TWI831792B - 靶向淋巴細胞活化基因3(lag-3)的核酸適體及其用途 - Google Patents
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Abstract
揭示了一種能結合淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的核酸適體，及一種其用於調節免疫反應的用途。此類適體可包含富含G的模體，例如GX1
GGGX2
GGTX3
A (SEQ ID No:1)，其中X1
和X2
各自獨立地為G、C或不存在，以及X3
為T或C，或L-(G)n
-L’，其中n為整數5至9，包括端值，且L和L’為具有互補序列的核苷酸區段。本文亦提供一種含有骨架部分的多聚核酸適體，其包含一迴文序列。
Description
相關申請案。本申請案主張2018年6月12日申請的美國臨時申請案號62/684,139，以及於2018年10月3日申請之美國臨時申請案號62/740,751的權益，該臨時申請案根據35 U.S.C. §119申請，其中每一者的完整內容皆經由引用合併於本文中。
本發明係關於靶向淋巴細胞活化基因3(LAG-3)的核酸適體及其用途。
經活化的T細胞會表現多種共抑制分子，稱為免疫檢查點分子，以調節T細胞反應。示範性免疫檢查點分子包括程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴細胞活化基因3(LAG-3)，和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)。這些免疫檢查點分子在維持免疫體內穩定和預防自體免疫方面扮演重要角色。
免疫檢查點分子通常會在癌症中被活化，導致抗腫瘤免疫反應的抑制。因此，免疫檢查點抑制劑療法為各種癌症提供有效的長期治療。然而，僅有一部分癌症患者被發現對這些治療有反應。因此，開發用於抑制免疫檢查點標靶之新試劑，以經由調節免疫細胞活性(例如T細胞增殖和活化)來治療癌症和其他疾病，是相當有意義的。
本發明至少部分地基於單體形式或四聚體形式的核酸適體的開發，該適體以高親和力結合至人類淋巴細胞活化基因3(LAG-3)，並經由如破壞LAG-3和MHC第II類分子之間的交互作用而調節免疫反應。令人驚訝的是，此類核酸適體單獨表現出抗腫瘤活性，並增強檢查點抑製劑如抗PD-1抗體的抗腫瘤活性。
因此，本發明之一態樣特徵在於能夠結合至人類LAG-3的核酸適體。此類核酸適體可包含一核苷酸模體：GX1
GGGX2
GGTX3
A (SEQ ID NO:1)，其中X1
和X2
每一者獨立地為G、C或不存在，以及X3
為T或C。在一實例中，該核苷酸模體可為GGGGGGGGTTA (SEQ ID NO:2)。或者，該核酸適體可包含一核苷酸模體：L-(G)n
-L’，其中n為整數5至9，包含端點(SEQ ID NOs:3-7)，L和L’為具有互補序列的核苷酸區段(例如，每一者皆含有5至8個核苷酸)。
本文所述之任一核酸適體可包含一核苷酸序列，其至少85%(例如，至少90%、至少95%或以上)等同於下列核苷酸序列之一：
(i) TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCG (SEQ ID NO:8)；
(ii) TGGGGGGGGGTTAGACTTACACTCTTATTCG (SEQ ID NO:9)；
(iii) AGAGGGGGGGGTTAGCTGCTTTAACTCATG (SEQ ID NO:10)；以及
(iv) AGGGGGGGGGTTACTGCGCATGTATCTCAG (SEQ ID NO:11)。
在一些實例中，該核酸適體包含上述核苷酸序列之一者。
在一實例中，該核酸適體包含核苷酸序列TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG (SEQ ID NO:12)。特定實例包括：
(a) TCCCTACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCACCGTGCTACAAC (SEQ ID NO:13)；
(b) ACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG (SEQ ID NO:14)；
(c) GCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGC (SEQ ID NO:15)；以及
(d) CTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCA (SEQ ID NO:16)。
在另一態樣中，本發明特徵為一種多聚核酸適體(如四聚體適體)，其包含第一聚核酸、第一核酸適體和第二核酸適體。該第一聚核酸可包含核苷酸序列式5’-X-L1
-Y-L2
-Z-3’，其中X和Z每一者為互補於第一核酸適體及/或第二核酸適體的一部分之核苷酸區段，L1
和L2
每一者皆獨立地為連接子，且Y為具有迴文序列的核苷酸區段。該第一核酸適體和第二核酸適體可與該第一聚核酸的X和Z區形成雙鏈體(duplexes)。
在一些實施例中，本文所述之多聚核酸適體可更包含第二聚核酸、第三核酸適體和第四核酸適體。該第二聚核酸包含核苷酸序列式5’-X’-L1
’-Y-L2
’-Z’-3’，其中X’和Z’每一者皆為互補於第三核酸適體及/或第四核酸適體的一部分之核苷酸區段，L1
’和L2
’之每一者皆獨立地為連接子或不存在，Y為具有迴文序列的核苷酸區段。該第三核酸適體和第四核酸適體可與第二聚核酸的X’和Z’區形成雙鏈體。該第一聚核酸和第二聚核酸可在Y區的迴文序列形成雙鏈體。
在一些實施例中，本文所述之多聚核酸適體可包含至少二個特異於相同之有興趣目標分子之核酸適體。在一些實例中，本文所述之多聚核酸適體可包含至少二相同之核酸適體。在一些實例中，該多聚核酸適體中的所有核酸適體部分皆相同。
在其他實施例中，本文所述之多聚核酸適體可包含至少二特異於不同之有興趣目標分子之核酸適體。在一些實例中，本文所述之多聚核酸適體可包含至少二不同之核酸適體。在一些實例中，該多聚核酸適體中的所有核酸適體部分皆不同。
在一些實施例中，任一多聚核酸適體中的第一核酸適體、第二核酸適體、第三核酸適體與第四核酸適體之至少一者，可為本文揭示之可結合至人類LAG-3之核酸適體。
在又一態樣中，本發明提供一種多聚核酸複合物，包含第一聚核酸與任擇地第二聚核酸。該第一聚核酸包含核苷酸序列式5’-X-L1
-Y-L2
-Z-3’，其中X代表第一核酸，Z代表第二核酸，L1
與L2
之每一者獨立地為一連接子，以及Y為具有迴文序列之核苷酸區段。該第二聚核酸包含一核苷酸序列式5’-X’-L1
’-Y’-L2
’-Z’-3’， 其中X’代表第三核酸、Z’代表第四核酸，L1
’與L2
’每一者係獨立地為連接子或不存在，以及Y為具有迴文序列之核苷酸區段；其中該第一聚核酸與第二聚核酸在迴文序列區形成雙鏈體。
在一些實施例中，該多聚核酸複合物之第一核酸、第二核酸、第三核酸、第四核酸或其組合，可為核酸適體(相同或不同)。在其他實施例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸、第四核酸或其組合，可為反義寡核苷酸或siRNAs (相同或不同)。在其他實施例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少一者係偶聯(conjugate)至一治療試劑，例如，小分子藥物、胜肽藥物或蛋白質藥物。
在一些實施例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少二者係特異於相同之有興趣目標分子。例如，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少二者為相同之核酸適體。在一些實例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之所有皆為相同之核酸適體。
在一些實施例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少二者係特異於不同之有興趣目標分子。例如，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少二者為不同的核酸適體。在一些實例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之所有皆為不同的核酸適體。在某些實例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少一者為本文揭示之抗-LAG3核酸適體。
在一些實例中，該第一核酸、第二核酸、第三核酸與第四核酸之至少一者為核酸適體，以及其他核酸之至少一者為反義寡核苷酸、siRNA或偶聯至治療試劑。
在一些實施例中，本文所述之多聚核酸複合物可更包含一核酸組，其包含第五核酸、第六核酸、第七核酸、第八核酸或其組合，其中，該核酸組的每一核酸包含與該第一核酸、第二核酸、第三核酸或第四核酸互補的部分，並與該第一核酸、第二核酸、第三核酸或第四核酸形成雙鏈體。該第五核酸、第六核酸、第七核酸、第八核酸或其組合可包含一核酸適體、反義寡核苷酸，或siRNA。或者，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少一者係偶聯至一治療試劑，如小分子藥物、胜肽藥物或蛋白質藥物。
在一些實施例中，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少二者係特異於相同之有興趣目標分子。例如，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少二者(如所有)包含一相同之核酸適體。在其他實例中，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少二者(如所有)係特異於不同之有興趣目標分子。在一些實例中，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少一者為本文揭示之抗-LAG3核酸適體。
在一些實施例中，該第五核酸、第六核酸、第七核酸，與第八核酸之至少一者包含一核酸適體，以及其他核酸之至少一者包含一反義寡核苷酸、siRNA或偶聯至治療試劑。
在本文所述之任一多聚核酸複合物(如適體)中，L1
、L2
、L1
’，及L2
’中的一個或多個(若可用的話)為一連接子，如聚A或聚T區段，其可由4至10個A或T核苷酸組成。或者或額外地，該迴文序列係由8、10、12、14或16個核苷酸組成。在一些實例中，該迴文序列為(A/T)4
(C/G)4
(A/T)4
。在一些實施例中，本文所述之多聚核酸適體之第一聚核酸與第二聚核酸的X與X’、L1
與L1
’、L2
與L2
’，以及Z與Z’之任一者(若可用的話)皆為相等。
