os ensaios com camundongo, mas em combinação com as sequências de VH, VL do clone 145-2C11 de anticorpo anti-CD3 específico para camundongo.
[0386] Construção do vetor de expressão e clonagem de DNA foi realizada de acordo com procedimentos convencionais (Green/Sambrook, Molecular Cloning, 2012) bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, as sequências de DNA do bi-scFv foram fornecidas com um sítio de restrição HindIII 5' e um XhoI 3' (HindIII e XbaI no caso do bi-scFv 1BiMAB) para clonagem em plasmídeos de expressão. Uma sequência sinalizadora de secreção foi introduzida na extremidade 5' a montante da sequência do bi-scFv para secreção de proteínas do citoplasma celular no meio de cultura. Uma sequência de codificação para um ligante peptídico de glicina-serina flexível de 15 a 18 aminoácidos foi inserida para unir os domínios VH e VL para a composição dos fragmentos de anticorpos variáveis com uma única cadeia (scFv), um dos quais se liga à CD3 e o outro ao TAA . Para formar um anticorpo com uma única cadeia biespecífico, as duas sequências de domínios scFv foram ligadas através de uma sequência que codifica um ligante peptídico curto (GGGGS). Juntamente com esta sequência ligante, um sítio de restrição BamHI foi introduzido para trocas de domínios scFv para clonagem das próximos construções de bi-scFv. Em profundidade, 5'scFv-domínios poderiam ser trocados através de restrição com HindIII e BamHI e 3'scFv-domínios através de restrição com BamHI e XhoI. Para esquemas do construto vide também Figura. 1.
[0387] Todas as construções de anticorpo bi-scFv usadas foram clonadas no vetor de expressão de mamífero convencional pcDNA™3.1/myc-His (+) (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). O marcador 6xHis no C-término serviu para purificação por afinidade de metal da proteína e para análise de detecção. Todas as construções foram verificadas por meio de sequenciamento através da MWG's Single Read Sequence Service (MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha).Tabela 1: Sumário de TAA e construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos específicos para CD3Tabela 2: Sumário de informação sobre construção bi-scFv Tabela 2 – Continuação
b. Geração de linhagens de células produtoras estáveis
[0388] Para gerar clones de células produtoras estáveis de proteínas bi-scFv específicas para CLDN18.2, a linhagem de células de rim embrionário humano HEK293 (ATCC CRL-1573) e a linhagem de células de Ovário de Hâmster Chinês CHO-K1 (ATCC CCL-61) foram usadas.
Transfecção de HEK293
[0389] 1x107 células HEK293 foram cultivadas dois dias antes de transfecção sobre discos de cultura tecidual de 14,5 cm em 20 ml de meio DMEM completo (DMEM/F-12 GlutaMax suplementado com FBS termicamente inativado a 10% e penicilina-estreptomicina a 0,5%; todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Antes de transfecção, as células foram lavadas com DPBS suplementado com EDTA a 2 mM, então, foram adicionados 20 ml de meio DMEM simples sem FBS ou antibióticos. 20 μg de DNA linearizado das construções descritas no Exemplo 1.a foram diluídos em 0,5 ml de meio DMEM/F-12 simples. 75 μl de solução de PEI linear a 1 mg/ml (polietilenimina; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Alemanha) foram adicionados ao DNA diluído e rigorosamente agitados. Após 15 minutos de incubação em TA, os complexos de DNA/PEI foram adicionados gota a gota às células, os discos de cultura de células foram suavemente centrifugados e, então, incubados a 37 °C, 5% de CO2. 24 horas após transfecção, o meio foi trocado. A seleção de células transfectadas começou 48h após transfecção com sulfato G418 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) em uma concentração final de 0,8 mg/ml. G418 foi adicionado permanentemente ao meio de cultura para cultura de células.
Transfecção de CHO-K1
[0390] 1x106 células CHO-K1 foram cultivadas um dia antes de transfecção em placas de cultura tecidual com 6 cavidades em 2 ml de meio DMEM completo (DMEM/F-12 GlutaMax suplementado com FBS termicamente inativado a 10%, sem antibióticos; todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Antes de transfecção, as células foram lavadas com DPBS suplementado com EDTA a 2 mM, então, foram adicionados 1,5 ml de meio DMEM simples sem FCS ou antibióticos. 4 μg de DNA linearizado das construções descritas no Exemplo 1.a foram diluídos em 0,25 ml de DMEM simples/meio F-12 e misturados suavemente. Em um segundo tubo de reação, 2,5 μl de Lipofectamine 2.000 (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) foram diluídos em 0,25 ml de meio DMEM/F12 simples, misturados suavemente e incubados durante 5 min em TA. Mistura de DNA e mistura de Lipofectamine foram combinadas na proporção de 1:1, suavemente misturadas e incubadas durante 20 min em temperatura ambiente. Os complexos de DNA/Lipofectamine 2000 foram adicionados gota a gota às células, os discos de cultura de células foram suavemente centrifugados e, então, incubados a 37 °C, 5% de CO2. 6h após transfecção, o meio foi trocado para meio completo DMEM/F-12. As células foram divididas ao dia seguinte em uma proporção de 1:10. Seleção de células transfectadas começou 48h após transfecção com sulfato G418 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha), em uma concentração final de 0,5 mg/ml. G418 foi adicionado permanentemente ao meio de cultura para cultura de células.
c. Seleção de células HEK293 como células produtoras
[0391] Expressão de proteínas bi-scFv por linhagens de células HEK293 e CHO-K1 estavelmente transfectadas descritas no Exemplo 1.b foi caracterizada por coloração de imunofluorescência para detectar a expressão de bi-scFv de acordo com procedimentos convencionais (Current Protocols in Immunology, 2012). Resumidamente, 2x105 células foram crescidas em lâminas de vidro durante 24 horas e, então, permealizadas com PFA a 2%. DPBS suplementado com BSA a 5% e saponina a 0,2% foi usado como tampão de bloqueio. Após lavagem com DPBS e bloqueio com um tampão de bloqueio, as células foram incubadas com o anticorpo primário anti- Epítopo-Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio durante 30 minutos em TA. Após lavagem com tampão de bloqueio, um anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com Cy3 (H+L) (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio e incubado durante 3 h em TA. Após lavagem com tampão de bloqueio e H2O, as células foram incrustadas em meio de montagem DAKO (Dako, Carpinteria, CA, EUA) suplementado com corante Hoechst 33342 (Pierce/Thermo Fisher Scientific,Rockford, IL, EUA). As lâminas foram investigadas e fotografadas com um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse-Ti quanto à presença de células positivas para bi- scFv (dados não mostrados). Células HEK293 mostraram uma melhor expressão global de proteínas bi-scFv do que as células CHO-K1 e, portanto, foram escolhidas como linhagem de células produtoras.
d. Produção e detecção de proteína bi-scFv 1BiMAB com HEK293 clone #28
[0392] Bi-scFv 1BiMAB foi escolhido como a primeira proteína bi-scFv a ser produzida, purificada e usada para o estabelecimento de vários ensaios. Para esta finalidade, linhagens de células clonais de células HEK293 densas que expressam estavelmente 1BiMAB (vide Exemplo 1.b) foram produzidas por triagem de única célula usando um classificador de células FACSAria (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Após expansão de aproximadamente 40 linhagens clonais, o melhor clone produtor foi selecionado por imunofluorescência, conforme descrito no Exemplo 1.c.
[0393] O clone produtor #28 selecionado foi expandido e cultivado em um Cell Factory (Nunc, Roskilde, Dinamarca) de 10 camadas em DMEM/F-12 GlutaMax suplementado com FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 0,5% e 0,8 mg/mL de G418 (todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante. No estágio confluente, as células foram lavadas com DPBS e o meio foi trocado para DMEM/F-12 com antibióticos, mas sem FBS. Sobrenadante celular contendo proteína bi-scFv 1BiMAB foi coletado a cada 3-5 dias durante até 4 semanas. O sobrenadante foi filtrado com 500 ml de Steritop Filter Units (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) e armazenado a 4 °C até purificação por FPLC.
[0394] Antes de purificação por FPLC, a presença de bi-scFv no sobrenadante da cultura de células foi testada por eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido por coloração com Coomassie e análise Western blot realizada pelo padrão (Current Protocols in Protein Science, 2012). O sobrenadante foi concentrado 5x - 10x por Centricon Centrifugal Filter Devices -10K MWCO (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Sobrenadantes concentrados e não concentrados foram separados em géis de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Subsequentemente, os géis foram corados com solução de Azul Brilhante de Coomassie de acordo com procedimentos convencionais para detecção de proteína bi-scFv 1BiMAB entre 50 e 60 kD e outras proteínas contidas no sobrenadante da cultura de células. Análise Western blot foi realizada para detectar especificamente a proteína bi- scFc 1BiMAB através de sua 6xHis-tag. Resumidamente, após blotting das proteínas sobre uma membrana de PVDF e bloqueio com PBST/leite em pó a 3%, a membrana foi incubada durante 1 h a 4 °C com o anticorpo primário anti-Epítopo- Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio. Após lavagem com tampão de bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase Fc- específico (Sigma Aldrich, Alemanha) diluído a 1:10000 em tampão de bloqueio durante 1 hora a 4 °C. Após lavagem com tampão de bloqueio, os sinais foram visualizados por SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) e registrados por um ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha). Foram detectados sinais de bi-scFv entre 50 e 60 kD, quando comparado com o padrão de peso molecular interno (vide Figuras 3A e B).
e. Purificação e quantificação de proteína bi-scFv 1BiMAB
[0395] Sobrenadante da cultura de células HEK293 clone #28 contendo proteína bi-scFv 1BiMAB (descrito no Exemplo 1.d) foi submetido à cromatografia de afinidade com metal imobilizado (Immobilized Metal Affinity Chromatography - IMAC) usando procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012). Resumidamente, o sobrenadante da cultura de células filtrado foi carregado sobre uma coluna His Trap FF de 5 ml conectada a um sistema AKTA Purifier 10 FPLC (ambos da GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha). Tampão de lavagem de PBS continha imidazol a 10 mM, tampão de eluição de PBS continha NaCl a 500 mM, NaH2PO4 a 50 mM e imidazol a 250 mM, o pH de ambos os tampões foi ajustado para 7,4. A eluição foi realizada com um gradiente por etapas. Proteína bi-scFv 1BiMAB eluída foi imediatamente submetida à diálise contra 1x PBS usando um Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassette 10K MWCO (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). Após diálise contra 1x PBS, bi-scFv foi submetida à diálise contra um tampão de arginina a 200 mM com base em H2O (monocloridrato de L-Arginina; Roth, Karlsruhe, Alemanha).
[0396] A concentração Bi-scFv foi determinada através de medição a 280 nm com um NanoDrop 2000c sob consideração do coeficiente de extinção e o peso molecular da proteína bi-scFv 1BiMAB foi determinado por meio da ferramenta ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/). A proteína purificada foi transformada em alíquotas e armazenada a -80 °C para armazenamento a longo prazo ou mantida a 4 °C para uso imediato.
[0397] A qualidade e pureza da proteína bi-scFv 1BiMAB foram testadas por meio de coloração com Coomassie e análise Western blot, conforme descrito no Exemplo 1.d (vide também Figuras 3A e B). Uma diluição padrão de BSA foi incluída no procedimento com Coomassie para confirmar aproximadamente a concentração medida por NanoDrop (dados não mostrados).
f. Estabelecimento de um ensaio ELISA
[0398] Para a quantificação de 1BiMAB no sobrenadante da cultura de células HEK293, um ensaio ELISA específico teve de ser estabelecido. Para esta finalidade, sobrenadante do Exemplo 1.d. e proteína bi-scFv 1BiMAB purificada descrita no Exemplo 1.e foram usados. Placas Ni- NTA pré-bloqueadas com BSA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) foram usadas para imobilizar as proteínas bi-scFv 1BiMAB através da sua 6xHis-tag. Todas as etapas de lavagem foram conduzidas três vezes com 200 μl de 1x PBS/Tween a 0,05% (tampão de lavagem) por cavidade e todas as etapas foram executadas em temperatura ambiente. Como padrão, proteína 1BiMAB purificada foi usada, diluída em 1x PBS dentro da faixa de 10 - 500 ng/ml. Os sobrenadantes foram diluídos a 1:10 em 1x PBS. 100 μl de proteína diluída ou sobrenadante foram transferidos para cada cavidade e incubados durante uma hora enquanto se agitava. Após lavagem, um anticorpo anti-idiotípico contra os domínios VH-VL de mCLDN18.2ab foi diluído para uma concentração final de 0,5 μg/mL em 1x PBS/BSA a 3%. 100 μl da solução de anti-mCLDN18.2ab foram adicionados por cavidade e incubados durante uma hora, com agitação. Após lavagem, um anticorpo anti-Fc de camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) foi diluído para uma concentração final de 300 ng/ml em 1X PBS/BSA a 3%. 100 μl desta solução de anticorpo secundário foram adicionados por cavidade e incubados durante mais uma hora enquanto se agitava. Como controles negativos, anticorpo secundário apenas, 1BiMAB mais anticorpo secundário e anti-mCLDN18.2ab mais anticorpo secundário foram usados. Além disso, sobrenadante de células HEK293 sem proteína bi-scFv foi incluído no ensaio. Finalmente, 50 μl de solução de substrato AP (1,5 mg de pNPP por ml de tampão de substrato, Applichem GmbH, Darmstadt, Alemanha) foram adicionados por cavidade após lavagem. Após 5, 15 e 30 minutos de incubação no escuro, a absorção a 405 nm com um comprimento de onda de excitação de 492 nm foi medida com um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan (Tecan, Mannedorf, Suíça). A concentração de proteína bi-scFv a partir do sobrenadante foi determinada através de cálculo contra a coluna normal (dados não mostrados).
g. Transfecção transitória de proteínas bi-scFv específicas para CLDN18.2 para estudos de comparação
[0399] Para gerar transitoriamente de preferência quantidades elevadas de proteínas bi-scFv específicas para CLDN18.2, a linhagem de células de rim embrionário humano HEK293T (ATCC CRL-11268) foi usada para transfecção.
[0400] 1x107 células HEK293T foram colocadas em placas dois dias antes de transfecção em discos de cultura tecidual de 14,5 cm em 20 ml de meio DMEM completo (DMEM/F- 12 GlutaMax suplementado com FBS a 10% termicamente inativado e penicilina-estreptomicina a 0,5%; todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Antes de transfecção, as células foram lavadas com DPBS suplementado com EDTA a 2 mM, então, foram adicionados 20 ml de meio DMEM simples sem FBS ou antibióticos. 20 μg das construções de DNA circular 1BiMAB, no. 11 - 20 e no. 35 (descrito sob o Exemplo 1.b) foram diluídos em 0,5 ml de meio DMEM simples/F-12. 75 μl de solução de PEI linear a 1 mg/ml (polietilenimina; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Alemanha) foram adicionados ao DNA diluído e vigorosamente agitados. Após 15 minutos de incubação em RT, os complexos de DNA/PEI foram adicionados gota a gota às células, os discos de cultura de células foram suavemente girados e, então, incubados a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h. Após uma troca de meio por DMEM simples/F-12, as células foram incubadas durante mais 48 horas a 33 °C, 5% de CO2. Sobrenadante celular foi coletada após a incubação e filtrado em condições estéreis com 0,2 um Minisart filtros de seringa (Sigma-Aldrich, Alemanha). Subsequentemente, as proteínas bi-scFv foram purificadas em pequena escala a partir dos sobrenadantes de cultura de células por colunas de centrifugação Ni-NTA de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). As concentrações de proteína bi-scFv foram estimadas por meio de um ensaio ELISA conforme descrito no Exemplo 1.f e verificadas por análise Western blot, conforme descrito no Exemplo 1.e (dados não mostrados). As proteínas purificadas foram armazenadas a 4 °C para uso imediato.
Exemplo 2: Elaboração de ensaios funcionais para monitorar a ativação específica de células T e lise de células alvo por células T redirecionadas mediada por proteínas bi-scFv
[0401] Proteína bi-scFv 1BiMAB purificada por FPLC foi usada para estabelecer ensaios in vitro para monitorar a capacidade de proteínas bi-scFv de redirecionar especificamente células efetuadoras humanas para células alvo TAA-positivas. O objetivo era visualizar os efeitos e quantificar a ativação de células T humanas e a lise de células alvo específicas.
a. Análise microscópica de células T redirecionadas a células alvo por proteína bi-scFv
[0402] Para a visualização de funcionalidade de proteínas bi-scFv, um ensaio para mostrar o redirecionamento de células efetuadoras para células alvo que expressam CLDN18.2 por proteínas bi-scFv via microscópio tinha de ser estabelecido. Para esta finalidade, a linhagem de células de carcinoma gástrico NugC4, a qual expressa endogenamente níveis relativamente elevados de CLDN18.2 humano (Sahin U. et al., Cancer Res. Clin. 1 de Dezembro de 2008; 14 (23): 7624-34), foi usada como linhagem de células alvo.
[0403] Células efetuadoras humanas foram recentemente isoladas a partir de sangue humano de doadores saudáveis de acordo com procedimentos convencionais (Current Protocols in Immunology, 2012): resumidamente, o sangue foi diluído com DPBS, colocado em camadas sobre Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha) e centrifugado. Células mononucleares de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) foram coletadas a partir da interfase, lavadas com DPBS gelado suplementado com EDTA a 2 mM e contadas. Células T humanas foram subsequentemente separadas por meio de separação magnética de células ativadas (Magnetic-Activated Cell Separation - MACS) a partir de PBMCs pelo Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante.
[0404] 1x105 células NugC4 foram cultivadas por cavidade em placas de cultura tecidual com 6 cavidades. As células humanas foram preparadas conforme descrito acima e adicionadas em uma proporção de efetuador para alvo (E:T) de 5:1. Meio RPMI 1640 suplementado com soro AB humano termicamente inativado a 5%, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) foi usado para todas as células e o volume final foi ajustado para 2 ml por cavidade. As amostras de controle compreendiam células alvo ou células T apenas com e sem proteína bi-scFv. Placas de cultura tecidual foram subsequentemente incubadas a 37 °C, 5% de CO2. O ensaio foi continuamente observado com um microscópio invertido Wilovert S (Hund, Wetzlar, Alemanha) a partir de 6h até 48h de coincubação. Efeitos significativos em termos de agregação de células T sobre células alvo, formação de uma sinapse imunológica e morte de células alvo na presença de proteína bi-scFv 1BiMAB foram observados em 24 h. Após 48h, células alvo viáveis dificilmente puderam ser encontradas. Fotografias foram tiradas em 24 h com um microscópio invertido Nikon Eclipse TS100 (Nikon, Japão). Vide também Figura 5.
[0405] Este ensaio foi ainda incluído como controle de visibilidade em todos os ensaios Cytotox em vários formatos também.
b. Ativação de células T dependente de alvo por proteína bi-scFv 1BiMAB
[0406] Para a detecção de uma ativação específica de células T humanas por proteínas bi-scFv, um ensaio de citometria de fluxo foi estabelecido. Para a detecção de ativação de células T, o marcador de ativação precoce CD69 e o marcador de ativação tardio CD25 foram selecionados para coloração através de anticorpos conjugados por fluorescência. Para a detecção de células T humanas na mistura de células alvo e células T, CD3 sobre as células T foi corado.
[0407] A configuração de ensaio acima foi escolhida (Exemplo 2.a). Resumidamente, células alvo NugC4 foram cultivadas com células T humanas em uma proporção E:T de 5:1 em 2 ml de meio completo e proteína bi-scFv 1BiMAB foi adicionada em uma concentração dentro da faixa de 0,0011000 ng/ml. As amostras de controle continham células alvo ou células T apenas com e sem proteína bi-scFv 1BiMAB. Após 24 h e/ou 48 h - dependendo do resultado do controle de visibilidade - todas as células foram coletadas por meio de raspagem suave com Cell Scrapers (Sarstedt AG & Co, Nürmbrecht, Alemanha) e transferidas para tubos de fundo redondo de 5 ml (BD Falcon, Heidelberg, Alemanha). As células foram centrifugadas e lavadas com DPBS. Para coloração das células, anticorpo anti-CD3-FITC humano de camundongo, anticorpo anti-CD69-APC humano de camundongo e anticorpo anti-CD35-PE humano de camundongo (todos os anticorpos da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) foram usados. Os pellets celulares foram ressuspensos em 50 μl de tampão para FACS (DPBS suplementado com FBS a 5%) contendo os anticorpos conjugados por fluorescência. Após incubação durante 20 min a 4 °C no escuro, as amostras foram lavadas com 4 ml de DPBS e os pellets celulares foram ressuspensos em 200 μl de tampão para FACS contendo iodeto de propídio (PI) ou 7-AAD (ambos da Sigma Aldrich, Alemanha) em uma final diluição de 1:1000 para detecção de células mortas. As amostras foram mantidas sobre gelo e no escuro durante toda a medição. Estabelecimento do ensaio foi realizado com um FACSCalibur; medições posteriores foram realizadas com um citômetro de fluxo FACSCanto II (ambos da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A análise foi avaliada por um software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).
[0408] Conforme mostrado nas Figuras 6A e B, nenhuma ativação de células T mediada por 1BiMAB é detectável na ausência de células alvo que são a base da dependência do alvo de funcionalidade de bi-scFv. Uma ativação significativa das células T na presença de células alvo ocorreu com apenas 0,01 ng/ml de 1BiMAB após 24h. Eficiência máxima foi alcançada usando 100 ng/ml de 1BiMAB.
[0409] Além do estudo de ativação de células T, este ensaio também permite a análise qualitativa dos efeitos mediados por bi-scFv sobre a morte de células alvo por ativação sobre a população de células alvo e cálculo da percentagem de células alvo PI- ou 7-AAD-positivas (nenhum dado mostrado). Todas as análises foram realizadas com o software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).
c. Ensaio Cytotox de luciferase
[0410] Para determinar as diferenças sutis no potencial de morte de células alvo de proteínas bi-scFv dirigidas contra CLDN18.2 e CD3, um ensaio altamente sensível tinha de ser desenvolvido. O objetivo era estabelecer um ensaio com o qual a morte de células alvo poderia ser quantitativamente monitorada de uma forma com elevado rendimento. Para alcançar este objetivo, um ensaio Cytotox de luciferase foi escolhido. Aqui, a medição da expressão de luciferase por células alvo viáveis permite determinar indiretamente a lise de células alvo mediada por células efetuadoras citotóxicas na presença de anticorpo.
