UA112154C2 - Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів - Google Patents

Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів Download PDF

Info

Publication number
UA112154C2
UA112154C2 UAA201204308A UAA201204308A UA112154C2 UA 112154 C2 UA112154 C2 UA 112154C2 UA A201204308 A UAA201204308 A UA A201204308A UA A201204308 A UAA201204308 A UA A201204308A UA 112154 C2 UA112154 C2 UA 112154C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
fibrosis
sho
group
map
shi
Prior art date
Application number
UAA201204308A
Other languages
English (en)
Inventor
Кристофер ВЕСТОН
Лі Чарльз Кларидж
Ли Чарльз КЛАРИДЖ
Девід Адамс
Дэвид АДАМС
Девід Сміт
Дэвид Смит
Ніна Вестерлунд (померла)
Нина Вестерлунд (умершая)
Марджо Піхлавісто
Марджо Пихлависто
Туа Остерман (померла)
Туа Остерман (умершая)
Original Assignee
Біоті Терапіс Корп.
Биоти Тэрапис Корп.
Дзе Юніверсіті Оф Бірмінгем
Дзе Юниверсити Оф Бирмингем
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Біоті Терапіс Корп., Биоти Тэрапис Корп., Дзе Юніверсіті Оф Бірмінгем, Дзе Юниверсити Оф Бирмингем filed Critical Біоті Терапіс Корп.
Publication of UA112154C2 publication Critical patent/UA112154C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
    • G01N2333/90605—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • G01N2333/90633—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general
    • G01N2333/90638—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3) in general with a definite EC number (1.4.3.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Abstract

Винахід стосується застосування повністю людського анти-VAP-1-антитіла, що містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в послідовності SEQ ID NО: 19, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в послідовності SEQ ID NО: 42, як антифіброзного засобу для лікування фіброзного стану, вибраного з групи, що складається з пульмонарного фіброзу, фіброзу нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, фіброзу шкіри й COPD, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними з накопиченням міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.

Description

Область техніки, якої стосується винахід
Даний винахід стосується інгібіторів МАР-1 і їхнього застосування як антифіброзних засобів.
Крім того, даний винахід стосується способу діагностики фіброзного стану й набору для застосування в діагностичному способі.
Рівень техніки
Як правило, фіброзні хвороби розвиваються в результаті порушеного процесу загоєння після травми або хронічного запалення. Фіброзна патологія переважно розвивається в органах, які постійно піддаються впливу ушкоджувальних факторів хімічної й біологічної природи, наприклад таких, як печінка, легені, шкіра й нирки. Незалежно від того, є розлади гострими або хронічними, вони мають загальну характеристику, що полягає у втраті органом функції, оскільки нормальна тканина заміщається рубцевою тканиною. Захворювання прогресує, часто викликаючи необоротні зміни з поганим прогнозом і виживаністю.
Склад фіброзного рубця є практично однаковим, незалежно від причини поразки.
Діагностика й установлення тяжкості фіброзу є дуже важливими з погляду прогнозу хвороби.
Процес планування лікування у великому ступені заснований на оцінці фіброзу, його прогресуванні й початку ускладнень. При фіброзі печінки перкутанна біопсія є золотим стандартом для класифікації й установлення стадії захворювання печінки. Однак це є інвазивна процедура з властивим їй певним неминучим ризиком і ускладненнями, яка, крім того, асоціюється з болем і дискомфортом. Показники смертності в результаті ускладнень від цієї процедури перебувають у межах від 1:1000 до 1:10000 (Стгоскей еї а!., 2006).
Було встановлено, що активність сироваткової моноаміноксидази підвищена в пацієнтів із цирозом, хронічним гепатитом і раком печінки, які всі асоційовані з фіброзом, але має нормальні показники в пацієнтів із запальними захворюваннями сполучної тканини, такими як ревматоїдний артрит або системний червоний вовчок (МсЕжмеп апа СавіеїІ, 1967, 9. Г аб. Сііп.
Меа., 70: 36-47; ЦО еї аї!., 1971, Оідевійоп, 4: 49-58; Ма І іп еї а!., 1976, Ргос. бос. Ехр. Віої. тед., 151: 40-43). Однак припускали, що підвищена активність сироваткової моноаміноксидази є тільки показником або відповіддю на поразку тканини, і не було відомо про її роль у патогенезі фіброзу.
Звичайні терапевтичні підходи в основному спрямовані на лікування запального процесу
Зо при фіброзі з використанням кортикостероїдів і імуносупресорів. Однак, на жаль, дані засоби мають слабку ефективність, або вона зовсім відсутня, і існує очевидна потреба в нових лікарських препаратах для лікування фіброзних хвороб.
Сутність винаходу
Деякі завдання даного винаходу стосуються інгібіторів МАР-1 як антифіброзних засобів, застосування інгібіторів МАР-1 для виробництва лікарського препарату для лікування фіброзної хвороби й способів профілактики, лікування або ослаблення фіброзної хвороби в людини, яка потребує цього, де зазначений спосіб включає введення зазначеному пацієнтові ефективної кількості інгібітору МАР-1.
Додаткове завдання даного винаходу стосується способу діагностики фіброзного стану в суб'єкта. Спосіб включає (а) одержання проби рідини організму від зазначеного суб'єкта; (Б) аналіз кількості розчинного МАР-1 (5МАР-1) або активності 55АО у зазначеній пробі; (с) діагностику фіброзу на основі зазначеної кількості 5МАР-1 або активності 55АО. Якщо бажано, то кількість 5МАР-1 або активність 55АО можна порівняти з кількістю 5МАР-1 або активністю
ЗЗАО в референц-рідині організму.
Ще одне завдання даного винаходу стосується набору для застосування в способі діагностики фіброзної хвороби.
У деяких варіантах здійснення вищевказаних цілей інгібітор МАР-1 являє собою анти-МАР-1- антитіло, таке як повністю людське анти-МАР-1-антитіло, що містить одну-три консенсусних
СОВ-послідовності, вибраних із групи, що складається з послідовностей ЗЕО ІЮО МО: 1-3, і/або поліпептиду легкого ланцюга, що містить одну-три консенсусних СОК- послідовності, вибраних із групи, що складається з послідовностей 5ЕБЕО ІО МО: 24-26. У деяких інших варіантах здійснення зазначене анти-МАР-1-антитіло містить поліпептид важкого ланцюга, що містить першу СОК-послідовність, вибрану з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 4-8, другу СОК-послідовність, вибрану з послідовностей 5ЕБО 10 МО: 9-13, і третю СОБК-послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 14-18, і/або поліпептид легкого ланцюга, що містить першу СОК- послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 27-31, другу СОК-послідовність, вибрану з послідовностей 5ЗЕО ІЮ МО: 32-36, і третю СОК-послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ
МО: 37-41.
У деяких додаткових варіантах здійснення винаходу зазначене анти-МАР-1-антитіло містить бо варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 19-23, і відповідну варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 42-46. У ще одних додаткових варіантах здійснення зазначене антитіло представляє собою повністю людське рекомбінантне антитіло, що містить поліпептид важкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮ МО:47, і поліпептид легкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮ МО:48.
У ще одних варіантах здійснення вищевказаних завдань інгібітор МАР-1 представляє собою інгібітор 55АО, такий як сполука, яка вибрана із групи, що складається з похідних гідразину, пропеніламінів і пропаргіламінів, 2-бутиніламінів, галогеналіламінів, похідних піроліну, пропаргілдіамінів, аліламінів, діамінів, похідних 4,5,6,7-тетрагідроіїмідазо|4,5-с|Іпіридину, тіокарбамоїльних похідних, карбоксамідів, сульфонамідів, похідних тіазолу й/або гуанідину, оксимних похідних, дигідразину, арилалкіламінів, оксазолідинонів, галогеналкіламінів, похідних бенфотіаміну й імідазопіридину.
У деяких додаткових варіантах здійснення вищевказаних завдань фіброзний стан обирають із групи, що складається з фіброзу печінки й запальних захворювань, що сприяють його розвитку, тобто гострого й хронічного гепатиту, захворювання жовчного міхура й жовчних шляхів, і токсичної поразки печінки, пульмонарного фіброзу, фіброзу нирок, включаючи той, що виникає в результаті діабетичної нефропатії, мієлофіброзу, фіброзу підшлункової залози, склеродерми, захворювань сполучних тканин, рубцювання, фіброзу шкіри, фіброзу серця, трансплантата органа, стенозу судин, рестенозу, фіброзу артерій, артрофіброзу, фіброзу молочної залози, фіброзу м'язів, ретроперитонеального фіброзу, фіброзу щитовидної залози, фіброзу лімфатичних вузлів, фіброзу сечового міхура, плеврального фіброзу й СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними в міру накопичення міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
Інші конкретні варіанти здійснення винаходу наводяться в залежних пунктах формули винаходу.
Інші завдання, деталі й переваги даного винаходу стануть зрозумілими з наступних фігур, докладного опису винаходу й прикладів.
Короткий опис фігур
Нижче винахід буде описаний докладніше за допомогою кращих варіантів здійснення з посиланням на фігури, що додаються, де:
На фігурі 1 показано, що введення анти-МАР-1-антитіла ВТТ-1029 приводить до практично повного захисту від індукованого ССі- фіброзу печінки. Забарвлювання сіріусом червоним печінки від мишей УМТ і з нокаутом МАР-1, яким уводили мінеральну олію (МО, контрольна група), ССіІ або ССІх разом з антитілом проти МАР-1. Кількісне визначення фіброзного рубця проводили з використанням граничної обробки зображень У. Наведене середнє значення х стандартна помилка середнього. Збільшення х10.
На фігурі 2 показано, що в печінці мишей, оброблених антитілом проти МАР-1, і в печінці мишей з нокаутом МАР-1 практично був відсутній гепатит і некротичні ділянки, незважаючи на індукцію фіброзу під дією ССіх. Показані пофарбовані гематоксилін-еозином при збільшенні х20 некротичні гепатоцити (вістря стрілок) і поточний гепатит (стрілки).
На фігурі З показано, що підвищення експресії колагену ІМ і еластину у фіброзних тканинах відвертається антитілом проти МАР-1. Проводили кількісне визначення колагену ІМ, еластину й ламініну з використанням граничної обробки зображень .). Наведене середнє значення ж стандартна помилка середнього.
На фігурі 4 показано, що рівні мРНК указують на регуляторний вплив МАР-1 на зірчасті клітини й фібробласти печінки. Показаний аналіз еластину, азМА, МАР-1 і ТІМРІ1 кількісної ОТ-
ПЦР. Дані представлені у вигляді середнього значення х стандартна помилка середнього по трьох мишах при аналізі в трьох паралелях. "р«0,05; рак, 01; и р«0,001 (АМОМА).
На фігурі 5 показано, що вміст розчинного МАР-1 і активність 55АО у сироватці крові підвищуються у відповідь на індукований ССіІ. фіброз печінки. На фігурі БА показаний вплив індукованого ССі- фіброзу печінки на вміст розчинного МАР-1 у сироватці крові по даним розділеного в часі флуорометричного аналізу з набором реагентів ОБГ РІА. На фігурі 5В показано, що підвищена активність 55АО виявлена в сироватці крові мишей М/Т з індукованим
ССіх фіброзом печінки за даними радіохімічного аналізу.
На фігурі 6 показано, що ділянки поразки клубочків, індуковані ССігх, відсутні у мишей з нокаутом МАР-1 і у мишей С57ВІ /6, оброблених антитілами проти МАР-1. Показане фарбування гематоксилін-еозином при збільшенні х40, що виявляє клубочки.
На фігурі 7 показано, що накопичення колагену у результаті індукованого ССі- фіброзу бо клубочків значно знижується у мишей з нокаутом МАР-1 і у мишей, оброблених антитілами проти МАР-1. Показано забарвлювання сіріусом червоним печінки від мишей М/І і з нокаутом
МАР-1, яким уводили мінеральну олію (МО, контрольна група), ССі4 або СсСіх разом з антитілом проти МАР-1. Кількісне визначення фіброзного рубця проводили з використанням граничної обробки зображень .. Наведено середнє значення ж стандартна помилка середнього.
Збільшення х40.
На фігурі 8 показане зниження загального числа клітин у рідині бронхоальвеолярного лаважа від мишей, підданих впливу тютюнового диму й оброблених антитілом до МАР-1 (ВТТ- 1029), у порівнянні з мишами, обробленими розчинником.
На фігурі 9 показане зниження загального числа клітин у рідині бронхоальвеолярного лаважа від мишей, підданих впливу тютюнового диму й оброблених рофлуміластом, у порівнянні з мишами, обробленими розчинником.
На фігурі 10 показане достовірне зменшення потовщення серединної оболонки в групі мишей, оброблених дексаметазоном, і в обох групах, оброблених інгібітором 55АО (ВТТ-2089), у порівнянні з мишами контрольної групи, обробленими 0,9 95 Масі.
На фігурі 11 показане достовірне зниження потовщення неоіїнтими в групі мишей, оброблених дексаметазоном, і в обох групах, оброблених інгібітором 55АО (ВТТ-2089), у порівнянні з мишами контрольної групи, обробленими 0,9 95 Масі.
На фігурі 12 показані приклади забарвлювання сегментів судин гематоксилін-флоксин сафроном (НРБ). Розмір просвіту був більше в групах С і 0, оброблених інгібітором 55АО, у порівнянні з контрольною групою А. А - група з 0,9 9о Масі; В - дексаметазон; С - ВТТ-2089 у дозі 10 мг/кг; О-ВТТ-2089 у дозі 30 мг/кг.
На фігурі 13 показана тканина нормальної печінки, цирозної печінки МАЗН і цирозної печінки
АІ О, пофарбованих анти-МАР-1-антитілом або аналогічним по ізотипу контрольним антитілом.
Забарвлювання МАР-1 більш темне в цирозній печінці МАЗН і цирозній печінці АГ О у порівнянні з нормальною печінкою або при забарвлюванні антитілом контрольного ізотипу, і відображає підвищення експресії МАР-1 у ділянках фіброзу.
На фігурі 14 показана тканина нормальної печінки й цирозної печінки МАЗН, пофарбовані анти-МАР-1-антитілом, анти-СО 31-антитілом і анти-колаген ІМ-антитілом. Забарвлювання МАР- 1 зазначене стрілками й переважає в основному в цирозній печінці МА5Н і відображає
Зо підвищення експресії МАР-1 у ділянках фіброзу.
На фігурі 15 показана тканина нормальної печінки й цирозної печінки МАЗН, пофарбовані анти-МАР-1-антитілом, анти-СОО9О0-антитілом і анти-СОЗ-антитілом. Забарвлювання МАР-1 зазначене стрілками й переважає в основному в цирозній печінці МАН і відображає підвищення експресії МАР-1 у ділянках фіброзу.
На фігурі 16 показані зірчасті клітини печінки, пофарбовані анти-МАР-1-антитілом і антитілом проти актину гладкої мускулатури, і міофібробласти печінки, пофарбовані анти-МАР-1- антитілом, анти-СО 90-антитілом і анти-колаген ІМ-антитілом. Забарвлювання МАР-1 зазначене стрілками й переважає в основному в зірчастих клітинах і міофібробластах печінки.
На фігурі 17 наведена діаграма розподілу 5МАР-1 і відповідної стадії фіброзу. Лінії вказують медіанні значення.
На фігурі 18 показані характеристичні криві виявлення (КОС) для 5МАР-1, використаного в якості єдиного біологічного маркера для прогнозу значимого фіброзу печінки (стадії ЕЕ 2-4) (фігура 18А), вираженого фіброзу печінки (стадії Е 3-4) (фігура 18) і цирозу (стадія Е4) (фігура 185).
На фігурі 19 показані характеристичні криві виявлення (КОС) для балів оцінки фіброзу за рівнем 5МАР-1, діабетичним статусом й співвідношенням А5Т/АЇТ (0,837--5МАР-1 (нг/мл) х 0,001 т діабет (так-!, немає-0) х 0,591-40д АЗТ/АЇ Т х 0,68) для прогнозу значимого фіброзу печінки (стадії Е 2-4) (фігура 19А), вираженого фіброзу печінки (стадії Е 3-4) (фігура 198) і цирозу (стадія
Е4) (фігура 195).
Докладний опис винаходу
Даний винахід заснований на несподіваному виявленні того, що білок 1 судинної адгезії (МАР-1), також відомий як семікарбазид-чутлива аміноксидаза (55АО) і обумовлений геном людини АОСЗ, відіграє безпосередню роль в утворенні фіброзної тканини. До теперішнього часу відомо, що МАР-1 бере участь у розвитку цілого ряду запальних захворювань через сприяння міграції лейкоцитів у тканину, але не було показано, що він безпосередньо залучений у патогенез самого фіброзу.
Термін "фіброз" стосується утворення або наявності надлишкової сполучної тканини в органі або тканині. Цей процес може мати місце для відновлення або заміщення у відповідь на стимул, такий як поразка тканини або запалення.
Одним із завдань, що лежать в основі даного винаходу, було дослідження ролі інгібіторів
МАР-1 у захисті різних органів від фіброзної поразки. Були отримані чудові результати, наприклад, при хронічній фіброзній поразці печінки, що викликана тетрахлоридом вуглецю в мишах, на моделі обструктивної хвороби легенів (СОРО), індукованої тютюновим димом, в мишах, і на мишачій моделі васкулярного ремоделювання, васкулярного стенозу й потовщення неоїнтими (фіброзу). Таким чином, інгібітори МАР-1 реально можуть розглядатися як антифіброзні засоби.
Таким чином, в одному аспекті варіанти здійснення даного винаходу стосуються способу придушення або лікування фіброзу в умовах іп мімо в організмі людини шляхом введення пацієнтові, який цього потребує, ефективної кількості інгібітору МАР-1. Термін "лікування" або "процес лікування" включає введення інгібіторів МАР-1 суб'єктові з метою, яка може включати профілактику, ослаблення, попередження або лікування розладів, що включають фіброз, такий як фіброз печінки й запальних захворювань, що призводять до нього, тобто гострий і хронічний гепатит, захворювання жовчного міхура й жовчних шляхів, і токсична поразка печінки, пульмонарний фіброз, фіброз нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, мієлофіброз, фіброз підшлункової залози, склеродерма, захворювання сполучної тканини, рубцювання, фіброз шкіри, фіброз серця, трансплантат органа, стеноз судин, рестеноз, фіброз артерій, артрофіброз, фіброз молочної залози, фіброз м'язів, ретроперитонеальний фіброз, фіброз щитовидної залози, фіброз лімфатичних вузлів, фіброз сечового міхура, плевральний фіброз і СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними в міру накопичення міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
Термін "ефективна кількість" інгібітору МАР-1 означає кількість, при якій, як мінімум, послабляються всі патологічні ефекти фіброзу. Фахівці в клінічній області лікування розладів, пов'язаних з фіброзом, можуть легко визначити кількості й схеми введення інгібіторів МАР-1.
