TWI787784B

TWI787784B - 即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具及其製備方法、以及qPCR系統的校正方法

Info

Publication number: TWI787784B
Application number: TW110113402A
Authority: TW
Inventors: 游杰穎; 勃馬; 李浚榮; 顏翊安
Original assignee: 台達電子工業股份有限公司
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2022-12-21
Also published as: TW202240149A

Abstract

即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具包含透明基材以及螢光粒子。透明基材為固體。螢光粒子均勻地散佈於透明基材中。

Description

即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具及其製備方法、以及qPCR系統的校正方法

本揭露是有關於一種即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具及其製備方法、以及qPCR系統的校正方法。

在現有的即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的光學校正工具中，常使用有機螢光染劑作為被激發的材料。然而，有機螢光染劑常發生螢光強度衰退過快、發光強度受環境光源及溫度等條件影響而不穩定的問題。因此，現有的qPCR系統的光學校正工具不易重複使用、製備方式複雜、且精確度難以提升。

有鑑於此，如何提供一種具有高精確度、可重複使用、且製備方式簡單的光學校正工具，仍是目前業界亟需研究的目標之一。

本揭露之一技術態樣為一種即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具。

在本揭露一實施例中，即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具包含透明基材以及螢光粒子。透明基材為固體。螢光粒子均勻地散佈於透明基材中。

在本揭露一實施例中，即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具還包含容器，配置以容納透明基材與螢光粒子。

在本揭露一實施例中，容器的折射率與透明基材的折射率之間的差值落在約0.2至0.3的範圍中。

在本揭露一實施例中，螢光粒子配置以由光源激發，且光源的波長落在約400奈米至800奈米的範圍中。

在本揭露一實施例中，螢光粒子包含量子點、螢光微粒、奈米矽球、或奈米鑽石中的一者或上述之任意組合。

在本揭露一實施例中，螢光粒子的平均直徑落在約1微米至10微米的範圍中。

在本揭露一實施例中，螢光粒子的濃度落在約1ppm至10000 ppm的範圍中。

在本揭露一實施例中，透明基材的材料包含聚二甲基矽氧烷 (PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯或樹脂。

在本揭露一實施例中，透明基材為液態時的黏性小於5500釐泊（centipoise，cP）。

本揭露之另一技術態樣為一種即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具的製備方法。

在本揭露一實施例中，qPCR系統之光學校正工具的製備方法包含：準備液態透明基材；混合液態透明基材與螢光粒子以形成混合物；對混合物進行抽真空；以及固化混合物以形成固態透明基材，其中螢光粒子均勻地散佈於固態透明基材中。

在本揭露一實施例中，混合液態透明基材與螢光粒子之步驟是藉由離心力攪拌，且離心力攪拌的轉速小於100 rpm。

在本揭露一實施例中，qPCR系統之光學校正工具的製備方法還包含在固化混合物前，將混合物裝入容器。

在本揭露一實施例中，qPCR系統之光學校正工具的製備方法還包含藉由鑽石雕刻方式對固態透明基材塑形。

在本揭露一實施例中，固態透明基材的蕭氏硬度落在約90D至100D的範圍中。

在本揭露一實施例中，固化混合物是藉由濕氣固化、熱固化或光固化而執行。

本揭露之另一技術態樣為一種qPCR系統的校正方法。

在本揭露一實施例中，qPCR系統的校正方法包含放置光學校正工具於qPCR系統；開啟qPCR系統的光源，以激發光學校正工具中的螢光粒子；比對螢光粒子的發射光與內建資料並產生比對結果；以及根據比對結果調整qPCR系統的設定。

在本揭露一實施例中，qPCR系統的設定包含該光源的光強度。在本揭露一實施例中，qPCR系統的光源的波長對應螢光粒子的激發光波長。

在上述實施例中，螢光粒子的發光強度具有高穩定性，因此本揭露的光學校正工具的可重複使用，不易產生光漂白現象，且具有高精確度。此外，螢光粒子的激發光強度皆可具有高訊噪比(signal-to-noise ratio，S/N Ratio)，可增進qPCR系統的光學校正表現。

以下將以圖式揭露本發明之複數個實施方式，為明確說明起見，許多實務上的細節將在以下敘述中一併說明。然而，應瞭解到，這些實務上的細節不應用以限制本發明。也就是說，在本發明部分實施方式中，這些實務上的細節是非必要的。此外，為簡化圖式起見，一些習知慣用的結構與元件在圖式中將以簡單示意的方式繪示之。且為了清楚起見，圖式中之層和區域的厚度可能被誇大，並且在圖式的描述中相同的元件符號表示相同的元件。

