UA113273C2 - ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ І ЕКСПРЕСУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Da, І ДНК, ЩО КОДУЄ І ЕКСПРЕСУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Fa, ДЛЯ БОРОТЬБИ З СОВКОЮ ТРАВ'ЯНОЮ - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується трансгенних рослин, які містять ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Cry1Da, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Cry1Fa. Вказані білки не конкурують один з одним за зв’язування з кишковими рецепторами совки трав’яної (FAW). Даний винахід також описує способи боротьби з лускокрилим шкідникомВказані способи дозволяють сповільнювати або попереджати вироблення резистентності у вказаної комахи до цих білків.

Description

(54) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ І ЕКСПРЕСУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК

СтгуїОа, І ДНК, ЩО КОДУЄ І ЕКСПРЕСУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙИ БІЛОК Стуїга, ДЛЯ БОРОТЬБИ З

СсОВвКОЮюЮ ТРАВ'ЯНОЮ (57) Реферат:

Даний винахід стосується трансгенних рослин, які містять ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сту1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок СтуїРа. Вказані білки не конкурують один з одним за зв'язування з кишковими рецепторами совки трав'яної (ГАУМ). Даний винахід також описує способи боротьби з лускокрилим шкідником Зродоріега їгидірегда. Вказані способи дозволяють сповільнювати або попереджати вироблення резистентності у вказаної комахи до цих білків.

Попередній рівень техніки

Людина вирощує кукурудзу для вживання в їжу і для енергетичних цілей. Людина також вирощує множину інших культур, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини, і тим самим наносять збиток діяльності людини. Для боротьби з комахами-шкідниками щорічно витрачаються мільярди доларів, і ще мільярди йдуть на відшкодування збитку, що наноситься цими шкідниками. Інсектициди, синтезовані методами органічної хімії, Є головним інструментом, що використовується для боротьби з комахами-шкідниками, але в деяких регіонах, в боротьбі з комахами-шкідниками важливу роль грають біологічні інсектициди, такі як інсектицидні білки, що відбуваються від Васійи5 (пигіпдіепбіє (ВО. Можливість культивувати резистентні до комах рослини за допомогою трансформації цих рослин генами інсектицидних білків ВІ була революцією в сучасному сільському господарстві і довела важливість і цінність інсектицидних білків і їх генів.

Деякі білки Ві були використані для створення резистентних до комах трансгенних рослин, які успішно пройшли випробування, і в цей час їх виготовляють в промисловому масштабі.

Такими білками є СгутАБ, СтгутАс, Стуї1Е і СтузВьЬ, що вводяться в кукурудзу, Стуї1Ас і Сту2АБ, що вводяться в бавовник, і СтуЗзА, що вводиться в картоплю.

Комерційно доступні продукти, експресуючі ці білки, експресують тільки один з цих білків, за винятком випадків, коли бажано отримати комбінований інсектицидний спектр з 2 білків (наприклад, в кукурудзі, СтутАб ії СтуЗзВЬ об'єднані для вироблення резистентності до лускокрилих шкідників і кореневих личинок, відповідно), або випадків, коли незалежна дія цих білків робить їх цінним інструментом для сповільнення розвитку резистентності до інсектицидів у сприйнятливих популяцій комах (наприклад, СтуїТАс і Сту2АБ в бавовнику об'єднують з метою вироблення у рослин резистентності до тютюнової листовійки).

Тобто, деякі сорти резистентних до комах трансгенних рослин, які швидко і повсюдно пристосовуються до цієї технології, також мають той недолік, що популяції шкідників виробляють резистентність до інсектицидних білків, що продукується цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження цінних ознак резистентності до Ві-комах, де вказані стратегії включають використання високих доз білків в комбінації із збереженням площ "сховищ" нетрансгенних рослин, і чергування або спільного використання різних токсинів

Зо (МесСацонеу єї а!І(1998), "ВІ-Везізтапсе Мападетепі" Майте Віоїтеснпої. 16: 144-146).

Необхідно, щоб білки, відібрані для використання в ІКМ-кластерах, мали незалежну інсектицидну дію, при якій резистентність, що виробляється до одного білка, не розповсюджувалася на інший білок (тобто, не спостерігалася перехресна резистентність до білків). Так, наприклад, якщо популяція комах, вибраних на резистентність до "білка А", є сприйнятливою до "білка В", то можна зробити висновок, що в цьому випадку перехресна резистентність відсутня, і комбінація "білок А і біллк В" буде ефективною для сповільнення вироблення резистентності до одного білка А.

У випадку за відсутності популяції резистентних комах, оцінка може бути зроблена виходячи з інших характеристик, які, як передбачається, стосуються механізму дії і можливої перехресної резистентності. Було висловлене припущення, що застосування опосередкованого рецептором зв'язування при ідентифікації інсектицидних білків, очевидно, не буде приводити до вироблення перехресної резистентності. (мап МейПаег еї аі. 1999). Ключовим прогностичним фактором відсутності перехресної резистентності, що з'являється при такому підході, є те, що інсектицидні білки не конкурують за зв'язування з рецепторами у сприйнятливих видів комах.

У випадку, коли два токсини ВІ конкурують за зв'язування з одним і тим же рецептором, і якщо цей рецептор мутує у комахи так, що один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором, а тому не має інсектицидної дії проти комахи, то така комаха може набувати резистентності до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). Тобто, можна сказати, що така комаха буде мати перехресну резистентність до обох токсинів ВІ.

Однак, якщо два токсини зв'язуються з двома різними рецепторами, то це означає, що така комаха не має одночасної резистентності до цих двох токсинів.

СтуїРа може бути використаний для боротьби з лускокрилими шкідниками багатьох видів, включаючи Європейського кукурудзяного трача (ЕСВ; О5ігіпіа пибіїаіі5 (Нибпег)) і совку трав'яну (ЕАМУ; бродорієга Пидірегда), і має активність проти бурякового трача (ЗСВ; Оіаїгаєа засопагаїї5). Білок Стуїба, що продукується в рослинах кукурудзи, які містять модифікацію

ТС1507, відповідальний за вироблення ознаки резистентності до комах, і цей білок застосовується у провідних галузях промисловості для боротьби з совкою трав'яною (БАМ).

СтгуїРа також використовується в продуктах НегсцехФб, Зтапеїах м і ууідевігіке "М,

Можливість провести дослідження на зв'язування з рецептором (конкурентне або бо гомологічне) з використанням білка Сту!Ра має певні обмеження, оскільки при застосуванні більшості методів мічення білків для детектування в аналізах на зв'язування з рецептором відбувається інактивація інсектицидної активності білка Стуї1 Га.

Додаткові токсини Стгу перераховані На мжер-сайті офісу Комітету по номенклатурі В.Ї. (СтісКтоге еї аї; ІШМезсі.зиз5зех.ас.ик/поте/Меї! СтісКктоге/ВІ). Див. Додаток А в даній заявці. У цей час відомо приблизно 60 основних груп токсинів "Стгу" (Сту1-Стгу59), і крім того, існують інші токсини, такі як токсини Суї і токсини МІР і т. п. Багато токсинів з кожної пронумерованої групи мають підгрупи, позначені великими буквами, а підгрупи, позначені великими буквами, в свою чергу, поділяються на підгрупи (суб-підгрупи), позначені малими буквами (наприклад, Сгту! має підгрупу А-Ї,, а СтуТА має підгрупу а-і).

Короткий опис суті винаходу

Даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що популяція трав'яної совки (Зродорієега їидірегаа; ЕАММ), відібрана на резистентність до інсектицидної активності білка Сгу!Ра, не є резистентною до інсектицидної активності білка СтуїСа. Для фахівця в даній галузі очевидно, що перевага такого відкриття полягає в тому, що рослини, експресуючі ці два інсектицидні білки або їх інсектицидні частини, можуть бути використані для сповільнення або попередження розвитку резистентності до будь-якого з цих окремо взятих інсектицидних білків.

Даний винахід також підтверджений виявленням того факту, що СтуїБа і СгуїОа не конкурують один з одним за зв'язування з кишковими рецепторами совки трав'яної (ЕАММ).

Даний винахід також стосується, зокрема, трикомпонентних кластерів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини Стуїба і Стгуїра являють собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресну резистентність до двох шкідників - до ЕАМУ і до ЕСВ (Європейського кукурудзяного трача; Оз5ігіпіа пибідаїйів5);

Стгуїба плюс СтгуїОа плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як СгутАб. У деяких переважних варіантах піраміди, вибрані токсини мають три різні механізми дії проти РАМУ. Цими переважними пірамідними комбінаціями з "трьома механізмами дії" є Сту!Ра плюс Стгу1!О плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, яка складається з МірзАб, Сту1С, Сгу1Ве і Стуї1Е. Рослини (ї посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/ген, але ці конкретні трикомпонентні

Зо кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти ЕАММ по трьох механізмах. Це допоможе знизити або взагалі уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. У загальних рисах, даний винахід також стосується застосування трьох інсектицидних білків (в деяких переважних варіантах, білків Сгу), які не конкурують один з одним проти одного шкідника-мішені.

Таким чином, Сту!Оа може бути використаний у вигляді комбінації з З генів для кукурудзи і інших рослин (наприклад, бавовнику і сої). Ген Стуї!Ора може бути введений, наприклад, в продукт СтгуїРа, такий як НегсшехФб, Зтаг5 їах"м ії Ууідез5 ейіке"мМ, Відповідно до цього, використання СтгуїОа може мати важливе значення для зниження тиску відбору на інші промислові білки.

Короткий опис графічного матеріалу

Фігура 1: Пошкодження (середній 96 пошкодження листя ж сер. кв. пом.) сегментів листя кукурудзи, уражених ЕАМУ (сині стовпці) або ггАМУ (пурпурові стовпці). Всі оброблювані зразки, перед яким стоять числа "5163", являють собою сегменти від рослин, трансформованих конструкцією, що містить Сту1Оба. Рослини, в яких не була детектована експресія Сгу1!ба, були розділені на групи, вказані в лівій крайній частині графіка. Рослини, в яких детектувалась експресія Стгу!Оа, були розділені на групи, вказані в центральній частині графіка.

Нетрансгенний (тобто, негативний) контроль вказаний в крайній правій частині графіка і позначений "В104", "Ні" ї "ІбоЇїпе". Комерційно доступна інбредна лінія, що містить СтгуїРа, представлена першим обробленим зразком, вказаним праворуч (позначений "Негсшціех 1") і є тим же самим генетичним фоном, як і нетрансгенний контроль, позначений "Ізоїїпе".

Фігура 2: Конкурування за зв'язування ВВММ 5родорієга ігидірегда з білком, що містить коровий токсин Стгуї1Ра, коровий токсин Сгу1ба і 125І-мічений коровий токсин Сту1ба.

Докладний опис винаходу

Як повідомляється в даний заявці, токсин Стгу!Оа, що продукується в трансгенній кукурудзі (і в інших рослинах наприклад, в бавовнику і сої), виявляє високу ефективність в боротьбі проти совки трав'яної (ГАМУ; 5родорієга ігидірегада), у якої виробляється резистентність до активності

СтгуїРа. Таким чином, даний винахід частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що совка трав'яна, резистентна до дії Сту!Ра, є сприйнятливою (тобто, не має перехресної резистентності) до дії Сту1ба.

Даний винахід також частково оснований на несподіваному виявленні того факту, що токсин

СтгуїОСа є ефективним для захисту рослин (таких як рослини кукурудзи) від ураження Сгу!Ра- резистентної совки трав'яної. Обговорення цього шкідника приводиться, наприклад, в публікації

Табазнпік, РМАБ (2008), мої. 105 по. 49, 19029-19030.

Даний винахід включає застосування токсину Сту!Оа для захисту кукурудзи і інших економічно цінних видів рослин від ураження шкідниками і зниження врожайності, що викликається поїданням цих рослин совкою трав'яною або популяціями совки трав'яної, у яких виробляється резистентність до Стуї1ГЕа.

Даний винахід також стосується кластера ІЕМ, що використовується для попередження або сповільнення розвитку резистентності совки трав'яної до Стуї1Ра і/або Сгу1Бба.

Даний винахід також стосується композицій, що використовуються для боротьби з лускокрилими шкідниками, в клітинах яких продукується білок, що містить коровий токсин

Стгуї Га, і білок, що містить коровий токсин Сгу1Ва.

Даний винахід також стосується хазяїна, трансформованого так, щоб він продукував білок, що містить коровий токсин Стуї!Ра, і білок, що містить коровий токсин Сту!Оа, де вказаним хазяїном є клітина мікроорганізму або рослини. Полінуклеотид СтуїРа, що розглядається, і полінуклеотид Сту!Оа, що розглядається, переважно присутні в генетичній конструкції під контролем промотору, що не є промотором Васійи5 ІПигіпдіепві5 (функціонально приєднані до цьому промотору/містять цей промотор). Полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити звичайно кодони, що зустрічаються в цій рослині, що сприяють підвищенню рівня експресії в рослині.

Даний винахід також стосується способу боротьби з лускокрилими шкідниками, що включає контактування вказаних шкідників або середовища їх проживання з ефективною кількістю композиції, що містить білок, який включає коровий токсин СтгуїРа, а також білок, що включає коровий токсин Сгу1ба.

У одному з своїх варіантів, даний винахід стосується рослини кукурудзи, що включає експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Сгуїба, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин СгуїРа, і насіння такої рослини.

Зо У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується рослини кукурудзи, де експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Сгу!ба, і експресований в цій рослині ген, який кодує білок, що містить коровий токсин Сгуї Ра, були введені у вказані рослини кукурудзи і в насіння таких рослин шляхом інтрогресії.

Рецептори комах. Як описано в прикладах, дослідження на конкурентне зв'язування з рецептором, що проводиться з використанням радіоактивно міченого білка корового токсину

Стуїра, показало, що цей білок корового токсину Стуїба не конкурує за високоафінне зв'язування з сайтом, присутнім в тканинах комахи ЕАМУ, з яким зв'язується Сту1ба. Ці результати показали, що комбінація білків Сгу!Ра і Стуї!Ора являє собою ефективний засіб для послаблення вироблення резистентності у популяції БАММ до Сгуї!Ра (і аналогічно, для послаблення вироблення резистентності до Сту!Оа), а також для підвищення рівня резистентності рослин кукурудзи, експресуючих обидва ці білки, до вказаного шкідника.

Таким чином, частково на основі даних, описаних вище, і даних, представлених в літературі, можна зробити висновок, що спільне продукування (у вигляді кластера) білків Сту!ба і СтуїРа може бути застосоване для отримання високої дози ІЕМ-кластера, що використовується для боротьби з РАМУ. У цю комбінацію можуть бути додані і інші білки для розширення спектра комах-шкідників, що знищуються. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання СтгутлАр дозволить створити ІЕМ-піраміду, що використовується для боротьби з європейським кукурудзяним трачем.

У іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного або двох білків

Стуїба і Стуїра в комбінації з іншим третім токсином/геном, і застосування цього трикомпонентного кластера для послаблення вироблення резистентності у ЕАММ до будь-якого з цих токсинів. Таким чином, в іншому своєму варіанті, даний винахід стосується застосування одного, двох або трьох (або більше) з цих білків в сільськогосподарських регіонах, де ГАМУ може розвиватися в резистентні популяції. Відповідно до цього, даний винахід також частково стосується "трикомпонентних кластерів" або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, де токсини

СтуїГРа і Сту!ра являють собою базову пару. Одна з переважних пірамід включає щонайменше два білки, що не мають перехресну резистентність до двох шкідників до РАМУ і до ЕСВ (Європейського кукурудзяного трача; О5ігіпіа пибіїаійє); Сгту!ба плюс Сгуїра плюс один або декілька анти-ЕСВ токсинів, таких як СтулАб (див. заявку США 20080311096), оскільки СтутїЕ бо має активність проти обох комах. Іншими токсинами проти ЕСВ є Стгу!Ве (див. заявку США реєстр. Мо 61/284290, подану 16 грудня, 2009), Сту1І (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня, 2009), Сту2Аа (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня 2009) і 0І6-3 (див. заявку США 201000269223). У деяких переважних варіантах "піраміди", вибрані токсини мають три різні механізми дії проти ЕАМУ. Такими переважними пірамідними комбінаціями з "трьома механізмами дії" є Сгу!Ра плюс Сту1!О плюс інший токсин/ген, вибраний з групи, яка складається з МірзАБ, Сту1!С (див. заявку США реєстр. Мо 61/284252, подану 16 грудня, 2009), Сту1Ве і СтутЕ (див. заявку США реєстр. Мо 61/284278, подану 16 грудня 2009).

Рослини (і посівні площі, засіяні такими рослинами), які продукують ці три токсини, входять в об'єм даного винаходу. Можуть бути також додані додаткові токсини/ген, і ці конкретні трикомпонентні кластери, відповідно до даного винаходу, будуть, як несподівано було виявлено, переважно діяти проти РАМУ по трьох механізмах. Це допоможе знизити або уникнути потреби в площах-"сховищах" нетрансгенних культур. Таким чином, в даному винаході розглядається поле, засіяне культурами на площі понад 10 акрів.

Таким чином, Стуїра може бути використаний у вигляді комбінації з З генів для кукурудзи, яка в цей час знаходиться на стадії Дослідження | процесу вироблення нових ознак. СтуїРа присутній в продуктах НегсціехФ), Зтанпеїах м і М/аезетгіке "м. Відповідно до цього, використання

Сту1їра може мати важливе значення для зниження тиску відбору на інші промислові білки.

Інші токсини, наприклад, Мір3, перераховані в Додатку А. Ці номери СЕМВАМК можуть бути також використані для ідентифікації послідовностей будь-яких описаних і згаданих тут генів і білків.

У патенті США Мо 5188960 і в патенті США Мо 5827514 описані білки, які містять коровий токсин СгуїРа, і які можуть бути використані для здійснення даного винаходу. У патенті США Мо 6218188 описані оптимізовані для рослини послідовності ДНК, що кодують білки, які містять коровий токсин Стгуї Ра, і які можуть бути використані в даному винаході.

Комбінації токсинів, описаних в даному винаході, можуть бути використані для боротьби з лускокрилими шкідниками. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і молі, харчуються, головним чином, нектаром і грають значну роль в запиленні. Майже всі личинки лускокрилих, тобто, гусениці, поїдають рослини, і багато з них є небезпечними шкідниками. Гусениці живуть на листі або поїдають внутрішню частину листя, або вони пошкоджують коріння або стебла рослини, що приводить до виснаження поживних речовин у рослини, і в більшості випадків, до руйнування основної фізичної структури рослини. Крім того, гусениці пошкоджують плоди, тканини і зерно, що зберігається, і борошно, в результаті чого продукти або взагалі стають непридатними для продажу, або їх комерційна цінність значно знижується. Використовуваний тут термін "лускокрилі шкідники" також стосується різних стадій життєвого циклу шкідника, включаючи стадії розвитку личинок.

Деякі химерні токсини згідно з винаходом містять повнорозмірну частину М-кінцевого корового токсину Ві, і в певному положенні, розташованому за частиною корового токсину, цей білок переходить в гетерологічну послідовність протоксину. М-кінцева, інсектицидно активна частина токсину Ві називається "коровим токсином". Перехід від корового сегмента токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі корової частини токсину) може зберігатися, причому, перехід в гетерологічну частину протоксину може відбуватися нижче.

Одним з прикладів може служити один химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою повнорозмірну частину корового токсину Сту!Ра (амінокислоти 1-601) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 602 до С-кінця). У одному переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка Стут АБ.

Другим прикладом може служити другий химерний токсин згідно з винаходом, який являє собою частину повнорозмірного корового токсину СтуїОа (амінокислоти 1-619) і гетерологічний протоксин (амінокислоти від положення 620 до С-кінця). У переважному варіанті винаходу, частина химерного токсину, що містить протоксин, походить від токсину білка СтутАб.

Для фахівців в даній галузі очевидно, що токсини Ві, навіть токсини, що належать до певного класу, такого як Стуї!Е, можуть до деякої міри варіюватися по своїй довжині і точній локалізації переходу від частини корового токсину в частину протоксину. Звичайно, токсини

Стуїба і СтуїРа мають довжину приблизно від 1150 до 1200 амінокислот. Перехід від частини корового токсину в частину протоксину звичайно відбувається на ділянці між частинами, що складають приблизно від 50 95 і приблизно до 60 95 від всієї довжини токсину. Химерний токсин згідно з винаходом включає повнорозмірну область цієї М-кінцевої частини корового токсину.

