TWI805175B - 使用交聯劑和多元醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠以及含彼的填充物、彼之製法、及預填充之注射器 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的係提供在使用交聯劑和多元醇交聯期間降低毒性以於體內具有高穩全性及高持久性之交聯的玻尿酸水凝膠，以及包含彼之用於填充物的組成物。本發明亦有關製備該交聯的玻尿酸水凝膠之方法、製備該填充物之方法、及該填充物於預填充之注射器中的用途。

Description

使用交聯劑和多元醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠以及含彼的填充物、彼之製法、及預填充之注射器
本發明係關於使用多元醇與交聯劑交聯之玻尿酸水凝膠以及含彼之填充物。
已開發用以改善皺紋之填充物廣泛使用玻尿酸，其為具有高度生物相容性之天然化合物。為了延長玻尿酸於體內的持續期間，目前使用採用各種交聯劑交聯之玻尿酸水凝膠作為填充物。然而，因交聯劑通常具有高毒性，故有難以大量使用的缺點。此外，儘管經交聯之水凝膠的交聯率低時，仍有因玻尿酸酶或反應性氧物種(自由基)而快速分解的缺點，因此難以提高於體內之穩定性與持久性二者。
為了解決如上述先前技術之問題而反複研究的結果，本案發明人已確認使用多元醇(諸如糖醇)與慣用交聯劑一起使玻尿酸交聯時，優異地改善對於玻尿酸酶、反應性氧物種(自由基)及/或熱之穩定性，並且，因使用少量交聯劑而使毒性顯著降低，因此可製備具有高度生物相容性之填充物，從而完成本發明。
因此，本發明之目的係提供在交聯期間降低毒性以於體內具有高安全性及高持久性之交聯的玻尿酸水凝膠，以及包含彼之用於填充物的組成物。
根據本發明之一態樣，提供包含玻尿酸或其鹽、交聯劑及多元醇之交聯的玻尿酸水凝膠，其中玻尿酸或其鹽係以交聯劑和多元醇交聯；以及包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物。
根據本發明之一態樣，填充物係用於軟組織注射，例如用於皮膚注射；填充物可基於填充性質而使用，例如填充物用途，諸如生物組織之填充、填充皺紋之改善皺紋、臉部重塑(remodeling)或輪廓矯正、或軟組織之體積修復或增加。
根據本發明之一態樣，多元醇可為糖醇。
根據本發明之一態樣，可提供用於製備交聯的玻尿酸水凝膠之方法，該方法包含將玻尿酸或其鹽與多元醇混合以及將交聯劑和鹼水溶液之混合溶液添加至玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物且使之反應。
根據本發明之一態樣，預填充之注射器填充有包含交聯的玻尿酸之填充物。
由於根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠使用交聯劑與多元醇，因此對體內之玻尿酸酶、反應性氧物種及儲存溫度的抗性提高。因此，包含此交聯的玻尿酸水凝膠之填充物的穩定性提高且於儲存期間之毒性降低以展現高安全性以及具有於體內之優異的持久性，因此軟組織修復或體積增大及改善皺紋效果優異。
[圖1]為根據本發明之實施例1-1的使用交聯劑及甘露醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之活體外抗酶性結果與比較例2至4比較之圖。
[圖2]為根據本發明之實施例1-1的使用交聯劑及甘露醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之活體外抗自由基性結果與比較例2至4比較之圖。
[圖3]為根據本發明之實施例1-1的使用交聯劑及甘露醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之活體外耐熱性結 果與比較例2至4比較之圖。
[圖4]為根據本發明之實施例1-1的使用交聯劑及甘露醇交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之活體內生物相容性試驗結果與比較例2至4比較之圖。
下文茲詳細說明本發明。
本發明之交聯的玻尿酸水凝膠中所含的玻尿酸(下文亦稱為「HA」)為生物聚合物物質，其中由N-乙醯基-D-葡萄糖胺及D-葡萄糖醛酸所組成之雙醣重複單元(雙醣單元)係線性連接，大量地存在於眼睛的玻璃狀液、關節之滑液、雞冠等等之中，且具有優異的生物相容性，因此其廣泛用於醫療及醫療裝置或化妝品用途，諸如眼科手術輔助劑、關節黏性補充(viscosupplementation for joint)、藥物遞輸材料、眼藥水、皺紋改善劑等等。
具體而言，根據本發明之玻尿酸水凝膠中所含的玻尿酸可指玻尿酸或玻尿酸之鹽。玻尿酸之鹽包含例如全部有機鹽，諸如玻尿酸鈉、玻尿酸鉀、玻尿酸鈣、玻尿酸鎂、玻尿酸鋅、玻尿酸鈷及玻尿酸四丁基銨，但不限於此。
本發明中，用於交聯反應之玻尿酸的重量平均分子量可為1,000,000Da或更高、1,500,000Da或更高、2,000,000Da或更高、2,300,000Da或更高、或2,500,000Da或更高，例如，其為1,000,000至1,500,000Da、 1,000,000至2,000,000Da、1,000,000至3,000,000Da、1,000,000至4,000,000Da、1,500,000至2,000,000Da、1,500,000至3,000,000Da、1,500,000至4,000,000Da、2,000,000至4,000,000Da、2,300,000至4,000,000Da、2,000,000至3,700,000Da、2,200,000至3,700,000Da、或2,500,000至3,500,000Da。
根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠之特徵在於玻尿酸或其鹽係使用交聯劑和多元醇交聯。
本發明中所使用之術語「交聯的」係指將個別聚合物分子或單體鏈結合成更安定之結構(諸如凝膠)的分子間鍵。如此，交聯的聚合物具有至少一個將至少一個個別聚合物分子連接至另一聚合物分子的分子間鍵。
根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠之特徵在於玻尿酸或其鹽係使用交聯劑和多元醇交聯，此與僅以交聯劑交聯之慣用玻尿酸水凝膠不同。