第1圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具100的示意圖。光學校正工具100包含透明基材110、多個螢光粒子120以及容器130。透明基材110為固體。螢光粒子120均勻地散佈於透明基材110中。容器130配置以容納透明基材110與螢光粒子120。光學校正工具100應用於校正qPCR系統的光學品質。螢光粒子120配置以由qPCR系統發出的光源激發。容器130為光學級的容器，例如可以是離心管。因此，qPCR系統的光源可穿透容器130以激發透明基材110中的螢光粒子120，使得螢光粒子120發出特定波長的光以用於執行qPCR系統的校正。

透明基材110的材料包含聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯或樹脂。舉例來說，透明基材110的折射率可以是1.40至1.7透明基材110為液態時的黏性小於5500釐泊(centipoise)。藉由此特性，可避免在混合螢光粒子120至液態的透明基材110中時產生氣泡。如此一來，可避免氣泡或雜質殘留於透明基材110中而降低qPCR系統的光學校正表現。

容器130的折射率與透明基材110的折射率之間的差值落在約0.2至0.3的範圍中。如此一來，可降低因介質折射率差異導致的像差問題而降低qPCR系統的光學校正精確度。

第2A圖至第2D圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子120的激發光與發射光光譜示意圖。螢光粒子120配置以由qPCR系統發出的光源激發，且光源的波長落在約400奈米至800奈米的範圍中。換句話說，螢光粒子120配置以發出可見光，且螢光粒子120的激發光波長與qPCR系統的光源波長對應。

舉例來說，一部分的螢光粒子120可藉由藍光激發並發出藍綠光。如第2A圖所示，當qPCR系統可配置以發出波長的波峰約為470奈米的光源EX1(藍光)時，螢光粒子120可被激發而發出波長的波峰約為520奈米的發射光EM1(藍綠光)。如第2B圖所示，另一部分的螢光粒子120可被波長的波峰約為520奈米的光源EX2(藍綠光)激發而發出波長的波峰約為570奈米的發射光EM2(綠光)。如第2C圖所示，另一部分的螢光粒子120可被波長的波峰約為590奈米的光源EX3(黃光)激發出波長的波峰約為590奈米的發射光EM3(黃光)。如第2D圖所示，另一部分的螢光粒子120可被波長的波峰約為630奈米的光源EX4(紅光)激發出波長的波峰約為640奈米的發射光EM4(紅光)。

根據上述可知，藉由使用可被qPCR系統的光源激發的螢光粒子120，則可接收螢光粒子120發出的光進行qPCR系統的光學校正，其詳細校正步驟將於後續詳述。應理解到，上述的光源波長僅為示例，本領域人士當可根據qPCR系統所具有的光源波長相應地選擇適當的螢光粒子120。

螢光粒子120可包含量子點(Quantum Dot)、螢光微粒(Fluorescent Particles)、奈米矽球(Silica Nanoparticles)或奈米鑽石(Nanodiamonds)中的一者或上述之任意組合。螢光粒子120的平均直徑落在約1微米至10微米的範圍中。螢光粒子120的濃度落在約1百萬分點濃度(ppm)至10000ppm的範圍中。

第3A圖至第3C圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子的濃度與發射光強度關係圖。第3A圖為對應第2A圖所示以藍光激發的螢光粒子120的濃度與發射光強度關係圖。舉例來說，如第3A圖所示，螢光粒子120的濃度在0至1000ppm的範圍中所對應的螢光訊號強度成正比，其線性迴歸分析的相關係數R1大約為1。第3B圖為對應第2C圖所示以黃光激發的螢光粒子120的濃度與發射光強度(毫伏特，mV)關係圖。螢光粒子120的濃度在0至1000ppm的範圍中所對應的螢光訊號強度成正比，其線性迴歸分析的相關係數R2大約為0.9853。第3C圖為對應第2D圖所示以紅光激發的螢光粒子120的濃度與發射光強度關係圖。螢光粒子120的濃度在0至1000ppm的範圍中所對應的螢光訊號強度成正比，其線性迴歸分析的相關係數R3大約為0.997。因此，藉由將螢光粒子120的濃度控制在0至1000ppm的範圍中，可精確地控制螢光粒子120激發光的光強度。

第4圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子120的發射光強度及訊噪比。在第4圖中以濃度為1000ppm的不同螢光粒子120最為示例。在第4圖的範例中，可發出藍光、綠光、黃光及紅光的螢光粒子120的激發光強度皆可具有高訊噪比，以增進qPCR系統的光學校正表現。