Переважно інгібітори МАР-1, які є моноклональними анти-МАР-1-антитілами, уводять інтраваскулярно з інтервалами в межах від одного разу на тиждень до одного разу в три місяці в дозах у межах від 0,01 до 20 мг/кг, більш переважно від 0,1 до 15 мг/кг, найбільше переважно від 1,0 до 10 мг/кг. Альтернативно, інгібітори МАР-1 уводять підшкірно з інтервалами в межах від одного разу на тиждень до одного разу в три місяці в дозах у межах від 0,1 до 20 мг/кг, більш переважно від 0,2 до 10 мг/кг, найбільше переважно від 0,5 до 5 мг/кг.
Сполуки за даним винаходом, які є інгібіторами 55АО, можна вводити в ефективній кількості в межах дозувань приблизно від 0,1 мкг/кг до приблизно 300 мкг/кг, переважно приблизно від 1,0 мкг/кг до 10 мг/кг. Сполуки за даним винаходом можна вводити в одній добовій дозі або в перерахуванні на кг маси тіла, або сумарну добову дозу можна вводити в розділених дозах, наприклад, два, три або чотири рази на добу.
Вищевказаний аспект можна формулювати альтернативним шляхом, тобто так, що деякі варіанти здійснення даного винаходу забезпечують інгібітори МАР-1 у вигляді антифіброзних засобів для профілактики, лікування й/(або ослаблення фіброзної хвороби, такої як фіброз печінки й запальні захворювання, що призводять до нього, тобто гострий і хронічний гепатит, захворювання жовчного міхура й жовчних шляхів, і токсична поразка печінки, пульмонарний фіброз, фіброз нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, мієлофіброз, фіброз підшлункової залози, склеродерма, захворювання сполучної тканини, рубцювання, фіброз шкіри, фіброз серця, трансплантат органа, стеноз судин, рестеноз, фіброз артерій, артрофіброз, фіброз молочної залози, фіброз м'язів, ретроперитонеальний фіброз, фіброз щитовидної залози, фіброз лімфатичних вузлів, фіброз сечового міхура, плевральний фіброз і
СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними в міру накопичення міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини. Отже, інгібітори МАР-1 можна використовувати для виробництва лікарського препарату для лікування зазначених фіброзних хвороб.
Термін "інгібітор МАР-1" стосується будь-якої сполуки, що має здатність блокувати функцію
МАР-1 або його 55450 активність. Інгібітори МАР-1 можна розділити на дві основні групи: такі, що блокують антитіла, й інгібітори 55АО.
У тому розумінні, у якому в даному документі використовується термін "анти-МАР-1- антитіло" (АБ) або "моноклональне анти-МАР-1-антитіло" (МАБ), він включає інтактні антитіла, а також фрагменти антитіл, такі як Раб- і Е(ар")2-фрагменти, які здатні специфічно зв'язуватися з білком МАР-1.
Придатні анти-МАР-1-антитіла для застосування в різних аспектах даного винаходу є відомими з рівня техніки й додаткові антитіла можна одержати способами, відомими фахівцям у даній області. Наприклад, у патенті США Мо 5580780 описане моноклональне антитіло (МАБбБ), бо 182, яке розпізнає людський МАР-1 і яке може блокувати зв'язування лімфоцитів з НЕМ у мигдалинах у тесті замороженого зрізу. МАБ 182 являє собою мишаче ІдМ-антитіло, і воно є специфічним до людського МАР-1. У публікації міжнародної заявки УМО 03/093319 розкривається химерне моноклональне антитіло ВТТ-1002, що має знижену імуногенність в порівнянні з відповідними мишачими антитілами. Однак, оскільки воно є химерним антитілом, його застосування для лікування людей несе певний ризик за рахунок імуногенності й виникаючої продукції антитіл проти нього.
У публікації міжнародної заявки УМО 2008/129124, включеної в даний документ як посилання, розкриваються повністю людські анти-МАР-1-антитіла зі зниженою імуногенністю (й вивільненням цитокінів. Приклади кращих повністю людських моноклональних анти-МАР-1- антитіл включають такі антитіла, що мають поліпептид важкого ланцюга, що містить одну-три консенсусних СОК-послідовностей, вибраних із групи, що складається з послідовностей ЗЕО ІЮ
МО: 1-3, і/або поліпептид легкого ланцюга, що містить одну-три консенсусних СОК- послідовностей, вибраних із групи, що складається з послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 24-26. Інші кращі анти-МАР-1-антитіла включають такі антитіла, що мають поліпептид важкого ланцюга, що містить першу СОК-послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 4-8, другу СОБ- послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 9-13, і третю СОБК-послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 14-18, і/або поліпептид легкого ланцюга, що містить першу СОК- послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 27-31, другу СОК-послідовність, вибрану з послідовностей 5ЗЕО ІЮ МО: 32-36, і третю СОК-послідовність, вибрану з послідовностей ЗЕО ІЮ
МО: 37-41.
У ще одних варіантах здійснення даного винаходу повністю людське анти-МАР-1-антитіло представляє собою антитіло, яке позначене як 8С10 і містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 19, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІО МО: 42. У ще одних варіантах здійснення анти-МАР-1-антитіло представляє собою антитіло, яке позначене як 8А4 і містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в
ЗЕО ІЮ МО: 20, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІЮ МО:43. У ще одних варіантах здійснення анти-МАР-1-антитіло представляє собою антитіло, яке позначене як
ЗЕ10 ї містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 21, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 44. У ще одних варіантах здійснення анти-МАР-1-антитіло представляє собою антитіло, яке позначене як 5Е12 і містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 22, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІО МО: 45. У ще одних варіантах здійснення анти-МАР-1- антитіло представляє собою антитіло, яке позначене як 4В3 і містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 23, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 46. Дані антитіла також можна забезпечити у вигляді рекомбінантних антитіл, таких як рекомбінантне антитіло г8С10 (ВТТ-1023), що містить поліпептид важкого ланцюга, представлений в 5ЕО ІЮ МО: 47, і поліпептид легкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮ МО: 48.
Приклади придатних інгібіторів 55АО для застосування в даному винаході включають, не обмежуючись цим, похідні гідразину, такі як алілгідразини, зокрема, фенілалілгідразини; і похідні гідроксиламіну (тобто амінокси) похідні. Більш конкретні приклади фенілалілгідразинів включають, не обмежуючись цим, 2-(феніл-аліл)гідразин, М-(2-(4-фторфеніл)-аліл|-гідразин і (Е)-1-фтор-2-феніл-З-гідразинопропен, а більш конкретні приклади похідних гідроксиламіну включають, не обмежуючись цим, 2-аміноокси-1-феніл-етанол і 2-аміноокси-1-(3'4"-диметокси- феніл)-етанол. Такі інгібітори 55АО описані в міжнародних заявках УУО2006/094201 і
ММО2005/014530, які включені в даний документ як посилання. Інші придатні похідні гідразину включають ацетогідразиди, такі як, не обмежуючись цим, 2-(4-2-(5-(4-ацетилпіперазин-1-іл) піридин-2-ілїєтилуфеніл)ацетоксигідразид, описаний в міжнародній заявці УМО2009/145360, що включена в даний документ як посилання; і гідразинові спирти, такі як, не обмежуючись цим, (18, 25)-2-(1-метилгідразино)-1-феніл-1-пропанол, (Кк, 25)-2-(1-метилгідразино)-1,2- дифенілетанол, 1-(1"-метилгідразино)-3-(м-метоксифенокси)-2-пропанол і (ІК, /25)-2-(1- метилгідразино)-1,2-дифенілетанол (ВТТ-2079), описані в міжнародній заявці М/О 02/02090, що включена в даний документ як посилання; і гідразинові індани, такі як, не обмежуючись цим, (15, 25)-2-(1-метилгідразино)-1-інданол, описаний у міжнародних заявках МО 03/006003 і УМО 2005/080319, що включені в даний документ як посилання.
Додаткові приклади придатних інгібіторів 55АО для застосування в даних варіантах здійснення включають, не обмежуючись цим, пропеніламіни й пропаргіламіни, 4-заміщені-2- бутиніламіни, галогеналіламіни (зокрема, 2- і З-галоаліламіни), похідні піроліну, пропаргілдіаміни, аліламіни й діаміни. Більш конкретні приклади вищевказаних інгібіторів ЗБАО бо включають, не обмежуючись цим, 5-феноксипента-2,3-дієніламін, 4-(4-метоксифеніл) бут-3-
ініламін, 4-фенілбут-З-ініламін, 2-феніл-3-фтораліламін, 5-(Е)-4-(4-аміно-2-фторбут-2-енілокси)-
М-(1-фенілетил)бензамід, (Е)-3-фтор-4-(4-метилсульфоніл)-бут-2-ен-1-амін), (Е)-3-фтор-(4-(2- метилбензої|д|гіазол-5-ілокси)бут-2-ен-1-амін, (Є)-4-(4-аміно-2-фторбут-2-енілокси)-М-(1- фенілетил)бензолсульфонамід і (Е)-2-(4-фторфенетил)- З-фтораліламін (ВТТ-2089, мофегелін).
Такі сполуки описані в міжнародних заявках МО 2007/005737, УМО 2005/082343, УМО 2009/066152, МО 2009/055002, і Райтеутап еї аї., У. Мешга!Ї. Тгапот., 1994, 41, 407-414), які всі включені в даний документ як посилання.
Ще одні приклади інгібіторів 55АО, що придатні для застосування в даному винаході, включають, не обмежуючись цим, похідні 4,5,6,7-тетрагідроімідазо|4,5-с|Іпіридину (описані в міжнародній заявці УМО 02/38153, що включена в даний документ як посилання), карбоксаміди, такі як М-гідрокси-2-(2-(2-метил-1Н-індол-3З-іллуацетамідо) ацетамід і 5-аміно-2-гідрокси-М-(2- гідроксибензил)бензамід, і сульфонаміди, такі як. М2-(Ц4-(1,1-диметилпропіл)/феніл|сульфоніл)-
М1-гідроксисеринамід, описаний у міжнародній заявці УМО 2006/013209 і заявці на патент США 2007/066646, які включені в даний документ як посилання.
Крім того, похідні тіазолу й/або гуанідину, зокрема похідні 2-ациламінотриазолу, придатні для застосування в різних варіантах здійснення даного винаходу. Більш конкретні приклади таких інгібіторів 5ЗАО включають, не обмежуючись цим, М-14-(2-(4-
Чаміно(іміно)метил|аміно)феніл)етил/|-1,3-тіазол-2-іллацетамід, М-14-(2-(4-ПЧаміно(іміно) метиліаміно)феніл)етилі|-5-(4-(метилсульфоніл)бензил|д|-1,3-тіазол-2-ілу ацетамід, /- М-(4-(2-(4-
Чаміно-1Н-імідазол-4-ілуметил|феніл)етил)тіазол-2-іл|ацетамід, 2-(4--2-(2-«ацетил-аміно)-1,3- тіазол-4-іл|істилуфеніл)-М-(аміно(іміно)дметил|Іацетамід. Такі сполуки описані в міжнародних заявках УМО 2004/087138, УМО 2004/067521, УМО 2006/028269, УМО 2006/011631 і УМО 2005/089755, які всі включені в даний документ як посилання.
Крім того, різні оксимні похідні являють собою інгібітори З5АО і, таким чином, можуть використовуватися в різних варіантах здійснення даного винаходу. Такі оксимні похідні включають, не обмежуючись цим, 5-бром-1,3-бензодіоксол-4-карбальдегіду оксим, б-етокси-1,3- диметил-2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіримідин-5-карбальдегіду окКсим, 1,3-диметил-6б- (метилтіо)-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетра-гідропіримідин-5-карбальдегіду оксим, описані в міжнародній заявці М/О 2010/029379, що включена в даний документ як посилання.
Також дигідразин, арилалкіламіни, оксазолідинони, галогеналкіламіни й бенфотіамін (вітамін
ВІ), розкриті в міжнародних заявках УМО 2010/015870, УМО 2005/072738, І уУіе5 ОБ.А., пі. 9.
Віоспетіса!. Сеї! Віої!. Мої. 28, рр. 259-276 (1996) і Мебропаїйа еї а!., Аппиа! Керогів іп Мед. Спет.,
Мо. 42, рр 229-243 (2007)), які всі включені в даний документ як посилання, можна використовувати як інгібітори 55АО у різних варіантах здійснення даного винаходу.
Додаткові інгібітори ЗБ5БАО, придатні для застосування в різних аспектах і варіантах здійснення даного винаходу, включають похідні імідазопіридину, описані в міжнародній заявці
УМО 2010/064020, що включена в даний документ як посилання.
Крім того, інгібітори 55АО, придатні для застосування в різних варіантах здійснення даного винаходу, включають будь-який стереоізомер, суміш стереоізомерів, Е- або 2-форми, суміш Е- або 7-форм, проліки, метаболіт, кристалічну форму, некристалічну форму, гідрат, сольват або їхню сіль, що мають здатність інгібувати або блокувати 5540 активність МАР-1.
Інші придатні інгібітори 55АО можна піддати скринінгу з використанням тестів оцінки активності 55АО, відомих у даній області. Такі тести можуть включати тест оцінки 55БАО активності МАР-1 з використанням сполученого колориметричного методу, зокрема, описаного для моноаміноксидази й близьких ферментів (Ної! А. еї аї!.,Апаї. Віоспет., 244: 384-392 (1997)).
ЗЗАО активність в ендотеліальних клітинах також можна незалежно визначити з використанням реагенту "Атріех Кей" (10-ацетил-3,7-дигідроксифеноксазин), що представляє собою високочутливий і стабільний зонд для НгОг (2пои М., Рапспик-Моіозпіпа М., Апа!ї. Віоспет., 253(2): 169-174 (1997)). Крім того, активність аміноксидази можна визначити радіохімічним способом з використанням (|7-""СІбензиламіну гідрохлориду як субстрату (дааккоїа еї аї., Ат. 9.
Раїпої., 155(6): 1953-1965 (1999)). Як джерело ферменту МАР-1 55АО можна використовувати рекомбінантний МАР-1, експресований у клітинних лініях, таких як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) (Зтійй 0.9. еї аїЇ.,, У. Ехр. Мей., 188: 17-27 (1998)). Іншими придатними джерелами ферменту МАР-1 55АО можуть бути сироватка крові й тканини від різних видів, таких як примати й гризуни.
Для застосування відповідно до даних втілень інгібітори МАР-1 можуть бути забезпечені у вигляді фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій або розріджувач і, як активний інгредієнт, інгібітор МАР-1. Композиція містить інгібітор МАР-1 у кількості, яка достатня для протидії (повної або часткової) 55АО активності в пацієнта або бо зв'язування природного МАР-1 з біологічними лігандами МАР-1 у пацієнтів, що потрібують цього.
Фахівці в клінічній області лікування розладів, пов'язаних з фіброзом, можуть легко визначити кількості й схеми введення інгібіторів МАР-1. Як правило, дози для лікування інгібітором МАР-1 будуть залежати від таких факторів, як вік, стать й загальний стан здоров'я пацієнта, що піддається лікуванню; виду супутнього лікування, якщо таке є; кратності лікування й природи необхідного ефекту; ступеня поразки тканини; тривалості прояву симптомів і інших змінних факторів для коректування лікарем. Необхідну дозу можна вводити один або більше разів для одержання бажаних результатів. Фармацевтичні композиції для даних варіантів здійснення можуть бути забезпечені у вигляді разових лікарських форм.
Фармацевтичні композиції можна вводити в будь-якому придатному фармацевтичному носії, що використовують для введення препаратів. Їх можна вводити в будь-якій формі, що робить профілактичний, паліативний, попереджуючий або лікувальний ефект відносно фіброзних хвороб людини й тварин.
Фармацевтичні композиції для парентерального й місцевого введення включають стерильні водні або неводні розчинники, суспензії й емульсії. Прикладами неводних розчинників є пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, риб'ячий жир і органічні складні ефіри для ін'єкційного введення. Водні носії включають воду, водно-спиртові суміші, включаючи сольові розчини й забуферені розчинники для парентерального введення, що включають розчин хлориду натрію, розчин декстрози Рінгера, розчин декстрози плюс хлорид натрію, розчин
Рінгера, що містить лактозу або нелетучі жирні олії. Розчинники для внутрішньовенного введення включають рідини й замінники живильних речовин, замісники електролітів, такі як на основі розчину декстрози Рінгера. Водні композиції за варіантами здійснення можуть містити буфери, такі як натрій- або калій-фосфатні, цитратні, ацетатні, карбонатні або гліцинові буфери залежно від необхідних меж рН. Також придатним є застосування хлориду натрію як регулятора ізотонічності. Композиції можуть містити інші наповнювачі, такі як стабілізатори або консерванти. Придатні стабілізатори включають поверхнево-активні речовини (полісорбат 20 і 80, полоксамер 407), полімери (полієтиленгліколі, повідони), вуглеводи (сахарозу, маніт, глюкозу, лактозу), спирти (сорбіт, гліцерин-пропіленгліколь, етиленгліколь), придатні білки (альбумін), придатні амінокислоти (гліцин, глутамінову кислоту), жирні кислоти (етаноламін), антиоксиданти (аскорбінову кислоту, цистеїн і т.д.), хелатоутворювальні агенти (солі ЕДТА,
Зо гістидин, аспарагінову кислоту) або іони металів (Са, Мі, Мо, Мп). До придатних консервантів входять бензиловий спирт, хлорбутанол, бензалконію хлорид і, можливо, парабени.