術語「交聯劑」意指能誘發玻尿酸鏈之間的交聯之任何化合物，且於本發明中，可使用能交聯玻尿酸或其鹽之交聯劑而無限制，例如，其可變化成，例如包含二或更多個環氧官能基之化合物。交聯劑之較佳實例可包含內源性多胺、醛、碳二醯亞胺、二乙烯碸作為非環氧基交聯劑。此外，環氧基交聯劑可包含丁二醇二環氧丙基醚(1,4-丁二醇二環氧丙基醚：BDDE)、乙二醇二環氧丙基醚(EGDGE)、己二醇二環氧丙基醚(1,6-己二醇二環氧丙基醚)、丙二醇二環氧丙基醚、聚丙二醇二環氧丙基醚、聚 伸丁二醇二環氧丙基醚、新戊二醇二環氧丙基醚、聚甘油聚環氧丙基醚、二甘油聚環氧丙基醚、甘油聚環氧丙基醚、三甲基丙烷聚環氧丙基醚(tri-methylpropane polyglycidyl ether)、雙環氧基丙氧基乙烷(bisepoxypropoxy ethylene)(1,2-(雙(2,3-環氧基丙氧基)乙烷(1,2-bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、新戊四醇聚環氧丙基醚及山梨醇聚環氧丙基醚等等，其中，二環氧化物系的1,4-丁二醇二環氧丙基醚因具低毒性而為特佳的。
與交聯劑一起使玻尿酸或其可接受之鹽交聯之多元醇係與交聯劑連接以使玻尿酸或其可接受之鹽交聯。此多元醇係指包含二或更多個自由羥基之有機分子，其可為具有2至20個碳原子之多元醇，更具體言，為糖醇。適合本發明之多元醇可為飽和或不飽和、帶有直鏈、支鏈或環狀烷基之化合物，於其烷基鏈上具有至少2個-OH官能基，例如3或更多個-OH官能基，更具體而言，4或更多個-OH官能基。多元醇之非限制性實例如下：甘油、1,3-丙二醇、異戊二醇、戊二醇、己二醇；二醇，諸如乙二醇、1,2-丙二醇(propylene glycol)、丁二醇、二乙二醇；具有2至6個重複單元之聚甘油，例如二甘油、赤藻糖醇、***糖醇(arabitol)、側金盞花醇(adonitol)、山梨醇、甘露醇、木糖醇、甜醇(dulcitol)、葡萄糖、果糖、木糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖；以及其衍生物及其混合物，諸如磷酸甲基葡萄糖苷(methylglucoside phosphate)。更具體而言，多元醇可選自由甘露醇、山梨 醇及木糖醇所組成之群組。本發明中，多元醇中之-OH官能基與反應性氧物種反應以使反應性氧物種變不活性，從而抑制填充物因反應性氧物種而分解。
作為一具體實例，玻尿酸或其可接受之鹽可如下與交聯劑及多元醇連接。
Figure 111100785-A0305-02-0009-1
換言之，玻尿酸或其可接受之鹽的羥基係連接至交聯劑之雙端的環氧基中之一者，且交聯劑之另一端的環氧基與多元醇之羥基連接成為玻尿酸-交聯劑-多元醇之形式。此外，多元醇之另一羥基係如下連續連接至新玻尿酸或其可接受之鹽之羥基，最終製得交聯的玻尿酸水凝膠。
Figure 111100785-A0305-02-0009-2
根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠具有在約3至約100，較佳為約3至約80，更佳為約3至約50之範圍的修飾度(MoD)。
此外，於本發明中，術語「修飾度(MoD)」係指連接至玻尿酸之總交聯劑相對於全部單位玻尿酸之莫耳數的莫耳比，且其可如以下方程式表達。
[方程式1] 修飾度(MoD)=連接至玻尿酸之交聯劑的莫耳數/單位玻尿酸之莫耳數
根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠可包含以交聯的玻尿酸水凝膠之總重為基準計，總共約10mg/g至約40mg/g，較佳為約15mg/g至約35mg/g，更佳為約20mg/g至約30mg/g之玻尿酸。
根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠(其中多元醇係化學性結合至玻尿酸或其鹽)展現出取代玻尿酸因反應性氧物種而分解之效果，且結構上干擾玻尿酸酶之結合及分解的機制，其因而具有將包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物注射至人體時展現抑制填充物分解之效果的優點，因此於注射至體內後的持久性增加。此外，當β-1-4-醣苷鍵(其中玻尿酸分子之間的化學鍵相對弱)不僅因如上述之酶而斷裂且亦因熱而斷裂時，交聯的玻尿酸水凝膠會分解，根據本發明，多元醇具有抑制此玻尿酸之熱分解以及於儲存期間具有優勢的熱穩定性，因此極適合作為填充物。
作為另一態樣，本發明係關於使用交聯劑和多元醇製備交聯的玻尿酸水凝膠之方法。具體而言，根據本發明之製備交聯的玻尿酸水凝膠之方法可包含(i)將玻尿酸或其鹽與多元醇混合；以及(ii)將交聯劑和鹼水溶液之混合溶液添加至玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物且使之反應。
於製備方法中，玻尿酸或其鹽、交聯劑及多 元醇之相關事項，除非另外陳述，否則可同樣地應用與交聯的玻尿酸水凝膠相關者。
此外，玻尿酸或其鹽之重量平均分子量可為1,000,000Da或更高、1,500,000Da或更高、2,000,000Da或更高、2,300,000Da或更高、或2,500,000Da或更高，例如，其為1,000,000至1,500,000Da、1,000,000至2,000,000Da、1,000,000至3,000,000Da、1,000,000至4,000,000Da、1,500,000至2,000,000Da、1,500,000至3,000,000Da、1,500,000至4,000,000Da、2,000,000至4,000,000Da、2,300,000至4,000,000Da、2,000,000至3,700,000Da、2,200,000至3,700,000Da、或2,500,000至3,500,000Da。
另一方面，製備方法中所使用之多元醇的濃度以玻尿酸或其鹽為基準計，可為5至100mol%、10至100mol%、10至90mol%或10至80mol%，但不限於此，以及可視反應條件而適當地調整。
此外，可使用鹼水溶液而無限制，只要其為已知適合玻尿酸之交聯的鹼水溶液即可，例如，可為NaOH、KOH、NaHCO3、LiOH或其組合，較佳的，可為NaOH。鹼水溶液之濃度可為0.1至0.5N，但不限於此。製備方法中所使用之鹼水溶液的濃度以玻尿酸或其鹽為基準計，可為5至100mol%、10至100mol%、10至90mol%或10至80mol%，但不限於此，以及可視反應條件而適當地調整。
當交聯劑及/或多元醇之濃度係以超過上述範圍之高濃度使用時，獲得具有過高彈性之填充物，而當濃度低於上述範圍時，彈性太低而無法展現適當的黏彈性。具體而言，交聯反應可藉由攪拌玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物、以及交聯劑和鹼水溶液以將彼等均勻地混合，然後使彼等維持一段特定時間來進行。於交聯反應期間之溫度可為室溫或更高，較佳係在25至65℃或27至55℃之溫度範圍，歷時1至22小時或2至20小時。
