TWI781430B

TWI781430B - 體外檢測癌症之試劑及套組

Info

Publication number: TWI781430B
Application number: TW109127259A
Authority: TW
Inventors: 張健忠; 劉宜璇; 賴紫綸
Original assignee: 國立中興大學
Priority date: 2020-08-11
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2022-10-21
Also published as: TW202206072A

Abstract

本發明係揭露一種體外檢測癌症之試劑及套組，其係能夠於體外與樣品反應，並透過觀察反應後之呈色反應得知樣品中是否具有多胺或/及循環腫瘤細胞，進而達到檢測癌症、評估癌症治療有效性、評估癌症預後之功效。

Description

體外檢測癌症之試劑及套組

本發明係有關於一種體外檢測用物質，特別係指一種體外檢測癌症之試劑及套組。

按，雖然人類平均壽命持續增加，但是造成人類死亡之因素中，癌症始終名列前茅，根據統計，每6個人中有1位是死於癌症。為能預防或是提早治療癌症，臨床上係發展出各種癌症檢測方法，例如透過全身性影像檢測來判斷是否有罹患癌症，惟影像檢測受限於影像解析度，且無法預測癌症發生風險，而若採取較高解析度之影像檢測，如正子電腦斷層，雖然能夠大幅提昇檢測準確率，但檢測費用高昂；亦有透過檢測體內與癌症相關之生物標幟物的表現，判斷受試者罹患癌症之風險，雖然本方法可以透過血液進行分析，惟，如HPLC、GC/MS等分析方式需要高額設備及費用，並且僅能提供40~60%檢測之準確。

由此可知，目前臨床上所使用之癌症檢測方法或儀器皆有其缺失存在，為能提昇檢測效率及降低檢測成本，實需要開發新一代之檢測技術及方法。

本發明之主要目的係在於提供一種癌症檢測之試劑及其套組，其係能夠於體外與樣品反應，並透過觀察反應後之呈色反應得知樣品中是否具有多胺或/及循環腫瘤細胞，進而達到檢測癌症、評估癌症治療有效性、評估癌症預後之功效。

本發明之另一目的係在於提供一種粒線體指示劑，其與樣品反應後之呈色結果係能用以作為判斷粒線體位置之依據，藉以達到追蹤粒線體或定位粒線體之功效。，

緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種如下式(I)所示化合物，其係能夠用以製備一檢測癌症之試劑或是一粒線體指示劑：

X為-R或-CH=C(R)；R為；

Y為氧或氨己酸。

具體來說，該化合物係得為

、

或

。

於本發明之一實施例中，該檢測癌症之試劑中係更包含有一醇類化合物，如乙醇、甲醇等。

於本發明之一實施例中所揭檢測癌症之套組，其係包含有一檢測試劑，而該檢測試劑之主要成分係為上式(I)所示之化合物。

而為能達成較佳之檢測效果且避免檢測結果之誤判，該檢測癌症之套組係更包含有一前處理劑，其內含有醇類化合物，如乙醇、甲醇等。

於本發明之又一實施例中係揭露一種檢測樣品中多胺或循環腫瘤細胞之方法，其主要係將上式(I)所示之化合物與一待測樣品進行反應，而藉由反應結果可作為檢測待測樣品提供者罹患癌症風險、評估癌症預後、癌症治療有效性之依據；具體來說，意即當反應結果出現一螢光時，表示該待測樣品中含有一多胺或一循環腫瘤細胞，可推知檢測待測樣品提供者體內具有癌症細胞或腫瘤細胞；又透過比較不同時間之反應結果的螢光強度，進而能評估樣品提供者病情之變化，以達到追蹤癌症療效之功效。