Таким чином, химерний токсин містить щонайменше приблизно 50 95 повнорозмірного білка 60 СтуїРа токсину Ві або щонайменше приблизно 50 95 повнорозмірного білка токсину ВІ Сгу1Ва.

Цей білок має довжину, що звичайно складає щонайменше приблизно 590 амінокислот. Що стосується частини протоксину, то повнорозмірна область частини протоксину СтутАБ простягається від кінця частини корового токсину до С-кінця молекули.

Гени і токсини. Гени і токсини, що використовуються в даному винаході, включають не тільки описані тут повнорозмірні послідовності, але також і фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і гібридні білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, конкретно описаних в даній заявці. Використовувані тут терміни "варіанти" або "модифікації" генів означають нуклеотидні послідовності, які кодують ті ж самі токсини або токсини, еквівалентні токсинам, що мають пестицидну активність. Використовуваний тут термін "еквівалентні токсини" означає токсини, що мають таку ж або, по суті, такою ж біологічну активність проти шкідників- мішеней, як і заявлені токсини.

Межі ідентичності, що використовуються тут, становлять приблизно 95 95 (СтуїРа і Сту1ба), 78956 (СтутБ ї Стгу!0) і 4595 (Сту!) відповідно до "змін номенклатури для пестицидних кристалічних білків Васійи5 игіпдіеп5іє" ("Вемівіоп ої Ше Мотепсіайте їог Ше Васійи5 игіпдієпвів Ревіїсіда! Стувіа! Ргоївіп5", М. СтісКтоге, О.В. 7 еїдіег, У. Рейе!бвоп, Е. ЗсеНпері, у. Мап

Віє, 0. І егесійв, У. Вайт, апа О.Н. Оєап. Місторіоїоду апа МоїІесшаг Віоіоду Неміємв (1998) Мої 62: 807-813). Такі межі можуть бути також застосовані тільки для корових токсинів (для токсинів

СтуїЕ і Сту15).

Для фахівців в даній галузі очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані і отримані декількома способами. Специфічні гени або частини генів, описані в даний заявці, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих в депозитаріях культур. Ці гени або їх частини або варіанти можуть бути також сконструйовані шляхом синтезу, наприклад, на синтезаторі генів. Варіанти генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами отримання точкових мутацій. Крім того, фрагменти цих генів можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз відповідно до стандартних процедур. Так, наприклад, для систематичного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані ферменти, такі як ВаЇ3З!, або може бути застосований сайт- направлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, можуть бути також отримані з використанням різних рестриктуючих ферментів. Для безпосереднього отримання активних

Зо фрагментів цих білків-токсинів можуть бути використані протеази.

Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність описаних тут токсинів, входять в об'єм даного винаходу. Крім того, внаслідок надлишковості генетичного коду, ряд різних послідовностей ДНК може кодувати описані тут амінокислотні послідовності. Фахівець в даній галузі може легко отримати такі альтернативні послідовності ДНК, що кодують ті ж самі або, по суті, ті ж самі токсини. Такі варіанти послідовностей ДНК входять в об'єм даного винаходу. Використовуваний тут термін "по суті, ті ж самі" послідовності означає послідовності, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або інсерції, які фактично не чинять впливу на пестицидну активність. У це визначення також входять фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність.

Іншим методом ідентифікації генів, що кодують токсини і частини генів, що використовуються в даному винаході, є застосування олігонуклеотидних зондів. Такими зондами є нуклеотидні послідовності, що детектуються. Такі послідовності можуть бути детектовані за допомогою відповідної мітки, або вони можуть бути спочатку зроблені флуоресцентними, як описано в Міжнародній заявці Мо ММО93/16094. Як добре відомо фахівцям, якщо молекула-зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються за допомогою утворення міцного зв'язку між двома молекулами, то розумно передбачити, що такий зонд і зразок будуть мати значну сгомологію. Гібридизацію, переважно, проводять в жорстких умовах із застосуванням методів, добре відомих фахівцям, наприклад, описаних КеїЇег, с. Н., М. М.

Мапак (1987) ОМА Ргобез, БіосКіоп Ргез5, Мем МогКк, М.У., рр. 169-170. Нижче приводяться деякі приклади комбінацій концентрацій солі і температур (в порядку зростання жорсткості): 2 х ЗОРЕ або 55С при кімнатній температурі; 1 х 55РЕ або 55С при 42 С; 0,1 х 55РЕ або 55 при 427С; 01 х 55РЕ або 55С при 65 "С. Детектування зонда являє собою відомий метод, що застосовується для того, щоб визначити, відбувається гібридизація чи ні. Такий аналіз з використанням зонда являє собою швидкий метод ідентифікації токсин-кодуючих генів згідно з винаходом. Нуклеотидні сегменти, що використовуються як зонди згідно з винаходом, можуть бути синтезовані на синтезаторі ДНК відповідно до стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності можуть бути також використані як ПЛР-праймери для ампліфікації генів згідно з винаходом.

Варіанти токсинів. Деякі токсини згідно з винаходом конкретно описані в даний заявці. 60 Оскільки ці токсини приводяться тут просто як приклади токсинів згідно з винаходом, то потрібно зазначити, що даний винахід включає варіанти токсинів або еквівалентні токсини (Її нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), що мають таку ж пестицидну активність, як і представлений тут токсин, або аналогічну активність. Еквівалентні токсини мають амінокислотну послідовність, гомологічну амінокислотній послідовності представленого тут токсину. Така гомологія амінокислотних послідовностей звичайно складає більше ніж 75 95, переважно, більше ніж 90 95, а найбільш переважно, більше ніж 95 95. Гомологія амінокислотних послідовностей є найвищою в критичних областях токсину, що відповідають за біологічну активність або визначають тривимірну конфігурацію, яка, зрештою, відповідальна за біологічну активність. Відповідно до цього, деякі амінокислотні заміни є допустимими і можуть бути присутнім в тих областях, які не грають важливої ролі в повідомленні активності, або є консервативними амінокислотними замінами, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Так, наприклад, амінокислоти можуть бути поділені на наступні класи: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислотні. Таким чином, при консервативних замінах, амінокислоту одного класу замінюють іншою амінокислотою того ж типу, і така заміна входить в об'єм даного винаходу, за умови, що вона, фактично, не буде впливати на біологічну активність сполуки. Нижче представлений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу.

Таблиця

У деяких випадках можуть бути також зроблені неконсервативні заміни. Важливим фактором є те, що такі заміни не повинні значно знижувати біологічну активність токсину.

Рекомбінантні хазяїни. Гени, що кодують токсини згідно з винаходом, можуть бути введені мікробним або рослинним хазяїнам широкого ряду. Експресія гена токсину приводить, прямо або опосередковано, до продукування пестициду всередині клітин і його збереження в цих клітинах. Для отримання штаму Ві, що експресує обидва токсини згідно з винаходом, може бути застосоване кон'югативне і рекомбінантне перенесення. Інші організми-хазяїни можуть бути також трансформовані одним або обома генами токсинів, що використовуються для досягнення синергічного ефекту. З використанням прийнятних мікробів-хазяїнів, наприклад, Рзхейдотопав, ці мікроби можуть бути внесені в місця проживання шкідників, де вони можуть розмножуватися і поїдати ці мікроби. Це буде приводити до знищення шкідників. Альтернативно, мікроб, що

Зо містить ген токсину, може бути оброблений в умовах, сприяючих пролонгуванню активності токсину і стабілізації клітини. Оброблена клітина, яка зберігає токсичну активність, може бути потім внесена в середовище проживання шкідників-мішеней.

Якщо ген токсину Ві вводять мікробу-хазяїну за допомогою прийнятного вектора, і якщо вказаний хазяїн вносять в середовище проживання в живому вигляді, то важливо, щоб були використані певні мікроби-хазяїни. При цьому, вибирають такі мікроорганізми-хазяїни, які, як відомо, займають певну "фітосферу" (філоплан, філосферу, ризосферу і/або ризоплан) однієї або декількох культур, які представляють інтерес. Ці мікроорганізми вибирають так, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретних умовах (в культурі і в іншому середовищі проживання комах) з мікроорганізмами дикого типу, забезпечували стабільне збереження і експресію генів, що кодують поліпептид-пестицид, і бажано, забезпечували кращий захист пестициду від руйнування і інактивації в умовах навколишнього середовища.

Відомо, що велике число мікроорганізмів проживає на філоплані (на поверхні листя рослин) іабо на ризосфері (в грунті, що оточує коріння рослин) цінних сільськогосподарських культур широкого ряду. Такими мікроорганізмами є бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, бактерії роду Рзендотопав, Егм/іпіа,

Зеїтаїйа, Кіерзієйа, Хапіпотопавз, бігеріотусе5, ВНігобішт, Аподорзейдотопаз, МеїНуїорніїив,

Адгорасієпит, Асейобасіег, І асіорасійи5, Агійгорасіег, А2оїобасієег, І еисоповіос і Аїсаїїдепев; гриби, а зокрема, дріжджі, наприклад, дріжджі роду бЗасспаготусе5, Сгуріососсив5,

Кісулхеготусев, 5рогороІоптусев, ЕпПодогогціа і Ачйгеобавзідішт. Особливий інтерес представляють такі види бактерій фітосфер, як Роейидотопа5 зугіпдае, Рзеидотопа5 Пшпогезсеп5, Зегтайа тагсеб5сепз5, Асеїорасієї хуїпит, Адгобасієпішт їштеїасіеп5, Нподорзейдотопа5 5рПегоїдев,

Хапшотопаб5 сатревігі5, КПі2обішт пеїїоїі, АІсаїдепеб5 епігорпи5 і АоїобБасіег міпіапаії; і дріжджів-фітосфер, таких як Вподоюгиїа гибга, В. дішіпів, В. тагіпа, В. ашгапіїаса, Стуріососсив аібідиє, С. аййицеп5, С. Іацгепії, зЗасспаготусеб5 гоб5еї, 5. ргейгіеп5і5, 5. сегемівіає,

ЗрогороІотусез гозеи5, 5. одоги5, Кіпулхеготусев мегопає і Ачгеобравзідішт роїїшап5. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми.

Для введення гена Ві, що кодує токсин, мікроорганізму-хазяїну в умовах, що забезпечують стабільне збереження гена і стабільну експресію гена, можуть бути застосовані методи широкого ряду. Такі методи добре відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприклад, в патенті

США Мо 5135867, який вводиться в даний опис за допомогою посилання.

Обробка клітин. Васійн5 «Пигіпдіепбіз або рекомбінантні клітини, експресуючі токсини ВІ, можуть бути оброблені з метою пролонгування активності токсину і стабілізації клітин.

Пестицидна мікрокапсула, що утворюється, містить токсин або токсини Ві в клітинній структурі, яка стабілізує і захищає токсин у випадку, коли цю мікрокапсулу вносять в середовище проживання шкідника-мішені. Прийнятними клітинами-хазяїнами можуть бути прокаріоти або еукаріоти, і такими клітинами звичайно є, але не обмежуються ними, клітини, які не продукують речовини, що є токсичними для вищих організмів, таких як ссавці. Однак, можуть бути також використані і мікроорганізми, які продукують речовини, токсичні для вищих організмів, але, при цьому, ці токсичні речовини є нестабільними, або рівень їх введення є досить низьким, що виключає можливість якого-небудь токсичного впливу на ссавця-хазяїна. Як хазяїни, особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби.

Клітини, що обробляються, звичайно є інтактними і, по суті, знаходяться в проліферативній формі, а не в формі спор, хоча, в деяких випадках можуть використовуватися і спори.

Обробка мікробних клітин, наприклад, мікробів, що містять ген або гени токсину Ві, може бути здійснена хімічними і/або фізичними методами, або комбінацією хімічних і фізичних методів, за умови, що такий метод не буде чинити негативного впливу на властивості токсину і не буде приводити до зниження здатності клітин захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, а зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Більш конкретно, може бути використаний йод в м'яких реакційних умовах протягом певного періоду часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Іншими прийнятними методами є обробка альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними агентами, такими як хлорид зефірану і хлорид цетилпіридинію; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними

Зо гістологічними фіксаторами, такими як йод Люголя, фіксатор Боуїна; різні кислоти і фіксатор

Хеллі (см: Нитавзоп, сгеїспеп Г.., Апіта! Тізвиє Тесппідцев, М. Н. Егеетап апа Сотрапу, 1967); або комбінацією фізичного методу (нагрівання) і хімічних агентів, які зберігають і пролонгують активність токсину, що продукується в клітинах, введених в середовище проживання хазяїна.

Прикладами фізичних методів є короткохвильове випромінювання, таке як гамма- випромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінення, ліофілізація і т. п. Методи обробки мікробних клітин описані в патентах США МоМо 4695455 і 4695462, які вводяться в даний опис за допомогою посилання.

Ці клітини звичайно мають підвищену структурну стабільність, що приводить до збільшення резистентності до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид присутній в формі попередника, то спосіб обробки клітин повинен бути вибраний так, щоб він не приводив до інгібування процесингу попередника з утворенням зрілої форми пестициду під дією патогена шкідника-мішені. Так, наприклад, формальдегід буде забезпечувати перехресне зшивання з білками, і тим самим інгібувати процесинг попередника поліпептидного пестициду. Спосіб обробки повинен зберігати щонайменше значну міру біологічної доступності або біологічної активності токсину.

Властивостями, що представляють особливий інтерес для продукування при виборі клітини- хазяїна, є простота введення гена або генів Ві хазяїну, доступність експресійних систем, ефективність експресії, стабільність пестициду в хазяїні і наявність додаткових генетичних ознак. Технологічними властивостями пестицидних мікрокапсул, які представляють інтерес, є їх захисна здатність відносно пестициду, наприклад, товщина клітинних стінок, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або здатність утворювати тільця включення; виживаність у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавців; привабливість з точки зору поїдання шкідниками; простота утилізації; фіксація без пошкодження токсину і т. п. Іншими властивостями, що розглядаються, є простота приготування препарату і його транспортування, матеріальні витрати, стабільність при зберіганні і т. п.

Культивування клітин. Клітина-хазяїни, що містять інсектицидний ген або гени В.., можуть бути вирощені в будь-якому прийнятному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція буде забезпечувати селективну перевагу, тобто, забезпечувати селективне середовище, в якій всі або майже всі клітини будуть зберігати ген В.І. Потім ці клітини можуть бути зібрані звичайними 60 способами. Альтернативно, ці клітини можуть бути оброблені до їх збирання.

Клітини Ві., що продукують токсини згідно з винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методом ферментації. Після завершення циклу ферментації, бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом відділення спор і кристалів В. від зброджуваного бульйону стандартними методами. Виділені спори і кристали Ві. можуть бути приготовані у вигляді змочуваного порошку; рідкого концентрату; гранул або інших препаратів, отриманих шляхом додавання поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних носіїв і інших компонентів, що полегшує транспортування, і обробку ними конкретних шкідників- мішеней. Такі процедури приготування і застосування добре відомі фахівцям.

Препарати. Приготовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини ізолятів В.І, або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з описаних тут ізолятів В.ї., можуть бути внесені в грунт. Приготований продукт може бути застосований у вигляді покриття, що наноситься на насіння, або препарату для обробки коріння або всієї рослини на останніх стадіях циклу вирощування сільськогосподарської культури. Для обробки рослин і грунту, клітини ВІ. можуть бути приготовані у вигляді змочуваних порошків, гранул або дустів, шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінеральні речовини (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинні матеріали (подрібнені в порошок качани кукурудзи, рисове лушпиння, шкаралупа волоського горіха і т. п.). Такі препарати можуть включати ад'юванти типу "розпилювачів-зв'язувальних речовин", стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі препарати можуть бути водними або безводними, і можуть бути використані у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів або т. п. Інгредієнтами можуть бути реологічні агенти, поверхнево- активні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини або полімери.

Як відомо фахівцям в даній галузі, концентрація пестициду може значно варіюватися залежно від природи конкретного препарату, а зокрема, залежно від того, чи використовується він у вигляді концентрату або в чистому вигляді. Пестицид складає щонайменше 1 95 по масі, а може становити 100 95 по масі. Сухі препарати можуть становити приблизно 1-95 95 по масі пестициду, а рідкі препарати звичайно становлять приблизно 1-60 95 по масі твердих речовин в рідкій фазі. Ці препарати звичайно містять приблизно від 102 до 107 клітин/мг. Ці препарати можуть бути введені в кількості приблизно від 50 мг (в рідкому або в сухому вигляді) до 1 кг або

Зо більше на гектар.

Препарати можуть бути внесені в середовище проживання лускокрилих шкідників, наприклад, нанесені на листя або грунт шляхом розпилення, опилювання, зрошування або т. п.

Трансформація рослин. Переважними рекомбінантними хазяїнами, які можуть бути використані для продукування інсектицидних білків згідно з винаходом, є трансформовані рослини. Гени, що кодують описані тут білки токсинів Ві, можуть бути введені в рослинні клітини із застосуванням різних методів, добре відомих фахівцям. Так, наприклад, існує велике число клонуючих векторів, що містять систему реплікації в Е5спегіспіа соїї, і маркер, що дозволяє провести відбір трансформованих клітин, і ці вектори можуть бути використані з метою отримання препарату для інсерції чужорідних генів у вищі рослини. Вектори містять, наприклад, іптег аа рВвКз322, серії рос, серії М1Зітр, рАСУСсС184. Відповідно до цього, ДНК-фрагмент, що має послідовність, яка кодує білок токсину Ві, може бути вбудований у вектор у прийнятний рестрикційний сайт. Отриману плазміду використовують для трансформації Е. соїї. Клітини Е. соїї культивують у прийнятному поживному середовищі, а потім збирають і піддають лізису.

Потім цю плазміду виділяють. Методами аналізу звичайно є аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші методи, що застосовуються в біохімії і молекулярній біології. Після кожної маніпуляції використовувана послідовність ДНК може бути розщепленням і приєднана до наступної послідовності ДНК. Кожна послідовність плазміди може бути клонована в одній і тій же або в інших плазмідах. Залежно від методу вбудовування потрібних генів в рослину, можуть виявитися необхідними і інші послідовності ДНК. Так, наприклад, якщо плазміду Ті або Кі використовують для трансформації клітин рослини, то щонайменше правий кордон, а в більшості випадків, правий і лівий кордони Т-ДНК-плазміди Ті або Кі приєднують як фланкуючу область генів, що вбудовуються. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин було ретельно досліджене і детально описане в ЕР 120516, І ее апа Сеїміп (2008), НоеКета (1985),

Егаїеу єї аї., (1986), і Ап еї аї!., (1985), і добре відомо фахівцям.

Після інтеграції вбудованої ДНК в геном рослини, така ДНК стає відносно стабільною.

Трансформуючий вектор звичайно містить селективний маркер, який повідомляє трансформованим клітинам рослини резистентність до біоциду або антибіотику, таких як біалафос, канаміцин, 5418, блеоміцин або гігроміцин, іпіег аа. З використанням окремо взятого маркера можна, відповідно, здійснювати відбір трансформованих клітин, а не клітин, які не 60 містять вбудовану ДНК.

Існує багато методів, прийнятних для вбудувування ДНК в клітини рослин-хазяїнів. Такими методами є трансформація молекулою Т-ДНК з використанням Аадгобасіегішт ішптеїасіеп5 або

Адгорасіегіцт гпігодепе5 як трансформуючі агенти, злиття, інжекція, біобалістичні методи (бомбардування мікрочастинками) або електропорація, а також інші можливі методи. Якщо для трансформації використовуються агробактерії, то ДНК, що вбудовується, клонують в конкретні плазміди, а саме, в проміжний вектор або в бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ті або Кі за допомогою гомологічної рекомбінації з використанням послідовностей, гомологічних послідовностям, присутнім в Т-ДНК. Плазміда Ті або Кі також містить область міг, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самі реплікуватися в агробактеріях. Проміжний вектор може бути перенесений в Адгобасіегійт

Імтеїасіеєп5е за допомогою хелперної плазміди (кон'югування). Бінарні вектори можуть самі реплікуватися як в Е. сої, так і в агробактеріях. Вони містять селективний маркерний ген і лінкер або полілінкер, які замикають праву і ліву приграничні області Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в агробактерії (Ноїісієг5 еї аї., 1978). Агробактерія, що використовується як клітина-хазяїн, містить плазміду, що несе область мі. Область міг необхідна для перенесення Т-ДНК в клітину рослини. Може також бути присутньою і додаткова

Т-ДНК. Трансформованим таким чином бактерію використовують для трансформації клітин рослин. Рослинні експлантати можуть бути переважно культивовані з Адгорасіегічт Кшптегасіеп5 або Адгобрасіегішт гпіглодепе5 для перенесення ДНК в клітину рослини. Потім цілі рослини можуть бути вирощені з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, з шматочків листя, сегментів стебел, коріння, а також протопластів або клітин, культивованих суспензійним методом) у прийнятному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для відбору.