於根據本發明之製備方法中，總反應濃度(即，玻尿酸和多元醇之總重相對於玻尿酸、多元醇及溶劑之總重的比)可為5至30%(w/w)、或10至30%(w/w)。
於本發明之一具體實例中，藉由將以玻尿酸為基準計，10mol%之甘露醇、山梨醇或木糖醇與玻尿酸混合，與NaOH溶液和1,4-BDDE之混合溶液相混合，且於30至50℃維持2小時，然後清洗/中和/溶脹交聯的凝膠，然後使用篩網將其粉碎，然後將其滅菌而製得物質。
於另一態樣中，本發明係關於包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物。
填充物可包含以總填充物重量為基準計，0.5至10重量%，較佳為1至5重量%之交聯的玻尿酸水凝膠。
此外，根據本發明之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物除了交聯的玻尿酸水凝膠以外，還可進一步包含麻醉劑以減輕注射期間病患的疼痛。
麻醉劑包含至少一種本領域中已知之麻醉劑，較佳為局部麻醉劑，此一或多種麻醉劑之濃度為可有效緩解注射組成物時經歷的疼痛之量。麻醉劑之實例可選自由下列所組成之群組：胺布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米卡因(amylocaine)、苯諾西納(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、貝托卡因(betoxycaine)、二苯胺明(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、布坦本(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、布特撒明(butethamine)、丁氧卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、古柯乙烯(cocaethylene)、***(***e)、環甲卡因(cyclomethycaine)、待布卡因(dibucaine)、二甲異喹(dimethysoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、狄珀洛東(diperodon)、地環奈(dicyclonine)、艾克定(ecgonidine)、艾克寧(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、β-優卡因(beta-eucaine)、尤普羅辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、己卡因(hexylcaine)、羥丁卡因(hydroxytetracaine)、對胺基苯甲酸異丁酯、亮胺卡因甲磺酸鹽(leucinocaine mesylate)、左沙屈爾(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、美普利兒卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷(methyl chloride)、麥替卡因(myrtecaine)、納帕因(naepaine)、安妥卡因(octacaine)、 鄰卡因(orthocaine)、息痛佳音(oxethazaine)、對乙氧卡因(parethoxycaine)、芬那卡因(phenacaine)、酚、匹派魯卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普拉莫星(pramoxine)、必洛卡因(prilocaine)、普魯卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、普洛拍拉卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假***(psuedo***e)、吡咯卡因(pyrrocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、鄰羥苯甲醇、特他卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉明(zolamine)、及其鹽。於一實施態樣中，麻醉劑可為利多卡因，例如利多卡因鹽酸鹽的形式。
於根據本發明之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物中，填充物中所含之麻醉劑的濃度可為以填充物之總重為基準計約0.1重量%至約1.0重量%，例如可為組成物之約0.2重量%至約0.5重量%。較佳可為0.3重量%。
根據本發明之填充物中的麻醉劑之濃度可為治療有效的，此意指適合提供手術便利性及病患順從性之優點而不會傷害病患的濃度。
此外，根據本發明之填充物可進一步包含緩衝液，只要是用於製備玻尿酸水凝膠，可使用緩衝液而無限制。較佳之緩衝液的實例可包含選自由下列所組成之群組中之一或多者的緩衝液：檸檬酸、磷酸氫二鈉(sodium monohydrogen phosphate)、磷酸二氫鈉、二乙基巴比妥 酸、乙酸鈉、TAPS(參(羥甲基)甲胺基)丙烷磺酸酯)、Bicine(2-雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸鹽)、Tris(參(羥基甲基)銨基甲烷(tris(hydroxymethyl)ammonium methane))、Tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基甘胺酸)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 111100785-A0305-02-0015-15
乙磺酸鹽)、TES(2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]甲磺酸鹽)及PIPES(哌
Figure 111100785-A0305-02-0015-14
-N,N’-雙(2-乙磺酸鹽))，但不限於此。緩衝液中所包含之上述組分的含量可經適當調整，但較佳的，包含以緩衝液為基準計為0.3至2.0g/L之濃度。
