TWI790214B - 魚皮膠原蛋白肽組成物及其作為藥劑之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於具有胺基酸譜(aminogram)之肽組成物，其中： 　　- 甘胺酸、羥基脯胺酸及脯胺酸具有之莫耳量使得各量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比分別介於20.0%與24.5%之間、介於6.0%與12.0%之間及介於10.6%與14.6%之間； 　　- 該肽組成物包含具有分子量少於1400 Da之肽量，使得此量對該組成物中的肽量之比少於40%； 在該組成物中的肽之分子量及量係以排阻層析術測定。本發明亦關於此組成物作為藥劑之用途。本發明亦關於此組成物作為食物補充品之用途。

Description

魚皮膠原蛋白肽組成物及其作為藥劑之用途
本發明關於來自魚皮的膠原蛋白肽之組成物。本發明特別關於藉由魚皮膠原蛋白之酵素水解所獲得的此等肽組成物。本發明亦關於此等組成物作為藥劑之用途。本發明因此關於此等組成物用於治癒性或預防性治療影響人體或動物體的病變之用途。本發明特別關於此等組成物作為治療人類或動物之消化系念珠菌症(candidiasis)及/或治療人類或動物之腸內發炎的藥劑之用途。本發明亦關於此等組成物作為治療刺激微生物相的藥劑之用途。
FR 2 720 067揭示藉由源自於魚、軟體動物或甲殼類動物的皮或骨骼之膠原蛋白富含原料經木瓜酵素媒介之水解所獲得的肽粉末。在所獲得的肽粉末中，38%之肽具有介於10000 Da與50000 Da之間的分子量。FR 2 720 067之肽組成物具有寬廣的分子量範圍，特別大於10%比例之肽的分子量大於10000 Da。FR 2 720 067之肽組成物就肽的大小方面為異質的且具有僅介於80%與90%之間的水溶性肽分率。大於10000 Da的此類高分子量肽粉末不全為水溶性。彼等又不完全被消化道吸收且因此具有彼等生物利用率的問題。 　　FR 2 720 067亦說明自活在深海的魚所獲得的此等肽粉末於治癒性治療賽馬的下肢關節(膝、球節和蹄)肌腱發炎之用途。獲得此等組成物是有難度的。特定言之，其需要收集深海魚。另外，此等粉末之用途受限在關節發炎之治療。
本發明因此旨在克服該等缺點。 　　本發明旨在提出以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生之新穎肽組成物，該肽為水溶性(亦即100%水溶性)且完全被消化道吸收。 　　本發明亦旨在提出以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所形成之新穎肽組成物。 　　本發明亦旨在提出可用作為藥劑之此種肽組成物。 　　本發明特別旨在提出以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生之此種肽組成物，其可用作為藥劑。 　　本發明旨在提出同時具有在其之肽介於約100與數千道耳頓之間的窄範圍擴展之視分子量分布(亦即排除高視分子量的肽)及亦具有低比例之低視分子量的肽之此種肽組成物。 　　本發明旨在提出此種肽組成物，其可用作為治療腸內念珠菌症的藥劑。 　　本發明亦旨在提出此種肽組成物，其可用作為治療消化發炎疾病(尤其為慢性發炎性腸病(CIBD))的藥劑。 　　本發明亦旨在提出此種肽組成物，其可用於促進腸內菌叢(或微生物相)平衡且維持。 　　本發明亦旨在提出以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生之此種肽組成物作為食物補充品之用途。 　　為此，本發明關於具有胺基酸譜之肽組成物，其中： 　　- 甘胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於20.0%與24.5%之間； 　　- 羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於6.0%與12.0%之間，尤其為介於7.0%與11.0%之間； 　　- 脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於10.6%與14.6%之間，尤其為介於11.6%與13.6%之間，特別為介於12.1%與13.1%之間，較佳為約12.6%；肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有肽之溶離曲線(亦即層析圖之溶離曲線)，該曲線具有在對應於具有視分子量少於1400 Da之肽的曲線下之面積值(亦即代表肽的質量之面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比少於40%，尤其少於38%，較佳為介於30%與38%之間，特別為介於30%與35%之間； 　　該分析係如下文所述方式執行： 　　○ 在300×7.8毫米尺寸的過濾管柱上，其包含以具有5微米(μm)孔隙度之矽膠所形成的靜止相； 　　○ 管柱維持在溫度40℃； 　　○ 以(A)包含0.1體積%之三氟乙酸的超純水及(B)乙腈所形成的溶液作為移動相，其中體積比A/B為75/25； 　　○ 將一體積之包含肽組成物之溶液引入凝膠過濾管柱之頂端； 　　○ 在管柱中的移動相之流速為0.6毫升/分鐘；且 　　○ 組成物之肽係以在214奈米(nm)波長之吸收率檢測。 　　在整個本文中，術語〝胺基酸譜〞意指以肽連結(或鍵結)形成肽序列或肽混合物之肽序列的游離胺基酸列表。此胺基酸譜係藉由分析(尤其以整體分析或序列分析)肽或肽混合物的成分胺基酸而獲得。 　　根據本發明的組成物之肽的成分胺基酸之本性及量特別經由那些熟習本技術領域者本身已知的任何整體分析來測定。此分析特別依照ISO 13903:2005來執行，其係藉由使用胺基酸分析儀或使用高性能液相層析術(HPLC)設備檢定游離及總胺基酸。羥基脯胺酸係藉由連續流動分析及比色檢測來檢定。 　　以根據本發明的組成物之整體分析所獲得的胺基酸譜代表來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之胺基酸組成物。本發明因此關於以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白經植物來源的半胱胺酸蛋白酶(尤其為類別EC 3.4.22.2的蛋白酶)之酵素水解所衍生之此等肽組成物。本發明者發現使用此等半胱胺酸蛋白酶有可能獲得水溶性(亦即100%水溶性)且完全被消化道吸收，且具有在介於約100與數千道耳頓之間的窄範圍擴展之視分子量分布(亦即排除高視分子量的肽)及亦具有低比例之低視分子量的肽之此等肽組成物。 　　另外，根據本發明的肽組成物之肽以彼等的視分子量為函數之分離係藉由使肽組成物經歷在矽膠過濾管柱(BioSep-SEC-S2000，Phenomenex, Le Peck, France)上的液相層析術之分析分離步驟來執行，該管柱為多孔且具有高表面密度的矽醇基團。 　　所使用的移動相為包含(A)補充有三氟乙酸(0.1體積%)之超純水及(B)乙腈(A/B：75/25 v/v)之溶液。凝膠過濾管柱在分析期間維持在40℃之溫度。在靜止相中的移動相之流速為0.6毫升/分鐘。引入凝膠過濾管柱之頂端的欲分析之肽組成物的體積為25微升且以214奈米波長之吸收率連續執行檢測。獲得層析圖，該圖上的各峰係以峰的最大吸收值處所測定之持續時間值或滯留時間(在欲分析之混合物引入管柱之頂端後以分鐘表示的時間)特徵化。對應於各峰的最大吸收值處之此滯留時間值的各肽之視分子量係藉助於預定的校準曲線測定，該曲線係藉由在與上述相同的層析條件下分析確定的視分子量之肽而獲得。例如，此校準曲線係藉由在該等相同的層析條件下分析已知視分子量介於100 Da與30 kDa之間的肽/蛋白質之參考混合物而產生。 　　因為層析圖代表在根據本發明的肽組成物之層析分析過程中在214奈米之吸收率變化，所以具有視分子量少於1400 Da之肽的比例係藉由評估在對應於具有視分子量少於1400 Da之肽的曲線下擴展之面積值(亦即在峰的曲線下擴展之面積值總和)對在整個曲線下擴展且對應於肽組成物之所有肽的總面積值(亦即在各峰的曲線下擴展之面積總和)之比來測定。 　　