Потім вирощеним таким чином рослини можуть бути протестовані на присутність вбудованої

ДНК. У випадку інжекції і електропорації, яких-небудь спеціальних вимог до отримання плазмід не пред'являється. При цьому, можуть бути використані стандартні плазміди, такі як, наприклад, похідні РОС.

Трансформовані клітини розвиваються в рослині як звичайно. Вони можуть утворювати зародкові клітини і передавати трансформовану(ії) ознаку(и) потомству. Такі рослини можуть бути вирощені звичайним способом і схрещені з рослинами, що мають трансформовані

Зо наслідувані фактори або інші наслідувані фактори. Отримані гібридні рослини мають відповідні фенотипічні властивості.

У переважному варіанті винаходу, рослини трансформують генами, у яких зустрічальність кодонів оптимізована для рослин. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, що вводиться в даний опис за допомогою посилання. Хоча в даній заявці описані деякі зрізані токсини, однак, фахівцям з ВІ добре відомо, що токсини, які належать до типу токсинів довжиною 130 кДа (повнорозмірні), мають М-кінцеву половину, що являє собою коровий токсин, і С-кінцеву половину, що являє собою протоксиновий "хвіст". Таким чином, відповідні "хвости" можуть бути використані разом із зрізаними/коровими токсинами відповідно до винаходу. Див., наприклад, патент США Мо 6218188 і патент США Мо 6673990. Крім того, методи створення синтетичних генів Ві для їхнього використання в рослинах відомі фахівцям (5(еулагі апа Вигдіп, 2007). Одним з необмежувальних прикладів переважного трансформованої рослини є фертильна рослина кукурудзи, що містить експресований у рослині ген, кодуючий білок Стгу1!Ра, а також другий експресований у рослині ген, кодуючий білок Стгу1Бба.

Перенесення (або інтрогресія) СтуїРа- і Сгу!Оа-детермінованого(их) ознаки(к) в інбредні лінії кукурудзи може бути досягнуть шляхом рекурентного селективного схрещування, наприклад, зворотного схрещування. У цьому випадку, потрібну рекурентну рослину спочатку схрещують з інбредним донором (нерекурентним батьком), що несе відповідний(ї) ген(и), що повідомляє(ють) СтуїЕ- ії Сту1О-детерміновані ознаки. Потім потомство цього кроса піддають зворотному схрещуванню з рекурентною рослиною з наступним відбором отриманого потомства на потрібну(ї) ознаку(и), перенесену(ї) від нерекурентного батька. Через три, переважно, чотири, а ще більш переважно, через п'ять або більше поколінь "бекросів" з рекурентним батьком з відбором на потрібну(ї) ознаку(и), потомство буде гетерозиготним по локусах, що контролює перенесенуй(ії) ознаку(и), але воно буде аналогічне рекурентному батьку по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Роепітап 8. біерег (1995) Вгеедіпд

Ріеїй Сторв, 4 Еа., 172-175; ЕРенг (1987) Рііпсіріев ої Сийімаг ОемеІортепі, Мої. 1: Тнеогу апа

Тесппідце, 360-376).

Стратегії вирощування культур, резистентних до комах (ІЕМ). Наприклад, Коив5п і співробітниками були описані стратегії з використанням двох токсинів, що також називаються створенням "пірамід" або "кластерів" для вирощування трансгенних культур, що мають бо інсектицидні властивості. (Тпе Коуаї Зосієїу. РП. Тгап5. К. 5об. І опа. В. (1998) 353, 1777-1786).

На мжер-сайті Агенства США по захисту навколишнього середовища (ера.дом/оррборра!/ріорезіїсідев/рір5/рі согп геде 2006. піт) опубліковані наступні вимоги по забезпеченню площ-сховищ з не-трансгенними культурами (тобто, не-В4.) культурами (земельної ділянки із сільськогосподарськими не-ві-культурами/кукурудзою) для їхнього використання під трансгенні культури, що продукують один білок Ві, що має активність проти шкідників-мішеней. "Конкретними структурними вимогами до продуктів з Ві-кукурудзи (СтутАб чи СгутЕ), захищеної від кукурудзяного трача, є:

Структурні площі-"сховища" 2095 площі-притулку під Ві- кукурудзу, не захищену від

Лускокрилих у Кукурудзяному поясі; 50 95 площі-притулку під Ві-бавовник, не захищений від Лускокрилих у Бавовняному поясі;

Блоки:

Внутрішні (тобто, у полях з ВЮ;

Зовнішні (тобто, окремі поля в межах У милі (по можливості 5 милі) від Ві-поля для максимізації вільного схрещування).

Смужки регулярно оброблюваних сільськогосподарських земель:

Ці смужки повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди (переважно, 6 рядів) для зниження числа випадків міграції личинок".

Крім того, Національна асоціація виробників кукурудзи, на своєму уер-сайті (псда.сот/іпзесі-гезізтапсе-тападетепі-гасі-зпеєї-Бі-согп) також опублікувала аналогічний посібник з вимог для площ-сховищ. Так, наприклад: "Вимоги до ІКМ у випадку кукурудзяного трача: - засівати щонайменше 20 95 акрів кукурудзою для збереження нетрансгенних гібридів; - у регіонах вирощування бавовнику, повинно залишатися 50 95 площі-притулку; - повинно бути засіяно 1/2 милі нетрансгенними гібридами; - площі-сховища можуть бути засіяні смугами на Ві-поля; площі-сховища повинні бути засіяні у вигляді смуг, що повинні мати ширину щонайменше в 4 ряди; - площі-сховища можуть бути оброблені стандартними пестицидами тільки, якщо досягаються економічні пороги для комах-мішеней;

Зо - розпилювані інсектициди на основі Ві не можуть бути використані на площах-сховищах під кукурудзу; - відповідне сховище повинне бути засіяне Ві-кукурудзою на кожній фермі"

Як указували Коибп і співробітники (наприклад, на сторінках 1780 і 1784 у правому стовпчику), кластери або піраміди з двох різних білків, кожний з який є ефективним проти шкідників-мішеней з мінімальною перехресною резистентністю або з відсутністю такої резистентності, можуть бути використані на дрібніших "сховищах" нетрансгенних рослин. Кои5п висловив припущення, що для успішного використання кластерів, площа-сховище, розмір якого складає менше ніж 10 956, може бути оброблений культурою з резистентністю, порівнянною з резистентністю культур, оброблюваною приблизно на 50 95 площі- притулку для одного (не- пірамідного) токсину. Що стосується доступних у даний час продуктів з кукурудзи, що містять "пірамідні" Ві, то Агентство США по захисту навколишнього середовища вимагає, щоб значно менша (звичайно 595) площа структурного притулку була засіяна не-ВІ кукурудзою, а не культурою з одним токсином (звичайно 20 95).

Існують різні шляхи забезпечення ІНМ-ефектів використання площ-сховищ, включаючи різні геометричні схеми засівання на поля (як згадувалося вище) і суміші насіння в одному пакеті, що також обговорюється Кові і ін. (див. вище), і в патенті США Мо 6551962.

Вищевказані відсотки або аналогічні співвідношення площ-сховищ можуть бути використані для розглянутих двокомпонентних або трикомпонентних кластерів або пірамід. Для трикомпонентних кластерів із трьома механізмами дії проти одного шкідника-мішені, притулку взагалі бути не повинно (або наприклад, площа-сховище повинен бути меншим 5 95). Це особливо справедливо для площ під комерційні культури, наприклад, понад 10 акрів.

Усі патенти, патентні заявки, попередні заявки і або публікації цитовані в них роботи у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання в тому ступені, у якому вони відповідають детальному опису даної заявки.

Нижче приводяться приклади, що ілюструють способи практичного здійснення даного винаходу.

Ці приклади не повинні розглядатися як обмеження обсягу винаходу. Усі відсотки дані по масі, а всі співвідношення сумішей розчинників дані по обсязі, якщо це не обговорено особливо.

Усі температури дані в градусах Цельсія.

Якщо це не зазначено або не мається на увазі конкретно, то використовувані тут артиклі "а", "ап" і "Пе" означають "щонайменше один".

Приклад 1

Дані біоаналізу

СтуїВа, експресований у трансгенній кукурудзі (рОА55163), забезпечує захист від поїдання совкою трав'яною (ГАМ), зродоріега І тидірегаа (У.Е. Зтійй). Така експресія є ефективнішої для боротьби з РАМУ, у яких виробляється резистентність до СтуїРа, і очевидно, ще ефективнішої для рослин кукурудзи, що містять модифікацію ТС1507, де зазначена модифікація, імовірно, є ознакою, що повідомляє резистентність, що може бути використана у провідних галузях промисловості для боротьби з ЕАМУ.

Авторами винаходу було також продемонстровано, що СгуїРа (білок від рекомбінантного штаму 0ОК1649 Рвзепйдотопах Пиогезсеп5; плазміда рорАВІ1817) і СтгуїОа (білок від рекомбінантного штаму ОС782 Рзейдотопах Пиогезсеп5) є ефективними для боротьби з ГАМУ, як показали біоаналізи, проведені з використанням штучного корму, і що активність цієї комбінації виявилася вище, ніж це очікувалося у випадку використання цих білків окремо.

Виходячи з даних, описаних вище, до-експресія Сту1!ба і СтуїРа дає можливість одержати

ІАМ-кластери, що у високій дозі можуть бути використані для боротьби з ГАМУ, з іншим важливим видом Зроаоріега 5ресіе5 і, імовірно, з іншими лускокрилими шкідниками. У цю комбінацію, для розширення спектра, можуть бути додані й інші білки. Так, наприклад, для кукурудзи, додавання СтгутАр дозволяє створити ІЕМ-кластер для боротьби з європейським кукурудзяної трачем (ЕСВ), Озігіпіа пибіїа!ї5 (Нибпег).

На фігурі 1 проілюстроване ушкодження (середній 956 ушкодження листів ж порівн. кв. пом.) сегментів листів кукурудзи, уражених ЕАММ (сині стовпці) або ггАУМ (пурпурові стовпці). Всі оброблювані зразки, перед яким стоять числа "5163", являють собою сегменти від рослин, трансформованих конструкцією, що містить Сту!Ора. Рослини, у яких не була детектована експресія Сту1ра, були розділені на групи, зазначені в лівій крайній частині графіка. Рослини, у яких детектувалася експресія Стгу1ба, були розділені на групи, зазначені в центральній частині графіка. Нетрансгенний (тобто, негативний) контроль зазначений у крайній правій частині графіка і позначений "В104", "Ні" ї "ІвоЇїпе". Комерційно доступна інбредна лінія, що містить

Зо СтуїРа, представлена першим обробленим зразком, зазначеним праворуч (позначений "Негсшех І"), Її Є тим же самим генетичним тлом, як і нетрансгенний контроль, позначений "ІвоїЇїпе".

Протоксинову химеру, що складається з послідовності, яка кодує розщеплений по кінцях трипсином токсин Стгу1ба, і послідовності, яка кодує С-кінцеву область протоксину СтуТтАБ, конструювали, а потім вбудовували в експресійний кластер, здатний здійснювати спрямовану експресію в кукурудзі (рОАБЗ5163). Кукурудзу трансформували з використанням Адгорасіегійт

Імтегїасіап5, і ідентифікували модифікації що містять химеру СтгуїОа/1Ар. Зрізи листів регенерованих рослин піддавали біоаналізу на поїдання совкою трав'яною дикого типу (ЕАМ/) або личинками популяції совки трав'яної, котра є резистентною до Стгу1їРа (ГЕАУМ). Стуї!ОралАр- трансформовані рослини в меншій мірі поїдалися личинками РАМУ, однак вони були не так ефективні, як інбредні рослини, що містять 2 копії Сту!Ра (фігура 1). (Протестовані Сту1ра- модифікації були гемізиготними по трансгену, а конвертована інбредна рослина була гомозиготною по модифікації ТС1507). На противагу цьому, ті ж самі модифікації, що містять

Сгту1ралАБ, по суті, були набагато ефективнішими відносно зниження міри поїдання личинками

ГЕАМУ, ніж інбредні лінії, що містять Сгу!Ра (фігура 1).

Інсектицидну активність СтуїРа (білка від рекомбінантного штаму Рзхендотопах Пиогезсепео рет1649; плазміда РОАВ1817), Сгуї!ба (білка від рекомбінантного штаму Р. Ппогезсеп5 ОС782), і комбінації з цих 2 білків у відношенні 1:11 (мас:мас) тестували в стандартних біоаналізах, проведених з використанням штучного корму для оцінки активності. Оцінку активності проводили за допомогою аналізу ГОСТ (ОМР8.0, 5А5 Іпс. 2008), що давав оцінки І Сзо і верхня і нижня межі (95 9о) для І Сво. Тест на синергізм проводили методом, описаним Табразппік (1992), у якому передбачувану величину активності комбінації обчислювали по активностях кожного окремого компонента. Дія комбінації вважалася синергічною, якщо оцінена верхня довірча межа активності даної комбінації був нижча, ніж обчислена величина передбачуваної активності. У випадку совки трав'яної (ЕАММ) і популяції совки трав'яної, котрі є резистентними до СтуїЕа (ГРАММ), верхні довірчі межі для і!/С5о даної комбінації нижчі, ніж обчислена величина передбачуваної активності (таблиці 1 ії 2), з чого можна зробити висновок, що дія комбінації

СтгуїРа і Сту1їба на ці 2 популяції є синергічною.

Таблиця 1. Оцінка активності, верхня і нижня межі 95 95 довірчого інтервалу (СІ ї ОСІ, бо відповідно) для Стгу1Ра, Стгу1ба і комбінації 1:1 (мас./мас) з цих 2 білків стосовно совки трав'яної дикого типу (ГАМУ), зродоріега Ігидірегадаа. В останньому стовпчику зазначені очікувані величини

Ї Сво, отримані виходячи з активності кожного окремого білка по формулі, описаній Табазппік (1992) (Табазппік В.Е. Емаїнайоп ої зупегдієт атопа Васійн5 Шигпдіепвіб їохіп5 Арріїєд апа

Епмігоптепіа! Містобіоіоду 58(10), 3343-3346, 1992). Комбінація вважається синергічною, якщо очікувана величина вища верхньої довірчої межі для даної комбінації.

Таблиця 1 11111111 Величини, що спостеріаються./////// | ОчікуваніЙ0/

Тільвиїба /////77/171717171153077 1777111 234 11731 |! 7777-11

Тількиїга.ї/////77777171717111196,1771 11111175 11111252

Таблиця 2. Оцінка активності, верхня і нижня межі 95 95 довірчого інтервалу (СІ ї ОСІ, відповідно), для СтуїРа, Стгу!Оа і комбінації 1:11 (мас./мас) з цих 2 білків стосовно Стгу1Ра- резистентної совку трав'яної (ТРАМУМ), Ззродоріеєга Ігидірегда. В останньому стовпчику зазначені очікувані величини І Сво, отримані виходячи з активності кожного окремого білка по формулі, описаній Табазппік (1992). Комбінація вважається синергічною, якщо очікувана величина вища верхньої довірчої межі для даної комбінації.

Таблиця 2 11111110 Величини, що спостерігаються. | ОчікуваніЙ0/

Лільвиїба | 777792... |. .ЮюЮЮ.58 |. 77144 її

Тількиїга,ї | 77795000, Її. -111111-111111111-

Приклад 2

Систематизовані дані зв'язування

Експерименти по конкурентному зв'язуванню, проведені з використанням 72»І-міченого

Стуїра і мембранних везикул щіткової облямівки (ВВММ), виділених у ЕАМУ, описані нижче.

Результати цих експериментів продемонстрували, що СтуїОа тісно зв'язано зі своїм рецептором, і що СтуїРа не конкурує з Сту!Оа за сайти зв'язування. Якщо резистентність до

Стуїра обумовлена мутацією рецептора, що спостерігається в цих дослідженнях, то отримані дані дають підставу припустити, що Стуїба є гарним ІКМ-засобом для знищення таких резистентних популяцій або зниження розвитку такої резистентності. Результати біоаналізів, проведених з використанням Сту1!Ра-резистентної РАМУ (ТЕАММ), продемонстрували, що СтуїОа є активним стосовно цієї популяції. У цілому, ці дані дозволяють припустити, що СтгуїРа і Стуїра можуть являти собою ІКМ-кластер, що ефективно пригнічує розвиток резистентності до будь- якого інсектицидного білка.

Аналізи на зв'язування з рецептором показали, що 725І-Стгу1ба тісно зв'язується зі своїм(и)

Зо рецептором(ами) і може ефективно конкурувати за зв'язування з неміченим СтуїОа. Жоден з

СтутАБ, СтуїРа або Сгу!Ве не може конкурувати з 725І1-Сгу!ба за зв'язування із сайтом його рецептора в ВВММ ЕАМУ, що вказує на те, що СтуїОа має унікальний сайт зв'язування в середній частині кишечнику ЕАМУ, за зв'язування з яким не можуть конкурувати СтутАб, СтутїЕ і

Стгу1!Ве. Оскільки ггАМУ є такими ж чутливими до Сгу1ба, як і РАМУ дикого типу, то це означає, що передбачуваний сайт рецептора, що є модифікованим у комах гЕАМУМ, не є сайтом рецептора, з яким зв'язується Сту!їОа. Таким чином, СтгуїОа є чудовим партнером по кластеризації для СтгуїРа, оскільки він взаємодіє в іншому сайті мішені, що відповідає за його біологічну активність.

При додаванні "22І-Стуї!Оа до ВВМУ ЕАМУ, витісняти зв'язаний 722І-Сгу!Оа здатний тільки сам

СтуїОра, що не був позначений радіоактивною міткою. Нездатність СтуїРа, СгутАБ і Сгу1Ве витісняти зв'язаний 125І-Сту!ра з ВВММУ указує на те, що в середній частині кишки ГАМУ, Стгу!ба зв'язується з унікальним сайтом рецептора, з яким не взаємодіють Стуї!Ра, СтгутАБ і Сту1Ве, навіть незважаючи на те, що всі ці чотири різні токсини Сгу мають активність, спрямовану проти личинок ЕАДМУ.

Приклад З

Конструювання химерних токсинів, що містять корові токсини Стгу! і гетеролігічні протоксини

Химерні токсини. Химерні білки, що містять домен корового токсину одного Сгу, приєднаного до протоксинового сегмента іншого токсину Сгу, були вже описані, наприклад, у патенті США Мо 5593881 і в патенті США Мо 5932209.

Варіантами химерних білків Сту1!Оа відповідно до винаходу є химерні токсини, що містять М- кінцевий сегмент корового токсину, що походить від інсектицидного токсину Сгу1ба, приєднаного до гетерологічного протоксинового сегмента ендотоксину дельта у визначеному положенні, розташованому за межами сегмента корового токсину. Перехід від корового токсину в гетерологічний сегмент протоксину може відбуватися приблизно в природній області стику токсин/протоксин, або альтернативно, частина нативного протоксину (що простягається за межі сегмента корового токсину) може зберігатися, причому, перехід у гетерологічний протоксин може відбуватися нижче. В одному з варіантів, сегменти корового токсину і протоксину можуть включати точно таку ж амінокислотну послідовність нативних токсинів, від яких вони походять, або вони можуть включати амінокислотні додавання, делеції або заміни, що не погіршують, а можуть навіть поліпшувати біологічну функцію сегментів, зв'язаних один з одним.