[0411] Primeiro, células NugC4 (descritas acima) foram transduzidas com um vetor lentiviral portando luciferase de vaga-lume, um gene repórter EGFP e um marcador de seleção de antibiótico. Após seleção com antibióticos de células transduzidas, células com alta expressão de EGFP foram classificadas por um separador de células FACSAria (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha), analisadas quanto à elevada expressão de luciferase e subsequentemente expandidas para estudos posteriores.
[0412] Células efetuadoras humanas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 2.a. Estabelecimento do ensaio foi realizado dentro da faixa de 1-100 ng/ml de proteína bi-scFv 1BiMAB, pelo que descobriu-se que uma concentração de 5 ng/ml resulta em efeitos altamente eficazes e reprodutíveis e foi adicionalmente usada como concentração padrão. Células NugC4 que expressam estavelmente luciferase (descrito acima) foram usadas como células alvo. 1x104 células alvo foram cultivadas por cavidade em placas com 96 cavidades de fundo plano branco. Células T humanas (preparadas conforme descrito no Exemplo 2.a) foram adicionadas em uma proporção E:T de 5:1. O meio descrito acima (Exemplo 2.a) foi usado e o volume final por cavidade foi ajustado para 100 μl. As amostras de teste e amostras de controle foram colocadas em placas pelo menos em triplicata.
[0413] Microplacas de cultura de células foram incubadas durante 24 h e 48 h a 37 °C, 5% de CO2. Para análise, 50 μl de uma solução aquosa contendo 1 mg/ml de luciferina (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e HEPES a 50 mM foram adicionados por cavidade e as placas subsequentemente incubadas durante 30 minutos no escuro a 37 °C. A luminescência resultante da oxidação de luciferina por células viáveis que expressam luciferase foi medida em um leitor de microplacas (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suíça). A percentagem de lise de células alvo específica foi calculada pela fórmula a seguir : % de lise específica = [1 - (luminescênciaamostra de teste - Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100, onde "L" indica a lise. Lmin se refere à lise mínima na ausência de bi-scFv e Lmax à lise máxima (igual à contagem de luminescência espontânea) na ausência de bi- scFv obtida mediante adição de Triton X-100 (concentração final a 2%).
[0414] Efeitos diretos potenciais de proteínas bi- scFv sobre células alvo independente de células efetuadoras foram determinados colocando as células alvo em placas sem células T humanas incluindo todos os controles, tais como Lmin e Lmax.
[0415] Este ensaio foi usado para estudos posteriores para investigar a lise de células alvo mediada por células T específicas. Modificações foram implementadas, por exemplo, variando as concentrações de bi-scFv, proteínas bi-scFv, proporções E:T ou células efetuadoras (células T CD8+, CD4+, PBMCs).
Exemplo 3: Seleção de um candidato protótipo bi-scFv específico para CLDN18.2 Ensaio Cytotox de luciferase com várias proteínas bi-scFv específicas para CLDN18.2 para a seleção da variante de bi- scFv mais potente
[0416] Todas as 10 construções otimizadas para códon de CHO (no. 11-20) específicos para o TAA CLDN18.2 foram testadas em comparação com a proteína bi-scFv com códon otimizado humana em um ensaio Cytotox de luciferase com células alvo NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 e luciferase ectopicamente expressa (vide também Exemplo 2.c). Características das proteínas bi-scFv usadas são especificadas na Tabela 2. Bi-scFv no. 35 específica para o TAA PLAC1 foi usada como controle de isotipo porque PLAC1 não é expresso por células NugC4. A atividade de ligação à CD3 sobre células T humanas foi comprovada em um ensaio de ligação FACS (dados não mostrados). Todas as proteínas bi- scFv foram geradas conforme descrito no Exemplo 1.g e usadas para um ensaio Cytotox configurado conforme descrito no Exemplo 2.c.
[0417] Todas as proteínas bi-scFv foram usadas em uma concentração final de 5 ng/ml. Para determinação de Lmin, proteína bi-scFv de controle no. 35 foi cultivada com células alvo e células T nove vezes, amostras de teste foram colocadas em placas seis vezes. Por ponto de tempo, uma placa foi preparada para análise.
[0418] A lise específica em cada ponto de tempo analisado (8h, 16h, 24h) foi representada graficamente contra as proteínas bi-scFv usadas. Proteínas bi-scFv IBiMAB (SEQ ID NO: 39) e no. 15 (SEQ ID NO: 41) - as quais são construídas na mesma orientação e contêm a mesma sequência anti-CD3 (TR66) e diferem apenas quanto a seu uso de códon ao nível de ácido nucleico e as sequências ligantes - provaram ser os anticorpos mais potentes na mediação de lise de células alvo (vide Figura 2). Uma vez que 1BiMAB e no. 15 são iguais quanto à sua eficiência, a proteína bi-scFv mais investigada 1BiMAB foi selecionada para todos os ensaios seguintes. As construções 18PHU3 e 18PHU5 (vide Tabelas 1 e 2) foram comparados em um ponto de tempo posterior com a 1BiMAB. A eficiência de 18PHU5 era equivalente à 1BiMAB, 18PHU3 foi menos potente (dados não mostrados).
Exemplo 4: Capacidade de ligação de proteína bi-scFv 1BiMAB Estabelecimento de um ensaio de ligação com base em FACS
[0419] Para avaliar a capacidade de ligação de CLDN18.2 e as porções de objetivação de CD3 de proteínas bi-scFv, um ensaio de citometria de fluxo foi estabelecido. Células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 foram usadas para investigar o sítio anti-CLDN18.2 e células T humanas foram usadas para investigar o sítio anti-CD3.
[0420] Para a investigação da capacidade de ligação de anti-CLDN18.2, células NugC4 foram tripsinizadas, lavadas com meio completo RPMI 1640 e, subsequentemente, com DPBS. Todas as etapas de lavagem foram conduzidas por meio de centrifugação a 1200 rpm durante 6 min a 4 °C. 2,5x105 células NugC4 foram transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo e incubadas com 50 μg/ml de proteína 1BiMAB purificada por FPLC em tampão para FACS durante 30 min a 4 °C. As células foram lavadas com 2 ml de tampão para FACS e subsequentemente incubadas com 3,3 μg/ml de anticorpo monoclonal anti-Epítopo-Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) durante 30 min a 4 °C. Após lavagem com 2 mL de tampão para FACS, o pellet de células foi incubado com um anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) em uma diluição de 1:200 em tampão para FACS durante 20 min a 4 °C no escuro. As células foram lavadas duas vezes com 2 ml de tampão para FACS e, finalmente, ressuspensas em 150 μl de tampão para FACS suplementado com 1 μg/mL de PI (Sigma Aldrich, Alemanha) para contra- coloração de células mortas. Outra coloração com o mesmo procedimento foi incluída usando 50 μg/ml de 1BiMAB e anticorpo monoclonal secundário da cabra anti-camundongo conjugado com APC (1:200), mas sem anticorpo anti-Epítopo- Tag HIS. As amostras de controle negativo incluíam anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC apenas, anticorpo anti-Epítopo-Tag HIS mais anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC. Como controle positivo, 10 μg/ml de anticorpo monoclonal específico para CLDN18.2 mCLDN18.2ab corado com anticorpo secundário de cabra anti-humano conjugado com APC (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) e seu controle de anticorpo secundário apenas foram implementados.
[0421] As amostras foram medidas com um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e analisadas pelo software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA). Sinais mais fortes foram detectados por coloração sequencial com 1BiMAB, anti-Epítopo-Tag HIS e anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com APC. A intensidade do sinal foi comparável ao controle positivo mCLDN18.2ab com anticorpo de cabra anti-humano conjugado com APC. Uma baixa ligação direta do anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com APC à 1BiMAB foi observada na amostra corada com 1BiMAB e anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com APC sem anti-Epítopo-Tag HIS (vide Figura 4A).
[0422] Para todos os outros ensaios de ligação por FACS, para investigar a capacidade de ligação de proteínas bi-scFv, o protocolo de coloração sequencial com bi-scFv, anti-Epítopo-Tag HIS e anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado com APC foi usado (vide Figuras 4B, C e D). Para excluir uma ligação inespecífica de 1BiMAB, células alvo que não expressam CLDN18.2, conforme verificado por RT-PCR (dados não mostrados), foram submetidas ao ensaio de ligação com base em FACS. Nenhuma ligação inespecífica de 1BiMAB foi detectada, conforme mostrado na Figura 4D.
[0423] Para investigar a capacidade de ligação do braço anti-CD3 da proteína bi-scFv 1BiMAB, foram usadas células T humanas. 1x106 células T preparadas conforme descrito no Exemplo 2.a foram transferidos para tubos de 5 ml de fundo redondo e incubadas com proteína 1BiMAB purificada por FPLC na faixa de 0,002-2 μg/ml em tampão para FACS durante 30 min a 4 °C. Além disso, o procedimento de coloração foi conforme descrito acima. As amostras de controle incluíam anticorpo secundário de cabra anti- camundongo conjugado com APC apenas e o anticorpo monoclonal anti-Epítopo-Tag HIS mais anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC. Medição e análise foram realizadas conforme descrito acima. Um sinal significativo foi obtido com 2 μg/ml de 1BiMAB (vide Figura 4C).
Exemplo 5: Investigação de ativação de células T dependente de alvo altamente específica por bi-scFv 1BiMAB
[0424] Linhagens de células de câncer que expressam endogenamente níveis elevados ou baixos de CLDN18.2 e linhagens de células de câncer que não expressam CLDN18.2 foram escolhidas para provar a estrita dependência do alvo de proteína bi-scFv 1BiMAB em um ensaio Cytotox in vitro. As linhagens de células escolhidas foram dos dois tipos predominantes de carcinoma que expressam CLDN18.2: carcinoma gástrico (NugC4, MKN7, SNU-1) e pancreático (DanG, KP-4). A linhagem de células de carcinoma de mama MCF7 foi usada como controle negativo.
a. RT-PCR de CLDN18.2 de linhagens de células de câncer
[0425] O RNA total foi extraído das linhagens de células de carcinoma mencionadas acima através de um procedimento RNEasy Mini Kit de acordo com o protocolo do fabricante (Quiagen, Hilden, Alemanha). 5 μg de RNA foram usados para a síntese de cDNA com Superscript II Reverse Transcriptase (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha).
[0426] Análises RT-PCR foram executadas em um ABI Prism 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) usando corante Sybr Green e os seguintes iniciadores:CLDN18.2: for TGGCTCTGTGTCGACACTGTG; rev GTGTACATGTTAGCTGTGGAC HPRT: for TGACACTGGCAAAACAATGCA; rev GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT
[0427] Delta Ct foi calculado subtraindo-se o valor Ct do gene "housekeeping" HPRT do valor de Ct de CLDN18.2 (para resultados vide Figura 7A).
b. Ativação exclusiva de células T na presença de CLDN18.2
[0428] Um ensaio citotóxico foi configurado conforme descrito no Exemplo 2.a. As linhagens de células de carcinoma examinadas quanto a transcritos de CLDN18.2 sob o Exemplo 5.a via RT-PCR quantitativa foram usadas como células alvo. A concentração de proteína bi-scFv 1BiMAB neste ensaio foi ajustada para 5 ng/ml. As células alvo foram cultivadas com células T humanas e 1BiMAB em duplicata para análise de ativação de células T. Para monitorar qualquer alorreatividade potencial das células T contra as células alvo independentemente de proteína bi-scF 1BiMAB, células alvo e células T foram cultivadas sem 1BiMAB em duplicatas. As células foram continuamente visualizadas através de um microscópio para observar o agrupamento de células T e ligação de células alvo. No caso da linhagem de células NugC4 com alta expressão de CLDN18.2, os efeitos ocorreram após 24 horas; após 48h, células alvo viáveis dificilmente eram visíveis. No caso da linhagem de células DanG com baixa expressão de CLDN18.2, os primeiros efeitos foram observados após 96h e efeitos significativos após 120h. Com as linhagens de células negativas para CLDN18.2, nenhum efeito indicando qualquer ativação de células T pôde ser observado, mesmo após 144 h. As células T de todas as amostras foram analisadas após 144 h de coincubação com células alvo através de citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 2.a, quanto ao marcador de ativação de células T precoce CD69 e o marcador de ativação tardia CD25, contra-coradas com CD3 para a população de células T e PI para células mortas. Curiosamente, até 100% das células T coincubadas com NugC4 e 1BiMAB eram positivas para CD25, mas negativas para CD69, indicando uma ativação de células T a longo prazo quando regulação negativa de CD69 já tinha ocorrido. Aproximadamente 75% das células T coincubadas com DanG e 1BiMAB foram ativadas, das quais cerca de 40% expressavam simultaneamente CD25 e CD69, indicando uma ativação de células T que está ainda em curso. As células T coincubadas com as linhagens de células negativas para CLDN18.2 não mostraram qualquer sinal de indução de ativação de células T: nem expressão de CD69 nem de CD25 foi significativamente elevada comparado com os níveis nas amostras sem 1BiMAB (vide também Figura 7B).
Exemplo 6: Investigação de função de células T induzida por proteína bi-scFv 1BiMAB a. Indução de proliferação de células T
[0429] A proliferação de células T é um indicador da ativação de células T. Para mostrar a proliferação de células T em resposta à proteína bi-scFv 1BiMAB na presença de células alvo positivas para CLDN18.2, foi usado um ensaio de citometria de fluxo. Resumidamente, 1x106 células T humanas isoladas conforme descrito no Exemplo 2.a foram coradas no escuro a 37 °C durante 10 min com succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína a 0,5 μM (CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, Alemanha) dissolvido em DPBS. A coloração foi interrompida mediante adição de 5 volumes de meio RPMI 1640 completo gelado. As células foram mantidas sobre gelo durante 5 minutos e lavadas 3 vezes com meio RPMI completo (soro AB humano termicamente inativado a 5%, penicilina- estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM) e foram, então, recolocadas em suspensão a 1x105 células por ml. Um ensaio Cytotox conforme descrito no Exemplo 2.b foi configurado com células NugC4 que expressam endogenamente CLDN18.2 e células T humanas como as células efetuadoras. 50 U de IL-2 por mL de meio foram adicionados às células. As amostras incluíram células T apenas, células T com 1 ng/ml de 1BiMAB, células T e células NugC4 e células T com 1 ng/ml de 1BiMAB e células NugC4. Após 120 h de coincubação, as células T foram colhidas, coletadas em tubos de 5 ml de fundo redondo, lavadas e coradas com solução de 7-AAD em DPBS a 1:1000 para contra-coloração de células mortas durante 15 min a 4 °C. Após lavagem com DPBS, as células foram ressuspensas em tampão para FACS e analisadas com um FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
[0430] A proliferação de células T foi detectada através de diminuição do sinal de CFSE apenas na presença de células alvo e proteína bi-scFv 1BiMAB (vide também Figura 8A).
b. Indução de serina protease Granzima B
[0431] Para demonstrar a regulação positiva de moléculas proteolíticas após ativação das células T mediada por proteína bi-scFv 1BiMAB na presença de células alvo positivas para CLDN18.2, a detecção de serina protease Granzima B através de análise por citometria de fluxo foi eleita. Um ensaio Cytotox conforme descrito no Exemplo 2.b foi configurado com células NugC4 que expressam CLDN18.2 endogenamente e células T humanas como as células efetuadoras. As amostras incluíram células T apenas, células T com 5 ng/ml de 1BiMAB, células T e células NugC4 e células T com 5 ng/ml de 1BiMAB e células NugC4. Após 96h de coincubação, as células T foram colhidas, coletadas em tubos de 5 ml de fundo redondo, lavadas e coradas com uma solução de 7-AAD em DPBS a 1:1000 para contra-coloração células mortas durante 15 min a 4 °C. Após lavagem com DPBS, as células foram fixadas com 100 μl de solução Cytoperm/Cytofix durante 20 min em RT. As células foram lavadas com 1x Perm/Wash e subsequentemente coradas com anticorpo de camundongo anti-Granzima B humana conjugado com PE humano durante 20 min em RT. Após lavagem, as células foram ressuspensas em tampão para FACS e analisadas com um FACSCanto II (todos os reagentes e dispositivo de FACS da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
[0432] A regulação positiva de Granzima B em células T foi detectada apenas na presença de células alvo e proteína bi-scFv 1BiMAB (vide também Figura 8B).
Exemplo 7: Determinação de EC50 de proteína bi-scFv 1BiMAB em um ensaio Cytotox in vitro Ensaio Cytotox de luciferase
[0433] Para a determinação de metade da dose eficaz máxima de proteína bi-scFv 1BiMAB, uma série de titulações de 1BiMAB foi testada em um ensaio Cytotox de luciferase in vitro essencialmente conforme descrito no Exemplo 2.c.
[0434] Células NugC4 que expressam estavelmente luciferase descritas no Exemplo 2.c foram incubadas com células T humanas e proteínas bi-scFv 1BiMAB em concentrações dentro da faixa de 1 pg/ml a 1 μg/ml (em etapas de 10) ou sem 1BiMAB para determinar o valor de Lmin. A luminescência de células viáveis foi medida com um leitor de placas Infinite M200 Tecan 24h e 48h após configuração do ensaio. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula exemplificada no Exemplo 2.c.
[0435] Lise máxima foi alcançada após 48 h com 1 - 10 ng/ml de 1BiMAB. A EC50 determinada após 48 horas neste ensaio é de aproximadamente 10 pg/ml (vide também Figura 9). Os resultados deste ensaio dependem fortemente da potência das células T humanas, a qual varia de acordo com o estado imune do doador, conforme também reportado por outros (por exemplo, Lutterbuese, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 13 de Julho de 2010; 107(28): 12605-10). Além disso, a linhagem de células alvo NugC4 usada mostra que variação de expressão de CLDN18.2 também influencia o resultado. Assim, uma variação no valor de EC50 da proteína bi-scFv 1BiMAB em uma faixa dentro de 10-300 pg/mL foi observada durante o curso da presente invenção.
Exemplo 8: Eficácia em um modelo de xenoenxerto com camundongos
[0436] Para investigar o potencial terapêutico da proteína bi-scFv 1BiMAB in vivo, o gênero de camundongo NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ ou NSG curto (Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, EUA) foi escolhido. Para o estudo descrito, o enxerto de células efetuadoras humanas e linfócitos T humanos em murinos é indispensável para estudar os efeitos de acoplamento de bi-scFc em células T in vivo. Em virtude da completa falta de células B, T e NK, o gênero de camundongos NSG é adequado para este tipo de estudos de xenotransplante. Um modelo com camundongos enxertados principalmente com células T humanas após injeção de PBMC foi estabelecido como parte da invenção.
a. Tratamento de início tardio de tumores avançados com alta expressão de CLDN18.2 em camundongos com proteína bi- scFv 1BiMAB
[0437] No estudo exemplificado, 40 camundongos NSG fêmeas com a idade de 8 semanas foram inoculados subcutaneamente com 1x107 células HEK293 que expressam estavelmente altos níveis de CLDN18.2 humano (HEK293- CLDN18.2). 5 dias após inoculação das células tumorais, os camundongos foram estratificados de acordo com o volume do tumor em grupos de tratamento; camundongos sem crescimento do tumor foram excluídos. Nos mesmos dias, células mononucleares do sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) foram isoladas a partir de sangue humano de doadores saudáveis por meio da técnica de gradiente de densidade Ficoll, conforme descrito no Exemplo 2.a, e usadas como células efetuadoras in vivo. 2x107 PBMCs diluídas em 300 μl de DPBS foram injetadas intraperitonealmente no dia de isolamento nos grupos de tratamento experimentais designados com "PBMC". Com "PBS", os grupos de tratamento designados receberam 300 mL de DPBS simples intraperitoneal e serviram como controle sem células efetoras humanas. Com grupos de controle "PBS", a investigação de um efeito potencial sobre o crescimento do tumor por 1BiMAB em si ou quaisquer efeitos colaterais potenciais que são causados por 1BiMAB ou veículo e não por células efetuadoras humanas contra tecido de camundongo (isto é, reação enxerto versus hospedeiro exercida pelas células efetuadoras humanas contra o tecido de murino) puderam ser examinados. O grupo "PBS/veículo" compreendia 4 camundongos (n = 4), "PBS/1BiMAB" 5 camundongos (n = 5), "PBMC/veículo" 13 camundongos (n = 13) e "PBMC/1BiMAB" 15 camundongos (n = 15). A terapia foi iniciada 1 dia após aplicação de DPBS ou PBMC: os grupos "PBS/1BiMAB" e "PBMC/1BiMAB" receberam intraperitonealmente 5 μg de proteína bi-scFv 1BiMAB purificada diluída em 200 mL de DPBS por animal. Os grupos "PBS/veículo" e "PBMC/veículo" receberam intraperitonealmente 200 μl de tampão de veículo (monocloridrato de L-Arginina a 200 mM dissolvido em H2O, esterilizado por filtração) diluído em DPBS. Os grupos de tratamento estão resumidos na Tabela 3. A terapia foi conduzida em uma base diária durante 22 dias. As dimensões do tumor foram medidas duas vezes por semana com um calibrador digital regulado e o volume do tumor calculado de acordo com a fórmula mm3 = comprimento x largura x (largura/2). As Figuras 10A e B exemplificam a inibição de crescimento do tumor e a eliminação da carga tumoral em metade dos camundongos do grupo "PBMC/1BiMAB" apenas pelo anticorpo na presença de células efetuadoras humanas. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical quando o volume tumoral excedeu 500 mm3 ou no caso de morbidade grave (sintomas de reação enxerto-versus- hospedeiro foram observados em alguns camundongos).Tabela 3: Grupos de tratamento
b. Determinação de influência da terapia sobre o peso corporal
[0438] O peso corporal de cada camundongo foi examinado duas vezes por semana usando uma escala laboratorial. Nenhum camundongo no grupo mostrou qualquer perda de peso ao longo do tempo de tratamento (dados não mostrados). Alguns camundongos em ambos os grupos "PBMC" mostraram sintomas de uma reação enxerto-versus-hospedeiro em quatro semanas após a injeção de PBMC e vários dias após o final do tratamento. Efeitos da 1BiMAB em si sobre o peso corporal ou quaisquer outros efeitos colaterais relativos à saúde dos camundongos não foram observados.
c. Conservação de tecidos e isolamento de esplenócitos
[0439] Após morte dos camundongos, os tumores foram dissecados e o tecido foi imediatamente fixado em 10 ml de Roti-Histofix a 4% (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) para análise imuno-histoquímica. Além disso, os baços foram dissecados para detectar o enxerto de células humanas por meio de análise de citometria de fluxo. Isolamento de esplenócitos foi realizado imediatamente após a dissecação do baço ao amassar os baços através de um retentor de células de 70 μm colocado em um tubo de reação de 50 ml com um êmbolo estéril de uma seringa de 3 - 5 ml e lavagem repetida do retentor de células com DPBS quente. Esplenócitos isolados foram centrifugados, decantados em DPBS e os pellets de esplenócitos ressuspensos em 1 ml de soro fetal de bovino termicamente inativado suplementado com DMSO a 10%. As amostras foram imediatamente congeladas a -80 °C e armazenadas até que as amostras de esplenócitos de todos os camundongos estivessem completas.
d. Análise do enxerto de linfócitos T humanos em baços de camundongo
[0440] Os esplenócitos de todos os camundongos foram coletados e congelados conforme descrito no Exemplo 8.c. A coleta completa de amostras de esplenócitos foi descongelada uma vez, todas as células foram lavadas duas vezes com DPBS quente e 1x106 esplenócitos por amostra foram incubados com anticorpos conjugados por fluorescência durante 20 min a 4 °C no escuro para detectar o enxerto de células humanas por coloração com anticorpo anti-CD45 e a percentagem de células T humanas por coloração com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8. Análise de citometria de fluxo foi realizada com um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Enxerto de células T humanas em ambos os grupos "PBMC" pôde ser confirmado pela alta percentagem de esplenócitos duplamente positivos para CD45-CD3, conforme mostrado na Figura 10D.