本發明因此關於以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白經植物來源之半胱胺酸蛋白酶酵素水解所衍生之肽組成物，組成物之各肽具有介於2與幾十個之間的胺基酸數量，較佳為介於2個胺基酸與100個胺基酸之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中甘胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於20.0%與22.4%之間，尤其為介於20.0%與21.9%之間，特別為介於20.4%與21.4%之間。 　　在特定的其他實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中甘胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於22.4%與24.9%之間，尤其為介於22.9%與24.4%之間，特別為介於23.0%與24.0%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於7.0%與9.0%之間，特別為介於7.5%與8.5%之間，較佳為介於7.7%與8.5%之間。 　　在特定的其他實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於9.5%與11.5%之間，特別為介於10.0%與11.0%之間，較佳為約10.5%。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中麩胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於8.0%與13.0%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中麩胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於8.0%與10.0%之間，特別為介於8.5%與9.5%之間，較佳為介於9.0%與9.5%之間。 　　在特定的其他實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中麩胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於10.5%與12.5%之間，特別為介於11.0%與12.0%之間，較佳為約11.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中精胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於6.9%與10.9%之間，尤其為介於7.9%與9.9%之間，特別為介於8.0%與9.0%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中丙胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於7.3%與11.5%之間，尤其為介於8.0%與10.0%之間，特別為介於8.1%與9.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中天冬胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於3.1%與7.1%之間，尤其為介於4.1%與6.1%之間，特別為介於4.6%與5.6%之間，較佳為介於5.0%與5.5%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中離胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於1.5%與5.5%之間，尤其為介於2.5%與4.5%之間，特別為介於3.0%與4.0%之間，較佳為介於3.1%與3.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中絲胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於1.5%與5.5%之間，尤其為介於2.5%與4.5%之間，特別為介於3.0%與4.0%之間，較佳為介於3.2%與3.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中蘇胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0.7%與4.7%之間，尤其為介於1.7%與3.7%之間，特別為介於2.2%與3.2%之間，較佳為介於2.4%與2.8%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中白胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0.6%與4.6%之間，尤其為介於1.6%與3.6%之間，特別為介於2.1%與3.1%之間，較佳為介於2.4%與2.9%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中苯基丙胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0.3%與4.3%之間，尤其為介於1.3%與3.3%之間，特別為介於1.8%與2.8%之間，較佳為介於1.8%與2.4%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中纈胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與4.0%之間，尤其為介於1.0%與3.0%之間，特別為介於1.5%與2.5%之間，較佳為介於1.8%與2.5%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中異白胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與3.5%之間，尤其為介於0.5%與2.5%之間，特別為介於0.9%與2.0%之間，較佳為介於0.9%與1.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中羥基離胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與3.5%之間，尤其為介於0.5%與2.5%之間，特別為介於1.0%與2.0%之間。較佳為約1.5%。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中組胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與3.3%之間，尤其為介於0%與2.3%之間，特別為介於0.5%與1.5%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中甲硫胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與2.5%之間，尤其為介於0%與2.0%之間，特別為介於0.5%與1.8%之間，較佳為介於0.7%與1.6%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中酪胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與1.5%之間，尤其為介於0%與1.0%之間，特別為介於0%與0.9%之間，較佳為介於0.2%與0.8%之間。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中半胱胺酸與胱胺酸一起具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於0%與2%之間，尤其為介於0%與1.0%之間，特別為介於0%與0.5%之間，較佳為約0.03%。 　　根據本發明的組成物具有胺基酸譜，其中基本胺基酸(離胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸及組胺酸)一起介於15%與20%之間。 　　