此外，本發明特徵為一種調節免疫反應的方法，該方法包含投予有需要個體一種醫藥組成物，其包含結合至LAG-3(為單體形式或多聚體形式，如本文所述)的核酸適體之任一者，以及一醫藥上可接受之載體。此種可配製用於靜脈內注射的醫藥組成物，亦落於本發明的範圍內。在一些實施例中，本文所述的任何抗-LAG3適體僅經由單劑量投藥於個體。
在一些實施例中，該個體可為患有、懷疑患有或具罹患癌症風險之人類病患。實例包括但不限於肺癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、腎細胞癌、泌尿上皮癌和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)。在一些實例中，該醫藥組成物之量可足以增強個體之T細胞活性及/或抑制癌症生長。
此外，本發明特徵為一種偵測LAG-3-陽性細胞存在之方法，包含：(i) 將懷疑表現有LAG-3的細胞與本文所述之任一會結合至LAG-3(單體形式或多聚體形式)之核酸適體接觸，其中該核酸適體係偶聯至偵測試劑上；以及(ii)測量由該偵測試劑釋放出之訊號，該偵測試劑係偶聯至已結合至一細胞之核酸適體；其中該訊號強度指示LAG-3-陽性細胞之存在或位準。在一些實施例中，該接觸步驟(i)係以投予該核酸適體或多聚核酸適體至有需要之個體而進行。
在下面的描述中闡述了本發明的一或多個實施例的細節。從以下附圖和若干實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍，本發明的其他特徵或優點將顯而易見。
淋巴細胞活化基因3(LAG-3)，也稱為CD223，是屬於免疫球蛋白(Ig)超級家族的細胞表面分子。它是第I型跨膜細胞表面蛋白，具有四個細胞外Ig-樣結構域。LAG-3通常在活化的T細胞、天然殺手細胞、B細胞及/或樹突細胞上表現。LAG-3的天然配體是MHC第II類分子，LAG-3以比CD4更高的親和力與其結合。作為檢查點受器，LAG-3可負調節T細胞增殖、活化和體內平衡，類似於CTLA-4和PD-1。在慢性病毒感染期間，LAG-3亦可在維持CD8+
細胞的致耐受狀態及/或CD8+
細胞耗盡中扮演重要角色。此外，LAG-3亦可在樹突細胞成熟和活化中扮演重要角色。在人類中，LAG-3由LAG3基因編碼。人類LAG-3的示範性胺基酸序列可在GenBank登錄號NP_002277.4下找到。
本文提供一種核酸適體，其能夠結合LAG-3並阻斷其與MHC II的交互作用，因而調節由LAG-3/MHC II交互作用介導的免疫反應。如本文所述的示範性抗-LAG-3適體，不論單體形式或四聚體形式，皆可成功抑制腫瘤生長，如在動物模型中觀察到的。
因此，本文描述一種抗-LAG-3適體(單體或多聚體)、包含其之醫藥組成物，以及以本文揭示的抗-LAG-3適體增強免疫活性及/或治療諸如癌症的疾病之方法。本文亦提供一種多聚核酸複合物的設計，其可用於遞送各種治療試劑，包括基於核酸的試劑(例如，適體、反義寡核苷酸及/或干擾RNA，例如siRNA)，基於蛋白質的試劑(例如，胜肽藥物或蛋白質藥物)或小分子試劑。抗 -LAG-3 適體
本文描述一種核酸適體，其與人類LAG-3結合，並干擾其與作為LAG-3天然配體的MHC第II類分子之交互作用，因而調節免疫反應，例如由LAG-3和MHC第II類分子之間的交互作用介導的免疫反應。因此，本文揭示的抗-LAG-3適體可有效調節免疫反應，這可有益於某些疾病和病症的治療，例如癌症和免疫病症(例如自體免疫病症)。
本文所用的核酸適體是指對特定標靶分子(例如LAG-3)具有結合活性的核酸分子(DNA或RNA)。該適體可結合特定的標靶分子，因而經由例如阻斷標靶分子與其天然配體的結合，來抑制標靶分子的活性，引起標靶分子的構形變化，及/或阻斷標靶分子的活性中心。本揭示的抗-LAG-3適體，呈線性或環狀形式，可為RNA、DNA(例如，單股DNA)、經修飾的核酸或其混合物。抗-LAG-3適體可為非天然分子(例如，含有不存在於天然基因中的核苷酸序列，或含有非天然存在的經修飾核苷酸)。或者或另外，抗-LAG-3適體可不含有編碼功能性胜肽的核苷酸序列。在一些情況下，抗-LAG-3適體可為單體，即包含標靶分子的一個結合位點。或者，抗-LAG3適體可為多聚體，即包含一或多個標靶分子的2或更多個結合位點。請見下面的討論。
本文揭示的抗-LAG-3核酸適體可包含富含G的區段(例如，其在結合至LAG-3分子(例如人類LAG-3)時扮演重要角色，並干擾其與MHC第II類配體的交互作用。在一些實施例中，抗-LAG-3適體可包含一核苷酸模體(a)：GX1
GGGX2
GGTX3
A (SEQ ID NO:1)，其中X1
和X2
每一者可獨立地為G、C或不存在，及/或X3
可為T或C。在一些實例中，X3
可為T。或者或另外，X1
、X2
，或兩者都可以不存在。在其他實例中，X1
、 X2
或兩者可為G或C。在特定實例中，X1
、X2
，或兩者可為G。例如，抗LAG-3適體可包含核苷酸模體GGGGGGTTA (SEQ ID NO:24)、GGGGGGGTTA (SEQ ID NO:25)、GGGGGGGGTTA (SEQ ID NO:2)，或GGGGGGGGGTTA (SEQ ID NO:26)。
在其他實施例中，抗-LAG-3適體可包含核苷酸模體(b)：L-(G)n
-L’，其中n為5至9的整數，包括端值(例如，5、6、7、8或9；分別為SEQ ID Nos：3至7)；L和L’是具有互補序列的核苷酸序列，使得抗LAG-3適體可具有髮夾結構，其中L/L’形成莖區且聚G區段形成整個或部分環結構。在一些情況下，區段L的一部分與L’區段的全部或一部分互補。在其他情況下，區段L’的一部分與L區段的整體或一部分互補。
模體(a)和模體(b)二者均含有聚G片段，預期其在適體與LAG-3的結合中扮演重要角色。因此，預期包含二者之一的模體之核酸分子是如本文所述的抗LAG-3適體。
在一些實例中，本文揭示之該抗-LAG-3適體可包含一核苷酸序列，其至少85% (如90%、95%，或98%)等同於
(i) TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCG (SEQ ID NO:8)；
(ii) TGGGGGGGGGTTAGACTTACACTCTTATTCG (SEQ ID NO:9)；
(iii) AGAGGGGGGGGTTAGCTGCTTTAACTCATG (SEQ ID NO:10)；或
(iv) AGGGGGGGGGTTACTGCGCATGTATCTCAG (SEQ ID NO:11)。
本文揭示之此抗-PDL1核酸適體可包含或由上述核苷酸序列(i)-(iv)之任一者組成。
二核酸之「百分比等同性」係使用Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990，經修飾之Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993所述之演算法決定。這種演算法被併入NBLAST與XBLAST程式(第2.0版)，Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990。可以NBLAST程式進行BLAST核苷酸搜尋，得分= 100，字長-12，以獲得與本發明的核酸分子類似的核苷酸序列。在兩個序列之間存在間隙的情況下，可使用Gapped BLAST程式，描述於Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997。當使用BLAST和Gapped BLAST時，可使用各個程式(例如，XBLAST和NBLAST)的預設參數。
在其他實施例中，與參考序列如核苷酸序列(i)-(iv)任一者相較，本文所述的抗-PDL1適體可含有最多8個(例如，最多7、6、5、4、3、2或1個)核苷酸變異物。此種變異物之位置可基於如可使用計算機演算法(例如Mfold)預測的適體二級結構來決定而引入。例如，雙股莖區中的鹼基對可突變為不同的鹼基對。這種突變將在該位置維持雙股區域中的鹼基對，因此對適體的整體二級結構沒有顯著影響。這種類型的突變是本領域技術人員已知的。例如，A-T對可以突變為T-A對。或者，它可以突變為G-C或C-G對。在另一個實例中，G-C對可以突變為C-G對。或者，它可以突變為A-T對或T-A對。較佳地，一或多個變異物位於核心序列GGGGGGTTAA (SEQ ID NO:27)、GGGGGGGTTA (SEQ ID NO:28)，或GGGGGGGGTTA (SEQ ID NO:29)之外的位置。
在一些實例中，該抗-LAG-3適體包含核苷酸序列TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG (SEQ ID NO:12)。實例包括但不限於：
TCCCTACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCACCGTGCTACAAC (SEQ ID NO:13)； ACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG (SEQ ID NO:14)；GCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGC (SEQ ID NO:15)；以及CTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCA (SEQ ID NO:16)。
該抗-LAG-3適體之任一者可在5’端與3’端或二者更包含一錨定區段。當一適體在5’端與3’端含有錨定區段時，該二錨定區段可相同或不同。該錨定區段可作為引子結合位點，其可用於倍增該適體序列。或者或額外地，該錨定區段可做為結合位點，用於經由鹼基配對將適體結合至骨架核酸，以形成多聚體抗-LAG-3適體。請見以下討論。示範性錨定序列包括5’-TCCCTACGGCGCTAAC-3’ (SEQ ID NO:30)與5’-GCCACCGTGCTACAAC-3’ (SEQ ID NO:31)。本文所述之抗-LAG-3適體 可含有上述之整個錨序列或其一部分。示範性之含有錨序列的適體係提供於下(錨定序列為斜體;核心序列以粗體表示)：
5’-TCCCTACGGCGCTAAC
TGGGGGGGGTTA
GTTCAATACATGCGGGCGG CCACCGTGCTACAAC
-3’ (SEQ ID NO:13)
5’-TCCCTACGGCGCTAAC
TGGGGGGGGGTTA
GACTTACACTCTTATTCGGCCACCGTGCTACAAC
-3’ (SEQ ID NO:32)
5’-TCCCTACGGCGCTAAC
AGAGGGGGGGGTTA
GCTGCTTTAACTCATGG CCACCGTGCTACAAC
-3’ (SEQ ID NO:33)
5’ -TCCCTACGGCGCTAAC
AGGGGGGGGGTTA
CTGCGCATGTATCTCAGGC CACCGTGCTACAAC
-3’ (SEQ ID NO:34)