Фармацевтична композиція може бути в концентрованій формі або у формі порошку для відновлення, коли це буде потрібно. У таких випадках можна використовувати порошкові композиції для розчинення в наповнювачах для ін'єкції/інфузії. У випадку ліофілізації кращими є деякі кріопротектори, що включають полімери (повідони, поліетиленгліколь, декстран), цукри (сахароза, глюкоза, лактоза), амінокислоти (гліцин, аргінін, глутамінова кислота) і альбумін. У тому випадку, якщо розчин для відновлення додають в упакування, він може бути чистою водою для ін'єкцій або розчином хлориду натрію або декстрози, або розчином глюкози.
Терапевтично придатні анти-МАР-1-антитіла можуть бути кон'юговані з використанням хімічного методу або генної інженерії з іншими агентами, які забезпечують спрямовану доставку антитіл до необхідного місця дії. Альтернативно з антитілами можна кон'югувати інші сполуки з використанням хімічного методу або генної інженерії для підвищення або забезпечення антитілам додаткових властивостей, зокрема, властивостей, які підвищують здатність антитіл послабляти патологічні ефекти, опосередковані зв'язуванням МАР-1.
В анти-МАР-1-антитіла можна ввести мітку з використанням хімічного методу або генної інженерії з одержанням визначуваних антитіл. Такі мічені антитіла представляють придатні інструменти для візуалізації фіброзних ділянок у людей, зокрема, для імуносцинтиграфічної візуалізації фіброзних ділянок. З метою візуалізації застосування фрагментів антитіл може бути кращим у порівнянні з використанням цілих антитіл для антифіброзної терапії, і фрагменти, отримані з повністю людських антитіл, будуть безпечніше в порівнянні з їх химерними або мишачими еквівалентними варіантами.
Деякі аспекти даного винаходу стосуються діагностики фіброзних хвороб. У зв'язку з даним винаходом було встановлено, що підвищені концентрації розчинного МАР-1 (5МАР-1) у рідинах організму (таких як сироватка або плазма крові) і, отже, підвищена активність 5ББАО корелюють зі ступенем розвитку фіброзу. Таким чином, деякі варіанти здійснення даного винаходу забезпечують засоби й способи діагностики фіброзних хвороб, таких як фіброз печінки й запальних захворювань, що призводять до нього, тобто гострий і хронічний гепатит, захворювання жовчного міхура й жовчних шляхів, і токсична поразка печінки, пульмонарний фіброз, фіброз нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, мієлофіброз, 60 фіброз підшлункової залози, склеродерма, захворювання сполучних тканин, рубцювання,
фіброз шкіри, фіброз серця, трансплантат органа, стеноз судин, рестеноз, фіброз артерій, артрофіброз, фіброз молочної залози, фіброз м'язів, ретроперитонеальний фіброз, фіброз щитовидної залози, фіброз лімфатичних вузлів, фіброз сечового міхура, плевральний фіброз і
СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними по мірі накопичення міофібробластів і коллагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
У деяких варіантах здійснення діагностику фіброзних хвороб, засновану на підвищених концентраціях 5МАР-1 і/або активності 55АО у рідинах організму, можна об'єднати з аналізом існуючих панелей прогностичних біологічних маркерів фіброзних хвороб. Це може підвищити діагностичну здатність існуючих біологічних маркерів. Іншими словами концентрації 5МАР-1 іабо активність ЗБАО можна використовувати одні або в комбінації з іншими клінічними або біохімічними маркерами в якості нового неінвазивного тесту для прогнозу наявності фіброзу.
Вміст 5МАР-1 у зразку рідини організму, такої як сироватка крові, можна визначити з використанням наступного способу. У розділеному в часі флуорометричному аналізі (ТК-ІРМА) з набором реагентів (ОБЕЇ РІА) для кількісного визначення розчинного МАР-1 використовується кон'юговане з біотином мишаче антитіло проти людського МАР-1 ТК8-14 (Віоїйе Паегаріез Согр.) як фіксатор на покритому стрептавідином мікротитраційному планшеті. Детектування зв'язаного розчинного МАР-1 проводять із використанням кон'югованого з іонами європію мишачого антитіла проти людського МАР-1 ТК8-14 (Віопйе ТПпегаріеєз Согр.) у якості індикатора. Мітка реєструється при визначенні розділеним у часі флуорометричним аналізом (лічильник Місіог3 тийПареї) при довжині хвилі 615 нм. Одиниці флуоресценції безпосередньо корелюють із кількістю розчинного МАР-1, що є в зразку. Потім дані по зразках аналізують при порівнянні зі стандартною кривою для репера.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу фіброз діагностують на основі активності
ЗБАО у рідині організму, що одержана від суб'єкта, який потребує таку діагностику й/або у якого є підозра на фіброз. Один придатний спосіб для даної мети розкритий І і еї аї. в У. Спготайоаг.
В., 810 (2004), 277-282. У даній області відомі інші засоби й способи визначення активності
ЗзБАО.
Крім того, деякі аспекти даного винаходу стосуються набору для застосування в діагностиці фіброзу. У деяких варіантах винаходу набір містить один або більше реагентів для оцінки кількості 5МАР-1, наприклад специфічне анти-МАР-1-антитіло, наприклад, одне з анти-МАР-1- антитіл, зазначених вище. В інших варіантах здійснення набір містить один або більше реагентів для оцінки активності 5540 у рідині організму, такій як сироватка або плазма крові.
Наприклад, набір може містити субстрат для МАР-1 55450, такий як бензиламін, метиламін, аміноцетон або інші аліфатичні або ароматичні моноаміни, разом з буфером, що придатний для аналізу активності ферменту 55АО, і набором реагентів, і способом детектування 55АО активності. Активність ББАО можна детектувати з використанням сполученого аналізу, у якому визначають утворення пероксиду водню в результаті прояву активності ББАО на моноамінах- субстратах, або можна визначити безпосередньо моніторингом перетворення водорозчинного аміну в розчинний в органічному розчиннику альдегід з використанням міченого "С аміну- субстрату, такого як бензиламін.
Фахівцям у даній області, мабуть, зрозуміло, що технологічні вдосконалення, концепцію винаходу можна здійснити різними шляхами. Винахід і його варіанти здійснення не зводяться до прикладів, описаних нижче, а можуть варіювати в обсязі формули винаходу.
ПРИКЛАД 1. Ефекти інгібіторів МАР-1 на моделі фіброзу печінки на мишах.
Метою дослідження була оцінка впливу інгібіторів МАР-1 на фіброзну поразку печінки у мишей.
Всіх мишей розміщали й тримали у звичайних умовах у відділі Біологомедичної служби
Університету Бірмінгема відповідно до правил Міністерства внутрішніх справ. У кожній клітці перебувало по чотири миші, і тварин адаптували до умов утримання протягом одного тижня перед постановкою експерименту. Використовували у досліді мишей-самок С57ВІ/6 і мишей
МАР-1-/- (миші з нокаутом гена АОСЗ з відсутністю МАР-1) у віці 8-10 тижнів. Мишей С57ВІ /6 одержували з розплідника Біологомедичної служби Університету Бірмінгема, у той час як мишей
МАР-1-/- (миші с нокаутом гена АОСЗ) одержували з розплідника Тасопіс, Данія за договором.
Модель хронічного фіброзу печінки на мишах відтворювали внутрішньочеревинним введенням чотирихлористого вуглецю (ССіл; АЇдпсп Спетісаї) у дозі 1 мл/кг, розчиненого в мінеральній олії, двічі на тиждень протягом 8 тижнів, у той час як контрольна група одержувала тільки мінеральну олію. Мишам, яких обробляли мишачим антитілом проти мишачого МАР-1
ВТТ-1029, антитіло вводили внутрівенно раз на тиждень за два тижні до й під час введення
Ссі« Обробку тварин припиняли через 96 годин після введення останньої дози ССі. Відбирали бо проби крові за допомогою серцевої пункції під анестезією ізофлураном, після чого мишей убивали дислокацією шийних хребців. Витягали печінку й розрізали на 4 шматочки для різної обробки.
Проводили статистичний аналіз АМОМА з використанням 5РББ5 УМіпдому5 версія 11.0.
Однобічний аналіз АМОМА з наступним роб5і пос тестом Фішера для найменшої достовірної різниці використовували для аналізу значущості в зразках з більш ніж двома варіабельними групами.
Зразки печінки фіксували в 4 95 параформальдегіді, заливали в парафін і робили зрізи товщиною 4 мкм. Зрізи для гістологічного аналізу забарвлювали сіріусом червоним або гематоксилін-еозином відповідно до стандартних методів. Для імунофлуоресцентного фарбування фіксовані зразки печінки мишей обробляли кріопротектором шляхом занурення в 30 96 розчин сахарози, швидко заморожували й готовили зрізи на кріостаті товщиною 7 мкм.
Зрізи недовго відмивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином, що містить 0,1 95 тритона Х-100 (РВ5Т) протягом 10 хв. і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з 10 95 козячою сироваткою в 0,1 95 РВ5Т. Після інкубації з первинними антитілами до еластину, колагену ІМ і ламініну (Абсат), розведеними в розчині сироватка-РВ5Т, слайди промивали три рази в РВЗ5Т і інкубували із вторинними антитілами (Іпмігодеп) протягом 1 години при кімнатній температурі.
Як і передбачалося, ССіх індукував розвиток важкої фіброзної поразки у мишей С57ВІ /6.
Після 8 тижнів у безпородних мишей маса печінки збільшилася в 8 разів за результатами фарбування фібрил сіріусом червоним з некрозом гепатоцитів і поточним гепатитом. Цікаво відзначити, що в мишей з відсутністю МАР-1 і оброблених ВТТ-1029 мало місце достовірне зниження фіброзного процесу. У цих мишей були тільки більш низькі кількості фібрил при фарбуванні сіріусом червоним, і гістологія печінки була практично нормальною з повною відсутністю некротичних ділянок і тільки незначно вираженим гепатитом (фігури 1 і 2). Крім того, мало місце достовірно більш низьке число зрілих макрофагів, що ще раз указує на істотно меншу поразку печінки в порівнянні з мишами дикого типу (дані не наводяться).
Рівні мРНК генів, пов'язаних з активацією зірчастих клітин печінки, оцінювали за допомогою кількісної ОТ-ПЦР. Наприкінці досліду загальну фракцію РНК екстрагували з печінки мишей з використанням набору Оіадеп КМАеазу Міпі (2474104). РНК транскрибували назад в матриці
Зо КДНК із використанням довільних праймерів (Рготеда) і зворотної транскриптази Зирегзогірі ПІ виробництва Іпмігодеп. Кількісну ОТ-ПЦР проводили в наступних умовах: денатурація при 95 С протягом 10 хвилин, ампліфікація при 95 "С протягом 10 с, 55 "С протягом 30 с, 72 "С протягом 1с, 55 циклів. Кількісну ОТ-ПЦР проводили в термоциклері Коспе ГідпіСусіег480 з використанням референц-гена САРОН і зондів виробництва Коспе. Рівні експресії кількісно визначали з використанням "Е-Методу" (Коспе).
Дані вказують на роль МАР-1 у розвитку фіброзу печінки через регуляцію зірчастих клітин печінки (НЗС). Активовані НЗС розглядаються як основне джерело синтезу компонентів ЕСМ у фіброзній печінці, включаючи еластин. ССії, уведений мишам дикого типу, призводив до істотного підвищення рівнів «ЗМА і мРНК еластину в печінці, вказуючи на накопичення НС, що експресують аЗМА, і відкладення еластину (фігура 4). Рівні МРНК як с5ЗМА, так і еластину в печінці мишей дикого типу, оброблених ВТТ-1029, і мишей МАР-1-/- були значно нижче в порівнянні з печінкою мишей дикого типу. Розходження в експресії еластину й колагену МІ також підтверджувалися конфокальною мікроскопією, у той час як рівень ламініну залишався без змін.
На закінчення, обробка ВТТ-1029 індукувала майже повний захист від розвитку вираженого фіброзу печінки за допомогою зниження активності зірчастих клітин печінки, тим самим обмежуючи розвиток фібробластів у фіброзних ділянках. Аналогічний ефект установили у мишей МАР-1-/-, тобто майже повне попередження індукованої ССі« поразки печінки. Отримані результати вказують на те, що МАР-1 відіграє ключову роль у розвитку фіброзу печінки через регуляцію печіночних зірчастих клітин. МАР-1 55АО являє собою мідьвмісну аміноксидазу і тому є аналогічним лізилоксидазі, іншому ферменту мідьвмісної аміноксидази, відповідальному за поперечне зшивання білка ЕСМ, такого як еластин і колаген. Залишається можливим, що 55АО активність МАР-1 також прямо впливає на утворення поперечних зшивок у білках ЕСМ.
Крім того, активності 55АО сироватки крові й тканини печінки аналізували з використанням радіохімічного методу з використанням (7-""СІ|бензиламіну гідрохлориду (питома активність 57 мкюрі/ммоль) як субстрату (фіг. 5). Сироватку крові (40 мг/мл білка) або препарати ткані (2 мг/мл білка) попередньо інкубували з 5 мкМ клоргіліну й паргіліну, а також з трубками неспецифічного зв'язування з 1 мМ семікарбазиду при 372С протягом 30 хвилин. Тест проводили при 372С протягом 1 години у кінцевому обсязі 200 мкл 0,2 мМ Ма-фосфатного буфера (рн 7,4), що містить (7-"СІ|бензиламін як субстрат. Реакції по оцінці каталітичної ферментативної активності бо зупиняли, і реакційні суміші обробляли, як описано раніше дааккоїа еї а!., 1999 (Атегісап Уоигпаї ої Раїпооду, 155, 6). Вміст білка визначали методом Бредфорда зі співавторами (Вгаатога М.М., 1976, Апа!. Віоспет., 72, 248) із використанням бичачого сироваткового альбуміну як репера.
Результати показували, що, в доповнення до попередження індукованого ССі: фіброзу печінки, обробка ВТТ-1029 помітно знижувала активність З55АО у зазначених зразках печінки.
ПРИКЛАД 2. Нефропротекторні ефекти інгібіторів МАР-1 на моделі поразки нирок у мишей
Тривалий вплив ССі- викликає поразку печінки й нирок. Отже, відбирали нирки від оброблених СсСі тварин, описаних у прикладі 1, і аналізували щодо впливу інгібіторів МАР-1 на нефропатію.
Нирки фіксували в 4 95 параформальдегіді, заливали в парафін і різали на зрізи товщиною 4 мкм. Гістопатологічний аналіз проводили на зрізах, пофарбованих сіріусом червоним і гематоксилін-еозином. Забарвлювання проводили відповідно до стандартних методів.
Підраховували кількість фібрил, пофарбованих сіріусом червоним, граничним аналізом з використанням програмного забезпечення для візуалізації ..
Проводили статистичний аналіз АМОМА з використанням 5РББ5 УМіпдому5 версія 11.0.
Однобічний аналіз АМОМА з наступним розі пос тестом ТиКеу НЗО для виявлення найменшої значущої різниці використовували для визначення значущості в зразках з більш ніж двома варіабельними групами.
У мишей, яким уводили ССі5, мали місце фокальні зміни клубочків із сегментними й загальними змінами. Фарбування гематоксилін-еозином показувало наявність різних ділянок поразки, наприклад, мезангіальної гіперклітинності, адгезії й склерозу верхівкової області.
Однак найбільш часто спостерігали загальну атрофію клубочкового пучка тільки із фрагментами клубочків, що залишилися, (дані не приводяться). Цікаво відзначити, що у мишей з нокаутом
МАР-Ї1 і оброблених ВТТ-1029 були повністю відсутні ділянки з поразкою клубочків (фігура 6).
Накопичення колагену навколо клубочків, як показник фіброзу, оцінювали фарбуванням сіріуусом червоним. Введення ССіх мишам С57ВІ/6 індукувало майже дворазове підвищення накопичення колагену навколо клубочкової верхівки. Цікаво відзначити, що миші з відсутнім
МАР-1 або з введеним інгібітором МАР-1 демонстрували достовірне зниження відкладень колагену, аналогічне контролю (фігура 7). Результати чітко вказують на захисну роль МАР-1 в нефропатії, що індукована Ссі».
Зо ПРИКЛАД 3. Ефекти інгібіторів МАР-1 на моделі СОРО на мишах
Використовували модель СОРО, індуковану тютюновим димом, для оцінки впливу інгібіторів
МАР-1 на лікування СОРО.
Мишей С57ВІ/62 піддавали щоденному впливу тютюнового диму (Т5) протягом 11 діб, викликаючи розвиток запалення легенів через 24 години після останнього впливу Т5. Через 11 діб відповідь виражалася в достовірному підвищенні макрофагів, епітеліальних клітин, еозинофілів, нейтрофілів і лімфоцитів.
Мишей довільно розділяли на дослідні групи (п-10) і обробляли розчинником (РВЗ рн 7,4 у дозі 5 мл/кг ж 0,1 95 полісорбату 80) або мишачим моноклональним анти-УАР-1-антитілом (ВТТ- 1029 у дозі З або 9 мг/кг у розчиннику) внутрівенно на 1, 3, 6 і 9 добу через 4 години після впливу Т5. Інша група мишей (п-10) одержувала розчинник внутрівенно й піддавалася впливу повітря протягом такого ж періоду часу. Дві додаткові групи мишей одержували інший розчинник (0,5 95 натрієву сіль карбоксиметилцелюлози (СМС) у стерильній воді) або реперний препарат (рофлуміласт у дозі 5 мг/кг в 0,596 СМС) один раз на добу протягом 11 діб за 1 годину до впливу Т5. Остання група (п-10) одержувала розчинник перорально (0,5 96 СМС) і піддавалася впливу повітря протягом такого ж періоду часу.
Всі результати були представлені як індивідуальні точки для кожної тварини й були розраховані середні значення для кожної групи. У тому випадку, коли дані мали нормальний розподіл, спочатку їх піддавали варіаційному аналізу (АМОМА) з наступним виправленням
Бонферроні для множинних порівнянь для оцінки достовірної різниці між дослідними групами. "р"'х 0,05 вважалося статистично значущою величиною.
Всі дані також обробляли тестом Бартлетса для рівних варіацій, і для більшості дослідів варіації були в основному рівними, однак, як це мало місце в даному досліді, іноді деякі дослідні групи давали позитивний результат. Через це використовували непараметричний аналіз.
Оскільки всі дані мали нормальний розподіл, їхню оцінку проводили параметричним аналізом (АМОМА).