其中，該待測樣品內幾乎不含有蛋白質或肽。

於本發明之另一實施例中，該待測樣品係由一樣品與一醇類反應後，再移除反應後之固體物質所得者；舉例來說，若該樣品為全血，則與乙醇反應後，剩餘之血清即為該待測樣品。

其中，該樣品係得為全血、尿液、糞便等。

圖1係為多胺之主要成分的結構式。

圖2係為本發明所揭式(II)化合物與20種胺基酸進行呈色反應之結果，其中，光源為手提螢光燈，激發波長為365nm。。

圖3係為本發明所揭式(II)化合物與20種胺基酸進行呈色反應後所測之螢光強度。

圖4係為本發明所揭式(III)化合物與20種胺基酸進行呈色反應之結果，其中，光源為手提螢光燈，激發波長為365nm。。

圖5係為本發明所揭式(III)化合物與20種胺基酸進行呈色反應後所測之螢光強度。

圖6A係為本發明所揭式(II)化合物與離胺酸(Lys)及精胺酸(Arg)分別於不同酸鹼度下進行呈色反應之結果。

圖6B係為本發明所揭式(II)化合物於不同反應條件及酸性環境下與離胺酸進行呈色反應後之結果，其中，光源為手提螢光燈，激發波長為365nm。

圖6C係為本發明所揭式(III)化合物於不同反應條件及酸性環境下與離胺酸進行呈色反應後之結果，其中，光源為手提螢光燈，激發波長為365nm。

圖7係為本發明所揭式(II)化合物與不同濃度之離胺酸，於添加不同濃度之酒精下，反應後之呈色結果。

圖8A係為本發明所揭式(II)化合物與Hela細胞株反應並以粒線體追蹤染劑(mitotracker red)進行免疫染色後呈現綠色螢光之結果(63X油鏡；Ex：476/35nm；Em：594 long pass filter)。

圖8B係為本發明所揭式(II)化合物與Hela細胞株反應並以粒線體追蹤染劑(mitotracker red)進行免疫染色後呈現紅色螢光之結果(63X油鏡；Ex：549/15nm；Em：594 long pass filter)。

圖8C係為圖7A及圖7B影像疊合之結果。

圖9A係為本發明所揭式(II)、(III)或(IV)化合物與Hep-G2肝癌細胞株反應後之呈色結果(Ex：370±20；Em：425nm)。圖9B係為本發明所揭式(II)化合物與Hep-G2肝癌細胞株反應不同時間後之呈色結果(Ex：370±20；Em：425nm)。

圖10A係為本發明所揭式(II)化合物與不同細胞株反應後之呈色結果(Ex：370±20；Em：425nm)。

圖10B係為本發明所揭式(IV)化合物與不同細胞株反應後之呈色結果(Ex：370±20；Em：425nm)。

圖11係為本發明所揭式(II)化合物與不同細胞數量於不同光照條件下反應之呈色結果。

圖12係為本發明所揭式(II)化合物與不同動物來源血液反應後之呈色結果。

本發明係揭露一如下式(I)所示化合物：

X為-R或-CH=C(R)；R為

；Y為氧或氨己酸。

具體來說，該化合物之結構式係如下式(II)、下式(III)或下式(IV)所示：

其中，式(II)化合物之化學名為N-(4-(2-(1,8-naphthalic anhydride-4-yl)vinyl)phenyl)-N-phenylbenzenamine，以核磁共振氫光譜(¹H NMR，條件：400MHz,、CDCl3、δ in ppm)分析後之結果如下：8.68(d,J=8Hz,1H)，8.66(d,J=8Hz,1H)，8.60(d,J=8Hz,1H)，8.04(d,J=8Hz,1H)，7.83(t,J=8Hz,1H)，7.75(d,J=16Hz,1H)，7.51(d,J=8Hz,2H)，7.36(d,J=16Hz,1H)，7.29-7.32(m,4H)，7.15(d,J=8Hz,4H)，7.09-7.11(m,4H)。而式(II)化合物於不同極性溶劑下具有不同螢光光譜，例如於甲苯中為570nm黃色螢光，於四氫呋喃、乙酸乙酯中為650nm橘紅色螢光。