本文揭示的任何抗-PDL1適體可含有長度約30至100個核苷酸(nts)(例如，35至100個核苷酸)。在一些實施例中，包含核酸模體的核酸適體為約40至80 nts、40至65 nts、40至62 nts、50至80 nts、60至80 nts，或70至80 nts。在一些實施例中，包含核酸模體的核酸適體為約30至70 nts、30至65 nts、30至62 nts、30至60 nts、30至50 nts或30至40 nts。在一些具體實例中，抗-LAG-3適體的長度範圍可為約50 nts至約60 nts。
通常，術語「約」和「大約」表示在本領域一般技術人員可決定的特定值的可接受誤差範圍內。「約」可以指小於特定值範圍的±30 %，較佳小於±20 %，更佳小於±10%，更佳小於±5 %，尤佳小於±1 %。
在一些實施例中，本文所述的抗-LAG-3適體可結合至LAG-3(例如，人類LAG-3)，其解離常數(Kd)低於20 nM(例如，15 nM、10 nM、5 nM、1 n M或更小)。抗-LAG-3適體可特異性結合至人類LAG-3。或者，適體可結合來自不同物種(例如人類、小鼠或大鼠)的LAG-3分子。當與細胞表面上表現的LAG-3分子結合時，此種適體可抑制LAG-3的活性(因而增加免疫細胞活性，例如T細胞活性)至少20%(例如，40%、50%、80%、100%、2倍、5倍、10倍、100倍，或1,000倍)。抗LAG-3適體對LAG-3的抑制活性(以及因此增強免疫細胞活性如T細胞活性的活化)，可經由本領域已知的方法測定，例如T細胞增殖試驗，其已於先前描述過，如Clay T.M.,et al
., Assays for Monitoring Cellular Immune Responses to Active Immunotherapy of Cancer,Clin Cancer Res.,
May 2001, 7, 1127；其相關揭示經由引用併入本文中。應當理解的是，本文提供的用於測量T細胞活性的方法是示範性的，並不意味著限制。
在一些實施例中，本文所述的任何抗LAG-3適體可含有非天然存在的核鹼基、醣類或共價核苷間聯結(骨架)。此種經修飾的寡核苷酸賦予期望的性質，例如，增強細胞攝取、增進對標靶核酸的親和力，以及增加體內穩定性。
在一實例中，本文所述的適體具有經修飾的骨架，包括保留磷原子者(請見例如美國專利號3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；以及5,625,050)和不具有磷原子者(請見例如美國專利號5,034,506；5,166,315；與5,792,608)。含磷之經修飾骨架的實例包括但不限於硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷醯胺酯，包括3'-胺基磷醯胺酯和胺基烷基磷醯胺酯、硫代磷醯胺酯、硫代烷基膦醯胺酯、硫代烷基磷三酯、硒代磷酸酯，以及硼烷磷酸酯，其具有3'-5'聯結，或2'-5'聯結。此類骨架還包括具有反轉極性的骨架，即3'至3'、5'至5'或2'至2'聯結。不包含磷原子的經修飾骨架由短鏈烷基或環烷基核苷間聯結、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間聯結，或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間聯結形成。此類骨架包括具有嗎啉聯結者(部分由核苷的醣部分形成)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯基和硫代甲醯基骨架；亞甲基甲醯基和硫代甲烯基骨架；核醣基乙烯骨架；含有骨架的烯烴；胺基磺酸骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸鹽和磺醯胺骨架；醯胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2
成分的其他成分。
在另一實例中，本文描述的適體包括一或多個經取代醣類部分。這些經取代的醣類部分可在其2'位置包括下列基團之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基和O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基和炔基可為經取代或未取代的C1至C10烷基，或C2至C10烯基和炔基。它們亦可在其2'位置包括雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代的矽烷基、RNA裂解基、報導子基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸的藥物動力學性質的基團，或者用於改善寡核苷酸的藥效動力學性質。較佳的經取代醣類部分包括具有2'-甲氧基乙氧基、2'-二甲基胺基氧基乙氧基，和2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基者。請見Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504。
或者或另外，本文所述的適體包括一或多種經修飾的天然核鹼基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和脲嘧啶)。經修飾的核鹼基包括描述於美國專利號3,687,808、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第858-859頁, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613，以及Sanghvi, Y. S., 第15章, Antisense Research and Applications, 第289-302頁, CRC Press, 1993。其中某些核鹼基特別適用於增加適體分子與其靶向位點的結合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基脲嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。請見Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278。
或者或另外，如本文所述的抗-PDL1適體可包含一或多種鎖核酸(LNA)。LNA，通常稱為難以接近的RNA，是一種經修飾的RNA核苷酸，其中核醣部分以連接2'氧和4'碳的額外橋聯修飾。這種橋聯將核醣「鎖定」在3'-內(北)構形中，這通常在A型雙鏈體中發現。LNA核苷酸可用於本文所述的任何抗-PDL1適體中。在一些實例中，抗-PDL1適體中高達50%(例如，40%、30%、20%或10%)的核苷酸是LNA。在一些實例中，抗-PDL1適體可包含10、8、6、5、4、3、2或1個LNA。
本文所述的任一適體皆可經由常規方法製備，例如化學合成或體外轉錄。它們如本文所述的預期生物活性可經由例如以下實例中描述者來驗證。用於表現任何抗-PDL1適體的載體也在本發明的範圍內。
本文所述的任一適體可經由共價鍵、非共價鍵或兩者，與一或多個聚醚部分例如聚乙二醇(PEG)部分偶聯。因此，在一些實施例中，本文描述的適體為PEG化。本揭示並非限制於具特定分子量的PEG部分。在一些實施例中，聚乙二醇部分的分子量為5 kDa至100 kDa、10 kDa至80 kDa、20 kDa至70 kDa、20 kDa至60 kDa、20 kDa至50 kDa，或30 kDa至50 kDa。在一些實例中，該PEG部分具有40 kDa的分子量。與本文所述的抗-PDL1適體偶聯的PEG部分可為直鏈或分支。其可與核酸適體的5'端、適體的3'端或兩者偶聯。需要時，PEG部分可共價偶聯至核酸適體的3'端。
將PEG部分與核酸偶聯的方法為本領域已知，且已先前描述於如PCT公開號WO 2009/073820，其相關揭示經由引用併入本文。應當理解的是，經PEG偶聯的核酸適體，以及將PEG偶聯至本文所述的核酸適體之方法是示範性的，並非用於限制。 多聚核酸適體
本發明亦提供一種多聚體形式的核酸適體，即含有大於一個的適體結合部分，用於結合相同或不同的有興趣標靶分子。在一些情況下，該多聚體適體是含有四個適體結合部分的四聚體，其可特異於相同的標靶分子或不同的標靶分子。當多聚體適體含有可結合至相同標靶分子的多個結合部分時，預期其對於標靶分子會表現出更高的結合活性，相對於單體形式的相同適體結合部分。此外，當其含有可結合至不同標靶分子的多個結合部分時，多聚體適體將具有多種結合特異性，允許同時結合和調節多個標靶。
本文所述的多聚核酸適體可包含骨架部分，其可共價地或經由鹼基配對與多個適體部分(例如，2、3或4個)偶聯。在一些實施例中，該骨架部分含有兩個核酸分子，其在每個核酸分子的中間部分含有互補序列。如本文所使用，互補序列(包括完全或部分互補的序列)是指能夠根據標準Watson-Crick互補規則，經由鹼基配對形成雙股雙鏈體的序列。骨架部分的核酸分子更含有位於側接互補序列的核苷酸序列。側接序列的每一者可包含一停泊位點，其包含與適體序列的一部分互補的序列(例如，在上節中討論的錨定位點)，使得停泊位點可藉由鹼基配對與適體偶聯。或者，該側接序列可包含適體部分。骨架部分的每個核酸分子中的側接序列和互補序列，可直接共價連接，或經由連接子如聚A區段或聚T區段連接。
在一些實施例中，骨架部分可含有兩個相同的核酸分子，其可含有如下所述的迴文序列。迴文序列，也稱為倒轉-反向序列，是指一核苷酸序列(從5'到3'向前)，其匹配其從5'到3'的互補序列。迴文序列傾向於自組裝形成莖環(髮夾)結構，這在構建多聚體適體複合物時可能會產生問題。令人驚訝的是，本揭示記載使用包含迴文序列的骨架部分成功地構建四聚體適體。此種四聚體顯示出期望的生物活性，如以下實例中所示。
在其他實施例中，骨架部分可含有兩種不同的核酸分子。骨架部分可與2、3或4個適體部分偶聯。在一些情況下，所有適體部分能夠結合至相同的標靶分子，例如相同的適體部分。在其他情況下，至少兩個適體部分能夠結合至不同的標靶分子，即多特異性適體。
在一些實施例中，本文揭示的多聚體適體(例如，四聚體)可包含第一聚核酸、第一核酸適體和第二核酸適體，它們全部形成複合物。該第一聚核酸包含核苷酸序列式5’-X-L1
-Y-L2
-Z-3’。X和Z之每一者皆獨立地為核苷酸區段，其含有分別與第一核酸適體和第二核酸適體的一部分互補的停泊位點，使得該第一和第二核酸適體可在第一聚核酸中與X和Z區段形成鹼基配對。在某些情況下，X和Z是相同的。在其他情況下，X和Z是不同的(例如，長度及/或序列)。L1
和L2
每一者皆為連接子，其可以是聚A區段或聚T區段(例如，含有4-10個A或T殘基)。在一些實例中，L1
和L2
是相同的連接子。在其他實例中，L1
和L2
是不同的連接子(例如，序列及/或長度不同)。在某些情況下，L1
、L2
或二者可不存在。
Y為迴文序列，其可含有8、10、12、14和16個核苷酸。在一些情況下，該迴文序列含有模體(A/T)4
(G/C)4
(A/T)4