第5圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具200的示意圖。光學校正工具200包含透明基材210與螢光粒子120。光學校正工具200不具有承裝透明基材210與螢光粒子120的容器。光學校正工具200的透明基材210可透過鑽石切割機等高精度機械加工而塑形，使得透明基材210的外表面可符合光學校正所需的品質。光學校正工具200的透明基材210可具有不同形狀，例如與第1圖所示的光學校正工具100相似的離心管外型、圓錐狀、圓柱狀、方塊、扁平型等。換句話說，只要光學校正工具200的形狀只要可與qPCR系統用以放置光學校正工具200的空間可相容即可。

第6圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的熱測試數據。第6圖中的數據將第1圖所示的光學校正工具100放置於65度的環境中持續兩天後所取得的實驗數據。由第6圖的實驗數據可看出，在本實施例中，發出黃光及藍光的螢光粒子120的發射光強度的變化量皆小於10%，且濃度為1000ppm的螢光粒子120的發射光強度的變化量大致小於2%。因此，本揭露的光學校正工具的螢光粒子120可承受高溫影響而無發光強度衰退現象。

第7圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的光穩定度數據。第7圖中的數據將第1圖所示的光學校正工具100放置於環境光源照射狀況下持續約五個月的實驗數據。由第7圖的實驗數據可看出，發出紅光及黃光的螢光粒子120的發射光強度大致維持穩定。因此，本揭露的光學校正工具的螢光粒子120可長時間重複使用，達到減少資源浪費之功效。

綜上所述，由於螢光粒子120的發光強度具有高穩定性，因此本揭露的光學校正工具的可重複使用，不易產生光漂白現象，且具有高精確度。此外，容器130或是塑形後的透明基材110之設計可讓使用者便利地使用，減少光學校正步驟的複雜度。

第8圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統之光學校正工具的製備方法300的流程圖。方法300的步驟S11起始於準備液態透明基材。接著，步驟S12為混合液態透明基材與複數個螢光粒子以形成混合物。接著，步驟S13為對混合物進行抽真空。最後，步驟S14為固化混合物以形成固態透明基材，其中螢光粒子均勻地散佈於固態透明基材中。

第9圖至10圖為第8圖之qPCR系統之光學校正工具的製備方法300的中間步驟示意圖。如第9圖所示，在步驟S11至步驟S12中，準備液態的透明基材110L，並將螢光粒子120加入液態的透明基材110L中。接著，混合透明基材110L與螢光粒子120。在本實施例中，藉由離心機140提供離心力攪拌透明基材110L中的螢光粒子120以形成混合物。離心力攪拌的轉速小於100 rpm。在其他實施例中，也可藉由電動攪拌機攪拌透明基材110L中的螢光粒子120。

如第10圖所示，在步驟S13中，對混合物進行抽真空，以移除透明基材110L中的氣泡G。接著，在固化混合物前，將混合物裝入容器130中。最後，在步驟S14中，藉由光L固化混合物以形成光學校正工具100。在其他實施例中，固化混合物也可藉由濕氣固化或熱固化等方式執行。

固態透明基材110的蕭氏硬度落在約90D至100D的範圍中。此外，在其他實施例中，以光學校正工具200為例，在固化混合物後，可藉由鑽石雕刻方式對該固態透明基材110塑形，而無需放置於容器中。

第11圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統之光學校正方法400的流程圖。方法400的步驟S21起始於放置光學校正工具於qPCR系統。接著，步驟S22為開啟qPCR系統的光源，以激發光學校正工具中的螢光粒子。接著，在步驟S23中，由qPCR系統接收螢光粒子的發射光訊號，並比對螢光粒子的發射光強度與內建資料並產生比對結果。例如，內建資料包含qPCR系統的各個波長光源所對應的螢光粒子發射光強度正常範圍。因此，在步驟S24中，可判斷光學校正工具中可被不同波長的激發光激發的螢光粒子所發出的發射光強度是否在正常範圍內。

如果步驟S24中得到的比對結果顯示發射光強度是在正常範圍內，則接續地進行至步驟S25，使qPCR系統回到預設模式。接著，進行至步驟S26，結束qPCR系統的校正程序。

如果步驟S24中得到的比對結果顯示發射光強度並非在正常範圍內，則根據比對結果調整qPCR系統的設定。qPCR系統的設定包含各個波長的光源的光強度。例如，步驟S24可接續地進行至步驟S27，調整qPCR系統的光源強度。接著，進行步驟S28，判斷qPCR系統的光源強度調整次數是否小於10。如果步驟S28的結果為是，則回到步驟S24，比對調整後的發射光強度與內建資料。如果步驟S28的結果為否，則進行至步驟S29，執行qPCR系統的維修程序。