式(III)化合物之化學名為4-(1,8-naphthalic anhydride-4-yl-N,N-diphenylbenzenamine，以核磁共振氫光譜(¹H NMR，條件：400MHz,、CDCl3、δ in ppm)分析後之結果如下：8.65(d,J=8Hz,2H)，8.53(d,J=8Hz,1H)，7.77(t,J=8Hz,1H)，7.76(d,J=8Hz,1H)，7.31-7.38(m,6H)，7.34(m,6H)，7.11(m,2H)。而式(III)化合物於不同溶劑下具有不同螢光光譜，例如於甲苯中為570nm黃綠色螢光，於四氫呋喃、乙酸乙酯、水中為625nm橘紅色螢光。

式(IV)化合物之化學名為6-(6-(N,N-diphenyl-4-aminostyryl)-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)-hexanoic acid，而由含有式(II)化合物之乙醇溶液與6-氨基己酸加熱反應後，濃縮分離所得者。以核磁共振氫光譜(¹H NMR，條件：400MHz,、CDCl3、δ in ppm)分析後之結果如下：8.62(d,J=8Hz,1H)，8.58(d,J=8Hz,2H)，7.98(d,J=8Hz,1H)，7.77(t,J=8,16Hz,1H)，7.51(t,J=8Hz,2H)，7.26-7.32(d,J=8Hz,4H)，7.09-7.11(m,4H)，4.18(t,J=8Hz,2H)，2.37(t,J=8Hz,2H)，1.68-1.79(m,4H)，1.45-1.50(m,2H)。而式(IV)化合物於不同溶劑下具有不同螢光光譜，例如於甲苯中為560nm黃色螢光，於四氫呋喃、乙酸乙酯中為620nm橘紅色螢光，於丙酮中為660nm橘紅色螢光。

本發明所揭式(II)或式(III)所示化合物得由化學合成方式所製備而成，舉例來說，式(II)所示化合物係由下列反應式(IV)所製備而成者；式(III)所示化合物係由下列反應式(V)所製備而成者。

反應式(IV)：

根據文獻指出，癌細胞或腫瘤細胞會於體內快速生長與分化，會使內多胺之合成與分泌量於血液及尿液中明顯增加，並且腫瘤細胞可能會游離於患者血液中。由於本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示化合物係能夠與一預定胺基酸，如離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)反應並呈色，意即當一樣品與本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)化合物反應後，若有呈色，表示該樣品中含有多胺或循環腫瘤細胞，因此，本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)所示化合物能作為檢測癌症之試劑或其套組中之有效成分，並且能夠應用於檢測樣品中之多胺或循環腫瘤細胞，更能夠透過螢光亮度分析多胺或循環腫瘤細胞之含量。換言之，本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)化合物呈色結果係能夠作為癌症檢測之試劑或套組，除能用於事前偵測癌症，更能於用於追蹤癌症患者之預後及治療成效。

舉例來說，式(II)所示化合物與一級胺於乙醇環境下反應後，可得到如下式(V)所示化合物，其能夠發出強綠色螢光，並且於放置一段時間後，強綠色螢光會變成橘色螢光。

更進一步來說，由於所使用之樣品，如全血、尿液、糞便或組織中可能含有蛋白質或肽而會造成檢測結果之誤判，因此，樣品於與本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)化合物反應前應先除去其內之蛋白質，舉例來說，可透過將樣品與乙醇反應後，將形成固體之蛋白質或肽移除，保留液態之部分，再與本發明所揭式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)化合物進行反應。

為能便於使用，本發明所揭檢測癌症之套組中係包含有一檢測試劑，其內含有式(I)、式(II)、式(III)或式(IV)化合物，及一前處理劑，其主要成分為得固化蛋白質或肽之化合物，舉例來說，如甲醇、乙醇或任何醇類化合物。