此外，根據本發明之填充物可進一步包含等滲壓劑，只要是用於製備填充物，可使用等滲壓劑而無限制，以及其可包含於緩衝液中。作為較佳之等滲壓劑，可使用氯化鈉，但不限於此。等滲壓劑之含量可視需要經適當調整，例如，可包含以緩衝液為基準計為7.0至9.0g/L，但不限於此。
於根據本發明之一實例中，使用包含氯化鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉於注射用水中之緩衝液。
作為另一態樣，根據本發明之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物除了上述組分以外還可進一步包含填充物之製備中所包含的可接受組分。
根據本發明之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物因高熱穩定性之故而具有與慣用玻尿酸填充物調配物相比顯著增長的儲存期間之優點。此外，對於因玻尿酸酶及反應性氧物種(自由基)的降解具有高度抗性，因此在注 射至人體內之後可顯著增長持續期間。因其在生物相容性及毒性方面展現極優異的性質，其極適合用於化妝品或治療目的。
作為一具體態樣，根據本發明之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物可藉由填充生物組織及填充皺紋而用於改善皺紋、用於臉部之重塑或軟組織(諸如唇、鼻、臀、頰或胸部等)之體積增加。包含玻尿酸水凝膠之填充物可以適合此用途之投與形式投與，較佳可為注射形式，更佳為預填充之注射形式(預填充之注射器)。
作為另一態樣，本發明係關於用於製備如上述之包含交聯的玻尿酸水凝膠之填充物的方法，該方法包含下列步驟：(a)將玻尿酸或其鹽與多元醇混合；(b)將交聯劑和鹼水溶液之混合溶液添加至玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物且使之反應以製備交聯的玻尿酸水凝膠；(c)將於步驟(b)中所製備之玻尿酸水凝膠粗切；(d)使用緩衝液清洗及溶脹於步驟(c)中所製備之經粗切的玻尿酸水凝膠；以及(e)將於步驟(d)中之經清洗且溶脹的玻尿酸水凝膠粉碎。
步驟(a)及(b)為藉由於鹼水溶液上使用交聯劑和多元醇交聯玻尿酸或其鹽來製備交聯的玻尿酸水凝膠之步驟，而關於玻尿酸或其鹽、交聯劑、多元醇及交聯的 玻尿酸水凝膠之相關事項，可同樣地應用於交聯的玻尿酸水凝膠及其製備方法中所述者。
於粗切程序(步驟(c))中，可使用各種粗切玻尿酸之程序。於一實例中，於反應後所製備之交聯的玻尿酸水凝膠可呈餅形(或圓柱體形)，且可將其分切成半月形，例如，藉由使用切斷器(諸如切草器)分切成6份。然後，粗切程序可藉由使如上述分切之凝膠通過(較佳為二或更多次)具有固定刀刃間隔之切碎機來進行。
可根據已知緩衝液製備方法來製備步驟(d)中所使用之緩衝液。此外，緩衝液中可另外進一步包含麻醉劑。只要是用於玻尿酸水凝膠之製備，可使用緩衝液而無限制。作為較佳緩衝液之實例，包含選自由下列所組成之群組中之一或多者的緩衝液：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、二乙基巴比妥酸、乙酸鈉、TAPS(參(羥甲基)甲胺基)丙烷磺酸酯)、Bicine(2-雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸鹽)、Tris(參(羥基甲基)銨基甲烷、Tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基甘胺酸)、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 111100785-A0305-02-0017-12
乙磺酸鹽)、TES(2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]甲磺酸鹽)及PIPES(哌
Figure 111100785-A0305-02-0017-9
-N,N’-雙(2-乙磺酸鹽))，但不限於此。
此外，清洗及溶脹可重複一次或兩次。清洗及溶脹完成時，可移除清洗液。
步驟(e)為粉碎經清洗及溶脹之水凝膠的步驟，此粉碎可藉由各種粉碎方法進行，但較佳係擠出粉 碎。
作為另一態樣，於步驟(e)之後所製備之交聯的水凝膠填充物可通過滅菌及/或消泡等程序，以及其可大量地於適當的容器(例如，預填充之注射器)中填充、密封及滅菌。
[發明的實施模式]
以下，為了協助理解本發明，將以實例詳細說明。然而，以下實例僅欲闡明本發明內容，但本發明之範圍不受以下實例限制。提供本發明之實例以對熟習本領域之人士更完整地解釋本發明。
[實施例] 實施例1-1：根據本發明之以甘露醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之製備(1)
為了製備根據本發明之以甘露醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠，進行以下程序。
具體而言，分別秤重具有重量平均分子量為3百萬Da之玻尿酸鈉鹽、氫氧化鈉、作為交聯劑之BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙基醚)、及甘露醇。
秤重1g玻尿酸，及秤重以玻尿酸重量為基準計為10mol%之甘露醇，然後將彼等置於混合機容器中且使之混合。將濃度為0.25N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液添加至另一容器(50mL管)以使總反應濃度以玻尿酸重量為 基準計為10%(w/w)，以及添加以玻尿酸重量為基準計為100mol%之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)且使之混合。將容器中所容納的混合物加至已含有混合的玻尿酸和甘露醇之混合機容器中，且使用混合機使之混合，然後將混合機容器置於恆溫水浴，且在維持50℃的情況下歷時2小時以完成交聯。然後，將完成反應之後所獲得之交聯的玻尿酸水凝膠粗切成一定大小，且使用緩衝液(藉由在裝有注射用水之500ml瓶容器中溶解1.26g/L磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)、0.46g/L磷酸二氫鈉水合物(一水合物)、7g/L氯化鈉、及3g/L利多卡因鹽酸鹽而製備之緩衝液)清洗及溶脹6次，每次1小時。在粉碎已完成清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠之後，將其移至250ml瓶容器且測量重量，添加緩衝液以使凝膠重量達到目標重量，由此進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠從250ml瓶容器擠出且使用篩網粉碎。然後，將經粉碎之玻尿酸水凝膠移至250ml瓶容器且均質化，然後測量含量並添加緩衝液，由此進行第二次含量校正。藉由在121℃或更高之溫度的熱處理對已完成含量校正之玻尿酸水凝膠滅菌歷時10分鐘或更久以製備根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠。