Так, наприклад, химерний токсин відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від Сту1ба, і гетерологічний протоксин. У переважному варіанті винаходу, сегмент корового токсину, що походить від Сту!Оа2 (594 амінокислоти), приєднаний до гетерологічного сегмента, що містить сегмент протоксину, що походить від дельта-ендотоксину СтутлАр (545 амінокислот). Послідовність химерного білка з 1139 амінокислот позначена тут Сту1!Оа. Слід зазначити, що інші химерні гібриди, що містять варіанти корового токсину Сгу1Браг2, і протоксини, що походять від Сту1тАб, входять в обсяг даного винаходу.

Другий химерний білок відповідно до винаходу містить сегмент корового токсину, що походить від Сту1!Ра (603 амінокислоти) і приєднаний до гетеролігічного сегмента, що містить сегмент протоксину, що походить від дельта-ендотоксину СтутАб (545 амінокислот).

Послідовність химерного білка з 1148 амінокислот позначена тут СтуїРа.

Приклад 4

Конструювання експресійних плазмід, що кодують химерні білки і їх експресію в

Рзепдотопав

Для створення експресійної конструкції РООУУ2848 Рзхейдотопах Пиогезсепз (РІ), отриманої

Зо з метою продукування повнорозмірного химерного білка Сгу!Оба, були застосовані стандартні методи клонування (описані, наприклад, в посібнику Затьгоок еї аї, (1989) і Аизибвеї еї аї, (1995), і в більш пізніх виданнях|ї. Продукування білка здійснювали в штамі МВ214 Рхепидотопа5

Поиогезсеп5 (похідному штаму МВ101; Р. Пиогезсепв, біовар 1), що має інсерцію модифікованого оперонк Іас, як описано в патенті США Мо 5169760. Основна стратегія клонування включає субклонування фрагмента ДНК, що кодує білок Сгу1!ба, в плазмідні вектори, в результаті чого цей фрагмент буде поміщений під експресійний контроль промотору Ріас і термінатора "пВТІТ2, що походить від плазміди рКК223-3 (РІ Рпапгтасіа, Мім"айКеє, УМ). Одна з таких плазмід позначена РООМУУ2848, а ізолят МВ214, що містить цю плазміду, позначений Орії5о.

Аналіз на ріст і експресію в шейкерних колбах. Продукування білка СтуїОра для характеризації і біологічного аналізу на його дію проти комах здійснювали з використанням штаму Орі150 Р. ПЯногезсеп5, вирощеного в шейкерних колбах. Продукування білка Сту1їра, що знаходиться під контролем промотору Ріас, здійснювали як описано раніше в патенті США Мо 5527883. Докладний опис мікробіологічних маніпуляцій приводиться в публікації 5дцігев еї аї., (2004), в заявці на патент США 20060008877, в заявці на патент США 20080193974 і в заявці на патент США 20080058262, які вводяться в даний опис за допомогою посилання. Експресія була індукована шляхом додавання |ізопропіл-(--О-1-тіогалактопіранозиду (ІРТО) після першого інкубування протягом 24 годин при 30 "С зі струшуванням. Зразки культур брали під час індукування і в різні періоди часу після індукування. Клітинну густину вимірювали по оптичній густині на 600 нм (ООвоо).

Фракціонування клітин і аналіз зразків в шейкерних колбах, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН. При кожному взятті зразка, клітинну густину зразків доводили до

ООвоо-20, і 1 мл-аліквоти центрифугували при 14000 х д протягом п'яти хвилин. Клітинний осад заморожували при -80 "С. Розчинні і нерозчинні Фракції, взяті із заморожених зразків клітинного осаду в шейкерних колбах, отримували з використанням розчину для екстракції бактеріального білка ЕазуЇ усе (ЕРІСЕМТКЕФ ВіоїесппоЇодіех, Мадібоп, ММ). Кожний клітинний осад ресуспендували в 1 мл розчину ЕазуЇ ухе"мМ, а потім розводили 1:4 в буфері для лізису і інкубували зі струшуванням при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Лізат центрифугували при 14000 про/міна протягом 20 хвилин при 40С, і супернатант виділяли у вигляді розчинної фракції. Потім осад (нерозчинну фракцію) ресуспендували в рівному об'ємі забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5; 11,9 мМ Маг2НРОХЯ4, 137 мМ Масі, 2,7 мМ

КСІ, рН 74).

Зразки змішували у відношенні 1:11 з 2 х буфером для зразків Леммлі, що містить рД- меркаптоетанол (ЗатргооК еї аі, див. вище), і кип'ятили протягом 5 хвилин, а потім завантажували на 12 95 біс-тріс-гель Сптегіоп ХТ (Віо-Кай Іпс., Негсше5, СА). Електрофорез здійснювали в ХТ-буфері МОР5, рекомендованому виробником. Гелі забарвлювали кумасі синім Віо-Заге відповідно до протоколу, рекомендованого виробником (Віо-Кад), і візуалізували з використанням візуалізуючої системи АїЇрпа Іппоїесі (Зап І еапаго, СА).

Отримання тілець включення. Отримання тілець включення білка Сгу1!ба (ІВ) здійснювали в клітинах, отриманих шляхом реакції ферментації Р. Пиогезсеп5, які продукували нерозчинний інсектицидний Ві-білок, як показав аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН ії МАГ0ОІ-М5 (матрична лазерна десорбція/онізувати мас-спектрометрія). Гранули, отримані шляхом ферментації Р. ПЯпогезсеп5, відтавали на водяній бані при 37 "С. Клітини ресуспендували до 25 95 мас/об в буфері для лізису (50 мМ трісу, рН 7,5, 200 мМ Масі, 20 мм

ЕОТА-динатрієвої солі (етилендіамінтетраоцтової кислоти), 190 тритони Х-100 ї 5 мМ дитіотреїтолу (О0ОТТ); 5 мл/л "коктейлю" інгібіторів бактеріальної протеази (Саїаіюд Ж Р8465;

Зідта-Аїдгісп, 5. І оці5, МО), який додавали безпосередньо перед застосуванням. Клітини суспендували на гомогенізаторі з ручним керуванням з установкою шкали найменшого значення (Тізвце Теагог, Віозрес Ргодисів, Іпс., Вапевміе, ОК). Лізоцим (25 мг Зідта 17651, виділеного з білка курячих яєць) додавали до клітинної суспензії шляхом змішування металевим шпателем, і суспензію інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Суспензію охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, а потім обробляли ультразвуком на ультразвуковому генераторі Вгапзоп Зопійег 250 (два раунди по 1 хвилині, 50 95 черговий цикл, 30 95 вихід). Лізис клітин підтверджували за допомогою мікроскопії. При необхідності додавали 25 мг лізоциму, а потім інкубування і обробку ультразвуком повторювали. Після підтвердження лізису клітин під мікроскопом, лізат центрифугували при 11500 х д протягом 25 хвилин (4 "С) з отриманням осаду тілець включення (ІВ), і супернатант відкидали. Осад ІВ ресуспендували зі 100 мл буфера для лізису, гомогенізували в міксері з ручним керуванням і центрифугували як описано вище. Осад ІВ повторно промивали шляхом ресуспендування (в 50 мл буфера для

Зо лізису), гомогенізації, обробки ультразвуком і центрифугування доти, доки супернатант не ставав безбарвним, а осад ІВ твердим і не зовсім білим. Для кінцевогго промивання, осад ІВ ресуспендували в стерильно відфільтровуваній (на фільтрі 0,22 мкм) дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і центрифугували. Кінцевий осад ресуспендували в стерильно відфільтровуваній дистильованій воді, що містить 2 мМ ЕОТА, і зберігали у вигляді 1 мл-аліквот при -80 "С.

Аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, і кількісну оцінку білка в препаратах ІВ здійснювали шляхом відтавання 1 мл-аліквоти осаду ІВ і розведення 1:20 стерильно відфільтровуваною дистильованою водою. Потім розведений зразок кип'ятили з 4 х відновлюваним буфером для зразків (250 мМ тріс, рН 6,8, 4095 гліцерину (об/об), 0,4 95 бромфенолового синього (мас/об), 895 ДСН (мас/об) і 895 ДВ-меркаптоетанолу (об/об),| і завантажували на 4-20 95 тріс-гліцин МомехФ в гелі в ямку 1242 (Іпийгодеп), обробленому 1 х тріс/лліцин/ДСН-буфер (Віокад). Гель піддавали електрофорезу протягом 60 хвилин при 200 вольт, а потім забарвлювали кумасі синім (50 95 (3-250/50 95 В-250 в 45 95 металолі, 10 95 оцтовій кислоті), і знебарвлювали 7 95 оцтовою кислотою, 5 95 метанолом в дистильованій воді.

Кількісну оцінку смуг-мішеней здійснювали шляхом порівняння денситометиричних величин для смуг зі стандартними зразками альбуміну бичачої сироватки (В5А), проаналізованих на тому ж гелі для побудови стандартної кривої.

Солюбілізація тілець включення. б мл суспензії тілець включення Сту!їОа від клону Рі,

ОРІИБО центрифугували на мікроцентрифузі Еппендорфа моделі 5415С, встановленій на найвище значення (приблизно 14000 х 9), в результаті чого отримували осад тілець включення.

Супернатант буфера для зберігання видаляли і замінювали 25 мл 100 мМ натрійкарбонатного буфера, рН 11, в конічній 50 мл-пробірці. Тільця включення ресуспендували піпеткою і піддавали вихровому перемішуванню до отримання однорідної суміші. Пробірку поміщували на платформу, що повільно обертається, і залишали на ніч при 4 "С для екстракції білка-мішені.

Екстракт центрифугували при 30000 х уд протягом 30 хвилин при 4 "С, і отриманий супернатант

Б-кратно концентрували на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Атісоп ШОКга-15 (з відсічкою молекулярної маси 30000; МіїПроге). Буфер для зразків замінювали 10 мМ САРБЗ |З-(циклогексаміно)-1-пропансульфоновою кислотою), рН 10, з використанням одноразових колонок РО-10 (СЕ НеайнНсагеє, Різсаїаулау, МУ).

Солюбілізація білка тілець включення і їх активація трипсином. У деяких випадках, суспензію СтуїОа тілець включення від клону РІ, ОР'ІЯБО, центрифугували на мікроцентрифузі

Еппендорфа моделі 5415С, встановленій на найвище значення (приблизно 14000 х 9), в результаті чого отримували осад тілець включення. Супернатант буфера для зберігання видаляли і замінювали 100 мМ САРЗ5, рН 11, з отриманням білка, концентрація якого становила приблизно 50 мг/мл. Пробірку обертали при кімнатній температурі протягом трьох годин до повної солюбілізації білка. Потім додавали трипсин в рівних кількостях до 5 95 - 10 95 (мас. 95, по вихідній масі порошку ІВ) і здійснювали гідроліз шляхом інкубування при обертанні протягом ночі при 4 "С або обертанні протягом 90-120 хвилин при кімнатній температурі. Нерозчинний матеріал видаляли шляхом центрифугування при 10000 х д протягом 15 хвилин, і супернатант наносили на аніонообмінну колонку Мопоб (10 мм х 10 см). Активований білок Сгуїба елюювали (як було визначено за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН) 25 колонковими об'ємами 0-100 95 1М градієнта Масі. Фракції, що містять активований білок, об'єднували, і при необхідності, концентрували до менше ніж 10 мл на центрифугальному фільтруючому пристрої з регенерованою целюлозою Атісоп Ойга-15 як описано вище. Потім матеріал пропускали через колонку з Зирегаех 200 (16 мм х 60 см) в буфері, що містить 100 мМ масі, 10 95 гліцерину, 0,5 95 твіну-20 і 1 мМ ЕОТА. Аналіз, що проводиться за допомогою електрофорезу в ПААГ з

ДСН, показав, що активований (ферментативно зрізаний) білок елююється при 65-70 мл.

Фракції, що містять активований білок, збирали і концентрували на центрифугальному концентраторі як описано вище.

Гель-електрофорез. Препарати концентрованого білка отримували для проведення електрофорезу шляхом розведення 1:50 в буфері для зразків 05 МиРАСЕФ (Іпмігодеп), що містить 5 ММ ОТ як відновник, і нагрівали при 95 "С протягом 4 хвилин. Зразок завантажували на доріжки-дублікати з 4-12 95 гелем МиИРАСЕФ разом з п'ятьма ВЗА-стандартами в кількості від 0,2 мкг до 2 мкг/доріжка (для побудови стандартної кривої). Потім подавали напруження в 200 В з використанням буфера МОРЗ для електрофорезу з ДНО (Іпмігодеп) доти, доки барвник- "свідок" не досягав основи гелю. Гель забарвлювали 0,2 95 кумасі синім 5-250 в 45 95 метанолі, 10 95 оцтовій кислоті, і знебарвлювали спочатку шляхом швидкої обробки 45 95 металолом, 1095 оцтовою кислотою, а потім шляхом тривалої обробки 795 оцтовою кислотою, 5 95

Зо метанолом до появи прозорого фону. Після знебарвлення, (гель сканували на мультивізуалізаторі ВіокКай Рійог-5. Для отримання об'ємів забарвлених смуг білка з відніманням фону і для побудови стандартної кривої В5БА, яка була використана для обчислення концентрації химерного білка СтуїОра в маточному розчині, використовували комп'ютерну програму СОцапійу Опе 5оїмаге м.4.5.2.

Приклад 5

Отримання білків, що містять корові токсини Сту!Ра і Сту!Оба, і виділення мембранних везикул щіткової облямівки Бродоріега їидірегда для проведення експериментів по конкурентному зв'язуванню

У нижченаведених прикладах описана оцінка конкурентного зв'язування білків, що містять коровий токсин Сту!ї, з передбачуваними рецепторами в тканині кишечнику комахи. Було показано, що 7"25І-мічений білок, що містить коровий токсин Сту!Оа, зв'язується з високою афінністю з мембранними везикулами щіткової облямівки (ВВМУ), отриманими від Зродорієга їгтидірегда (совки трав'яної), і що білок, який містить коровий токсин Сту!Ра, не конкурує за зв'язування з цими везикулами.

Очищення білків Сгу. Ген, що кодує химерний білок Сту!Оа, експресувави в експресійному штамі Рзендотопах Пиогезсеп5 як описано в прикладі 4. Аналогічним чином, ген, що кодує химерний білок, який містить коровий токсин Сгу!Ра (603 амінокислоти) і протоксин СгтгутАБб (545 амінокислот), експресували в системі Рі. У випадку СгуїРа, експресійна плазміда була позначена ррАВ1817, а штам Р. Поогех5сеп5, що містить РОАВІ1817, був позначений ОРИ29.

Білки очищали методами, описаними в прикладі 4, і здійснювали гідроліз трипсином з отриманням активованих корових токсинів з повнорозмірних білків, а потім ці продукти очищали методами, описаними в прикладі 4. Препарати оброблених трипсином білків (що містять активований коровий токсин) мали чистоту 295 95, а їх молекулярна маса становила приблизно 65 кДа як було експериментально визначено за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ.

Використовуваний тут активований коровий токсин отриманий з білка Сгуїра, називається білком, що містить коровий токсин Сгу1!Оа, а активований коровий токсин, отриманий з білка

Стгуї1Ра, називається білком, що містить коровий токсин Стгуї1Ра.

Отримання і фракціонування солюбілізованих ВВМУ. Стандартні методи кількісної оцінки білка і електрофорезу в поліакриламідному гелі з ДСН проводили як описано, наприклад, в бо посібнику Затрьгоок еї а. (1989) і Аизибеї еї аї. (1995), і в більш пізніх виданнях.

Личинки 5. їидірегаа в останній віковій стадії витримували в умовах голодування протягом ночі, а потім, після охолоджування на льоду протягом 15 хвилин, розкривали. Тканину середньої частини кишечнику видаляли з порожнини тіла, а задню частину кишечнику залишали приєднаною до покривного шару. Середню частину кишечнику вміщували в 9 х об'єм охолодженого льодом гомогенізуючого буфера (300 мМ маніт, 5 мМ ЕСТА, 17 мМ основи тріс, рН 7,5), в який була додана суміш інгібіторів протеази (Зідта-Аїадгіспй Р-2714), розведена відповідно до рекомендації постачальників. Тканину гомогенізували 15-а імпульсами, що подаються скляним гомогенізатором тканини. ВВММ отримували методом МасСІіг-преципітації, описаним М/о(Гегерегдег (1993). Коротко, рівний об'єм 24 мМ розчину МаоСі» в 300 мМ маніту змішували з гомогенатом, виділеним з середньої частини кишки, перемішували протягом 5 хвилин і залишали на льоду на 15 хвилин. Розчин центрифугували при 2500 х 9 протягом 15 хвилин при 40 "С. Супернатант зберігали, і осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5 х розведеного гомогенізуючого буфера, а потім знову центрифугували. Два супернатанти об'єднували і центрифугували при 27000 х д протягом 30 хвилин при 4 "С з отриманням Фракції

ВВМУ. Осад суспендували в буфері для зберігання ВВММ (10 мМ НЕРЕ5, 130 мМ КСІ, 10 95 гліцерин, рН 7,4) до отримання концентрації білка приблизно 3 мг/мл. Концентрацію білка визначали з використанням альбуміну бичачої сироватки (В5А) як стандарт. Визначення рівня лужної фосфатази (ферменту-маркера для фракції ВВМУ) проводили до заморожування зразків з використанням набору для аналізу лужний фосфатази ОцчапіСнгот"м БАГР-250 (Сепаийг

МоїІесшіаг Ргодисіє5, Катреппоцші, ВЕ) відповідно до інструкцій виробників. Питома активність цього ферменту звичайно зростала в 7 разів в порівнянні з активністю, що виявляється у вихідній фракції гомогенату середньої частини кишки. ВВММ розділяли на зразки-аліквоти по 250 мкл, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 "С.

Електрофорез. Аналіз білків за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ проводили у відновних умовах (тобто, в 5 95 В-меркаптоетанолі, ВМЕ) і в денатуруючих умовах (тобто, при нагріванні протягом 5 хвилин, при 90 "С в присутності 2 95 ДСН). Білки завантажували на ямку з 4-20 95 тріс-гліциновим поліакриламідним гелем (ВіоКай; Негсшіез, СА) і розділяли під напругою 200 вольт протягом 60 хвилин. Смуги білка детектували шляхом фарбування кумасі діамантовим блакитним К-250 (ВіоКкад) протягом однієї години, і знебарвлювали розчином 5 95

Зо метанолу в 7 95 оцтовій кислоті. Гелі візуалізували і аналізували на візуалізаторі Віобай Рійго-5

Мийні Ітадег"м. Відносні молекулярні маси смуг білка визначали шляхом порівняння з рухливістю білків з відомою молекулярною масою, що спостерігаються в зразку ледера білка

ВепспМагк "м (І Те Тесппоїодіє5х, КосКміПе, МО), завантаженого на одну ямку гелю.

Йодування білка, що містить коровий токсин Сгу!ба. Очищений білок, що містить коровий токсин Сту1!ба, піддавали реакції йодування з використанням йодуючих сфер Ріегсе Іодіпайоп

Веаа5 (Тпепто Рі5пег Зсіепійіс, Косктога, І). Коротко, дві йодуючі сфери два рази промивали 500 мкл РВ5 (20 мМ фосфат натрію, 0,15 М масі, рН7,5), і вміщували в центрифугальну 1,5 мл- пробірку, що містить 100 мкл РВ5. Потім додавали 0,5 мКі "25І-міченого йодиду натрію, після чого компоненти залишали для реакції на 5 хвилин при кімнатній температурі, а потім до розчину додавали 1 мкг білка, що містить коровий токсин Сту1ба, і суміш залишали для реакції ще на 3-5 хвилин. Реакцію завершували шляхом піпетування розчину з йодуючих сфер і наносили на центрифугальну колонку 2еба "м (Іпмігодеп), урівноважену в 50 мМ САРБ, рН 10,0, 1 мМ ОТ (дитіотреїтол), 1 мМ ЕОТА і 5 95 гліцерині. Йодуючі сфери два рази промивали 10 мкл

РВ5З і промивальний розчин також наносили на знесолювальну колонку 2ера "м, Радіоактивний розчин елюювали з центрифугальної колонки шляхом центрифугування при 1000 х у протягом 2 хвилин. Потім, білок, що містить коровий токсин Стгу1ба і мічену радіоактивну "2»І, діалізували проти 50 мМ САРБ, рН 10,0,1 ммоОТТтТ, 1 мм ЕОТА і 5 95 гліцерину.