Exemplo 9: Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN6 e CD3 a. Origem de sequência, concepção de construções bi-scFv e clonagem em vetores de expressão
[0441] As construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos em tandem (bi-scFv ) continham domínios de ligação específicos para o componente receptor de células T humano CD3 e antígenos associados a tumor (Tumor Associated Antigen - TAA) humanos. As regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes para cada construto são especificamente arranjadas, do N- para o C-término, na ordem consecutiva: N- VHαCLDN6 - VLαCLDN6 - VHαCD3 - VLαCD3 - C (6PHU5; SEQ ID NO: 43) N- VHαCD3 - VLαCD3 - VHαCLDN6 - VLαCLDN6 - C (6PHU3; SEQ ID NO: 45)
[0442] A Tabela 4 resume todas as construções bi- scFv específicos para o TAA CLDN6 que foram elaborados no curso da invenção. O construto bi-scFv específico para CLDN18.2, 1BiMAB, foi usado como anticorpo de controle. As construções bi-scFv foram gerados por meio de síntese gênica pela GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Alemanha) usando as sequências de VH e VL dos anticorpos correspondentes. Otimizações de códons, tal como Homo sapiens (HS) ou Mus musculus (MM), foram implementadas pelo software GeneOptimizer® da GeneArt e são listadas na Tabela 5. Informações sobre a especificidade, origem sequência de anticorpos monoclonais (mAB), uso de códon, características de sequência adicionais e referências de todos os domínios aplicados são resumidos na Tabela 5. A origem de sequência do domínio variável dos respectivos anticorpos à CD3 são listados na Tabela 5. Em virtude da elevada homologia de TAAs humanos e de camundongo, as mesmas sequências de VH e VL anti-TAA podem ser usadas para a geração de construções bi-scFv para ensaios com camundongo, mas em combinação com as sequências de VH e VL de anticorpos específicos anti-CD3 de camundongo, clone 145-2C11.
[0443] Clonagem de DNA e construção de vetor de expressão foram realizadas de acordo com procedimentos convencionais (Sambrook, 1989) bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, as sequências de DNA de scFv-bi foram fornecidas com um sítio de restrição 5' HindIII e 3' BamHI para clonagem em plasmídeos de expressão. Uma sequência de sinal de secreção foi introduzida na extremidade 5' a montante da sequência do bi-scFv para secreção de proteínas a partir do citoplasma celular no meio de cultura. Uma sequência de codificação para um ligante peptídico de glicina-serina flexível de 15 a 18 aminoácidos foi inserido para unir os domínios VH e VL para a composição dos fragmentos de anticorpos variáveis com uma única cadeia (scFv), um dos quais se liga à CD3 e o outro ao TAA. Para formar um anticorpo com uma única cadeia biespecífico, as duas sequências de domínios scFv foram conectadas através de uma sequência de codificação para um ligante peptídeo curto (GGGGS). Juntamente com esta sequência ligante, um sítio de restrição BamHI foi introduzido para trocas de domínios scFv para a clonagem do próximo construto de bi-scFv. Em profundidade, domínios 5'- scFv podem ser trocados por sítios de restrição HindIII e BamHI e domínios 3'-scFv por sítios de restrição BamHI e XhoI.
[0444] Todos as construções de anticorpo bi-scFv usadas foram clonados no vetor de expressão de mamífero convencional pcDNA™ 3.1/myc-His (+) (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). O marcador 6xHis no C-término serviu para purificação por afinidade de metal da proteína e para análise de detecção. Todos as construções foram verificadas por meio de sequenciamento através do MWG's Single Read Sequence Service (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemanha). Para esquemas de construção vide também Figura 11.Tabela 4: Sumário de TAA e construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos para CD3Tabela 5: Resumo de informação sobre construções bi-scFvTabela 5: Continuação
b. Geração de linhagens de células produtoras estáveis
[0445] Para gerar clones de células produtoras estáveis de proteínas bi-scFv específicas para CLDN6, a linhagem de células de rim embrionário humano HEK293 foi usada (ATCC CRL-1573).
[0446] 1x107 células HEK293 foram cultivadas dois dias antes de transfecção para discos de cultura tecidual de 14,5 cm em 20 ml de meio DMEM completo (DMEM/F-12 GlutaMax suplementado com FBS a 10% termicamente inativado e penicilina-estreptomicina a 0,5%; todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Antes de transfecção, as células foram lavadas com DPBS suplementado com EDTA a 2 mM, então, foram adicionados 20 ml de meio DMEM simples sem FBS ou antibióticos. 20 μg de DNA linearizado das construções pcDNA3.1/6PHU5 e pcDNA3.1/6PHU3 (descritos sob o Exemplo 9.a) foram diluídos em 0,5 ml de meio DMEM simples/F-12. 75 μl de solução de PEI linear a 1 mg/ml (polietilenimina; Polysciences Europe GmbH, Eppelheim, Alemanha) foram adicionados ao DNA diluído e rigorosamente agitados. Após 15 minutos de incubação em RT, os complexos de DNA/PEI foram adicionados gota a gota às células, os discos de cultura de células foram suavemente centrifugados e, então, incubados a 37 °C, 5% de CO2. 24 horas após transfecção, o meio foi trocado. A seleção de células transfectadas foi iniciada 48 horas após a transfecção com sulfato G418 (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) em uma concentração final de 0,8 mg/ml. G418 foi adicionado permanentemente ao meio de cultura para cultura de células.
c. Produção em pequena escala de proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3 com células HEK293 policlonais
[0447] Proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3 foram produzidas em pequena escala e purificadas a partir de sobrenadantes de células HEK293 policlonais para comparação in vitro.
[0448] Resumidamente, no estado confluente, o sobrenadante sem FBS foi coletado a partir das linhagens de células policlonais descritas no Exemplo 9.b e filtrados com filtros para seringa Minisart de 0,2 μm (Sigma-Aldrich, Alemanha). Subsequentemente, as proteínas bi-scFv foram purificadas em pequena escala a partir de sobrenadantes de cultura de células por colunas de centrifugação Ni-NTA de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). As concentrações de proteína bi-scFv foram determinadas por medição a 280 nm com um NanoDrop 2000c tendo em consideração o coeficiente de extinção e peso molecular - determinado através da ferramenta ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) - das proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3. As proteínas purificadas foram armazenadas a 4 °C para uso imediato.
[0449] Proteínas bi-scFv foram testadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido por coloração com Coomassie e análise Western blot realizada por meio de procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012). Proteínas purificadas em pequena escala foram separadas em géis de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Subsequentemente, os géis foram corados com solução de Azul Brilhante de Coomassie de acordo com procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012) para detectar proteínas bi-scFv 6PHU5, 6PHU3 e outras proteínas contidas no sobrenadante da cultura de células. Análise Western blot foi realizada para detectar especificamente proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3 através de sua 6xHis-tag. Resumidamente, após secagem das proteínas em membranas de PVDF e bloqueio com PBST/leite em pó a 3%, a membrana foi incubada durante 1 h a 4 °C com o anticorpo primário anti-Epítopo-Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio. Após lavagem com tampão de bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase específico para Fc (Sigma Aldrich, Alemanha) diluído a 1:10000 em tampão de bloqueio durante 1 hora a 4 °C. Após lavagem com tampão de bloqueio novamente, os sinais foram visualizados pelo SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) e registrados por um ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha). Foram detectados sinais de proteínas bi-scFv entre 50 e 60 kDa quando comparado com o padrão de peso molecular interno.
d. Produção em larga escala de proteínas bi-scFv 6PHU3 com células HEK293 policlonais
[0450] A linhagem de células produtora policlonal foi cultivada em um Cell Factory de 10 camadas (Nunc, Roskilde, Dinamarca) em DMEM/F-12 GlutaMax suplementado com FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 0,5% e 0,8 mg/mL de G418 (todos os reagentes da Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante. No estágio confluente, as células foram lavadas com DPBS e o meio foi trocado para DMEM/F-12 com antibióticos, mas sem FBS. Sobrenadante celular contendo proteína bi-scFv 6PHU3 foi coletado a cada 3-5 dias durante até 3 semanas. O sobrenadante foi filtrado com 500 ml de Steritop Filter Units (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) e armazenado a 4 °C até purificação por FPLC.
[0451] Antes de purificação por FPLC, a presença de bi-scFv no sobrenadante da cultura de células foi testada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido por coloração com Coomassie e análise Western blot realizada através de procedimentos convencionais, conforme brevemente descrito no Exemplo 9.c.
e. Purificação e quantificação de proteína bi-scFv 6PHU3
[0452] Sobrenadante de cultura de células HEK293 policlonais contendo proteína bi-scFv 6PHU3 (descrito sob o Exemplo 9.b) foi submetido à cromatografia de afinidade com metal imobilizado (Immobilized Metal Affinity Chromatography - IMAC) usando procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012). Resumidamente, o sobrenadante da cultura de células foi carregado em uma coluna His Trap FF de 5 ml conectada a um sistema AKTA Purifier 10 FPLC (ambos da GE Healthcare Life Sciences, Munique). Tampão de lavagem de PBS continha imidazol a 10 mM, tampão de eluição de PBS continha NaCl a 500 mM, NaH2PO4 a 50 mM e imidazol a 250 mM; o pH de ambos os tampões foi ajustado para 7,4. A eluição foi realizada com um gradiente por etapas. Proteína bi-scFv 6PHU3 eluída foi imediatamente submetida à diálise contra 1x PBS usando um Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassette 10K MWCO (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA). Após diálise com PBS, bi-scFv foi submetida à diálise contra um tampão de arginina a 200 mM (monocloridrato de L-Arginina; Roth, Karlsruhe, Alemanha) com base em H2O.
[0453] A concentração de bi-scFv foi determinada por meio de medição a 280 nm com um NanoDrop 2000c sob consideração do coeficiente de extinção e do peso molecular da proteína bi-scFv 6PHU3. A proteína purificada foi transformada em alíquotas e armazenada a -80 °C para armazenamento a longo prazo ou mantida a 4 °C para uso imediato.
[0454] A qualidade e pureza da proteína bi-scFv 6PHU3 foram testadas por meio de coloração com Coomassie e análise Western blot, conforme descrito no Exemplo 9.c. Uma diluição padrão de BSA foi incluída no procedimento com Coomassie para confirmar aproximadamente a concentração medida por NanoDrop (dados não mostrados).
Exemplo 10: Eficiência de bi-scFv candidatos 6PHU5 e 6PHU3 que objetivam CLDN6 a. Análise microscópica de células T redirecionadas a células alvo por proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3
[0455] Para visualizar o redirecionamento de células efetuadoras para células alvo que expressam CLDN6 por proteínas bi-scFv através de análise microscópica, o ensaio Cytotox in vitro foi realizado. Proteínas bi-scFv 6PHU3 e 6PHU5 purificadas em uma coluna NiNTA (vide Exemplo 9.c) foram usadas para comparar estas duas variantes de acordo com sua eficiência. Como linhagem de células alvo, foi usada a linhagem de células de teratocarcinoma ovariano PA-1 que expressa endogenamente níveis elevados de CLDN6 humano.
[0456] Células efetuadoras humanas foram recentemente isoladas a partir de sangue humano de doadores saudáveis de acordo com procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012): resumidamente, o sangue foi diluído com DPBS, colocado em camadas sobre Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha) e centrifugado. Células mononucleares de sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) foram coletadas a partir da interfase, lavadas com DPBS gelado suplementado com EDTA a 2 mM e contadas. As células T humanas foram subsequentemente separadas através de separação magnética de células ativadas (Magnetic-Activated Cell Separation - MACS) de PBMCs pelo Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante.
[0457] 1x105 células PA-1 por cavidade foram cultivadas em placas de cultura tecidual com 6 cavidades. As células humanas foram preparadas conforme descrito acima e adicionadas em uma proporção de efetuador para alvo (E:T) de 5:1. Meio MEM suplementado com FBS a 10% termicamente inativado, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA, bicarbonato de sódio a 1 mM e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) foi usado para todas as células e o volume final por cavidade foi ajustado para 2 ml por cavidade. A concentração de proteína bi-scFv usada foi de 50 ng/ml neste ensaio. As amostras de controle compreendiam células alvo ou células T apenas sem proteína bi-scFv. Placas de cultura tecidual foram subsequentemente incubadas a 37 °C, 5% de CO2. O ensaio foi continuamente observado com um microscópio invertido Wilovert S (Hund, Wetzlar, Alemanha) a partir de 6h a 24h de coincubação. Efeitos significativos em termos de agregação de células T sobre células alvo, formação de uma sinapse imunológica e morte de células alvo na presença de proteína bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3 foram observados em 24h e fotografados com um microscópio Nikon Eclipse TS100 invertido (Nikon, Japão). Ambas as proteínas bi-scFv levam a uma forte agregação de células T e morte de células alvo, conforme mostrado na Figura 12.
b. Ativação das células T mediada por proteínas bi-scFv 6PHU5 e 6PHU3
[0458] Para a detecção de ativação das células T e para definir as diferenças na eficiência das duas variantes bi-scFv específicas para CLDN6, foi usado um ensaio de ativação de células T com base em FACS. O marcador de ativação precoce CD69 e o marcador de ativação tardia CD25 foram selecionados para coloração por fluorescência de anticorpos conjugados. Para a detecção de células T humanas na mistura de células alvo e células T, CD3 sobre as células T foi corada.
[0459] Em geral, a configuração de ensaio acima foi escolhida (Exemplo 10.a). Resumidamente, células alvo PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram cultivadas com células T humanas em uma proporção E:T de 5: 1 em 2 ml de meio completo e proteínas bi-scFv 6PHU5 ou 6PHU3 foram adicionadas em uma concentração na faixa de 5 - 200 ng/mL. As amostras de controle compreendiam células alvo ou células T apenas com e sem proteínas bi-scFv. Após 24 h e 48 h, as células T foram coletadas por meio de lavagem e transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo (BD Falcon, Heidelberg, Alemanha). As células foram centrifugadas e lavadas com DPBS. Para coloração de células, anticorpo de camundongo anti-CD3 humana-FITC, anticorpo de camundongo anti-CD69 humana-APC e anticorpo de camundongo anti-CD25 humana-PE (todos os anticorpos da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) foram usados. Os pellets celulares foram ressuspensos em 50 μl de tampão para FACS (DPBS suplementado com FBS a 5%) contendo os anticorpos conjugados por fluorescência e 2 μl de 7-AAD (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Após incubação durante 20 min a 4 °C no escuro, as amostras foram lavadas com 4 ml de DPBS e os pellets celulares foram ressuspensos em 200 μl de tampão para FACS. As amostras foram mantidas sobre gelo e no escuro durante toda a medição com um citômetro de fluxo FACSCanto II (ambos BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A análise foi avaliada por um software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).
[0460] Ambas as variantes bi-scFv específicas para CDLN6 resultaram na ativação eficiente de células T de até 60%. A variante 6PHU3 (bi-scFv CD3 x CLDN6) foi mais potente na faixa de concentração de 5-10 ng/ml (vide também Figura 13) e, portanto, foi escolhida para estudos posteriores.
Exemplo 11: Capacidade de ligação de bi-scFv 6PHU3 Ensaio de ligação FACS
[0461] Para avaliar a capacidade de ligação das porções que objetivam CLDN6 e CD3 da proteína bi-scFv 6PHU3, um ensaio de citometria de fluxo foi usado. Células PA-1 e OV-90 que expressam CLDN6 endogenamente foram usadas para investigar o sítio anti-CLDN6 e células T humanas foram usadas para investigar o sítio anti-CD3. Células NugC4 negativas para CLDN6 foram usadas como células de controle.
[0462] Para a investigação da capacidade de ligação de anti-CLDN6, células positivas para CLDN6 (PA-1, OV-90) e células negativas para CLDN6 (NugC4) foram tripsinizadas, lavadas com meio completo e subsequentemente com DPBS. Todas as etapas de lavagem foram conduzidas por meio de centrifugação a 1200 rpm durante 6 min a 4 °C. 1x105 células foram transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo e incubadas com 0,01-10 μg/ml de proteína 6PHU3 purificada por FPLC- ou proteína bi-scFv 1BiMAB de controle em tampão para FACS durante 30 min a 4 °C. As células foram lavadas com 2 ml de tampão para FACS e subsequentemente incubadas com 3,3 μg/ml de anticorpo monoclonal anti- Epítopo-tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) durante 30 min a 4 °C. Após lavagem com 2 mL de tampão para FACS, os pellets de células foram incubados com anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) em uma diluição de 1:200 em tampão para FACS durante 20 min a 4 °C no escuro. As células foram lavadas duas vezes com 2 ml de tampão para FACS e, finalmente, ressuspensas em 150 μl de tampão para FACS suplementado com 1 μg/mL de PI (Sigma Aldrich, Alemanha) para contra-coloração de células mortas. As amostras de controle negativo incluíam anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC apenas. Como controle positivo, 10 μg/ml de anticorpo monoclonal específico para CLDN6, mCLDN6ab, corado com anticorpo secundário de cabra anti-humano conjugado com APC (Jackson ImmunoResearch Europe, Suffolk, Inglaterra) e o controle de anticorpo secundário adequado apenas foram implementados.
[0463] As amostras foram medidas com um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e analisadas pela software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA). A intensidade do sinal de 10 μg/ml de 6PHU3 foi 4-9 vezes menor do que o controle positivo mCLDN6ab (vide Figura 15A). Ligação não específica de 6PHU3 à linhagem de células NugC4negativa para CLDN6 não foi detectada (Figura 15C).
[0464] Para investigar a capacidade de ligação do braço anti-CD3 da proteína bi-scFv 6PHU3, foram usadas células T humanas. 5x105 células T foram transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo e incubadas com a proteína6PHU3 purificada por FPLC dentro de uma faixa de 100 ng/mL - 10 ng/ml em tampão para FACS durante 30 min a 4 °C. Além disso, o procedimento de coloração foi conforme descrito acima. As amostras de controle incluíam anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com APC apenas e o anticorpo monoclonal anti-Epítopo-Tag HIS mais anticorpo secundário de cabra anti-camundongo conjugado com PE. A medição e análise foram realizadas conforme descrito acima. Um sinal significativo foi obtido com 100 ng/ml de 6PHU3 (vide também Figura 15B).
Exemplo 12: Investigação de ativação de células T dependente de alvo por bi-scFv 6PHU3
[0465] Um ensaio Cytotox conforme descrito nos Exemplos 10.a e b foi realizado. Resumidamente, células alvo PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram cultivadas com células T humanas em uma proporção E:T de 5:1 em 2 ml de meio completo e proteína bi-scFv 6PHU3 foi adicionada em uma concentração dentro da faixa de 0,0011000 ng/ml. Para analisar a dependência do alvo para ativação de células T mediada por bi-scFv, as células T foram cultivadas sem células alvo, mas foram incubadas com as mesmas concentrações de bi-scFv 6PHU3 como o alvo mais amostras de células T. Após 24 h e 48 h, as células T foram coletados por meio de lavagem e transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo (BD Falcon, Heidelberg, Alemanha). Coloração e análise foram realizadas conforme descrito no Exemplo 10.b.
[0466] Conforme mostrado nas Figuras 16A e B, nenhuma ativação de células T mediada por 6PHU3 é detectável na ausência de células alvo, destacando a estrita dependência do alvo de funcionalidade de bi-scFv. Ocorreu uma ativação significativa de células T com apenas 0,1 ng/ml de 6PHU3 após 48 horas.
Exemplo 13: Determinação de EC50 de bi-scFv 6PHU3 em um ensaio Cytotox in vitro Ensaio Cytotox de luciferase
[0467] Para a determinação de metade da dose eficaz máxima de proteína bi-scFv 6PHU3, uma série de titulações de 6PHU3 foi testada em um ensaio Cytotox de luciferase in vitro.
[0468] Células PA-1 que expressam estavelmente luciferase e células T humanas em uma proporção E:T de 5:1 foram incubadas com proteína bi-scFv 6PHU3 em concentrações dentro da faixa de 1 pg/ml a 1 μg/ml (em etapas de 10) ou sem 6PHU3 para determinar os valores de Lmin.