在根據本發明特定的實施態樣中，肽組成物之肽中至少90% (尤其為至少95%)有利地具有少於15000 Da (道耳頓)之視分子量，尤其為介於200 Da與15000 Da之間，較佳為介於200 Da與14000 Da之間，特別為介於200 Da與13000 Da之間。在根據本發明特定的實施態樣中，組成物之肽中至少90%有利地具有介於200 Da與12000 Da之間的視分子量。 　　根據本發明的組成物之肽具有在介於約100與幾千道耳頓之間的窄範圍擴展之窄視分子量分布，亦即排除含有超過100個胺基酸的高視分子量之肽)，且亦具有低比例的低視分子量之肽。 　　在根據本發明特定的實施態樣中，組成物之肽有利地具有介於2500 Da與3600 Da之間的平均視分子量值，尤其為介於2700 Da與3600 Da之間。因為根據本發明的肽組成物之各肽在組成物中具有質量分布，所以組成物之肽的平均視分子量值對應於以組成物中的各肽之質量分布的代表值加權之各肽的視分子量之各值(已知為加權值)的平均。在組成物中的各肽或肽族群之質量分布的代表值係以在對應於該肽或該肽族群的曲線下之面積值對在對應於組成物之所有肽的曲線下之總面積值之百分比表示。 　　事實上，對應於層析圖之相同峰的肽族群之加權視分子量值對應於以在此峰之曲線下擴展之面積值對在層析圖曲線下擴展之(總)面積之比相乘的層析圖之此峰的頂點(最大值)記錄之視分子量值。術語〝在曲線下擴展之面積〞或〝在曲線下之面積〞或〝在峰下擴展之面積〞或〝在峰下之面積〞意指在說明層析圖之峰的曲線與層析圖的基準線之間擴展之表面積。在層析圖之峰中之一者下的面積特別在層析圖曲線的頂點(最大值)之兩側的層析圖曲線的兩個最小值之間擴展。 　　根據本發明特定的實施態樣，肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有代表肽溶離之曲線(亦即層析圖)，該曲線具有在對應於具有視分子量大於10000 Da(尤其在介於10000 Da與50000 Da之間)之肽的此曲線下之面積值(亦即代表肽之質量的面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比少於15%，尤其少於10%。根據某些特別的實施態樣，此比係介於2.5%與8.5%之間。 　　根據本發明其他特別的實施態樣，肽組成物可能沒有任何高分子量肽。根據該等其他特別的實施態樣，根據本發明的肽組成物係自水溶性肽所形成。 　　根據本發明特定的實施態樣，肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有代表肽溶離之曲線(亦即層析圖)，該曲線具有在對應於具有視分子量介於1800 Da與10000 Da之間的肽之此曲線下之面積值(亦即代表肽之質量的面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比大於35%，尤其為介於35%與70%之間，特別為介於45%與65%之間。根據某些特別的實施態樣，此比係介於49%與55%之間。 　　根據本發明特定的實施態樣，肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有代表肽溶離之曲線(亦即層析圖)，該曲線具有在對應於具有視分子量介於600 Da與1800 Da之間的肽之此曲線下之面積值(亦即代表肽之質量的面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比介於15%與45%之間，尤其為介於20%與40%之間，特別為介於25%與35%之間。根據某些特別的實施態樣，此比係介於27%與32%之間。 　　根據本發明特定的實施態樣，肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有代表肽溶離之曲線(亦即層析圖)，該曲線具有在對應於具有視分子量少於600 Da之肽的此曲線下之面積值(亦即代表肽之質量的面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比少於10%。根據某些特別的實施態樣，此比係介於8.5%與14.5%之間。 　　根據本發明的組成物有利地於肽組成物之各肽於分析期間以代表其電荷的滯留時間自管柱溶離之陰離子交換管柱之層析術分析上顯示： 　　- 在對應於陰離子性肽的峰下之面積值； 　　- 在對應於中性肽的峰下之面積值；及 　　- 在對應於陽離子性肽的峰下之面積值；使得在對應於該陰離子性肽的峰下之此面積值對在對應於組成物之陰離子性肽、中性肽及陽離子性肽的峰下之面積值總和之比介於27.0%與45%之間，尤其為介於30%與45%之間，特別為介於35%與43%之間，較佳為介於35%與40%之間； 　　在對應於陰離子性肽的峰下之面積值、在對應於陽離子性肽的峰下之面積值及在對應於中性肽的峰下之面積值係以在下文所述之條件下的層析術分析來測定： 　　○ 使用100×7.8毫米(mm)尺寸之層析管柱，其包含以四級銨基團官能化且具有10微米(μm)粒徑之陰離子交換親水性樹脂作為靜止相； 　　○ 使用pH 8.35之5 mM Tris水性緩衝液(C)作為溶離陽離子性肽及中性肽之第一移動相7分鐘時間，此係自將欲分析之組成物引入管柱之頂端開始計，且接著使用溶離陰離子性肽之第二移動相，其中以pH 8.35之5 mM Tris、5 M NaCl所形成的緩衝液(D)之體積對緩衝液(C)之體積之比在30分鐘中自0%線性增加至100%； 　　○ 在管柱中的移動相具有1毫升/分鐘之流速； 　　○ 分析係在25℃之溫度下執行；且 　　○ 在管柱出口以214奈米波長之吸收率檢測。 　　根據本發明，根據本發明的組成物之肽有利地於反相液相層析術之疏水性分析上具有介於16分鐘與36分鐘之間的滯留時間； 　　該疏水性分析係在下列條件下執行： 　　○ 使用250×4.6毫米尺寸的層析管柱，其具有以丁基接枝之二氧化矽所形成的靜止相，二氧化矽具有5微米粒徑值及300Å孔隙度值； 　　○ 使用在超純水中的0.1%三氟乙酸溶液(E)作為溶離親水性肽之第一移動相7分鐘時間，此係自將欲分析之組成物引入管柱頂端開始計，且接著使用溶離疏水性肽之第二移動相，其中在包含40%乙腈之水中的0.1%三氟乙酸溶液(F)之體積對溶液(E)之體積之比在30分鐘中自0%線性增加至40%； 　　○ 在管柱中的移動相具有0.6毫升/分鐘之流速； 　　○ 分析係在40℃之溫度下執行；且 　　○ 在管柱出口以214奈米波長之吸收率檢測。 　　在特定的實施態樣中，根據本發明的組成物包含具有疏水本性之肽，其自上述管柱及在上述指定之條件下以對應於介於12%與38%之間的乙腈百分比之滯留時間溶離。根據本發明的組成物之肽對應於溶離物中的25%之乙腈百分比的中位數滯留時間為26分鐘。 　　根據本發明，肽組成物有利地呈液體形式。其可為根據本發明的肽組成物於液體溶劑中(尤其於水性溶劑中)的溶液。 　　根據本發明，肽組成物有利地呈固體形式。肽組成物可呈分隔形式的固體形式。其可特別地呈至少部分脫水形式的固體。根據本發明的肽組成物可呈粉末形式。 　　根據本發明，肽組成物有利地不含碳水化合物。 　　根據本發明，肽組成物有利地不含脂肪。 　　根據本發明，肽組成物的固體有利地包含大於95%質量比例之膠原蛋白肽，尤其為大於99%。因此，肽組成物具有之膠原蛋白肽量使得肽組成物固體之膠原蛋白肽質量對肽組成物固體質量之比大於95%，尤其為大於99%。 　　根據本發明，組成物之肽有利地呈水溶性。肽組成物之肽有利地於水中呈100%可溶性。肽組成物有利地與水可相容。 　　根據本發明，肽組成物之肽有利地衍生自至少一種選自下列之魚所形成的群組之魚的魚皮膠原蛋白之受控酵素水解：𩷶鯰科(Pangasiidae family)，尤其為低眼巨鯰(Pangasius hypophthalmus 或Pangasianodon hypophthalmus )、扁加秋斯鯊(Pagasius pangasius )、博氏巨鯰(Pangasius bocourti )，以及慈鯛科(Cichlidae family)，尤其為口孵非鯽屬(genus Oreochromis )(特別為尼羅口孵魚(Oreochromis niloticus ))或非鯽屬(genus Tilapia )。肽組成物之肽有利地衍生自至少一種自溫帶地區的溫水捕獲之魚的魚皮膠原蛋白之受控酵素水解。 　　本發明亦延伸至此等肽組成物於治療性治療人體或動物體之用途。本發明因此亦延伸至此等肽組成物作為藥劑之用途。本發明因此延伸至此等肽組成物作為預防性或治癒性治療人體或動物體之至少一種病變的藥劑之用途。 　　