本發明所謂「多胺(polyamine)」，係指低分子量脂族聚陽離子，含有兩個以上胺基之化合物，一般來說，如圖1所示，多胺主要包含有putrescine(Put，1,4-diaminobutane)、spermidine(Spd，1,8-diamino-4-azaoctane)、spermine(Spm，1,12-diamino-4,9-diazadodecane)等分子，而主要是以L-arginine以及L-methionine作為主要原料，並且，於合成過程中，具有兩個關鍵調控酵素：SAMDC(S-adenosylmethionine decarboxylase)及ODC(ornithine decarboxylase)。

本發明所謂「蛋白質」，係指由不同胺基酸所形成之聚合物，具有完整之生物學功能並有穩定結構之分子。

本發明所謂「肽」，係指較短之胺基酸寡聚體，大多缺少穩定之三維結構，其中，肽包含有多肽。

本發明所謂「多肽」，係指任何長度之胺基酸線性單鏈分子，缺少穩定之三維結構。

本發明所謂「癌症」，係包含有卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、乳癌、胰臟癌、食道癌、頭頸部癌、神經細胞癌、髓母細胞瘤、腎臟癌、攝護腺癌、甲狀腺癌等。

本發明所謂「循環腫瘤細胞(CTCs)」，係指游離於患者體液內之腫瘤細胞。

以下，為能證實本發明所揭技術特徵之功效，茲舉若干實例並搭配結果作更進一步說明如後。

以下實例中所使用之細胞株皆為市面購入者，並且，所有細胞株皆依據本發明所屬技術領域之通常知識進行餵養，例如人類肝癌細胞株以含有10%胎牛血清及非必需氨基酸之MEM(Minimum Essential Media)培養基進行培養。

實例一：胺基酸呈色反應之結果(一)

取本發明所揭式(II)及(III)所示化合物25μM分別與20種胺基酸(250μM)於乙醇環境下進行反應4小時，於激發光源波長為365nm下觀察其呈色結果，結果如圖2至圖5所示。

由圖2至圖5之結果可知本發明所揭式(II)及(III)所示化合物分別與離胺酸(Lys)或精胺酸(Arg)反應後會產生綠色螢光，而與其他胺基酸反應不會產生螢光，其中，式(II)所示化合物離胺酸(Lys)及精胺酸(Arg)反應之螢光激發波長分別為380nm，並且會發生520nm綠色螢光；式(III)所示化合物離胺酸(Lys)及精胺酸(Arg)反應之螢光激發波長分別為340nm，並且會發生500nm綠色螢光。

實例二：胺基酸呈色反應之結果(二)

取當量為10eq之離胺酸(Lys)及精胺酸(Arg)分別於不同PH值下與本發明所揭式(II)化合物(25μM)反應，於於激發光源波長為365nm下觀察其呈色結果，結果如圖6A所示。

取不同溶劑：DMAO、甲醇、四氫呋喃、乙醇、丙酮、丙烯酸乙酯、甲苯、水，分別加入本發明所揭式(II)化合物及離胺酸反應後，加入酸性試劑(HCl)，觀察其呈色變化，如圖6B所示；另，將上述溶劑分別與本發明所揭式(III)化合物及離胺酸反應後，加入酸性試劑(HCl)，觀察其呈色變化，如圖6C所示；藉上述檢測本發明所揭式(II)及式(III)化合物是否有PH依存性。

由圖6A至圖6C之結果可知，本發明所揭式(II)及式(III)化合物確實能與不同有機溶劑(DMSO、甲醇、乙醇)之環境下而與胺基酸反應並且發出綠色螢光訊號，並且，若添加酸後，會使螢光顏色由綠色變成橘色；又，如圖6A及圖6B所示，本發明所揭式(II)所示化合物於中性或鹼性環境下與胺基酸反應後之呈色效果較佳。

基於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知，本發明所揭各化合物較佳之反應環境為中性或鹼性，並且能夠透過改變反應環境之酸鹼值(變為酸性)，而使反應後之螢光顏色產生變化，以能達到較佳之檢測功效。

實例三：胺基酸呈色反應之結果(三)