[0469] Microplacas de cultura de células foram incubadas durante 24 h e 48 h a 37 °C, 5% de CO2. Para análise, 50 μl de uma solução aquosa contendo 1 mg/ml de luciferina (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e HEPES a 50 mM foram adicionados por cavidade e as placas foram subsequentemente incubadas durante 30 minutos no escuro a 37 °C. A luminescência resultante da oxidação de luciferina em luciferase expressa por células viáveis foi medida com um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan (Tecan, Mannedorf, Suíça). A percentagem de lise específica para células alvo foi calculada pela fórmula a seguir: % de lise específica = [1 - (luminescênciaamostra de teste - Lmax)/(Lmin - Lmax)] x 100, onde "L" indica a lise. Lmin se refere à lise mínima na ausência de bi-scFv e Lmax à lise máxima (igual à contagem de luminescência espontânea) na ausência de bi-scFv obtida mediante adição de Triton X-100 (concentração final de 2%).
[0470] Lise máxima foi alcançada após 48 h com 1 - 10 ng/ml de 6PHU3. A EC50 determinada após 48 horas é de aproximadamente 10 pg/ml (vide também Figura 17). Os resultados deste ensaio dependem fortemente da potência das células T humanas, a qual varia de acordo com o estado imune do doador, conforme também reportado por outros (vide, por exemplo, Lutterbuese, R et al., 2010, Proc.Natl. Acad. Sci USA. 13 de Julho de 2010; 107(28): 1260510). Assim, uma variação no valor de EC50 da proteína bi- scFv 6PHU3 em um fator de 3 foi observada durante o curso da presente invenção.
Exemplo 14: Eficácia em um modelo de xenoenxerto de camundongo
[0471] Para investigar o potencial terapêutico da proteína bi-scFv 6PHU3 in vivo, o gênero de camundongo NOD.Cg-Prkdscid IL2rgtm1Wjl/SzJ ou NSG curto (Jackson Laboratory, Bar Harbour, ME, EUA) foi escolhido. Para o estudo descrito, o enxerto de células efetuadoras humanas e linfócitos T humanos em murinos é indispensável para estudar os efeitos de acoplamento de bi-scFv em células T in vivo. Em virtude da completa falta de células B, T e NK, o gênero de camundongos NSG é adequado para este tipo de estudos de xenotransplante. Um modelo com camundongos enxertados principalmente com células T humanas após injeção de PBMC foi estabelecido como parte da invenção.
a. Tratamento de início tardio de tumores avançados com alta expressão de CLDN18.2 em camundongos com proteína bi- scFv 1BiMAB
[0472] No estudo exemplificado, 25 camundongos NSG fêmeas e 25 camundongos NSG machos com a idade de 8-11 semanas foram inoculados subcutaneamente com 1x107 células PA-1 que expressam estavelmente altos níveis de CLDN6 humano. 15 dias após inoculação das células tumorais, os camundongos foram estratificados de acordo com o volume do tumor em grupos de tratamento; camundongos sem crescimento do tumor foram excluídos. Nos mesmos dias, células mononucleares do sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) foram isoladas a partir de sangue humano de doadores saudáveis por meio da técnica de gradiente de densidade Ficoll e usadas como células efetuadoras in vivo. 2x107 PBMCs diluídas em 200 μl de DPBS foram injetadas intraperitonealmente no dia de isolamento nos grupos de tratamento experimentais designados com "PBMC". Com "PBS", os grupos de tratamento designados receberam 200 mL de DPBS simples intraperitoneal e serviram como controle sem células efetoras humanas. Com grupos de controle "PBS", a investigação de um efeito potencial sobre o crescimento do tumor por 6PHU3 em si ou quaisquer efeitos colaterais potenciais que são causados por 6PHU3 ou veículo e não por células efetuadoras humanas contra tecido de camundongo (isto é, reação enxerto versus hospedeiro exercida pelas células efetuadoras humanas contra o tecido de murino) puderam ser examinados. O grupo "PBS/veículo" compreendia 8 camundongos (n = 8), "PBS/6PHU3" 8 camundongos (n = 8), "PBMC/veículo" 7 camundongos (n = 7) e "PBMC/1BiMAB" 8 camundongos (n = 8). A terapia foi iniciada sete dias após aplicação de DPBS ou PBMC: os grupos "PBS/6PHU3", "PBMC/6PHU3" e "PBMC/1BiMAB" receberam intraperitonealmente 5 μg de proteína bi-scFv 6PHU3 ou 1BiMAB purificada diluída em 200 mL de DPBS por animal. Os grupos "PBS/veículo" e "PBMC/veículo" receberam intraperitonealmente 200 μl de tampão de veículo (monocloridrato de L-Arginina a 200 mM dissolvido em H2O, esterilizado por filtração) diluído em DPBS. Os grupos de tratamento estão resumidos na Tabela 6. A terapia foi conduzida em uma base diária durante 26 dias. As dimensões do tumor foram medidas duas vezes por semana com um calibrador digital regulado e o volume do tumor calculado de acordo com a fórmula mm3 = comprimento x largura x (largura/2). As Figuras 18A e B exemplificam a inibição de crescimento do tumor e a eliminação da carga tumoral em metade dos camundongos do grupo "PBMC/6PHU3" apenas pelo anticorpo na presença de células efetuadoras humanas. Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical quando o volume tumoral excedeu 1500 mm3 ou no caso de morbidade grave (sintomas de reação enxerto-versus- hospedeiro foram observados em alguns camundongos).Tabela 6: Grupos de tratamento
b. Determinação de influência da terapia sobre o peso corporal
[0473] O peso corporal de cada camundongo foi examinado duas vezes por semana usando uma escala laboratorial. Nenhum camundongo no grupo mostrou qualquer perda de peso ao longo do tempo de tratamento (dados não mostrados).
c. Conservação de tecidos e isolamento de esplenócitos
[0474] Após morte dos camundongos, os tumores foram dissecados e o tecido foi imediatamente fixado em 10 ml de Roti-Histofix a 4% (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) para análise imuno-histoquímica. Além disso, os baços foram dissecados para detectar o enxerto de células humanas por meio de análise de citometria de fluxo. Isolamento de esplenócitos foi realizado imediatamente após a dissecação do baço ao amassar os baços através de um retentor de células de 70 μm colocado em um tubo de reação de 50 ml com um êmbolo estéril de uma seringa de 3 - 5 ml e lavagem repetida do retentor de células com DPBS quente. Esplenócitos isolados foram centrifugados, decantados em DPBS e os pellets de esplenócitos ressuspensos em 1 ml de soro fetal de bovino termicamente inativado suplementado com DMSO a 10%. As amostras foram imediatamente congeladas a -80 °C e armazenadas até que as amostras de esplenócitos de todos os camundongos estivessem completas.
d. Análise do enxerto de linfócitos T humanos em baços de camundongo
[0475] Os esplenócitos de todos os camundongos foram coletados e congelados conforme descrito no Exemplo 14.c. A coleta completa de amostras de esplenócitos foi descongelada uma vez, todas as células foram lavadas duas vezes com DPBS quente e 1x106 esplenócitos por amostra foram incubados com anticorpos conjugados por fluorescência durante 20 min a 4 °C no escuro para detectar o enxerto de células humanas por coloração com anticorpo anti-CD45 e a percentagem de células T humanas por coloração com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8. Análise de citometria de fluxo foi realizada com um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Enxerto de células T humanas em ambos os grupos "PBMC" pôde ser confirmado pela alta percentagem de esplenócitos duplamente positivos para CD45-CD3, conforme mostrado na Figura 18D.
e. Imuno-histoquímica para a determinação da expressão de células alvo e infiltração de células T
[0476] Os tumores foram fixados após dissecação usando solução de formaldeído tamponada a 4% (Roti- Histofix, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) durante 48 h a 4 °C. Os tumores fixados foram divididos em duas partes e transferidos para o processador de tecidos a vácuo automatizado ASP200 para desidratação (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha), seguido de incorporação em parafina (Paraplast, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) através do Paraffin Dispenser Station MPS/C (Slee Medical GmbH, Mainz, Alemanha). Para colorações imuno- histoquímicas, tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina de 3 mm de espessura foram gerados usando o micrótomo rotativo RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha). A desparafinação e re-hidratações foram conduzidas no retentor de batelada bi-linear StainMate Max (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA), seguido por recuperação de epítopo induzida pelo calor em tampão de ácido cítrico a 10 mM, pH de 6 com Tween 20 a 0,05% durante 10 min a 120 °C. Peroxidases endógenas foram subsequentemente neutralizada usando solução de H2O2 a 0,3% em PBS durante 15 min (Carl Roth), seguido por incubação com soro de cabra em PBS a 10% (PAA Laboratories GmbH/GE Healthcare, Pasching, Áustria) durante 30 min para bloquear sítios de ligação de anticorpo não específica. TAA Claudina 6 foi detectada por meio de incubação com o anticorpo primário policlonal de coelho anti-Claudina 6 (C) de camundongo (IBL-America, Minneapolis, MN, EUA) a 4 °C durante a noite; as células T foram detectadas em seções consecutivas usando o Ab policlonal anti-CD3 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) a 4 °C durante a noite, seguido por incubação com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com polímero HRP BrightVision (ImmunoLogic, Duiven, Países Baixos). As reações de ligação foram visualizadas usando o kit Vector NovaRED (Vector Laboratories Ltda.,Peterborough, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante, seguido por contra-coloração com hematoxilina (Carl Roth), desidratação e montagem. Análise e documentação foram realizadas usando o scanner Axio Imager M2 ou Mirax (ambos da Carl Zeiss Microscopy GmbH, Goettingen, Alemanha).
[0477] Conforme mostrado na Figura 19, maior infiltração de células T foi detectada nos tumores do grupo "PBMC/6PHU3" através de coloração de CD3, especialmente nas áreas limítrofes de expressão de CLDN6. O padrão de expressão heterogêneo de TAA CLDN6 nos grupos de controle (Figuras 19A, B, C e D) mudou para áreas mais compactas de expressão de CLDN6 nos tumores do grupo "PBMC/6PHU3" como um resultado da terapia (Figura 19D).
Exemplo 15: Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN18.2 e CD3 a. Origem de sequência, concepção de construções bi-scFv e clonagem em vetores modelo
[0478] As construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos em tandem (bi-scFv) continham domínios de ligação específicos para o componente receptor de células T humano CD3 e antígenos associados a tumor (Tumor Associated Antigen - TAA) humanos. As regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes para cada construto são especificamente arranjadas, do N- para o C-término, na ordem consecutiva:pST1-hAgKozak-VHαCLDN18-2-VLαCLDN18-2-VHαCD3-VLαCD3-His-2hBgUTR-A12 0 (1BiMAB, 18RHU5, no.1-5) psT1-hAgKozak-VHαCD3-VLαCD3-VHαCLDN18-2-VLαCLDN18-2-His-2hBgUTR-A12 0 (18RHU3, no.6-10)
[0479] A Tabela 7 resume todas as construções bi- scFv específicos para os TAAs CLDN18.2 e PLAC1 que foram elaborados no curso da invenção. As construções de bi-scFv específicos para CLDN18.2, 1BiMAB, foram usadas como anticorpo de controle. As construções bi-scFv foram geradas por meio de síntese gênica pela GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Alemanha) usando as sequências de VH e VL dos anticorpos correspondentes. Otimizações de códons, tal como Homo sapiens (HS, Mus musculus (MM) ou ovário de hâmster chinês (Chinese Hamster Ovary - CHO), foram implementadas pelo software GeneOptimizer® da GeneArt e são listadas na Tabela 7. Informações sobre a especificidade, origem sequência de anticorpos monoclonais (mAB), uso de códon, características de sequência adicionais e referências de todos os domínios aplicados são resumidos na Tabela 8. A origem de sequência do domínio variável dos respectivos anticorpos à CD3 são listados na Tabela 8. Em virtude da elevada homologia de TAAs humanos e de camundongo, as mesmas sequências de VH e VL anti-TAA podem ser usadas para a geração de construções bi-scFv para ensaios com camundongo, mas em combinação com as sequências de VH e VL de anticorpos específicos anti-CD3 de camundongo, clone 145-2C11.
[0480] Clonagem de DNA e construção de vetor de expressão foram realizadas de acordo com procedimentos convencionais (Sambrook, 1989) bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, as sequências de DNA de scFv-bi foram fornecidas com um sítio de restrição 5'-BsmBI e 3'-XhoI para clonagem em plasmídeos pST1. Uma sequência de sinal de secreção foi introduzida na extremidade 5' a montante da sequência do bi-scFv para secreção de proteínas a partir do citoplasma celular no meio de cultura. Uma sequência de codificação para um ligante peptídico de glicina-serina flexível de 15 a 18 aminoácidos foi inserido para unir os domínios VH e VL para a composição dos fragmentos de anticorpos variáveis com uma única cadeia (scFv), um dos quais se liga à CD3 e o outro ao TAA. Para formar um anticorpo com uma única cadeia biespecífico, as duas sequências de domínios scFv foram conectadas através de uma sequência de codificação para um ligante peptídeo curto (GGGGS). Juntamente com esta sequência ligante, um sítio de restrição BamHI foi introduzido para trocas de domínios scFv para a clonagem das próximos construções de bi-scFv. Resumidamente, domínios 5'-scFv podem ser trocados por sítios de restrição BsmBI e BamHI e domínios 3'-scFv por sítios de restrição BamHI e XhoI. Uma 6xHis-tag no C- término foi implementada para análise de detecção da proteína traduzida. Regiões não traduzidas de alfa globina humana 5' e de beta-globina humana 3' da sequência de bi- scFv estavam presentes no vetor pST1 (para detalhes vide documento WO2007/036366A2; Waggoner, S. et al. (2003) Exp. Biol. Med. (Maywood) 228 (4), páginas 387-395).
[0481] Para produção do vetor de replicon de 1BiMAB, a sequência de 1BiMAB completa incluindo sinal de secreção e 6xHis-tag foi subclonada 3' do promotor subgenômico do vetor de replicon do vírus Semliki Forest (pSFV) gentilmente fornecido por K. Lundstrom (Lundstrom, K. et al. (2001) Histochem. Cell Biol. 115 (1), páginas 8391; Ehrengruber, M.U. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12), páginas 7041-7046).
[0482] Todas as construções foram verificadas por meio de sequenciamento através do MWG's Single Read Sequence Service (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemanha)e apenas aqueles com uma sequência correta e cauda poli(A) de mais de 100 adeninas foram usados para transcrição de RNA in vitro.
[0483] Para esquemas de construção vide também Figura 20A.Tabela 7: Sumário de TAA e anticorpo biespecífico para CD3 com construções de mRNA-modelo de anticorpo com uma única Cadeia Bi-scFv indica fragmento variável com uma única cadeia biespecífico; CHO, Ovário de Hâmster Chinês; SH, Homo sapiens; HU, humanizado; MM, Mus musculus; TAA, antígeno associado a tumor; VH, domínio variável de cadeia pesada, VL, domínio variável de cadeia leve.Tabela 8: Sumário de informação de construto de mRNA-modelo de bi-scFv Tabela 8: Continuação
b. Síntese de IVT-RNA
[0484] Para a geração de modelos de IVT bi-scFv específico anti-CLDN18.2, os plasmídeos foram linearizados a jusante da cauda poli(A) usando uma endonuclease de classe IIs. DNA modelo linearizado foi purificado por meio de extração com fenol/clorofórmio e precipitação com acetato de sódio, conforme descrito em outra parte (Holtkamp, S. et al. (2006) Blood 108 (13), páginas 40094017).
[0485] Modelos de DNA linearizados foram submetidos à transcrição in vitro usando kits MEGAscript (Ambion/Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante: modelos de pST1 foram transcritos com o kit MEGAscript T7 e modelos de pSFV com o Kit MEGAscript SP6. Para as reações com "cap" análoga, a concentração de GTP foi reduzida para 1,5 mM e 6 mM de ARCA, beta-S-ARCA(D1) ou beta-S-ARCA(D2), sintetizado conforme descrito em outra parte (Kowalski, J. et al. (2008) RNA 14 (6), páginas 1119-1131; Grudzien, E. et al. (2004) RNA 10 (9), páginas 1479-1487; Stepinski, J. et al. (2001) RNA 7 (10), páginas 1486-1495) foram adicionados à reação. Purificação de IVT-mRNA foi realizada com o Kit MEGAclear (Ambion/Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) de acordo com o manual. A concentração e a qualidade do IVT-RNA foram avaliadas por espectrofotometria e análise em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).
Exemplo 16: Ativação de células T em resposta à secreção de bi-scFv por células alvo transfectadas com vários IVT-mRNAs específicos para CLDN18.2
[0486] Para o exame da funcionalidade de IVT-RNA bi-scFv específico para CLDN18.2, a linhagem de células de carcinoma gástrico NugC4, que expressa endogenamente níveis relativamente elevados de CLDN18.2 humano (Sahin, U. et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14 (23), páginas 7.624-7.634) foi usada como linhagem de células alvo.
[0487] Células alvo NugC4 - que são rotineiramente ensaiadas quanto à expressão de TAA por meio de análise FACS antes de cada ensaio - foram lavadas duas vezes com meio X-Vivo 15 gelado (Lonza, Basileia, Suíça) e ressuspensas em uma densidade de 2x107 células/ml. 250 μl de suspensão de células foram transferidos para Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (Bio-Rad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm pré-resfriadas e 20 μg/ml de IVT-mRNA foram adicionados. IVT-mRNAs usados foram: 1BiMAB, no.2, no.3, no.4, no.5, no.7, no.8, no.9 e no.10. Para obter informações detalhadas sobre variantes de bi-scFv vide Tabelas 7 e 8. Após mistura cuidadosa, as células foram transfectadas com um eletroporador BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA), usando as seguintes condições: 250 V, 2 pulsos, duração de pulso de 12 ms, duração de intervalo de 400 ms. Imediatamente após eletroporação, as cubetas foram logo colocadas em gelo e, então, as suspensões de células foram transferidas para meio de ensaio quente em RT (RPMI 1640 suplementado com soro AB humano termicamente inativado a 5%, penicilina- estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha)) em tubos de 15 ml. Células alvo transfectadas foram contadas e ajustadas para 1x105 células por ml.
[0488] Células efetuadoras humanas foram recentemente isoladas a partir de sangue humano de doadores saudáveis de acordo com procedimentos convencionais (Current Protocols in Immunology, 2012): Resumidamente, o sangue foi diluído com DPBS, colocado em camadas sobre Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha) e centrifugado. Células mononucleares do sangue periférico (Peripheral Blood Mononuclear Cells - PBMCs) foram coletadas a partir da interfase, lavadas com DPBS gelado suplementado com EDTA a 2 mM e contadas. Células T citotóxicas humanas foram isoladas por meio de separação magnética de células ativadas (Magnetic-Activated Cell Separation - MACS) a partir de PBMC com o kit CD8+ T Cell Isolation (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante. Separações de células efetuadoras foram rotineiramente testadas quanto a o isolamento de células T com êxito por meio de análise FACS (coloração de CD4, CD8). As células T foram ajustadas para 5x105 células por ml em meio de ensaio.
[0489] 1x105 células alvo foram cultivadas por cavidade em uma placa com 6 cavidades e células T citotóxicas humanas foram adicionadas em uma proporção E:T de 5:1. O volume final por cavidade foi de 2 ml. Amostras de controle contendo células efetuadoras e células alvo compreendiam células alvo que secretam no.25, o mAb de IgG precursor chCLDN18.2ab e 1BiMAB como controle positivo em uma concentração final de 5 ng/ml. Os controles incluíam células alvo eletroporadas apenas ou células T apenas com e sem proteína 1BiMAB. Após 48 h, as células T e células alvo foram coletadas, identificadas e analisadas por citometria de fluxo. Resumidamente, todas as células foram coletadas por raspagem suave com Cell Scrapers (Sarstedt AG & Co, Nürmbrecht, Alemanha) e transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo (BD Falcon, Heidelberg, Alemanha). As células foram centrifugadas e lavadas com DPBS. Para coloração de células, anticorpo de camundongo anti-CD3 humano-FITC, anticorpo de camundongo anti-CD69 humano-APC e anticorpo de camundongo anti-CD25 humano-PE (todos os anticorpos da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) foram usados. Os pellets celulares foram ressuspensos em 50 μl de tampão para FACS (DPBS suplementado com FBS a 5%) contendo os anticorpos conjugados por fluorescência. Após incubação durante 20 min a 4 °C no escuro, as amostras foram lavadas com 4 ml de DPBS e os pellets celulares foram ressuspensos em 200 μl de tampão para FACS contendo iodeto de propídio (PI) (Sigma Aldrich, Alemanha) em uma diluição final de 1:1000 para detecção de células mortas. As amostras foram mantidas sobre gelo e no escuro até serem medidas. Estabelecimento do ensaio foi realizado com um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A análise foi avaliada por um software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).
[0490] Conforme mostrado na Figura 21A, cada IVT- mRNA específico para CLDN18.2 resultou em secreção de proteína bi-scFv, conforme observado na ativação eficaz de células T. As variantes mais potentes, com apenas diferenças marginais na ativação das células T, foram no.5 > no.8 > no.10 > no.3 > 1BiMAB na ordem decrescente. Todas estas variantes levaram a uma ativação total de células T acima de 55%, enquanto que as variantes no.2, no.4, no.7 e no.9 levaram a uma ativação total de células T de 40 a 50%.
[0491] Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula: % de lise = (% células alvoamostra PI+ - % células alvoEP referência PI+) em que "amostra" especifica células efetuadoras e células alvo coincubadas e "referência EP" células alvo eletroporadas de cada eletroporação com IVT-mRNA individual apenas. Conforme mostrado na Figura 21B, lise de células alvo acima de 65% foi alcançada pelas variantes 1BiMAB > no.5 > no.8 > no.3 na ordem decrescente. As outras variantes mediaram uma lise de células alvo de 55-64%.
[0492] O bi-scFv específico para CLDN18.2 mais potente traz os domínios VH e VL de TR66 (1BiMAB, no.5, no.10) ou UCHT1 (no.3, no.8). Em relação às orientações de domínio, não foi observada diferença significativa em contraste com as variantes de proteína bi-scFv (vide Exemplo 3). De acordo com os estudos de proteína, IVT-mRNA que codifica 1BiMAB foi escolhido para estudos posteriores.
[0493] Construções 18RHU5 e 18RHU3 (vide Tabelas 7 e 8) foram comparadas em um ponto de tempo posterior com 1BiMAB. A eficiência de 18RHU5 era equivalente à 1BiMAB, 18RHU3 foi menos potente (dados não mostrados).