Візуалізація. Нерадіоактивний йодований білок, що містить коровий токсин Стгу1Бра, визначали за допомогою електрофорезу в ДСН-ПААГ і візуалізації рлуоресцентним методом.

Коротко, ДСН-ПААГ-гелі сушили з використанням апарату для сушіння гелю ВіоКай відповідно до інструкцій виробників. Осушені гелі візуалізували шляхом їх загортання в плівку МуїЇаг (товщиною в 12 мкм) і експонування під флуоресціюючим екраном з накопиченням Моїесшаг

Оупатісх (35 см х 43 см) протягом 1 години. Планшети виявляли за допомогою флуоресцентного візуалізатора МоЇІесшаг Юупатіс5 5іопт 820, і зображення аналізували за допомогою комп'ютерної програми ІтадеОцапі м,

Приклад 6

Зв'язування 725І-міченого білка, що містить коровий токсин Сту!ї, з ВВММ від Зродоріега

Тгидірегда

З метою визначення оптимальної кількості білка ВВММ для його використання в аналізах на бо зв'язування з білками, що містять корові токсини Стуїба і Сгу!Ра, будували криву насичення.

0,5 нМ "25І-міченого білка, що містить коровий токсин Сгу!, інкубували протягом 1 години при 28 "С в буфері для зв'язування (8 мМ МанНрРох, 2 мМ КНеРо»х, 150 мМ масі, 0,1 95 ВБА, рН7,4) з білком ВВМУ в кількості, що складає від 0 мкг/мл до 500 мкг/мл (загальний об'єм 0,5 мл). 125І- мічений білок, що містить коровий токсин Сгу! і зв'язаний з біллами ВВМУ, відділяли від незв'язаної фракції шляхом взяття зразків 150 мкл реакційної суміші з трьома повторностями, які вміщували в окремі центрифугальні 1,5 мл-пробірки і центрифугували при 14000 х 4д протягом 8 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант обережно видаляли, і осад три рази промивали охолодженим льодом буфером для зв'язування. Дно центрифугальної пробірки, що містить осад, відрізали, вміщували в скляну пробірку для культивування розміром 13 х 75 мм, і кожний зразок підраховували протягом 5 хвилин в гамма-лічильнику. Потім будували графік залежності СРМ (число імпульсів в хвилину) мінус фоновий СРМ (за відсутності реакції з білком

ВВММУ) від концентрації білка ВВМУ. Крім того, відповідно до результатів, отриманих в іншому аналізі (І о еї аї., 1999) оптимальна концентрація білка ВВМУ, що використовується в аналізах на зв'язування, становила 150 мкг/мл.

Приклад 7

Аналізи на конкурентне зв'язування ВВММ від 5. їгидірегда з білками, що містять корові токсини Сту1ба і Сту1гРа

Аналізи на гомологічне і гетерологічне конкурентне зв'язування проводили з використанням 150 мкг/мл білка ВВММ 5. їШидірегда і 0,5 нМ 725І-міченого білка, що містить коровий токсин

СтуїОа. До реакційної суміші додавали конкурентний нерадіоактивний білок, що містить коровий токсин СтуїРа, в концентраціях від 0,045 нМ до 1000 нМ, і одночасно додавали радіоактивний білок, що містить коровий токсин Сту1ба, для гарантії істинного конкурентного зв'язування. Інкубування проводили протягом 1 години при 28 "С і вимірювали кількість 125І- міченого білка, що містить коровий токсин Сту1ба і зв'язаного з ВВММ (специфічно зв'язаного) як описано вище. Неспецифічне зв'язування виражали як величину, отриману в присутності 1000 НМ нерадіоактивного білка, що містить коровий токсин Сту!ЮОа. 100 95-е загальне зв'язування розглядається як кількість зв'язування за відсутності якого-небудь конкурентно зв'язаного білка, що містить коровий токсин СгуїГа.

У аналізах на зв'язування з рецептором, що проводяться з використанням 7"22І-міченого білка, що містить коровий токсин Сту!Ора, визначали здатність білка, який містить коровий токсин Стуї1Ра, витісняти цей радіоактивно мічений ліганд з його сайту зв'язування з ВВММ від 5. їпидірегаа. Результати показали, що білок, який містить коровий токсин Сгуї1Ра, не витісняв зв'язаний 125|І-мічений білок, що містить коровий токсин Сгу1ба, з його рецепторного(их) білка(ів) при концентрації до 1000 нМ (при концентрації, яка в 2000 разів перевищувала концентрацію радіоактивного зв'язувального ліганду). Як і передбачалося, немічений білок, що містить коровий токсин Стгу1ба, мав здатність витісняти радіоактивно мічений білок, що містить коровий токсин Сту1!Оа, з його білка(ів), що зв'язується(ються), на що вказувала сигмоїдальна крива доза-відповідь, де 50 95-е витіснення відбувалося при 5 НМ.

Таким чином, було показано, що білок, який містить коровий токсин Сту1!Оа, взаємодіє з сайтом зв'язування ВВММУ 5. Іпидірегда, який не зв'язується з білком, що містить коровий токсин

Стутга.

Джерела інформації:

Еіппеу, 0.9. 1971. Ргорії апаїузів. Сатргіддає Опімегейу Ргевз5, Епаїапа.

Ниа, п., Ї. Мавзоп, у). Г. Уига!-Риепієв, С. Зспмар, апа М. у. Адапо. Віпаїпуд апаїузев ої

Васив ІПигіпдієпвів Сту а-епдоїохіпе ивіпа бги5и рогаєг тетбргапе мевзісіє5 ої О5ігіпіа пибіваїв.

Арріїєа апа Епмігоптепіа! Місгтобіоіоду 67121, 872-879. 2001.

Ї еОга бЗоймаге. 1987. РОЇ О-РС. А изег диїде (о ргобії апа Іодії апаїузіз. Вегкеїеу, СА.

МесСацоанеу, МУ. Н., Б. Сбюоцій, апа МУ. Стів. Ві гезібїапсе тападетепі. Майшге

Віотесппо!оду 16121, 144-146. 1998

Магсоп, Р.ВА.Са.С., 1.9. Мошпо, К. 5іеїеу, апа В.О. зЗівднівад. 1999. Вазеїїпе зизсеріїбіїйу ої Ше

Ейгтореап сот бБогег, О5ігіпіа пибіїіаії5 (Нибпег) (І ерідорієга: Ругаїїдає) ю Васйив іигіпдіепвів їохіп5. У. Есоп. Епіотої. 92 (2): 280-285.

Вобрегізоп, І..). апа Н.К. Ргєїзівсг. 1992. Резіїсіде Біоаззау5 м/ййп аппгородз. САС Ргезв, Воса

Вапюгп, БІ.

ЗА5 Іпзійше Іпс. 1988. 5А5 ргоседигез дціде, ВНеІеазе 6.03 еайіоп. АБ Іпвійціе Іпс, Сагу, МО. зіопе, В.Е. 1968. А їТогтшіа їог аеїгептіпіпд дедгееє ої дотіпапсе іп сазе5 ої топогасіогіа! іпнепапсе ої гезізіапсе о спетісаї!в5. Ви. МУНО 38:325-329.

Мап МепПаєегт!і, Н., У. Вонегтап, 9. Мап Кіеє, апа Н. доо5. Тгапздепіс ріапів Ттог (Пе ргемепійоп ої демеіортепі ої іпзесів гевівїапі о Васіїи5 Іигіпдієпвів їохіп5. (Ріапі Сепеїіїс Зувієт5 М.У., Ве/д. (510) 89-401499І400246), 57-19901205. ЕР. 5-31-1989.

дедаток А

Список дельпьсендетоксинів Стіоктзоге сі ві, хуеб-сайт (вказаний в заяву

Реєстраційний номер для дастуду во чСВі

Назва Реєстр. Ме Авт Віко 0 бВівведжерело Коментарі їлтідйві АЛАІЗІІ бойлер ві І9ЖЯ 0 Б косу НІ

Сава ВААОІУВ ЗВІВВВО гі ві 1955 Вбехоно

Сіла) ВАЛОВІЯТ Бвіннха сі ві ТОЩЯ БИ віхауві ІРТУ

Стідна СААЛІЕНО Мазноя сі ці 19ЖО 0 Би етос ув

СМІАВІ ВААС івуввийуав Ві 1994 ВИ Бц-аУу шов я ИНА ! па ВЕН МК

СтлЧАзБ АЛАКОІБХ Махов ев І9Я а і стуійа? ААТМКЛ9 Охмнан сі ві зНню ВНЗ гСчездав 4 їлю 1995 тільки песлідовніисть ДНЕ оз де - щу ж депо іптих

СлхідвО ВАЗІ Меса сі ві 1509 Веде і опиня що З гляді що. я вет К - я ВЕ кіш НІМ.

Селі ЗАЗ О Нове Свей 1559 в

Сі СААЛОВО Тор сеї зі 9930 ВЕ жнив стілі ААРТОЇЯО во ві Кк шщіхю спі ААМАНОХ МвВолпе ві ві ЖН біхоце сі Я ААРНЮЗ Кеті ві ЗО 0 меспубликован іїчуіАВі5 ААУБОЗІУ Мавка сві а 0 ВечТА Макіз

СТпТІіАВІ лАА2ІЮ авкосеві І5Я6 Ві бепійеє 1715

СТАВІ АЛАВІЗ ТПкуче ві ві 1985 Ви киривк:

СМІЛА АААНЬ СОквегеї ві ІН 0 Ве аняено НОМ

СеіА ВААОЖРї Кововесні 987 0 Виоехів НГ

СА СААКЮЯ Нопеег зві Же Вібегност 1715 сила в ; ск ті ВЕК ВКОХ

Срідрв АААОЗЮЮ Нейбейеєві 987 з

Сів? СААЗОД Нація Я ЕПаг ТОВЖ Ві візаж ЦІ

Сі АВЕ АААІВІ Обів сів 1987 Відтжеж РІО їчхі АВ СААЗЯТЬ Сак Ж лев 1993 РеарауаиНО3З

С 1АВМО АОТХУ Евсвбой ев 1987 Викизаю НОЇ сміАни ПМІ15 ЕК Ж Пров 95 ВЕАзО тількм постіновніть ДНЕ сі АВ ААСеННІІ Біев-уенюскесві 1995 Векузакі де

СІ АВІЗ ААННЯОЯ Тан сі ві ММ Щек що щи сезкізлю ЛИС ИВАНВМКО АТО кт ке ,

Смідві дай КК Мацує Свпсва ВІ - ТвВеншіох

СТАВ ААСІЗНІЯ Шев ЩКИ 0 БбеВ-Нв15 су1АВіБ АК ЯВ Уві ві МО ТАС

СтійсоІ? БІБ17ЯЯ7 0Сюав Ропреї ві МНЮ оВіТнмЯ ів Се СНІ, зареєстр. 09 липня сехі ле АСМЯИОУ ії ві ще ВІЗ

СТАНІ АААЛІЗЮ Бенеїхой 193 Ве вів РА сті СААТГЕВО Авпопупюца 1995 ВЕРБКІКВІ сій Аа есе Аптвов КИ Вевісхі

ГУРіАЙ ААБВЕТЯЄ Кава еі 1997 Ти МтО453

СіАН ААТМОЗ? Мидвівіх 1599

Сівіаві ААСИЯХе Тапесві Ка сіла АВТО сиві ві МУ В аю

СА ААСОЗНЛО Же ві Ну зош ААКІЖИО Месевййвіа ері 00 БИ Китваів вас невжзмаменх

Банні | й Й , ТОК НКТЬ

СеіВВі СААСОВОЮ Впххамі 2 УВИвісх 1988 Ви двосіввісвн сіхіВаО СААБЯЮІ Босівсн троє Б евіотосівюв нин і ЩО І6 су ва ААКОВІ Явапоесег а КИ

Стів ЛАКЗЦВЯ Мафапея МЮгорроюв

Сіх)Вах: АВОММНОЇ опр ві 2007 Вівйх-12

СтІВай АВ? Манів» і ві 2006 ВЕК

СІВ АЛЛА БРюпоуви «г Ві їч94 ОВЕЕСаХЯ; жів! САлнезея Ввворег ві 1994 Веюютіові чити куда зхиляки члля ВЯ жУНіНВепВіх ха ААБВІНЮВОСЇ Кибегві КО ноя їжі» ААМОЗ4О6 зкоха сені 202 ВЕБ їчуіВеі ААСЗІВМІ Гатне ев НЮХ ВЕРКІЗВСО

Стів ААОЮЗВТ Ват ві З стуіВе3 БРАТ? 0 Хіодсле бовеїваі 2009 В МЕ МОВІ, зареєстр. 99 якштня

СІВ САЄМКТВ Атиенбегві 2 сів: ААСОБЗВО Ваши ві 200

Стів ААСЗОО вве вві ЗК

СУОВІ СААЗОТОЄ Нопевег ві одя ВЕ спкнтююкіюв

М 05 сісяі СА запоВіх егі 1І9ЖО Віва 7.29 сія) АААЛІІЛЯЯЇ Беневов КМ Вівіхахві РУВИ

СІІСВа САЛОІВЯБ увя Мейценсєві 1990 б спвилосібов

НЕНІЮ їлзісСа5 СААбБЯУ бирвох іа Ві візаві 7.2 їххісСна ААБЕЛЯ Увег ві МКК ВЕАБО

ТхуісС ААСЯІВ Аїхте ев ЯКО ВК біс ААМООЗЯ сСвепеяі КН п

СтісСвУ ААГООЗУВІ Кові І ООН А су СО ААМІБЯОЮ Цівецв 5 ВЕ БО 20а стісві ААХУООА Свев я що слі АВТ ААТНЯІЇ Назве ев за гЕУВО сажі АВіх ААОНЕОЯЯ мобіво се ві КА В

Сі АВ ААУ Жівютесє ві 005 ВЕХ-З сеіАВБЮАВВІЯВО іс збе ВвеоОв сажі ЗР АНЯ Бхуіесіска гі ві МЕ ВеІБЗахе (зі АВІІ АВУУВТІОО Хув вий Келе ЗЮЕ ВІяМОТАВ

Се пз де що ще ши пух зрчул НЕВНЛНИЧеНЯ

КК ААКІЯЮ Мадалийамистья СО Бекона КХЯЯ снідовтть

СТЖІАВ у кукі НК гол с рн тваза УЮ НеБИЗНВНОМУ ен е ААКІЯІ37 Масаивімаеїві 0 Вікова ВХОЯ ПОШй

НКе ій послідовність

Схід. узято хі по со ядяї знову івояо тим невианцов: пи ААКІЯІЗ Малаві вія КН ОО ВЕ канав КК пененнчевя ке й послідовність

СА проаачня ; р столі евкачени пит АВОЖНЕХВ спе ві щюе Ор 4а свнзкачена ке Й посліднанть сту! ас АААЖМІ Адави сі ві Іза БЕ Кавізю НОТІ

СижіАсі АААЗІЗЗЕ Мов Гете гі ві 191 В кепуєе сСхіАсі СААНООЯ Гмнаевпнпе сі ді Із Ві БТчАвА й щу й ВЕ жеветаюі стій АЛЛА? Бенеівов ЯЗ довело сій АААТН Бенеівов чі реве , й й гц Ві кКшхві сік ААУ Бенефов мор

Ах й ВВ щ й пстих що зи В Кимаю МАЮ.

Сщпілоб АЛАЖВОб Маєхоп вію 1994 їй сСіхідс? ААВЯБОХО Немеока гі ві ТЯ Вгкненаю НОЗІ схід ААСЯЯВЯ: Овоо ві ві НУ 0 Ве кнаю НОТІ

СУіАСО ААБВЯОІК Оігаує ст я! 92 МА Т3У моз з я при де ВЕК УВТ-

Сі АС САДОВО бив 197 кА пн 1520 що й для МіаКіНОВт АК ще

Седасі! САТ МаКвдост Х 1998

ЕХ Вів тика поеніловенев МН й шк й нй - А, Й плькя поснідовкнсть ДНЕ стіАНЯ ОВ Еїу Ж Зроейї 1Ч95 ВЕ АЗО

СтідсіЗ ААПЗКЛОІ сна сі ві ПО ВИ ик НО схіАсіЯ АСК? Уво гаї З ОВвеІюЮ сажі АсіВ ААМЕ ЯК Тевпи ей ві ЯК ВЕ бот Гаржай

Сяхійсіб ААШЕТОЗТ Жвво є ві щю5 ВНЗ

Ті Аві7 ААХІЮН ОО Ніго ві ві 25 Би Кепуве НІЗЗЯ5

Тл Асі ААЖВНІЯУ Как АНат 2005 ВЕБ5К-АТІЗ

Ствідсія АВОЗ7О5І Саосї ві ю5 Вес-3 сижіАЛеоО АБВЕНМО Тввоез ві 5 слжідесі ААХОБУЗИ бвикаст ві 8005 ІМ ТА Мові стій АВЯНЯУЗО Жвапи ок Баде да ВУ ЗА

Сткійно3 САМІ Казпувр «і ві 200 в

СтуідсаЯ АВІОЇХ3 Агро ст ві ЩЮЖ ВЕ 14618

СтуїАс25 БІЗІЗ33Я 0 Єпит Реве ді МЮЖО Вт МЕМСВІ, зареєстр. 09 лвиня

СлутАсоб ВІБІЕМЮ бова гелю сі ві 2 Вт -4 МЕ МСВІ, хзароєсту, 9 знпня стісві Метаво Квіт сі ві 19293 Вевийснае НО офльки послідсвність ДНЕ

СіСВ А ДОЗОЮ» опе ві ві як Деві

Сі АСОЗОНЯ Низ ев! ОК ВІВ?

ЧУ Се загканої ІВЕВОНАХННОВИ ОЇ дадеоотурея дея недостатня теж ААХОІЮ ді і з ЩщООВЕТАЯНАЇ песлелювність

Сеуібві СААЛНВО Нойсегці 1990 Біда НОВ Ос. бе но щи й що ; тіки посдмювнють ДНК

Секібно пеЗ15 Ватпе Я БСК. 197

СХ1ОВі СААКОЯЯ ідей іч ВТОМА

СреіБа ААКАВЯ? 14 ЯКНО ВІВ е

Ст кі АВКТММЯ феспжніуавжово о аю ВСІ сиУіКаі САААМЯХ Уретеєві 1990 ВеБопуве І

Сіно СААЛОВОЮ Бозі ві 19 ВЕКевуве бчхіБщі ААУ Бенеков 199 Би Келуєа РЗВІЄ моз кітч Вибр іннова 055 ВЕ Кепуве СТУ

Сів аАПОУІ ТО дою М

Й І що | що тільки посла внсть ДНК су цай ІІ Войсулао а ії

СаіКаб ААТБОЗЮ опе а і ву

Стіва? АТО Нивнве ві ві мю5 во

СтіБая АВХІОЯЯ Низ ві 7 ВЕНжМО скоз хх ся па ; Бі діхжхі

СЖІКБІ АААІЗЯЄ Бенаіво 93 де

СУіКБІ АААОЯЕ Беневов 1993 РЧВІА? вози ди й ЕІ піхауві пі! ДААІЯВ ЄСватіжея і з З чини їчУївяї АААЗІЗЯВ сСватоегв сі ві 159 роб сСтуіїкаа АААЛІЯТ Бейвівов 1593 решета РЕМ

СТУЇКБІ СААВЯ їатрей 1593 ВЕВБ'ТКОЛЬЮА оз жя зх ст ж щу хна Вбопо сСттіЕВО ВААОЯОЯ Машка б Аве ОХ ї їМаАЄ?

СУФіКВ3 ААУ Бопреє ві ЗК 0 Ві тогасві ситівва ААСІОВЯА) Ратпеег ві 397

СухівВ: ВАСІ іс ММ ВЕВ-О-ЯВ счу1БВа АСОМКОХ Нивпееє ві з вето сту; АСОНЕКОХ Ніиеега! МН Вве08?

СУТ! САМОЮ Бавбей 3 в НТеОЗаЗА

СУужіая СААЧВОБ о Бвпетеівех г ві 1957 Де УМВавенвів

Арт газ я и по 0 В Унввеев ій

СІМІЦЬ ААУ: Коза Свак 99 срок.