本發明亦特別延伸至肽組成物作為下列治療中至少一者的藥劑之用途： 　　- 治療消化病變； 　　- 治療腸內念珠菌症； 　　- 治療消化發炎；及 　　- 維持腸內微生物相。 　　本發明亦延伸至根據本發明的肽組成物於人類營養之任何用途。根據特定的實施態樣，除了作為藥劑之任何用途以外，本發明亦延伸至根據本發明的肽組成物於人類營養之任何用途。根據本發明的組成物特別有利地用作為食物補充品。 　　本發明亦延伸至經由下列方法所獲得的肽組成物，其中： 　　- 選擇溫水魚的魚皮，尤其來自𩷶鯰科及/或來自慈鯛科；且接著 　　- 相繼執行下列步驟： 　　• 至少一個清洗魚皮的步驟，且接著 　　• 至少一個酸或鹼處理魚皮的步驟，該酸或鹼適於能夠至少部分萃取魚皮膠原蛋白；且接著 　　• 至少一個以至少一種植物來源之半胱胺酸蛋白酶(特別為至少一種番木瓜(Carica papaya )蛋白酶)在低於75℃之溫度下水解膠原蛋白的步驟；且接著 　　• 藉由在高於各半胱胺酸蛋白酶之變性溫度的溫度下加熱膠原蛋白水解物而中斷酵素水解，以便形成肽組成物。 　　在根據本發明的方法中，在酸或鹼處理魚皮的步驟之後，有利地執行至少一種液體/固體萃取膠原蛋白至維持在60℃與98℃之間的溫度下之水中。在根據本發明的方法中，接著有利地執行包含固體材料(及脂肪)之萃份及包含經萃取之膠原蛋白的溶液之萃份的分離步驟，尤其以傾析之分離步驟，且接著使包含經萃取之膠原蛋白的溶液經歷適合於形成包含膠原蛋白的經純化之溶液的純化步驟，例如在土(earth)上過濾及/或在離子交換樹脂上去礦質化，經純化之溶液的固體包含至少99%質量比例之膠原蛋白，尤其為至少99.5%，特別為至少99.8%。形成包含實質上純膠原蛋白的經純化之膠原蛋白溶液。特別地形成實質上無色的此等經純化之膠原蛋白溶液。特別地形成實質上(尤其為全部)不含彈性蛋白的此等經純化之膠原蛋白溶液。使經純化之溶液濃縮以形成經純化之膠原蛋白凝膠，且接著使經純化之膠原蛋白凝膠經歷膠原蛋白水解的步驟。 　　此方法使得有可能獲得實質上無色之根據本發明的肽組成物。此方法使得有可能獲得實質上不含彈性蛋白之根據本發明的肽組成物。特別使得有可能不以任何用於純化肽組成物的層析步驟而獲得根據本發明的此等肽組成物。 　　在此方法中，有利地且根據本發明執行過濾肽組成物的後續步驟。亦有利地在最低介於85℃與90℃之間的巴斯德殺菌溫度下執行至少2分鐘時間之肽組成物的巴斯德殺菌步驟。 　　在此方法中，有利地且根據本發明執行乾燥肽組成物的步驟。以霧化(atomization)執行此乾燥步驟以形成實質上脫水且呈粉末形式之根據本發明的組成物。 　　本發明因此延伸至經由下列方法所獲得的肽組成物，其中： 　　- 選擇溫水魚的魚皮-尤其來自𩷶鯰科及/或來自慈鯛科；且接著 　　- 相繼執行下列步驟： 　　• 至少一個清洗魚皮的步驟，且接 　　• 至少一個酸處理魚皮的步驟，該酸適於能夠至少部分萃取魚皮膠原蛋白；且接著 　　• 至少一個以至少一種植物來源之半胱胺酸蛋白酶(特別為至少一種番木瓜蛋白酶)在低於75℃之溫度下水解膠原蛋白的步驟；且接著 　　• 藉由在高於各半胱胺酸蛋白酶之變性溫度的溫度下加熱膠原蛋白水解物而中斷酵素水解，以便形成肽組成物； 　　該肽組成物具有總胺基酸分析，其中： 　　- 甘胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於20.0%與24.5%之間； 　　- 羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於6.0%與12.0%之間； 　　- 脯胺酸具有之莫耳量使得此量對組成物中的胺基酸莫耳量總和之比 係介於10.6%與14.6%之間； 　　肽組成物於其中肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有：肽之溶離曲線(亦即層析圖之溶離曲線或分布)，該曲線具有在對應於具有視分子量少於1400 Da之肽的曲線下之面積值(亦即代表肽之質量的面積值)，使得此面積值對曲線下之總面積(對應於組成物之所有肽)之比少於40%； 　　該分析係如下文所述方式執行： 　　○ 在300×7.8毫米尺寸的過濾管柱上，其包含以具有5微米孔隙度之矽膠所形成的靜止相； 　　○ 管柱維持在40℃之溫度； 　　○ 以(A)包含0.1體積%之三氟乙酸的超純水及(B)乙腈所形成的溶液作為移動相，其中體積比A/B為75/25； 　　○ 將一體積之包含肽組成物之溶液引入凝膠過濾管柱之頂端； 　　○ 在管柱中的移動相之流速為0.6毫升/分鐘；且 　　○ 組成物之肽係以在214奈米波長之吸收率檢測。 　　本發明亦關於肽組成物、此等肽組成物作為藥劑之用途、獲得此等肽組成物之方法及經由此等製造方法所獲得的此等肽組成物，其特徵在於上文或下文所述之全部或一些特徵之組合。
製備根據本發明的組成物之方法 　　收集或購買來自溫帶地區之水域的魚皮，尤其為𩷶鯰科之魚，尤其為低眼巨鯰(Pangasius hypophthalmus 或Pangasianodon hypophthalmus )、扁加秋斯鯊、博氏巨鯰，及/或鯰魚科(catfish family)或慈鯛科之魚，尤其為口孵非鯽屬(特別為尼羅口孵魚)或非鯽屬。 　　相繼執行清洗魚皮、酸處理經清洗之魚皮及萃取且純化膠原蛋白的步驟。接著執行因此獲得的魚皮膠原蛋白之酵素水解的步驟以形成根據本發明的組成物。為此，將水加熱至介於70℃與75℃之間的溫度。將魚皮膠原蛋白質量逐漸引入攪拌的熱水中，使得膠原蛋白在水中的質量比例為45%及將溶液之pH調整至pH 6.0。接著將一數量的植物來源之半胱胺酸蛋白酶添加至熔融之膠原蛋白溶液中。所選擇之半胱胺酸蛋白酶為至少一種來自無水形式的番木瓜之蛋白酶(尤其為lypaine (Lypaine® ，LYVEN, Collombelles, France))。半胱胺酸蛋白酶的質量對膠原蛋白的質量之比係根據所欲水解條件調整。例如，半胱胺酸蛋白酶的質量對膠原蛋白的質量之比為0.2%。溶液的溫度維持在經調整介於65℃與70℃之間的值以促進半胱胺酸蛋白酶之酵素活性及維持膠原蛋白水解物之最適流動性，其係考慮膠原蛋白水解物的黏度隨著水解時間增加而降低的事實。溶液在此溫度下維持約45分鐘的時間。 　　酵素水解反應係藉由在高於半胱胺酸蛋白酶之變性溫度的溫度下加熱膠原蛋白水解物而停止，例如在介於85℃與90℃之間的溫度下20分鐘。魚皮膠原蛋白水解物隨意地經歷過濾步驟且接著在最低介於85℃與90℃之間的巴斯德殺菌溫度下經歷至少2分鐘時間的巴斯德殺菌步驟。 　　膠原蛋白或膠原蛋白肽水解物接著在適合於形成自預定粒徑之粉末所形成之根據本發明的組成物之條件下經歷乾燥步驟。 根據本發明的組成物之肽的結構特徵 胺基酸組成物 　　根據本發明，以來自溫水魚之魚皮的膠原蛋白水解所衍生之肽組成物的特徵化係藉助於胺基酸分析儀或藉助於高性能液相層析術(HPLC)設備依照標準的ISO 13903:2005檢定游離及總胺基酸來執行。出於比較的目的，測定自白令海(阿拉斯加)之深水域捕獲的冷水魚(阿拉斯加鳕魚(Alaska pollock))之魚皮的膠原蛋白水解物之胺基酸組成物。將比較結果呈示於以下表6中。
Figure 02_image001
根據本發明的肽組成物之特徵化亦以肽的視分子量分布、肽的極性及肽的疏水性執行。 分析肽的視分子量 　　根據本發明的組成物之成分肽的視分子量分布係以在300×7.8毫米尺寸之液相層析術管柱上的凝膠滲透來分析，管柱中靜止相係由具有5微米孔隙度的二氧化矽為基底之凝膠(BioSep-SEC-S2000，Phénomenex, Le Peck, France)所構成。將過濾管柱維持在40℃之溫度。移動相係由包含(A)補充有三氟乙酸(0.1體積%)之超純水與(B)乙腈的混合物(A/B：75/25 v/v)所構成。將移動相之流速維持在0.6毫升/分鐘。包含欲分析之肽組成物的溶液之體積為0.25微升(μL)。檢測係在凝膠滲透管柱之出口藉由測量在214奈米波長之吸收率來執行。平行確立校準曲線以測定以滯留時間為函數之視分子量。為了確立此校準曲線，選擇具有分子量介於100 Da與30 kDa之間的已知肽。已知的標準物為分別具有115 Da、307 Da、13.7 kDa及28.2 kDa之視分子量的脯胺酸、麩胱甘肽、核糖核酸酶A及胰蛋白酶。 　　標準物之視分子量及以分鐘表示的滯留時間於下列表1中給出：
Figure 02_image003