。示範性迴文序列包括但不限於TCAGCTGA (SEQ ID NO:35)、ATCAGCTGAT (SEQ ID NO:36)、ATATCGCGATAT (SEQ ID NO:37)，或ATATGACGCGTCATAT (SEQ ID NO:38)。
上面揭示的多聚體適體可進一步包含第二聚核酸、第三核酸適體和第四核酸適體。第二聚核酸可包含核苷酸序列式5’-X’-L1
’-Y-L2
’-Z’-3’。X’和Z’之每一者獨立地為含有停泊位點的核苷酸區段，該停泊位點分別與第三核酸適體和第四核酸適體的一部分互補，使得第三和第四核酸適體可在第二聚核酸中與X’和Z’區段形成鹼基配對。在某些情況下，X’和Z’是相同的。在其他情況下，X’和Z’是不同的(例如，長度及/或序列)。在一些實例中，X與X’及/或Z與Z’是相同的。在其他實例中，X與X’不同，及/或Z與Z’不同。L1
’和L2
’每一者皆為連接子，其可為聚A區段或聚T區段(例如，含有4至10個A或T殘基)。在一些實例中，L1
’和L2
’是相同的連接子。在其他實例中，L1
’和L2
’是不同的連接子(例如，序列及/或長度不同)。
在一些實例中，上述多聚體適體中的第一聚核苷酸和第二聚核酸是相同的分子。在其他實例中，第一聚核酸和第二聚核酸在至少一態樣不同，例如，不同的停泊位點及/或不同的連接子。在一些情況下，多聚體適體複合物中的至少兩個適體(2、3或4個)與同一標靶分子結合。在一實例中，該適體(2、3或4個)為相同的適體分子。在其他情況下，多聚體適體複合物中的至少兩個適體(2、3或4個)與不同的標靶分子結合。
本文所述的任何多聚體適體，例如四聚體，可含有一或多個本文所述的抗-LAG-3核酸適體。在一些實施例中，多聚體適體是含有如本文所述的1、2、3或4個抗-LAG-3核酸適體的四聚體。當該四聚體含有2個或更多個抗-LAG-3適體時，抗-LAG-3適體部分可以相同或不同。在一些實例中，該四聚體含有四個相同的抗-LAG-3部分，其可為本文所述的任何抗-LAG-3適體。
抗-LAG-3適體可經由鹼基配對偶聯至多聚體適體中的骨架部分。或者，抗LAG-3適體可與骨架核酸共價連接，以形成單一多核苷酸鏈。請見上述討論。多聚核酸複合物
此外，本發明提供一種使用迴文序列的多聚(例如，四聚體)核酸分子的通用設計。適用於製備多聚核酸分子的迴文序列可含有8、10、12、14或16個核苷酸。在某些情況下，該迴文序列包含模體(A/T)4
(G/C)4
(A/T)4
。示範性迴文序列包括但不限於TCAGCTGA (SEQ ID NO:35)、ATCAGCTGAT (SEQ ID NO:36)、ATATCGCGATAT (SEQ ID NO:37)，或ATATGACGCGTCATAT (SEQ ID NO:38)。
示範性四聚體核酸複合物可含有兩個聚核酸分子，每個分子包含一側接有兩個核酸區段的迴文序列。感興趣的核酸可直接與該迴文序列連接或經由如本文所述的連接子與該迴文序列連接。該二聚核酸分子經由該迴文序列形成雙鏈體，因而產生如本文所揭示的多聚核酸複合物。
在一些實施例中，該二聚核酸分子中，迴文序列側接的核酸區段中的至少一者或全部，係包含基於核酸的治療劑，例如核酸適體(例如，如本文所公開的抗-LAG3核酸適體)、反義寡核苷酸，及/或干擾RNA，如siRNA。或者或另外，該二聚核酸分子中，迴文序列側接的核酸區段中的至少一個或全部係與治療劑偶聯，該治療劑可為胜肽藥物、蛋白質藥物或小分子藥物。該胜肽藥物、蛋白質藥物或小分子藥物是指具有治療活性的任何胜肽、蛋白質或小分子。
在其他實施例中，本文揭示的多聚核酸複合物可包含一或多種核酸，每一者皆含有與兩個聚核酸分子中的迴文序列側接的一核酸區段的一部分或全部互補的區段，可使額外的核酸與側接有迴文序列之核酸片段形成雙鏈體。在一些情況下，一或多種額外的核酸可包含基於核酸的治療劑(相同或不同)，例如核酸適體，例如本文公開的任一抗-LAG3適體、反義寡核苷酸，及/或干擾RNA如siRNA。在其他情況下，一或多種額外的核酸可以與非基於核酸的治療劑偶聯，例如胜肽藥物、蛋白質藥物或小分子藥物。
在一些情況下，本文揭示的多聚核酸複合物可攜帶與本文描述者相同的治療劑。在其他情況下，本文揭示的多聚核酸複合物可攜帶多種治療劑。在一些實施例中，多聚核酸複合物可含有相同類型的有興趣核酸(例如，核酸適體、反義寡核苷酸，或能夠結合至相同標靶的siRNA)。或者，本文所述的多聚核酸複合物可含有不同類型的有興趣核酸(例如，結合至不同標靶的核酸適體)。在其他實施例中，本文公開的多聚核酸複合物可包含多種治療劑，其可以是不同類型的分子(例如，胜肽、蛋白質，核酸及/或小分子)。例如，多聚核酸複合物可包含靶向與疾病相關的生物標誌物的核酸適體和治療劑，使得該適體可將治療劑引導至呈現該生物標誌物的位置，以發揮其治療活性。醫藥組成物
一或多種抗-LAG-3適體(如本文所述的單體形式或多聚體形式，及/或亦如本文所述的游離形式或PEG偶聯形式)，可與藥學上可接受的載體(賦形劑)混合，以形成用於治療目標疾病的藥物組成物。「可接受的」是指載體必須與組成物的活性成分相容(且較佳能夠穩定活性成分)，並對待治療的個體無害。包括緩衝劑的醫藥上可接受的賦形劑(載體)為本領域熟知。請見如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。
用於本發明方法的醫藥組成物可包含醫藥上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，其為凍乾製劑或水溶液形式。請見如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。可接受的載體、賦形劑或穩定劑，在使用劑量和濃度下對於個體無毒，並可包含緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；酚、丁基或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間-甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多胜肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚醣；螯合劑如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子如鈉；金屬錯合物(例如，鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如TWEEN™
、PLURONICS™
或聚乙二醇(PEG)。
在一些實例中，本文所述的醫藥組成物包含含有任何LAG-3結合適體(以單體形式或多聚體形式，或用於產生適體的載體)的脂質體，其可經由所屬技術領域中已知之方法製備，例如，描述於Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；以及美國專利號4,485,045和4,544,545。具有增強循環時間的脂質體揭示於美國專利號5,013,556。特別有用的脂質體可藉由逆相蒸發法，以包含磷脂醯膽鹼、膽固醇和PEG衍生的磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組成物產生。通過具有確定孔徑的過濾器擠出脂質體，以產生具有期望直徑的脂質體。
如本文所述的抗LAG-3適體也可以包埋在微膠囊中，其藉由如凝聚技術或界面聚合化而製備的，例如分別在羥甲基纖維素或明膠-微膠囊，以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中，於膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米顆粒和奈米膠囊)或在***化物(macroemulsions)中。這些技術是本領域已知的，請見例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)。
在其他實例中，本文所述的醫藥組成物可以持續釋放形式配製。持續釋放製劑的合適實例包括含有LAG-3結合適體的固體疏水聚合物之半透性基質，該基質為成型物件的形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利號3,773,919)、L-麩胺酸和7-乙基-L-麩胺酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、蔗糖乙酸異丁酯，以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於體內投藥的醫藥組成物必須是無菌的。這可藉由例如通過無菌過濾膜過濾而容易地實現。可將治療性PDL1結合適體組成物置於具有無菌進入口的容器中，例如具有可經由皮下注射針刺穿的塞子之靜脈內溶液袋或小瓶。
本文所述的醫藥組成物可為單位劑型，例如藥錠、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒、溶液或懸浮液，或栓劑，用於口服、腸胃外或直腸投藥，或經由吸入或吹入投藥。
為了製備諸如藥錠的固體組成物，可將主要活性成分與藥物載體混合，例如常規的製錠成分，例如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠，和其他藥物稀釋劑，例如水，以形成含有本發明化合物或其醫藥上可接受的無毒鹽類之均勻混合物的固體預製劑組成物。當將這些預製劑組成物稱為均勻時，意指活性成分均勻地分散在整個組成物中，使得組成物可容易地細分成等效的單位劑型，例如藥錠、丸劑和膠囊。之後將該固體預製劑組成物再分入上述類型的單位劑型中，其含有0.1至約500 mg本發明的活性成分。可將新組成物的藥錠或丸劑以包衣或其它方式混合，以提供具有延長作用優點的劑型。例如，藥錠或丸劑可包含內劑量和外劑量成分，後者係於前者上形成包膜。這兩種成分可經由腸溶層分開，該腸溶層用於抵抗胃中的崩解，並允許內部成分完整地進入十二指腸或延遲釋放。有多種材料可用於這種腸溶層或包衣，這種材料包括許多聚合酸，以及聚合酸與這種材料如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的混合物。
合適的界面活性劑尤其包括非離子試劑，例如聚氧乙烯山梨糖醇(例如，Tween™
20、40、60、80或85)和其他脫水山梨糖醇(例如Span™
20、40、60、80或85)。具有界面活性劑的組成物將方便地包含0.05至5%之間的界面活性劑，並可為0.1至2.5%之間。應當理解的是，如果需要，可加入其他成分，例如甘露醇或其他醫藥上可接受的載劑。
合適的乳化物可使用市售脂肪乳劑製備，例如Intralipid™
、Liposyn™
、Infonutrol™
、Lipofundin™
與Lipiphysan™