Exemplo 17: Análise microscópica de células T redirecionadas para células alvo que secretam bi-scFv 1BiMAB específico para CLDN18.2
[0494] A configuração de ensaio foi essencialmente conforme descrito no Exemplo 2.a.
[0495] Células T citotóxicas humanas foram isoladas por MACS a partir de PBMCs recentemente isoladas pelo kit CD8+ T Cell Isolation (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante.
[0496] Células alvo NugC4 foram preparadas e transfectadas conforme descrito no Exemplo 16, exceto que 80 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB ou 80 μg/ml de IVT-RNA no.25 ctrl foram usados. Células alvo transfectadas foram contadas e ajustadas para 2x105 células por ml. 1x104 células alvo foram cultivadas por cavidade de uma placa com 96 cavidades e células T citotóxicas humanas foram adicionadas de acordo com uma proporção E:T de 5:1. O volume final por cavidade foi de 100 μl. As amostras de controle compreendiam células alvo transfectadas apenas para segurança de prova após eletroporação e células alvo transfectadas com bi-scFv de controle com células efetuadoras. Placas de cultura tecidual foram subsequentemente incubadas a 37 °C, 5% de CO2. Efeitos significativos em termos de agregação de células T sobre as células alvo, formação de uma sinapse imunológica e morte de células alvo em amostras contendo células alvo transfectadas com 1BiMAB foram observados em 24 h e registrados com um microscópio Nikon Eclipse TS100 invertido (Nikon, Japão). Nenhuma de agregação de células T ou lise de células alvo foi observada na amostra de controle com células alvo transfectadas com no.25, o que implica na estrita dependência da expressão de TAA para induzir a uma ativação de células T. Vide também Figura 22. Exemplo 18: Análise citométrica de fluxo de ativação de células T dependente de concentração por bi-scFv 1BiMAB específico para CLDN18.2
[0497] Para investigar uma ativação de células T dependente da concentração de bi-scFv na presença de células alvo que expressam TAA, uma série de diluições de três vezes foi aplicada ao processo de transfecção.
[0498] Células alvo NugC4 foram preparadas e transfectadas conforme descrito no Exemplo 16, mas com uma concentração final de IVT-RNA de 40 μg/ml. Concentrações de IVT-mRNA de 1BiMAB variavam de 0,4-40 μg/ml e foram enchidas com quantidades apropriadas de IVT-mRNA de luciferase com o objetivo de expor todas as amostras ao mesmo nível de estresse em relação às quantidades de IVT- mRNA.
[0499] 1x105 células alvo transfectadas e células citotóxicas T humanas (isoladas conforme descrito no Exemplo 16) foram cultivadas em uma proporção E:T de 10:1 em 2 ml de meio de ensaio em um formato de 6 cavidades. As amostras de controle continham células alvo transfectadas com 40 μg/ml de IVT-mRNA de luciferase, mas não com IVT- mRNA de 1BiMAB. Após 24 h e 48 h de coincubação de células alvo e células efetuadoras, as células foram coletadas, coradas e analisadas conforme descrito no Exemplo 16.
[0500] Conforme mostrado nas Figuras 23A e B, ativação de células T significativa foi observada em amostras contendo células alvo transfectadas com 4 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB. Ativação máxima de células T neste ensaio foi alcançada com 40 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB. A expressão de CD69 e CD25 variou com o tempo de coincubação (Figuras 23A e B) e a concentração de IVT-mRNA. Maiores quantidades de IVT-mRNA de 1BiMAB (12 e 40 μg/ml) levaram a um início mais rápido do mecanismo de ativação de células T conforme, por exemplo, visível no aumento da expressão de CD25 comparado com aquele de CD69 na Figura 23. Ativação total de células T não excedeu ~ 40%.
Exemplo 19: Análise de citometria de fluxo da lise de células alvo mediada por células T dependente da concentração por bi-scFv 1BiMAB específico para CLDN18.2
[0501] Para investigar uma lise de células alvo mediada por células T dependente da concentração de bi- scFv, a configuração experimental descrita no Exemplo 18 foi usada. Além de amostras de coincubação de células efetuadoras e células alvo ("amostra"), também as células alvo eletroporadas individualmente apenas foram cultivadas. Estas últimas serviram como amostras de referência ("referência EP") para subtrair células alvo mortas pelo processo de eletroporação em si de células alvo submetidas à lise por células T.
[0502] Coleta e coloração foram realizadas de acordo com o Exemplo 18. As células alvo foram finalmente analisadas através de sua incorporação de iodeto de propídio com um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
[0503] A percentagem de lise específica de células alvo foi determinada por meio de uma subtração em duas etapas de células mortas de linha de base: 1. % lise mediada por células T = (% PI+ células alvoamostra - % PI+ células alvoEP referência EP) 2. % lise específica = ((% lise mediada por células Tamostra - % lise mediada por células Tctrl)
[0504] "Lise mediada por células Tctrl" é deduzida a partir da diferença de células alvo PI+ de amostras de controle (40 μg/ml de IVT-mRNA de luciferase apenas) com e sem células efetuadoras.
[0505] Através deste cálculo, uma lise máxima específica de 55,5% +/- 5,6% é alcançada com 12 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB neste experimento. Em virtude da sensibilidade de células alvo NugC4 ao estresse de eletroporação e, com isto, as inevitáveis células alvo de linha de base mortas que são subtraídas, a lise de células alvo específica representada pode ser menor nesta configuração experimental do que a porcentagem real de lise.
Exemplo 20: Proliferação de células T em resposta à transfecção de IVT-mRNA de 1BiMAB
[0506] A proliferação de células T é um indicador de ativação de células T. Para mostrar a proliferação de células T específica em resposta ao IVT-mRNA que codifica bi-scFv 1BiMAB na presença de células alvo positivas para CLDN18.2, foi usado um ensaio de citometria de fluxo. Resumidamente, 1x107 células T humanas isoladas conforme descrito no Exemplo 16 foram coradas com succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína a 1 μM (CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, Alemanha) dissolvido em DPBS no escuro em temperatura ambiente durante 5 min. As células foram lavadas duas vezes com DPBS/FCS a 5% e ressuspensas em meio de ensaio para 2x106 células por ml. Como células alvo, células NugC4 transduzidas lentiviralmente com CLDN18.2 humano e - para testar a especificidade - a linhagem de células de câncer de mama MDA-MB-231 negativa para CLDN18.2 foram escolhidas. 20 μg/ml de IVT-mRNAs de 1BiMAB ou um controle não específico foram usados para eletroporação. A eletroporação de NugC4 foi realizada conforme descrito no Exemplo 16. Eletroporação de MDA-MB-231 foi realizada usando as seguintes condições: 400 V, duração de pulso de 3 ms, 1 pulso, duração de intervalo de 400 ms em Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (BioRad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm. Um ensaio Cytotox conforme descrito no Exemplo 16 foi configurado com as células alvo transfectadas e células T marcadas com CFSE humano como células efetuadoras. Células T apenas e células alvo não transfectadas ou células de controle transfectadas mais células T foram usadas como controles negativos. Células T apenas estimuladas com 5 μg/ml de OKT3 (Bio X Cell, West Lebanon, NH, EUA) e 2 μg/mL de anti-CD28 (BioLegend, Fell, Alemanha) serviram como controle positivo. Proteína 1BiMAB na concentração de 5 ng/ml foi aplicada às células alvo mais células T não transfectadas para confirmar a validade do ensaio. Amostras combinadas com a proteína bi-scFv 6PHU3 não específica foram incluídas como controle de especificidade. Todas as amostras foram criadas em triplicata em um volume total de 0,2 ml de meio de ensaio em 96 cavidades. Após 72 h de coincubação, as células T foram colhidas, coletadas em tubos de 5 ml de fundo redondo, lavadas e coradas a 4 °C durante 30 min com 2 μL de anti-CD45-APC para diferenciar células T humanas de células tumorais e 0,25 μl de eFluor506 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) para contra-coloração de células mortas em 200 μl de DPBS. Após lavagem com DPBS, as células foram ressuspensas em tampão para FACS e analisadas com um FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
[0507] A proliferação de células T foi detectada pela diminuição do sinal de CFSE apenas na presença de células alvo positivas para CLDN18.2 e bi-scFv 1BiMAB (vide também Figura 25). Além do controle positivo, uma proliferação de células T de 42-48% pôde ser observada na presença de células alvo positivas para CDLN18.2 em combinação com a proteína 1BiMAB. Células alvo positivas transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB levaram a 22% +/- 3%. A menor proliferação em resposta ao IVT-mRNA do que à proteína é provavelmente em virtude da baixa eficiência de transfecção obtida com células alvo NugC4. Células T que foram incubadas com células alvo MDA-MB-231 negativas para CLDN18.2 não mostram uma proliferação significativa em qualquer caso, bem como células T sem células alvo, exceto quanto ao controle positivo.
Exemplo 21: Titulação de proporções de efetuador para alvo para determinar uma proporção potente
[0508] Para a determinação de uma proporção E:T adequada na configuração do ensaio Cytotox in vitro com base em análise FACS, proporções E:T que variavam entre 0,3:1 a 10:1 em etapas de 3 vezes foram escolhidas.
[0509] Células alvo NugC4 foram preparadas e transfectadas conforme descrito no Exemplo 16 com uma concentração de IVT-RNA de 40 μg/ml. Um preparado de células transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB foi usado para todas as amostras de teste. Transfecção de 40 μg/ml de IVT- mRNA de luciferase foi selecionada como controle negativo.
[0510] Células T citotóxicas humanas foram separadas de PBMCs recentemente isoladas, conforme descrito no Exemplo 16, e serviram como células efetuadoras. 1x105 células alvo foram transfectadas com células T citotóxicas coincubadas em placas com 6 cavidades em duplicata nas seguintes proporções de efetuador para alvo: 0,3:1 - 1:1 - 3:1 - 10:. Além disso, células T citotóxicas humanas foram cultivadas na ausência de células alvo para determinar a ativação de base de células T. Células alvo de controle transfectadas com IVT-mRNA de controle ou IVT-mRNA de 1BiMAB também foram cultivadas na ausência de células efetuadoras para definir as células mortas de base pelo estresse da eletroporação. O controle negativo de luciferase apenas foi cultivado na proporção E:T máxima de 10:1. Após 48 h de coincubação, as células foram coletadas, identificadas e analisadas conforme descrito no Exemplo 16.
[0511] A Figura 26A mostra uma ativação específica de células T citotóxicas em resposta à secreção de 1BiMAB pelas células alvo NugC4. Independente do número de células T nas amostras, uma ativação total de 50-60% foi detectada. Além disso, a distribuição de expressão de CD25 e CD69 nas amostras é altamente comparável. Isto indica que há uma determinada percentagem de células T na população de células T citotóxicas que pode ser ativada.
[0512] Na Figura 26B, a dependência de lise eficiente de células alvo do número de células T citotóxicas se torna óbvia. Mesmo que as células alvo sejam submetidas à lise em uma proporção E:T de apenas 0,3:1, uma lise potente começa com uma proporção de 3:1.
Exemplo 22: Análise da ativação de células T e lise de células alvo em um ensaio com base em FACS com células efetuadoras transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB
[0513] Neste experimento, o objetivo foi testar se também células efetoras humanas são capazes de produzir e secretar 1BiMAB após transfecção de IVT-mRNA. A razão por trás disso foi a situação de um paciente hipotético no qual as células T do próprio paciente podem ser transfectadas com bi-scFv, seguido por uma re-transferência para o paciente.
[0514] Células T citotóxicas humanas - isoladas conforme descrito no Exemplo 16 - foram lavadas duas vezes com meio X-Vivo 15 (Lonza, Basileia, Suíça) e ressuspensas em uma densidade de 2x107 células/ml. 250 μl de suspensão de células foram transferidos para Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (Bio-Rad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm pré- resfriadas e 80 ou 240 μg/ml de IVT-mRNA foram adicionados. IVT-mRNAs usados foram 1BiMAB e eGFP como controle. Após mistura cuidadosa, as células foram eletroporadas com um eletroporador BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA) usando as seguintes condições: 500 V, 1 pulso, duração do pulso de 3 ms, duração de intervalo de 400 ms. Imediatamente após eletroporação, as cubetas foram logo colocadas sobre gelo e, então, as suspensões de células foram transferidas para meio de ensaio (RPMI 1640 suplementado com soro AB humano termicamente inativado a 5%, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha)) contendo 10 U/ml de IL-2. Células efetuadoras transfectadas foram cultivadas durante a noite a 37 °C, 5% de CO2. No dia seguinte, a eficiência de transfecção foi analisada por FACS, que revelou uma eficiência de transfecção acima de 70% para ambas as concentrações de IVT-mRNA de eGFP. Cada amostra de células efetuadoras foi contada e ajustada para 5x105 células por ml. Células alvo NugC4 foram coletadas por tripsinização, lavadas com meio de ensaio, contadas e ajustadas para 1x105 células por ml. As células efetuadoras e células alvo foram misturadas e cultivadas em 6 cavidades em duplicata com uma proporção E:T final de 5:1 e um volume final de 2 ml. As células T não tratadas foram cultivadas sem células alvo para determinação de sinais de ativação de base. Análise do ensaio foi realizada conforme descrito no Exemplo 16 após 48 horas de coincubação a 37 °C, 5% de CO2.
[0515] Uma ativação significativa de células T citotóxicas transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB e coincubadas com células alvo foi realizada, conforme mostrado na Figura 27A. A lise das células alvo por células T transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB era superior a 60%, conforme representado na Figura 27B. O efeitos de 80 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB não podem ser aumentados com quantidades maiores de RNA.
[0516] Em conclusão a partir deste experimento, as células efetuadoras poderiam, teoricamente, ser usadas como células receptoras que produzem e secretam bi-scFv.
Exemplo 23: Estudo da especificidade pelo alvo de IVT-mRNA de 1BiMAB em um ensaio Cytotox com base em luciferase usando células alvo negativas para CLDN18.2
[0517] A especificidade estrita pelo alvo é uma questão importante para evitar efeitos adversos indesejáveis em pacientes. Neste estudo preliminar, uma linhagem de células negativa para CLDN18.2 - a linhagem de células de teratocarcinoma PA-1 (ATCC CRL-1572) - foi escolhida para examinar um potencial citolítico não específico de 1BiMAB introduzido como IVT-mRNA.
[0518] A linhagem de células PA-1 usada tinha sido estavelmente transduzida com um vetor lentiviral de luciferase e poderia, portanto, ser aplicada em um ensaio Cytotox com base em luciferase. Células alvo PA-1/luc foram preparadas por meio de eletroporação, conforme descrito no Exemplo 16. Um total de 40 μg/ml de IVT-mRNA foi transfectado por amostra. IVT-mRNAs usados foram: 1BiMAB, no. 25 e 6RHU3. No. 25 objetiva o TAA PLAC-1 não expresso e 6RHU3 objetiva o alvo CLDN6 altamente expresso em células PA-1/luc. Para obter informações detalhadas sobre variantes de bi-scFv vide Tabelas 7 e 8. No.25 foi usado como IVT- mRNA de enchimento em amostras de eletroporação com 4 μg/ml de IVT-mRNA para assegurar o mesmo nível de estresse causado pela transfecção de RNA para todas as amostras de células alvo. Após mistura cuidadosa, as células foram transfectadas com um eletroporador BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA) usando as seguintes condições para uma cubeta de 0,4 cm: 200 V, 2 pulsos, duração de pulso de 12 ms, duração de intervalo de 400 ms. Imediatamente após eletroporação, as cubetas foram logo colocadas sobre gelo e, então, as suspensões de células foram transferidas para meio de ensaio PA-1 quente em RT (meio MEM suplementado com FCS a 10% termicamente inativado, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA, 1,5 g/l de bicarbonato de sódio e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha)) em tubos de 15 ml. Células alvo transfectadas foram contadas e ajustadas para 1x105 células por ml.
[0519] As células efetuadoras humanas foram isoladas conforme descrito no Exemplo 16. As células citotóxicas T humanas foram isoladas por meio de separação magnética de células ativadas (Magnetic-Activated Cell Separation - MACS) a partir de PBMCs pelo Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante . As células T foram ajustadas para 5x105 células por ml em meio de ensaio PA-1.
[0520] 1x104 células alvo foram cultivadas por cavidade de uma placa com 96 cavidades e células T citotóxicas humanas foram adicionadas em uma proporção E:T de 5:1. O volume final por cavidade foi de 100 μl. As amostras de controle contendo células efetoras e células alvo compreendiam células alvo que secretam no.25 como controle negativo, proteína 6RHU3 ou 6PHU3 como controle positivo e proteína 1BiMAB. As concentrações de proteínas foram ajustadas para uma concentração final de 100 ng/ml e foram combinadas com células alvo transfectadas com no.25 para assegurar a mesma condição para as células alvo usadas. Controles de lise mínima (Lmin) incluíam cada amostra de células alvo eletroporadas apenas. Controles de lise espontânea (Lmax) consistiam em células alvo e células efetuadoras não tratadas (Lmax1) para subtração de Lamostra teste ou células alvo não tratadas apenas (Lmax2) para subtração de Lmin. Cada amostra foi cultivada em triplicata. Análise do ensaio foi realizada após 72 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2. Controles de lise espontânea (Lmax) foram tratados com Triton X-100 em uma concentração final de 2%.
[0521] Para análise, 50 μl de uma solução aquosa contendo 1 mg/ml de luciferina (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e HEPES a 50 mM foram adicionados por cavidade e as placas subsequentemente incubadas durante 30 minutos no escuro a 37 °C. A luminescência resultante da oxidação da luciferina em luciferase expressa por células viáveis foi medida em um leitor de microplacas (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suíça). A percentagem de lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula a seguir: % de lise específica = [1 — (luminescênciaamostra teste- Lmaxl) / (Lmin — Lmax2 )] x 100.
[0522] A Figura 28 mostra a percentagem de lise específica de células alvo. Células PA-1/luc negativas para CLDN18.2 transfectadas com o controle negativo no.25 ou com 1BiMAB não mostram lise significativa, mesmo após uma incubação de 72 h. Também, 100 ng/ml de proteína 1BiMAB não resultam em lise significativa, enquanto que a lise por secreção de bi-scFv 6RHU3 que objetiva o TAA ou 100 ng/ml de proteína 6PHU3 estava entre 85-93%. Os pontos de tempo de 24 h e 48 h foram analisados também e mostram resultados equivalentes (dados não mostrados).
Exemplo 24: Análise qualitativa da produção de proteína 1BiMAB após transfecção de IVT-RNA de células de mamífero
[0523] Para fins de investigação da tradução de RNA em proteína em células de mamíferos, a linhagem de células BHK21 (ATCC CRL-13001) foi escolhida como um sistema de expressão. 2x107 células BHK21 por ml foram transfectadas por meio de eletroporação, conforme descrito no Exemplo 16, com a diferença de que todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente. 250 μl de suspensão de células foram transferidos para Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (Bio-Rad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm e 40 μg/ml de IVT-mRNA de 1BiMAB ou IVT-RNA de replicon foram adicionados. As condições de eletroporação foram as seguintes: 300 V, duração de pulso de 16 ms, 1 pulso, duração de intervalo de 400 ms.
[0524] As células eletroporadas foram ressuspensas em meio de cultura em RT (RPMI1640, FCS a 10%) e transferidas para discos de cultura de 15 cm. 5 horas após cultura, o meio contendo FCS foi substituído por meio sem FCS. No caso dos Exemplos 24a e b, o sobrenadante da cultura de células e as células foram coletadas separadamente 18 h após eletroporação. Os pellets celulares foram submetidos à lise em 1x tampão de amostra LDS (cat. no. NP0008; Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) e aquecidos a 72 °C durante 15 min. Para análise ELISA, sobrenadante não concentrado e concentrado cerca de 50 vezes foi usado. A concentração foi realizada com Amicon ultra-15 Centrifugal Filter Units (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. No caso do Exemplo 24c (IVT-mRNA apenas), o sobrenadante foi coletado 48 h após transfecção e submetido a uma concentração de 40 vezes, conforme descrito acima.
a. ELISA usando sobrenadante
[0525] Para análise ELISA, placas revestidas de níquel (Thermo Fisher Scientific, Bonn, Alemanha) foram usadas para captura do analito através de sua His-Tag. Primeiro, a placa foi lavada três vezes com 200 μl de tampão de lavagem (Tween-20 a 0,01% em 1x PBS) por cavidade. Como padrão, proteína 1BiMAB purificada foi diluída em Na-caseína a 1,75% em 1 x PBS (= diluente). A coluna de diluição variava de 2,34-37,50 ng/mL em etapas de 2. 100 μl por diluição padrão foram transferidos para as cavidades em triplicata de cada concentração. Consequentemente, 100 μl das amostras foram transferidos em triplicata. A placa foi selada com um filme adesivo e incubada a 37 °C durante 30 minutos. Então, a placa foi lavada três vezes com 200 μl de tampão de lavagem por cavidade. Para detecção de 1BiMAB, o anticorpo monoclonal de IgG anti-idiotípico 8B1F3, o qual se liga especificamente à VH-VL de mCLDN18.2ab e, portanto, também à 1BiMAB, foi usado. 8B1F3 foi misturado no diluente em uma concentração final de 1 μg/ml. 100 μl da solução de anticorpo anti-idiotípico foram transferidos para cada cavidade, seguido por um tempo de incubação de 30 min a 37 °C. Subsequentemente, a placa foi lavada 3x com 200 μl de tampão de lavagem por cavidade e 100 μl de um anticorpo de detecção anti-camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA) - diluído a 1:500 em diluente - foram adicionados a cada cavidade, seguido por 30 min de incubação a 37 °C. Após um etapa final de lavagem (3 x 200 μl de tampão de lavagem), 1,5 mg/ml do substrato pNPP em tampão de substrato apropriado (dietanolamina a 1 M, MgCl2 a 0,5 mM, azida de sódio a 0,01%, pH de 9,8) foram adicionados a cada cavidade, seguido por incubação durante 30 min em temperatura ambiente no escuro. 100 μl de KOH a 3 M foram usados para cada cavidade para interromper a reação enzimática. A absorbância foi medida com um leitor de microplacas (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suíça). Para análise de duplo comprimento de onda, 405 nm foi definido como o comprimento de onda de medição e 492 nm como comprimento de onda de referência. Os valores de absorbância foram calculados subtraindo-se o comprimento de onda de referência do comprimento de onda de medição.