綜上所述，由於螢光粒子的發光強度具有高穩定性，因此本揭露的光學校正工具的可重複使用，且具有高精確度。容器或是塑形後的透明基材之設計可讓使用者便利地使用，減少光學校正步驟的複雜度。藉由將螢光粒子的濃度控制在0至1000ppm的範圍中，可精確地控制螢光粒子激發光的光強度。此外，螢光粒子的激發光強度皆可具有高訊噪比，可增進qPCR系統的光學校正表現。透明基材的黏性小於5500centipoise，可避免在混合螢光粒子至液態的透明基材中時產生氣泡。容器的折射率與透明基材的折射率之間的差值落在約0.2至0.3的範圍中，可降低因介質折射率差異導致的像差問題而降低qPCR系統的光學校正精確度。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

100,200:光學校正工具

110,110L,210:透明基材

120:螢光粒子

130:容器

140:離心機

300,400:方法

EX1,EX2,EX3,EX4:激發光

EM1,EM2,EM3,EM4:發射光

R1,R2,R3:相關係數

G:氣泡

S11~S14,S21~S29:步驟

第1圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的示意圖。第2A圖至第2D圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子的激發光與發射光光譜示意圖。第3A圖至第3C圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子的濃度與發射光強度關係圖。第4圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具的螢光粒子的發射光強度及訊噪比。第5圖為根據本揭露另一實施例之qPCR系統的光學校正工具的示意圖。第6圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的熱測試數據。第7圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統的光學校正工具的光穩定度數據。第8圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統之光學校正工具的製備方法的流程圖。第9圖至10圖為第8圖之qPCR系統之光學校正工具的製備方法的中間步驟示意圖。第11圖為根據本揭露一實施例之qPCR系統之光學校正方法的流程圖。

100:光學校正工具 110:透明基材 120:螢光粒子 130:容器

Claims

一種即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，包含：一透明基材，其中該透明基材為固體；以及複數個螢光粒子，均勻地散佈於該透明基材中。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，還包含：一容器，配置以容納該透明基材與該些螢光粒子。
如請求項2所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該容器的一折射率與該透明基材的一折射率之間的差值落在約0.2至0.3的範圍中。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該些螢光粒子配置以由一光源激發，且該光源的波長落在約400奈米至800奈米的範圍中。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該些螢光粒子包含量子點、螢光微粒、奈米矽球或奈米鑽石中的一者或上述之任意組合。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該些螢光粒子的平均直徑落在約1微米至10微米的範圍中。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該些螢光粒子的濃度落在約1ppm至10000ppm的範圍中。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該透明基材的材料包含聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯或樹脂。
如請求項1所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的光學校正工具，其中該透明基材為液態時的黏性小於5500釐泊(centipoise)。
一種即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統之光學校正工具的製備方法，包含：準備一液態透明基材；混合該液態透明基材與複數個螢光粒子以形成一混合物；對該混合物進行抽真空；以及固化該混合物以形成一固態透明基材，其中該些螢光粒子均勻地散佈於該固態透明基材中。
如請求項10所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統之光學校正工具的製備方法，其中混合該液態透明基材與該些螢光粒子之步驟是藉由離心力攪拌，且該離心力攪拌的一轉速小於100rpm。
如請求項10所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統之光學校正工具的製備方法，還包含：在固化該混合物前，將該混合物裝入一容器。
如請求項10所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統之光學校正工具的製備方法，還包含：藉由鑽石雕刻方式對該固態透明基材塑形。
如請求項10所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統之光學校正工具的製備方法，其中該固態透明基材的一蕭氏硬度落在約90D至100D的範圍中。
如請求項10所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統之光學校正工具的製備方法，其中固化該混合物是藉由濕氣固化、熱固化或光固化而執行。
一種即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR)系統的校正方法，包含：放置一光學校正工具於該qPCR系統，其中該光學校正工具包含：一透明基材，其中該透明基材為固體；以及複數個螢光粒子，均勻地散佈於該透明基材中；開啟該qPCR系統的一光源，以激發該光學校正工具中的該些螢光粒子；比對該些螢光粒子的發射光與一內建資料並產生一比對結果；以及根據該比對結果調整該qPCR系統的設定。
如請求項16所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的校正方法，其中該qPCR系統的設定包含該光源的一光強度。
如請求項16所述之即時定量聚合酶連鎖反應系統的校正方法，其中該qPCR系統的該光源的波長對應該些螢光粒子的激發光波長。