Процентне інгібування розраховували автоматично в Ехсеі для клітинних даних з використанням формули, наведеної нижче:
інгібування -1-- Результату дослідній рупі- результату групіз імітацієкобробки х100
Результату групіз розчинниксм Т5- результату групіз імітацієкобробки
При внутрішньовенному введенні ВТТ-1029 у дозах 9 або 3 мг/кг через 4 години після впливу Т5 на 1, 3, 6 і 9 добу досліду, в ВАГ. мало місце достовірне зниження числа індукованих клітин (інгібування відповідно 38 і 33 95, для обох доз р « 0,001) (фіг. 8). Це виражалося в помітному зниженні макрофагів (інгібування відповідно 29 ії 2295, р « 0,001 ії р '« 0,05), нейтрофілів (інгібування 66 і 59 95, для обох доз р « 0,001), лімфоцитів (інгібування 69 і 54 95, для обох доз р. « 0,001) і еозинофілів (інгібування відповідно 93іб5 95, р«О0001їр 0,01).
При введенні реперного препарату рофлуміласту перорально один раз на день за 1 годину до впливу Т5 також мало місце статистично достовірне зниження загального числа клітин (41 95, р « 0,001) (фігура 9). Це виражалося в зниженні числа нейтрофілів (63 95, ре«0,001), епітеліальних клітин (51 95, р « 0,01) і лімфоцитів (65 95, р « 0,001). У цьому досліді рофлуміласт не привів до достовірного зниження числа макрофагів і еозинофілів в ВАГ.
ПРИКЛАД 4. Ефекти інгібіторів МАР-1 на фіброз неоіїнтими й серединної оболонки стінки судин
Потовщення неоіїнтими й серединної оболонки є ранньою й важливою стадією в розвитку атеросклеротичних бляшок і важливим компонентом рестенозу. Воно супроводжується фіброзними змінами в неоінтимі й серединній оболонці судинної стінки. У даному досліді досліджували роль блокування ЗБАО при фіброзній хворобі по оцінці впливу системного введення (щодня при внутрішньочеревинному введенні) низькомолекулярного інгібітору ББАО (мофегіліну, ВТТ-2089) на індуковане манжеткою потовщення неоінтими (стеноз, індукований манжеткою) у стегновій артерії мишей АроЕЗ ГІ еідеп, які одержували помірний раціон західного типу.
Методи: 40 мишам-самцям АроєБзЗ'їєїФдеп (у віці 12 тижнів) згодовували середній гіперхолестеринемічний раціон протягом З тижнів перед хірургічним установленням манжети.
Обробку проводили щодня внутрішньочеревинним введенням 1) розчинника; 2) дексаметазону з питною водою в концентрації 9 мг/л; 3) ВТТ-2089 щодня внутрішньочеревинно в дозі 10 мг/кг; 4) ВТТ-2089 щодня внутрішньочеревинно в дозі 30 мг/кг, всі препарати вводили за день до
Зо хірургічної операції й продовжували вводити під час дослідного періоду. На 0 добу проводили хірургічну операцію, тобто манжету, що не стягує, (довжиною 2-3 мм) поміщали навкруг стегнових артерій миші. По 10 мишей з кожної групи піддавали евтаназії через 2 тижні для проведення гістоморфометричного аналізу для кількісної оцінки інгібування індукованих атеросклеротичних бляшок і потовщення неоінтими. Спостерігали достовірне зниження в потовщенні серединної оболонки й неоінтими в групі мишей, що одержували дексаметазон і служили як позитивний контроль, і в групах, оброблених ВТТ-2089, у порівнянні з контрольною групою, обробленої 0,9 95 Масі (фігури 10 і 11). Це виражалося в збільшеному розмірі просвіту на пофарбованих НР5 судинних сегментах у групах, оброблених інгібітором З5АО, у порівнянні з контрольною групою (фігура 12).
Другий дослід на тій самій моделі проводили з інгібітором З5АО з іншого хімічного класу, що відрізняється від ВТТ-2089. Цей інгібітор на основі гідразину (ВТТ-2079) уводили в дозі 10 мг/кг щодня внутрішньочеревинно й порівнювали з ВТТ-2089 у дозі 30 мг/кг. У всьому іншому дослід проводили аналогічно, за винятком того, що контрольна група з дексаметазоном була відсутня.
Інгібування 55АО мофегіліном (ВТТ-2089) у дозі 30 мг/кг внутрішньочеревинно щодня знову дало позитивний ефект, і спостерігали достовірне зниження потовщення неоінтими й процентного стенозу просвіту після інгібування З55АО. У групи мишей, оброблених інгібітором
ЗБАО ВТТ-2079 у дозі 10 мг/кг внутрішньочеревинно щодня, також відзначали достовірне зниження потовщення неоінтими. Була відсутня статистично достовірна різниця між всіма групами в діаметрі стінки судин, площі серединної оболонки й просвіту. Співвідношення інтими
БО й серединної оболонки у мишей, оброблених ВТТ-2079 у дозі 10 мг/кг і ВТТ-2089 у дозі 30 мг/кг, було значно нижче в порівнянні з контрольною групою, але процентний стеноз порожнини був достовірно нижче тільки в групі із введенням ВТТ-2089 у дозі ЗО мг/кг у порівнянні з контрольною групою. Був відсутній вплив на цілісність судин.
Дані результати показують, що системне введення інгібіторів 5БАО забезпечило менше потовщення неоінтими (фіброзу неоіїнтими) на моделі манжети на мишах у порівнянні з контрольною обробленою групою.
ПРИКЛАД 5. Ефекти інгібіторів МАР-1 на моделі фіброзу легенів на мишах
Індукований блеоміцином фіброз є встановленою й відтвореною моделлю на мишах для вивчення фіброзу легенів.
Мишам-самцям С57ВІ/6)У у віці 8 тижнів системно вводили блеоміцин (у дозі 100 мг/кг) протягом 7 діб за допомогою осмотичних мінінасосів АІлеї для індукції поразки легенів.
Спостерігали не пов'язану з легенями токсичність протягом 7-21 діб після імплантації насоса.
Після 21 доби в 12-15 95 мишей мав місце фіброз легенів, про що свідчили збільшена частота подиху й інтенсивна втрата маси тіла і, в остаточному підсумку, загибель більшої частини тварин протягом 42 діб (якщо це не відбувалося раніше).
Мишей довільно розділяли на дослідні групи й обробляли розчинником, інгібітором МАР-1 або реперним препаратом при внутрішньовенному введенні кожні З доби з 0 по 28 добу.
Половину мишей у кожній дослідній групі піддавали евтаназії на 21 добу, а другу половину - на 28 добу.
Після розкриття легені фіксували (в 1095 забуференому формаліні) і піддавали гістопатологічній обробці для оцінки фіброзних ділянок. Зрізи ткані забарвлювали гематоксилін- еозином і трихромовим барвником за Массоном для ідентифікації фіброзу. Для кожної миші кількісно визначали відношення площі фіброзної області в легенях до загальної площі легенів за допомогою комп'ютерної візуалізації.
Однофакторний аналіз АМОМА з наступним придатним розі пос тестом використовували для оцінки значущості для зразків з більш ніж двома варіабельними групами.
Було показане зниження фіброзу легенів по достовірному зниженню оцінних балів у порівнянні з контролем.
ПРИКЛАД 6. Нефропротекторні ефекти інгібіторів МАР-1 на моделі діабетичного захворювання нирок на мишах
Діабет може викликати діабетичну нефропатію (ОМ), асоційовану з прогресуючим фіброзом нирок, що призводить в остаточному підсумку до зниження функціонуючої маси нирок. Для оцінки ефекту анти-МАР-1-антитіл і інгібіторів ББАО на фіброз нирок використовували добре адаптовану модель діабету на мишах ОБ/дЬ для діабетичного захворювання нирок.
Всі аспекти даних дослідів (зміст, проведення експериментів і виведення тварин з досліду) проводили згідно з "Посібником з утримання й використання лабораторних тварин" (Маїйопаї
Асадету Ргевз5, Мазпіпдіюп, О.С., 1996).
Випробуваний препарат інгібітор ББАО ВТТ-2079 оцінювали на можливу нефропротекторну
Зо дію на моделі діабетичної нефропатії на мишах. Випробувану сполуку й розчинник уводили внутрішньочеревинно (в/ч) один раз на день протягом 42 діб мишам аБ/аЬ (ВК5 Со-І ерг аБ/ ерг аб) у віці 15 тижнів, коли вже повністю розвився діабет. Миші др/т служили як нормальний контроль із низькою масою тіла. У плазмі крові мишей 4р/4Б були підвищені рівні креатиніну, що вказувало на порушення функції нирок, а також гіперглікемію й дисліпідемію (ГО, загальний холестерин і тригліцериди) у порівнянні з мишами аБб/лт. У мишей з діабетом мало місце ожиріння, поліурія, альбумінурія й підвищений вміст Ма" у фракції сечі, що не абсорбується, (ГЕМа), що вказує на порушену реабсорбцію Ма" у клубочках. Кліренс ендогенного креатиніну (ССг), показник клубочкової фільтрації, мав тенденцію до зниження в мишей з діабетом у порівнянні з мишами аБ/т.
Самців мишей аБр/дь з неінсулінзалежним цукровим діабетом розподіляли на дослідні групи, як показано нижче:
Таблиця 1
Узагальнення структури досліду речовина (мг/кг) (самці) 21111177111аит 0171 Розчинник.у/ | 77/07 17771118 72727111 абр/аь 071 Розчинник.у/ | 77/07 17771718 8 арлаь 17 вт2гою | 7/5 177778 17417771 авлаь 17 вттгол | 15 Й. | 8 ар/т: недіабетичні гетерозиготи з низькою масою тіла ар/ар: миші ВК5 Со9-І ерг ОБЛ ерг дБ; неінсулінзалежний цукровий діабет
Розчинники й випробувану речовину вводили внутрішньочеревинно.
Після закінчення прижиттєвої фази досліду проводили розкриття мишей з відбором і консервацією тканин. Праву нирку від всіх 32 тварин фіксували в 1095 нейтральному забуференому формаліні. Виконували поздовжні зрізи й готовили парафінові блоки, робили зрізи товщиною З мкм і офарблювали йодною кислотою Шиффа (РАб5) для дослідження світловою мікроскопією. Збільшення об'єму мезангіального матриксу оцінювали в балах в 50 клубочках на нирку по напівкількісній оцінній шкалі, як описано в протоколі нижче. 50 клубочків з кожної нирки оцінювали на збільшення об'єму мезангіального матриксу за наступною системою:
Середній бал збільшення об'єму мезангіального матриксу для кожної групи розраховували додаванням балів по мезангіальному матриксу для всіх тварин у кожній групі й діленням суми на загальне число тварин у групі. Середні бали по збільшенню мезангіального матриксу наведені в наступній таблиці.
Таблиця 2
Середні бали по групі по оцінці збільшення мезангіального матриксу матриксу 6 |Втт2о7о,ї5миг 7 ЇЇ 777777171717171717171717111111117165411СсС
У нормальних тварин у клубочках можна знайти невелику кількість мезангіального матриксу, але збільшення об'єму мезангіального матриксу характерно для різних захворювань, таких як цукровий діабет. Мезангіальний матрикс включає базальну мембрану й зв'язані поліаніонні протеоглікани й інші молекули, які зафарблюються в червоно-пурпурний колір йодною кислотою
Шиффоа (РАБ). Таким чином, кількість позитивного на РАЗ матеріалу в клубочках є показником кількості присутнього мезангіального матриксу. 50 клубочків від кожної тварини досліджували при збільшенні х200 і оцінювали на збільшений об'єм мезангіального матриксу з використанням оцінної шкали, описаної вище.
Середні бали по групі по збільшенню мезангіального матриксу розраховували додаванням балів для кожного аналізованого клубочка для кожної тварини. Потім бали по збільшенню мезангіального матриксу для всіх тварин у групі підсумували й ділили на число тварин у групі з одержанням середнього бала в групі по оцінці збільшення мезангіального матриксу.
Грунтуючись на цих даних, можна було зробити висновок, що обробка ВТТ-2079 у дозах 5 і 15 мг/кг знижувала бал збільшення мезангіального матриксу залежно від дози в порівнянні із середнім по групі балом мезангіального матриксу в мишей 4р/дБЬ з неінсулінзалежним цукровим діабетом (група 2).
Для оцінки впливу анти-МАР-1-антитіл і інгібіторів ББАО на фіброз нирок використовували інші добре адаптовані моделі діабетичного захворювання нирок: 1) модель індукованого
Зо стрептозотоцином діабету на мишах і 2) однобічна обструкція сечоводу, модель фіброзу нирок. 1) Модель індукованого стрептозотоцином діабету на мишах. Мишей-самців у віці 6-7 тижнів (з масою тіла 20-25 г) витримували голодними протягом 6 годин до введення стрептозотоцину (5712). Для індукції діабету свіхоприготовлений розчин 5172 (7 мг/мл у натрій-цитратному буфері) уводили внутрішньочеревинно кожній миші в дозі 55 мг/кг на голодний шлунок. Для повної індукції захворювання дану процедуру повторювали таким чином, що кожній миші 5Т2 уводили протягом 5 днів. Через один тиждень після останньої ін'єкції 512 мишей із вмістом глюкози в крові нижче 280 мг/дл (не натще) виключали з досвіду, оскільки в таких мишей звичайно діабет не розвивається в достатньому ступені для того, щоб викликати значну поразку нирок.
Всім мишам уводили розчинник або випробувану речовину внутрішньочеревинно через день протягом З тижнів у відповідному обсязі. Всі тварини одержували звичайний лабораторний гранульований корм і воду досхочу.
Біохімічні показники сироватки крові визначали ферментативним методом (Мутаротаза-
СО) із проб крові. Поразку нирок оцінювали за біохімічними показниками, виділенню альбуміну із сечею й кліренсу креатиніну, і потім гістологічно при фарбуванні трихромовим барвником за
Массоном і йодною кислотою Шиффа.
2) Однобічна обструкція сечоводу - модель фіброзу нирок. Всім мишам уводили розчинник або випробувану речовину внутрішньочеревинно протягом 5 діб до операції й 7 діб після операції. Інгібітор і розчинник уводили через день у відповідному обсязі для інгібування 55АО.
Всі тварини одержували звичайний лабораторний гранульований корм і воду досхочу.
Мишей-самців у віці 6-7 тижнів (з масою тіла 20-25 г) анестезували інгаляцією ізофлурану (2- хлор-2-(дифторметокси)-1, 1,1-трифторетан) і вводили підшкірно 0,05-0,1 мг/кг бупренорфіну перед операцією. Мишам проводили однобічну обструкцію сечоводу (ШОО) або імітацію операції. У підданих ШШО мишей лівий сечовід лігували швом із шовку 4-0 у двох точках і перерізували між лігатурами для попередження ретроградного переносу інфекції в сечові шляхи.
Поразку нирок оцінювали за біохімічними показниками, виділенню альбуміну із сечею й кліренсу креатиніну, і потім гістологічно при фарбуванні трихромовим барвником за Массоном і йодною кислотою Шиффа.
У всіх дослідженнях використовували однобічний аналіз АМОМА і тест Даннета для визначення статистично достовірної різниці між дослідними й контрольними тваринами.
Достовірну різницю визначали при значенні р « 0,05.
Було показане зниження розвитку фіброзу нирок за даними достовірного зменшення оцінних балів у досліді в порівнянні з контролем.
ПРИКЛАД 7. Антифіброзна терапія при діабетичній нефропатії
Діабетична нефропатія є розповсюдженою причиною кінцевої стадії хвороби нирок і фіброзу, зокрема, інтерстиціального фіброзу, і представляє ключову патологічну ознаку стану нирок при діабеті. За допомогою клінічного випробування можна визначити, наскільки інгібітори
МАР-1 можуть знижувати нефропатію в пацієнтів з діабетом для пролонгації функціонування нирок.
До випробування включаються дорослі пацієнти з діабетом типу 1 або 2 зі швидкістю клубочкової фільтрації (ЕР) 20-75 мл/хв/1,73 м-, протеїнурією вище 300 мг/добу й кров'яним тиском нижче або рівним 140/90 на інгібіторі ангіотензин-конвертуючого фермента (АСЕ) або антагоністі рецептора ангіотензину (АКА). Пацієнти одержують інгібітор МАР-1 в ефективній дозі або плацебо протягом 1 року за придатною схемою введення, яка може представляти один раз
Зо у день або рідше. Пацієнтів довільно розподіляють на групи із введенням плацебо або інгібітору
МАР-1. Під час випробувань проводять регулярне спостереження за пацієнтами відносно таких параметрів, як вміст глюкози в крові натще й у сечі, кров'яний тиск і біохімічні показники. Можна здійснити інші проби для визначення рівня сироваткової З5БАО МАР-1, що може бути підвищений при діабеті й пов'язаний із прогресуванням захворювання. Крім того, можна визначити вміст метиламіну в сироватці крові. Підвищений вміст метиламіну є біологічним маркером інгібування активності ЗБ5БАО МАР-1. Пацієнтів просять регулярно перевіряти кров'яний тиск і рівень глюкози й записувати визначені показники для моніторингу діабетичного статусу. За допомогою введення інсуліну у відповідних кількостях можна досягти гарного контролю діабетичного статусу в пацієнтів.
Пацієнти перебувають на сучасному підтримуючому лікуванні із приводу діабетичної нефропатії, що може включати лікування інгібітором АСІ й/або АКА, антигіпертензивну терапію з метою збереження цифр 130/80 і надійний контроль глікемії відповідним набором для НЬА1С.
Функцію нирок оцінюють за допомогою СЕК і первинною кінцевою точкою випробувань може бути зміна у функції нирок у порівнянні з вихідним періодом випробувань. Вторинні точки можуть включати процентну зміну у виділенні альбуміну із сечею протягом періоду випробувань.
ПРИКЛАД 8. МАР-1 як діагностичний маркер фіброзних станів
У даному документі показано за допомогою імуногістохімії що експресія МАР-1 підвищується при цирозі з дуже високими рівнями у фіброзній перегородці (фігури 13-15). За допомогою багатобарвної конфокальної мікроскопії оцінювали експресію МАР-1 у зірчастих клітинах і міофібробластах печінки (фігура 16). Культивовані людські зірчасті клітини печінки (НЗО) використовували для підтвердження експресії й секреції 5МАР-1 НЗС в умовах іп міїго. На підставі цих результатів можна було припустити потенційну роль МАР-1 у фіброгенезі.