取濃度為10^-2μM之本發明所揭式(II)化合物分別與不同濃度(10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7μM)之離胺酸混合後，添加不同濃度(30%、40%)之酒精進行反應，觀察其呈色結果，如圖7所示。

如圖7之結果所示者，本發明所揭式(II)所示化合物與不同濃度之離胺酸反應，其呈色結果會有所不同，且於添加不同酒精之反應環境下，所呈現之螢光亮度亦有差異；整體來說，當離胺酸之濃度越高，與本發明所揭式(II)所示化合物反應後之螢光亮度越高，並添加之酒精濃度越高，與本發明所揭式(II)所示化合物反應後之螢光亮度亦會越高。

基於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知，本發明所揭各化合物於乙醇濃度較高之環境下，具有較佳之呈色效果；並當樣品中離胺酸濃度越高，與本發明所揭各化合物反應後之螢光強度會越高。

實例三：細胞試驗(一)

以本發明所揭式(II)化合物(10μM)餵養Hela細胞株8小時，再以粒線體追蹤染劑(mitotracker red)5nM染30分鐘，透過共軛焦顯微鏡觀察細胞影像，結果如圖8所示。

由圖8A之結果可知本發明所揭式(II)化合物於細胞影像內發出綠色螢光訊號，並由圖8B可知粒線體追蹤染劑於細胞影像內顯示出紅色螢光訊號；而將圖8A及圖8B疊合得到圖8C，可知細胞內同時有黃色、綠色和橘色的螢光訊號，其中，黃色螢光表示紅色螢光與綠色螢光完全重疊，顯示本發明所揭式(II)化合物與粒線體追蹤染劑於細胞內位於相同位置。

由此可知，本發明所揭式(II)所示化合物不僅能夠偵測到腫瘤細胞，並且能夠偵測到粒線體之位置，得用以作為粒線體追蹤染劑之用。而基於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知本發明所揭各化合物皆具有同時作為偵測腫瘤細胞或癌細胞，以及粒線體位置之能力。

實例四：細胞試驗(二)

先分別以本發明所揭式(II)、(III)或(IV)化合物(10μM)餵養Hep-G2肝癌細胞株8小時後，分別觀察細胞影像，結果如圖9A所示。

再以本發明所揭式(II)化合物(10μM)餵養Hep-G2肝癌細胞株不同時間後，分別觀察其螢光呈色之結果，如圖9B所示。

由圖9A之結果可知，本發明所揭式(II)、(III)或(IV)化合物皆會與肝癌細胞反應後並呈色，顯示本發明所揭式(II)、(III)或(IV)化合物確實會被癌細胞攝入而能夠透過螢光呈色標記出癌細胞。

再者，由圖9B之結果可知，當本發明所揭式(II)所示化合物與癌細胞反應時間越久，螢光亮度越高，顯示由於癌細胞會持續分泌多胺，因此當反應時間越長，本發明所揭式(II)所示化合物與多胺反應量越多，故會使螢光呈色越明顯。

基於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知本發明所揭各化合物與含有癌細胞或腫瘤細胞之樣本反應越久，自會顯示出越強或越明顯之螢光。

實例五：細胞試驗(三)

以本發明所揭式(II)化合物(10μM)分別為餵養不同癌症細胞株及正常肺細胞株4小時，再分別觀察其螢光呈色之結果，結果如圖10A所示，其中，癌症細胞株包含有MDA-MB-231(乳癌細胞株)、Hep-G2(肝癌細胞株)、CL1-0(人類肺腺癌細胞株)、Hela(人類子宮頸癌細胞)、A549(肺癌細胞株)，正常肺細胞株為MRC-5及IMR-90。

另取本發明所揭式(IV)化合物(10μM)分別為餵養不同癌症細胞株8小時，再分別觀察其螢光呈色之結果，結果如圖10B所示，

由圖10A1及圖10B之結果可知，本發明所揭式(II)或式(IV)所示化合物係具有癌細胞專一偵測之特性，意即由於癌細胞會分泌大量多胺，而正常細胞不會分泌大量多胺，故本發明所揭式(II)或式(IV)所示化合物與癌細胞反應後會顯現出明顯之螢光；更進一步來說，由於先前文獻中指出乳癌細胞與肝癌細胞會大量表現多胺，故本發明所揭式(II)或/及式(IV)所示化合物與MDA-MB-231及Hep-G2反應後之螢光表現會高於與其他腫瘤或癌細胞之表現。