實施例1-2：根據本發明之以甘露醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之製備(2)
為了製備根據本發明之以甘露醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠，進行以下程序。
具體而言，分別秤重具有重量平均分子量為3百萬Da之玻尿酸鈉鹽、氫氧化鈉、作為交聯劑之BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙基醚)、及甘露醇。
秤重2g玻尿酸，及秤重以玻尿酸重量為基準計為10mol%之甘露醇，然後將彼等置於混合機容器中且使之混合。將濃度為0.25N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液添加至另一容器(50mL管)以使總反應濃度以玻尿酸重量為基準計為15%(w/w)，以及添加以玻尿酸重量為基準計為5mol%之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)且使之混合。將容器中所容納的混合物加至已含有混合的玻尿酸和甘露醇之混合機容器中，且使用混合機使之混合，然後將混合機容器置於恆溫水浴，且在維持30℃的情況下歷時19小時，以完成交聯。然後，將完成反應之後所獲得之交聯的玻尿酸水凝膠粗切成一定大小，且使用緩衝液(藉由在裝有注射用水之500ml瓶容器中溶解1.26g/L磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)、0.46g/L磷酸二氫鈉水合物(一水合物)、7g/L氯化鈉、及3g/L利多卡因鹽酸鹽而製備之緩衝液)清洗及溶脹一次2小時以及二次1小時。在粉碎已完成清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠之後，將其移至150ml瓶容器且測量重量，添加緩衝液以使凝膠重量達到目標重量，由此進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠從150ml瓶容器擠出且使用篩網粉碎。然後，將經粉碎之玻尿酸水凝膠移至150ml瓶容器且均質化，然後測量含量並添加緩衝液，由此進行第二次含量校正。藉由在121℃ 或更高之溫度的熱處理對已完成含量校正之玻尿酸水凝膠滅菌歷時10分鐘或更久以製備根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠。
實施例2：根據本發明之以山梨醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之製備
為了製備根據本發明之以山梨醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠，進行以下程序。
具體而言，分別秤重具有重量平均分子量為3百萬Da之玻尿酸鈉鹽、氫氧化鈉、作為交聯劑之BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙基醚)、及山梨醇。
秤重2g玻尿酸，及秤重以玻尿酸重量為基準計為10mol%之山梨醇，然後將彼等置於混合機容器中且使之混合。將濃度為0.25N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液添加至另一容器(50mL管)以使總反應濃度以玻尿酸重量為基準計為15%(w/w)，以及添加以玻尿酸重量為基準計為5mol%之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)且使之混合。將容器中所容納的混合物加至已有混合的玻尿酸和山梨醇之混合機容器中，且使用混合機使之混合，然後將混合機容器置於恆溫水浴，且在維持30℃的情況下歷時19小時以完成交聯。然後，將完成反應之後所獲得之交聯的玻尿酸水凝膠粗切成一定大小，且使用緩衝液(藉由在裝有注射用水之500ml瓶容器中溶解1.26g/L磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)、0.46g/L磷酸二氫鈉水合物(一水合物)、7g/L氯 化鈉、及3g/L利多卡因鹽酸鹽而製備之緩衝液)清洗及溶脹一次2小時以及二次1小時。在粉碎已完成清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠之後，將其移至150ml瓶容器且測量重量，添加緩衝液以使凝膠重量達到目標重量，由此進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠從150ml瓶容器擠出且使用篩網粉碎。然後，將經粉碎之玻尿酸水凝膠移至150ml瓶容器且均質化，然後測量含量並添加緩衝液，由此進行第二次含量校正。藉由在121℃或更高之溫度的熱處理對已完成含量校正之玻尿酸水凝膠滅菌歷時10分鐘或更久以製備根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠。
實施例3：根據本發明之以木糖醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之製備
為了製備根據本發明之以木糖醇和交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠，進行以下程序。
具體而言，分別秤重具有重量平均分子量為3百萬Da之玻尿酸鈉鹽、氫氧化鈉、作為交聯劑之BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙基醚)、及木糖醇。