СЮРЄВО ААСІЗІК їлегві хо веВ-векй

СжЖНю АаАСБІМІ Вантеї ві щю сінях! СААВОЮЬ Гзювей 1593 ВЕВТБОМВОАА

Бої ще щ ; лок ВЕ ВІОБщОВІ

КЕ ха тай те ВК гу КК

СН лвААТО Козеа 1995 вЕТов

СТУ. засво : ід; сах ри нентатуа зе АлАТ дпічвеїаві і вОСз ИН

НК ПОСЛІДОВНІ

Сеаві СААЯаю Тайстеєв 1992 ВЕкКогн

Се вААМАУМ сСісвує сг ві 1595 ТЕ киенаю

СВІ ААУ Ве 95 ВЕ Кана НЕ сЖаа ААВЖюЮВЕ Жоесвка с я 19а Б АВЕВ

СиЖі СААЛОІМЯ беіуарайцтува реа ве сумна ААЄВеІ ЖВопо в зі іо Бека 510

СР ца ААМ'ТУІо Роше МО Ві стуцях ААКеаМО Бепесі ві 2

Сеії85 ААсСЮМеВ Звосраі Ме НЕ

СІжі8ід ААРВБОКО Екрііюв ої щі МЮУ Ве ввевнія

СИ САСКУЧОЯ Тов сі ві ММ Ре каюнакю МБО сів ЗАМ сСтожідЧебвсебві Мю5 В

Стуцвії АВЕВЗ2ЯЗ Мепівя ві хі 06 Ві свя АСВ бл сн в НІНУ

Ст НаіХ БІБІ7ЯЄХ Оезатевусюяі 2009 ВЕБ О 0/ЛО МОВ, зароєєтр. 09 лвтня слу еіб БЕБРЛЯЯВ 0 Созабепу сві Ям ВЕБ А МЕМСВІ, зареєсхр. 09 вип

Сей АААВНЯ Вщпеві тоя Ві емотоскіа

АТАКУ виз

Сяу Б АВУВЖО1О співа ві ві кл ВвІБВаАї сажі АСТЮВХІЯ ль бо 20 ВЕС

СІК ААСеюмла Овтвщі сві 998 ви їчжіКа ААБЕТІВЗІ бвтав є ві ВАНН

Се вар Зев Єва здо

Стхіві ААСЯЗУ»6 ов есяі ЯКО ВЕТО

СНИ ААОВОЗВО Ввоте а зпОЗ

СТУП НБе ААСЗІОЮЯ Раудесє ві юЮВ нелостирня послідовність сік АВС 135 Евви Юе НуЯаЗ недястетня послідавніть

СІ АААЗІЯ бювпоуза ї5б4 ВЕБСЯКЯ?

Спів: оАлАОрохо ба ень й 1994 ВЕЕО50ОЮ2

ВАН сЗопхнех сп ААЄЗНИЮ Раупте ві 19УК с АЗОВ Ваше ві сю сі САС Ап аі ЩО

СрЗІКАІ ААВОЮІТ. Коосіві тю5 о вр

Ст яії ААБОеНЗ і еегві ЗО 0 Ві дняеак КІ

Су цк ААСЗНЮ Раупе сі ві 199К невовтатня пестдовність

Страва аАлАЯІЯАЯХ Бюпоуаи сеї ві «(БО ВІ Китаю

Сула АААВІМБ Узбостй ЖУвВисіву 1589 ВИ Коочакюі НОЇ (хуйдеї НЕБУ Канакі сг ві ОТ В вом титьки воспідненість ДНК

Сайдай АСОМ Міс ві ві ОО ВЕ кепуве НІЗХЯЮ

Срлава СААТОВУї Ув Ж Радо юри БРЗо сездав СААЮЄТ ув й рапо Ід ОВЕжВЛІ ста СААНЕВЯВ ть Ж Рапе 195945 ОВіСУзО

СУА аВ ААСТІТЯ уві ев МЩНЮ ТИ Бювпебе 00

Стлаво ААОІІІЯО Увопеег а 2000 спол дАСММОвІ Увоєгві ва

СТАВІ АЛЛО Ван єї ві ЮЗ сива АБВІШОТЬ о Тав сі ві аю Краю

СЛАВІЯ АВІЛНЯЗО Атапро сі і ЮК ВЕ зЯАе|УВЯИ сор Я АСРЕОУЯЯ Ние еі ві КАС З НЕТ

СА АААІАЗЯХ Уніпег й Жвнеїу 190 0 Веде НО

СТУЗАНІ СААМНИЯ Банкосек ес зі 1990 ВИ Кота НОЗІ

СА ААСЛАТея Свевеї ві юФ в ВТС су ААСНІООЮ Її яі МК ОО ВІ ВАрр-8В

СУА ААСНВОЮ Узо- ві ВОЮ

СТАВ ААРІОВЯТ ЗМапе ока 3 Ву? сІхаАнНІ ААОВІЯ? ібзувховуви ві ні З0О0Я ВЕ Я»і

СУА АСОМ Ниви і ді юне ВІхУНО їз АБСТАНУ ване і як во

СЕЛА ЕБІ5736 за еаї щю ВхО

ГУ АВІЇ САМНЯ75 Бнісев сеї ві 27 ВЕСМЕНАВТІ

СТУдАВІЗ АВМІ1764 тівеєві щі ХО

СеЗАВІЗ АСОТВІОО са ві ЮК ВИ ухе3-4 стання СОЛІ Жага Я Ві Ве сс САН Аптхов ІК Ві явпанвва 5

СААСИ ААСЗЯЯНЬ Бонпе сг ві 2

СІЛА кІ ААОЗІМВХ Валя ві ві МН сутадкі АСОМ Нвяпр ог ві 20 ВЕ УВО їзелАс3 АВС івпосеє в 2005

Стжадсв АВЄТАТ3 Хівегві ЗОМ ВЕ злвавення

СлУаАві САРІ баівєвег ві юки БАБА

СТУІАЄВ САМ0ОЮЗОХ Часи вія ЗО? ВЕСМВІ-ВТІ

СчУлАвО САМО) Бвіеет і ві з? ВвЕЄМНІ-НТО сло АВМІЗІЯ Ва ві ЩІ вт

СА САМЕЗНЯХ Хзіет її ві щМЮ? ВЕНГКО

СтрАгІЗ САМБО бваісст ес ві щЮ ВсМВі-вІЗ

СухоАЯІ ААБООЯНІ Са ві інею ве:вК3о саудаЯча АВСВачИ? Низок сі ві ще ВЕУ

Сеча і САКОЗЮЯ віестеєні 006 ОВ 5 АК

СІЛА САМИМ Ввісст єв! ет вемагВтО сажі САСУКТУ баісстеє ві Зк ВвеНнОозо суулакі ААОЗОНІ Ват ві 2003

СУА АВОЗОХ1З Веякі ев) мк СЕ сек АСНОАТО носа 5 ОВЕрОЗ

СтузАВ БОВІЯ55 Хвапу сі ві ЮК В Ме МСВІ, зпреєстр. 09 липня

Се аВа АСВ вав ві щюе вЕВКС-ЯСНА

СтуєА: БРГ/ЯВаКХ Обаувимоувл о і 2009 ВІ НЕ МСВІ, зареєстр. ПО пня

Сіжіяазі АДАМА Неппхай в ві ЇЗЖ? БівввШево стей АлЛАЛОВЯІ Зекаге ві 19? Ви епевгника

СтеузАаю СААВЖАВІ Нойвеегзі що суда Аа Мервевой сі а 1958 0 ЕН евеОгемих щокою сдлкк в зол ЕМО ЕОМ туда АААМОВВ Бювоуза в ві ТОщА З ох най

МЕ вОлІіяя

Стузаяв АСВ Айва в 944 0 ВЕ евевнова

СтоаАЯ! САНЯ ХБавее я! КО що

Ста ААЗМЯКУ Ово ві Св зО0Я ВЕУ

СУА ААМЖОБВ Вова Єва ОКО ВЕК

СТАВІВ ААРОН Свевеєві НМ р ЕМа дод пулачея що чис ВІ ТЕПеВИОТ

Спа ААМЯОКТІ Киеві КОЮ т іспевліє В панни КУ сті АБУ беж є ді 2005 би епевиові: сова СААЗЯЗКУ ВЕК ві БК ВИ Юре Я сови ЄАМИКМУ Ребтосв о ві ЩО ЕЕ ВОБІОВ

СІВ АААЗЯ Вювотви ві іа ЕЕ вЕСечаї

СТАВ ААДАКНОЯ Бювоуви я ві я ЕС й | Ша

СтЯВЬІ 113475 Рейтопсг ві 1505 тівьки послідевність ДНК вояк у діт; - ВН Есенакі ставі САлЛЯОЗ Гатіен я ві 1995 ти миня І й вшоое

Сід САЛевеКя уві Ж ЕН 1957 Ві івхасівювіх щ , . іще ; змо Ві ївгавівнвіх сСечвава ВААФИ Бевог ві 1ЗК

ТИН нОохо

Стеїйяі САРЕННЯВ Бетхуєві ОК ОВ іхучеі ех

СУА: хи я Ян хе чІчУК з кН сеомлихеи п : ее ААХЗАЗЖІ Манів са ДЕ ООВЦОСЯ недествня посніввіть мА пня Зокохлдяія МИНУС Аі М сов 0 ВБИВ

СтЯВаІ СААЗНВІЯ СИДНОРОРСВА Є рдуу З НаКТете

НА НЖМ зі Ота соб СААМНІЯ ТепоруаічОкоі еєві РУЯК Ву іувеієвее їжі аАААРЯ? Уаптианюв ее ві ІК РИ ішевеїетвів яка яти ще зас ВИ ВЕВеВИХіВ

Спявні ВААООІВ Яепеі ві розу бле шин Ноя ст Вях САСНЮОЯ Вепу є ві 2003 0 ВЕ ікраеіеввіх ке АВСЯБаБ Манвівкеїння я МЕ щІЇЛюЮО неластатня послідовить пВке

Севсві БОБ Чввегі зе ММС, запеветр. СО пи -« их МКК Кк жи хї Я У ді її хо ху Є даже що М

СЯСВІ БІОЗІОЮ Лю б Було Зої овеняіВ МС, зареєєть, 09 лекня

СтуЯСВО БІХО7623 0 Зни й; ерове ООВЯ ОВ усі МБ МОВ, зареєстр» ФУ яння

СУС БІОЇО? Лов Богоме пООХ вІМеоя 0 МБМСВІ, звреєтр. 0 ання зок сита : , дія ВИ Звризави и хія

СУЛА ААЛЕТОЯЇ Матв ев НН ок 17 скл хі ери , звенху Ві йвгпаивоЇсв вх

УМАНІ АлАТ Махетв віщі ТО бе: ро і

Усні

Тула ПЗ Рауве хі ві НА тільки послізовність ДИК

УЗА АВОНООВ? Тепанестві МН ВІЛ еЄ

ТУСВВЕ АЗАБЯЗОХ Бопсетців Я Маген 1997 ВЕ ВБВЕС

Стуса АВХУВНЯХІ Стос ві ЯКЕ ВТІК

СУбаві АВАЛОЗЯ? Мигуже ві 1593 и в55Аї

Сови ААМЯОНЯЮ Ваегві МІ УВТІІВ со АВНОМВУ? Насга ще ВЕЗаІ В

СНИ АААІІяВ Магха г ві ІЧ: ВЕРЯБЧУГИ сті А АЛЯКТ Опція сну ВН ваНемає

Са АЛАМЯВІ Гапібеп в я 1992 ваших

СТАВІ АААЗІМЮ Магун 5 Би ІЧО4 Вгдавна НОЯ

СУА АЛАЛІІЗІ Магув Ж Бу То ех чиальмовивів

СЛАВІ АВХОЯЯО2 Кове ві ві МюЮЯ ВЕК о

СтуТАВА ВИЗЩОЄЯ Яви МюВ Ві М МСВІ, зареєстр. 09 днини

СТАВІ АВХТЗУВІ Авайте Агов сі ві ЗО0Х - вютанеу СМ.

СТАВ АС Севееєві ма ВеЕнНОО ши й

УТА? БІЮЯОТ76 хар ві мхю Ж МЕТИ, зарюсотр, Ю зилня

СтУТАВА СПІЯЗМН Безо йре 2009 МеМЄВЬ зареєстр. 09 зилвя ста! АВИАТОКІ? свапр ев 2006 ВЕ пвазйспоссввіх стві АБКОте засее ці кл о шат а сві АСООзЯТ іга що ВЕСНА їчтукляі АААМІЇ? Мегуа М ОБу 1599 ВЕ круматоюоєлвів

СтУВАВІ БЦОМЯЯЗО Стевеет ві зай: ВЕБ Х Ме МОВІ, зареесту. 9 липня

СУМИ АААХІІХ Маєте Я Ку 1993 Ву кшвамниноєтих

СТВІ САББЗЯЗ Арайсекві доп стУяАсі САБЗ5АЗ Авайсг 2002

Стів АААЗІТО Явіосі ві. ох В івропеовів

Уж Вівці сус ВвІ АКТІ ЗБ ев аа ВІН

Стувсні БИ625340 рчеві пово дееЕттІ М МСВІ, зареєстр. 99 двна ба! ВАСО2а Авяпо гі ві ЯЮЗ3 Ве озПегще хінька послідовність ДНЕ. їзУурао ВО З3574 Азаров! ще Ві су БОІІХ?Х дезпо ві з Ві чільки таслідовність ДНЕ

СтВОВІ ВАБОУЗЯЗ Увпшевспіезі 3007 ДЕ ВВТ2-5

СВІ ААСМЯЮ Барта ві ЯК віх

ЄзУуйКа: БЕОЛІ597 флверяі м ОО ВЕВАЯ, Ме МОВ, зареєстр. 09 живе

СУМКИ ЗАТЯЯСОЮ висі ві М ВІН також ДАВНЯ стуНОві ААТЯБОТІ ней 2004 Ві НВЕ-І8 сов АВСЯЯЗ тав еєві КО ВК 145

СтУВОВІ ЕМО 0 Хівофопе сі ві 2О08 ВЕС ІЯ 0/МЕМОВ, зароєстр, (9 лення

СтУВНаї БЕЛал532 Епріввеї ві 2006 вх М МЕВ зареєстр. ОО пучтня

Стуйін! БОЗНІМА обвпое ві ОХ Вій Ме МСВІ, зауюестр. 09 вїня

С ту КОЗАК би а МО ОВЕЕРТ-Х Ме МСВІ, здрееств. сю пиния

СТУВКаї БІЛОЯЯЯ 0 Ощежмію сі ві ОК Ме МСВІ, зареєстр. 00 зизня

МІЖЯКИ АСМАТОО Морист б ата МОЮ Вкевуве

Си ке КРУ Моваєз й бача ЩЮЮ Бі свпмієвня тільки послідовність ДНК

СлУВ-НКе АВЯЖНЮХ Маепсевв ві Кк В

СУА СААЯІРІЯ Брест мі НО ВИ даНегізе (чав СААЗІЯЯ Сісяхе є ві 1 ТЕО?

Стувані ЦОМО2О3 чав Мию овес ро) Ле МОВІ. зареєстр. Об хниня

СЛУЗАВЯ ОСА Басів МНЕ ОВІЕТОЗСО 06 МОВІ, зареєстр. ОО липня

Сту ЗАВ панни й га

ПЕ ААУ Ваше є ві щюЮХ венге посжкювиють

СУ! САМО Квруєсь сі ві 1993 ВЕ квіернє

СОБІ лАУЕЛЬ біса Устоесксєві МКМ В вровепе: суУСві СААВЕТОЯ апмбенсгі ві 19965 ВІ взіссіві

СОС ААОМІІУ Ват ві «ПОЗ пекевв супе печія уст дже М уиовеле створі ВАЛІММЯ лезо Уа ШИ

Мі

ЧУВ АВ УУнваво Я ОВО КВ 0 ВЕ ізропенів слу СО249295 див ві ке ВІ ТОЗВОдІі ЛО КСН, зреєстр. 09 линня

ТпУЧОВА 4НУ2Я9297 Веаеїві ЗОБУ БЕЗ АНН ОО МСМ, зауюєєті, ОЗ яилна ко Ві Винівві

Уві АХА Сіздизозп й дбай Зап 0 КНУ

УЗ ВІ ААЖТКЯЛО Біднивван М Абащі 0005 рід

СООЕВІ ВААЗОЮВ МОВ Оуюта і сту ААСІЗЯВ пера І В-НАа»ів

СУК АВМ ів в 6 ВОтА сзжаКай АСЕЖНВУ жі ві ШИК Бе луєі Я сах АСЕВЯХ ви ері НЮХ вне слу АСОСезтя лю сю Ох ВИ ства? БЖ? Ба ес ві ЗОВ Ме МСВІ, звреєств. 09 липні

Кай Ми щО292 среаї о пСездзаз са дя с

Стузнай СОЯ бита дю СОМ в МС, зареєстр. ОЗ нипня

СУ БВЕ САЄНКО Ат сі ді 2001 Ме МеВ чай дв сЕотчнй сь яті : і пою 000 ЛВЬМСВІ, заресств. ОО вионя

СеФБВІ ООМО39Н Коса! 2006 Ве ТОозвОвІ ра я

ТлУУБНі ААСТЗЯОО Ууввапо сі ді ММ Ві вайснає сухі слода щ ле ВЕ МЦивак

СУМНО ААХОВЯАН Кіаовякаа Ж АВаЙ 2005 вино

СлУЗКВІ СюЮТЯОО би ог в) МК ОВЕЛТОЯВНИ Ме ме, звунеєстр. ОО пяеея іду НЕ ААСОМОВ УуУзеаро ег ві 19595 евайсте

СБУ АлАТ Твоглесе ві ІУКО ВЕ вичеієвніх й ще пуща ; зи ВИ мгавівцкіх зільки паслідовність ДНЕ

Сміла? ЩІ Атвп о Тости дк

Сідай БО Ага ТосноВее 1995 ОМЕ.ВОА

Слів САВА Вежу ев МК ВЕУ сл пра ах «ї т тя з. Гл нЕелпанна нн

Ще ПСНетят Маевзізкананеаі 006 ОВИНТЯ велевв свое

СА АААРОЯХІ Гннючни сі ві ЗНА ОБ бле епі

Став АААВІ Аякс ві 1ЗЩО ВІ івувеіспвіх

СА САВКЮВІ Ветуєві 2002 ВЕ івгасіствів пед ПО бе53 Мевбаізкенич са 7 ОВНС 00 меловва послідовність

СВ СААСОНИ Пефсівзе сі щі 1905 Пе іеваєбехин 67

СИ ААСОІВО Охівхеєяі ОКО Ветеденів

СВІ АВ АААСОЗІУ Магувегді БОР ВЕР ЕО

СУА АЛАСЗЯЖВ Магуя ві ві 92 ВЕРБА В

СТАВ ААЛАЗІЛІВ Марув ві ві 094 0 Ту хоцо РЗКОЦИ

ПХіЗАІ АААЛОІІЯ Втожт ЕОУВИСЮУ 99 0 В йотреєт сСіівлаі САЛеТНО Вепйохеє ві ма Сь ввуча СНІХ

СТАВІ САЛАТ Вау гі зі 1595 СВ ювівуюа СНІВ

СІІВАВІ САЛеОВ лави сві роду Гаевібаснов 7 я Інні цае

Стеівва! ААБНОБЕ? раї ега! цюю Гасвійасіних

ЕАВУЮТА рорннає зоре сойка в заз Раеніваспих їчхізсСв! ААРЯЗООЇ Раефесві 19599 зт пива ровниве

Сеізані СААВЕКУЯ Мозок беіссірве 996 0 ВИ ерзібевно 307

Стіва ВААЗЛО? Гечве ві 155 Ві Війо

СройАзІ ААВОЗЯЕТЬ о Бев Ж ОСНІ 1397 0 ВЕ киокаєних

СхЛОВаІ АСЧОЗБОЇ Морваст бо баета 2005 0 Ве біво 1ВІТ-976

САКЕ СО У ев Ка ВЕ т-5 зіднки послідонність ДНЕ

Стіні 2932 Реупе г гі 1996 тільки послідовність ДНК

Сихів НЯ? Еенвівсв 1597 члька послідовність ДОК сзудіВа! ВАСОвЯНЯ Зо Ж Азаво 2 Ві товка ен

Стеиаві ВЯЖЯ; Гауве се ді 1997 зільки послідовність ДИК

Стук САДУ Тевяс ег ві МК ОВ

Салан АСОМ Овегві ЗОВ внги-Я

СТАН ААКММХо Ваши ві ЩО ВЕСНІЯО страва САПМІ5У нас ві КО Ви сил САМУ ав ога! КВ суши ААБТОІ7У Бевроеви кі ві МКЮ Ен ОП'ЄДНаНиЙ З сеузгАві

Ста Аві ААСОІЖУ: Кахвекаві Си 1995 Ви ебабйєвав бла ВВі ВАЇМОХ? Свраввее ві МКМ о Вгвовбо са сСВі САВЗОЮ Вел абаєто МБ ОВ РОСС сла ААСВІНОЇ Камвіекапа СНИ 1994 Віісеввехай стузбАВі ААГЮОВОТ5 У КісВояНКи ої зорю В Поньвов В.