肽係以彼等降低的視分子量為函數相繼自管柱溶離。對應於層析圖中之峰的滯留時間值之欲分析之組成物的各肽家族係以層析圖之各峰的頂點記錄，且藉由與校準曲線比較而轉換成視分子量。各肽家族的量之相對值對應於層析圖中之各峰的曲線下之面積值。該等值係以對應於一個肽家族的曲線下之面積值對各肽家族之面積值總和之比表示。 　　對應於圖1所表示的層析圖之各肽家族的滯留時間值(分鐘)、對應之視分子量值(Da)及在曲線下之面積百分比值(以曲線下之總面積百分比表示)於下列的表2中給出。對應於層析圖中之峰的各肽族群係以對應於層析圖之此峰的最大值之視分子量值識別。
Figure 02_image005
根據本發明的組成物(其層析圖顯示於圖1中且其值於表2中給出)中視分子量少於1400 Da之肽的比例為相對於組成物的所有肽之31.2%(983 Da及333 Da之視分子量值)。 　　根據本發明的組成物(其視分子量值於表2中給出)之肽的平均視分子量為3442 Da。組成物之肽的平均視分子量經定義為對應於組成物之對應於層析圖中之相同峰的各肽族群之加權視分子量值的平均。在層析圖中之相同峰的肽族群之加權視分子量值對應於在以對應於峰的曲線下之面積值對層析圖的曲線下之(總)面積之比加權之峰的頂點(最大值)之視分子量值。術語〝在曲線下之面積〞或〝在峰下之面積〞意指在說明層析圖之峰的曲線與層析圖的基準線之間擴展之表面積。在層析圖之峰中之一者下的面積特別在層析圖曲線的頂點(最大值)之兩側的層析圖曲線的兩個最小值之間擴展。 　　概括而言，對應於根據本發明的三種肽組成物之不同分析的各肽家族之滯留時間(分鐘)的平均值、對應的視分子量(Da)的平均值及在曲線下之面積百分比的平均值呈示於下列表3中。
Figure 02_image007
在根據本發明的組成物中之肽(其值在表3所給出及其分子量少於1400 Da)的平均比例為35.2%(基本上對應於983 Da及340 Da之視分子量)。 分析成分肽的極性 　　分析在根據本發明的組成物中之陰離子性肽的比例，該肽的視分子量於表2中給出，亦即在pH 8.35下具有負電荷之肽的比例。亦分析在根據本發明的組成物中之中性及/或陽離子性肽的比例，亦即在pH 8.35下具有整體中性電荷之肽的比例或在pH 8.35下具有正電荷之肽的比例。此分析係以離子交換高性能液相層析術(HPLC)執行，其中靜止相為粒徑10微米之陰離子交換樹脂(Hydrophase HP-SAX，Interchim, Montluçon, France)。離子交換HPLC層析管柱為100×7.8毫米尺寸。 　　離子交換HPLC層析管柱係以在水中的5 mM濃度之參(羥甲基)胺基甲烷(Tris)緩衝液調理，且其pH調整至8.35之值。管柱溫度維持在25℃之溫度。在管柱中的移動相之流速為1毫升/分鐘。製備欲分析之肽組成物的樣品，使得其以超純水稀釋後的濃度為2克/公升。將90微升體積的欲分析之此溶液引入管柱頂端。連續測量在214奈米之吸收率以執行檢測。 　　自樣品引入管柱頂端的時間開始，以pH 8.35之5 mM Tris (溶液A)構成的移動相經7分鐘時間，且接著以其中由pH 8.35之5 mM Tris、5 M NaCl所形成的溶液B於溶液A中自0%線性增加至100%構成之移動相經30分鐘。接著維持以溶液B溶離2分鐘。 　　所獲得的層析圖顯示於圖2中。陰離子性肽係以對應介於0.5 M與1.7 M之間的NaCl濃度之介於10分鐘與17.5分鐘之間的滯留時間離開管柱。在圖2所顯示之分析中，在根據本發明的肽組成物中之陰離子性肽的比例為36.9%。中性及陽離子性肽係以介於1分鐘與8分鐘之間的滯留時間離開管柱。在圖2所顯示之分析中，在根據本發明的肽組成物中之中性及陽陰離子性肽的比例為57.5%。 　　概括而言，以三種根據本發明的肽組成物重現此分析。在根據本發明的該等組成物中之陰離子性肽的平均比例係介於27.9%與42.5%之間，且在根據本發明的該等組成物中之中性及陽陰離子性肽的平均比例係介於57.5%與72.1%之間。 分析成分肽的疏水性 　　根據本發明的組成物之成分肽的疏水性係在以丁基接枝之二氧化矽(Vydac 214TP™ C4 ，Grace, Epernon, France )的250×4.6毫米尺寸管柱上以反相液相層析術分析。二氧化矽之粒徑為5微米且其孔隙度為300Å。 　　管柱係以0.1%三氟乙酸酸化之超純水調理。管柱溫度維持在40℃之溫度。在管柱中的移動相之流速為0.6毫升/分鐘。製備欲分析之肽組成物的樣品，使得其濃度以超純水稀釋為2克/公升。將100微升體積的欲分析之此溶液引入管柱頂端。連續測量在214奈米之吸收率以執行檢測。 　　自樣品引入管柱頂端的時間開始，以酸化水(溶液A)構成的移動相經7分鐘時間，且接著以其中由0.1%(以體積計)三氟乙酸酸化之水及包含40%乙腈所形成的溶液B於溶液A中自0%線性增加至100%構成之移動相經30分鐘。 　　所獲得的層析圖顯示於圖3中。根據本發明的組成物之肽係在對應介於溶離物中的12%與38%之間的乙腈百分比之介於16分鐘與36分鐘之間的滯留時間之後離開管柱。根據本發明的組成物之肽的中位數滯留時間為對應於溶離物中的25%之乙腈百分比的26分鐘。 根據本發明的組成物之生物效應 對以白色念珠菌(Candida albicans )選殖及對消化念珠菌症的效應 　　分析根據本發明的組成物對在8週齡及重量介於20至25克之C57BL/6雌性小鼠中所誘發之消化念珠菌症的效應。該等小鼠係以根據本發明的組成物以4克/公斤/天之比率餵食21天。在第21天，以5×107 個酵母細胞之量強迫餵食各小鼠以誘消化念珠菌症。在誘發後2天(D2)與7天(D7)之間收集小鼠糞便且基於顯色培養基評估酵母價(CFU/毫克糞便)。在以下表4中給出與其中誘發消化念珠菌症，但未以根據本發明的組成物治療之小鼠所測量之值相比的結果。
Figure 02_image009
根據本發明的組成物引起降低的白色念珠菌價。 根據本發明的抗發炎肽組成物 　　執行以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生之根據本發明的肽組成物與以來自冷水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生之肽組成物(本發明的範圍以外)刺激發炎1型巨噬細胞(M1)受體及/或抗發炎2型巨噬細胞(M2)受體的比較分析。 　　將來自健康的人類個體之巨噬細胞/單核球以100微克/毫升培養基之濃度，在預處理組成物(沒有膠原蛋白肽的控制組、本發明、本發明的範圍以外，表7)存在下培養24小時。此預處理對1型巨噬細胞(M1，發炎)之特徵性受體表現及對2型巨噬細胞(M2，抗發炎)之特徵性受體表現的效應係藉助於以100 µM濃度的佛波酯(phorbol ester)(佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，TPA)特異性刺激之1型巨噬細胞受體或以100微克/毫升之濃度的未助噬之酵母聚糖(NOZ)特異性刺激之2型巨噬細胞受體產生的氧游離基量(活性氧物質，ROS)來評估。氧游離基產生量係以66 µM濃度之發光胺(luminol)存在下的化學發光來測量。在下列表7中呈示之結果代表以三次試驗所獲得的平均值。
Figure 02_image011