秤重2g玻尿酸，及秤重以玻尿酸重量為基準計為10mol%之木糖醇，然後將彼等置於混合機容器中且使之混合。將濃度為0.25N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液添加至另一容器(50mL管)以使總反應濃度以玻尿酸重量為基準計為15%(w/w)，以及添加以玻尿酸重量為基準計為5 mol%之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)且使之混合。將容器中所容納的混合物加至已有混合的玻尿酸和木糖醇之混合機容器中，且使用混合機使之混合，然後將混合機容器置於恆溫水浴，且在維持30℃的情況下歷時19小時以完成交聯。然後，將完成反應之後所獲得之交聯的玻尿酸水凝膠粗切成一定大小，且使用緩衝液(藉由在裝有注射用水之500ml瓶容器中溶解1.26g/L磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)、0.46g/L磷酸二氫鈉水合物(一水合物)、7g/L氯化鈉、及3g/L利多卡因鹽酸鹽而製備之緩衝液)清洗及溶脹一次2小時以及二次1小時。在粉碎已完成清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠之後，將其移至150ml瓶容器且測量重量，添加緩衝液以使凝膠重量達到目標重量，由此進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠從150ml瓶容器擠出且使用篩網粉碎。然後，將經粉碎之玻尿酸水凝膠移至150ml瓶容器且均質化，然後測量含量並添加緩衝液，由此進行第二次含量校正。藉由在121℃或更高之溫度的熱處理對已完成含量校正之玻尿酸水凝膠滅菌歷時10分鐘或更久以製備根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠。
比較例1：根據慣用方法之以交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠之製備
為了製備根據慣用方法之以交聯劑交聯之交聯的玻尿酸水凝膠，進行以下程序。
具體而言，分別秤重具有重量平均分子量為3百萬Da之玻尿酸鈉鹽、氫氧化鈉、及作為交聯劑之BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙基醚)。
秤重2g玻尿酸，且將濃度為0.25N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液添加至另一容器(50mL管)以使總反應濃度以玻尿酸重量為基準計為15%(w/w)，以及添加以玻尿酸重量為基準計為5mol%之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)且使之混合。將容器中所容納的混合物加至已有玻尿酸之混合機容器且使用混合機使之混合，然後將混合機容器置於恆溫水浴，且在維持30℃的情況下歷時19小時以完成交聯。然後，將完成反應之後所獲得之交聯的玻尿酸水凝膠粗切成一定大小，且使用緩衝液(藉由在裝有注射用水之500ml瓶容器中溶解1.26g/L磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)、0.46g/L磷酸二氫鈉水合物(一水合物)、7g/L氯化鈉、及3g/L利多卡因鹽酸鹽而製備之緩衝液)清洗及溶脹一次2小時以及二次1小時。在粉碎已完成清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠之後，將其移至150ml瓶容器且測量重量，添加緩衝液以使凝膠重量達到目標重量，由此進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠從150ml瓶容器擠出且使用篩網粉碎。然後，將經粉碎之玻尿酸水凝膠移至150ml瓶容器且均質化，然後測量含量並添加緩衝液，由此進行第二次含量校正。藉由在121℃或更高之溫度的熱處理對已完成含量校正之玻尿酸水凝膠滅菌歷時10分鐘或更久以製備根據本發明之交聯的玻尿酸 水凝膠。
比較例2、3、4、5、6及7
將市售的皮膚填充物A、B、C、D、E及F分別作為比較例2至7進行試驗。
[比較例2-7之填充物]
A：Juvederm voluma lidocaine,Allergan
B：Restylane lidocaine,Galderma
C：YVOIRE volume s,LG Chem
D：Ellanse,Sinclair
E：Cleviel,Pharma Research Products
F：YVOIRE classic plus,LG Chem
實驗例1：根據本發明製備之交聯的玻尿酸水凝膠之黏彈性質的研究
為了研究所製備實施例1-2、2及3以及比較例1之流變性質，使用流變計分析該等實施例及比較例。分析條件如下。
<分析條件>
振盪及旋轉流變計(Oscillatory and Rotational Rheometer)之分析條件
複數黏度(complex viscosity)(η*)試驗之情況
(1)試驗設備：流變計(Anton Paar Ltd.,MCR301)
(2)頻率：1Hz
(3)溫度：25℃
(4)應變：4%
(5)測量幾何(Measuring geometry)：25mm板
(9)測量間隙：1.0mm
分析結果顯示於表1。
Figure 111100785-A0305-02-0026-3
從各樣本之複數黏度分析的結果確認，實施例1-2、2及3(其為使用為糖醇(甘露醇、山梨醇及木糖醇)所製備之交聯的玻尿酸水凝膠)之複數黏度高於僅使用交聯劑所製備之比較例1。
實驗例2-1：活體外抗酶性研究(1)
將交聯的玻尿酸(HA)水凝膠注射至體內時，此交聯的玻尿酸水凝膠經歷玻尿酸酶之直接分解攻擊而被分解。藉由將玻尿酸酶直接注入樣本，可檢查降解傾向以及測量對酶之抗性。具體而言，抗酶性試驗係根據以下方法使用流變計在原位進行。
分別粉碎藉由實施例1-2、2及3所製備之交 聯的玻尿酸水凝膠以及比較例1之交聯的玻尿酸水凝膠之後，進行最終滅菌，秤取1g經滅菌樣本至50mL管中，然後添加200uL玻尿酸酶(製備成500單位/mL)且使之混合。將與酶混合之樣本載於流變計上且將溫度設為37℃，然後即時測量樣本之複數黏度。抗玻尿酸酶性愈高，則與複數黏度之初始值相比的複數黏度之殘留率愈高。其意味著複數黏度之殘留率愈高，則對酶之抗性愈高。根據測量結果，計算%50 Hase(分鐘)，結果顯示於表2。%50 Hase(分鐘)意味著交聯的玻尿酸水凝膠之複數黏度因酶分解而降至其初始物理性質的50%所耗費之時間。換言之，其意味著%50 Hase(分鐘)之值愈高，則交聯的玻尿酸水凝膠之抗性愈高。
Figure 111100785-A0305-02-0027-4