ЗЕЕяНХ ві ве студтАВі ВАХ Баної 1599 ВІВіро

СТОВАВІ ААГОЯІЯО коісіосьомекистаі1909 І СВАИНЬ В.

СІВ АНІ ААСЮЮЮОЗО Мостжавібмбто Ж Ве Явпипия

ІН АВІ САСВМНЯ Пекосінее сі а! ЯКЮ Ве гейсіцв.

Ста САЄВОЮНе беієсіюхе гі ві ЯКЮ У дейе Цю судова ВАСОЮО5І повер ЗО Віешотостіе

СВІ ВАЄ? Обрив ві щі МЩЮЯ бе воно

НИ АСОЗЯУВІ хуя виб ЗЮ ВИ іеватвевап 367

СУМНІ БРОЗО55 вче я МЕ ВЕЖА з МВ, зареєстр, по плями

СУДОВІ ВАЖНОЮВІ Кік сега зов ре вікаваї ВИМИ:

СУ ЕВІ АССОЖЯЯХУ Бапе ві ві ЯМ ЕЕ БАТБЬОІ

СУМНА ЕМКОН 0 Таз ві ЗК ОВУ Ме МСВІ, зарсєстр. 09 литня

СУМНІ АСВ Тап ев щю ВЕ МСЗЕ

ТУ ИНІ АССеМІю вас ві МИ НОТ

Спа ВАБВІЇТЯ? байов б Міхай 2О0ЮО ВЕ ВАНЯ

СТАВІ ААГЯТЯУК пт ві схе КОТИ МІХ

Стій ВАБТУВОВ ГПепвт еї ві Ме БТ ОХ сла Аві ВАКЗІЖ Узкизке ек ді Ме ВЕ 7Од 25 суді й ВАБІЗЯТЯ Уамиако с ві яю ВЕ

СОТ АВІ ВАБЛКОЮ Сетогі еї ві щю ВЕЧНОЇ сСРЗІАНО ВАБЯІХТО Увхцівкест ві БО ВЕЛ-Я ск ВАЗ Узчизке ві ві ЮК ООВЕБТ-ХО сСтудзАНІ АЗОТ раівхоютатиная СЮ Ві уввпкпеввів сх ВАВ Теакере сві КН я стуДСВІ ВАНОЇ Тзкереегаві Ю ОВІ су ОВ БВАВВБОЗ Такебе ех ві МК ОВ

СУ АВ ААГОВЯТ Кивегаі щюЮї Вата слу ААСНОЯІ БИК га ЗИ шРУВЩИ об'єднання судин сСузаю ААКО5вО Еира сві ОО ВЕКСЗВО: об'єтнимий з СтуззАо сСІхЗіАеІ ААТОВОЇІ Зейперг сі зі ЗО ВЕРЯВБОЮ об'єднаний (СтуззАі

СА ААТООВН Бсінері і я МЕНЯ ВЕРЯЗЯОС об'єднанні з Суха сту АвІ ААСМІВТІ Моспеносскаєві ОЩюЮЮ ВІРІ об'єпнаннйз сте АВІ сСеЯЗАсІ ААСМНІЯ Біб ев ЩЮЮ ВЕВРЯН ЕТНО офєлнаннйз студ

СУА ААКОЯЇЗО Кирвгсї ві КО ВЕЕСеНЯ ярєднаенняз сСтузх АБО

Сула дої ААТОЗОО Бейпевтеї ві ще Ве ВІ13Бо «теднанни з Стуз5АВІ

СІВ АК Вораге ві М ВЕБ ЯВІІ сб'єдваийз сСтузаВні

Слава а ААТОЗОЗ бевлерісї ві Я ЕРНІ сзб'єлезнийз (узяла?

Стумцваз ААТІООЇІ Жевлерт сеї ві 004 ОВЕРЯЛОЇННО об'єднанийз Стузяра

Стіва ЛАСЯ БЕН я! Ю ВЕРЖЕНОШІ об'єднаний Су Аві

СсгуУзтав ААКОЗІ Вирзк сі ві щннН ОО ВЕБОБВОЗ ош'єднаннйз (СТУ 4АвВе

СА ААУ Бевбпері вія ща Ві РщеО об'єднанні суда

СУБ АВ АТО ІЮХ Боплерг ера Ж БЕРБІВНОЄ 0 об'юввнива стані

ПРІАВІ ВАСІ Мосйснвосксва! 001 ВІБЕІЯОВІ соб'єднаннйз Суха АВІ

СУА ААКОІВІ Віджет еє ві ак ОО ЕС сбелевнніаз теЗ4Асо

Сплав АУ5З6НО: ААТУНЮЯ 2004 ВІКЛІЗКОЮ 00 об'єзнаннйз Спладез

СтпазАсі ААОМНІ? БИвнесві ОО: ВІБЯІ6ІНО о об'леютаз СтузаАсі

Ста:Ва! ЛАХОЯОВ Вроагеї ві КОВИХ зфєлязний: Сеузаваї хаб Вно ААТОЗОЗ? вспверт є ві ща ВЕРЕІЯНІЗ сб'єлнаннйя ЄууЗаВаЗ

Зв йаа й АЛЕ чн мк т жу зу

СТІ А ААКЗаО Вгабпоєв сі ві ко вт УЗ

Стубвані БІ5У7О3 ав А Бгопх МЮВ ВЕУзуєтя ММС, знреєстр. 09 ачиня

СтузвАана СОЧІ Сипци Бепе егаї пюре МОМСВІ, звреєстю, 29 дийня

СІЛА АМСХВІ Мовне аєтв ОО ВИ В

Сира АМС о Мобоєт Ж о ата ОЗ0О09 0 ВІ епінпосіфця гені кзі Авт Згдозіечих Ж суд и ке гг З

КІЖІНАВІ АСВЯУУХ Морюєтьс бала ДО ВЕ КВи СВІРКО пківзляї лоз АВ ПАЛ НІВ СбавновВ ТБ опора ся ОАНИК : З з В В п: Н Ко | З

МОЗ А лвІАВ АКА МЕ пав а пава опеее Сава : :

Н : : | і ї ВИНА : :

ПЛАЗА пу А п ЖБкцновека ПК АН і

Ж Б В : ПО Бе ШЕ Е : : : | , і дкоюв ГАОЗЕНВУМА,

ЛУрлАн СБ БА Бор ААВННМО СБейсіюовсів ОХ пи ВИ ВЖІБА ОМА МУ п п От : п не АН То ШИ:

В н Н і В : й НЕ ї проанн и ки ЧИ сови ПЕВ ою АВМ,

Мій лах РВК Ор СААББНКО сбейерюювсває КО ун ПРЕ САМЕ

Ти ї и наван В Не ТЕ МН їж М ї ї І : В : ї НЕ ї пені щу» пихуп моли «Кк лини ме мийна ПІД МИІИ ЗІМІХ ти МИ М ДКНС, ПАЦІ и У хх ПИЙ нний : ! ! ї В З й Не: ПАСКА пн ча пн ОН А я и МВА

МЗАзО Зат9аБое СААЙЕНВЕ бейенепевєар СРЗУЯХ пи а ПЕРІ МЕ: : ї : ї Я же У : Чули 7 і ї | Н В З і як З

ТУТФЗАЖІ ПляЗ Аа ев ПН онеепуднююаю Це УНР у

Злязаай 0 Мр3А "АКУЛ блюмевблесья! ОО: сеопувньювана ВЕБНОЇЛЯ :

ДА Те і кченис ЗМЇМНМНИЙУВИ одллу 0 не свйікаваце оон я : ї

УНВАВО ОУН ех: МИ : ПДК еуяеи р АІУ : і

МЕЗАВЮ У У АВМ Винкс ві М сток БВ в Е й т ії Я ї ШЕ ї ї омірзАВИ: ВЗА 0 ААЙДОВОО (Цісіві ОЩОДУ реовийннюванс у СЮ ! і плвІАНІ? УЇрЗАЛУВО ДМСУ лев дна 29 пеемеукнноваює і : : ; Е Е ї Жіеер : . : і і й і Кола Стеви З : ї

ЗлюрзАВії люЗА ААіКОММО Сієвеєві ЯМ сХоєВае5, ВЕЗІЯ С : : ї : Е : ЗБ: : і слраляія Мо 0 АЛОІНЮО боїшвиаєся; 903 емвннеюю ВііінНнйй

ПАНІ ЯРА ЗААРЯНЯ пише ві СЛМВЕ свюспуфжксвано МІНЯЮ С ; ! ; Е | я ЕЕМЕ Міс; ;

Пурзднік Мав ААУ Момеревї ОЮ5 се ОЕ | : с З п Її п Ппеша зай ї Н ї

Я В ї : Я ІЗ і : і . | ши с: ІНШ ше пуд ей п Жейсікв і ОТ ха ве Миуєнв БВ ОСА І1МОЄ с 17 НІ п 1 ц пак УК п х 7 п : : : : ї ГЕ Є лов :

МАК З ОАХХЯКИИ Сюзпб Хі 00Ю5 еекуєткомна ВЕЗБІЯС : пилу т си пи пд ви ення ня п кре пудліканант и - мір АМЯ ЛУЮІЗАТЮ ОСКЮЯеЯ пднеаі о КАК ми р

УЩЗАВІЯ МірзАУ 0 тес ПЗ св енувліккнко ї :

УЗА СУД А ЗОВ Налеаві (ЖК веспудліткн ! ! па ТВ ТАВОЖЯЯТ оВапраюцимі 00006 се ихбавовано Зх іл :

ОУЮЗАЮ? МЮЗАЯЯ ААХНЯМ ше ЖНЮХ о неспувзітоюва В ЇЯІ Н !

УВА ІУЮЗАЯ В АЛУЧІЯОВ вера СОУ Тра опубніковано ЦЗ Т.В В Я

ЛАЗАЮЯ ВІЯНОЗІІ сбовркесв СНМКР о хеспимикомна БЕОСАМЯНИ

УїрЗАВНИХ І БРБОВІО: ББеве ві ПОТ тневаублвована 1 прЗАК СБІЗОМЯУЕ сбвейзадОмо ОПО) пеопубліковено в Те н І

ДВА НЧЯЗЯВІТ 0 сХвнцеї Хе ПОЄД рмспудиновию ВЕК е

МірзАЮЮ 10000000ОСБНОВЕТ о Хеюожієтя! ОСММУК озудненно БЗКАНЯО000 !

АвідаМЬО: Пе жеТа сХіемеєїеєві ЛЮ; в опуєвиковане ОЇ ! :

ГІЗАВЬ С: ПЕРЕОвБТВ сХіеюижітгіві 0009 неосебліховане ЗВКЛ1-Ї : :

ПЛАН ЖНЮбБНУ? Хі екаї ОСЖККК се олубродююат МОЇ ; : ; ї 1 шо ї Тв вклади З ТКС ИЯНАХ рр нев Аква ко ока А ВОВМННЯ озеапха и тя клх зів

У ЦцАвІ вів АДЛИЖНОВЯ бепеот ві СБС: пед ЩЕ ХБІзЗАЯЬ ЗАВ РРМах с : ; В мої : АН С: пада : : ! : : : я ! яю :

СУЛАВІ ав ААЖНЕЗИІ опр зхні ю ОМК зно мтубняковано ВІ ї ї нн пн пон пон п у нн нон нин : Е : Я : Патент СА: ! ї аа РУС і Магуз і ді й ідплнілчт;ої : і тА і пива ЛОНО ' і і і Я Я занана : : : й : : лк НН : : рів свегки : ее у ці : З : : ї прі ї ВСІ і Меса «а Е морю ! . : | в | ї пила ІВРУВ САБЛОТ сУва лесі! 2005 0 ре опуйнковет ВІ : В

ВА Нав ЧА о сУуваебіеєраї ОПО05 неепрбаекако Я :

ЗпрзА ОПЕРА ЗСАНІДІ бува Вівесві ЖК 0 Туеовувнююако ВИ 1 :

ФюЗАЮ ур "(АБУЖА?53 буррема Ж ! : р рок на ал 7 вда : Ві ца єн АГМОХТЯЙ купеттия : В; | ! : тЄ ірізаї Мр В АХ пБТях ; УвЕЄТНа : оди Н ї

МІрЗАЮО СКЕЗУЕНОЯ о саннійнуєєа! ЮК сне опуєбнкоюне Фі й : з р у и у У ПИ уч они ер Уфа о ря и се миня

ППрАВІ п. ві НееЕе пи ПОН й ш вині зе п ОО. о ЖнЕпнукліковано щ по ПН

ЕВІНЯЮ ОО. ААУ Капрі ві о сш В !

АВ гевій ЗАДУМОВІЄ Худаснів т А : Я В

МВВ ЖРАМЩВІЗ СсАВІНЖВееєВі ОЩЮ? З я і ї

Ко)

пет ихця Ему у то ти і и вм НН а ВТ НН пт тако КУМ Кін хто «11» змо ВВС Тв тт 1 пек ВЕКБОБСІВБКСКЕ БАК

Сг МИ ІКИВВІЇІ сви иМИи у МІ ФУ гІр учжух тя товують т зх УмиЗ пі еуцамих тп зані Шина и ие вав» КОМЕТ НОВАНЕ ЗАСТОСУВЛВНВ КІПКІВ СЕТ Її сті в «и о щрясУуш лет ФМ ті пи пух хитка ся лля виБОБлЕННЯ БЕЗИСТЕНТНОСТІ ПО КОМАХ ре ТАЗА ШІ ДІ

Зі МАША а

ЩО М вени Бо су тМою СЮ зх чех Оп сх касету ФІН 5. та 1 кА 4 сок шк Шк шле чу м «Ві2м вх хх: ка рт їж; ц и кв ещійз Штучна посплідсовність нена чяИпМУ лю сть рга лей СЕК «ап і

УНН пу Воші що Жди Ж га лі сити тях є йш Уха Тож Води

Ме біс Ази Аа Ті біз зп осів Суз УВА Бо Тує Аа Се Мем Дао 1 їз тв НЕ х А я ХХХ боді Бідні лу ЯТЬ три ту бої Дод ї1135 (1 бок дачу нн Ту Ду ких

Авт Ека (Фо Уа Оп тіж Бей Аді з щі Бі Ако Зах п о БьіУ АХ г пл МІ з пи ех му пі ї З т «и Її . Фут Ті Тк чук Ту т зх Сг 11 Н Кк

Вхоб Бец йЕЮ обі еу зва йвробейц ТЕХ Акоз бив о Їви Бей де Зі) бве

Зк ях 5

З о ЗЕ ярмо хх г їх тії рн ни т т кат КИМ пом тоих Ж ок ПУ ку бах вхо йеу Уві піУу Мав віх Ре Біу Бе) Ра АзВроКей ТівОТЕБ о ЗАУ зо зп о пня Ті вве рем же ик тим фу Тим: во Том: Та бі ті сь пін

ЕнНЕ Ті тик Бко Зак Авт ТКвосех лед Ве і Тай сік її піз сій по п г Б та Тік ім (вк дк Ті іє тв бою) л13; Деу дя дузту Дія тів тльк еац оті сій біп Акщш о дів сіб ТпЕ зе оо Аг аза Ася Аїв о їзе МЕ ях за 5 бло тож: Джері «ї сові У Ах піхоту ТІ кі люту ТЯ а й шо ж твжЖоїші Ат Бі Бец Аза Ар обах Тук іа ТїРе Тух Ті бій йАїз ГЕО 100 105 110 фот 13: стеку ПК: їв Дж кг Зв щує Вій фа Тер й ів дк ді дхо ші Тко 10 дів Азво Бк Ач» Ажо Аза бів іш Ахз бі зво Уд3

МІ ї2о хх т Сен Желе Алх гу СМч Махх Тугх В хм: ТЛ дю бан АТ чл Дод вх оті бхл Ж АВ Азо ТИХ бло» вза о бів їм; їїв5 тв йка бле Ава й хз лик

АЗИ АКІ А ха Філе бно томи там п білих и тями их Тік Туз ку 1йщ 1 пе гу лави рве Тк ей Твк о Жеї Ве с) Тів Бо фра їзе Зах Уві Туш Майї зле як з тец ит їч5 ви 155 ї165О

А іх пл пах тем бі мо Тех: Слує Том тку де дик щи їі пли Юуи бій Аін Аза бал пПецч Кіз Мей ЖежЖ бе) ем ВЕ Що, вок Жах ВБпе ткц їла п

АЙ вч НО тік лік раю тку Мах їі дев ті ві тв ні дет дев ціх бін пек каАм'і пі У жЖхвосБАУ АжМ о зе дл Зх КлХ а па ал паз оту зшл тах чо

АШМИ А шо

У НЕ Мяєк там ХА Я м Ану тя Ки ія їм хм пока йо

ХУдтролжид КЛ АЛІ БМац оса Бай б Тук пх о Був МУЗ Сук май ою те 155 й НН тож оду пі ТЯ Тв тя Мк тжмі дим лю тв Ах о лтвя Ат; Мі пе

АмХ АВК (ЖАЛЬ СОУ м МА АКВО мем ОФУш БА ХпХ АЗИ АДХ АК шеАМОХХЮ я ух к зх дів 15 шк

Міс Дж йнух йо 1 У ки ато У ак А Тв Том ра и чи нн в нн

Аізв вт Впе Азвопівй Бе Ах Фк ч Ашо ба) тро бай Ти Чад бен зр -и зх яжц тат

Я че «4 пай тів (щі рад ої вл й Ди тою вжтх З8Ц Я Лоу бр ху ему жо мм

Мп охУвМ оба ша КлтожгО вахпозУуш бар о УвУ лтла Тит оту жо Т3за сів зай т.к; я

У ЗИ ха жвае о шуу сх 1 вет Мк Ду 213 7овев бу ситу уує тим 33 жу хо.