[0526] Na Figura 29A, os valores de absorbância a 405 nm, incluindo o desvio padrão, são representados. Sobrenadante concentrado a partir de IVT-mRNA de 1BiMAB e células transfectadas com IVT-replicon levou a sinais significativos que comprovam a tradução de IVT-RNA que codifica bi-scFv. Sobrenadante concentrado a partir de células simuladamente transfectadas não resultou em qualquer sinal. As concentrações reais de proteína não podem ser propostas em virtude das diferentes toxicidades das construções de IVT-mRNA e IVT-replicon e X de concentração ligeiramente diferentes. Estimativa da concentração aproximada de proteína no sobrenadante concentrado estava na faixa de 1,5 ng/mL para amostras de IVT-replicon e 2,4 ng/mL para amostras de IVT-mRNA.
b. Análise Western blot do sobrenadante e lisato celular (amostras de IVT-mRNA e IVT-replicon)
[0527] Para análise Western blot, os sobrenadantes concentrados e lisatos celulares foram separados em géis de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Sobrenadante e lisato celular de células BHK21 transfectadas com IVT-mRNA de 1BiMAB, RNA de IVT-replicon ou células não tratadas e um controle positivo - 0,1 mg de proteína 1BiMAB purificada - foram carregados. A análise Western blot foi realizada através de procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012). Resumidamente, após secagem das proteínas sobre membranas de PVDF e bloqueio com PBST/leite em pó a 3%, a membrana foi incubada durante 1 h a 4 °C com o anticorpo primário anti-Epítopo-Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio. Após repetidas lavagens com tampão de bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo específico para Fc conjugado com peroxidase (Sigma Aldrich, Alemanha) diluído a 1:10000 em tampão de bloqueio durante 1 h a 4 °C. Após lavagens repetidas com tampão de bloqueio, os sinais foram visualizados pelo SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) e registrados por um ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha). Foram detectados sinais de 1BiMAB entre 50 e 60 kDa comparado com o padrão de peso molecular interno.
[0528] Conforme mostrado na Figura 29B, sinais fracos foram detectados no sobrenadante de células transfectadas com IVT-mRNA (coluna 2) e RNA de IVT-replicon (coluna 3), enquanto que o sinal está ausente na coluna 4 com sobrenadante de células não tratadas. Sinais fortes puderam ser gerados com lisatos celulares de células transfectadas com IVT-mRNA (coluna 5) e RNA de IVT-replicon (coluna 6). O lisato celular de células não tratadas (coluna 7) novamente não levou a nenhum sinal. Todos os sinais apareceram na mesma altura que o controle de proteína 1BiMAB purificada (coluna 8). O sinal fraco no sobrenadante e, com ele, a fraca secreção de 1BiMAB, provavelmente se deve ao tempo de incubação relativamente curto após transfecção. Em virtude do efeito tóxico do RNA de replicon, tempos de incubação mais longos não puderam ser testados.
[0529] Ambas as análises são de natureza qualitativa e não servem para determinações de concentração de proteínas.
c. Análise Western blot do sobrenadante (amostras de IVT- mRNA)
[0530] O sobrenadante coletado 48 h após transfecção foi separado por SDS-PAGE, seguido de análise Western blot, conforme descrito no Exemplo 24b. Conforme mostrado na Figura 29C, no.25 e 1BiMAB traduzidos a partir de IVT-mRNA e secretados no sobrenadante foram detectados através da sua His-tag. Com isto, a produção e secreção de 1BiMAB, bem como no.25, o qual foi usado como controle de especificidade de bi-scFv, puderam ser comprovadas.
Exemplo 25: Detecção de proteína 1BiMAB funcional e traduzida in vivo após injeção intramuscular de RNA
[0531] Camundongos NSG fêmeas e machos com idade de 8-16 semanas foram selecionados e distribuídos em 4 grupos de 5 camundongos. 40 μl de solução de RNA foram injetados por camundongo no músculo femoral. 40 μl de solução de RNA consistia em 1x PBS, 5 μg de IVT-mRNA de 6RHU3 D2-capped ou replicon, 2 μg de IVT-mRNA de luciferase D1-capped e 0 ou 15 μg de IVT-mRNA de EBK D1-capped. O IVT-mRNA de EBK que codifica as proteínas do vírus da varíola E3L, B18R e K3L (EBK) foi coinjetado para inibir a resposta de IFN e neutralizar a ativação de PKR para fins de melhora da tradução de RNA (Pedido de Patente PCT/EP2012/04673). O sinal da luciferase foi monitorado 24 horas após injeção com um Xenogen IVIS 2000 para excluir camundongos sem sinal das coletas de amostras.
[0532] Sangue foi coletado 2, 4 e 7 dias após a injeção. O soro foi coletado e subsequentemente congeladas a -80 °C. O sangue foi coletado 2, 4 e 7 dias após injeção. O soro foi coletado e subsequentemente congelado a -80 °C. Músculos de camundongos com forte sinal de luminescência foram dissecados e histofixados para IHC ou congelados para análise de Western blot 4 dias após a injeção de RNA. Ensaio Cytotox
[0533] Soro de camundongos NSG foram analisados em um ensaio Cytotox in vitro. Células alvo NugC4 transduzidas estavelmente com luciferase de vaga-lume e expressando endogenamente CLDN18.2 foram cultivadas com células T humanas (isoladas conforme descrito no Exemplo 16) em uma proporção E:T de 30:1 para sensibilidade máxima. O meio de ensaio consistia em RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% termicamente inativado, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). 20 μl de soro de teste descongelado foram adicionados por amostra de teste também. Cavidades de controle padrão com 1BiMAB e cavidades para Lmin e Lmax foram completadas com 20 μl de soro de camundongos NSG não tratados. O volume final por cavidade foi de 100 μl. Lmin foi cultivada doze vezes, Lmax seis vezes e amostras de teste em triplicata. Após 48 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, cavidades para Lmax foram misturadas com 10 μl de solução de Triton X-100 a 2% e incubadas durante 10 min. Para todas as outras cavidades, foram adicionados 10 μl de meio de ensaio. 50 μl de solução de luciferina (vide Exemplo 23) foram adicionados e as placas foram medidas - após uma etapa de incubação de 30 min a 37 °C no escuro - em um leitor de microplacas Infinite M200 (TECAN, Mannedorf, Suíça). Cálculo de lise específica de células alvo foi realizada conforme descrito no Exemplo 23.
[0534] Na Figura 30, a percentagem de lise específica é representada. Efeitos citolíticos foram aumentados em um fator de 1,7 em cavidades contendo soro de camundongos injetados com IVT-mRNA de EBK e 1BiMAB e coletado 2 dias após injeção. Efeitos citotóxicos significativos foram detectados em cada grupo. Efeitos significativamente menores foram atingidos por amostras coletadas 4 ou 7 dias após injeção. No caso de amostras de 1BiMAB-replicon, soros coletados em pontos de tempo posteriores também geraram fortes efeitos citolíticos.
[0535] Estes dados comprovam a tradução in vivo de 1BiMAB a partir de IVT-mRNA ou -replicon e a secreção na corrente sanguínea após injeção intramuscular.
Exemplo 26: Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN6 e CD3 a. Origem de sequência, concepção de construções bi-scFv e clonagem em vetores modelo
[0536] As construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos em tandem (bi-scFv) continham domínios de ligação específicos para o componente receptor de células T humano CD3 e antígenos associados a tumor (Tumor Associated Antigen - TAA) humanos. As regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes (VH) e as regiões variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes para cada construto são especificamente arranjadas, do N- para o C-término, na ordem consecutiva:pST1-5'hAgKozak-VHαCLDN6-VLαCLDN6-VHαCD3-VLαCD3-His-2hBgUTR-A12 0 (6RHU5) pST1-5'hAgKozak-VHαCD3-VLαCD3-VHαCLDN6-VLαCLDN6-His-2 hBgUTR-A12 0 (6RHU3)
[0537] A Tabela 9 resume todas as construções bi- scFv específicos para os TAAs CLDN6 que foram elaborados no curso da invenção. As construções de bi-scFv específicos para CLDN18.2, 1BiMAB, foram usadas como anticorpo de controle. As construções bi-scFv foram geradas por meio de síntese gênica pela GeneArt AG (GeneArt/Life Technologies GmbH, Regensburg, Alemanha) usando as sequências de VH e VL dos anticorpos correspondentes. Otimizações de códons, tal como Homo sapiens (HS, Mus musculus (MM) ou ovário de hâmster chinês (Chinese Hamster Ovary - CHO), foram implementadas pelo software GeneOptimizer® da GeneArt e são listadas na Tabela 9. Informações sobre a especificidade, origem sequência de anticorpos monoclonais (mAB), uso de códon, características de sequência adicionais e referências de todos os domínios aplicados são resumidos na Tabela 10. A origem de sequência do domínio variável dos respectivos anticorpos à CD3 são listados na Tabela 10. Em virtude da elevada homologia de TAAs humanos e de camundongo, as mesmas sequências de VH e VL anti-TAA podem ser usadas para a geração de construções bi-scFv para ensaios com camundongo, mas em combinação com as sequências de VH e VL de anticorpos específicos anti-CD3 de camundongo, clone 145-2C11.
[0538] Clonagem de DNA e construção de vetor de expressão foram realizadas de acordo com procedimentos convencionais (Sambrook, 1989) bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, as sequências de DNA de scFv-bi foram fornecidas com um sítio de restrição 5'-BsmBI e 3'-XhoI para clonagem em plasmídeos pST1. Uma sequência de sinal de secreção foi introduzida na extremidade 5' a montante da sequência do bi-scFv para secreção de proteínas a partir do citoplasma celular no meio de cultura. Uma sequência de codificação para um ligante peptídico de glicina-serina flexível de 15 a 18 aminoácidos foi inserido para unir os domínios VH e VL para a composição dos fragmentos de anticorpos variáveis com uma única cadeia (scFv), um dos quais se liga à CD3 e o outro ao TAA. Para formar um anticorpo com uma única cadeia biespecífico, as duas sequências de domínios scFv foram conectadas através de uma sequência de codificação para um ligante peptídeo curto (GGGGS). Juntamente com esta sequência ligante, um sítio de restrição BamHI foi introduzido para trocas de domínios scFv para a clonagem das próximas construções de bi-scFv. Resumidamente, domínios 5'-scFv podem ser trocados por sítios de restrição BsmBI e BamHI e domínios 3'-scFv por sítios de restrição BamHI e XhoI. Uma 6xHis-tag no C- término foi implementada para análise de detecção da proteína traduzida. Para produção do vetor de replicon de 6RHU3, a sequência de 6RHU3 completa incluindo sinal de secreção e 6xHis-tag foi subclonada 3' do promotor subgenômico do vetor de replicon do vírus Semliki Forest (pSFV) gentilmente fornecido por K. Lundstrom (Lundstrom, K. et al. (2001) Histochem. Cell Biol. 115 (1), páginas 8391; Ehrengruber, M.U. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12), páginas 7041-7046).
[0539] Todas as construções foram verificadas por meio de sequenciamento através do MWG's Single Read Sequence Service (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemanha)e apenas aqueles com uma sequência correta e cauda poli(A) de mais de 100 adeninas foram usados para transcrição de RNA in vitro.
[0540] Para esquemas de construção, vide também Figura 31A.Tabela 9: Sumário de TAA e construções de mRNA-modelo de anticorpo com uma única cadeia biespecífico específico para CD3
[0541] Bi-scFv indica fragmento variável biespecífico com uma única cadeia; SH, Homo sapiens; MM, Mus musculus; TAA, antígeno associado a tumor; VH, domínio variável de cadeia pesada, VL, domínio variável de cadeia leve. Tabela 10: Sumário de informação sobre construção bi-scFv de mRNA-modeloTabela 10 – Continuação
b. Síntese de IVT-RNA
[0542] Para a geração de modelos de IVT bi-scFv anti-CLDN6, os plasmídeos foram linearizados a jusante da cauda poli(A) usando uma endonuclease de classe IIs. DNA modelo linearizado foi purificado por meio de extração com fenol/clorofórmio e precipitação com acetato de sódio, conforme descrito em outra parte (Holtkamp, S. et al. (2006) Blood 108 (13), páginas 4009-4017).
[0543] Modelos de DNA linearizados foram submetidos à transcrição in vitro usando kits MEGAscript (Ambion/Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante: modelos de pST1 foram transcritos com o kit MEGAscript T7 e modelos de pSFV com o Kit MEGAscript SP6. Para as reações com "cap" análoga, a concentração de GTP foi reduzida para 1,5 mM e 6 mM de ARCA, beta-S-ARCA(D1) ou beta-S-ARCA(D2), sintetizado conforme descrito em outra parte (Kowalski, J. et al. (2008) RNA 14 (6), páginas 1119-1131; Grudzien, E. et al. (2004) RNA 10 (9), páginas 1479-1487; Stepinski, J. et al. (2001) RNA 7 (10), páginas 1486-1495) foram adicionados à reação. Purificação de IVT-mRNA foi realizada com o Kit MEGAclear (Ambion/Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) de acordo com o manual. A concentração e a qualidade do IVT-RNA foram avaliadas por espectrofotometria e análise em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).
Exemplo 27: Análise microscópica de células T redirecionadas para objetivar células alvo que secretam bi- scFv 1BiMAB específico para CLDN6
[0544] A configuração de ensaio foi realizado, em princípio, conforme descrito no Exemplo 2.a.
[0545] Como linhagem de células alvo, foi usado um subclone da linhagem de células de teratocarcinoma ovariano PA-1 (ATCC CRL-1572) que expressa endogenamente níveis elevados de CLDN6 humano. Células T citotóxicas humanas foram isoladas por meio de MACS de PBMCs recentemente isoladas pelo Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Teterow, Alemanha) de acordo com as orientações do fabricante.
[0546] Células alvo PA-1 - as quais são rotineiramente ensaiadas quanto à expressão por meio de análise FACS antes de cada ensaio - foram lavadas duas vezes com meio X-Vivo 15 gelado (Lonza, Basileia, Suíça) e ressuspensas em uma densidade de 2x107 células/ml. 250 μl de suspensão de células foram transferidos para Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (Bio-Rad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm pré-resfriadas e 20 μg/ml de IVT-mRNA foram adicionados. Condições usando um eletroporador BTX ECM 830 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA) foram: 200 V, duração de pulso de 12 ms, 2 pulsos, duração de intervalo de 400 ms. Os IVT-mRNAs usados foram: 6RHU5, 6RHU3, no.25 (para maiores detalhes vide Tabelas 9 e 10). Células alvo transfectadas foram contadas e ajustadas para 1x105 células por ml. 1x105 células alvo foram cultivadas por cavidade de uma placa com 6 cavidades e células T citotóxicas humanas foram adicionadas de acordo com uma proporção E:T de 5:1. O volume final por cavidade foi de 2 ml. As amostras de controle compreendiam células alvo transfectadas apenas para fins de prova após eletroporação e células alvo transfectadas com bi-scFv de controle com células efetuadoras. Como controles positivos, proteína bi-scFv CLDN6 e 6PHU5 específicas para 6PHU3 correspondentes foram aplicadas em uma concentração de 50 μg/ml. Portanto, células PA-1 não tratadas foram usadas com as células T humanas. As placas de cultura tecidual foram subsequentemente incubadas a 37 °C, 5% de CO2. Efeitos significativos em termos de agregação de células T sobre células alvo, formação de uma sinapse imunológica e morte de células alvo em amostras contendo células alvo transfectadas com 6RHU5 ou 6RHU3 foram observados após 24 h e registrados com um microscópio invertido Nikon Eclipse TS100 (Nikon, Japão). Conforme mostrado na Figura 32, nenhuma agregação de células T ou lise de células alvo foi observada na amostra de controle com células alvo transfectadas com No.25, o que implica na estrita dependência da expressão de TAA para indução de uma ativação de células T. O controle simulado sem bi-scFv também não mostra nenhum agrupamento de células T. Controles de proteína, ao contrário, levaram à forte agregação de células T e lise de células alvo.
Exemplo 28: Ativação de células T induzida por bi-scFv candidatos 6RHU5 e 6RHU3 que objetivam CLDN6
[0547] Para a detecção de ativação de células T e para definir as diferenças na eficiência das duas variantes de bi-scFv específicas para CLDN6, um ensaio de ativação de células T com base em FACS foi realizado. O marcador de ativação precoce CD69 e o marcador de ativação tardia CD25 foram selecionados para coloração por fluorescência de anticorpos conjugados. Para detecção de células T humanas na mistura de células alvo e células T, CD3 expressa por todas as células T foi corada.
[0548] Células alvo e efetuadoras foram preparadas conforme descrito acima (Exemplo 27). Resumidamente, células alvo PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 foram transfectadas por meio de eletroporação com 20 μg/ml dos seguintes IVT-mRNAs: 6RHU5, 6RHU3 e no.25. No.25, que objetiva um TAA não expresso, serviu como controle de especificidade, as células alvo não tratadas como controle simulado. Como controle positivo, foram usados 50 ng/ml de proteína 6PHU5. Além disso, células T foram cultivadas sem células alvo, com ou sem proteína 6PHU5, serviram como referências de ativação de linha de base. Cada amostra foi cultivada em duplicata sobre placas com 6 cavidades e incubadas a 37 °C, 5% de CO2. Após 24 h e 48 h, as células T foram coletadas por meio de raspagem e transferidas para tubos de 5 ml de fundo redondo (BD Falcon, Heidelberg,Alemanha). As células foram centrifugadas e lavadas com DPBS. Para coloração de células, anticorpo de camundongo anti-CD3 humana-FITC, anticorpo de camundongo anti-CD69 humana-APC e anticorpo de camundongo anti-CD25 humana-PE (todos os anticorpos da BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) foram usados. Os pellets celulares foram ressuspensos em 50 μl de tampão para FACS (DPBS suplementado com FBS a 5%) contendo os anticorpos conjugados por fluorescência e 2 μl de 7-AAD (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Após incubação durante 20 min a 4 °C no escuro, as amostras foram lavadas com 4 ml de DPBS e os pellets celulares foram ressuspensos em 200 μl de tampão para FACS. As amostras foram mantidas sobre gelo e escuro durante toda a medição com um citômetro de fluxo FACSCanto II (ambos BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A análise foi avaliada por um software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).
[0549] Conforme mostrado nas Figuras 33A e B, ambas as variantes levaram à ativação de células T, enquanto que nenhum dos controles negativos mostrou expressão significativa de marcadores de ativação de células T, CD69 ou CD25.
[0550] A ativação total de células T em resposta à 6RHU3 foi 1,53 vezes maior após 24 h (A) e 1,35 vezes maior após 48 h (B) de coincubação do que em resposta à 6RHU5. Com base em todos estes resultados, foram realizados estudos adicionais apenas com a variante 6RHU3.
Exemplo 29: Concentração dependente de ativação de células T através de coincubação com células alvo transfectadas com 6RHU3
[0551] Para determinação da menor concentração de IVT-RNA de 6RHU3 necessária para induzir a uma ativação de células T dependente do alvo, uma série de diluições de 0,2-20 μg/ml de IVT-mRNA foi transfectada em células alvo PA-1. Para expor todas as amostras ao mesmo nível de estresse pela eletroporação de RNA, uma concentração total de 20 μg/ml de IVT-mRNA foi transfectada. No.25 - que objetiva um TAA não expresso - foi usado como IVT-mRNA de enchimento. Consequentemente, 0 μg/ml de 6RHU3 se correlaciona com 20 μg/ml de no.25. A eletroporação foi realizada conforme descrito no Exemplo 27. Células T humanas foram usadas como células efetuadoras. Isolamento de PBMCs foi realizado de acordo com o manual do fabricante (Pan T Cell Isolation Kit II, Miltenyi, Teterow, Alemanha).As células efetuadoras e células alvo foram misturadas em uma proporção de 5:1. Células alvo não tratadas com células T serviram como controle simulado. Além disso, as células T foram cultivadas sem células alvo, com ou sem proteína 6PHU5, como referências de ativação de base. Como controle positivo, células alvo não tratadas foram misturadas com células T e 50 ng/ml de proteína 6PHU5. Todas as amostras foram preparadas em duplicata em placas com 6 cavidades.
[0552] As células alvo e efetuadoras foram coincubadas durante 48 h a 37 °C, 5% de CO2. As amostras foram preparadas para análise por meio de citometria de fluxo, conforme descrito no Exemplo 28.
[0553] Na Figura 34, a percentagem de células T CD3-positivas que expressam marcadores de ativação é representada. Nenhuma ativação de células T foi observada nos controles. A detecção de uma ativação significativa de células T começou em uma concentração de 0,7 μg/ml de IVT- mRNA de 6RHU3. Efeitos em resposta a 2,0 μg/ml de IVT-mRNA de 6RHU3 eram comparáveis com aqueles mediados por 50 ng/ml de proteína 6PHU5 de controle. Assim, tradução e secreção da proteína a partir de IVT-RNA transfectado parece ser um processo eficiente.
Exemplo 30: Determinação de EC50 para 6RHU3
[0554] Para a determinação de metade da dose eficaz máxima de IVT-mRNA que codifica bi-scFv 6RHU3, uma série de titulações de 6RHU3 foi testada em um ensaio Cytotox de luciferase in vitro. Células PA-1 que expressam estavelmente luciferase foram transfectadas transitoriamente por meio de eletroporação, conforme descrito no Exemplo 27. As concentrações de IVT-mRNA de 6RHU3 usadas variaram de 0,004-13,3 μg/ml em 6 etapas de diluição. A concentração total de IVT-mRNA foi constantemente ajustada para 13,3 ng/ml, no.25 foi usado como IVT-mRNA de enchimento. Como controles de lise mínima (Lmin), todas as amostras de células alvo transfectadas foram cultivadas sem células efetuadoras. Através deste processo, as células mortas de linha de base de cada amostra de eletroporação individual são subtraídas e apenas efeitos de lise mediados por células T serão obtidos.