。活性成分可溶解在預混合的乳化物組成物中，或者可溶解在油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中，並與磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合形成乳化物。應當理解的是，可加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節該乳化物的張力。合適的乳化物通常含有高達20%的油，例如5-20%之間。脂肪乳化物可包含具有合適大小的脂肪滴，並可具有pH值範圍為5.5至8.0。
乳化物組成物可為藉由將抗-LAG-3適體與Intralipid™
或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而製備者。
用於吸入或吹入的醫藥組成物包括置於醫藥上可接受的水性或有機溶劑或其混合物和粉末中的溶液和懸浮液。該液體或固體組成物可含有如上所述的合適醫藥上可接受的賦形劑。在一些實施例中，該組成物經由口服或鼻呼吸途徑投藥，以產生局部或全身性作用。
組成物較佳位於無菌的醫藥上可接受的溶劑中，可藉由使用氣體霧化。霧化溶液可直接從霧化裝置呼吸，或者霧化裝置可連接到面罩、帳篷或間歇式正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組成物，可由以適當方式遞送製劑的裝置投藥，較佳為口服或經鼻投藥。治療應用
任何以游離形式或PEG-偶聯形式的單體形式或多聚體形式的抗-LAG-3適體，所有這些都已在本文中描述，可用於調節免疫活性，例如，促進T細胞增殖，因而有效治療可受益於免疫反應調節的疾病或病症，例如癌症或免疫病症。
為了實施本文揭示的方法，有效量之本文所述的含有至少一種抗LAG-3適體的醫藥組成物，可經由合適的途徑投藥至需要治療的個體(例如人類)，例如靜脈內投藥，例如，推注或經過一段時間的連續輸注、經肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、吸入或局部途徑。用於液體製劑的市售霧化器，包括噴射霧化器和超音波霧化器，可用於投藥。液體配方可直接霧化，且凍乾粉末可在重製後霧化。或者，如本文所述的含有抗-LAG-3適體組成物可使用碳氟化合物配方和定量吸入器霧化，或以凍乾和研磨粉末形式吸入。
如本文所用，「有效量」是指單獨或與一或多種其他活性劑組合，而賦予個體治療效果所需的每一活性劑之量。在一些實施例中，治療效果是減少腫瘤負荷、減少癌細胞，或增加免疫活性。確定LAG-3結合適體的量是否達到治療效果，對於本領域技術人員而言是顯而易見的。如本領域技術人員所認知到的，有效量係根據所治療的具體病症、病症的嚴重程度、個體患者參數包括年齡、身體狀況、體型、性別和體重、治療持續時間、同時療法的性質(如果有的話)、特定的投藥途徑，以及健康從業者的知識和專業知識中的相似因素而不同。這些因素是本領域一般技術人員所熟知的，並且可以僅經由常規實驗來解決。通常較佳使用最大劑量的各成分或其組合，即根據完整的醫學判斷之最高安全劑量。
經驗考慮，例如半衰期，通常將有助於決定劑量。投藥頻率可在治療過程中決定和調整，且通常但不是必須基於目標疾病/病症的治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，LAG-3結合適體的持續連續釋放配方可能是合適的。用於實現持續釋放的各種配方和裝置是本領域已知的。
在一實例中，如本文所述的抗-LAG-3適體的劑量可在已給予一次或多次LAG-3結合適體投藥的個體中憑經驗確定。投予個體增加劑量的拮抗劑。為了評估拮抗劑的功效，可遵循疾病/病症的指標。
通常，對於本文所述的任何抗-LAG-3適體的投藥，初始候選劑量可為約2 mg/kg。出於本揭示目的，典型的每日劑量可為約0.1 µg/kg至3 µg/kg 至30 µg/kg至300 µg/kg至3 mg/kg、至30 mg/kg至100 mg/kg或更多的任何一者，取決於上述因素。對於數天或更長時間的重複投藥，取決於病症，持續治療直至出現期望的症狀抑制，或直至達到足夠的治療水平，以減輕目標疾病或病症或其症狀。示範性投藥方案包括投予約2 mg/kg的初始劑量，然後投予約1 mg/kg之LAG-3結合適體的每周維持劑量，或者之後投予約1 mg/kg每隔一週的維持劑量。然而，取決於醫師希望實現的藥物動力學衰變模式，可使用其他劑量方案。例如，考慮每週投藥一次至四次。在一些實施例中，可使用劑量範圍為約3 µg/mg至約2 mg/kg (如約3 µg/mg、約10 µg/mg、約30 µg/mg、約100 µg/mg、約300 µg/mg、約1 mg/kg，以及約2 mg/kg)。在一些實施例中，投藥頻率為每週一次、每2週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每7週一次、每8週一次、每9週一次或每10週一次；或每月、每2個月、或每3個月或更長時間一次。藉由常規技術和試驗可容易地監測此療法的進展。投藥方案(包括使用的LAG-3結合適體)可隨時間變化。在一具體實例中，如本文所述的LAG-3結合適體可經由單劑量投予需要治療的個體(例如，需要調節免疫反應的人類患者)。
在一些實施例中，對於體重正常的成年患者，可投予約0.3至5.00 mg/kg的劑量。特定的劑量方案，即劑量、時間點和重複次數，將取決於特定個體和個體的病史，以及各試劑性質(例如試劑的半衰期，以及技術領域中已知的其他因素)。
出於本揭示目的，如本文所述LAG-3結合適體的適當劑量，將取決於特異性LAG-3結合適體、疾病/病症的類型和嚴重性、投予LAG-3結合適體是否用於預防或治療目的、先前的治療、患者的臨床病史和對拮抗劑的反應，以及主治醫師的判斷。臨床醫生可投予LAG-3結合適體，直到達到實現期望結果的劑量。在一些實施例中，期望的結果是腫瘤負荷減少、癌細胞減少或免疫活性增加。決定劑量是否產生期望結果的方法，對於本領域技術人員而言是顯而易見的。一或多種LAG-3結合適體的投藥可以是連續式或間歇式，取決於例如接受者的生理狀況、投藥目的是治療性還是預防性，以及技術人員已知的其它因素。LAG-3結合適體的投予可在預選的一段時間內為基本上連續，或者可以是一系列間隔劑量，例如，在目標疾病或病症發展之前、期間或之後。
如本文所用，術語「治療」是指向個體施加或投予包括一或多種活性劑的組成物，該個體具有目標疾病或病症、該疾病/病症的症狀，或對所述疾病/病症的易感性，目的是治療、治癒、緩解、減輕、改變、補救、改善、增進或影響該病症、疾病的症狀，或對疾病或病症的易感性。
減輕目標疾病/病症包括延遲疾病的發展或進展，或降低疾病嚴重程度。緩解疾病並不一定需要治療效果。如本文所使用的，「延遲」目標疾病或病症的發展意味著推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定及/或延遲疾病的進展。此延遲可具有不同的時間長度，取決於疾病的歷史及/或待治療的個體。一種「延遲」或減輕疾病發展或延遲疾病發作的方法為，降低在特定時間範圍內發展一或多種疾病症狀的可能性，及/或減少在特定時間範圍內症狀程度的方法，與不使用該方法時相較。這種比較通常基於臨床研究，使用足以提供統計學顯著結果的許多個體。
疾病的「發展」或「進展」意指疾病的初始表現及/或隨後的進展。可使用本領域熟知的標準臨床技術偵測和評估疾病的發展。然而，發展也指可能無法偵測的進展。出於本揭示目的，發展或進展是指症狀的生物學進程。「發展」包括發生、復發和發作。如本文所用，目標疾病或病症的「發作」或「發生」包括初始發作及/或復發。
在一些實施例中，本文所述的LAG-3結合適體係以足以減少體內腫瘤負荷或癌細胞生長的量之至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)，投至需要治療的個體。在其他實施例中，LAG-3結合適體係以可有效降低LAG-3活性位準至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的量投藥。在其他實施例中，LAG-3結合適體係以可有效增加免疫活性至少5%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)的量投藥。
藥物領域中一般技術人員已知的常規方法，可用於將醫藥組成物投至個體，取決於待治療的疾病類型或疾病部位。該組成物亦可經由其他常規途徑給藥，例如口服、腸胃外、藉由吸入噴霧、局部、直腸、鼻腔、口腔、***或經由植入的儲庫投藥。本文所用的術語「腸胃外」包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和顱內注射或輸注技術。另外，可經由可注射儲庫投藥途徑投至個體，例如使用1個月、3個月或6個月儲庫的可注射或可生物降解之材料和方法。在一些實例中，該醫藥組成物經由眼內或玻璃體內投藥。
可注射組成物可含有各種載體，例如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及類似物)。對於靜脈內注射，可經由滴注方法投予水溶性LAG-3結合適體，由此輸注含有LAG-3結合適體和生理學上可接受的賦形劑之醫藥配方。生理學上可接受的賦形劑可包括例如5%葡萄糖、0.9%生理食鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。肌肉內製劑，例如PDL1結合適體之合適可溶性鹽形式的無菌配方，可溶解於並於醫藥賦形劑如注射用水、0.9%生理食鹽水，或5%葡萄糖溶液中投藥。
在一實施例中，係經由部位特異性或靶向局部遞送技術投予LAG-3結合適體。部位特異性或靶向局部遞送技術的實例包括LAG-3結合適體，或局部遞送導管的各種可植入儲庫來源，例如輸注導管、留置導管或針導管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其他可植入設備、部位特異性載體、直接注射或直接施加。請參見如PCT公開號WO 00/53211和美國專利號5,981,568。
亦可使用含有反義聚核苷酸、表現載體或亞基因組聚核苷酸的治療組成物之靶向遞送。受器-介導的DNA遞送技術描述於如Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202；Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)；Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621；Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655；Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338。
含有聚核苷酸的治療組成物(例如，本文所述的LAG-3結合適體或用於製備它們的載體)的投藥範圍為約100 ng至約200 mg的DNA，用於基因治療流程中的局部投藥。在一些實施例中，亦可使用濃度範圍為約500 ng至約50 mg、約1 µg至約2 mg、約5 µg至約500 µg，以及約20 µg至約100 µg的DNA或更多，在基因治療流程中。