Визначали концентрацію 5МАР-1 у сироватці крові в чітко визначеній групі з 138 пацієнтів з неалкогольною жировою хворобою печінки (МАРІО) зі співпадаючою й класифікованою гістологією нирок (класифікація Клейнера). Вміст 5МАР-1 оцінювали по гістології печінки (стеатоз, запалення й фіброз), метаболічних параметрах і серологічних маркерах поразки печінки (таблиця 3).
Таблиця З
Узагальнення демографічних даних і параметрів, визначених для 138 пацієнтів з гістологічно класифікованою й стадірованою МАР О норма/надлишкова маса тіла/ожиріння 4(З 90)/11(8 У0)/123(89 95
ВМІ - індекс маси тіла; НОМА-ІК - модель оцінки гомеостазу для резистентності до інсуліну;
АБТ - аспартатрансфераза; АГТ - аланінтрансфераза; АР - лужна фосфатаза; СТ - гамма-глутамілтрансфераза; СКР-С-реактивний білок.
Вміст 5МАР-1 був достовірно вище в групі з МАРІО (середнє значення ж стандартне відхилення; 945,92457,6 нг/мл) у порівнянні зі здоровими пацієнтами (300-500 нг/мл). Найбільш високі рівні мали місце в пацієнтів зі значимим фіброзом печінки (стадії Е 2-4) і була чітка лінійна залежність між 5МАР-1 і стадією фіброзу (фігура 17).
Результати одномірного кореляційного аналізу підтверджували наявність достовірної кореляції між вмістом 5МАР-1 і гістологічною стадією фіброзу (г-0,43; р-0,0000003) (таблиця 4) і за даними множинної логістичної регресії зі зворотною елімінацією стадія фіброзу була найбільш достовірним незалежним фактором, що робить вплив на вміст 5МАР-1 (таблиця 5).
Таблиця 4
Фактори, які достовірно корелюють із рівнем 5МАР-1 за даними одномірного аналізу
Вк 77777771 177717171717171717109177777771117117711111111110б00027С2щС
Таблиця 4
Фактори, які достовірно корелюють із рівнем 5МАР-1 за даними одномірного аналізу
Лобулярне запалення значення г показують коефіцієнт кореляції Пірсона
Таблиця 5
Фактори, які незалежно пов'язані з рівнем 5МАР-1 за даними множинної регресії зі зворотною елімінацією
Стадія фіброзу 0,0005
Співвідношення АЗТ/АІ Т 0,009
Білірубін
Результати одномірного й багатомірного аналізу факторів, асоційованих зі значимим фіброзом печінки (стадії ЕЕ 2-4), дозволяють зробити висновок, що рівні 5МАР-1 є більш значимими в порівнянні зі звичайними біохімічними маркерами поразки печінки, такими як ферменти печінки й співвідношення А5Т/АЇ Т (таблиці 6 і 7).
Таблиця 6
Фактори, асоційовані зі значимим фіброзом (стадії Е 2-4) за даними одномірного аналізу
Співвідношення ОБО (95 95 довірчий інтервал) 5МАР-1 (постійно) 1,003 (1, 001-1,004 0,00006 4,607 (2, 168-9,789 0,00007
Вік (роки) 1,041 (1, 010-1,072 0,008
АБТ/АІ Т 6,144 (1, 525-24,756 2,628 (1, 265-5,458 0,913 (0, 836-0,996
Таблиця 7
Фактори, які незалежно пов'язані з фіброзом за даними множинної регресії зі зворотною елімінацією
ЗМАР-1 0,001
АЗТ/АЇТ 0,009
У тому випадку, коли в групі хворих вміст 5МАР-1 використовували в якості єдиного біологічного маркера для прогнозу значимого фіброзу печінки (стадії Е 2-4), рівень 21000 нг/мл мав позитивне прогностичне значення, що становить 88,9 965. Площа під характеристичною кривою виявлення (АШКОС) для прогнозу значимого фіброзу (стадії Е 2-4), вираженого фіброзу (стадії Е 3-4) і цирозу (стадія Е4) становила 0,71 (0, 62-0,80), 0,68 (95 95 довірчий інтервал 0, 58- 0,78) і 0,75 (95 9о довірчий інтервал 0, 58-0,92) відповідно (фігура 18).
Крім того, на підставі результатів можна припустити, що є можливість поліпшити чутливість і специфічність 5МАР-1 для прогнозу фіброзу печінки при його об'єднанні з іншими клінічними й біохімічними показниками. Бал оцінки фіброзу (розрахований із рівняння регресії) для факторів, незалежно асоційованих з фіброзом печінки з використанням мультимерного аналізу (5МАР-1, діабетичний статус і співвідношення А5Т/АГТ), мав АОКОС для прогнозу значимого фіброзу (стадії Е 2-4), фіброзу на пізніх стадіях (стадії Е 3-4) і цирозу (стадія Е4) на рівні 0,79 (95 95 довірчий інтервал 0,71-0,87), 0,80 (95 95 довірчий інтервал 0,71-0,88) і 0,89 (95 95 довірчий інтервал 0,74-1,02) (фігура 19).
Білок МАР-1 має активність ферменту моноаміноксидази, який називають 55:50 (семікарбазид-чутливою аміноксидазою). Оскільки активність ферменту З5АО є складовою частиною білка МАР-1, з цього витікає, що вміст 5МАР-1 у рідинах організму також можна визначити по активності 55АО у рідині організму (такій як сироватка або плазма крові). 5БАО є джерелом основної моноаміноксидазної активності сироватки й плазми крові людини, діючі на субстратах 554А0О, таких як бензиламін або метиламін. Таким чином, активність ББАО можна використовувати як еквівалентний маркер фіброзу печінки.
список послІДОВНОСТЕЙ «1105 Біоті Терапіс Кори., Юніверсіті оф Бірміноем «12025 БШикористання інгібіторів ЧУАВеі пия лікування фіброзних станів «ЗО азЗкЗЗ9пА «айв 48 «1705 Бахепфітіп хехвіоп 3.5 «гію її «211: 5 «вій» ВБІК «діа» Ното вавівпз -2235 тив МІЗС ЕКАТОВЕ «вв С) 1 «Ії» Б, Мав к «ВЕУ «тії» МІС КЕАТОВЕ «рр Ср... (83 «рЗ- М вбо В «рих «2212 МІС ЕБАТОВЕ «веж 3)... 31 «ф23» В, б абда й «каоу» «штіз МІВБС КЕЕБАТОВЕ «тва (А). . 4 «223 М або ї кра» сеї МІС КБАТОКЕ «дви 15. .458) ки» НН аябо в «пах 13
Хва ха Хаз Хай Хад й к «105 2 «8115 17 «йї2з БІЛОК «щі Ношо Барієйе «2 «2215 МІБС КБАТОВЕ «ша 11, «223» У, й асо м «сег «Ру» МІВС ЕКАТОВЕ «ий р.а и кава» І аб Її.
«21» МІБС ГБАТОВЕ «вих (3).,131 «жах й, З вбо Кк «аа «т0ї» МІБС ЕЕАТОВЕ «222 (43. «ве» ЕЕ, 0, У або У «вих 42215 МІС КЕАТОНЕ «тех 51... «КеЗ3з Ой аа о че «Р215 МІБС ЕЕАТІВЕ шив 73..7 «ший» Б, Б аба г «вах «21» МІбС С РЕАТОВЕ «ййй? 18)... 81 «Феї ж М, В, ХХ або без амівсокиспОожи «вх «дагі» МІ5С ЕБАТОВЕ «кавй 935.4 «жа ЖЕ, К або т же» «ді» МІС ЕЕАТОВЕ «вах 103.00) «ваз Ж, В'аво В «юІйх «2212 МІБО КБАТОВЕ «рай С, «3» їй або Н «ех с«а2ї» МІБ5С ЕБАТОВЕ «йо (СР2р..(19) «вЕЗ» У або й «пе» «22,» МІБС ЕКАТОВЕ «Еш 16: .1 61 «23» Кк аа кад
Хаа Хай Хай Хаз Хаа біу Хаа Хаа Хай хва Хаа Ха АБр Бех Хі Хаа 3 З 10 15 слу «10» З «2115 184 «їй ВІДОК
«2135 Ното Зарієпв
СОР
«віз МІБО ЕБАТИОНЕ «авож ТТ К.. «риЗ» б або к «ах -Еві» МІС КЕАТОКЕ «ай (2.8 «9232 А, б, К, В або У «2205 «г» МІС ЕКАРЧВЕ чада (3у:.(3) «3» М, КЕ, б або Кк «да» «2915 МІ5С ЕКАРОБЕ «вий 483.14) ктеї3» БЕ, б абе баз змінокислоти «вих «т0ї» МІС ЕКАТОНЕ «пай 5. .5 кигам с й, 5 або беї амінокислоти: «ших «2915 МІБС КЕАТОВЕ «вайх 16),.6) «23 шщ або без амінокислоти «20» «2915 МІБС. РЕАТОВЕ «иа» Су «й» т аба без амінокислоти «ве «их МІВС ЕКАТОВЕ ! хара» (р. .8 «ше» Ж або без амінокислоти «и» «тв МІ 50 ЕКАТОВЕ «ай (ар. г «ит Ж, Кк або Без амінокислоти «дах «гії» МІ5С КЕЕАТОВЕ «вав» 0). .4МИО «3 Ж, б, 8, М а М «жво» «ййїх МУІБЄ. ТЕАТОВЕ «й (ЛІ1..4115 кегра» її во «ВД «е21 МІ5С ЕЕАТОВЕ сша?» 12..(12) «23» Ба «ой З
Хаа Хаа Хаа Ха Хаа Хаа Хаа Ха Ха Хаа Хаз Хаа Авр тує 1 З то «8105 4 «21ї7 5 «212» БІЛОК «КіЗ» Нощто зарієепя «40025 4 бек Тух Аїа Меб Нів 1 5 «10 5 «ії» 5 «19 БІЛОК «81325 Нот» заріайв «400 5
Ави Тух Ткр Мебє бех 1 5 «10» 6 «ВМ» 5 «вій БІЛОК 2135 Ното вайівпе «Ой в бет Тухк дів Мес нів 1 5
ТО» 7 «віх. У. «Ві» БІЛОК «їі» НотОо зарізнпав «аб» 7
Аа бек о біу ТТ пія 1 5 «їз В «ії» 5 «гії» БІЛОК «213» Ноте варіспа «ро» 8
Бех Тук біу Меж Нв і З «10» З «-81ї15 17 «2125» ВІЛОК «віз» Бойо заржаена
«40025 З чаї Тїе Тхр Ре двр СіУу ех Авв о ЄТй Авіп тує Уаї Авв о бек Уаї Був ре 5 19 15 -у «еїОЖх То «11» 17 «гійз БІЛОК стЕЗ3» Ново зарівпа «00» 10
Авпоїїв Був сій Авр сі Бек біз був Ту Ту чаї Авр о бЗеї Уаї Ака і З То 185 іт вій» її «ії» 17 «Іі» БІЛОК киї3» Нощо варіепа «дрож 11
Уаї пбец Тер Вре Аяр біт бек Ап обід Авр отТух Аїа Азробежх Чаї Був і В 10 15 ме 5 «ій їй «рї1їЗз Її каїйт БІЛОК «ві» Ноше варена ко» 15 таі тів Тер Тук Авробіу 18 Тухє Пув Тук Тук Аза Авр Бех Уаї Був ї 5 10 15
Зі «ф10» 13 «211» 16 «10» БІШОК «Аз» Ново варїівие «400» 13 діа тіє сь Чаї 5Б1у піу 01у Твжх Ту Нів Маї Авр беж Уа! Був 01У 1 5 10 ІЗ «їй» 14 «9113 8 «2195 БІЛОК «213» Нощо зарієпе «во» 18
Ав; о йіз Тгр о бЗех Тук Різ АвроТук 1 5 «віх 15 «112 14 «1» БЮ «га» Нотшо варієлпяв «ро ж 15
Авр отТУк Врпе бСіу Вех біу Трт Тук Рае Ре Тук Ре Авротух 4 5 10 «105 16 «їм В ката БІЛОК «13х Ношо зарівля «005 16 дво обіу Тр обіу тує Ре Ар о тух х 5 «віз 17 «її» В «125 БІЛОК «ВІЗ» Ношо варівпе «й 1 -Іа пПув дви Ткробіу т1е Ар оїТує 1 5 «2105 і8 «її» 11 «Вій БІЛОК «213» Ного зарівопа «ВОФфе 18
Авр о рго піу вБпе бі біс Уаї тує РБе АвроТує 3 5 10 «від» 19 «21їзх 1ї7 кала БІЛОК «13» Нощо варів
«а» 19 зіп Уві сіп без уаї бій бек б1у бі бі Узі Уаї бій Рео біу Да 1 5 10 ІЗ
Вес їез Ата Бей бек Сув Азія Аза бек біу РКе Твш вве Рпе бек тТук 20 23 Зо
Аїа Мет Ніз Тур чаї ка Бі Те РК біу гу сіб без біз Тв ха 38 40 45
Аїа Уві Її Тхр Бпе АБр осіу ек Азп Бій Аве Тук маї Авро век Уві 50 о БО був біу Дкч Рре ТІ І)е бех Ду Авр о Аво бек ув АБп о ТВЕ їв Ту 73 ТУ що теп обіп Меб дз Тк бази Агу Аза бій дяр тає діа чаї Тук тує був 85 зо За
А1їа Ако АВ Аїа Тер чех Тук Ре Вар тує Ткр осі ів бі Те Бер 100 во 110
Уаї Тву Уаї бах бЗех 115 «й1аж 20 «11» 1953 «2122 БІЛОК «13» Кошюс варавив «ОО» 20 -
Зі Уа)ї біп бен Узі бів Бех біу Бі сіу пем Уаі біп Рхо 01у б1у ї. 5 19 15 бех Бе АкЯ Бей бек Сув дів Ат бек обту РБе її РБе Бех Авип Тух 23 Зо
Тк о Мехє бек Ттр Уаі Агу бій Аїя8 БЕо біу пу бСіу рей бі) Тхр Уві 5 50 45 аїа вза іє був біз Азов обіу Бак ст пу ТУє Тук Уві Авр Бек Ммаї во 55 Бо ху зі» йко Бле Тв уві бек Ако яр дл Ааїа Був дер бЗех ей Тук йо 7о т За
Бем бьп Меї деп обех пев Акад дів біз Авр ої Аія Уві ТУує Турко См не 93 з5 діа Ах АвроТук Рпа біу Бех О1у Так Тут Рпе Рпе Тук Ра Азов тут 108 105 то
Тхр піу пів сіу тре Без Уаї Тпх РБе Зек бек 11х 120 «10» 81 «11 117 «122 БІЛОК кі» Номо чзаржене «8002 гі сіп уаї бій Без уаї біз бек о бБіу БіУу сту Уаі уві біп оРхо СІ деЕд ї З 10 15
Бек Гей о Ако Бей Бек Сув Аїа Аїа беїх сіу Ве тн РБе бек бек Тут 20 -5 3
Аїа Меє Ніз Ткр о Уві Ага спів Аїза Ребо бі Був віу Пец бій ТЕв май 35 40 45
Аза Уві Пей Ткр о Ре авробіу беж Авповізч деротТух Аза Ар беж Узі во З во
Був біу Ах Бпе Ти ї11ї1е бех Ак Др одеп бек цув дзи ТВЖ Бей тую 70 75 во ев дів Мей Авп о Зех це Ах Атіа 810 Дар Так оАїа Чаї ук тую Сув
З во з5
Ата ко Авр 5іу Ттр о біу Тук Біле Дер Тег Тсробіу біп біу ТВко рев 100 105 119
Чаї Тнк Уаї Зак бег 115 «10» 22 «Ті» л17 «іа БІЛОК «Ь3» Ноше зарієйв к«апйх 22 бі За) Зіпобеч Мазі Авро бек сі 5іУу ар оМаї Уві сій Рко с1іу Ажа 1 з 10 15
Зек їв Агсе ев беж Сув Аїз Аїа Бек біУу Ре бак БНе бек Ак бе 28 ав 30 сій ІІе пів тТкр Уві Ака сів вів Ро сту Був сСіу бе бів Тв Уві
З 43 45 вів уаї Тіє Ткр Тух Авр бБіуУ ї11е Тух Був Тує Туб Діа Ар бек Уаї о 55 БО був 01уУу Аку Ре Тис її Бек Ак Авр о Аяп обек пув Абп отв Бей тух 7о 75 во
Бам бів Мес АвпобЗех ви Ато Аа бій Аве оТйк діа Чаї Тук Тухг Сув 85 зо З5
АтТа Ах біз пув Ап оТкросьу Її АБО Тут Ткр Сіу сї1п б1Уу ТВ Без 1950 105 110
Чаї ТвЕ Уаї Вех Бек «ей» 23 «115 115 «Біг» БІЛОК «різ» Нощто зарієпеш «00 23 щи Уві бій пев Уаї сіп бек Біу іу БЕ Тех туаї Нів рго стіу Ту і 5 10 15 зек цей Ахч Пей бех Стув вів Сіу бек СТУ Ре Бко Уві Бех беж Тук 23 2 а біу Ммек Ні Тк Маї Аква сіб Ата срго бІ1у Буя сту Беб об Тгр уаї
З: 48 ЯЗ
Бех вів ї1е бьУи Тваї Біу бїу піу Тих тТук вів узі Ав бек о Уувь був що 53 вО 51у дк вне Тв їіє беж Аху Ар дви діа Був два бек реп тую Без 5 7о 75 во біп Меї Аяапобеє Пец о дед Аза біу Дар Ме Аза Уаї Тут Тух Сув Аїз 85 20 з5