Кг оЖХаї пек опій їмо Тех Ммхсч ід їі Т токах ом о смпІ да пає скл зді зи св дО Ух я

Мекки ул ба ду - учи чи пою й жи ща Кв нт, у; бе Зк; ал Же ід дну 135 руОо дів бло тих дай чі ГЕН ввЮросзех Ек чаї мес лів лі с ру Еш Оу Ве шо Ахзч дів 1 яткц зов як цу за КЧНЯ шої хм ай ть Хі ЦЯ ду пи и ЦЯ там мМек Сломту ФМ М дя дими т оимя ге о бішЖ Уві БУ о кКЖОо хо Ммаж ої Мел тю о Кпеб Ме Адп де іа ке

ТЕ мук, У чо ва ж

Яга ті гу 1: ян Ід хм ду АОС ХА ах т» м ціа т

Маї Тквк Дів щі ТнУ Уді дк З кп оси Тахо Уві Те пі у о шАШ НІЖ ШТ зи З за ЗЕ

ЗУ ку КЗ Зк

Та сн мак де ев жи і ог кт Мун т Ддкто Му ек Мт фол чва зЗех лФИ А КЧ ВАТ ІК ов саУ ВЛ ОАХО бфаФ оп гОЖ кКисюУушХ КУХ

За за зх

У й ЛУ мік щі бів лу їуки іх сліз БА гі лами УА дім дах сх т уже бі Уві бе Ав обто пі оту йіа бі Тк Ті Віз Ав обумХ АБр о Бто

Ай 345 350 іюту Вк де Куті Мами Деу фжті 2 біуз 35531 Де 1 ак гл;

Зкщо реа Бпе тех Ах Ту Бе) йеє Вар охо УдДіУ рве отзі вка пбіу бі зе сом зах

ВУ що ЗаЗ тво т йяєе о Вка щЯ оту щі Хо: Трах їкчі Ву о тіік мі Аза шШню біф пе обіЗіу Аз оБко МЗ Тух Уві Бе Зі Бе АкУу біу Уві А Та Вп бів

Зо 375 Зно гр чн 10 тн лм іє пу йти пе УЮ йсечх й бр хх пл тд

Чіп тЕВх Сі Тахо Азб Ку Твх Ах З Тахо вне де З еб ше У АХ ОАЄ зд зак зиц а йг зсух СК за по 53 в амО шо на п ОН п ИН и ПАН и а и НН НН пдв ті Ві ян тиж

Авробак їво Ар о спі) сів Бо Бк біб Ав Ап ойек осі Віз Бжо Тхр пи ІЙ 15 о ш КУ ЗАо ху йдеш тм бу шо тА т. зп Я а гц у б р дю ну ди

Ана Ав о ТУК Шеїх Нів о Уаї га Ав») НІіЗ Уві ТЬВхІ гл Узі ДАЕ дош ХО й тугі пох 47 йо я о пл ті тло бу т щу До не кт жу діа ут Мк бе Марк парне ді Бі Т1іє Хек бі Хек дво ес Ук вхо Ада Бхо Ме пе ЗФх ЖІр зай 345 533 о 445 їх паж Мт до ку ун Мо йно пня хі Фото Ми Де Й ух

ТпгоНніз Ах Хек Аіа Тр Бка Того Ап о Тпкх Ліс АВо Вко біч зе блю ше зе зи ее т а 5 й зи І Зк сер кт чл жі ді м ДІ 4 ко т КВУ Фев бік стін тех тп обі їїіє ВкОо бе) Уудї ууз іа Ніз Твнх їм бів бек обі Тв тих ки да із а дт

ПУ У 475 СН хі Ук поміж Фхчах Фк ф7лїу Би бу бі стаю па Ті Тов у: ук я чаї Уві дкц бу Ркоз бі Ре ТвЕ осьУу Зіу Аза Ті бего Ак Аку тих ще де ке за 455 аа нанні ша Ше НК НН ри в не НН НН на на ШВИ мТл їМу маш шко спе ох ХуУуХ 15 їів Ууді ди Ті Ар опт ж мап шли «ид пл пз-ї ами жо ж шо чі ау, ж МІ о ж 2 ро і те пн анна очи ї ше шоу 1, бро дк ідо ден ті шо дит тк дій бек ляє п сто БМ лхщл сп ОодХО Її вх мпха ехо А АІС У ва окопу Ул ААшО Мем ціх УВЧ СЕ

Му Ті бебум ТА тим 51 ДІВ Іі п Ввхим ті би йів о лл йпли швх

Мф хі оте УЗ пк ща Ма му міц ЛК ді СВ БІВ МАУ май пе

ВО АХ я п й ху аа Мк бує Лу й: дош ун г шт у Ре вах гм м ТУ ду

Аши Буш ТК оМес Явр о ТВБХх бі Ав о БкОо Мем УВХ бе іп бах спе цех слк пе пце тищ пл ТО дл зі

Жбет Мі я ль Жій Дт бе Мі та бір Зі: Шоу ВйУЮ свою ту ся де хук вів УВК Льв лап тн Аіа Бе ТВі ББе о Бсоз Меї о Зек о зів Зах Кат

ЗО НУ УТ бої бЕре Яві 1 що дп Жку ви ту Мово іх Же М я т сь

Бдт о тТвтоУвВА ЗМУ вів Ав о ТБх ББе ех бек о щі» Бар обі УЗ Тух Т1Ф

КИ БЯ та патини із нт тах мама ди мк м ян ЮК одато й сх пвм ол кис само їв аж око УМХ алх Але ВХ лБцО сах щІк вчу ке о их и смій 2 сєжіцх ко 2 тя п «ЖАВ СЮ а нн прут

АК Ж

«й о Шеучна песбпідсовнХсть тут хай я ІН лю Жуля сах - хуя Ко

ГК пт. вжи ше нон с ав с но о НН ьо

Ме баз фі А АБа Зій Ап осів Сбув в ХО Т ЖЕ о мІВш Сум ВО мя ї 5 15 ж 4 У ХМ їх

Ток те Тл Ла 1 Тит ме т дю би ія рія тях

Хм Еко 4, ж їх А ї1іе тве їшна пі ба пі Ат би бло ти С Мой п 5 ЗИ лу мМщі вбив щду; те ово фр Тр; с Фавст, СМує о Тощояо бе Мен Мо

Тк Мах йів одне діє Бек обей бі бе Ті Аве Ва обей Лек Ме Девд ад вих вк о Ки ро. лу ни М тА КК зи що я т сміх Тація я т т му пе оУві Еко Зі шіу баіу гбле і3е Уві іУу Бей пем піч без їїев ткЮ

БІ 5 ЩІ піс пн бо зи уми фа мосту Аг т шо мих там па а и Три шпАш БЕХА аж ому Ж ЗХ ЗАМ СХ ОН дж ха цем Ба ал За піс п чт п о еп М а МИ и НИ Че Шри ТК М ю Ул ит КІ Же МТ ож и нови Ше пі м полиг ває БЕЖ ол яко ля са шо ле дов лхО жи мать Ал зле

З що шо

Шрот іс 0743 215: тв Бах о бцур Тими бах лицо ХА бек ДАТ Кер ЗАТ

Шеж баз іч бі пі Бе дех Бл о Беб ТужЖ ї че хай тух жах лХхЧч МАВ 103 пу 115

ТУ потуж му Мен М яса ДІлу ке Жвк Мат бій В до тами бачу ЛІ 1

Би Бех Азуоттробів пую АвроБхО ТВх Аза ге Аза би АкУу БМ СІЧ ся и «хх

ААУ виз. КЯКкІ

КАЧАНИ тра фі вою шу: Аавту Мао ле блю і тин: з м чл

Мет оди її Пік Єв йві; Да) Мі Демо йо дів їд 1; 7 Акво їі

Ме: йкФ їі Бір вне о йза ЗБр ож дей дек дів щем фі» ТиЄ ЗувОотає

З 15 хг

Ще їз 148 тету Мувуг СІВ оо ЕВ їн жи, По 1: хг Жду тащаж Вико сад пу

Мт жим пил о мич ха І спіб мні т МХ жалю Ха М і ем дм ех УВА Ух

Ач чо МА Ко са ія АТ і дам мат Я що Жмі ЕНЄ Спрех тар Де ле Шо свеко їла заї ші Аза Аа пал о гла Кід їн ЖЕж Тік їжи ду опа УЗ ошх УА таке че зсиц

ЗАТ ЧНО КА їни: Мія; й: дат ух із стік дае бю Ві тьу ті цито йшмо щи чим пе о жАУу мій ввоЩ Хр ожзАу ух АЮ их ав КлаХ її мВ лам ях ТУ чия за мч

КО Ух Та по дл Ток бр Жде Ті Ж шо щі Міли ко тує й; Мі моб г ууея зах АВ о мЕея тТпжЕ же Ми вфае НіБ Уч. Тук їцх Ав МіЗз с Сук Ущі АЗО 7щ5 УНН вжи рани іти ші пустот й ТУ ку че ит Моя дух тов (ху вжи ТМ ж ож пл ло пах Кук шо мат іюАуУ лм Мур оУЄТ лНЮМ ої о мА од октих ла ст УМ пла ель ла

КН «АХ па

СО ххх, ПИ п Пд БА Дах їх: зла нь п Жоажхек Сі у Ж, "Же ГУ Том іш Ат хе Ух АЗГгО ВІЗ ОЗдгс де Фо АЛ КО ТЧекротІів пах о Уві жк тат ме М ДОК ях жк ши ее

Ха тік мА МІУ Жри Мк Ж бух те ножі Ки Дамо Лем Печемо усі чо ту дво їі Маї Аїз Бе Бпе о бжо Ахо Тук АввоТА т Тих бук БЕХ її й ц зл пе, «ЗИ шим пе хна НА НА ті жрии х пе А НЯ - КН тую Ву 3 пвх діа ви - Тим: ЖТрє Лат Мі а Міг Там ще фе й Та заводах ів Зах біб Без тБЕ лк За Уві шк пви вв о бем о кшхо НВ ще ди з7та

ИУ ОК 41

НИ пт С Тож ве їх ст. - їх ку 1. о т КМ - ХУжих ЖУК г Лк Фе сх їі йег М13ї Дт їм їм Зкгз хх й : Зк я зх Ше й

Тіе Азпослім Аж о бви бек о бхо Лі Ав Бех ЖУуХ Рхо тик Бе ех ЛІВ хв тн ява йо и дея А Ті нач ух ачну фа жа М Ми» би досую іа бій ет Аїд бів їі Ак о Мшеж жо Віз їні Удоа ЕІ ЖІМІ ЛиМа йди тр не гр зи ЗК їй

У Яке КІ

Фк Ша тв Ті тех твер о Аміх мук фам; Мф йо сля Мі ярок ск 1 па ВІ МК дол Ух МК олеО Беж Баг пав бек УЖ дід ї ЖлОлюЮ шу

Зп зЗіА Зі пла й УЗ 315 25 піхє Мік Тані Уді Демо йруУ ве дк фе біз ть с тьк о фнк дат тихі Тс пі Кін бе Ві Аша йех ВВЕ од Я БЖ б Ж АМХ лк ОКЛя АЖ ем 4 і:

Зк за «МО палчоЖау ит ік Шхю бл ут піз; Піх дим свя Чі; дк бут раї тя шо слшх жо мем о хух зау ВХ ЗМ му вшМЙ Тх па Ах М жЖХш мах лІЕ ат «ак чи

З ЗК мех)

Мо ЧЕ ух кі Фо Хан Тл уУмеЗі Шах т іх р НН божі вони ШУ

ТХіє ТЬьу Аза Жах пуб бе Уді Бк Ті: Ва го ТВх їв деко т У о док чек п дик їКУ ка ве ве у а кош т х ОО 4-1 ді пече и гару да те І ля пет чую шу лм Ма ля їн Ар БО з Ж хо АН

ТвВк бу У ве Ар лап ек ва жк ЗУ АУД ОЇКМ Ма дю шіУу УВК ОА 379 За зве рюкшо йівно дек бан ті би дл змо ТА там ху тро ж фік й Кл

Бе 5іа Аза ТОЖ бе век АхО бек ої3ле ТбУЖ ЗКЯ уз мех щ У ЖЖ ЛАК леац ту иащ пл

ЗО в ЗМ БК весм и Ва шиє іі Ломі Ве ке бі лет хів бууюж 3 брехун бл ВЛ пе ОЗ Спо їх с УМО КО бхк ВБЮ УМ кМаМХ І ЮК ОКХ мах мя я чі как 05 я 15 ж т сумо дя ші жи Хі іх: Мі шо АТ я й Шум Ти М жи

РА ОоїшАУ АУЖК мМ пАЩ ЄМО ІНШ СТІ Мпа АХіш лтаж Бр Сава бі АЖ поле іп ЗУ ат ам че у не аа и ч ту тую г ие я їй ую КК ТУ и ери шо тт: ч Мо Моя ФУ со» у іх; ет дує гів ідо» Же Ка зо Сук лек з і щ м Зак аж оку БІО АхЯ лів Адвослу ТЛПЖ У зі ві Шежх бе о Жвх Вів Ако йо км 2 дих

А 243 да

ТК ою жала Пи а ен ФУ Боже Фбсозч ди каш ле ду м жл пи "ШКО ие Хан гої ха я з то пла бв бек о Вус бу духу т в : Її б іа Бех Еш ТБЖ дим обі Уві) Бек БІ беж о дк Те ТвВу па тів рхх а х5 3 бен; бу теє Ві Мід співу їТлмх вія йаве іо Вій бак ді тло та у їквр Уа) був Азїв Ніз ТИХ Бей із дер осі Аза Хек Уві їїі8 пуй оїу зац В алла їй 185 ТО с ї85

Шен 1 ки прикла щу ж тури Ме ун ох ие Мао і ля

Бо йіУ Бе стаж пку Бу Адм тів їм Те Ако вза Бех Мей бі 3 лази доль 3 зо 35

Жжощію ВІ 4ю бу от фут СК Кяк ШИХ ую фл жо жи Би ККУ, (75 шву пиккжя мем Ооуеу жпЖ о вашовхц Ха х Нх она Тих бу Ахш о бви КО Бій дах 7 Ух кл п п

За За зі жду СК оуєяк ДУКУ доюих Чоиюво Мово Жвн АЯ А ТУ лох Фен бохк о Тк ва тя

Тек Кі обх Кто дими кома мет ха і оАів обкл жо ек о шіс ТВО Ена ря «вт цех ен М «ж

Мхокю о бл тТак і у Брю т бок о Жек бе тів Фе Шк йхту Зло тво Ку дка Тую бак сів Кез Бо бех Тек бу її Же Бе Ехо Мув Тк Мер 535 пах За

Маші йо лах Ж 5 ями Ху Лі ге Мото нє КА Ду яко ІМрчую ру ТЗ дих ля о ау сЗАЦО БИК ВЕ КБ о див КУ сш КтнБ о БЕ о лпля го) ТпжЖ о Си

Зах КІ 55 50 дфуюві СТ око бут Ті; Кв ОКУ йдк о дже М'що 1 711 34 учи А дту Там лінню

ЖЕО АХ ЄХо А ДЛІХ ЄТЖ лек КО МЛ о їжАтЬ їх Ма ЇМ бла окр аиВоО ук и вет поле

У ВЕК Кі ких

Зх те пі

Тзіе біп Хек Бі Уві Тух їі Ашр о Ах їі 13 Ре зі Рко ві ТВК вяо ва язо

Claims (34)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Трансгенна рослина, яка містить ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Стуї1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сгуї Ра.

2. Трансгенна насінина рослини за п. 1, яка містить ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сгу1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сгу! Ра.

3. Трансгенна рослина за п. 1, де ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сгу1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок СгуїРа, були введені у вказану рослину шляхом інтрогресії.

4. Трансгенна насінина трансгенної рослини за п. 3, яка містить ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сту1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок СгуїРа.

5. Сукупність рослин, що містить не-ВІ рослини-сховища, і сукупність трансгенних рослин за п. 1, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 40 95 від вказаної сукупності рослин.

6. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 30 95 від вказаної сукупності рослин.

7. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 20 95 від вказаної сукупності рослин.

8. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 10 905 від вказаної сукупності рослин.

9. Сукупність рослин за п. 5, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 5 90 від вказаної сукупності рослин.

10. Суміш насіння, що містить насіння не-Ві рослин-сховищ і сукупність трансгенного насіння за п. 4, що містить ДНК, яка кодує і експресує інсектицидний білок Сту1!Оа, і ДНК, яка кодує і експресує інсектицидний білок Сгу!1 Ра, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 40 Фо від всього насіння у вказаній суміші.

11. Суміш насіння за п. 10, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 30 95 від всього насіння у вказаній суміші.

12. Суміш насіння за п. 10, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 20 95 від всього насіння у вказаній суміші.

13. Суміш насіння за п. 10, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 95 від всього насіння у вказаній суміші.

14. Суміш насіння за п. 10, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 5 95 від всього насіння у вказаній суміші.

15. Спосіб запобігання виробленню у совки трав'яної резистентності до токсинів Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 5, де вказана сукупність рослин містить трансгенні рослини, які містять ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сту1ба, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок СгуїРа.

16. Трансгенна рослина за п. 1, де вказана рослина також включає ДНК, що кодує і експресує білок, який містить коровий токсин Стут АБ.

17. Сукупність рослин, що містить не-ВІ рослини-сховища і сукупність трансгенних рослин за п. 16, де вказані рослини-сховища складають менше ніж 20 95 від всіх сільськогосподарських культур у вказаній сукупності рослин.

18. Сукупність рослин, що містить сукупність трансгенних рослин за п. 16, де вказана сукупність рослин містить менше ніж 10 95 рослин-сховищ.

19. Спосіб запобігання виробленню у совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння, яке містить ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Стгу1ра, і ДНК, що кодує і експресує інсектицидний білок Сту!Ра, для отримання сукупності рослин за п. 18.

20. Композиція для боротьби з Сгу-резистентними лускокрилими шкідниками або їх попередження, що містить клітини, які експресують інсектицидно-активну кількість білка, що містить коровий токсин Сту1!Ра, і білка, що містить коровий токсин СтуїМра, де вказаний лускокрилий шкідник являє собою совку трав'яну.

21. Композиція за п. 20, що містить хазяїна, трансформованого так, щоб він експресував білок, що містить коровий токсин Сгуї1Ра, і білок, що містить коровий токсин Сгу!ра, де вказаним хазяїном є мікроорганізм або клітина рослини.

22. Спосіб боротьби з Стгу-резистентними лускокрилими шкідниками або їх попередження, що включає обробку вказаних шкідників або середовища проживання цих шкідників інсектицидно- активною кількістю композиції за п. 20, де вказаний лускокрилий шкідник являє собою совку трав'яну.

23. Трансгенна рослина, що продукує білок Сту!ба плюс білок Сгту!їОа, плюс третій інсектицидний білок, які мають інсектицидну дію проти совки трав'яної, у якої може вироблятись резистентність до будь-якого одного зі вказаних білків Сгу, і де кожний зі вказаних білків Сту зв'язується з сайтом зв'язування рецептора, що відрізняється від інших, у кишечнику вказаної совки трав'яної.

24. Трансгенна рослина, що продукує білок Сгу!ба плюс білок СгуїОа плюс третій білок, вибраний з групи, яка складається з білків МірзА, Стгу1С, Стгу1Ве і СтутЕ.

25. Спосіб запобігання виробленню у совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності трансгенних рослин за п. 24, де вказана сукупність трансгенних рослин продукує вказаний білок Сгу1Ра, вказаний білок Сгу1!ба і вказаний третій білок, вибраний з групи, яка складається з білків МірзА, Сту1С, Стгу1Ве і СтутЕ.

26. Сукупність рослин, що містить не-ВІ рослини-сховища і множину трансгенних рослин за п. 24, де вказані рослини-сховища складають менше ніж приблизно 10 95 від всіх сільськогосподарських культур у вказаній сукупності рослин.

27. Сукупність рослин за п. 26, де вказані рослини-сховища складають менше ніж приблизно 5 Фо від всіх сільськогосподарських культур у вказаній сукупності рослин.

28. Спосіб запобігання виробленню у совки трав'яної резистентності до токсину Сгу, де вказаний спосіб включає висівання насіння для отримання сукупності рослин за п. 26 або 27.

29. Суміш насіння, що містить насіння не-ВІ рослин-сховищ і сукупність насіння трансгенної рослини за п. 24, де вказана трансгенна рослина продукує вказаний білок Сгу1!Ра, вказаний білок Сту1!ба і вказаний третій білок, вибраний з групи, яка складається з білків МірзА, Стгу1сС, СтгуїВе і СтутЕ, де вказане насіння рослин-сховищ складає менше ніж 10 95 від всього насіння у Зо вказаній суміші.

30. Сукупність рослин за будь-яким з пп. 5, 17 або 26, де вказані рослини займають площу, більшу ніж 10 акрів.

31. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 16, 23 і 24, де вказана рослина вибрана з групи, яка складається з кукурудзи, сої і бавовника.

32. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 16, 23 і 24, де вказаною рослиною є рослина кукурудзи.

33. Клітина трансгенної рослини за будь-яким з пп. 1, 16, 23 і 24, 31 і 32, де вказана клітина рослини містить вказану ДНК, що кодує і експресує вказаний інсектицидний білок Сту1Бба, і вказану ДНК, що кодує і експресує вказаний інсектицидний білок СтуїБа, і де вказаний інсектицидний білок Сту!Ба щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності «хЕО ІЮ МО-1, а вказаний інсектицидний білок Стуї!Оа щонайменше на 99 95 ідентичний послідовності ФЕО ІЮ МО:2.

34. Трансгенна рослина за будь-яким з пп. 1, 16, 23 і 24, 31 ї 32, де вказаний інсектицидний білок СтуїРа містить БЕО ІО МО:1, а вказаний інсектицидний білок Сту!ба містить 5ЕО ІЮ МО:2. Зб