經由本文描述方法治療的個體可為哺乳動物，例如農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。在一實例中，該個體是人類。含有抗-LAG-3適體的組成物可用於增強需要治療的個體之免疫活性，例如T細胞活性。在一些實例中，該個體可以是患有、懷疑患有癌症或有罹患癌症風險的人類患者，例如肺癌、黑素瘤、結腸直腸癌、腎細胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。此類患者亦可經由常規醫療實施來辨識出。
患有目標疾病或病症(例如，癌症或免疫病症)的個體，可經由常規醫學檢查辨識出，例如實驗室測試、器官功能測試、CT掃描或超音波掃描。懷疑患有任何這種目標疾病/病症的個體，可能表現出該疾病/病症的一或多種症狀。具有疾病/病症風險的個體可為具有與該疾病/病症相關的一或多種風險因子的個體。此類個體亦可經由常規醫療實施來辨識出。
在本文描述的方法中使用的具體劑量方案，即劑量、時間點和重複次數，將取決於特定個體(例如，人類患者)和該個體的病史。
在一些實施例中，抗-LAG-3適體可與另一種合適的治療劑(例如，抗癌劑、抗病毒劑或抗菌劑)共同使用。或者或額外地，抗-LAG-3適體亦可與用於增強及/或補充試劑有效性的其他藥劑聯合使用。
目標疾病/病症的治療功效可經由例如以下實例描述的方法評估。診斷應用與其他
任何抗-LAG-3適體也可用於偵測LAG-3分子和表現LAG-3分子的細胞之存在，或用於將治療劑遞送至LAG-3+
細胞。抗-LAG-3適體可化學合成並以官能基團操作，以與治療劑或可偵測標記物(例如，成像劑例如對比造影劑)偶聯，以用於體內或體外診斷目的。如本文所用，「偶聯的」或「連接的」意指兩個實體相結合，較佳地具有足夠的親和力，以實現兩個實體之間結合所得之治療/診斷益處。兩個實體之間的結合可以是直接的或通過連接子，例如聚合物連接子。偶聯的或連接可包括共價或非共價鍵結，以及其他形式的結合，例如捕捉(entrapment)，如一個實體在另一個之上或之內，或者任一個或兩個實體在第三實體之上或之內，例如微胞。
在一個實例中，如本文所述的抗-LAG-3適體可連接於可偵測標記，該標記是能夠直接或間接釋放可偵測信號的化合物，因而可體外或體內偵測、測量及/或定性該適體。這種「可偵測標記」的實例旨在包括但不限於螢光標記、化學發光標記、比色標記、酵素標記、放射性同位素與親和性標記，例如生物素。這種標記可經由常規方法直接或間接地與適體偶聯。
在一些實施例中，可偵測標記是適合於對由LAG-3/MHC II交互作用介導的疾病成像的藥劑，其可以是放射性分子，放射性藥物或氧化鐵顆粒。 適用於體內成像的放射性分子包括但不限於122
I、123
I、124
I、125
I、131
I、18
F、75
Br、76
Br、76
Br、77
Br、211
At、225
Ac、177
Lu、153
Sm、186
Re、188
Re、67
Cu、213
Bi、212
Bi、212
Pb與67
Ga。適用於體內成像的示範性放射性藥物包括111
In 氧喹啉、131
I碘化鈉、99m
Tc苯溴胺乙酸(Mebrofenin)和99m
Tc紅細胞、123
I碘化鈉、99m
Tc依沙美肟(Exametazime)、99m
Tc巨聚合白蛋白、99m
Tc亞甲基二磷酸(Medronate)、99m
Tc巰替肽(Mertiatide)、99m
Tc亞希卓(Oxidronate)、99m
Tc三胺五乙酸(Pentetate)、99m
Tc過鎝酸鹽(Pertechnetate)、99m
Tc西斯坦密必(Sestamibi)、99m
Tc硫磺膠體、99m
Tc替弗思明(Tetrofosmin)、鉈-201和氙-133。報導子試劑亦可為染料，例如螢光基團，其可用於偵測組織樣品中LAG-3介導的疾病。
在一些實施例中，將與本文公開的可偵測標記(例如成像劑)偶聯的抗-LAG-3適體，係投予個體，以評估個體中的LAG-3位準。LAG-3的此種偵測可用於辨識相關患者的抗-LAG-3治療情況(例如，以本文揭示的抗-LAG-3藥物組成物治療或用抗-LAG-3抗體治療)。
LAG-3或LAG-3+
細胞可於樣本(例如，懷疑含有LAG-3的生物樣品，包括但不限於血液樣品和尿液樣品)中進行體外偵測，經由常規方法使用本文描述的任何適體。在一些情況下，該適體可與可偵測標記偶聯，其可以直接或間接釋放信號，指示樣品中LAG-3的存在及/或位準。或者，該抗-LAG-3適體可用於體內成像LAG-3或LAG-3+
細胞在個體(例如，如本文所述的人類患者)中的存在和定位。由本文所述的任何診斷試驗(體外或體內)獲得的結果，可指示與LAG-3相關的疾病之風險或狀態。含有抗 -LAG-3 適體之診斷與治療套組
本揭示亦提供用於調節(例如，增強)免疫活性(例如，T細胞活性)、減輕癌症(例如，肺癌、黑色素瘤、結腸直腸癌或腎細胞癌)，及/或治療或降低患癌症的風險之套組。此類套組可包括一或多個容器，其包含結合LAG-3的適體，例如本文所述的任何一種。
在一些實施例中，該套組可包含依據本文所述任何方法之使用說明書。例如，所包括的說明書可包括投予適體以治療、延遲發作，或減輕目標疾病的描述，如本文所述。該套組可進一步包含篩選適合該治療的個體之描述，基於辨識該個體是否患有目標疾病。在其他實施例中，該說明書包含向具有目標疾病風險的個體投予適體的描述。
關於使用LAG-3結合適體的說明書通常包括關於預期治療的劑量、投藥方案和投藥途徑的信息。容器可為單位劑量、大包裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。本發明套組中提供的說明書通常是在標籤或包裝說明書上的書面說明(例如，包括在套組中的紙張)，但機器可讀說明(例如，磁性或光學儲存盤上搭載的說明書)也是可接受的。
標籤或包裝內說明書指示該組成物用於治療、延遲發病及/或緩解與癌症相關的疾病或病症，例如本文所述者。可提供用於實踐本文描述的任何方法之說明書。
另外，本揭示提供一種用於偵測或測量生物樣品中的LAG-3及/或LAG-3+
細胞位準或用於體內診斷目的之套組。此種套組可包含本文所述的一或多種抗-LAG-3適體，其亦可與本文所述的可偵測標記偶聯。套組可更包含一或多種試劑，用於處理生物樣品及/或產生或偵測信號，其直接或間接地由可偵測標記釋放。該套組可更包括進行試驗之說明，該試驗係使用套組中包括之抗-LAG-3適體進行，以偵測或測量樣品中LAG-3或LAG-3+
細胞位準的說明書。該套組可包含如何處理生物樣品，以及如何進行適當試驗，以測量樣品中的LAG-3或LAG-3+
細胞的描述。
如本文所述的套組位於適當包裝中。適當的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、廣口瓶、彈性包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)，以及類似物。亦考慮與特定裝置組合使用的包裝，例如吸入器、鼻腔投藥裝置(例如霧化器)或輸液裝置，例如微型泵。套組可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可以皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組成物中的至少一種活性試劑是如本文所述的LAG-3結合適體。
套組可任擇地提供額外的成分如緩衝液，以及說明資訊。通常，該套組包括一容器，以及在容器上或與容器相結合的標籤或包裝說明書。在一些實施例中，本發明提供包含上述套組內容物的製品。一般技術
除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些技術在本領域的技術範圍內。Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。無需進一步闡述，相信本領域技術人員可基於上面描述以完整利用本發明。因此，以下具體實施例僅僅是說明性的，並不以任何方式限制本發明的其他部分。本文引用的所有出版物均經由引用併入，用於本文引用的目的或主題。
無需進一步闡述，相信本領域技術人員可基於上面描述以完整利用本發明。因此，以下具體實施例僅僅是說明性的，並不以任何方式限制本發明的其他部分。本文引用的所有出版物均經由引用併入，用於本文引用的目的或主題。實例
為了可以更全面地理解本文所述的發明，係提出以下實例。係提供本申請案中描述的實例，以說明本文提供的系統和方法，且不應以任何方式解釋為限制其範圍。實例 1: 辨識與鑑定 LAG-3 適體
候選淋巴細胞活化基因3(LAG-3)適體係由合成的ssDNA庫中辨識出，使用人類重組LAG-3作為靶標的高通量SELEX試驗。此類LAG-3適體候選物係進行下一代測序，並使用LAG-3/MHC-II生物試驗測試其破壞LAG-3與MHC-II交互作用的活性。已發現數種LAG-3適體破壞LAG-3和MHC-II之間的交互作用，如螢光素酶報導子的表現所示。示範性結果提供於圖1A。抗-LAG-3抗體使用作為陽性對照。圖1A。
LAG-3適體B4、B8、D9和F4係於圖1A中以箭頭標記，這些適體的序列提供於下面表1。序列比對揭示該辨識出的LAG-3適體中的保守性模體，如圖1B所示。包含該保守性模體的適體預期與LAG-3結合，並破壞其與MHC-II的交互作用。
為了直接測試LAG-3適體與LAG-3的結合，體外結合試驗係使用附著於經鎳塗覆的微珠或經鎳塗覆的盤孔上之His標記重組LAG-3進行。沖提出結合的LAG-3適體，並以qPCR偵測。使用基於微珠的試驗，適體B4和B8與重組LAG-3的結合，係以濃度依賴性方式增加。圖1C。使用盤基礎試驗，發現適體B4和適體B4的生物素標記形式(Bio-B4)，係以類似方式結合至重組LAG-3。圖1D。表 1.
示範性LAG-3適體之序列
*保守性模體以粗體與與下標顯示
為了辨識出涉及結合至LAG-3的適體B4之最小序列，係製備適體B4的各種截短形式，並在本文所述的結合試驗中研究它們對於LAG-3的結合活性，使用R9R作為陰性對照組。適體B4的這些截短形式之適體序列，以及它們與重組LAG-3結合的解離常數(Kds)示於表2中。適體B4、B4-SL2、B4-SL3和B4-SL4與重組LAG-3的結合，係以濃度依賴性方式增加。圖1E。截斷形式的B4-SL5和B4-SL6顯示最小結合至無結合；這兩個截短形式的變異體刪去上述保守模體之一部分。圖1E。表 2.
截斷適體B4序列與解離常數
*保守性模體或其部分係以粗體與與下標顯示
這些結果顯示圖1B中所示的保守性模體，對於在細胞培養物中結合至重組LAG-3，以及破壞LAG-3與MCH-II的交互作用是相當重要的。因此，包含該保守模體的適體預期具有與LAG-3結合的活性，並破壞其與MCH-II的交互作用。實例 2 ：四聚體形式之 LAG-3 適體的合成與鑑定
四聚體形式的LAG-3適體係使用具有互補區段的兩個骨架序列構建，使得它們可經由鹼基配對黏合在一起。每一骨架序列可在5'和3'末端連接兩個適體，因而形成一適體四聚體。此連接係使用在每個末端具有引子序列的骨架序列達成，該引子序列與適體序列中的引子序列互補，其允許適體與骨架序列的每個末端鹼基配對。示範性的適體序列和骨架序列如表3所示。表 3.