於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知本發明所揭各示化合物確實能夠係於體外樣品中檢測出其內是否含有多胺或是否為癌細胞。

實例六：細胞試驗(四)

將正常人血清(10μL)與不同數量(0、6、60、600、6000個)之肺癌細胞株A549混合，再加入100%乙醇本發明所揭式(II)所示化合物(10-2μM)；而後分別以白光拍照後，再於照射UV燈0、5、10、30、60分鐘後進行拍照，結果如圖11所示。

由圖11之結果可知，隨著細胞數的增加，與本發明所揭(II)所示化合物反應後之螢光亮度亦隨之增加，並且，於相同細胞數下，螢光亮度係會隨著照射UV時間增加而變強。

實例七：動物試驗

取以下各組動物之血液，分別與本發明所揭式(II)所示化合物反應，結果如圖12所示。

對照組：野生型小鼠(Wild Type)之血液；肝腫瘤小鼠組：將致癌物注射至B型肝癌病毒(HBV)基因轉殖小鼠，使之成為肝腫瘤小鼠後，取其血液；肺癌腫瘤小鼠組：取A549肺癌細胞異體移植小鼠之血液。

由圖12之結果可知，本發明所揭式(II)所示化合物於來自癌症個體之血液反應後，確實能夠呈現螢光。由此顯示，本發明所揭式(II)所示化合物係能夠用於與樣品反應，透過觀察反應後之呈色結果，進而達到檢測樣品提供者是否罹患癌症、評估癌症預後、評估癌症治療手段有效性之功效。

於本發明所揭各化合物之結構相類似，並且與胺基酸作用位置與呈色位置相同，故可以合理推知本發明所揭各化合物確實能夠係於偵測體外樣品內之多胺或游離腫瘤細胞，以作為檢測癌症發生、評估治療有效性及預後之工具。

Claims

一種將化合物用於製備檢測癌症之試劑之用途，其中，該化合物之結構式係如下式(I)所示：
X為-R或-CH=C(R)；R為
；Y為氧或氨己酸。
如請求項1所述用途，其中，該檢測癌症之試劑中係更包含有一醇類化合物。
一種將化合物用於製備粒線體指示劑之用途，其中，該化合物之結構式係如下式(I)所示：
X為-R或-CH=C(R)； R為
；Y為氧或氨己酸。
一種檢測癌症之套組，其係包含有一檢測試劑，而該檢測試劑中具有如下式(I)所示之化合物：
X為-R或-CH=C(R)；R為
；Y為氧或氨己酸。
如請求項4所述檢測癌症之套組，其更包含有一前處理劑，其內含有醇類化合物。
一種檢測樣品中多胺或循環腫瘤細胞之方法，其包含有下列步驟：a.取一待測樣品，其內幾乎不含有蛋白質或肽； b.取一檢測試劑，其包含有如下式(I)所示之化合物：
X為-R或-CH=C(R)；R為
；Y為氧或氨己酸；c.混合該待測樣品與該檢測試劑，形成一反應樣品，當該反應樣品中顯現一螢光時，表示該待測樣品中含有一多胺或一循環腫瘤細胞。
如請求項6所述檢測樣品中多胺或循環腫瘤細胞之方法，其更包含有一步驟a1，位於該步驟a前；步驟a1：一樣品與一醇類反應，並移除反應後之固體物質，得到該待測樣品。
如請求項7所述檢測樣品中多胺或循環腫瘤細胞之方法，其中，該醇類係為乙醇。
如請求項6所述檢測樣品中多胺或循環腫瘤細胞之方法，其中，該樣品為全血或尿液。