如表2中所確認，實施例1至3之根據本發明的包含糖醇之交聯的玻尿酸水凝膠之%50 Hase(分鐘)分別為42分鐘、45分鐘及41分鐘，而比較例1之藉由慣用方法製備之交聯的玻尿酸水凝膠顯示%50 Hase(分鐘)為33分鐘，由此確認根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠顯示相對高之抗酶性。
實驗例2-2：活體外抗酶性研究(2)
抗酶性試驗係根據以下方法使用流變計在原位進行。
分別粉碎藉由實施例1-1所製備之交聯的玻尿酸水凝膠以及比較例2至4之交聯的玻尿酸水凝膠之後，進行最終滅菌，秤取1g經滅菌樣本至50mL管中，然後添加10uL玻尿酸酶(製備成500單位/mL)且使之混合。將與酶混合之樣本載於流變計上且將溫度設為37℃，然後即時測量樣本之複數黏度。根據測量結果，計算%50 Hase(分鐘)，結果顯示於圖1。
如圖1中確認，實施例1-1之根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠之%50 Hase(分鐘)為約32分鐘，而比較例2至4之藉由慣用方法製備之交聯的玻尿酸水凝膠分別顯示%50 Hase(分鐘)為10、4及6分鐘，由此確認根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠顯示三倍或更高倍數之抗酶性。
實驗例3-1：活體外抗自由基性研究(1)
為了測量藉由實施例1-1所製備之交聯的玻尿酸水凝膠以及比較例2至4之交聯的玻尿酸水凝膠對於過氧基自由基所誘發之降解的抗性，與抗酶性實驗相同，藉由以下方法使用流變計即時測量。
秤取1g經滅菌樣本至50mL管中之後，添加1莫耳過氧化氫(H2O2)(10uL)及1莫耳抗壞血酸(10uL)且使之混合。將混合樣本載於流變計上且將溫度設為37℃，然 後即時測量樣本之複數黏度歷時6小時。從結果計算%50 H2O2(分鐘)且顯示於圖2。%50 H2O2(分鐘)意味著交聯的玻尿酸水凝膠之複數黏度因反應性氧物種(自由基)所造成之分解而降至其初始物理性質(複數黏度)的50%所耗費之時間。換言之，其意味著%50 H2O2(分鐘)之值愈高，則交聯的玻尿酸水凝膠對於反應性氧物種(自由基)之抗性愈高。
如圖2中確認，實施例1之根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠之%50 H2O2(分鐘)為約32分鐘，而比較例2至4之市售交聯的玻尿酸水凝膠顯示之%50 H2O2(分鐘)分別為5、7.5及18分鐘，由此確認根據本發明之實施例1-1之交聯的玻尿酸水凝膠顯示三倍或更高倍數之抗自由基性。
實驗例3-2：活體外抗自由基性研究(2)
為了測量藉由實施例1-2、2及3所製備之包含糖醇之交聯的玻尿酸水凝膠以及比較例1之交聯的玻尿酸水凝膠對於過氧基自由基所誘發之降解的抗性，與抗酶性實驗相同，藉由以下方法使用流變計即時測量。
秤取1g經滅菌樣本至50mL管中之後，添加1莫耳過氧化氫(H2O2)(10uL)及1莫耳抗壞血酸(10uL)且使之混合。將混合樣本載於流變計上且將溫度設為37℃，然後即時測量樣本之複數黏度歷時6小時。從結果計算%50 H2O2(分鐘)且顯示於表3。%50 H2O2(分鐘)意味著交聯的玻尿酸水凝膠之複數黏度因反應性氧物種(自由基)所造成 之分解而降至其初始物理性質(複數黏度)的50%所耗費之時間。換言之，其意味著%50 H2O2(分鐘)之值愈高，則交聯的玻尿酸水凝膠對於反應性氧物種(自由基)之抗性愈高。
Figure 111100785-A0305-02-0030-5
如表3中確認，實施例1-2、2及3之根據本發明的包含糖醇之交聯的玻尿酸水凝膠之%50 H2O2(分鐘)分別為16.5分鐘、18.4分鐘及17.6分鐘，而比較例1之藉由慣用方法製備之交聯的玻尿酸水凝膠顯示%50 H2O2(分鐘)為14.6分鐘，由此確認根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠顯示相對高之抗自由基性。
實驗例4：活體外耐熱性研究
將藉由實施例1-1所製備之交聯的玻尿酸水凝膠以及比較例2至4之交聯的玻尿酸水凝膠儲存在嚴苛條件(55℃±2℃，75% RH±5% RH)下歷時4小時，使用流變計測量於0.02Hz之複數黏度，以及計算複數黏度之殘留率(%)，結果顯示於圖3(單位：cP)。複數黏度殘留率(%)表示現時之複數黏度相對於初始複數黏度的比率，其意味著 該值愈大，則物理性質(複數黏度)之穩定性愈佳。
如圖3顯示，於根據本發明之實施例1-1之交聯的玻尿酸水凝膠中，與比較例1至3之交聯的玻尿酸相比，保有(維持)約93%或更高之複數黏度的殘留率，然而比較例2至4顯示低的複數黏度殘留率，因此可確認根據本發明之交聯的玻尿酸水凝膠顯示極優異之對於熱的穩定性。
實驗例5：活體內生物相容性研究
為了確認藉由實施例1-1所製備之交聯的玻尿酸水凝膠以及比較例5至7之交聯的玻尿酸水凝膠的生物相容性，進行如下試驗。
使用雄兔((紐西蘭白兔，Orient Bio)，皮下投與0.3mL之樣本(每組6隻兔)，4週之後進行組織病理檢查。根據ISO10993-6附件E(植入後之局部生物效應的評估之實例)進行實驗。以刺激指數來評估皮膚反應之結果。刺激指數為將物質投與動物時該物質之組織反應的評估值，且意味著該值愈高則生物相容性愈低，0.0~2.9評估為無刺激性，3.0~8.9評估為稍微刺激，9.0~15.0評估為中等刺激，以及>15.0評估為嚴重刺激，結果顯示於圖4。如圖4所示，比較例5及6之刺激指數分別為約18及8，然而實施例1之刺激指數顯示刺激指數值為約5，因此與市售改善皺紋之填充物相比，其展現低或相似水準，因而可確認其展現作為待注射至體內之填充物的適當生物相容性。

Claims (19)

  1. 一種交聯的玻尿酸水凝膠，其包含玻尿酸或其鹽、交聯劑以及多元醇，其中該玻尿酸或其鹽係以該交聯劑和多元醇交聯，其中該交聯劑為選自由下列所組成之群組中之一或多者：內源性多胺(endogenous polyamine)、醛、碳二醯亞胺、二乙烯碸(divinylsulfone)、丁二醇二環氧丙基醚(1,4-丁二醇二環氧丙基醚：BDDE)、乙二醇二環氧丙基醚(EGDGE)、己二醇二環氧丙基醚(1,6-己二醇二環氧丙基醚)、丙二醇二環氧丙基醚、聚丙二醇二環氧丙基醚、聚伸丁二醇二環氧丙基醚、新戊二醇二環氧丙基醚、聚甘油聚環氧丙基醚、二甘油聚環氧丙基醚、甘油聚環氧丙基醚、三甲基丙烷聚環氧丙基醚(tri-methylpropane polyglycidyl ether)、雙環氧基丙氧基乙烷(bisepoxypropoxy ethylene)(1,2-(雙(2,3-環氧基丙氧基)乙烷(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene))、新戊四醇聚環氧丙基醚及山梨醇聚環氧丙基醚，及其中該多元醇為選自由下列所組成之群組中之一或多者：甘油、1,3-丙二醇(1,3-propanediol)、異戊二醇、戊二醇、己二醇、乙二醇、1,2-丙二醇(propylene glycol)、丁二醇、二乙二醇、二丙二醇、二甘油、赤藻糖醇、***糖醇(arabitol)、側金盞花醇(adonitol)、山梨醇、甘露醇、木糖醇、甜醇(dulcitol)、葡萄糖、果糖、木糖、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖及磷酸甲基葡萄糖苷(methylglucoside phosphate)。