示範性骨架與適體序列
*引子序列下標出。P16代表一段16個殘基的引子，以及P10代表一段10個殘基的引子。
將骨架序列和適體序列以各種莫耳比例混合，由此形成的四聚體以尺寸排阻層析法分離。如圖2A至2E所示，代表游離適體的峰值隨著適體的莫耳濃度降低而降低。得到的骨架/適體錯合物為四聚體形式，含有與4個適體結合的兩個骨架分子。
不同骨架和適體序列的四聚體係經由將10μM的每一骨架與60μM的適體靜置而形成。骨架和適體組合和靜置條件示於表4中。由各種骨架和適體序列形成的四聚體中的骨架和適體的莫耳比，係使用尺寸排阻層析法檢查，結果示於圖3A至3J中。在數種四聚體組合的層析譜中偵測到多個尖峰，顯示這些組合形成部分結構(例如，圖3B-3C)。部分結構包括除了期望的四聚體之外的結構，例如三聚體或二聚體。偵測到對應於四聚體的尖峰和對應於游離適體的第二尖峰，顯示形成了期望的適體四聚體。圖3A和3H。表 4.
示範性LAG-3適體四聚體合成摘要
接下來，係使用LAG-3/MHC-II生物試驗測試由此形成的LAG-3四聚體破壞LAG-3與MHC-II交互作用的活性，其中係以螢光素酶報導子的表現指出LAG-3與MHC-II交互作用的破壞。如圖4A所示，螢光素酶報導子的表現通常隨著四聚體濃度的增加而增加。數種LAG-3適體四聚體較抗-LAG-3抗體誘發更多的螢光素酶表現，即使在使用較少LAG-3四聚體(250 nM)的條件下(相對於抗-LAG-3抗體(333 nM))的試驗中亦如此。圖4A。這些結果說明LAG-3四聚體對於LAG-3與MHC-II結合的阻斷活性，高於抗-LAG-3抗體。
為了驗證LAG-3四聚體是否可結合至LAG-3，係使用重組LAG-3和LAG-3四聚體進行體外結合試驗。觀察到LAG-3四聚體係以劑量依賴性方式與LAG-3結合。圖4B。CD4在結構上與LAG-3相似，亦結合至MHC-II。然而，在LAG-3四聚體和CD4之間未偵測到結合，表示LAG-3適體四聚體和LAG-3之間的結合具特異性。圖4B。
亦使用本文所述的體外結合試驗，測試LAG-3適體(游離形式或四聚體形式)與不同物種(例如大鼠、小鼠和人類)的LAG-3結合情況。結果顯示LAG-3適體可與來自大鼠、小鼠和人類的LAG-3交叉反應。圖4C。
總之，這些結果顯示LAG-3適體(游離形式或四聚體形式)會與來自不同物種的LAG-3結合，且LAG-3適體與LAG-3的結合會抑制LAG-3與MHC-II的交互作用。實例 3 ： LAG-3 四聚體保護 小鼠對抗腫瘤形成
如下研究四聚體形式的LAG-3適體之抗腫瘤活性。以CT26結腸癌細胞皮下接種小鼠，以允許形成腫瘤異種移植物。之後小鼠投予單獨之抗-PD-L1抗體，或與四聚體形式的LAG-3適體組合，或載體對照組。使用骨架和B4-SL3適體序列形成LAG-3四聚體。使用尺寸排阻層析法決定的骨架比適體之莫耳比，證實形成了具有B4-SL3適體的LAG-3四聚體(圖5)。
在第3天投予小鼠1劑量的LAG-3四聚體，或在第3至12天投予10次連續劑量的LAG-3四聚體，每天一劑。圖6A中提供治療處方的說明。與單獨以PD-L1抗體或載體對照組處理的小鼠相較，以LAG-3四聚體和PD-L1抗體處理的小鼠顯示出顯著降低的腫瘤生長。圖6B。與以10次劑量的LAG-3適體治療的小鼠相較，以1劑LAG-3適體治療的小鼠觀察到的腫瘤生長減少，且與10 mg/kg LAG-3四聚體投藥相較，使用1 mg/kg LAG-3四聚體者，觀察到更大的降低。投予不同治療的小鼠手術切除的腫瘤顯示在圖6C中。
在相關研究中，係以CT26結腸癌細胞皮下接種小鼠，以允許形成腫瘤異種移植物。將小鼠隨機分成5組(每組包括6隻小鼠)，每組以下列物質處理：(A)載體對照組(6次注射，間隔3天，接著最終注射1次)，(B)抗-PD-L1抗體(10 mg/kg；6次注射，間隔3天)，(C)LAG-3適體(1 mg/kg，單劑量)，(D)抗-PD-L1抗體(10 mg/kg；6次注射，間隔3天)+ LAG3四聚體(1 mg/kg；單劑量)，以及(E)抗-PD-L1抗體(10 mg/kg；6次注射，間隔3天)，以及LAG3四聚體(1 mg/kg；單劑量)；遵循圖10A中所示的投藥方案。如圖10B所示，相對於載體對照組，抗-PD-L1抗體和LAG3四聚體的共同投藥顯著降低異種移植小鼠中的腫瘤體積。令人驚訝的是，單劑量的LAG3四聚體便足以實現抗腫瘤效果。
總之，這些結果顯示LAG-3四聚體保護免於形成CT26結腸癌細胞腫瘤。實例 4 ：使用經由迴文序列黏合之相同骨架序列建構 LAG-3 四 聚體
使用具有迴文殘基的骨架序列建構LAG-3四聚體，該迴文殘基允許兩個相同的骨架序列經由迴文殘基的鹼基配對黏合。具有8個殘基、10個殘基、12個殘基和16個迴文殘基的骨架序列，係經由瓊脂凝膠分析和尺寸排阻層析測試其四聚體的形成。具有粗體和下標的迴文殘基之適體序列和骨架序列，如表5所示。表 5.
示範性適體與橋聯序列
*迴文殘基以粗體與下標表示
具有8個迴文殘基(圖7A)和12個迴文殘基(圖7C)的骨架序列，在僅有骨架之行列中顯示出單一條帶，表示其為由兩個相同骨架序列黏合形成的雙鏈體。相反地，具有10個迴文殘基(圖7B)和16個迴文殘基(圖7D)的骨架序列，僅有骨架之行列中顯示出兩個條帶，表示並未形成這些序列的相同骨架序列雙鏈體。
使用尺寸排阻層析法確認上述結果。在使用具有12個迴文殘基的骨架序列形成LAG-3四聚體的層析譜中，觀察到一主要單峰(圖8A)，表示形成單一四聚體結構。在使用具有8個迴文殘基的骨架序列形成的LAG-3四聚體的層析譜中，觀察到兩個相似大小的峰(圖8B)，表示並未形成相同骨架序列之雙鏈體。這些結果證明LAG-3四聚體是使用經由12個迴文殘基黏合的相同骨架序列形成的。
接下來，具有不同12個殘基迴文序列的骨架序列之黏合情況，係經由瓊脂凝膠和自由能分析來分析。檢查具有通式(A/T)4
(C/G)4
(A/T)4
的迴文序列的各種組合。
如圖9和表6所示，迴文序列ATATCGCGATAT (SEQ ID NO:17)和ATATCCGGATAT (SEQ ID NO:18)經過瓊脂凝膠分析，顯示超過90%的二聚體形成，其在測試序列中最高。經瓊脂凝膠分析偵測的迴文序列和二聚體形成百分比及/或單體形成百分比，顯示在下面表6中。表 6.
示範性迴文序列與瓊脂凝膠分析結果
類似結果係於迴文序列之自由能分析中獲得。如下面表7所示，迴文序列ATATCGCGATAT (SEQ ID NO:17)與ATATCCGGATAT (SEQ ID NO:18)，在所分析之序列中傾向於形成雙體，以自由能計算為基礎。表 7.