觀察到未經NOZ及TPA處理(未誘發)之巨噬細胞/單核球具有實質上恆定的氧游離基產生量，該產生量係取決於預處理本性(沒有膠原蛋白、根據本發明及本發明的範圍以外)而定。 　　以根據本發明的肽組成物(亦即以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生者)預處理之巨噬細胞/單核球具有以NOZ誘發之化學發光強度(5.06×108 a.u.)顯露之增加的抗發炎2型巨噬細胞(M2)受體表現，其係相對於以本發明的範圍以外的肽組成物(亦即以來自冷水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生者)預處理之巨噬細胞/單核球(3.91×108 a.u.)。 　　以根據本發明的肽組成物(亦即以來自溫水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生者)預處理之巨噬細胞/單核球具有以TPA誘發之化學發光強度(6.75×108 a.u.)顯露之降低的發炎1型巨噬細胞(M1)受體表現，其係相對於以本發明的範圍以外的肽組成物(亦即以來自冷水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生者)預處理之巨噬細胞/單核球(1.40×109 a.u.)。 　　相對於本發明的範圍以外的肽組成物(亦即以來自冷水魚的魚皮膠原蛋白之酵素水解所衍生者)，根據本發明的肽組成物係藉由增加抗發炎2型巨噬細胞(M2)受體表現水平及降低發炎1型巨噬細胞(M1)受體表現水平而具有抗發炎表現型。 　　製備自溫水魚的魚皮所衍生及具有胺基酸譜之根據本發明的肽組成物，於胺基酸譜中： 　　- 甘胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於20.0%與24.5%之間； 　　- 羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於6.0%與12.0%之間； 　　- 脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於10.6%與14.6%之間； 　　具有以鼠類模式的結腸發炎試驗所確認且未於自冷水魚的魚皮所衍生及具有表6中所述之胺基酸譜的肽組成物中發現之抗發炎表現型。 鼠類模式的結腸發炎 　　根據本發明的肽組成物之抗發炎效應係在以葡聚糖硫酸鈉(DSS，MP Biomedical LLC, Canada)誘發且以重量減輕及血性腹瀉為特徵的鼠類藥理學發炎模式證明。 　　研究根據本發明的肽組成物對限制以DSS處理之小鼠的體重減輕之效應。將10至11週齡及體重介於20與25克之間的雌性C57BL/6實驗室小鼠用以1.5%(重量/體積)之比率溶解在小鼠飲用水中的DSS處理7天(D1 至D7 )。亦將該等小鼠以0.1克/公斤/天、1克/公斤/天和4克/公斤/天之比率的根據本發明的組成物處理12天(D1 至D12 )。此量之根據本發明的組成物係於小鼠飲用水中遞送。在D12 ，將小鼠安樂死。 　　準備五個批組小鼠，各批組包含10隻小鼠，其中： 　　- 批組1係以DSS處理7天； 　　- 批組2係以DSS處理7天及以0.1克/公斤/天之比率的根據本發明的組成物處理12天； 　　- 批組3係以DSS處理7天及以1克/公斤/天之比率的根據本發明的組成物處理12天； 　　- 批組4係以DSS處理7天及以4克/公斤/天之比率的根據本發明的組成物處理12天； 　　- 批組5係以DSS處理7天及以0.1克/公斤/天之比率之非根據本發明的水解酪蛋白處理12天。 　　以5隻未以DSS處理及未誘發發炎且未以根據本發明的肽組成物處理之小鼠平行執行對照組。 1. 體重的研究 　　每天測量各小鼠的體重且計算各批組的各小鼠經歷之體重減輕。將結果呈示於圖4中，其中對照組係以空心圓(○)代表，批組1係以實心圓(●)代表，批組2係以空心方格(□)代表，批組3係以實心方格(■)代表，批組4係以空心三角形(∆)代表，及批組5係以實心三角形(▲)代表。觀察到在0.1克/公斤/天下及在大於0.1克/公斤/天(批組2，□)下，根據本發明的組成物限制小鼠的體重減輕。亦於1克/公斤/天(批組3，■)及4克/公斤/天(批組4，∆)觀察到此限制。以水解酪蛋白(批組5，▲)處理未觀察到此限制，其體重減輕與批組1(●)之小鼠的體重減輕可相比擬。 　　根據本發明的組成物有可能限制或甚至幾乎完全消除小鼠中由葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發之發炎所產生的體重減輕。根據本發明的組成物能夠用作為藥劑，尤其用於治療結腸發炎。 2. 組織學 　　單獨以DSS處理之小鼠的結腸之橫向組織切片在以蘇木精及伊紅雙色染色之後顯示在黏膜及黏膜下層(sub-mucosa)中大量的發炎細胞浸潤。上皮厚度減少。上皮顯示擴大的潰瘍。以DSS及以0.1克/公斤/天、1克/公斤/天和4克/公斤/天之比率的根據本發明的組成物處理之小鼠的結腸之橫向組織切片在以蘇木精及伊紅雙色染色之後顯示狹窄的直管狀腺體，其代表健康且有功能的上皮。 3. 巨觀評分(Macroscopic score) 　　根據華萊士(Wallace)量表(E.S. Kimball, N.H. Wallace, C.R. Schneider, M.R. D’Andrea and P.J. Hornby；2004；Neurogastroenterol. Motil.；16 , 811-818. Vanilloid receptor 1 antagonists attenuate disease severity in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice)，各處理條件的巨觀評分係根據與糞便外觀、受損的結腸外觀、結腸重量及結腸長度有關的華萊士量表所建立之記分法計算。越發炎的結腸，則成比例有越高的巨觀評分值，及越健康的結腸，則成比例有越低的巨觀評分值。 　　批組1至5的小鼠之巨觀評分的平均值及標準偏差於下列的表5中給出。
Figure 02_image013
觀察到根據本發明的組成物處理引起降低的巨觀評分，亦即根據本發明的組成物引起改進的結腸發炎狀態。 4. 抑制小鼠中之促發炎標記物的表現 　　在D12 ，將小鼠安樂死且經由ELISA技術檢定促發炎細胞激素在結腸中的表現水平： 　　- IL-1β：IL-1β水平係經由ELISA技術分析且以每毫克(mg)結腸計之皮克(pg) IL-1β表示。結果顯示於圖5中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於以DSS誘發發炎之小鼠結腸及相對於以DSS誘發發炎且以水解酪蛋白處理之小鼠，在以0.1克/公斤/天、1克/公斤/天和4克/公斤/天之劑量的根據本發明的肽組成物處理之小鼠結腸中觀察到統計學顯著(p＜0.05)降低的L-1β表現。此效應係以定量RT-PCR分析IL-1β信使RNA確認，特別為0.1克/公斤/天和1克/公斤/天之劑量(p＜ 0.01)； 　　- IL6：IL6水平係經由ELISA技術分析且以每毫克(mg)結腸計之皮克(pg) IL6表示。結果顯示於圖6中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於以DSS誘發發炎之小鼠結腸及相對於以DSS誘發發炎且以水解酪蛋白處理之小鼠，在以0.1克/公斤/天(p＜ 0.01)、1克/公斤/天(p＜0.01)和4克/公斤/天(p＜0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物處理之小鼠結腸中觀察到統計學顯著降低的IL6表現。此效應係以定量RT-PCR分析IL6信使RNA確認； 　　- TNF-α：TNF-α水平係經由ELISA技術分析且以每毫克(mg)結腸計之皮克(pg) TNF-α表示。結果顯示於圖7中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於以DSS誘發發炎之小鼠結腸及相對於以DSS誘發發炎及以水解酪蛋白處理之小鼠，在以0.1克/公斤/天(p ＜ 0.05)、1克/公斤/天(p＜0.05)和4克/公斤/天(p＜0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物處理之小鼠結腸中觀察到統計學顯著降低的TNF-α表現。 　　MCP1之信使RNA的定量RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈反應)分析顯示統計學顯著降低該等DSS誘發之mRNA，特別為0.1克/公斤/天(p ＜ 0.01)和1克/公斤/天(p ＜ 0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物。 　　誘發性NO-合成酶(iNOS)之信使RNA的定量RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈反應)分析顯示於圖17中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。在以0.1克/公斤/天(p＜0.05)和1克/公斤/天(p＜0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物觀察到統計學顯著降低DSS誘發之iNOS mRNA。 5. 刺激小鼠中之抗發炎標記物的表現 　　 在D12 ，將小鼠安樂死且分析下列抗發炎標記物在結腸中的表現水平： 　　- TGF-β。