Аку Авр обто біу ре сб3у Ста ба! Тук Рпе Авр о Тук Ттр біу зїв бу 105 КУ 1
Тнх Бен Узі тих Уваї бех бек їїт5 «2105 24 «її 12 «8185 ВІДОК
«213» Ношо чарієгів «вах «ші? МІБС ЕБАТОКЕ хеайх (ЗК..19) «Тез» баб 5 «ей «221і» МІБС ЕЕАТОВЕ. хай» 46). (6) каві» т або х «ве: «ші» МІБС КЕЕАТОВЕ «дей» (83-48) «ве3» Баов «220» . «авї» МІВС КЕАТУНЕ «й» (51..9) «232 5 або без амінокислоти «80» «291 МІБС ЕКАТОВЕ «Фей» 130)3..(10) «веі» А, ЖЕ, М або У «002 24 дкоа діа бес біз Хаа Хаа бек Хаа Хаа Хай Бевз Аїа і В 16 «10» 5 «115 7 «й10х БІЛОК «135 Ното варієпв «вх «22їв МІБС КЕАТОВЕ «йо» 11... «2932. 0 айо б «жшйх «пі» МІБС ЕЕВТОНЕ «два (8... «2232 8 аа М «ах «2212 МІБС КЕАТОКЕ «гг» (8..45) «ри її або В хавох «т8їз МІ5С КБАТУВЕ «ов» (6) ек) «гг А, Б адо «Ох «ва1ї» МІБС ЕБАТУВЕ «Фашт» (1..(7 «Тих 5, т або В
«4505 75
Хаа Аїа Бек Хда Хав Хай Хай ї 5 «вібйж те «вії 8 «рід БІЛОК «вах НощОо варієпв «2205 «і» МІБС ЕКЕАТОКЕ кий (3.3 «2232 ЖК, ХХ вдбОо СВ «вт «2215 МІБО ЕЕАТОВА «ВІ» (ау. «га М, б айо 5 кепй» кр МІВ С ЕБАТОКЕ «аа (851. «вай» б 'айши м «ек І жит МІБС КБАТОВЕ кий (бі. же Ж, КЕ, М аб й «ВО «ев» МЕТБС ЕБАТОВЕ «ее» (8). (3 «вЕЗ3з Б Або т «005 26 міо зів о Хад хава Хав хаз ко» Ха тах
Кая З «вій 7 «21ї» 11 «рій БІЛОК «97135 Нощо парівся «Ом в
Аха дід бек біп о 0іу Те бек Агу АТж Гео Аза 1 З Ку «В1Пп 58 «її 11 «вій БІЛОК «2135 Номще зарівгів «аа» В дго Азія бек біз Бех Уві бек Зет ТУуг їжі Лів ї Б 1й
«10» 25 «115 11 «ій» БІЛОК «213» Ново вархепе «002 2
Акч Аїа Бест зій су ї1е бег Акз АтТа пецй д3іа і З 10 . «10х 30 «її» 31 «й192з ВБІДОК «віЗхж пото варівпаз «00» 30 вхЗ Аїа Бех іп сі Ізв Бех беж Тк їз 818 1 5: вя; «ій 3 я? їЕ» 19 кеїй» БІЛОК «13» Ното варієйв «дз 31 дхчо дів Бах бів Бех Уаі бек Бех Зеб Бпе бе Аїа 1 5 І0й чахОоЗ (38 «115 7 «ій БІНОЄ «213» ото зарівоз «дО ло
Азе діа Бех бат гей сі Бех
Її 5 «віх о За «11 7 «йї2» БІК кві3» Ношо варієпв «4002 33
АвроАїв бах Авп о Ага Аїв жах 1 З «й10». 34 «Ще 7 «из БІЛОК кеВ» Ново бваріепз «оп 34
Авр Дів бве Авп беч бів Ага 1 З «МІ 35 -вТЕх 7 «122 БІЛОК «РІЗ» Ношо нарівпа каса» 35 зу Аїз бек Бек бер ія Зет їх З «Р1йз 36 «Ії» 7 «Р12з БІЛОК «2135 Номо завієйя «00» 36 сіу Аїіа Бек Бек Аку Ата ТНЕ ї 5 «чЕВОм З7 «ЕІ З «212 БІЛОК «13» Ново зарієпта «4005: 37
Сій біз впе Авб Бек Тук Ехо Бей ТпЕ ї З «210» 38 «Ії 5 «10» вІюЮК І 2132» Пото варіепв «4002 ЗВ
Сів бій дка Бех Двпотгр Ро без ТВХ ї й «піз за сЕїї12» 9 : «219» ВІЛОК «бТіЗз Ношо Заріваз кад» 35 бій бій ре Вей бах рРаЄ рко пей тп 1 5 -2105 до «її» З «вії2з БІДОК «ІЗ» Ноте зарієйв
Зо
«бо» 40 сів сій Тук Ап о бек Туєк Во Дкд тах 1 5 кіп» 41 к«іїх З «2125 БІДОК «2135 Ното зарієпв «О0з 4 5ій біп Тук біу Беж бет рко Бей Те ї З «еВ» Я2 «йІї» Лот «-218з БІЛОК «2135 Ното варієпа «аа» 45 уУуаваї тів біп рей Тк о бів Зег Ро йщек бек цео Бек дія ех Уаї бу 1 5; 10 15
Авр овбка Уві Тпк їїе Твх Сув АкЯ Аза Беї СІЯ біУ І1їе Бек Ак Аїд 26 кі за теп Аіїа Тв ТУЮ біб бій Був Бко СтТу пу бБІу го був йей Бем їїе ув; а5
Тух Ар Аза Бек Бех лем піз бех сіу Уді Ето бек Ах РБе Бех сту 0 зек сзїу заї азіу тих АБр о Рпе тТпх пез Ту І1їе Бек Бек йеч біп Ко
БУ то 75 80
Січ Авр Бпе А1і3 Тпх Ту Тук Сув Сі о бБівз Бпе Авпобек Тує Рко Сей 85 щі 5
ТвІ ве 5іу сіж біуУу ТНжЖ був Маї біз ї1е Був яв) їо5 «кОм З «211 307 «бій» вІЛОК «гіЗ3» Ното зваріепв «ай» 43 бі їі Узі ївей Твкобіп о бег Рко Аза ТБт їв) беж їв); бе Вго 0іу ії 5 То 15
Сі» Дха Віа Тржх о Сцез Вес Сує Дка4 Ата бек Сіїть Чех чаї бек Зек тує в; В 30 їжу діа ТгроТуї Сіп бій Пув Рго біу біп Аїа Рхо йго Пед Ге) Ті 35 40 45
Туг Азр діа йех Азп Ако йїа ТВх Сіу Тіє Рго діа Ак пе Чех біу 58 50 цех біу ек Сіу ТВх Авр Ре Тик ем Три біє Зек бех бец. бій Рго 55 то т5 яО
Фіз двробне Аза Уаї Тук їТує Сув 013 біб дко бех Дяг отТгр о бхо Без 5 зо ЗБ
ТВх бе Зі Сіу БіУу тах бує Уаії бій Іїе Буз 100 жо «Ох я «2115 107 «12» БІЛОК «23» Ното зарівня «Об» ай
Аїа її бій Без Таж бів Бас Рко беж Зек Гей бек діа Бех чаї Ту 1 5 182 15
Авр ака уаї Тр її Тв; Суб ДкЯ Аїа бев біб бі1У Ті бЗехг Ака Аїа за ви Аа Тер Тук біп бій Був Рко СТУ Пув та рез Був Бей оївз їЇТе 33 40 45 тух Вер о Аїа бет Дао тей пін дгу щшіу Уаї бло бек Ака Бйе век сту о ве еб
Бек сту ек щу Тит Авр вне тв дей Твх їїе бек бек Гецм біп Рке то. ту 8о біз Авр о рбе діа Трек Тут Тук Суз біп біп Бйе двпобех Бре вхо ев 85 50 55 тТрЕ вве сіу сіу біу Тиг був Маї біб ї1е був їпа 105 «ій» 45 «йії1з 187 «бій» ВІЛОК «вій Ношо зарієпв: «400»: 45
Азр жі біп о Меб ТЬк осіб) бек ко бек беї Бей бек Аїа Бех уві біу ї 5 19 15
Ар о Аку уаї тТвж Ї1е Твх Суз Ага АкБа бек біп біу 116 бек бек. Тер 20 28 30
Без Ака Тур Тут біб біб був Рго 1 Був Аза Бгто Був бат Пен ї1в 35 40: 45
Тут б1іу Афїа Чех бек без іп Бек білу УМаї Рко Бер Ак РБе Зек Біу во пе 59 чек біу цех 51Уу Тк дав Ра Тк Те тво ї1іє Зек бах рей бій Бго
БО то 75 80 зів дзе Бе Ада ТпЕ Тук Тук Сув Сіїб біп о Тук Ап обех Ту РКО Ак зо 35
ТВ о РНе піу Стій О1У ТУ Був УЯї бій 116 Був 130 155 кі» 46 «КРУ «їй БІЛОК «жі Ново заріввпа «йд0з 46 іа тів уві Пец ТЕ бл зер вко 5БУ Так їа Вес рей беж ВЕхОо СТУ і а 10 їх
Азр'Аха Аїа тах Пе) бек Суз Ак Аїа беж Сіп сеї Уаії бек Бех бек 29 25 39
Тле Ге) Аія Тер Тух біп 10 Буз Рто біу бій діа Рко Агу це бе їїє тут біу АЗа Бех Зак дДгсо Аїа Тахо СіУу г1є Рко ВвроАхо Бде Зех
Ко) 35 50 піУ бех біу Бех біу ТБт АвроБвВа Тут Без Твкої1є бек дк Бен бі 63 у 75 на
Рг обі) Авробве АТа Ууаії Тук Тук Сув бій бій Тук біу беж Бех РКО 5 зо ЗО їво ТВжховйпа біу біу бБіу ТБкК о їйув о маї ів їв Був
То ї05 «21 47 кЕ11їз 453 «крій» ВІЛОК «т13з Ното барієрв «4005 47
Мек біз Бне сіу ПейоАво Тр Маї Ре бе Уаї Аїа Без рез Аку Дер 1 З 10 їх
Уаї біп Сузг Сі Чаї біп бе Уаї бій бек йпіу біу віу Уві Мді дів 23 30
Рхо біу йкоа Зех ви АкЯ ев бех Су Аіа дів бек біу Бе Тв влпе 45
Ре Бех Тук АКа Меє Нів То Уаї Ат бік ТВЕ рхо Б1Уу ув бту Бех
За 50
Сі» Тур Уаі Аза Уві І1їе Тур Ріе Дер обіу бех двп Сів Ап отуг о уаії 15 ЗВ 30
Азв бек Узі Буз Біу йхЯ вне Те ї1іе бег одеа АвроАво Звг Був 85 85 50 з5
Твкс о фец тує бев бій Ме Аяп Ту беч вка діа біо дер ТБ Аїа Уві
Т00 65 110
Тук Тук Суз Аїа Ахя Адр Аза Тхр век Тукє РБе бер Тух Тер щу ІП 115 120 123 сту Тв ей Маї тах Узі бек бек Аїа Бех ТВАХ Був біу Рго Зек Уаї ізо 135 що
Вйе ро во лів рко Суво бат Ахд Зекх Ту Чет бід бе Тк дів АТ 145 І50 155 ВО бей біу Сув ей Уві пу Азр о Тух Ре Рко біз РК; Уві Тпх Уаї беж 155 170 175 тТЕр Авп век піу дія Бей Тпжх бек Зіу Уві нів Тве вве ре оАта уві. ї8о0 і85 150
Тен о біп бек бек б)уу їн Туг Бек їв бех Бек Уа! Уві Тк Уа) Рко 155 208 та5
Зех Заг бек Пец Піу Тьж Пув Ток оТух ТВх Суз яп Чаї АвроНія пув 210. 215 290
Бго зег двпотвЕ Кув Уаї Бво Ппув Ага Уа сів Ядаг був тТук ПІіУ РХО ше 230 2535 240
Ркзз був о Рко Рко Суз Руб Аза Рго біз Бпе Аза бі біу Рко бек Уві 245 250 255 вве цей Не Рко Ба Ццув Бо був о АвроїТвК бе Меб її Зв Аг ТЕ 280 255 7
РКО бін чаї Твж о Сув уві Уаї Уаї АвроХві Бех бій бто Авробго 61; 275 250 а
Уаї б) РБе АБвпотТтр Тук аз Авр 01у Уві бів Ущі Ні Авп о Аіа був 230 235 300
Тк був Рко Акад біц СБ бій Ре АвпоБех Тпх отух Акз Уаї Уві бек 255 315 Зї5 329
Уві Без ТБЕ Чаї Її нія 010 Адлр откробей Ав біу був єї Тук Був
З25 330 З35 сСув оув Уві Бех Авп Був бі Мем вхо Беє бех їТі6 шій Буз твж Ії 40 345 350 бБех пув Ажа Пув бі бів Вхо АжЯ бій Рхо бій ба) Тух Те ва во 355 зо 355
Бко бех бів бій бію Ме тру Був дви сій уаї беї цем тТАх бух тер 310 Зі зва уахМ був біу БМе Тук Рхо бБег Дер ї1їе Аії« уві бра Ткр. б) Зак Аеп 3а5 зо Зх 400 віУу бів ко бів Азподвп о Тух Був ТБ Тнх Рго Вко чаї Ге» Аяр о Зекг
В 410 4ї5
Авровіу Зах Ре Різ лей Тук бек АтЯ Бей тик о Уаї Авробув беє дк 420 ви 30
Ттв'яєМ» біч 01іУу Ап о Ууаї Ре бвї Суб бех Уві Меб Нія біз Аїз цец 435 4134 42
Нів Авп Ні Тух Тс бів був БЕ Без Зех пев бек Бен пту Буя 450 ЗЕ 450 «ох В київ 236 «тій БІЛОК «213» Ной варкена «ОО» 48
Меб Авр Меб Ака Уа) Рко Аза біп їв без біу їм фе цей пев о Тео 1 З 12 15 пез Рхто біу Аза Аку сСуз Маї Т1їе біп Бей Тих Зіп бек Рго бЗев бак 29 25 30 без Зех АТта Бех Маї біу Авр Аг Уві Тк І1є ТБк Сув'Аку Аза Бех 35 40 . 45 бап обі» ті бЗех Ах Віа рев Аза Тгр о Тух Сів Сій Був Рто біу пув
ЗО За (518) сту Рго Був ей Їїєв Тле Тук Авр А1а бек бек Пец бів бек біу Уаї 79 75 80 гко Бек Ака Рпе бек сіу бек спі бет біу ТИХ Авр Ре ТУ ви Тв з0 95 чів Зек вес дез стіп Бо 51іч Азр о ББе Аїз ТВЕ Тут Тут Сув бів бій
То Оо5 119
Епе Авт бек Тук РгОо цен Тпх Пе біу Бі біу Тк ру Уаї 010 тів 115 120 125
Був Ак Так Уві Ата Бі Рко бех уаї РБе тів Ра вко РКО Бех АБО 130 135 130 біз бів їєм був беї біу Тв Аіз бек уві Уаії був бен Бей дво Ай 145 155 155 180 вне тТух БРуко Ахо бій: Дій іїув Уві бій ТероГПуз Уаї Авр Аво діа Пехй 165 770 175
Сів Веїх біу Авп о Зек бів бід Зеї Уаї Так бій біп Авробек Пцув Дер 189 і85 то
Бек ТЕ тує Зек Бей бег Век Твс Бваз Ту їй Заж уз дів Ав Тух 195 209 205 сів вуз нів Був Чаї Ту Аїв Сув біх Уа) Ту Ні Бій 61Уу бец зек 210 215 а
Бек Ркб Уві Тих цу Зеж Ре йаподкЯ СІУ Зі осуя их 230 235

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Застосування повністю людського анти-МАР-1-антитіла, що містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в послідовності «ФЕО ІЮ МО: 19, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 42, як антифіброзного засобу для лікування фіброзного стану, вибраного з групи, що складається з пульмонарного фіброзу, фіброзу нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, фіброзу шкіри й СОРО, Зб захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними з накопиченням міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
    2. Застосування за п. 1, де зазначене антитіло представляє повністю людське рекомбінантне антитіло, що містить поліпептид важкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮО МО: 47, і поліпептид легкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮ МО: 48.
    З. Застосування повністю людського анти-МАР-1-антитіла за п. 1 або 2 для виробництва лікарського препарату для лікування фіброзної хвороби, вибраної із групи, що складається з пульмонарного фіброзу, фіброзу нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, фіброзу шкіри й СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними в міру накопичення міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
    4. Спосіб попередження, лікування або послаблення фіброзної хвороби в людини, яка цього потребує, де зазначений спосіб включає введення зазначеному пацієнтові ефективної кількості повністю людського анти-МАР-1-антитіла, що містить варіабельну область важкого ланцюга, представлену в послідовності 5ЕСО 10 МО: 19, і варіабельну область легкого ланцюга, представлену в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 42, де зазначений фіброзний стан вибраний із групи, що складається з пульмонарного фіброзу, фіброзу нирок, включаючи виниклий у результаті діабетичної нефропатії, фіброзу шкіри й СОРО, захворювання, при якому стінки дихальних шляхів стають фіброзними з накопиченням міофібробластів і колагену, і включаються всі подібні фіброзні тканини.
    5. Спосіб за п. 4, у якому зазначене антитіло представляє повністю людське рекомбінантне антитіло, що містить поліпептид важкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮО МО: 47, і поліпептид легкого ланцюга, представлений в ЗЕО ІЮ МО: 48.