示範性迴文序列之自由能分析
總結之，這些結果證實LAG-3四聚體係使用相同的骨架序列，經由具有一般式(A/T)4
(C/G)4
(A/T)4
之12個迴文殘基黏合而形成。其他實施例
本說明書中揭示的所有特徵可以任何組合方式組合。本說明書中揭示的每個特徵可以用於相同、等效或類似目的的替代特徵取代。因此，除非另有明確說明，否則所揭示的每個特徵僅是一系列等效或類似特徵的實例。
根據以上描述，本領域技術人員可容易地確定本發明的必要特徵，並在不脫離其精神和範圍的情況下，可以對本發明進行各種變化和修飾，以使其適應各種用途和條件。因此，其他實施例亦落於申請專利範圍內。等效物
雖然本文已描述和說明若干發明實施例，但是本領域一般技術人員將容易想到用於執行功能及/或獲得結果的各種其他裝置及/或結構，及/或本文描述的一或多個優點，這些變化及/或修飾中的每一者被認為是在本文描述的發明實施例的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易理解的是，本文描述的所有參數、尺寸、材料和配置，旨為示範性，且實際參數、尺寸、材料及/或配置，將取決於特定應用，或使用本發明所教示之應用。本領域技術人員將認知到，或者能夠使用不超過常規實驗查明，本文所述的具體發明實施例的許多等效物。因此，應該理解的是，前述實施例僅作為實例呈現，並落於所附申請專利範圍及其等效物的範圍內，本發明實施例可以不同於具體描述和主張的方式實施。本揭示的發明實施例係相關於本文描述的每一單獨特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法。此外，如果這些特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則二或更多個這樣的特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法的任何組合，皆包括在本發明的發明範圍內。
如本文定義和使用的所有定義，應理解為超越字面定義、通過引用併入文獻中的定義，及/或定義術語的普通含義的控制。
本文揭示的所有參考文獻、專利和專利申請案，均經由引用併入本文所引用的主旨，在某些情況下可涵蓋整份文件。
除非明確相反指出，否則本說明書和申請專利範圍中使用的不定冠詞「一(a)」和「一個(an)」應理解為表示「至少一」。
本說明書和申請專利範圍中使用的片語「及/或」應理解為表示如此結合的元件中的「其中一者或二者皆是」，即在某些情況下結合存在並且在其他情況下分離存在的元件。以「及/或」列出的多個元素應以相同的方式解釋，即，如此結合的元件「一或多者」。除了以「及/或」子句具體標示的元件之外，可任擇地存在其他元件，無論是與具體標示的那些元件相關或是不相關。因此，作為非限制性實例，當與諸如「包含」的開放式語言結合使用時，對「A及/或B」的引用，可在一個實施例中僅指稱A(任擇性地包括除了B以外的元素)；在另一實施例中，僅指稱B(任擇性地包括除了A以外的元素)；在又一個實施例中，指稱A和B兩者(任選地包括其他元件)；等等。
如本說明書和申請專利範圍中所用，「或」應理解為具有與如上所定義的「及/或」相同的含義。例如，當分隔列表中的項目時，「或」或「及/或」應被解釋為包容性的，即包含至少一個，但也包括大於一個元素的數量或列表，以及(任擇地)其他未列出的項目。只有明確指出相反的術語，例如「只有一個」或「恰好一個」，或者，當在申請專利範圍中使用時，「由...組成」將指的是恰好包含某一數量的元件或某一列表的元件。一般而言，此處使用的術語「或」僅應被解釋為表示排他性替代語(即「一個或另一個但不是兩個」)，當前面接有排他性術語，例如「之一」、「其中之一」、「僅有一個」，或「恰好一個」。當在申請專利範圍中使用時，「基本上由......組成」，應具有其在專利法領域中使用的普通含義。
如本說明書和申請專利範圍中所使用的，片語「至少一」，當提及一或多個元件的列表時，應理解為代表選自該元件列表中的任何一個或多個元件中的至少一個元件，但不一定包括元件列表中具體列出的每個元件中的至少一者，且不排除元件列表中元件的任何組合。此定義亦允許的是，除了在片語「至少一」所提及的元件列表內具體標示的元件之外，元件可任擇性地出現，無論是與具體標示的那些元件相關還是不相關。因此，作為非限制性實例，「A和B中的至少一者」(或等效地，「A或B中的至少一者」，或等效地「A及/或B中的至少一者」)，在一實施例中，可指至少一，任選地包括多於一個A，但不存在B(並且任擇地包括除B之外的元素)；在另一實施例中，至少一，任選地包括多於一個B，但不存在A(並且任擇地包括除A之外的元素)；在又一實施例中，至少一，任擇地包括多於一個A，以及至少一，任擇地包括多於一個B(和任擇地包括其他元素)；等等。
亦應理解的是，除非明確相反地指出，否則在本文主張的包括一個以上步驟或動作的任何方法中，該方法的步驟或動作的順序不一定限於引用方法的步驟或動作的順序。
無
圖 1A-1E
是顯示候選LAG-3適體候選物的結合活性之圖。圖 1A ：
顯示使用所示LAG-3適體候選物的LAG-3/MHC-II生物試驗結果之圖。圖 1B
：示範性LAG-3適體中辨識出的保守性模體(SEQ ID NO：1)的示意圖。圖 1C ：
顯示LAG-3適體與附著於經鎳包覆的微珠之His-標記的重組LAG-3之體外結合試驗結果圖。圖 1D
：顯示LAG-3適體與附著於板上之經鎳塗覆孔的His-標記重組LAG-3之體外結合試驗結果圖。圖 1E
：顯示截短形式的LAG-3適體B4與附著於經鎳包覆微珠的His-標記重組LAG-3之體外結合試驗結果圖。圖 2A-2E
為顯示使用尺寸排阻層析法測定的LAG-3四聚體中，骨架分子和LAG-3適體B4_FL的莫耳比例圖。圖 2A
：骨架：骨架：適體的莫耳比例為1：1：10。圖 2B ：
骨架：骨架：適體的莫耳比例為1：1：8。圖 2C
：骨架：骨架：適體的莫耳比例為1：1：6。圖 2D
：骨架：骨架：適體的莫耳比例為1：1：5。圖 2E
：骨架：骨架：適體的莫耳比例為1：1：4。圖 3A-3J
為顯示使用尺寸排阻層析法測定的LAG-3四聚體中，骨架分子和各LAG-3適體序列的莫耳比例圖。圖 3A ：
因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1、R2與適體序列B4_FL之莫耳比例。圖 3B
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P16和R2_B10_P16，與適體序列B4_SL3_P16之莫耳比例。圖 3C
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P16和R2_B10_P16，與適體序列B4_SL8_P16之莫耳比例。圖 3D ：
因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P16和R2_B10_P16，與適體序列B4_SL11_P16之莫耳比例。圖 3E
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P10和R2_B10_P10，與適體序列B4_SL3_P10之莫耳比例。圖3F
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P10和R2_B10_P10，與適體序列B4_SL8_P10之莫耳比例。圖 3G
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B10_P10和R2_B10_P10，與適體序列B4_SL11_P10之莫耳比例。圖 3H
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B18_P10和R2_B18_P10，與適體序列B4_SL3_P10之莫耳比例。圖 3I
：因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B18_P10和R2_B18_P10，與適體序列B4_SL8_P10之莫耳比例。圖 3J ：
因此形成之LAG-3適體四聚體中，骨架序列R1_B18_P10和R2_B18_P10，與適體序列B4_SL11_P10之莫耳比例。圖 4A-4C
是顯示候選LAG-3適體候選物的結合活性之圖。圖 4A
：顯示使用表4中所示的使用序列形成的LAG-3四聚體之LAG-3/MHC-II生物試驗結果圖。圖 4B
：顯示LAG-3四聚體與His-標記重組LAG-3的體外結合試驗結果圖。圖 4C
：顯示LAG-3四聚體與來自不同物種如大鼠、小鼠和人類的His-標記重組LAG-3的體外結合試驗結果圖。圖 5
是顯示由適體序列B4-SL3形成的LAG-3四聚體的尺寸排阻層析法之結果圖。圖 6A-6C
是顯示LAG-3適體四聚體用於治療具有結腸腫瘤的異種移植小鼠的用途之圖，其經由皮下接種CT26結腸癌細胞而誘發。圖 6A
：植入CT26結腸癌細胞的小鼠治療區域之圖示。圖 6B
：顯示在小鼠植入CT26結腸癌細胞後不同時間點的腫瘤體積圖。圖 6C
：經CT26結腸癌細胞植入後第21天，從小鼠中取出的腫瘤的照片。圖 7A-7D
是顯示具有迴文殘基的各種骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。圖 7A
：顯示具有8個迴文殘基的骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。圖 7B
：顯示具有10個迴文殘基的骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。圖 7C
：顯示具有12個迴文殘基的骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。圖 7D
：顯示具有16個迴文殘基的骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。圖 8A-8B
是顯示使用具有迴文殘基的骨架序列形成的LAG-3四聚體的尺寸排阻層析法結果圖。圖 8A
：顯示使用具有12個迴文殘基的骨架序列形成的LAG-3四聚體之尺寸排阻層析法結果圖。圖 8B
：顯示使用具有8個迴文殘基的骨架序列形成的LAG-3四聚體之尺寸排阻層析法結果圖。圖 9
是具有不同的12個殘基迴文序列的骨架序列的瓊脂凝膠分析圖。B12P16： SEQ ID NO：17。B12P16_1： SEQ ID NO：18。B12P16_2： SEQ ID NO：19。B12P16_3： SEQ ID NO：20。B12P16_4： SEQ ID NO：21。B12P16_5： SEQ ID NO：22。B12P16_6： SEQ ID NO：23。圖 10A-10B
包括顯示在小鼠模型中觀察到的抗-LAG3適體(四聚體)與抗-PD-L1抗體組合的治療效果之圖。圖 10A
：示範性投藥方案的示意圖。圖 10B
：顯示以抗-LAG3適體與抗-PD-L1抗體組合處理的小鼠中，腫瘤組的抑制圖。圖 11
是顯示攜帶適體、siRNA及/或治療劑的多種示範性多聚核酸複合物的示意圖
無
Claims (12)
- 一種核酸適體，其包含核苷酸模體GGGGGGGGTTA(SEQ ID NO：2)；其中該核酸適體結合至人類淋巴細胞活化基因3(LAG-3)。
- 如請求項1之核酸適體，其中該核酸適體包含TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG(SEQ ID NO：12)之核苷酸序列。
- 如請求項2之核酸適體，其中該核酸適體包含TCCCTACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：13)之核苷酸序列。
- 如請求項2之核酸適體，其中該核酸適體包含ACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG(SEQ ID NO：14)之核苷酸序列。
- 如請求項2之核酸適體，其中該核酸適體包含GCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGC(SEQ ID NO：15)之核苷酸序列。
- 如請求項2之核酸適體，其中該核酸適體包含CTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCA(SEQ ID NO：16)之核苷酸序列。
- 如請求項2之核酸適體，其中該核酸適體選自於由下列組成之群組： (a)TCCCTACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCACCGTGCTACAAC(SEQ ID NO：13)；(b)ACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG(SEQ ID NO：14)；(c)GCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGC(SEQ ID NO：15)；以及(d)CTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCA(SEQ ID NO：16)。
- 如請求項1至7任一項之核酸適體，其中該核酸適體係由約35至100個核苷酸組成。
- 如請求項1至7任一項之核酸適體，其中該核酸適體係由約35至70個核苷酸組成。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9任一項之核酸適體，以及醫藥上可接受之載體。
- 一種如請求項1至9任一項之核酸適體用於製備供調節免疫反應之藥物之用途。
- 一種偵測LAG-3-陽性細胞存在之方法，其包含：(i)將懷疑表現有LAG-3的細胞與如請求項1至9任一項之核酸適體接觸，其中該核酸適體係偶聯至偵測試劑上；以及(ii)測量由該偵測試劑釋放出之訊號，該偵測試劑係偶聯至已結合至細胞之該核酸適體；其中該訊號強度指示LAG-3-陽性細胞之存在或位準。
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