TGF-β水平係經由ELISA技術分析且以每毫克(mg)結腸計之皮克(pg) TGF-β表示。將結果顯示於圖8中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於以DSS誘發發炎之小鼠結腸，在以0.1克/公斤/天之劑量的根據本發明的肽組成物處理之小鼠結腸中觀察到刺激TGF-β表現。此效應係以定量RT-PCR分析TGF-β信使RNA確認，特別為0.1克/公斤/天和1克/公斤/天之劑量的根據本發明的肽組成物(圖16)； 　　- Fizz1：Fizz1為抗發炎巨噬細胞M2之標記物。Fizz1信使RNA的定量RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈反應)分析顯示於圖18中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。以0.1克/公斤/天(p＜ 0.05)、1克/公斤/天(p＜ 0.01)和4克/公斤/天(p＜ 0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物觀察到統計學顯著增加DSS減弱之Fizz1信使RNA； 　　- 亦以1克/公斤/天(p＜ 0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物觀察到統計學顯著增加DSS減弱之Ym1信使RNA。 6. 根據本發明的肽組成物對結腸菌叢(結腸微生物相)之效應 　　在D12 ，將小鼠安樂死且以PCR(聚合酶鏈反應)定量該等小鼠之結腸菌叢。值係以相對於細菌或真菌總量及相對於β-肌動蛋白而標準化。β-肌動蛋白為相對於所分析之結腸組織量進行標準化之參考基因。特別定量下列者： 　　- 藉由ITS1-2真菌核糖體DNA之定量擴增的總真菌菌叢。ITS1-2真菌核糖體DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖9中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物恢復真菌菌叢，特別以4克/公斤/天之劑量； 　　- 藉由26S核糖體DNA之定量擴增的酵母釀酒酵母。26S核糖體DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖10中。第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。以0.1克/公斤/天(p＜ 0.05)、1克/公斤/天(p＜ 0.05)和4克/公斤/天(p＜ 0.05)之劑量的根據本發明的肽組成物以統計學顯著方式恢復釀酒酵母菌叢。在本發明的例子中，釀酒酵母具有抗發炎潛力； 　　- 藉由16S核糖體DNA之定量擴增的腸桿菌菌叢。16S核糖體DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖11中。第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第四欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物容許以0.1克/公斤/天之濃度減少DSS誘發之腸桿菌菌叢。腸桿菌係與促發炎潛力相關聯； 　　- 藉由在基因片段上的16S核糖體DNA之定量擴增的厚壁菌門菌叢，容許分析門中的多樣性。此等16S核糖體DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖12中。第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物係以0.1克/公斤/天(p＜ 0.05)、1克/公斤/天(p＜ 0.05)和4克/公斤/天(p＜ 0.05)之濃度引起統計學顯著減少的DSS誘發之厚壁菌門菌叢，且在該等相同的濃度下亦引起未誘發之厚壁菌門菌叢的減少。應注意通常係以已知的方式觀察到消化發炎(IBD，發炎性腸病)過程中增加的厚壁菌門菌叢； 　　- 藉由在基因片段上的16S核糖體DNA之定量擴增的擬桿菌門菌叢，容許分析門中的多樣性。此等16S核糖體DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖13中。第一欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第二欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第三欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第四欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第五欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物係以0.1克/公斤/天(p＜ 0.05)、1克/公斤/天(p＜ 0.05)和4克/公斤/天(p＜ 0.05)之濃度引起統計學顯著減少的DSS誘發之擬桿菌門菌叢。通常係以已知的方式觀察到消化發炎(IBD)過程中增加的擬桿菌門； 　　- 藉由特異性DNA之定量擴增的柔嫩梭菌(Faecalibacterium praustnizii )菌叢。此等特異性DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖14中。第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物係以0.1克/公斤/天(p＜ 0.01)、1克/公斤/天(p＜ 0.01)和4克/公斤/天(p＜ 0.01)之濃度引起統計學顯著增加的以DSS消滅之柔嫩梭菌菌叢。通常係以已知的方式觀察到消化發炎(IBD)過程中增加的柔嫩梭菌。柔嫩梭菌似乎亦能具有抗發炎性質； 　　- 藉由特異性DNA之定量擴增的鼠乳桿菌菌叢。此等特異性DNA的量對β-肌動蛋白DNA的量之比R顯示於圖15中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的檢定。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的檢定。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的檢定。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的檢定。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的檢定。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的檢定。根據本發明的肽組成物係以0.1克/公斤/天、1克/公斤/天和4克/公斤/天(p＜ 0.05)之濃度引起增加的鼠乳桿菌菌叢。鼠乳桿菌似乎亦能具有抗發炎性質。 7. 根據本發明的肽組成物對二十碳四烯酸脂質代謝酵素的效應： 　　- 5-LOX：酵素5-脂肪加氧酶(5-LOX)之信使RNA的定量RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈反應)分析顯示於圖19中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於未以DSS誘發之對照小鼠，以0.1克/公斤/天 (p＜ 0.01)和1克/公斤/天(p＜ 0.01)之根據本發明的肽組成物劑量觀察到統計學顯著降低的5-LOX表現。根據本發明的肽組成物對5-LOX表現具有抑制效應，5-LOX會促進促發炎脂質媒介物的產生； 　　- 12/15-LOX：酵素12/15-脂肪加氧酶(12/15-LOX)之信使RNA的定量RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈反應)分析顯示於圖20中，其中第一欄(白色欄)對應於以對照小鼠執行的分析。第二欄(具有斜影線的欄)對應於以批組1之小鼠執行的分析。第三欄(具有垂直影線的欄)對應於以批組4之小鼠執行的分析。第四欄(具有水平影線的欄)對應於以批組3之小鼠執行的分析。第五欄(灰階欄)對應於以批組2之小鼠執行的分析。第六欄(黑色實體欄)對應於以批組5執行的分析。相對於以DSS誘發之對照組，以0.1克/公斤/天(p＜ 0.01)和1克/公斤/天(p ＜ 0.01)之根據本發明的肽組成物劑量觀察到統計學顯著增加的12/15-LOX表現。 　　不言而喻，本發明可為標的的許多實施及應用變型。特別地可變化作為藥劑的不同用途而不偏離本發明的保護範圍。