    Група з фіб Група з припине! тот з фюорозом фіброзу енням ХК Я ї КЕ З У ОК В КК с ОО о ОКО и о. о. ОО о : щу р ех шен с Іс с . п ВО с г Ен і МЕ З я МІ СХ ше . о с І с с УАРІ-/-ЄСИ г о о. ОК ОО КЕ с ОКО о М їх : и и о . с З МО Шо, КЕ рупа з шо г "пі рупа з припи а іб вра рипиненням з 12 фіброзом фіброзу лм що ло Е а а ке Б Ф 4 ее Ст т сс Ї МАР Сом мит соя ВТ
    Фіг. 1
    ОМ ВЕа В НИКИ КК ї жоЄ ПКЕЕ НЕ МОЛ и и вя СИ и и и ин ОТ ся в я дв КИ ОО ВО Я Сл І М КАК ВЕ Ер п Дек о и ДОД ПЕ ВО НК В ПК ня де ер оо ПО и в я В НЙК М Пика о и М и я М М я о о Кн В В и м Пи я ний У Кир и я о ен а кв В Но а мой и ВЕ о и и і ВИ я А неЯХ ПК ри вн у Мо о о ноя ВЕК а ОК ох ОД КИ КО Ка В НВ В ОТАК В Ко ККД ПЕК Ер ЕЕ ЕЕ КЕ ДН Доки и ОКО ЕС А т В МК В пф и Кр и 5 ен я СД Во и Ка о ви В ЛАНИ ми В М в КК ен СТЕК ЕЕ Ен КИ ЕН оо п ПОМ и и І а ИН ях ОО А и и ДНЯ у би и нн ОО А ОККО В КИ В по нн ПО ОО од КК в Вк В В В А ОН А и в в В ЗВ о НИ ОО тая ПЕК а Кв нов В КА КО КМ Си ни но КО в и я о Кв и и КМ
    У, й. пес в СИ Пи Го ЕЕ еру я їЗ Кві Ру р в я КК, 5, дея дай со Я КК де пе ни и КК р и Пе оо В Я а о шо ГЕ дк ово ой СК Ох З НИ ВЕ й ти и ЕЕ и и в Сх ЗЕ пл ие Ки я я п По а о ВО и в и А, о ме и а и од МЕ Бех нями КК дир Ко ВА ПЕН ве С ОО де т СО я о Ки ВУ ПЕНЯ о КУ жо со ДН НЕ М в и В о и ЕК а КК В ДК ВЕ КО Ся и пах По я С В о ПЕК шо с Се дек: СЕ ДО и А в и м я ори Вр ще Інв КО и ЕН ПО Ки ПКЕЕ Аня со дея ях ПК вади В МЕККА КК Пи ПЕС ие нн КИ в пд о ен я ол Я Я По ОД я В ЗИ в во кю» о о В Он ДО в я де шо ще ПЕ о о ка УДО КОНЯ ли, в СК вокалу ва Пд ном ПЕ Ен М тн МИТ ТИ я А фр В ЖЕН и кр ик Кия С и А и М Во м Ан в в І В я ре и Я В ПЕД М ИН Ки ОУН КИ Кн вв Пов о а нн еВ В о пу Ж укр фа ОО КТК о р о Во ня ЕК У КД що я Ся ню ту я о ПО А о о и ро имя ПЕ ння ВИ ПК А Лв УЛ КК МОУ ПО Кф КА В р вою НД Ки ОО В ОО КО СХ В СОТ Е В ВВ В ф ії 2 І ж
    СУ Група а фіброзом о ШО Група з припиненням фіброзу 7 4 7 3 ЕЕ « Р Н я ши іє ІЗ з ІЗ Б Я і Ко ! Е Е ее 5 Е Ще ри : В з Ж я лк нн: не КО ї г: й 5: ; ши ши г кеш М юютчююх Ддеюютютеючня как вже Саереа чеку зате УМО Ко ШЕ НКУ кіз чл чу ій щтЖ сук 1: 3х ких Калаген |У Є Група з фіброзом Ж Група з припименням фіброзу ща 3 - жк п У в 4. щ а - 3534 У і і 5 24 сі ж гжжжж леж КУ ях» Говоававньья я ВО фун В ї пох МИ ру 1 з щ- ши ІЗ ї ї х З 1 ! І пет кдех ак і чу чу ТАК УТА КЕНЕ чести щтт х. МІХ Ламінівн СХ Група з фіброзом Ж Група з припиненням фіброзу ї4 з ах р ж че хо. Щ У Х ї Е Ж ат 1 М з Ех і в. Е ВА ж п 3 деєдссннкя З і ШИ 1 із ті ї Е Е і Н : й 45 : З А : 4 ; т я - Кк "Заиш Її і ан ТК ужочнчннчуя МО, З кжчжуючючмй бук уми МА УМ нлуктихюююч я УТА чес КОС чес Еластин Ще
    Фіг. З
    Угоупа з фхбососм ШЕ Група з припиненням Зхброгм Т3Грула з фіброзом ЩЕГрупе з прюпинеення фіброзу ; ЧУ т 8520 Зап перу нттнтнннк як че 3 ж шов ; ЖЕ з спииж нка Ех ная: ІЗ Зайва « ї щ вдо СВ Х їз ІЗ ІЗ пак: : ж й Е їх ї ї
    ОВ. ! ! ще в ва о «2 3 ІЗ ї Д ви Н ї же Ф збо і | іі Ес І Е І Ж Н НЕ оч : чт 3 в до. ; рі х ї Е - Н с І 1 я Н Н ї -- задо : Е І мовах | | ; сення Н З НН Енн у ; : се еивеяч кпсеь уч - : дея ча МО ЗУ хкоасосв НЕ Ум о чУпсси КО чтсса вт ВІТ ТВЖІ ЗЗМА льно зо НА з, коди. 2. ХХ Грип з фіброзом І Група з припиненням фікуюву х панни ТЕ груУпа з Яма Й рука з припиненням фиібосзх вол у Ж й ЕН - ї ' денне ж ЗБ Зо оо : ж зов т - ї ї х ШЕ кор т 5 зав. Н ре нео я НИ: Кк ї Е НІ Га - ї ж 005 її - е щ денну і с і І ї 15 1 їх : НУ т ри що : Гаки Н Е Е; їх с. я ї ово і і і вяЄ і я І ! я : ; : ОО Я - Бас Н Ї чтМмО т осв жЖа1ССМ о што; ; . й ій вт йо т мо штесі мок вт тт Еластин ; Удвї я
    Фіг. 4 сі Група з фіброзом і Група з припиненням фіброзу Го)
    2. ле БО0 ра ї- ря 400 в. З з З00 Е 2 200
    З б. 100 Фо МА контроль МП СІЯ ЧУАРІКОССІМ УСС т
    Фіг. 5А 140 ОС Група зсріброзом ЩО Група. з припиненням фіброзу Гі бо І: 120 о 100 в ж 80 я ва Я яд ТВ 40 Г2 за 0 МИ контроль АИТССМ 0 УАВІКО СС АРІ КО ССМ МИТ СС А ВТ ВТ 1029 1029
    Фіг. 58
    ХК КК КОХ ЗОЗ М ; є 0. с ши х п с с МОМ М ня МОН М о г о. с о.
    о. с с о ан в он вн о с а. ОО В В В ВМ М В В В В п о ОБ о я Сея КК ОО С с ЗК ХО ОО с с о. 3 с п с с с нн З Ко В В ХКня ЕК ее ОО шо Ох В Ха КЕ З ОКХ КВ КК с ОБО . З ооо. п І с ССС. о. СК ЕК К І ХА СХ МНК КК КО Ко я х я - МО ОО о. о. п в НО ОВК пе ОК Ме о шо о. о М с МОУ Я СУ ОО с о Ге ОК МК КВ о. ОК КК КОЖ ІВ. зх по о ЕВ и с З с п п ТОК Ох ОО З А ОО М с С З З о ОО п ме о о Ох и ОКО ЗО КЕ ОКО Ох В СЕ о у. ХО 5 ОК ОО
    Фіг. 5 о КВК Ко в КВ Кл ки АХ ТК Ко ин ния А и ОК ОК ОО нини Ин АН АК Ин ОН А НН НК М НН ОК Оу ге и М НН и и ИН В ИН -Х ин и і им Нм Зк НК и ви в и я 5 на, НК а и НН и І ОК НН НН ЗВ ОН НК НН м ОН НН и НН НН Гая о ИН ОБО ММ В М В УВУ Ко в МН я мн в в в В НН Ен А В М КН Я ВСЕМ КЕ ЕВ ФОМИ ІЛ ММК нн СИЛИ По НН НН ИН А ен й НК НН НК В в Я ЕДеК не НН В НО я ен о и М М и Мн М КО и и МН в ДН ов НН и Я ен и НН ни и и ОН щих ІШЛИ МНИХ ВИПИТИ МИТИ ДИНИ ШИМИ ФММ МИ МЛИН ВО ШИК Мем УТУПИ ВИ и МИ ІЕЕ Ше ПКП ТЕМ фу КМ ВЕК ОО и КВ и и В ГО А В НН ОО НН А НН ЖУМЕ ИН В ЕК ВИ УДК НИМИ ВИШ ПМ З ОУЕН и п ИМЕНИ НП ПИ ПИ нн НН я ОО НН НН І ОВ АН ОА МИНЕ ППП ВН ОПН ЕВ В ВОК ПН А нн в в ОМ и ВН я ее НН и ШУМОК КИМ ЕЕ КЕ ВІ ІДЕ ТИВИ КОНЕМ НКИ АК ВВЕ К КИ З о о НО в НН а НН М КН ЗЕ в НН НН ІН в КАК В ВО В В М В КК КК В СОМ ВН І М М В Я ВИЛКИ У и НН и НН МН и НК ИН в НИ НМ КК З НН но ок и КК Зо АД ВН о С ЗК. ПІК КОК ММА ПК КК в ор КМ Ки Е ВК Те Я ЕН и ЕВ АНУ МОЗ ЖЕ У М вн и А не и ОН и і ОК и НА НН КН М ЗОН А о У м В В и ВН и ЗД и НА ин и НН ШК УНК в М и НН ноя Во и М и МЕ А и ШІ НН ОН В НН и ПФ КИТ Ел МО КЕ МИ КОМ ВК ВК ПМК М ВОМ Мои Ми Ким ППУ У По ЕП У ТУТ ИМ ри М У МН ММК. КОНИК У ЕМ В ИьИ МУ ВОиКМД ЕП ВАВ НВ В В ІН МО ОВ КИ НН ши НН Ну нн ВИК КЕПКИ ЕК КК ФК АМ в К ЕЕЕККния МО НИ М А ОО пеня ОВ ин М М о нн в М и НО ПН и НН и в ОК и НН В ну о в в В я Кок ОК и о а ЗИ В ОН и Бо нн в и и в У ИНА ТИТА МЕНКИХИ ПИЖМА ІД ПИШИ у в и и НВ г У В в В М ВН ВИ УНН В и и в А НН ин ши нн М и я нн и ВН кн не в о ОН и а вн в Я На но в и ВНАУ КН НН НК НА о ННЯ І ИМЕНИ КАК Див ФПМ ІК В До в МКК Х ЗО В А и В А у а и А Ні и о НН М ОО А Пенн Кн вн МИКИТА ОН В и ХАЛАЛКККАКАКА АКА АМНККХ АААААЛАМАХ ККАЛ АЛЛА АКА КМ АААХ А АКА АКАКАМААКАМХ м чок зеюкєєкескскикююкюкюююєєкєк ж кики мих нки юка ююююкия щ- ШУ Кк ї : Ж ї хх Жолх дом і ке шок в: сккюккжт тю етек сю й Олі ї ї нн ї хо. Жов ох щих -т Н ше М я щі ї Кз І ух ж Н І и - ЗЕ Око Ж ї ха Н Н і Фа Н Ї ; шою жо ї. Н щ Ж ої Е кровних в ї - ізо ї Я мб пл і в МАТ ї З Я Е - | ; не не А ЗН Е в ху З шрот ІЗ Ж ї 2 8 а ше ОМА 5 Шо ц ЗЕ хі що 4 со г по ї що й ї
    ЩЕ. сихжнея оо сук чт схе 1 у уся о ую же ЕЗЕ жк ут хх 4 Уж МИТ контроль ЗТ С У КІ ІТТ х г ІК і
    Загальна кількість клітин - внутрішньовенне введення в д інгібування - 3395 З895 а і ре0о01 у р0.001 р-0.001 А що - 4 - - тож - гав; А ? т мя Ф? - а - А ? Е я - м в Ф чт о ? г: ч в? - Е Як шш в ш со й щі 0 Обробкапри 7 штялото 6 внутрішньовенному --- Меп-- -- вТ71-1029 --» введенні в міїкг З 9 Вплив Ловітря нн т ---нфь
    Фіг. 8 загальна кількість клітин - перорапьне введення в А Інгібування - 4195 т 4 р-г0.001 А р0.001 Е - - - є - А А що З гу т не А М - --- Я -- - 2 їж" Ф х -0 ко їй пиши г щі о Обробкаприсоральному а Меп. ж Рофлуміласт (п-7) введенні, мг/кг 5 Вплив Повітря -- 3 2 3З--
    Фіг. 9 14000 - Ж 120001 Дена бе о шо х Е 10000 Ж о и о синя о о. я 8000 ЩЕ ШО ЩЕ ШО Гв; ПИПИКЦПИНИИ ПИПИИИИИИИИ ПИШИ ПИИЛИШИЙ 5 що о о о 8 бю о. о о ВУ ПАК ШО ЩЕ я 40001 о. о. о. ї о о о о
    0. ВОМ БО п ВО 0,995 Мас! Дексаметазон вп 2089 ВТ 2089 контроль У питній воді у дозі у дозі мг/кг ЗО мг/кг
    Фіг. 10 тю Ж - о - 000 ВІ о вої ФДПЕПИПИНИИИ ЛЕП Е о Ж о п т 2000 - МЕ не ШИ я и М ПТПІЦІПИНИНИ СПИНИ ПИПИНИИНии ПДПІПІПИНИНИ т о о. о о. 0 ОО ВО ОО ПЕ оо масі Дексаметазон ВТ 2089 ВТ 2089 контроль у питній воді у дозі у дозі мг/кг ЗО мг/кг
    Фіг. 11 х ще -ї зд ШК, що т ша ЩЕ хо ТЕВО ПОКИ ие Ен ПНО ПМ Щ КБ Он с УВК по М ; ше ПЕН В г в ПАК Я КО Кия о Ко КК НА КК ЩО о ї ЕЕ і и ве З. В я КОСИ і КЕ й о о пом Мох и ХУ й ОВ УК Ек 0 ПЕОМ : КАН еВ р Емо пе МИ В; Ке яке ке у о СК ня ШИ пи. Я п СОВОК Ха жен ЛИ еВ х ще 5 ОКех ЕК З НИ КОН САТ й У НЯ ПОЛКИ АНУ ОБУ пи о х КАЖУ ох ТЕКИ НЕК шко | |. ! нн и ШИК Ко ПОН Я а з я ПО Пжь ПИ СОМИ щу У о що о х с. я ї У «І адкт Ме Я СИ 2 Кен Не ОДНО ПОД ВОК а ПАК пен? : с / шиимх у УТ ДЕ плин ОК СД и й СОН пошко Вер п. ня ще мя ї Ба що Кк кое В ЕВ я СК Пот ОО Аж нях я КЗ ке як щх Кня ПИ ЕММА ї Бас огиди Ве дн ши ее ПАНЕ З хе С м п пд пан ето ик Що ЕЕ ХЕ ПЕ ще й в Сеня Зла ее ї ж ДЕ КО Е АНЯ й шо і ще но й ЛА що х вки я я М : ! МОМ КОНЕМ КН 7 ех в ОО І м. в Мт ЖЕ ЩИХ дО КК в ММ дення ПКЩІК 7 шо шо «КТК пк, Зо пс їке Коен вія ТОВ ен Ед я КОНИК, ЕЕ АК МИ ДА у «. пе а зв ОКО АК Се і Те з о я де МО і. КО ве НИ кад кн Би егь не в Ше ТЯ дж х ко ще с. | і Й ї о | і. с с о. з еВ тт ЖЕ шик ТУ ТО х. ПИ п З ТК КВ МЕ дов ко ее і ЗО ПЕОМ - Во
    5 . Ех ща юр й КЕ Т ОВ НЕ ни Ж м же ЕН пе пи, пл пк Джо пад шия ях 000 ее недо армій и я МОЖ он їх я би ЄМ сту гок Фі іг. 12
    МОТО сок ! МЕ -Е вна ЩО п: - пнапопчний контро п ке ії контрольний ізотил о. ПО о ПОМ. ОХ я КОТ Еко ТИ змальна печіня МО у ТУ з о І й г я ВХ х по ОККО. Бе о Кс в с с 5 «ОВ по ОМ п. ВК я ЗК 5: М ще МО я п ши Ох с с ПО У КОКОН У о о о с о 0. пише с п 55 ОХ Я З ЛЕК ВИ п ХО МО Ох я о с с с ОО я що ХВ по М г Не г МКК КМ ОВК СА, ОКУ шо ОО п о що ау во об вд М М.