[0555] Células alvo transfectadas foram cultivadas com células T humanas em uma proporção de efetuador para alvo de 5:1 em triplicata em um formato de 96 cavidades e incubadas a 37 °C, 5% de CO2. Lise máxima (Lmax) para normalização para contagens de luminescência espontâneas foi obtida mediante adição de Triton X-100 a cavidades de controle contendo células efetuadoras e células alvo não tratadas pouco antes da adição de luciferina. Após a adição da solução de luciferina - 50 μl por cavidade de uma solução aquosa contendo 1 mg/ml de luciferina (BD Monolight, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e HEPES a 50 mM - a luminescência foi medida em um leitor de microplacas Infinite M200 Tecan após 24 h e 48 h. A lise específica de células alvo de foi calculada pela fórmula: % de lise específica = [luminescênciaamostra teste - Lmax) / (Lmin_amostra teste - Lmax)] x 100.
[0556] A Figura 35 representa a curva dependente da concentração de lise específica de células alvo em resposta à 6RHU3. Uso da equação "log(agonista) versus resposta - declínio variável" do GraphPad Prism para cálculo de valores de EC50 revelou um valor de EC50 (24 h) = 548,0 ng/ml e um valor de EC50 (48 h) = 194,5 ng/ml. O resultado deste ensaio depende fortemente da potência das células T humanas que varia de acordo com o estado imune do doador, conforme também reportado por outros (vide, por exemplo (Lutterbuese, R. et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (28), páginas 12605-12610). Portanto, os resultados podem variar com cada doador.
Exemplo 31: Proliferação de células T em resposta à transfecção com IVT-mRNA de 6RHU3
[0557] A proliferação de células T é um indicador de ativação de células T. Para mostrar a proliferação de células T específica em resposta ao IVT-mRNA que codifica bi-scFv 1BiMAB na presença de células alvo positivas para CLDN6, foi usado um ensaio de citometria de fluxo. Resumidamente, 1x107 células T humanas isoladas conforme descrito no Exemplo 16 foram coradas com succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína a 1 μM (CellTrace CFSE, Invitrogen/Life Technologies GmbH, Alemanha) dissolvido em DPBS no escuro em temperatura ambiente durante 5 min. As células foram lavadas duas vezes com DPBS/FCS a 5% e ressuspensas em meio de ensaio para 2x106 células por ml. Como células alvo, células PA-1 que expressam endogenamente CLDN6 e - para testar a especificidade - a linhagem de células de câncer de mama MDA-MB-231 negativa para CLDN6 foram escolhidas. 20 μg/ml de IVT-mRNAs de 6RHU3ou um controle não específico foram usados para eletroporação. A eletroporação de PA-1 foi realizada conforme descrito no Exemplo 27. Eletroporação de MDA-MB-231 foi realizada usando as seguintes condições: 400 V, duração de pulso de 3 ms, 1 pulso, duração de intervalo de 400 ms em Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (BioRad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm. Um ensaio Cytotox conforme descrito no Exemplo 27 foi configurado com as células alvo transfectadas e células T marcadas com CFSE humano como células efetuadoras. Células T apenas e células alvo não transfectadas ou células de controle transfectadas mais células T foram usadas como controles negativos. Células T apenas estimuladas com 5 μg/ml de OKT3 (Bio X Cell, West Lebanon,NH, EUA) e 2 μg/mL de anti-CD28 (BioLegend, Fell, Alemanha) serviram como controle positivo. Proteína 6PHU3 na concentração de 5 ng/ml foi aplicada às células alvo mais células T não transfectadas para confirmar a validade do ensaio. Amostras combinadas com a proteína bi-scFv 1BiMAB não específica foram incluídas como controle de especificidade. Todas as amostras foram criadas em triplicata em um volume total de 0,2 ml de meio de ensaio em 96 cavidades. Após 72 h de coincubação, as células T foram colhidas, coletadas em tubos de 5 ml de fundo redondo, lavadas e coradas a 4 °C durante 30 min com 2 μL de anti-CD45-APC para diferenciar células T humanas de células tumorais e 0,25 μl de eFluor506 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) para contra-coloração de células mortas em 200 μl de DPBS. Após lavagem com DPBS, as células foram ressuspensas em tampão para FACS e analisadas com um FACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).
[0558] A proliferação de células T foi detectada através da diminuição do sinal de CFSE apenas na presença de células alvo positivas para CLDN6 e bi-scFv anti-CLDN6 específica (vide também Figura 36). Além do controle positivo, uma proliferação de células T de 49-61% pôde ser observada na presença de células alvo positivas para CDLN6 em combinação com proteína 6PHU3. Células alvo positivas transfectadas com IVT-mRNA de 6RHU3 levaram a 62% +/- 2%. Células T foram incubadas com células alvo MDA-MB-231 negativas para CLDN6 não mostram uma proliferação significativa em qualquer caso, bem como células T sem células alvo, exceto quanto ao controle positivo.
Exemplo 32: Análise qualitativa da produção de proteína após transfecção de células de mamífero com IVT-RNA de 6RHU3
[0559] Para fins de investigação da tradução de RNA em proteína em células de mamíferos, a linhagem de células BHK21 (ATCC CRL-13001) foi escolhida como um sistema de expressão. 2x107 células BHK21 por ml foram transfectadas por meio de eletroporação, conforme descrito no Exemplo 16, com a diferença de que todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente. 250 μl de suspensão de células foram transferidos para Gene Pulser/MicroPulser Cuvetes (Bio-Rad, Dreieich, Alemanha) de 0,4 cm e 40 μg/ml de IVT-mRNA de no.25, IVT-mRNA de 6RHU3 ou RNA de IVT-replicon de 6RHU3 foram adicionados. As condições de eletroporação foram as seguintes: 300 V, duração de pulso de 16 ms, 1 pulso, duração de intervalo de 400 ms.
[0560] As células eletroporadas foram ressuspensas em meio de cultura em RT (RPMI1640, FCS a 10%) e transferidas para discos de cultura de 15 cm. 5 horas após cultura, o meio contendo FCS foi substituído por meio sem FCS. No caso dos Exemplos 24a e b, o sobrenadante da cultura de células e as células foram coletadas separadamente 18 h após eletroporação. Os pellets celulares foram submetidos à lise em 1x tampão de amostra LDS (cat. no. NP0008; Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) e aquecidos a 72 °C durante 15 min. Para análise ELISA, sobrenadante não concentrado e concentrado cerca de 50 vezes foi usado. A concentração foi realizada com Amicon ultra-15 Centrifugal Filter Units (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. No caso do Exemplo 32c (IVT-mRNA apenas), o sobrenadante foi coletado 48 h após transfecção e submetido a uma concentração de 40 vezes, conforme descrito acima.
a. ELISA usando sobrenadante
[0561] Para análise ELISA, placas revestidas de níquel (Thermo Fisher Scientific, Bonn, Alemanha) foram usadas para captura do analito através de sua His-Tag. Primeiro, a placa foi lavada três vezes com 200 μl de tampão de lavagem (Tween-20 a 0,01% em 1x PBS) por cavidade. Como padrão, proteína 1BiMAB purificada foi diluída em Na-caseína a 1,75% em 1 x PBS (= diluente). A coluna de diluição variava de 2,34-37,50 ng/mL em etapas de 2. 100 μl por diluição padrão foram transferidos para as cavidades em triplicata de cada concentração. Consequentemente, 100 μl das amostras foram transferidos em triplicata. A placa foi selada com um filme adesivo e incubada a 37 °C durante 30 minutos. Então, a placa foi lavada três vezes com 200 μl de tampão de lavagem por cavidade. Para detecção de 6PHU3/6RHU3, o anticorpo monoclonal de IgG anti-idiotípico 4F9, o qual se liga especificamente à VH-VL de mCLDN6ab e, portanto, também à 6PHU3/6RHU3, foi usado. 4F9 foi misturado no diluente em uma concentração final de 2,5 μg/ml. 100 μl da solução de anticorpo anti-idiotípico foram transferidos para cada cavidade, seguido por um tempo de incubação de 30 min a 37 °C. Subsequentemente, a placa foi lavada 3x com 200 μl de tampão de lavagem por cavidade e 100 μl de um anticorpo de detecção anti-camundongo conjugado com AP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA) - diluído a 1:500 em diluente - foram adicionados a cada cavidade, seguido por 30 min de incubação a 37 °C. Após um etapa final de lavagem (3 x 200 μl de tampão de lavagem), 1,5 mg/ml do substrato pNPP em tampão de substrato apropriado (dietanolamina a 1 M, MgCl2 a 0,5 mM, azida de sódio a 0,01%, pH de 9,8) foram adicionados a cada cavidade, seguido por incubação durante 30 min em temperatura ambiente no escuro. 100 μl de KOH a 3 M foram usados para cada cavidade para interromper a reação enzimática. A absorbância foi medida com um leitor de microplacas (Infinite M200, Tecan, Mannedorf, Suíça). Para análise de duplo comprimento de onda, 405 nm foi definido como o comprimento de onda de medição e 492 nm como comprimento de onda de referência. Os valores de absorbância foram calculados subtraindo-se o comprimento de onda de referência do comprimento de onda de medição.
[0562] Na Figura 37A, os valores médios de absorbância, incluindo o desvio padrão, são representados. Sobrenadante concentrado a partir de células transfectadas com IVT-mRNA de 6RHU3 e IVT-replicon levou a sinais significativos que comprovam a tradução de IVT-RNA que codifica bi-scFv. Sobrenadante concentrado a partir de células simuladamente transfectadas e células transfectadas com controle no.25 (-ctrl) não resultou em nenhum sinal, conforme esperado. As concentrações reais de proteína não puderam ser propostas em virtude das diferentes toxicidades das construções de IVT-mRNA e IVT-replicon e vezes de concentração ligeiramente diferentes. Estimativa da concentração aproximada de proteína no sobrenadante não concentrado estava na faixa de 1,4 ng/ml para amostras de IVT-replicon e 5,9 ng/mL para IVT-mRNA.
b. Análise Western blot do sobrenadante e lisatos celulares (amostras de IVT-mRNA e -replicon)
[0563] Para análise Western blot, os sobrenadantes concentrados e lisatos celulares foram separados em géis de Bis-Tris a 4-12% NuPAGE Novex (Invitrogen/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). Sobrenadante e lisato celular de células BHK21 transfectadas com IVT-mRNA de 6RHU3, RNA de IVT-replicon, IVT-mRNA de no.25 ou células não tratadas e um controle positivo - 0,1 mg de proteína6PHU3 purificada - foram carregados. A análise Western blot foi realizada através de procedimentos convencionais (Current Protocols in Protein Science, 2012). Resumidamente, após secagem das proteínas em membranas de PVDF e bloqueio com PBST/leite em pó a 3%, a membrana foi incubada durante 1 h a 4 °C com o anticorpo primário anti-Epítopo-Tag HIS (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemanha) diluído a 1:500 em tampão de bloqueio. Após repetidas lavagens com tampão de bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo específico para Fc conjugado com peroxidase (Sigma Aldrich, Alemanha) diluído a 1:10000 em tampão de bloqueio durante 1 h a 4 °C. Após repetidas lavagens novamente com tampão de bloqueio, os sinais foram visualizados pelo SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Pierce/Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) e registrados por um ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Life Sciences, Munique, Alemanha). Foram detectados sinais de 6PHU3 entre 50 e 60 kDa quando comparado com o padrão de peso molecular interno.
[0564] Conforme mostrado na Figura 37B, sinais foram detectados em sobrenadantes de células transfectadas com IVT-mRNA de no.25 (coluna 1), IVT-mRNA de 6RHU3 (coluna 4) e RNA de IVT-replicon de 6RHU3 (coluna 5), enquanto que a coluna 6 com sobrenadante de células não tratadas não tem sinal. Sinais fortes podem ser gerados com lisatos celulares de células transfectadas com IVT-mRNA de 6RHU3 (coluna 8) e RNA de IVT-replicon (coluna 9). O lisato celular de células transfectadas no.25 levou a um sinal muito fraco (coluna 2); células não tratadas (coluna 10) não mostraram qualquer sinal. Controle de proteína 6PHU3 purificada (coluna 11) pôde ser detectado. Os sinais relativamente fracos no sobrenadante e, com isto, a fraca secreção de 6RHU3, provavelmente se devem ao tempo de incubação relativamente curto após transfecção. Em virtude do efeito tóxico do RNA de replico, tempos de incubação mais longos não puderam ser testados.
[0565] Ambas as análises - ELISA e Western blot - são de natureza qualitativa e não servem como determinações da concentração de proteínas.
c. Análise Western blot do sobrenadante (amostras de IVT- mRNA)
[0566] O sobrenadante coletado 48 h após transfecção foi separado por SDS-PAGE, seguido de análise Western blot, conforme descrito no Exemplo 32b. Conforme mostra na Figura 37C, no.25 e 6RHU3 traduzido a partir de IVT-mRNA e secretados no sobrenadante foram detectados através de sua His-tag. Com isto, a produção e secreção de 6RHU3, bem como no.25, o qual foi usado como controle de especificidade bi-scFv, puderam ser comprovadas.
Exemplo 33: Detecção de proteína bi-scFv específica para CLDN6 funcional e traduzida in vivo após injeção intramuscular de RNA
[0567] Camundongos NSG fêmeas e machos com idade de 8-16 semanas foram selecionados e distribuídos em 4 grupos de 5 camundongos. 40 μl de solução de RNA foram injetados por camundongo no músculo femoral. 40 μl de solução de RNA consistia em 1x PBS, 5 μg de IVT-mRNA de 6RHU3 D2-capped ou replicon, 2 μg de IVT-mRNA de luciferase D1-capped e 0 ou 15 μg de IVT-mRNA de EBK D1-capped. O IVT-mRNA de EBK que codifica as proteínas do vírus da varíola E3L, B18R e K3L (EBK) foi coinjetado para inibir a resposta de IFN e neutralizar a ativação de PKR para fins de melhora da tradução de RNA (Pedido de Patente PCT/EP2012/04673). O sinal da luciferase foi monitorado 24 horas após injeção com um Xenogen IVIS 2000 para excluir camundongos sem sinal das coletas de amostras.
[0568] O sangue foi coletado 7 dias após injeção. O soro foi coletado e subsequentemente congelado a -80 °C. Ensaio Cytotox
[0569] Soro de camundongos NSG foram analisados em um ensaio Cytotox in vitro. Células alvo PA-1 transduzidas estavelmente com luciferase de vaga-lume e expressando endogenamente CLDN6 foram cultivadas com células T humanas (isoladas conforme descrito no Exemplo 16) em uma proporção E:T de 30:1 para sensibilidade máxima. O meio de ensaio consistia em RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% termicamente inativado, penicilina-estreptomicina a 0,5%, 1x NEAA e piruvato de sódio a 1 mM (Gibco/Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha). 20 μl de soro de teste descongelado foram adicionados por amostra de teste também. Cavidades de controle padrão com proteína 6PHU3 e cavidades para Lmin e Lmax foram completadas com 20 μl de soro de camundongos NSG não tratados. O volume final por cavidade foi de 100 μl. Lmin foi cultivada doze vezes, Lmax seis vezes e amostras de teste em triplicata. Após 48 h de incubação a 37 °C, 5% de CO2, cavidades para Lmax foram misturadas com 10 μl de solução de Triton X-100 a 2% e incubadas durante 10 min. Para todas as outras cavidades, foram adicionados 10 μl de meio de ensaio. 50 μl de solução de luciferina (vide Exemplo 23) foram adicionados e as placas foram medidas - após uma etapa de incubação de 30 min a 37 °C no escuro - em um leitor de microplacas Infinite M200 (TECAN, Mannedorf, Suíça). Cálculo de lise específica de células alvo foi realizada conforme descrito no Exemplo 23.
[0570] Na Figura 38, a percentagem de lise específica é representada. Efeitos citotóxicos significativos foram detectados em cada grupo. A concentração de proteína bi-scFv específica para CLDN6 foi significativamente aumentada pela coinjeção de EBK no caso de IVT-mRNA de 6RHU3.
[0571] Estes dados comprovam a tradução in vivo de 6RHU3 a partir de IVT-mRNA ou -replicon e a secreção na corrente sanguínea após injeção intramuscular.
Exemplo 34: Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN18.2 ou CLDN6 e CD3
[0572] No desenvolvimento adicional de fragmentos de anticorpo bi-scFv anti-CLDN18.2 e anti-CLDN6 específicos, diferentes aspectos para uma otimização da proteína original foram abordados. Estes aspectos se referem, principalmente, à obtenção de preparados com maior homogeneidade em relação a diferentes espécies de dobramento, isômeros de dissulfureto e oligômeros que poderiam ser formar quando de produção de proteína recombinante. Estas modificações não deverão ser prejudiciais para a atividade funcional das proteínas bi- scFv.
Substituição do resíduo de cisteína extra (não emparelhado) no domínio de ligação anti-CD3 das proteínas bi-scFv
[0573] De modo a investigar se os resíduos de cisteína não emparelhados que ocorrem dentro da sequência primária de um domínio de Ig poderiam ou não interferir com a formação correta das ligações de dissulfureto intracadeia e/ou intercadeia, as quais são essenciais para dobramento correto e estabilidade do fragmento de anticorpo resultante, várias construções sintéticas foram geradas. Tais cisteínas desemparelhadas podem comprometer a eficácia, homogeneidade, produtividade e estabilidade do produto de proteína final e devem, portanto, ser evitadas. Além do conjunto "padrão" de cisteínas envolvidas no emparelhamento de dissulfureto, resíduos de cisteína livres podem estar presentes nos domínios variáveis.
[0574] Por exemplo, no domínio VH do anticorpo OKT3, três resíduos antes do início de CDR-H3, uma cisteína conservada na posição H92 está presente e forma uma ligação de dissulfureto estrutural com a posição H22. Mas, nesta molécula, na posição H100A (CDR-H3), outra cisteína (Cys) pode permitir dobramento errôneo, onde H100A, em vez de H92, está envolvida na formação da ligação de dissulfureto com H22, deste modo, gerando um produto erroneamente dobrado, insolúvel e não funcional. Para superar este possível emparelhamento errôneo dos resíduos de cisteína, substituição sítio-dirigida da cisteína livre foi realizada (Kipriyanov, Protein Engineering 10: 445-453, 1997). Através desta única substituição, foi conseguido um aumento significativo de produtividade e estabilidade da scFv derivada a partir de OKT3, mantendo a atividade de ligação global.
[0575] O domínio VH do anticorpo anti-CD3 TR66 (SEQ ID NO: 36) usado no presente estudo contém uma cisteína livre na posição H103 da sequência primária, conforme mostrado em SEQ ID NO: 36. Comparação de sequência do domínio VH do anticorpo anti-CD3 TR66 (SEQ ID NO: 36) com o domínio VH do anticorpo anti-CD3 OKT3 mostra 96,6% de homologia de sequência.
[0576] A partir destes resultados, uma substituição da cisteína livre por um resíduo de serina dentro da CDR-H3 do diminuição VH do anticorpo anti-CD3 TR66 foi realizada para as proteínas bi-scFv que objetivam CD3 (SEQ ID NO: 94) e para CLDN18.2 ou CLDN6. A introdução de tais substituições resulta na concepção das proteínas bi-scFv 1- BiMAB-S (SEQ ID NO: 103) e 6-PHU3-S (SEQ ID NO: 101) (vide Tabelas 11 e 12, respectivamente).
Substituição dos resíduos de cisteína extras (desemparelhados) nas proteínas bi-scFv anti-CLDN6
[0577] O anticorpo anti-CLDN6 mCLDN6ab precursor, cujos domínios variáveis foram usados para montagem das proteínas bi-scFv 6PHU3 (SEQ ID NO: 45) e 6PHU5 (SEQ ID NO: 43) correspondentes, contém um resíduo de cisteína não emparelhado dentro da região de flanqueamento da CDR-L2 do domínio VL na posição 46 da sequência primária correspondente. Isto corresponde à posição 45 dentro de SEQ ID NO: 23, onde o primeiro aminoácido da VL foi omitido. Diferentes substituições foram realizadas para substituir esta cisteína livre por: • um resíduo de serina em analogia à substituição no domínio VH do anticorpo anti-CD3, TR66 (SEQ ID NO: 100); • um resíduo de leucina através de comparação com a sequência de aminoácidos de outros anticorpos anti-CLDN6 (SEQ ID NO: 97 e 98); • um resíduo de triptofano através de comparação com a sequência de aminoácidos com o banco de dados de linhagem germinativa (SEQ ID NO: 99).
Avaliação de comprimento de ligante, ordem de V-domínios e interface de pontes de dissulfureto artificiais em proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2
[0578] Como outro exemplo, Arndt et al. (Biochemistry 37: 12918-12926, 1998) descrevem a assim denominada troca de domínio como uma possível explicação para o aparecimento de oligômeros não covalentemente ligados de fragmentos de scFv. De acordo com este modelo, o estado da proteína está sujeito a um possível equilíbrio termodinâmico entre uma forma monomérica e uma forma dimérica/oligomérica em virtude de uma troca intra- e inter-molecular que ocorre constantemente dos contatos de interface VL/VH. Estes oligômeros já podem estar presentes no sobrenadante da cultura de células e devem ser eliminados durante o processo de purificação. No entanto, estas espécies moleculares também poderiam ser formadas durante armazenamento das espécies monoméricas purificadas.
[0579] O estado energético preferido da proteína é fortemente influenciado por sua concepção global (sequência primária, comprimento de ligante, orientação VL/VH, etc.).
[0580] Worn e Plückthun (JMB 305:989-1010, 1999) citaram que formas com maior teor de espécies monoméricas podem ser obtidas mediante uso de um ligante de 20 ou mais resíduos.. Desplancq et al. (Protein Eng. 7: 1027-1033, 1994) indicaram que a orientação do domínio variável também poderia ter um impacto sobre a formação de dímeros e formas de elevado peso molecular. Na mesma publicação, Desplancq mostrou que um ligante de 25 ou 30 aminoácidos (aa) forneceu a melhor proporção de monômeros em relação aos dímeros para seu anticorpo particular. A distância entre a extremidade C-terminal da VL e a extremidade N-terminal da VH é de cerca de 39-43 Â e a distância entre a extremidade C-terminal da VH e a extremidade N-terminal da VL é de 3234 Â (Plückthun et al., From PCR to Fermentation. (J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, & D. J. Chriswell, Eds.) em (IRL Press., páginas 203-252, 1996). Para obter propriedades moleculares similares, um ligante para a orientação VL-VH tem de ser maior do que um ligante de VH- VL. Plückthun et al. (From PCR to Fermentation. (J. McCafferty, H. R. Hoogenboom, & D. J. Chriswell, Eds.) em (IRL Press., páginas 203-252, 1996) recomendaram o uso de ligantes com um comprimento de 15 ou 20 aminoácidos na orientação VH/VL e ligantes com um comprimento de 20 ou 25 aminoácidos na orientação VL/VH.