  2. 如請求項1之交聯的玻尿酸水凝膠，其中該玻尿酸之鹽係選自由下列所組成之群組：玻尿酸鈉、玻尿酸鉀、玻尿酸鈣、玻尿酸鎂、玻尿酸鋅、玻尿酸鈷及玻尿酸四丁基銨(tetrabutylammonium hyaluronate)。
  3. 如請求項1之交聯的玻尿酸水凝膠，其中平均分子量為1,000,000至4,000,000Da之玻尿酸或其鹽被交聯。
  4. 如請求項1之交聯的玻尿酸水凝膠，其具有0.1至100之修飾度。
  5. 如請求項1之交聯的玻尿酸水凝膠，其包含以該交聯的玻尿酸水凝膠之總重為基準計，總共10mg/g至35mg/g之玻尿酸。
  6. 一種用於製備如請求項1至5中任一項之交聯的玻尿酸水凝膠之方法，其包含(i)將玻尿酸或其鹽與多元醇混合；以及(ii)將交聯劑和鹼水溶液之混合溶液添加至該玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物且使之反應。
  7. 如請求項6之製備方法，其中以該玻尿酸或其鹽為基準計，該多元醇之濃度為5至100mol%。
  8. 如請求項6之製備方法，其中以該玻尿酸或其鹽為基準計，該交聯劑之濃度為5至100mol%。
  9. 如請求項6之製備方法，其中以該玻尿酸重量為基準計，總反應濃度為5至30%(w/w)。
  10. 如請求項6之製備方法，其中該鹼水溶液之濃度為0.1至0.5N。
  11. 如請求項6之製備方法，其中該鹼水溶液為NaOH、KOH、NaHCO3、LiOH或其組合。
  12. 一種填充物，其包含如請求項1至5中任一項之交聯的玻尿酸水凝膠。
  13. 如請求項12之填充物，其中該填充物係用於皮膚注射。
  14. 如請求項12之填充物，其中該填充物係用於改善皺紋、軟組織修復或體積增大、或輪廓矯正。
  15. 如請求項12之填充物，其進一步包含麻醉劑。
  16. 如請求項15之填充物，其中該麻醉劑係選自由下列所組成之群組：胺布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米卡因(amylocaine)、苯諾西納(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、貝托卡因(betoxycaine)、二苯胺明(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、布坦本(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、布特撒明(butethamine)、丁氧卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、古柯乙烯(cocaethylene)、***(***e)、環甲卡因(cyclomethycaine)、待布卡因(dibucaine)、二甲異喹(dimethysoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、狄珀洛東(diperodon)、地環奈 (dicyclonine)、艾克定(ecgonidine)、艾克寧(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、β-優卡因(beta-eucaine)、尤普羅辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、己卡因(hexylcaine)、羥丁卡因(hydroxytetracaine)、對胺基苯甲酸異丁酯、亮胺卡因甲磺酸鹽(leucinocaine mesylate)、左沙屈爾(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、美普利兒卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷(methyl chloride)、麥替卡因(myrtecaine)、納帕因(naepaine)、安妥卡因(octacaine)、鄰卡因(orthocaine)、息痛佳音(oxethazaine)、對乙氧卡因(parethoxycaine)、芬那卡因(phenacaine)、酚、匹派魯卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普拉莫星(pramoxine)、必洛卡因(prilocaine)、普魯卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、普洛拍拉卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假***(psuedo***e)、吡咯卡因(pyrrocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、鄰羥苯甲醇、特他卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉明(zolamine)、及其鹽。
  17. 如請求項12之填充物，其進一步包含緩衝液及等滲壓劑(isotonic agent)。
  18. 一種用於製備如請求項12之填充物之方 法，其包含下列步驟：(a)將玻尿酸或其鹽與多元醇混合；(b)將交聯劑和鹼水溶液之混合溶液添加至該玻尿酸或其鹽和多元醇之混合物且使之反應以製備交聯的玻尿酸水凝膠；(c)將於步驟(b)中所製備之該玻尿酸水凝膠粗切；(d)使用緩衝液清洗及溶脹(swelling)於步驟(c)中所製備之經粗切的該玻尿酸水凝膠；以及(e)將於步驟(d)中之經清洗且溶脹的該玻尿酸水凝膠粉碎。
  19. 一種預填充之注射器，其填充有如請求項12之填充物。
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