本發明的其他目標、特性及優點在閱讀下列所給出而無暗示限制下的說明及參考所附圖形時變得顯而易見，其中： 　　- 圖1為以凝膠過濾分析根據本發明的肽組成物之代表性層析圖； 　　- 圖2為在陰離子交換樹脂上以HPLC分析根據本發明的肽組成物之代表性層析圖； 　　- 圖3為以反相層析術分析根據本發明的肽組成物之代表性層析圖； 　　- 圖4為代表在以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘發之結腸發炎的小鼠之身體質量變化的圖形式代表； 　　- 圖5為經由ELISA方法檢定在小鼠結腸中的IL1β之結果的直方圖代表； 　　- 圖6為經由ELISA方法檢定在小鼠結腸中的IL6之結果的直方圖代表； 　　- 圖7為經由ELISA方法檢定在小鼠結腸中的TNF-α之結果的直方圖代表； 　　- 圖8為經由ELISA方法檢定在小鼠結腸中的TNF-β之結果的直方圖代表； 　　- 圖9為以PCR檢定小鼠結腸中的真菌菌叢之結果的直方圖； 　　- 圖10為以PCR檢定小鼠結腸中的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )之結果的直方圖代表； 　　- 圖11為以PCR檢定小鼠結腸中的腸桿菌( enterobacteria)之結果的直方圖代表； 　　- 圖12為以PCR檢定小鼠結腸中的厚壁菌門( Firmicute)之結果的直方圖代表； 　　- 圖13為以PCR檢定小鼠結腸中的擬桿菌門( Bacteroidete)之結果的直方圖代表； 　　- 圖14為以PCR檢定小鼠結腸中的柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii )之結果的直方圖代表； 　　- 圖15為以PCR檢定小鼠結腸中的鼠乳桿菌(Lactobacillus murinus) 之結果的直方圖代表； 　　- 圖16為以RT-PCR定量分析小鼠結腸中的TGF-β之信使RNA的直方圖代表； 　　- 圖17為以RT-PCR定量分析小鼠結腸中的可誘發性NO-合成酶(iNOS)之信使RNA的直方圖代表；及 　　- 圖18為以RT-PCR定量分析小鼠結腸中的Fizz1之信使RNA的直方圖代表； 　　- 圖19為以RT-PCR定量分析小鼠結腸中的5-LOX之信使RNA的直方圖代表； 　　- 圖20為以RT-PCR定量分析小鼠結腸中的12/15-LOX之信使RNA的直方圖代表。

Claims (15)

  1. 一種具有胺基酸譜(aminogram)之肽組成物，其中：- 甘胺酸具有之莫耳量使得此量對該肽組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於20.0%與24.5%之間；- 羥基脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該肽組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於6.0%與12.0%之間；- 脯胺酸具有之莫耳量使得此量對該肽組成物中的胺基酸莫耳量總和之比係介於10.6%與14.6%之間；該肽組成物於其中該肽組成物之各肽係以代表此肽之視分子量的滯留時間溶離之排阻層析術分析上具有：肽之溶離曲線，該曲線具有在對應於具有視分子量少於1400Da之肽的曲線下之面積值，使得此面積值對該曲線下之總面積之比少於40%；且該肽組成物之肽具有介於2500Da與3600Da之間的平均視分子量值；該分析係如下文所述方式執行：○在300×7.8毫米尺寸的過濾管柱上，其包含以具有5微米孔隙度之矽膠所形成的靜止相；○該管柱維持在40℃之溫度；○以(A)包含0.1體積%之三氟乙酸的超純水及(B)乙腈所形成的溶液作為移動相，其中體積比A/B為75/25；○將一體積之包含該肽組成物之溶液引入該凝膠過濾管柱之頂端； ○在該管柱中的該移動相之流速為0.6毫升/分鐘；且○該肽組成物之肽係以在214奈米波長之吸收率檢測，其中該肽組成物之肽係衍生自至少一種選自
    Figure 106137113-A0305-02-0051-1
    鯰科(Pangasiidae family)之魚及慈鯛科(Cichlidae family)之魚所形成的群組之魚的魚皮膠原蛋白之受控酵素水解。
  2. 根據請求項1之肽組成物，其中該肽組成物之各肽具有介於200Da與12000Da之間的視分子量。
  3. 根據請求項1之肽組成物，其中該肽組成物於其中該肽組成物之各肽係以代表其電荷的滯留時間自該管柱溶離之陰離子交換管柱之層析術分析上具有：- 在對應於陰離子性肽的峰下之面積值；- 在對應於中性肽的峰下之面積值；及- 在對應於陽離子性肽的峰下之面積值；使得在該對應於陰離子性肽的峰下之此面積值對在該等對應於該肽組成物之陰離子性肽、中性肽及陽離子性肽的峰下之面積值總和之比介於27.0%與45%之間；在該對應於陰離子性肽之峰下的該面積值、在該對應於陽離子性肽之峰下的該面積值及在該對應於中性肽之峰下的該面積值係以在下文所述之條件下的層析術分析來測定： ○使用100×7.8毫米尺寸之層析管柱，其包含以四級銨基團官能化且具有10微米粒徑之陰離子交換親水性樹脂作為靜止相；○使用pH 8.35之5mM Tris水性緩衝液(C)作為溶離陽離子性肽及中性肽之第一移動相7分鐘時間，此係自將欲分析之該肽組成物引入該管柱之頂端開始計，且接著使用溶離陰離子性肽之第二移動相，其中以pH 8.35之5mM Tris、5M NaCl所形成的緩衝液(D)之體積對緩衝液(C)之體積之比在30分鐘中自0%線性增加至100%；○在該管柱中的該移動相具有1毫升/分鐘之流速；○該分析係在25℃之溫度下執行；且在該管柱之出口以214奈米波長之吸收率檢測。
  4. 根據請求項1之肽組成物，其中該等肽於以反相液相層析術進行之疏水性分析上具有介於16分鐘與36分鐘之間的滯留時間；該疏水性分析係在下列條件下執行：○使用250×4.6毫米尺寸的層析管柱，其具有以丁基接枝之二氧化矽所形成的靜止相，該二氧化矽具有5微米粒徑值及300Å孔隙度值；○使用在超純水中的0.1%三氟乙酸溶液(E)作為溶離親水性肽之第一移動相7分鐘時間，此係自將欲分析之該肽組成物引入該管柱之頂端開始計，且接著使用溶離疏水性肽之第二移動相，其中在包含40%乙腈之超純水中的 0.1%三氟乙酸溶液(F)之體積對該溶液(E)之體積之比在30分鐘中自0%線性增加至40%；○在該管柱中的該移動相具有0.6毫升/分鐘之流速；○該分析係在40℃之溫度下執行；且○在該管柱之出口以214奈米波長之吸收率檢測。
  5. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其中該肽組成物係呈液體形式。
  6. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其中該肽組成物係呈分隔形式的固體。
  7. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其中該肽組成物不含碳水化合物。
  8. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其中該肽組成物不含脂肪。
  9. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其中該肽組成物之肽為水溶性。
  10. 根據請求項1至4中任一項之肽組成物，其係用作為藥劑。
  11. 根據請求項10之肽組成物，其係用於治療消化系病變。
  12. 根據請求項10之肽組成物，其係用於治療腸內念珠菌症(candidiasis)。
  13. 根據請求項10之肽組成物，其係用於治療消化發炎。
  14. 根據請求項10之肽組成物，其係用於維持腸內微生物相。
  15. 一種根據請求項1至9中任一項之肽組成物於人類營養之用途。
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