[0581] Outra possibilidade para forçar a formação de monômeros e estabilizar a interação do domínio VH/VL é manipular uma interface de ligação de dissulfureto na superfície de contato entre os dois domínios. A introdução de uma ponte de dissulfureto na posição H44-L100 (numeração de Kabat) tem sido a mais usada em scFvs, com resultados satisfatórios (Brinkmann et al., PNAS. 90: 7538-7542, 1993; Worn e Plückthun, Biochemistry 38: 8739-8750, 1999; Weatherill et al., PEDS. 25: 321-329, 2012). Esta estratégia tem sido usada com sucesso para estabilizar anticorpos biespecíficos de tipo IgG que combinam scFv fundida à IgG de comprimento completo (Michaelson et al., mAbs 1: 128-141, 2009; Schanzer et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 55: 2369-2378, 2011).
[0582] Weatherill et al. (PEDS 25: 321-239, 2012) estabilizaram scFvs humanas (VH-(G4S)4-VL e VL-(G4S)4-VH) com uma ligação de dissulfureto entre as posições VH44 e VL-100. Além disso, esta publicação resolve o problema da possível troca de domínio com scFv que não contém nenhuma interface de ligação de dissulfureto ao realizar diferentes experimentos de SE-HPLC em diferentes volumes de carga e concentração. Os ensaios deram origem a resultados diferentes, dependendo das condições de carregamento da amostra para a scFv não estabilizada mas, independente das condições usadas, as moléculas estabilizadas com dissulfureto eluíram como um monômero. Zhao et al. (Int. J. Mol Sci. 12: 1-11, 2011) introduziram a mesma mutação em uma scFv e observaram maior estabilidade da molécula estabilizada após armazenamento durante 20 h a 37 °C.
[0583] Para o formato biespecífico usando scFv fundida à IgG de comprimento completo, Schanzer et al. (Antimicrob. Agents Chemother. 55:2369-2378 2011) compararam o efeito do comprimento do ligante e da interface de ligação de dissulfureto. Eles fundiram a scFv precursora ou scdFv (VH-(G4S)3-VL) na parte C- ou N- terminal das cadeias pesada ou leve. Para ligantes de comprimentos diferentes (20, 25 e 30 aminoácidos), a scFv precursora foi fundida à parte C-terminal de qualquer uma das cadeias leve ou pesada. Os resultados obtidos com os diferentes comprimentos de ligante identificaram o peptídeo de 30 aa como o ligante mais preferido para a produção de monômeros estáveis. O nível de agregados após 7 dias de armazenamento a 40 °C foi de 50% para scFv15, 18% para scFv20, 8% para scFv25 e 6% para scFv30. Mas o dissulfureto scFv15 estabilizado com a interface de ligação de dissulfureto foi ligeiramente superior ao scFv30. A mesma abordagem foi usada por Michaelson et al. (mAbs, 1: 128-141 2009) e eles melhoraram seu anticorpo biespecífico de tipo IgG precursor contendo scFv com um ligante de 15 aa na orientação VH/VL (gerando 40% de agregados) ao aumentar o comprimento do ligante para 20 aa do scFv e introduzir a interface de ligação de dissulfureto entre as posições VH44 e VL-100. A molécula resultante produziu mais de 98% de monômeros que eram estáveis após três meses de armazenamento a 4 °C. Os autores tomaram a decisão de trabalhar na melhora da molécula de scFv antes de ir para o formato biespecífico.
[0584] No caso das proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 específicas, não se sabia se a formação de dímeros e formas de elevado peso molecular poderiam ocorrer e qual é a implicação sobre as moléculas scFv anti-Claudina e/ou anti- CD3. De modo a avaliar uma molécula global ideal para a proteína bi-scFv anti-CLDN18.2 específica para cada scFv distinto, as seguintes modificações foram avaliadas: • orientação de domínio • comprimento de ligante • introdução de uma interface de ligação de dissulfureto • combinação das três modificações
[0585] Para o domínio de ligação anti-Claudina 18.2, além dos domínios variáveis derivados de mCLDN18.2ab (VH: SEQ ID NO: 8; VL: SEQ ID NO: 15), as sequências derivadas de mCLDN18.2ab1 (VH: SEQ ID NO: 6; VL: SEQ ID NO: 11) foram usadas para construção das proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 específicas.
[0586] A Tabela 11 na seção A.a "Origem de sequência, concepção de 32 construções bi-scFv anti- CLDN18.2 específicos e clonagem em vetores de expressão" descreve as diferentes construções.
A. Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN18.2 e CD3 a. Origem de sequência, concepção de 32 construções bi-scFv anti-CLDN18.2 específicos e clonagem em vetores de expressão
[0587] As construções bi-scFv de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos apresentados aqui contêm dois domínios de ligação diferentes, dos quais o primeiro é específico para um antígeno associado a tumor (TAA) humano, enquanto que o outro é específico para a cadeia ε do receptor de células T humano (CD3). Cada um dos dois domínios de ligação da molécula biespecífica compreende dois domínios variáveis de anticorpo, arranjados como uma porção scFv na orientação VH-VL ou VL-VH. Os domínios variáveis de anticorpo são conectados através de um ligante peptídico flexível de glicina-serina que consiste em quatro ou cinco repetições de uma subunidade G4S, dependendo da orientação. Assim, as porções scFv arranjadas na orientação VH-VL são conectadas por um ligante de 20 aminoácidos (denominado "LL4"), a VL-VH está conectada por um ligante de 25 aminoácidos (denominado "LL5"). As duas porções scFv, por outro lado, estão conectadas através de um ligante SG4S de seis aminoácidos de comprimento (denominado "SL"). A informação sobre sequência de origem de anticorpos monoclonais (mAb) e organização de domínios é resumida na Tabela 11.
[0588] As variantes 5504, 5505, 5506, 5507, 5512, 5513, 5514, 5515, 5520, 5521, 5522, 5523, 5528, 5529, 5530, 5531, 5536, 5537, 5538, 5539, 5544, 5545, 5546, 5547, 5552,5553, 5554, 5555, 5560, 5561, 5562 e 5563 compreendem a VH anti-CD3 com SEQ ID NO: 95 e a VL anti-CD3 com SEQ ID NO: 96.
[0589] No caso particular de 1-BiMAB-S, apenas a substituição da cisteína livre por uma serina na VH anti- CD3 (SEQ ID NO: 94) é feita comparado com a sequência de aminoácidos da sequência de 1-BiMAB (SEQ ID NO: 39). Deverá ser notado que SEQ ID NO: 39 ainda contém a sequência de aminoácidos de uma sequência sinalizadora N-terminal que media a secreção da proteína bi-scFv 1-BiMAB no sobrenadante da cultura de células após expressão em mamíferos. Esta sequência sinalizadora não faz parte da proteína recombinante secretada, uma vez que ela é clivada por uma peptidase sinalizadora no lúmen do retículo endoplasmático.
[0590] Os genes que codificam as construções bi- scFv foram gerados por meio de síntese gênica GeneArt® (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) usando o software GeneOptimizer® para otimizar o uso de códons para expressão em células CHO. Além de um sinal de secreção em comum, todas as construções de DNA contêm a mesma sequência de Kozak e um sítio de restrição HindIII na extremidade 5'. Na extremidade 3', os sítios de reconhecimento BsiWI e XhoI foram adicionados para permitir subclonagem flexível em diferentes vetores de expressão. Subclonagem no vetor pCEP4 de escolha (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha), foi realizada usando técnicas convencionais empregando os sítios de restrição HindIII e XhoHI.Tabela 11: Resumo das construções bi-scFv anti-CLDN18.2
[0591] Deverá ser notado que SEQ ID NOs: 66-93 ainda contêm a sequência de aminoácidos de uma sequência sinalizadora N-terminal que media a secreção da proteína bi-scFv 1-BiMAB no sobrenadante da cultura de células após expressão em mamíferos. Esta sequência sinalizadora não faz parte da proteína recombinante secretada, uma vez que ela é clivada por uma peptidase sinalizadora no lúmen do retículo endoplasmático.
b. Produção e purificação de 32 proteínas bi-scFv anti CLDN18.2 específicas por transfecção transitória
[0592] Células CHO adaptadas em suspensão foram subcultivadas em meio isento de soro em um agitador umidificado com CO2. Um dia antes da transfecção, as células foram cultivadas em meio isento de soro em frascos de agitação. No dia da transfecção, as células foram centrifugadas (5 minutos a 200 x g) e novamente suspensas em meio DMEM fresco (Invitrogen, 41965-039) em frascos de agitação. Reagente de transfecção e DNA foram adicionados às células e misturados suavemente por agitação. Após incubação estática em uma incubadora de CO2, as células foram diluídas com meio de crescimento isento de soro e depois cultivadas para expressão em um agitador de incubação. As células foram alimentadas, de acordo com os requisitos nutricionais, com CHO CD EfficientFeed™ C (Invitrogen, A13275). Proteínas bi-scFv foram coletadas após a viabilidade das células começar a diminuir. As construções de anticorpo foram purificadas por Capto L Sepharose. A concentração de proteína foi determinada pela absorbância a 280 nm.
c. Ensaio de citotoxicidade de luciferase com 32 proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 específicas
[0593] Para o rastreio funcional de 32 proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 específicas, quatro titulações pontuais (5000, 1000, 200 e 40 ng/ml) foram testadas em um ensaio de citotoxicidade de luciferase in vitro, conforme descrito no Exemplo 2.c.
[0594] Células NugC4 que expressam luciferase estavelmente descritas no Exemplo 2.c foram incubadas com células T humanas e proteínas bi-scFv ou sem proteína bi- scFv para determinar os valores de Lmin. A luminescência de células viáveis foi medida com um leitor de placas Infinite M200 Tecan 24h e 48h após configuração do ensaio. Lise específica de células alvo foi calculada pela fórmula exemplificada no Exemplo 2.c.
[0595] Ao realizar uma análise qualitativa dos resultados citotóxicos (Figuras 39 a, b, c e d), com base nos domínios de ligação de TR66 do scFv anti-CD3, a seguinte observação pode ser extraída.
[0596] As proteínas bi-scFv anti-CLDN18.2 específicas de melhor desempenho no ensaio citotóxico de luciferase contêm a porção anti-CD3 na orientação de domínio VH/VL conectado pelo ligante "LL4" com ou sem a ponte de dissulfureto de interface (5504, 5505, 5506, 5507, 5536, 5537, 5538, 5539, 5512, 5513, 5514, 5515, 5544, 5545, 5546, 5547; Figuras 39 a e b). Uma atividade citotóxica menor é obtida com as variantes contendo a porção anti-CD3 na orientação de domínio VL/VH com o ligante peptídico "LL5" e contendo a ponte de dissulfureto de interface (5528, 5529, 5530, 5531, 5560, 5561, 5562, 5563; Figura 39d). A menor atividade citotóxica é obtida com a variante contendo a porção anti-CD3 na orientação de domínio VL/VH com o ligante peptídico "LL5" sem ponte de dissulfureto de interface (5520, 5521, 5522, 5523, 5552, 5553, 5554, 5555; Figura 39c).
B. Geração e testagem de agentes de ligação biespecíficos que objetivam CLDN6 e CD3 a. Concepção de sequência de origem de construções bi- scFv e clonagem em vetores de expressão
[0597] As construções de anticorpo com uma única cadeia biespecíficos bi-scFv apresentados aqui contêm dois domínios de ligação diferentes, dos quais um é específico para um antígeno associado a tumor (TAA) humano, enquanto que o outro é específico para a cadeia ε do receptor de células T humano (CD3). Cada um dos dois domínios de ligação da molécula biespecífica compreende dois domínios variáveis de anticorpo, arranjados como uma porção scFv na orientação VH-VL ou VL-VH. Os domínios variáveis de anticorpo são ligados através de um ligante peptídico flexível de glicina-serina. As porções scFv que objetivam o TAA estão arranjadas na orientação VH-VL e são conectadas por um ligante de 15 aminoácidos (denominado "LL3") que consiste em três repetições idênticas de uma subunidade G4S. As porções scFv que objetivam CD3 também estão arranjadas na orientação VH-VL, mas estão conectadas por um ligante de 18 aminoácidos (denominado LLv1) com a sequência G4S(G2S)3G3S. As duas porções scFv, por outro lado, estão conectadas através de um ligante SG4S de seis aminoácidos de comprimento (denominado "SL"). A informação sobre origem de sequência de anticorpos monoclonais (mAb) e organização de domínios está resumida na Tabela 12. As variantes 5454, 5456, 5458, 5460, 5462 e 5464 compreendem, para o domínio de ligação a anti-CD3, a VH anti-CD3 com SEQ ID NO: 95 e a VL anti-CD3 com SEQ ID NO: 96. As variantes 5454 e 5458 compreendem a VL anti-CLDN6 com SEQ ID NO: 98; as variantes 5456 e 5460 compreendem a VL anti-CLDN6 com SEQ ID NO: 99; as variantes 5462 e 5464 compreendem a VL anti-CLDN6 com SEQ ID NO: 100.
[0598] No caso particular da 6PHU3-S (SEQ ID NO: 101), apenas a substituição da cisteína livre por um resíduo de serina na VH anti-CD3 (SEQ ID NO: 94) é feita comparado com a sequência de aminoácidos da sequência de 6- PHU3 (SEQ ID NO: 45). Deverá ser notado que SEQ ID NO: 45 ainda contém a sequência de aminoácidos de uma sequência sinalizadora N-terminal que media a secreção da proteína bi-scFv 6-UBS-3 no sobrenadante da cultura de células após expressão em mamíferos. Esta sequência sinalizadora não faz parte da proteína recombinante secretada, uma vez que ela é clivada por uma peptidase sinalizadora no lúmen do retículo endoplasmático. Além disso, para 6PHU3-SL (SEQ ID NO: 102), substituição da cisteína livre por um resíduo de leucina na VL anti-CLDN6 (SEQ ID NO: 97) na posição 46 da sequência principal correspondente é realizada comparado com a sequência de aminoácidos de 6PHU3-S. Isto corresponde à posição 45 em SEQ ID NO: 23, onde o primeiro aminoácido da VL foi omitido.
[0599] Os genes que codificam as construções bi- scFv foram geradas por meio de síntese gênica GeneArt® (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Alemanha) usando o software GeneOptimizer® para otimizar o uso de códons para expressão em células CHO. Além de um sinal de secreção em comum, todas as construções de DNA contêm a mesma sequência de Kozak e um sítio de restrição HindIII na extremidade 5'.Na extremidade 3', os sítios de reconhecimento BsiWI e XhoI foram adicionados para permitir subclonagem flexível em diferentes vetores de expressão. Subclonagem no vetor de expressão escolha, pEE12.4 (Lonza Group Ltda., Basileia, Suíça), foi realizada usando técnicas convencionais empregando os sítios de restrição HindIII e BsiWI.Tabela 12: Resumo das construções bi-scFv anti-CLDN6
b. Produção e purificação de 6 proteínas bi-scFv anti-CLDN6 específicas por meio de transfecção transitória
[0600] Células CHO adaptadas em suspensão foram subcultivadas em meio isento de soro em um agitador umidificado com CO2. Um dia antes da transfecção, as células foram cultivadas em meio isento de soro em frascos de agitação. No dia da transfecção, as células foram centrifugadas (5 minutos a 200 x g) e novamente suspensas em meio DMEM fresco (Invitrogen, 41965-039) em frascos de agitação. Reagente de transfecção e DNA foram adicionados às células e misturados suavemente por agitação. Após incubação estática em uma incubadora de CO2, as células foram diluídas com meio de crescimento isento de soro e depois cultivadas para expressão em um agitador de incubação. As células foram alimentadas, de acordo com os requisitos nutricionais, com CHO CD EfficientFeed™ C (Invitrogen, A13275). Proteínas bi-scFv foram coletadas após a viabilidade das células começar a diminuir. As construções de anticorpo foram purificadas por meio de FPLC usando Capto L Sepharose. A concentração de proteína foi determinada pela absorbância a 280 nm.
c. Determinação de EC50 de 6 proteínas bi-scFv anti-CLDN6 específicas
[0601] Para determinação de metade da dose eficaz máxima de proteínas bi-scFv anti-CLDN6 específicas, uma série de titulações de proteínas bi-scFv foi testada em um ensaio citotóxico de luciferase in vitro, conforme descrito no Exemplo 13.
[0602] Células PA-1 que expressam estavelmente luciferase e células T humanas em uma proporção E:T de 5:1 foram incubadas com concentrações de proteína bi-scFv dentro da faixa de 2,5 pg/ml a 5 μg/ml (em etapas de 10) ou sem proteínas bi-scFv anti-CLDN6 específicas para determinar os valores de Lmin.
[0603] Três ensaios independentes foram realizados com diferentes doadores humanos para preparo das células T humanas. Os resultados são ilustrados na Figura 40.
[0604] Ao realizar uma comparação quantitativa dos resultados citotóxicos com base na substituição dos resíduos de cisteína dentro da região de flanqueamento da CDR-L2 por uma serina, leucina ou triptofano, e sobre a posição do domínio de ligação a anti-CLDN6 e anti-CD3, a seguinte observação pode ser extraída.
[0605] As proteínas bi-scFv anti-CLDN6 específicas de melhor desempenho no ensaio citotóxico de luciferase contêm a substituição de cisteína para triptofano com o domínio de ligação anti-CLDN6 na parte N-terminal da proteína bi-scFv (variante 5456). Uma atividade citotóxica ligeiramente menor é obtida com as variantes contendo a proteína anti-CLDN6 na parte C-terminal ou com a substituição de cisteína por um triptofano (variante 5460) ou uma serina (variante 5464). Para as variantes contendo a substituição de cisteína por uma leucina com anti-CLDN6 na parte N-terminal (variante 5454) ou na parte C-terminal (variante 5458) das proteínas bi-scFv, menor atividade citotóxica é medida comparado com as variantes precedentes. Surpreendentemente, a variante contendo a substituição de cisteína por uma serina com anti-CLDN6 na parte N-terminal (variante 5462) da proteína bi-scFv tem a menor atividade citotóxica.

Claims (17)

1. Agente de ligação que compreende pelo menos dois domínios de ligação caracterizado pelo fato de que um primeiro domínio de ligação se liga à claudina (CLDN) e um segundo domínio de ligação se liga à CD3, em que o agente de ligação compreende um domínio variável de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina (VH) com uma especificidade por um antígeno claudina (VH(CLDN)), um domínio variável de uma cadeia leve de uma imunoglobulina (VL) com uma especificidade por um antígeno claudina (VL(CLDN)), um domínio variável de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina (VH) com uma especificidade por CD3 (VH(CD3)) e um domínio variável de uma cadeia leve de uma imunoglobulina (VL) com uma especificidade por CD3 (VL(CD3)), em que (i) a CLDN é CLDN6 e a referida VH(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas sequências de aminoácidos representada pelas SEQ ID NO: 20, 22, 24 e 26 e a VL(CLDN) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em uma sequência de amino ácidos representada pelas SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 28 e 29, e (ii) a VH(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36 e 95, e a VL(CD3) compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37 e 96, em que os referidos domínios variáveis podem compreender entre 1 a 5 substituições de aminoácidos.
2. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação é uma molécula biespecífica.
3. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a molécula biespecífica é um anticorpo biespecífico.
4. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico com uma única cadeia.
5. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a ligação do referido agente de ligação à CD3 nas células T resulta em proliferação e/ou ativação das referidas células T, em que as referidas células T ativadas liberam fatores citotóxicos e iniciam a citólise e apoptose de células cancerosas.
6. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação está no formato de um anticorpo de comprimento total, um fragmento de anticorpo ou um diacorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada conectado a um domínio variável da cadeia leve na mesma cadeia polipeptídica, de modo que os dois domínios não emparelham.
7. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o diacorpo compreende duas cadeias polipeptídicas em que um polipeptídeo compreende VH(CLDN) e VL(CD3) e a outra cadeia polipeptídica compreende VH(CD3) e VL(CLDN).
8. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação está no formato de um anticorpo biespecífico com uma única cadeia que consiste em duas moléculas de scFv ligadas através de um peptídeo ligante.
9. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e os domínios variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes estão dispostas, do N-terminal para o C-terminal, na ordem VH(CLDN)-VL(CLDN)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CLDN)-VL(CLDN) ou VH(CD3)-VL(CD3)- VL(CLDN)-VH(CLDN).
10. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os referidos domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e os domínios variáveis de cadeia leve (VL) correspondentes são ligadas através de um ligante peptídico longo que compreende as sequências de aminoácidos (GGGGS)3 ou VE(GGGGS)2GGVD.
11. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 e 10, caracterizado pelo fato de que as referidas duas unidades VH-VL ou VL-VH do scFv são ligadas através de um ligante peptídico curto que compreende a sequência de aminoácidos SGGGGS ou GGGGS.
12. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 42, 43, 44 e 45 ou variante da mesma.
13. Agente de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação tem um sinal de secreção N-terminal, um domínio constante C-terminal de IgG e/ou um marcador epítopo de seis histidinas C-terminal.
14. Célula hospedeira microbiana caracterizada pelo fato de que compreende o agente de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. Uso de um agente de ligação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou de uma célula hospedeira, como definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de câncer que se caracteriza por células que expressam CLDN6.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de bexiga urinária, câncer de ovário, em particular adenocarcinoma de ovário e teratocarcinoma de ovário, câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) e câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular carcinoma de células escamosas de pulmão e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer de pâncreas, câncer de pele, em particular carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer de ducto biliar, câncer de bexiga urinária, em particular carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer renal, em particular carcinoma de células renais incluindo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma de células renais papilares, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo câncer de íleo, em particular adenocarcinoma de intestino delgado e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumores de células germinativas, como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular tumores de células germinativas do testículo e as formas metastáticas dos mesmos.
17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o agente de ligação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou a célula hospedeira como definida na reivindicação 14.
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