    5. дДД((ДЙЦй ши о. вх -га пи 0. ще У ОО ее Що В ОК АХ о ВО Он Яр іхрозна печінка МАБ5Н о о. о с НК во, ун і М с Ох я о с З АН В Я ле СО, Он я ЩЕ і с о с ВО ак я . ШЕ шо я - г Ме 0 ОБО я ОХ я с г г збазапюве тс у 5 с о. рапіювання УА с ПИВ Же КК с 5 с А п п СОЯ с с с ще о с керовн МН с
    ЕЕ. пен ЕВ У ОК НИ М ня ші. о ши щОАИ дя жо пл У сек МКК, ро Ба УК ВО ши хі п. о МВ де г зЗазвовлюв : неон по ща КЕКВ пе я 5 ретовання ДР ес с . с шо по ще п й Вже СО сов ПОВ ще 0. З не х ди МКК ОО Енея В ж ОКО р п. о : . З 5 в. ОК ОКУ УМ НЯ
    Фіг. 13 НЕ БЕ ! Б ПЕЕККІ КО т КО ШО бр з ПО ще и . 6 ТУ. Кия БЕН ЗМ ОТ К Ех, ся ан її ООН па о. ТОЖ се п Мен й ЛШ ПТО Ке С у Бо ЕЗ шою вої щи : Я я в. я - я я Е пл и ьо со щ о цу в. ; я ОВЕН ка г: Ще ОО Жук. бзлаген М 5 ща г: : пе бе ви М НИК Й ев ва о НЕ ОВКОХ й ЩИТ. б ДФ Д. і: КОЖ: Пе ДИКИМ о сі. ай ОБО ща . Пляж хх ЗИ со Що. чо 0. ке а НН вки фе Щ Б. Й т ди В с зве Є | ще я в. ут в БА У ООН КЕ Ой і ПЕ, ОПО ИЙ : Ж доба КО ени дов нн о Ех я 7 ще Зебарвтовання ВОЖНННЯ і | о ! що : БУ УАр.і В лику Ше Я Ел; ОХ ші ЕЕ ші ОТИКОВ КН арщаль . їх Е Й ОМ : ормальна печінка (синосоїдя) нн ке х Сеоідя хі Я ще ках дяк Оо0 ОКО , КМ Ць СИ імпозна печінка МАН пий ка МАБНІСИНОСОЇДІ ю. гсиносоїди) 100 Фіг . 14
    Цирозна печінка МАННЯ вкл вьюкнкфяас9ввокмьнинсошуо«ф«чясю в ння МНН ПО В ТИКИ М А М І І М НН НН І ИН Ох С и нн нн В и и М ОК М ОО ОО я КН ОО По КК В КВЯ Кен ве У В ЛИЖ МВА. ЖЕ, ПЛІВКИ Зх МАМА и НИ МНН Ж ДИМКМАКА Соми КМ и и НК ОПЕК па о я СН о ши ШЕ 0 30 ЕЕ с НН в о о и І ВИН и ЕМ, ВЕК КК Я ОО В Я НН о ПК ВК я Коди пек и и І І а І НН в НН и ПЕ Ки АК 5-5 ППЕШКИ ОТ. ПЕД ПК С ши. с . с шо ШО НК І а УК ПЛАН ЕК лин КК ДН ОВК ВИ, В Її : о о с Ж сша за БВ В и НН І ес и в у КН с ОК Кий 5. ЗО окш ПИпОйЖИ и типи ДШМ и КИ ВК и ВИХ ЕЕ НН Ум инНу іх ЛИХ В нон Н с ж у. УА ОК во СКК НН НН шо пе НН М НН пн її - я о ПОМЕНЕ ви В НО о а нн во НН я СПЕ Ко п В В ВВ ОО щих и о МИ, пек М СОЮ КК А АК ААКЕ Я ОДИН о КН М Ми и ин в о В ЕЕ ща р в В еВ Ох 5 ее и в В о. в о В я МУ ОО Ж ОН В 5 ши НН НЕ ОН я НЕО ЕНН ПИТИ ПЕКИ М ее У Ух ще АВ я КМ СИВИНИ МТК Ко НОЯ пани В УМХ ках МЕЗНННННН В и ни НН ПМ НН М В о ЗА ВОНИ а НА ПН КК ок МОН в и НН ВЕ в. пи ОК НН НН р СДШОМНННИИ ЕМ МЕМ НИ КК В МИ, КНУ НН о НИ ОО с ше 5 МИ ИН НИ и нд ПОВ ПИ В НН НН КОЛИ Ки ПЕК ТИКИ ОО о. ще ро и пи ЕК КИ ДМ й ЗХ КОН о. й КИйПИ СПИ ОНИ Ки КК Я УКХ Кн и В Ин Но ЛЕВИ НН, Пн еВ З МО: С ІДИ Мен КК САШКО Пе Й МАР-А С090 ; УАРА СОЗ3 Забарвлювання МАР
    Фіг. 15 . Зірчасті клітини печінки МюФфібровлаєсти печінки отри ооо орорвфавосоювани Сх дінкаеевоія сосссовансс В ши Шин МК Кт но в ЕК ДИ МДДИЕНЕК т ВВА ТИ о ооо и ПЖМх ДИН ЕНН ПЕН Ки ни о НН НН : пох В НН й НО р шнниннн Птн КЕ нище со и ПИВО ОТОЖ бокле Б ОО плит ЕХ МПК ЕК Б с я нн и но пот КВ у : а Й ще ни В Ек ЕВ п Ки НН о М ХНН В Телолтмоию Х шт Пиши М КА Па КИМ в ШК у Беню г пря Шк ПЕ Ен М и ни нн кю НН ВИ: нн в нн и а М в ниш м н я в нн и о нн ЗІ 20 ТИЖ ДН ХИТ ЖК ев КВ ЕХ Е КИНЕ В МОМ ТИКИ ак пол. Ох Во НН х т о ИН нн В мо Ту ро и ри дв Ж пф ВШ КВ М ТЕО шт, ш ФЕН ОО В о нн нн и МИНЕ Б м в о и КОСПОЛНх СПЕКА Ки АК ПИТ ПЛИТИ ПЕ пет ПД НК КК и в У 0 5 - с їе ПИЛ УКОЛИ ТЕЛА СКИПТИШИХ С я Борн ОХ в НН т. ТИМИ В с Нв ЛИЦІ ТИЗИМИ Пи ї пт. ЦИ АЖ ПОС о ЖЕК я С Дон СН: ВИВИХ ПМД Е ШИ АК п я и п Я пох пд п о нн ен с Вон ТІ БУ ШЕ З нн ВН ОН НО В ин Юа у ОО ЮНИХ в о; они, и и НКИ Ва Баш я нн нн НН М ВН НН шк ння ПТ МК тв сн а ан, яки ПДК ЕЕ о рон ня З Пют ПАН коя ЕМВ о ІНШИХ: р зо ПЛИТИ ЛЕЖНО о Кн М а . М йо 6 ьо на и нн и и, СОН НН а а НН УАР-1 аЗзМА УАвР-1 Сай Колаген М «І м з: Забарвлювання УдАР-1 х
    Фіг. 16 д'є ОЛЮОЮВ алвчстжтнжЕньиьивьжитжьиьжиннтьиттнтнинтнтнтиьиьтнвтнтжн тн жнтчнтттчтчтчнжнчнжнчЧ7отннннтлтиишнини! рн 00033 " ит тттлфГтГжтжТитнцтцтфннтлтлнТтнжлТннишш ЗО рд'х 0069 з ииттвтТвтТвиТьтТТинвтТилтєТолТиштннншши! в 2000 КУ 2 " , ; пак - з А гЯ у т роль х пом к 1000 з і жа, М «5 Фе й ь 5 пееодютесяя «
    зав. ай ож вдих я вя дах жук Бі Фзфакої? а маки ж « зх "ї пи СУТ » « « є - ж У Ж не т » Стадів фіброзу Тест Кдіака айв ре0,0003 Тест Сцліск р ОВО Значення р розраховані тестом Манн Уїтні з поправкою Бонфаерромі
    Фіг. 17
    В во (3) 2-4 г п о з Ф іх Ф Ф Ки 10096 - специфічність 96
    Фіг. 18А
    100. - 60 - І- 3 ва ж 40 Е ся шо 20 о З пох іх Ф Ф Ки 10096 - специфічність бо
    Фіг. 188 100: 80 ово о п хх оо ра ще 20 о З нт Гхх Ф Сом Ко 10096 - специфічність 95
    Фіг. 180 д в
    Є
    С. 40 йп- ! ої їм Ф Ф я є ме 12095 специфічність
    Фіг. 194 700 86 Ка) Б є ш В м
    С. ло Ж 720 В з я С Ф ее ке 10075 специфічність
    Фіг. 198 1 зо Кн Б в в й В Є з У 20
    І. З Ф г Ф я А 19095 специфічність Фіг, 136
UAA201204308A 2009-09-08 2010-07-09 Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів UA112154C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24040209P 2009-09-08 2009-09-08
US32303210P 2010-04-12 2010-04-12
PCT/FI2010/050689 WO2011029996A1 (en) 2009-09-08 2010-09-07 Use of vap-1 inhibitors for treating fibrotic conditions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA112154C2 true UA112154C2 (uk) 2016-08-10

Family

ID=43732037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201204308A UA112154C2 (uk) 2009-09-08 2010-07-09 Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів

Country Status (26)

Country Link
US (2) US9795671B2 (uk)
EP (1) EP2475387B1 (uk)
JP (3) JP6009355B2 (uk)
KR (2) KR20180026808A (uk)
CN (2) CN102740886A (uk)
AU (1) AU2010294123B2 (uk)
CA (1) CA2773218C (uk)
CY (1) CY1119867T1 (uk)
DK (1) DK2475387T3 (uk)
ES (1) ES2657943T3 (uk)
HR (1) HRP20180131T1 (uk)
HU (1) HUE035890T2 (uk)
IL (1) IL218535A (uk)
LT (1) LT2475387T (uk)
ME (1) ME02999B (uk)
NO (1) NO2475387T3 (uk)
NZ (3) NZ598920A (uk)
PL (1) PL2475387T3 (uk)
PT (1) PT2475387T (uk)
RS (1) RS56809B1 (uk)
RU (2) RU2667963C1 (uk)
SG (1) SG179012A1 (uk)
SI (1) SI2475387T1 (uk)
UA (1) UA112154C2 (uk)
WO (1) WO2011029996A1 (uk)
ZA (1) ZA201202515B (uk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA112154C2 (uk) 2009-09-08 2016-08-10 Біоті Терапіс Корп. Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів
JP5953035B2 (ja) * 2011-11-28 2016-07-13 学校法人慶應義塾 病理診断支援装置、病理診断支援方法、及び病理診断支援プログラム
CA3086105A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Boehringer Ingelheim International Gmbh Substituted 3-haloallylamine inhibitors of ssao and uses thereof
WO2014024820A1 (ja) * 2012-08-06 2014-02-13 塩野義製薬株式会社 新規慢性腎臓病治療用医薬組成物及び新規慢性腎臓病治療薬のスクリーニング方法
KR102205845B1 (ko) 2013-10-28 2021-01-22 삼성전자주식회사 입자에 기반한 모델링 방법 및 장치
WO2015189534A1 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 Proximagen Limited Vap-1 inhibitors for treating muscular dystrophy
JP2018080114A (ja) * 2015-05-29 2018-05-24 株式会社アールテック・ウエノ 抗ヒトｖａｐ−１モノクローナル抗体
EP3645039A4 (en) * 2017-06-27 2021-05-05 Neuracle Science Co., Ltd USE OF ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES TO TREAT FIBROSIS
WO2023164548A1 (en) * 2022-02-23 2023-08-31 Yale University Il-6 inhibitor as treatment for nephropathy

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4997854A (en) * 1989-08-25 1991-03-05 Trustees Of Boston University Anti-fibrotic agents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in-situ using adjacently positioned diamine analogue substrates
US5580780A (en) 1992-06-09 1996-12-03 Jalkanen; Sirpa Vascular adhesion protein-(VAP-1) and VAP-1-specific antibodies
PL192459B1 (pl) * 1997-05-23 2006-10-31 Biotie Therapies Corp Sposób utleniania aminy, sposób zahamowania aktywności oksydazy aminowej i sposoby manipulowania wiązaniem limfocytów z komórkami śródbłonka
HUP0301625A3 (en) 2000-07-05 2005-04-28 Biotie Therapies Corp 1,3,4-oxadiazine-compounds as inhibitors of copper-containing amine oxidases, process for their preparation and their use for preparation of pharmaceutical compositions
WO2002038153A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 Biovitrum Ab New use of 4, 5, 6, 7-tetrahydroimidazo-[4,5-c]pyridine derivatives
WO2002053161A1 (en) * 2000-12-29 2002-07-11 Alteon, Inc. Method for treating fibrotic diseases or other indications
US6982286B2 (en) 2001-07-12 2006-01-03 Biotie Therapies Corp. Carbocyclic hydrazino inhibitors of copper-containing amine oxidases
FI20020807A0 (fi) * 2002-04-29 2002-04-29 Biotie Therapies Oyj Uusia humanisoituja anti-VAP-1 monoklonaalisia vasta-aineita
KR20120030601A (ko) 2003-01-27 2012-03-28 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 티아졸 유도체 및 ｖａｐ-1 저해제로서의 용도
CA2520957C (en) * 2003-03-31 2013-08-06 Sucampo Ag Method for treating vascular hyperpermeable disease
AU2004263525A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 La Jolla Pharmaceutical Co. Inhibitors of semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) and VAP-1 mediated adhesion useful for treatment of diseases
CA2549029A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Faron Pharmaceuticals Oy Compositions for treatment or prevention of metabolic syndrome
FI20040270A0 (fi) 2004-02-20 2004-02-20 Biotie Therapies Oyj Kuparia sisältävien amiinioksidaasien imhibiittoreina käyttökelpoiset hydratsinoalkoholijohdannaiset
JP2007523955A (ja) 2004-02-25 2007-08-23 ラ ホヤ ファーマシューティカル カンパニー 疾患の治療のためのアミンおよびアミド
KR101206319B1 (ko) 2004-03-18 2012-11-29 가부시키가이샤 아루떼꾸 우에노 티아졸 유도체를 포함하는 수성 조성물
US20070254931A1 (en) 2004-07-27 2007-11-01 Astellas Pharma Inc. Thiazole Derivatives Having Vap-1 Inhibitory Activity
AU2005268781A1 (en) * 2004-08-02 2006-02-09 Genmedica Therapeutics Sl Compounds for inhibiting copper-containing amine oxidases and uses thereof
WO2006028269A2 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Astellas Pharma Inc. Thiazole derivatives having vap-1 ihibitory activity
WO2006094201A2 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 La Jolla Pharmaceutical Company Semicarbazide-sensitive amide oxidase inhibitors
WO2007005737A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Case Western Reserve University Amine oxidase inhibitors
US20070066646A1 (en) 2005-08-02 2007-03-22 Genmedica Therapeutics Sl Compounds for Inhibiting Copper-Containing Amine Oxidases and Uses Thereof
US20080058922A1 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 Cardiac Pacemakers, Inc. Methods and devices employing vap-1 inhibitors
FI20075278A0 (fi) * 2007-04-20 2007-04-20 Biotie Therapies Corp Uudet täysin ihmisperäiset anti-VAP-1 monoklonaaliset vasta-aineet
WO2009055002A1 (en) 2007-10-24 2009-04-30 La Jolla Pharmaceutical Company Combined inhibitors of cyclooxygenase and semicarbazide-sensitive amine oxidase (ssao) (vascular adhesion protein, vap-1)
SG186008A1 (en) 2007-11-21 2012-12-28 Pharmaxis Ltd Haloallylamine inhibitors of ssao/vap-1 and uses therefor
TWI437986B (zh) * 2008-01-31 2014-05-21 R Tech Ueno Ltd 噻唑衍生物及使用該衍生物作為ｖａｐ－１抑制劑之用途
TWI490214B (zh) 2008-05-30 2015-07-01 艾德克 上野股份有限公司 苯或噻吩衍生物及該等作為ｖａｐ－１抑制劑之用途
HUP0800498A2 (en) 2008-08-06 2010-03-29 Semmelweis Egyetem Use of dihydralazine for the preparation of medicaments for treatment of diseases related to ssao level
ES2545966T3 (es) 2008-09-11 2015-09-17 Semmelweis Egyetem Compuestos para inhibir la amina oxidasa sensible a semicarbazida (SSAO) y la proteína 1 de adhesión vascular (VAP-1) y sus usos para el tratamiento y prevención de enfermedades
MX2011002581A (es) 2008-09-16 2011-04-07 Proximagen Ltd Compuestos nuevos i.
DK2376490T3 (da) 2008-12-04 2013-04-15 Proximagen Ltd Imidazopyridinforbindelser
UA112154C2 (uk) * 2009-09-08 2016-08-10 Біоті Терапіс Корп. Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів

Also Published As

Publication number Publication date
ES2657943T3 (es) 2018-03-07
JP2013503915A (ja) 2013-02-04
US9795671B2 (en) 2017-10-24
AU2010294123A1 (en) 2012-04-12
AU2010294123B2 (en) 2013-11-21
LT2475387T (lt) 2018-03-26
RU2012113561A (ru) 2013-10-20
JP6290940B2 (ja) 2018-03-07
NZ598920A (en) 2014-06-27
CY1119867T1 (el) 2018-06-27
NZ706740A (en) 2016-06-24
US20130195883A1 (en) 2013-08-01
EP2475387A1 (en) 2012-07-18
RU2667963C1 (ru) 2018-09-25
IL218535A (en) 2016-06-30
SG179012A1 (en) 2012-04-27
JP2018104445A (ja) 2018-07-05
CN102740886A (zh) 2012-10-17
HRP20180131T1 (hr) 2018-04-20
ME02999B (me) 2018-10-20
EP2475387A4 (en) 2015-05-13
ZA201202515B (en) 2012-12-27
RS56809B1 (sr) 2018-04-30
CA2773218A1 (en) 2011-03-17
JP6009355B2 (ja) 2016-10-19
DK2475387T3 (en) 2018-02-05
NO2475387T3 (uk) 2018-03-31
CA2773218C (en) 2021-05-04
US20180071388A1 (en) 2018-03-15
KR20120088699A (ko) 2012-08-08
WO2011029996A1 (en) 2011-03-17
RU2580626C2 (ru) 2016-04-10
NZ616432A (en) 2015-04-24
PL2475387T3 (pl) 2018-06-29
EP2475387B1 (en) 2017-11-01
HUE035890T2 (en) 2018-05-28
JP2016147847A (ja) 2016-08-18
KR101837117B1 (ko) 2018-03-09
IL218535A0 (en) 2012-07-31
SI2475387T1 (en) 2018-04-30
KR20180026808A (ko) 2018-03-13
PT2475387T (pt) 2018-02-06
CN107661500A (zh) 2018-02-06
US10576148B2 (en) 2020-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA112154C2 (uk) Застосування повністю людського анти-vap-1-антитіла для лікування фіброзних станів
Zhou et al. Klotho ameliorates kidney injury and fibrosis and normalizes blood pressure by targeting the renin-angiotensin system
Pomozi et al. Functional rescue of ABCC6 deficiency by 4-phenylbutyrate therapy reduces dystrophic calcification in Abcc6–/–mice
Johnson et al. ACE2 improves right ventricular function in a pressure overload model
Yamamoto et al. ACE inhibitor and angiotensin II type 1 receptor blocker differently regulate ventricular fibrosis in hypertensive diastolic heart failure
JP6239635B2 (ja) 血管石灰化の誘導因子であるソルチリン１
JPWO2008013324A1 (ja) 糖尿病関連肝臓由来分泌タンパク質の２型糖尿病または血管障害の診断または治療への利用
US20180311356A1 (en) Method to inhibit endothelial-to-mesenchymal transition
US11116784B2 (en) Niacinamide (NAM) in ischemic tissue injury
CZ20004358A3 (cs) Farmaceutický prostředek
Mebratu et al. The aged extracellular matrix and the profibrotic role of senescence-associated secretory phenotype
US8506965B2 (en) R-RAS activity in vascular regulation
Cohen et al. Cardiac remodeling secondary to chronic volume overload is attenuated by a novel MMP9/2 blocking antibody
Lagoutte et al. Procollagen C-Proteinase Enhancer 1 (PCPE-1) is a marker of myocardial fibrosis and impaired cardiac function in a murine model of pressure overload
Imberti et al. Decreased nephron number within physiologic ranges increases susceptibility to chronic renal diseases later in life
TWI594764B (zh) 治療用途
El Kenani Mechanisms underlying low flow-low gradient aortic stenosis
Rajpurohit et al. Moving Towards Dawn: KRas Signaling and Treatment in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
KR100678523B1 (ko) Pro840 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 확인 방법